UNIVERZA V LJUBLJANI Fakulteta za elektrotehniko Peter Kramar Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja MAGISTRSKO DELO Mentorica: doc. dr. Alenka Maček Lebar Ljubljana, 2005 Zahvala Iskreno se zahvaljujem mentorici doc. dr. Alenki Maček Lebar, univ. dipl. inž. el., za koristne nasvete in usmerjanje pri pisanju magistrskega dela. Za krmarjenje med podiplomskim študijem in delom na projektu se iskreno zahvaljujem študijskemu mentorju in „šefu” prof. dr. Damijanu Miklavčiču, univ. dipl. inž. el. Hvala vsem sodelavcem iz Laboratorija za biokibernetiko, ki so s svojim vzdušjem pripomogli k nastajanju magistrskega dela. Zahvala gre tudi mami in ženi Andreji. KAZALO I Kazalo 1 Uvod 5 2 Merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev 13 2.1 Kapacitivnost (C)................................ 13 2.2 Debelina lipidnega dvosloja (d) ........................ 16 2.3 Upornost (R) oziroma prevodnost (G) .................... 17 2.4 Merjenje nastanka por in pretok snovi (*).................. 18 2.5 Porušitvena napetost ravninskega lipidnega dvosloja (Ubr) ......... 19 2.6 Analiza merjenj lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev ........... 19 3 Sistemi za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev 23 3.1 Napetostno vzbujanje.............................. 24 3.1.1 Pravokotna oblika signalov....................... 24 3.1.2 Sinusna oblika signalov......................... 29 3.2 Tokovno vzbujanje............................... 33 3.3 Pregled sistemov za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev .... 35 4 Merjenje porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja z linearno naraščajočim signalom 37 4.1 Materiali in metode............................... 39 4.1.1 Sistem za elektroporacijo lipidnih dvoslojev ............. 39 4.1.2 Priprava raztopin............................ 40 4.1.3 Merilni protokol............................. 41 4.1.4 Določitev življenjske dobe ravninskega lipidnega dvosloja...... 43 4.1.5 Statistika ................................ 44 5 Zaključek 49 Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja II KAZALO A Tabela pregleda sistemov za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvo-slojev 57 B Tabela lipidnih molekul 61 C Pregled izmerjenih lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev 65 Peter Kramar Povzetek 1 Povzetek Lipidne molekule so v naravi poglaviten del celiˇcne membrane tako rastlinskih kot ˇzivalskih celic. Sestavljene so iz polarne hidrofilne glave in nepolarnega hidrofobnega repa. Zaradi njihovih fizikalnih lastnosti in enostavnosti lahko tvorijo ˇsiroko paleto struktur: enoslojev, dvoslojev, veˇcslojev, veziklov in micel. V tako ˇsirokem spektru lipidnih struktur smo se omejili na opazovanje ravninskih lipidnih dvoslojev, ki jih z obeh strani obdaja vodna raztopina. Lastnosti, ki jih opazujemo na ravninskem lipidnem dvosloju, so: kapacitivnost, debelina, upornost oziroma prevodnost, pretok snovi in poruˇsitvena napetost. Vsaka lastnost zahteva svoj princip merjenja. Signale, s katerimi ravninski lipidni dvosloj vzbujamo, delimo na napetostne in tokovne. Kadar raziskujemo pojav elektroporacije v biomedicini in biotehnologiji, je poruˇsitvena napetost ena izmed pomembnejˇsih lastnosti ravninskega lipidnega dvosloja. Znano je, da je poruˇsitvena napetost odvisna od sestave ravninskega lipidnega dvosloja in koncentracije okoliˇskega elektrolita ter od trajanja izpostavitve elektriˇcnemu polju. Najpogosteje uporabljen protokol za merjenje poruˇsitvene napetosti je vzbujanje ravninskega lipidnega dvosloja s pravokotnimi napetostnimi signali. Napetost prvega pulza je nizka, tako da ˇse ne poruˇsi ravninskega lipidnega dvosloja. Vsak naslednji pulz, ko ravninski lipidni dvosloj ˇse ni poruˇsen, poveˇcamo za izbran napetostni korak. Amplitudi pulza, pri katerem se ravninski lipidni dvosloj poruˇsi, pravimo poruˇsitvena napetost ravninskega lipidnega dvosloja. Pri uporabi takˇsnega protokola ˇstevilo pulzov, ki jih dovedemo na ravninski lipidni dvosloj, ni vnaprej znano. Ravno tako ni znano, kolikˇsen bo vpliv seˇstevka vseh signalov, ki ga definiramo kot pred-izpostavitev ravninskega lipidnega dvosloja. V svojem magistrskem delu sem ˇzelel poiskati metodo, s katero bi omejil vlogo pred-izpostavitve ter nakljuˇcnosti ˇzivljenjskega ˇcasa ravninskega lipidnega dvosloja in mu do-loˇciti pravo” poruˇsitveno napetost. ” Predlagal sem merilni protokol, ki je sestavljen iz dveh korakov. V prvem koraku izmerimo kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja s pravokotnim pulzom nizke napetosti. Le-ta mora biti dovolj nizka, da ravninskega lipidnega dvosloja ne poruˇsimo. V Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 2 Povzetek drugem koraku izmerimo porušitveno napetost ravninskega lipidnega dvosloja z linearno naraščajočim signalom. Rezultati kažejo, da sta porušitvena napetost in življenjska doba ravninskega lipidnega dvosloja odvisni od naklona linearno naraščajočega napetostnega signala. Pri manjšem naklonu signala je ravninski lipidni dvosloj dalj časa pred-izpostavljen električnemu polju in ima nižjo porušitveno napetost. Ob večjem naklonu je ravninski lipidni dvosloj izpostavljen električnemu polju krajši čas, izmerjena porušitvena napetost pa je višja. Linearno naraščajoč napetostni signal povzroči, da se deformacije, ki nastanejo na membrani zaradi električnega polja, ne povrnejo v prvotno stanje, temveč se proces konča z porušitvijo ravninskega lipidnega dvosloja. Naši rezultati se skladajo z ugotovitvami, ki so jih dobili z molekularno dinamičnimi modeli ravninskih lipidnih dvoslojev. Prav tako so primerljivi s poizkusi na veziklih, kjer so namesto porušitvene napetosti opazovali mehansko trdnost lipidnega dvosloja ob linearnem naraščanju tlaka. Peter Kramar Abstract 3 Abstract Lipid molecules are an important part of the cell membrane. They are composed of polar hydrophobic heads and nonpolar hydrophilic tails. Due to physical properties and simplicity they can build a wide spread of self assembly systems such as: monolayer, bilayer, vesicles and micelles. We studied planar lipid