MOLEKULARNO BIOLOŠKE PREISKAVE LIMIOPRO-LIFERATIVNIH BOLEZNI Z UPORABO KLASIČNE METODE PCR
Ira Kokovic, Rastko Golouh, Janez Jančar, Andreja Zidar, Srdjan Novakovic
Onkološki inštitut Ljubljana
Uvod
Določanje klonalnosti limfoidnih proliferacij in dokazovanje specifičnih genetskih sprememb ima pomembno vlogo v diagnostiki limfoidnih neoplazem, saj omogoča ločevanje med neoplastičnimi lezijami in reaktivnimi procesi. Klonal-no populacijo limfoidnih celic lahko dokažemo s pomnoževanjem preurejenih genov, ki kodirajo težko verigo imunoglobulina (IgH) pri B-celičnih limfomih in y verigo receptorja T (TcRy) pri T-celičnih limfomih. Z metodo PCR lahko dokažemo tudi kromosomsko translokacijo t(14;18)(q32;q21) oziroma preurejeno področje bcl-2/lgH pri folikularnem limfomu. Uvedli smo tehnike za določanje klonalnosti limfoidnih proliferacij in dokazovanje specifične kromosomske translokaclje t(14;18), ki temeljijo na polimerazni verižni reakciji.
Metode
Opravili smo molekularno biološko preiskavo 168 biopsij različnih limfoprolif-erativnih bolezni, ki jih nismo mogli opredeliti s klasičnimi morfološkimi in imunofenotipskimi metodami. Tkivne vzorce fiksirane v formalinu in vklopljene v parafin smo zbirali na Oddelku za patologijo Onkološkega inštituta v času od 1997-2005. DNA smo izolirali po ustaljeni metodi. Preurejene gene za IgH in TcRysmo pomnožili z uporabo oligonukleotidnih začetnikov, ki se prilegajo na ohranjena področja variabilnih (angl. variable, V) in spajalnih (angl. joining J) genskih segmentov. Pomnožene produkte smo analizirali z gelsko elektrofore-zo v 10% poliakrilamidnem gelu, obarvanem z etidijevim bromidom, in fotografirali pod UV svetlobo.
Rezultati
Z uporabo novih, molekularnih metod smo določili klonalnost pri 146/167 analiziranih primerov (87,4%). Štiriinpetdeset lezij (32.3%) je bilo monoklon-skih in 92 lezij (55,1%) poliklonskih. Pri 21 primerih (12,6%) nismo mogli
89
določiti klonalnosti: 3 primeri so bili oligoklonski, 12 primerov smo opredelili kot »monoklonsko v poliklonskem ozadju« in 6 primerov je bilo negativnih. Upoštevajoč rezultate tako klasičnih histopatoloških, kot molekularnih preiskav, smo določili tip limfoidne neoplazije pri 94,6% primerov. Od tega je bilo 31,5% B-celičnih limfomov, 21,4% T-celičnih limfomov, 4,8% primerov Hodgkinove bolezni in 36,9% reaktivnih limfoidnih proliferacij. Pri preostalih 5,4% primerov nismo mogli določiti tip limfoidne proliferacije. Preiskali smo tudi 26 limfopro-liforacij suspektnih za folikularni limfom. Pri 8 primerih (30,8%) srno dokazali kromosomsko translokacijo t(14;18)(q32;q21), 15 primerov (57,7%) je bilo negativnih in 3 primeri (11,5%) so bili nekonkluzivni.
Zaključki
Opisane molekularne metode so enostavne, hitre in uporabne tudi na majhnih količinah formalinsko fiksiranega, v parafin vklopljenega tkiva. V času sodobnih tehnik genomike in proteomike, določanje klonalnosti in specifičnih genetskih sprememb s klasičnimi metodami PCR še vedno prispeva pomembne klinične in diagnostične informacije.
90