bilayer surrounded by water solution from both sides. The properties studied on planar lipid bilayer were: capacity, thickness, conductivity, resistivity, fluctuations and voltage breakdown. Each property demands its own measurement principal. The signal used, are voltage clamp or current clamp. Voltage breakdown is one of the most important properties when studying the phenomena of electroporation in biomedicine and biotechnology. The most common protocol for measuring voltage breakdown is using square shaped signals. The first pulse is low, so that the planar lipid bilayer does not break down. Every subsequent pulse amplitude is higher for the selected voltage step until the planar lipid bilayer is broken down. We define the amplitude, at which the planar lipid bilayer layer is broken down as the voltage breakdown of planar lipid bilayer. Using this particular protocol, the number of pulses is not known in advance. The summation of all the applied pulses before the voltage breakdown, the so called pretreatment is thus not known. With my research, I wanted to find the method that would allow me to restrict the role of pretreatment and the coincidence of the planar lipid bilayer’s lifetime, thus establishing its ”true” voltage breakdown. We suggested a new measurement protocol for determinate planar lipid bilayer voltage breakdown. According to our measuring protocol each planar lipid bilayer is exposed to a voltage signal only twice. In the first step bilayer capacitance is determined by a rectangular low voltage signal. The capacitance measurement reveals an intact planar lipid bilayer before inducing its breakdown. In the next step, the planar lipid bilayer breakdown is induced by the linearly rising voltage signal. Our results show that the planar lipid bilayer lifetime depends on the slope of the linearly rising voltage signal and the voltage breakdown is function of the linearly rising voltage signal slope. Gently sloping voltage signal pre-treats the lipid bilayer at a relatively Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 4 Abstract lower voltages then steep voltage signal, before lipid bilayer breakdown occurs. By the linearly rising signal the deformation of the planar lipid bilayer does not reseal to its initial state, but concludes with the planar lipid bilayer breakdown. Our results are consistent with other experiments treated in various articles. They correspond to planar lipid bilayer molecular models on and to experiments on vesicles, where linearly rising pressure was used to observe the mechanical stress on the membrane. Peter Kramar 5 1 Uvod Lipidi so v naravi poglaviten del celiˇcne membrane tako rastlinskih kot ˇzivalskih celic. Lipidne molekule so sestavljene iz polarne hidrofilne glave in nepolarnega hidrofobnega repa (slika 1A-C). Zato skupek molekul v vodi tvori energijsko ugodno strukturo tako, da repi nikoli niso izpostavljeni vodnim molekulam. Prav ta lastnost in njihova preprostost jim omogoˇca uporabnost na razliˇcnih podroˇcjih kot so biologija, kemija, fizika in medicina. Obstaja ˇsiroka paleta lipidnih struktur: enoslojev (slika 1D,E), dvoslojev (slika 1F-H), veˇcslojev, zaprtih dvoslojev oziroma veziklov (slika 1G) in zaprtih enoslojev oziroma micel (slika 1D,E) ter veliko razliˇcnih sistemov za tvorjenje teh struktur, saj jih lahko tvorimo v razliˇcnih okoljih (tabela 1). Nekaj v eksperimentalnih ˇstudijah najpogosteje uporabljenih lipidnih molekul smo zbrali v dodatku B. Tabela 1. Lipidne strukture in okolja v katerij jih tvorimo [1]. ime lipidne strukture vmesniki 1. milni filmi 2. lipidni enosloji 3. miceli (voda v olju) miceli (olje v vodi) 4. veˇcsloji 5. ravninski lipidni dvosloj 6. liposomi, vezikli 7. lipidni enosloj na zlatu 8. lipidni dvosloj na kovini 9. lipidni dvosloj na gelu 10. vezani lipidni dvosloj zrak | milnica | zrak zrak | plast lipidov | voda voda | plast lipidov | olje olje | plast lipidov | voda zrak | plasti molekul | voda voda | lipidni dvosloj | voda voda | lipidni dvosloj | voda zrak | plast lipidov | zlato voda | lipidni dvosloj | kovina voda | lipidni dvosloj | vodni gel zlato | vezne molekule | lipidni dvosloj Leta 2001 je bila 40. obletnica prve uspešne postavitve ravninskega lipidnega dvosloja kot modela celične membrane [2]. Vendar se je zgodovina lipidnih dvoslojev začela že mnogo pred tem. Eden prvih mejnikov v zgodovini je bilo leto 1672, ko je Robert Hooke, fizik, ki je dal ime „celici” in je znan predvsem po preučevanju elastičnih lastnosti snovi, opazoval črne lise na milnih mehurčkih in filmih. Raziskovanje umetnih membran je potekalo vzporedno z odkrivanjem lastnosti bioloških celic, odkritjem osmoze in preučevanju gibanja snovi skozi membrano. Odkrili so tudi, da ima membrana rdečih krvnih telesc izredno visoko električno upornost. Leta 1925 je bila prvič izmerjena kapacitivnost mem- Meritev porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 6 1. Uvod brane rdečih krvnih telesc. Kopica zanimivih lastnosti, ki jih ima biološka membrana, je botrovala nastanku različnih merilnih sistemov, namenjenih določanju teh lastnosti. V devetdesetih letih so veliko časa posvetili kemični strukturi umetnih membran. Preučevali so vplive različnih koncentracij lipidnih molekul na kapacitivnost lipidnih dvoslojev, njihovo prevodnost ter stabilnost. Poleg tega so preučevali vplive različnih koncentracij soli v okoliški vodni raztopini na stabilnost lipidnega dvosloja ter obnašanje lipidnega dvosloja pri različnih temperaturah. V kasnejših raziskavah so dodajali ravninskemu lipidnemu dvosloju različne molekule, ki so njegove lastnosti spremenile. Slika 1. A) Kemiˇcna struktura lipidne molekule POPC. B) Shema lipidne molekule. C) Model lipidne molekule POPC. D) Micela (voda v olju). E) Micela (olje v vodi). F) Ravninski lipidni dvosloj tvorjen v komori. G) Liposom. H) Lipidni dvosloj [1, 3-5]. Celična membrana in membrane celičnih organelov so v večini sestavljene iz lipidnih Peter Kramar 7 dvoslojev, v katerem so tudi proteinske molekule. Zaradi oblike celice je teˇzko meriti lastnosti membrane, saj bi morali posegati v notranjost celice ali celo celiˇcne strukture. Umeten lipidni dvosloj je sicer preprost, a velikokrat zadovoljiv model celiˇcne membrane. Tvorimo lahko vezikle ali liposome, katerih oblika je podobna celici, vendar je zgradba membrane v obeh primerih zelo poenostavljena v primerjavi s pravo celiˇcno membrano (slika 1G). Druga moˇznost je ravninski lipidni dvosloj, ki si ga lahko predstavljamo kot del membrane. Poglavitna prednost ravninskega lipidnega dvosloja je, da je med merjenjem dostopen z obeh strani. Z ˇsirokega nabora lipidnih struktur smo se omejili na opazovanje ravninskih lipidnih dvoslojev. Ravninske lipidne dvosloje obiˇcajno pripravimo v posebni komori, ki je sestavljena iz dveh prekatov. Prekata loˇcuje teflonska folija, v kateri je majhna luknjica s premerom od 0,1 do 1 mm. Na rob luknjice napnemo ravninski lipidni dvosloj z eno od naslednjih metod: metodo barvanja, metodo dvigovanja gladine ali metodo potopitve konice [6, 7]. Metoda barvanja (ang. painted bilayer) ali Muller - Rudinova metoda se je razvila med prvimi. Vodna raztopina soli je pripravljena v komori, s pipeto pa nanesemo (obarvamo) lipide na teflonsko folijo, ki loˇcuje prekata komore (slika 2A). V zaˇcetku so lipidne molekule zdruˇzene v veliko gmoto (slika 2B), sˇcasoma pa se enakomerno porazdelijo po teflonski foliji in na luknjici nastane ravninski lipidni dvosloj (slika 2C). Slika 2. Metoda barvanja. A) Komora z vodo in nanos lipidov na teflonsko folijo, ki deli prekata komore. B) Gmota naneˇsenih lipidov se enakomerno razporedi po teflonski foliji, odveˇcni odplavajo na gladino. C) Po doloˇcenem ˇcasu nastane lipidni dvosloj. Metoda dvigovanja gladine (ang. folded bilayer) oziroma Montal - Mullerjeva metoda je ena od najpogostejˇsih metod za preuˇcevanje lipidnih dvoslojev. Oba prekata komore napolnimo z vodno raztopino soli pod nivojem luknjice v teflonski foliji. Na gladino obeh Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 8 1. Uvod prekatov nanesemo lipide in poˇcakamo, da se enakomerno porazdelijo po gladini (slika 3A). Obe gladini nato soˇcasno dvignemo tako, da je luknjica potopljena v tekoˇcini (slika 3B). Na luknjici v teflonski foliji tako nastane lipidni dvosloj (slika 3C). Prednost te metode pred metodo barvanja je predvsem v tem, da lahko s spuˇsˇcanjem in dviganjem gladine v prekatih tvorimo lipidne dvosloje enega za drugim, brez daljˇsega ˇcakanja. niiHjHH A mmmmmumu B MwimwimmwM Slika 3. Metoda dviganja gladine. A) Gladino vode postavimo tik pod luknjico v teflonski foliji. Na povrˇsino nanesemo lipidne molekule in poˇcakamo, da se porazdelijo enakomerno po gladini. B) V obeh prekatih enakomerno dvignemo gladino vode. C) Na luknjici teflonske folije tvorimo lipidni dvosloj. Pri metodi potopitve konice (ang. Tip-Dip bilayer) potrebujemo kopel, v katero potopimo cevko premera nekaj milimetrov. Na gladino vodne raztopine soli nanesemo lipidne molekule, ki se porazdelijo po celotni gladini in na rob cevke (slika 4A). Ko cevko, dvignemo iz kopeli, na njej nastane lipidni enosloj, nato poˇcakamo nekaj ˇcasa, da se molekule lipidov na gladini ponovno razporedijo (slika 4B). Ko cevko ponovno potopimo, nastane na njeni konici ravninski lipidni dvosloj (slika 4C). mvmmmmmwmmmmiKmwivifmm B Slika 4. Metoda potopitve konice. A) V kopel potopimo ozko cevko in nanesemo molekule lipidov. B) Cevko dvignemo, C) in jo ponovno potopimo, tako da se na njej tvori ravninski lipidni dvosloj. Ce želimo uporabiti ravninski lipidni dvosloj kot model celične membrane, se moramo zavedati razlik med lastnostmi lipidnih dvoslojev ter lastnostmi biološke membrane. V tabeli 2 so zapisana območja vrednosti, ki smo jih za različne lastnosti biološke membrane Peter Kramar 9 in lipidnih dvoslojev zasledili v literaturi. Zanimive lastnosti tako celične membrane kot ravninskega lipidnega dvosloja so predvsem njegova debelina, transmembranska napetost, električna upornost oziroma prevodnost membrane, porušitvena napetost in kapacitivnost membrane. Tabela 2. Primerjava lastnosti različnih bioloških membran ter lipidnih dvoslojev [3, 4]. lastnost -metoda biološka membrana lipidni dvosloj debelina (nm) -elektronska mikroskopija 4- 13 9 - 6 -odklon rendgenskega valovanja 4- 8,5 — -optične metode — 4- 8 -s kapacitivnostjo (ob predpostavki vrednosti dielektriˇcne konstante) 3 -15 4- 13 transmembranska napetost (mV) 10 - 88 0- 140 specifična upornost (Qcm2) 102 - 105 103 - 109 porušitvena napetost (mV) 105 - 106 100 - 550 specifična kapacitivnost (ßF/cm2) 0,5 - 1,3 0,3 - 1,3 indeks svetlobne odbojnosti okoli 1,6 1,37-1,66 natezna napetost (ßJ/cm2) 0,3 - 30 2- 60 Lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev veˇcinoma doloˇcamo z meritvijo toka oziroma napetosti preko ravninskega lipidnega dvosloja ali z optiˇcnim opazovanjem, kjer opazujemo odklon ˇzarka ter absorpcijo svetlobe v ravninskem lipidnem dvosloju. Obe vrsti meritev lahko med seboj tudi kombiniramo. Omenjeni naˇcini merjenja so osnova za opazovanje tako enostavnih ravninskih lipidnih dvoslojev kot tudi dvoslojev, ki smo jim dodali razliˇcne molekule ter na ta naˇcin spremenili njihovo kapacitivnost, prevodnost ali stabilnost [8, 9]. V ravninski lipidni dvosloj lahko vgradimo tudi proteine, ki delujejo kot senzor za opazovanje prehoda molekul skozi membrano. Sestavo ravninskega lipidnega dvosloja lahko izberemo poljubno in jo s tem pribliˇzamo sestavi prave celiˇcne membrane [1]. Na takem preprostem modelu lahko tudi preuˇcujemo, kako na celiˇcno membrano vplivajo elektromagnetna valovanja [10]. Ravninske lipidne dvosloje pa je mogoˇce uporabiti tudi kot enostaven model tankih plasti Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 10 1. Uvod [11]. V nadaljevanju se bomo osredotoˇcili na opazovanje ravninskih lipidnih dvoslojev in doloˇcanje njihovih lastnosti na podlagi meritev napetosti in toka. Ravninski lipidni dvo-sloj namreˇc lahko predstavimo s preprostim elektriˇcnim vezjem (slika 5). Napetostno ali tokovno vzbujanje tega preprostega vezja je lahko osnova za izraˇcun vrednosti njegovih elementov, ki doloˇcajo lastnosti ravninskega lipidnega dvosloja. Slika 5. Nadomestno vezje ravninskega lipidnega dvosloja. Pri pregledovanju lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev smo se osredotoˇcili na metode merjenja kapacitivnosti, upornosti, debeline in poruˇsitvene napetosti. Za merjenje posamezne veliˇcine namreˇc lahko uporabimo razliˇcne pristope, s katerimi se znanje o doloˇcenem ravninskem lipidnem dvosloju dopolnjuje. Natanˇcneje smo se seznanili z napetostnim in tokovnim vzbujanjem ravninskih lipidnih dvoslojev. Zanimalo nas je, s kakˇsnimi oblikami signalov se sreˇcujemo pri posameznem vzbujanju ter katere lastnosti lahko z njimi opazujemo (slika 6). Peter Kramar 11 Slika 6. Pregled različnih načinov določanja lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev. I predstavlja tokovno vzbujanje in U napetostno vzbujanje. Oblika signala vzbujanja je narisana v krožcu. S takimi vzbujanji lahko merimo veličine kot so pretok snovi (VO, porušitveno napetost (U*), debelina (d), kapacitivnost (C) in upornost (R). Z rdečo je obarvan signal vzbujanja ter vrsta meritev, ki jih lahko opravimo v Laboratoriju za biokibernetiko. Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 13 2 Merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev Skozi zgodovino so sisteme za opazovanje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev spreminjali. Izboljševali so principe merjenja, napredovala je natančnost merilnih instrumentov. Poleg merilnih instrumentov so razvijali tudi komore, v katerih so tvorili ravninske lipidne dvosloje. Pregled sistemov sem pričel z letom 1971, deset let po prvi postavitvi ravninskega lipidnega dvosloja. V tem času je izzvenela doba pionirskih sistemov in poizkusov. 2.1 Kapacitivnost (C) V literaturi zasledimo tri različne metode merjenja kapacitivnosti: merjenje časovne konstante razelektritve ravninskega lipidnega dvosloja, z izmenično napetostjo sinusne oblike in s kapacitivnostno časovnim pretvornikom. Pri vseh treh metodah izmerjeno kapacitivnost normiramo na površino lipidnega dvosloja. Tako dobljeno specifično kapacitivnost namreč lahko primerjamo med različnimi avtorji. Najpogosteje je kapacitivnost izmerjena na podlagi meritve časovne konstante razelektritve ravninskega lipidnega dvosloja [8, 9, 12-17]. Ravninskemu lipidnemu dvosloju vsilimo napetost izbrane velikosti. Naboj, ki se pri tem nabere na lipidnem dvosloju, je Q(t) = CU {t). Ob času t0, ko je pulza konec, se naboj razelektri preko upora, katerega upornost poznamo. Razelektritev ravninskega lipidnega dvosloja lahko opazujemo z osciloskopom (slika 7). u(V)a to ""KS) Slika 7. Merjenje kapacitivnosti lipidnega dvosloja z razelektritvijo. Napetost na ravninskem lipidnem dvosloju u(t) se ob razelektritvi s časom spreminja kot: Meritev porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 14 2. Merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev u{t) = U0e~ (1) U0 je velikost vsiljene napetosti; r časovna konstanta, ki je odvisna od kapacitivnosti (C) in upornosti lipidnega dvosloja ter merilnega sistema (E), R-C. (2) Če poznamo upornost merilnega sistema in je ta mnogo manjša od upornosti ravninskega lipidnega dvosloja (~ IO8 Q), lahko kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja določimo z meritvijo, ki je sestavljena iz dveh delov. Najprej izmerimo kapacitivnost sistema (Caia) brez ravninskega lipidnega dvosloja, v drugem delu pa kapacitivnost sistema z lipidnim dvoslojem (Csblm)- Kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja CBLM je razlika obeh izmerjenih kapacitivnosti (slika 8): Cblm = Csls - Csblm- (3) R C V K™ v v Rnad V Rnad v v v v RH B ^nad V v Slika 8. Nadomestni vezji pri merjenju kapacitivnosti v dveh korakih. A) Nadomestno vezje sistema brez ravninskega lipidnega dvosloja. B) Nadomestno vezje sistema in ravninskega lipidnega dvosloja. Pri obeh vezjih upornost lipidnega dvosloja lahko zanemarimo, ker je mnogo veˇcja od upornosti sonde osciloskopa in upora. Metoda je najpogostejˇsa zato, ker je njena izvedba preprosta; potrebujemo le napetostni vir, hitro stikalo in spominski osciloskop za opazovanje. T _ Peter Kramar 2.1. Kapacitivnost (C) 15 Kapacitivnost je mogoˇce meriti tudi z izmeniˇcno napetostjo [18–20]. Z uporabo sinusnega signala amplitude 2 mV in frekvence 1 kHz se spremeni karakteristika nadomestnega vezja ravninskega lipidnega dvosloja (slika 5). Zaradi visoke frekvence teˇce celoten tok preko kondenzatorja; upornost je zanemarljiva. Usmerjena izhodna napetost se spreminja v odvisnosti od vrednosti kapacitivnosti lipidnega dvosloja. Kapacitivnost lahko napnemo na paraboliˇcno funkcijo [18]: Cblm = a V\h b-Vlh (4) pri ˇcemer je V1h izhodna usmerjena napetost, a in b pa sta parametra, ki ju doloˇcimo s predhodno meritvijo spektra znanih kapacitivnosti. Kapacitivnost lahko merimo tudi tako, da vrednost kapacitivnosti pretvorimo v periodo [21]. S ˇcasovnim vezjem enakomerno nabijemo lipidni dvosloj do neke napetostne vrednosti, po tem ko jo doseˇzemo, pa ravninski lipidni dvosloj praznimo. Tak periodi-ˇcen pojav nam na izhodu vezja da pravokotni signal s svojo periodo, ki je odvisna od kapacitivnosti lipidnega dvosloja (slika 9). pv'+sv <»-----------------1 68k S R,5k ^ R3 8,8M I _C 160pF r son LM108A +1,6 vf A 14 NE555 s q W H> S „ >• -5V izhod -1,6 V +5 V' B 3 \ 6V-5V B +5V C -5V +15 mV 4 D -15 mV B Slika 9. A) Vezje za transformacijo kapacitivnosti v periodo. B) Potek signalov na posamezni toˇcki v vezju [21]. Kondenzator CBLM predstavlja kapacitivnost lipidnega dvosloja. Na kondenzatorju merimo napetost v točki D in jo ojačimo z operacijskim ojačevalnikom. Le-ta ima ojačanje k določeno z uporoma Rx in R2: Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 16 2. Merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev Izhod ojačevalnika je pripeljan v integrirano vezje NE555. V integriranem vezju imamo dva napetostna primerjalnika, ki imata na vhodih merjeno napetost v točki A, na drugem vhodu pa razdeljeno napetost, ki gre preko delilnika treh uporov. Glede na nivo napetosti se preklopi izhod na RS celici. Izhod iz celice invertiramo, rezultat pa je pravokotni signal, kateremu zlahka izmerimo periodo. Napetost na lipidnem dvosloju lahko izrazimo z enačbo kjer je V = V+ = \V~\ simetrično napajanje vezja. Merjenje kapacitivnosti razdelimo v dve fazi. Prva faza je polnjenje kondenzatorja, kjer teče tok iz napajalnika preko uporov R4 in R3 v kondenzator. Tranzistor T je zaprt. V drugi fazi se zaradi preklopa RS celice tranzistor T odpre in kondenzator se razelektri. Tok teče preko upora R3 in tranzistorja T v negativni pol napajanja. Zaradi ohranjanja energije velja, da je produkt napetosti in časa v eni periodi enak: T-V= Ublm (R3 + R,) Cblm + UblmRsCblm- (7) Če v vezju izberemo vrednost upora R3 > RA, lahko v enačbi (7) zanemarimo upornost RA. Periodo polnenja in praznenja kondenzatorja lahko izrazimo kot: v ZUblmRsCblm ,a, = -----------TT-----------• \°) 2.2 Debelina lipidnega dvosloja (d) Debelino lipidnega dvosloja (d) določimo neposredno iz kapacitivnosti. Iz literature je znano, da je dielektrična konstanta e lipidnih molekul enaka 2,1 [14]. Iz enačbe za ploščat kondenzator izrazimo debelino lipidnega dvosloja Peter Kramar 2.3. Upornost (R) oziroma prevodnost (G) 17 kjer je e dielektričnost ravninskega lipidnega dvosloja, e0 dielektrična konstanta, A površina in Cblm kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja. Če se izmerjena debelina razlikuje od standardnih vrednosti, je zelo verjetno, da v postopku priprave ni nastal li-pidni dvosloj temveč več slojev. Merjenje debeline je posebej pomembno, kadar tvorimo ravninske lipidne dvosloje z metodo barvanja. 2.3 Upornost (R) oziroma prevodnost (G) Upornost (R) oziroma prevodnost (G) lipidnih dvoslojev ponavadi določimo iz razmerja toka in napetosti. Kadar vzbujamo lipidni dvosloj z napetostjo, lahko z opazovanjem toka neposredno opazujemo prevodnost. Obratno je pri tokovnem vzbujanju, ko opazujemo upornost ravninskega lipidnega dvosloja z merjenjem napetosti. Na podlagi meritev toka in napetosti izračunamo upornost, ki je pri lipidnem dvosloju izredno velika (reda IO8 Q). Pri pregledu literature sem opazil zanimiv sistem, v katerem ravninski lipidni dvosloj vzbujajo s sinusnim signalom amplitude od 0,1 do 1,5 V in frekvence 1 Hz. Temu signalu je prištet še sinusni signal amplitude 2 mV in frekvence 1 kHz [18-20]. Z 1 kHz signalom merijo kapacitivnost, kot sem opisal v razdelku o merjenju kapacitivnosti z izmenično napetostjo. Nadomestno vezje za tak sistem vidimo na sliki 10. Za vezje lahko zapišemo napetostni enačbi za realni in imaginarni prispevek napetosti: Vl cos (ip-ipi) + Vblm cos {ipBLM - ----- Slika 10. Nadomestno vezje sistema ter kazalˇcni diagram [18–20]. 2.4 Merjenje nastanka por in pretok snovi (*) V literaturi zasledimo opis meritev pretoka snovi skozi sam ravninski lipidni dvosloj ali ob vgradnji različnih dodatkov, kot so kalcijevi kanalčki ali drugi proteini. Tako na primer vgradimo v lipidni dvosloj kalcijev kanalček. Ravninski lipidni dvosloj vzbujamo z električnim tokom in merimo napetost, na njem. Kadar je kalcijev kanalček odprt napetost na dvosloju pade; če je kanalček zaprt, pa se njena napetost na njem poveča. Na enak Peter Kramar 2.5. Poruˇsitvena napetost ravninskega lipidnega dvosloja (Ubr) 19 naˇcin lahko opazujemo, ali so v ravninskem lipidnem dvosloju nastale pore ter ocenjujemo njihovo ˇstevilo in velikost [12, 18, 22–29]. 2.5 Poruˇsitvena napetost ravninskega lipidnega dvosloja (Ubr) Z meritvijo poruˇsitvene napetosti dobimo podatek o mehanski trdnosti in stabilnosti lipi-dnega dvosloja v elektriˇcnem polju ali ob vsiljeni transmembranski napetosti. Poruˇsitveno napetost obiˇcajno merimo tako, da opazujemo tok ob napetostnih pulzih, ki jih dovedemo na ravninski lipidni dvosloj. Velikost napetostnih pulzov poveˇcujemo vse dotlej, ko zaznamo poveˇcanje elektriˇcnega toka. Elektriˇcni tok je znak, da je ravninski lipidni dvosloj podrt. Amplitudo napetostnega pulza, s katerim smo ravninski lipidni dvosloj poruˇsili, imenujemo poruˇsitvena napetost [8]. Na tak naˇcin doloˇcena poruˇsitvena napetost je odvisna od ˇcasa trajanja pulza ter predhodne izpostavitve ravninskega lipidnega dvosloja elektriˇcnemu polju [30]. 2.6 Analiza merjenj lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev Ravninskim lipidnim dvoslojem lahko doloˇcamo kapacitivnost, debelino, upornost oziroma prevodnost ter poruˇsitveno napetost. Vse lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev merimo posredno z opazovanjem toka, napetosti ali spremembe optiˇcnih lastnosti. Za opazovanje lastnosti moramo ravninski lipidni dvosloj vzbujati z napetostjo ali tokom. Izbira napetosti ali toka pogojuje opazovanje sprememb na ravninskem lipidnem dvosloju. Z napetostjo ravninski lipidni dvosloj obiˇcajno hitro poruˇsimo vendar pa z napetostnim vzbujanjem merimo kapacitivnost. Tokovno vzbujanje ravninski lipidni dvosloj ne poruˇsi tako hitro zato je primeren za opazovanje dinamiˇcnih sprememb na ravninskem lipidnem dvosloju. Najpomembnejˇsa lastnost, ki jo na ravninskem lipidnem dvosloju merimo je kapacitiv-nost. V literaturi smo zasledili tri razliˇcne metode opazovanja kapacitivnosti. Najveˇckrat uporabljena metoda je metoda razelektritve, saj je najbolj preprosta ter dovolj natanˇcna. Dobra stran metode je tudi to, da je napetost na ravninskem lipidnem dvosloju prisotna samo med pulzom, ki obiˇcajno traja le od 10 do 100 µs. Pri obeh drugih metodah, je ravninski lipidni dvosloj izpostavljen izmeniˇcni napetosti celoten ˇcas meritve, ki je obi-Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 20 2. Merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev ˇcajno daljˇsi. Prednost metode z izmeniˇcno napetostjo je v tem, da lahko soˇcasno merimo upornost in kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja. Kapacitivnost je povezana s kvaliteto ravninskega lipidnega dvosloja; primerjava vrednosti kapacitivnosti z vrednostjo navedeno v literaturi nam pove ali imamo lipidni dvosloj ali veˇcsloj. Meritev kapaci-tivnosti je obvezna pred vsakim eksperimentom, metodo pa izberemo glede na nadaljne poizkuse in zanimanja. Debelino ravninskega lipidnega dvosloja ponavadi izraˇcunamo iz podatka o kapacitiv-nosti in dielektriˇcne konstante. Upornost oziroma prevodnost obiˇcajno preraˇcunamo iz izmerjenega toka oziroma napetosti na ravninskem lipidnem dvosloju. Kadar dovedemo na ravninski lipidni dvosloj napetost in opazujemo tok, se na ravninskem lipidnem dvosloju zaradi napetosti zgodijo hitre spremembe. Tako ponavadi lahko samo opazimo le stanje, ko tok priˇcne teˇci skozi ravninski lipidni dvosloj oziroma ko se upornost ravninskega lipidnega dvosloja zmanjˇsa. Natanˇcen podatek o upornosti dobimo z metodo, pri kateri vzbujamo ravninski lipidni dvosloj z dvema izmeniˇcnima napetostima in na predpostavki elektriˇcnega modela dobimo soˇcasno podatka o upornosti in kapacitivnosti ravninskega lipidnega dvosloja. Za pretok snovi se ponavadi uporablja enak princip merjenja kot za upornost, saj opazujemo, kolikˇsen tok prodira skozi ravninski lipidni dvosloj. Obiˇcajno pri opazovanju pretoka skozi ravninski lipidni dvosloj dovedemo tok, ter opazujemo napetost, ki se na njem postavi. Dovajanje toka nam zagotavlja veˇcjo verjetnost, da se ravninski lipidni dvosloj med meritvijo ne bo poruˇsil. Krivulja napetosti nam posredno govori o upornosti ravninskega lipidnega dvosloja in je obratno sorazmerna s prevodnostjo in s tem s pretokom snovi. Poruˇsitvena napetost je napetost pri kateri se ravninski lipidni dvosloj poruˇsi zaradi napetostnega stresa. Najpogostejˇsi princip doloˇcanja poruˇsitvene napetosti je s pravokotnim napetostnim signalom. Meritev zaˇcnemo z nizko napetostjo, ki jo v korakih poveˇcu-jemo do vrednosti, s katero ravninski lipidni dvosloj poruˇsimo. Iz literature je znano, da pred-izpostavitev ravninskega lipidnega dvosloja napetosti vpliva na njegovo poruˇsitveno napetost. V svojem magistrskem delu sem ˇzelel poiskati metodo, s katero bi omejil vlogo pred-Peter Kramar 2.6. Analiza merjenj lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev 21 izpostavitve ter naključnosti življenjskega časa ravninskega lipidnega dvosloja in mu določiti pravo” porušitveno napetost. Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 23 3 Sistemi za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev V tem poglavju sem zbral osnovne merilne principe razliˇcnih sistemov za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev, ki so opisani v literaturi. V sploˇsnem velja, da je vsak novejˇsi sistem vsaj deloma izpeljanka starejˇsega, ˇze obstojeˇcega sistema. Sisteme sem poimenoval po prvih avtorjih znanstvene publikacije. Kadar je idejno isto zasnovo sistema objavilo veˇc prvih avtorjev, sem tudi ime sistema sestavil. Sisteme sem glede na vzbujanje ravninskega lipidnega dvosloja razdelil na napetostno in tokovno. Sisteme z napetostnim vzbujanjem sem dodatno razdelil ˇse glede na obliko vzbujalnega signala. Opisal sem zgradbo vsakega sistema, uporabljeno metodo merjenja ter navedel poizkuse, ki so jih avtorji opravili. Za laˇzjo primerjavo sem podatke o sistemih zbral v tabeli, ki se nahaja v dodatku A. Tabela vsebuje ime sistema, oznako navedene publikacije, tip vzbujalnega signala in podatke o poizkusih, ki so jih avtorji izvedli, kot: uporabljene lipidne molekule lipidne molekule, vodne raztopine, volumni lipida, volumen komore, ˇstevilo in vrsta elektrod, premer ali povrˇsina luknjice ter temperatura med poizkusi. Za primerjavo izmerjenih lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev zgrajenih iz razliˇcnih lipidnih molekul ali njihovih meˇsanic, sem sestavil tabelo v dodatku C. Tabela vsebuje podatke o lipidnih molekulah, koncentracijah vodnih raztopin, oblikah vzbujal-nega signala in trajanju pravokotnega signala (ˇce je le-ta podan), izmerjeni poruˇsitveni napetosti, specifiˇcni kapacitivnosti normirani na povrˇsino, specifiˇcni upornosti normirani na povrˇsino, debelini ravninskega lipidnega dvosloja ter oznako navedene publikacije. Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 24 3. Sistemi za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev 3.1 Napetostno vzbujanje 3.1.1 Pravokotna oblika signalov Sistem Benz Sistem je bil objavljen leta 1976 [14, 17]. To je eden najpreprostejših sistemov za opazovanje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev. Sestavljen je iz generatorja enosmerne napetosti v območju 10 mV do 5,4 V, stikala in baterijskega pulznega generatorja. Stikalo je realizirano s hitrim FET tranzistorjem 2N5653. Napetostni odziv lipidnega dvosloja so merili s spominskim osciloskopom Tektronix 7633, pasovno širino odziva pa so omejili s pasovnim ojačevalnikom v pasu od 80 Hz do 40 MHz. Natančni podatki so zbrani v dodatkih A in C. 80 Hz-40 Mhz 10mV-5,4V Slika 11. Sistem Benz. Shemo sem narisal po opisu iz literature [14, 17]. V svojih zaključkih so podali kapacitivnosti in porušitvene napetosti različnih ravninskih lipidnih dvoslojev, kot tudi vpliv različnih koncentracij solne raztopine na njihovo kapacitivnost in porušit veno napetost. Benz-Zimmermann-Winterhalter Sistem je bil prviˇc opisan leta 1979 [17]. Je eden najbolj pogosto uporabljenih sistemov, pri katerem uporabljamo napetostno vzbujanje s pravokotnimi signali. Dioda, ki je med izhodom generatorja in elektrodo, pomaga, da se naboj na lipidnem dvosloju izprazni samo preko osciloskopa; tako dioda sluˇzi kot stikalo. Sistem je izredno preprost, zato je tudi tako ˇsiroko uporabljen. Skozi zgodovino so se spreminjali signalni generatorji ter osciloskopi. Sistem sem nazadnje zasledil v ˇclanku leta 2001 [24]. Natanˇcni podatki so Peter Kramar 3.1. Napetostno vzbujanje 25 zbrani v dodatkih A in C. )iačevalnik pulzni generator pulzrii generator okence digitalni spominski osciloskop / asm ma ce I____*J I if elektrodi ravninski lipidni dvosloj okence B ravninski lipidni dvosloj Slika 12. Sistem Benz-Zimmermann-Winterhalter. A) Starejˇsa izvedba sistema [16, 17, 26, 31]. B) Novejˇsi sistem [12, 13, 24]. S sistemom Benz-Zimmermann-Winterhalter so preuˇcevali vpliv koncentracije soli v vodni raztopini ter temperature na poruˇsitveno napetost [17]. Opazovali so tok skozi ravninski lipidni dvosloj in s tem ugotavljali, kako velika je koncentracija por v njem [24, 26, 31]. Naredili so tudi model, ki predpostavlja eno poro v ravninskem lipidnem dvosloju in glede na spremembo toka izraˇcunali hitrost, s katero se pora odpira [12, 13, 16]. Sistem Abidor-Chernomordik-Chizmadzev-Pastushenko Sistem je bil prviˇc omenjen leta 1979 [30]. Sestavljajo ga signalni generator, komora, ojaˇcevalnik in spominski osciloskop. Ima dva naˇcina delovanja: prvi je namenjen opazovanju ravninskega lipidnega dvosloja (slika 13A), drugi pa merjenju poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja (slika 13B). Natanˇcni podatki so zbrani v dodatkih A in C. V svojih rezultatih so avtorji podali odziv ravninskega lipidnega dvosloja na stopniˇcast signal. Opazovali so pretok snovi z merjenjem majhnega toka (10-11 A). Opazovali so tudi ˇzivljenjsko dobo ravninskega lipidnega dvosloja. Ravninski lipidni dvosloj so najprej izpostavili manjˇsim napetostim od 0 do 300 mV po 200 ms, za tem pa stopnici z amplitudo 500 mV. Pri slednjem so merili ˇcas poruˇsitve. Ugotovili so, da imajo ravninski lipidni Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 26 3. Sistemi za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev B Slika 13. Sistem Abidor-Chernomordik-Chizmadzev-Pastushenko [30]. Sistem ima dva naˇcina delovanja. A) za opazovanje ravninskega lipidnega dvosloja. B) za merjenje poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja. 1. pulzni generator, 2. operacijski tokovni ojaˇcevalnik, 3. zapisovalnik, 4. spominski osciloskop, 5. komora z ravninskim lipidnim dvoslojem. dvosloji, ki so bili izpostavljeni višjim predhodnim napetostim, pri 500 mV stopnici krajšo življenjsko dobo. Sistem Chanturya Sistem je bil prviˇc omenjen leta 1990 [32]. Sestavljen je iz signalnega generatorja, komore z lipidnim dvoslojem, operacijskega ojaˇcevalnika ter analogno-digitalnega pretvornika, ki podatke shrani v raˇcunalnik. Natanˇcni podatki so zbrani v dodatkih A in C. RH a < 2 J> 4> 5> 6 Slika 14. Sistem Chanturya [32]. 1. signalni generator, 2. invertor, 3. operacijski ojaˇcevalnik, 4. analogno-digitalni pretvornik, 5. raˇcunalnik, 6. tiskalnik. RM in CM sta nadomestno vezje za ravninski lipidni dvosloj, CC pa je kompenzacijski kondenzator. Peter Kramar 3.1. Napetostno vzbujanje 27 V rezultatih so opisali spremembe kapacitivnosti in prevodnosti ravninskega lipidnega dvosloja ob dodajanju toksinov ( ?- in ß- latrotoksin). Sistem Sharma-Stebe-Tung Sistem je nadgradnja Benzovega sistema in je bil prviˇc omenjen leta 1996 [8, 9]. Stikalo v obliki FET tranzistorja so zamenjali z dvopoloˇzajnim analognim stikalom. Na en vhod je bil prikljuˇcen signalni generator, na drugega pa visokoohmski upor (1 M?). Sistem sta sestavljala ˇse komora in spominski osciloskop. Natanˇcni podatki so zbrani v dodatkih A in C. diferencialni ojačevalnik ravninski lipidni dvosloj okence analogno stikalo signalni__ generator 1MQ Agarjevi mostički Slika 15. Sistem Sharma-Stebe-Tung [8, 9]. S tem sistemom so avtorji preučevali so kapacitivnost in prevodnost azolecitina ter razlike, ki se pojavijo z dodajanjem poloxaomera. Pri tem so vzbujali ravninski lipidni dvosloj z dvema signaloma. Prvi je bil pravokotni signal velikosti 100 mV in trajanja 10 (is, drugi pa Voltage clamp”. S prvim signalom so merili kapacitivnost ter porušitveno napetost. Posebnost drugega signala je, daje sestavljen iz pravokotnega signala, ki se konča z linearno padajočim signalom. Z linearno padajočim signalom opazujemo prevodnost ravninskega lipidnega dvosloja med porušitvijo [9]. Z enakim sistemom so preučevali tudi vpliv surfaktanta Cl2Es na porušitveno napetost. Uporabljali so signale širin od 10 ps do 10 s [8]. Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 28 3. Sistemi za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev Sistem Hanyu-Yamada-Matsumoto Pri tem sistemu so ravninski lipidni dvosloj soˇcasno vzbujali pravokotnim napetostnim signalom amplitud od 0,1 do 1 V ter s He-Ne laserjem. Opazovali so spremembo elektriˇcne napetosti na ravninskem lipidnem dvosloju ob vgrajevanju peptidov. Sistem je bil sestavljen iz optiˇcnega ter elektriˇcnega dela [33, 34]. Natanˇcni podatki so zbrani v dodatkih A in C. He-Ne laser zaslonka ND sito leča leča analizator zaslonka leča foto-pomnoževalka [ J-fH-J-«--^ ravno zrcalo 3 polarizator _____ozko pasovno sito 543 nm leča leča visoko pasovno polprepustno sito 550 nm zrcalo komora z ravninskim lipidnim dvoslojem števnik fotonov i ->[osebni računalnik [<- Slika 16. Sistem Hanyu-Yamada-Matsumoto [33, 34]. V rezultatih so opazovali premike fluorescentnih peptidov, ki so bili vgrajeni v ravninski lipidni dvosloj, ter pretok snovi skozi ravninski lipidni dvosloj. Sistem Vargas-Alorcon-Rojas Sistem je sestavljen iz EPC-7 ojaˇcevalnika, Besslovega pasovnega filtra ter 12-bitnih analogno-digitalnih in digitalno-analognih pretvornikov. Shema vezja v literaturi ni bila podana [15]. Ostali podatki so zbrani v dodatkih A in C. Avtorji so opazovali, pod kakˇsnimi pogoji se v ravninski lipidni dvosloj vgradijo ami-loidni ß-peptidi. Te peptide uvrˇsˇcajo med vzroke za ˇzivˇcno degenerativne bolezni. Poznavanje medsebojnega vpliva med peptidom in celiˇcno membrano je pomembno predvsem pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo. Peter Kramar 3.1. Napetostno vzbujanje 29 3.1.2 Sinusna oblika signalov Sistem Rosen-Sutton Sistem je prviˇc opisan leta 1968. Ravninski lipidni dvosloj so vzbujali tako z enosmernimi kot z izmeniˇcnimi signali. Pri enosmernih signalih uporabljajo konstantno napetost ±200 mV. Izmeniˇcni signal uporabljajo amplitudo 5 mV in frekvenco 500 Hz. Natanˇcni podatki so zbrani v dodatkih A in C. elektro-meter M f 1 /. 1 elektro-meter i napetostni vir —> :> < mostiček signalni generator osciloskop fazni detektor X-Y risalnik Slika 17. Sistem Rosen-Sutton [35]. Opazovali so spremembe kapacitivnosti zaradi indukcije enosmernega potenciala. Spremljali so tudi odvisnost kapacitivnosti od koncentracije soli v vodni raztopini in prevodnost ravninskega lipidnega dvosloja [35]. Sistem Wobschall Sistem je bil objavljen leta 1971 [36]. Vsebuje modulacijski oscilator z obmoˇcjem od 1 do 50 Hz ter oscilator s konstantno frekvenco 4 kHz. Vhodni signal v mostiˇc je sestavljen iz nizko frekvenˇcnega signala, visoko frekvenˇcnega signala, ter referenˇcne napetosti, ki je pogojena z izhodno napetostjo mostiˇcnega vezja. Z detektorjem faze merijo kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja. Natanˇcni podatki so zbrani v dodatkih A in C. Avtorji so merili odvisnost kapacitivnosti ravninskega lipidnega dvosloja od napetosti Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 30 3. Sistemi za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev kapacitivni demodulator modulacijski oscilator 0,01-50 Hz osciloskop osciloskop ------------->------- fazni detektor I refi Slika 18. Sistem Wobschall [36]. ter frekvence. V komori so imeli moˇznost napihovati ravninski lipidni dvosloj v obliko leˇce, pri ˇcemer so opazovali spremembo kapacitivnosti od povrˇsine ukrivljenega ravninskega dvosloja [36]. Sistem White-Thompson Je eden od najstarejˇsih sistemov, ki so se uporabljali za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev [37]. Natanˇcni podatki so zbrani v dodatkih A in C. V rezultatih navajajo odvisnost kapacitivnosti ravninskega lipidnega dvosloja od napetosti. Merijo tudi debelino ravninskega lipidnega dvosloja. Sistem Yamaguchi-Nakanishi Sistem uporablja kombinacijo elektriˇcnega in optiˇcnega merjenja. Ravniniski lipidni dvosloj vzbujajo s sinusnim signalom 7 mVRMS /1 kHz. Odziv merijo z LCR metrom, ki Peter Kramar 3.1. Napetostno vzbujanje 31 podatke zapisuje v računalnik. Istočasno lahko osvetljujejo ravninski lipidni dvosloj s ha-logensko ali ksenonsko lučjo. Svetlobni odboj spremljajo z barvno kamero [38]. Natančni podatki so zbrani v dodatkih A in C. D2 svetilka video-rekorder barvni zaslon elektrodi ravninski 'Vu impedančni pretvornik Slika 20. Sistem Gallucci-Micelli [18–20]. V svojih poizkusih so izmerili kapacitivnost in prevodnost uporabljenih lipidov. Opazovali so tudi spremembo prevodnosti pri nastanku por. Sistem Maheswari-Ramachandran-Rajaji Enosmerne elektriˇcne karakteristike, kot sta upornost in kapacitivnost, so izmerili z elektrometrom, izmeniˇcne pa z digitalnim LCZ metrom. Uporabili so sinusno napetost amplitude od 0,01 do 1,0 V, ki so jo poveˇcevali v korakih po 10 mV. Frekvenco so spreminjali od 40 Hz do 200 kHz v tridesetih korakih [39]. Natanˇcni podatki so zbrani v dodatkih A in C. S sistemom so merili specifiˇcno kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja. Opazovali so spremembo specifiˇcne kapacitivnosti ter napetosti na membrani zaradi dodatkov cisplatina [39]. Sistem Naumowicz-Petelska-Figaszewski Je eden izmed novejˇsih sistemov, saj je bil prviˇc omenjen leta 2002 [40]. Merjenje kapacitivnosti je realizirano z impedanˇcno spektroskopijo. Natanˇcni podatki so zbrani v dodatkih A in C. Opisali so merjenje impedance ravninskega lipidnega dvosloja. Prikazali so spremembo Peter Kramar 3.2. Tokovno vzbujanje 33 ^Zd^u -io -12 -11 Slika 21. Sistem Naumowicz-Petelska-Figaszewski [40]. 1. brizgalka, 2. zunanji vijak, 3. zunanji vijak z roˇcajem, 4. jeklena cev, 5. tesen teflonski bat, 6. prikljuˇcek iz organskega stekla, 7. tokovna platinasta elektroda, 8. Ag-AgCl merilna elektroda, ki je pritrjena na stoˇzec brizgalke, 9. teflonsko tesnilo, 10. posoda iz organskega stekla, 11. druga tokovna elektroda, 12. druga Ag-AgCl merilna elektroda, 13. nivo vodne raztopine, 14. obmoˇcje tvorbe ravninskega lipidnega dvosloja. impedance pri razliˇcnih vodnih raztopinah. Kot zanimivost so grafe impedance prikazali s polarnim diagramom. 3.2 Tokovno vzbujanje Sistem Robello-Gliozzi Sistem ima napetostni signalni generator. Napetost se preko upora pretvori v tok, ki steˇce preko ravninskega lipidnega dvosloja. Ravninski lipidni dvosloj je vezan v negativno povratno vezavo operacijskega ojaˇcevalnika. Izhod operacijskega ojaˇcevalnika po-kaˇze spremembo napetosti na ravninskem lipidnem dvosloju. Pri poizkusih so uporabljali pravokotne signale, stopnice ter trapezne stopnice. Merili so tudi histerezno zanko ravninskega lipidnega dvosloja z izmeniˇcno trikotno napetostjo (2,5 mHz) [23, 27–29, 41–43]. Natanˇcni podatki so zbrani v dodatkih A in C. V rezultatih opisujejo meritve notranjega ˇsuma ravninskega lipidnega dvosloja. Spremljajo napetost na ravninskem lipidnem dvosloju ob elektroporaciji, pri ˇcemer ravninski Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 34 3. Sistemi za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev lipidni dvosloj vzbujajo s tokom. C, Uvh- i-------------oUji Slika 22. Sistem Robello-Gliozzi [23, 27–29, 41–43]. Sistem Kalinowski-Figazewski Sistem je sestavljen iz tokovnega vira, dveh stikal, preko katerih lahko izbiramo reˇzim merjenja, merilnika napetosti ter komore. V komori so 4 elektrode, 2 aktivni in 2 merilni. Stikalo S1 uporabljajo za priklop tokovnega vira, stikalo S2 pa zato, da elektrodi CE1 in CE2 veˇze v kratek stik. To povzroˇci, da sta napetosti v obeh prekatih enaki in se naboj na ravninskem lipidnem dvosloju razelektri preko merilnika napetosti. V zadnjem primeru pa so prav tako kot v sistemu Robello-Glozzi uporabili ˇzagasto napetost za merjenje histereze ravninskega lipidnega dvosloja [21, 22, 25, 44, 45]. Natanˇcni podatki so zbrani v dodatkih A in C. V ˇclankih so natanˇcno opisali sistem za merjenje kapacitivnosti, vendar ˇstevilskih rezultatov o izmerjeni kapacitivnosti niso navedli. Opazovali so predvsem obnaˇsanje spremembe napetosti na ravninskem lipidnem dvosloju ob razliˇcnem toku. Uporabljali so sto-pniˇcasto, pravokotno ter trikotno obliko signala. Ob tako izvedeni meritvi lahko ravninski lipidni dvosloj opazujemo daljˇsi ˇcas, saj ga ne preobremenimo z napetostjo. Spremembe na ravninskem lipidnem dvosloju opazujemo preko spremembe napetosti. Peter Kramar 3.3. Pregled sistemov za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev 35 programabilni galvanostat CEI REI I I RE2 CE2 I Slika 23. Sistem Kalinowski-Figazewski [21, 22, 25, 44, 45]. 3.3 Pregled sistemov za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev Opisani sistemi se med seboj precej razlikujejo. Vzrok za to so razliˇcna podroˇcja raziskovanja in razliˇcne lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev, ki so jih raziskovalci z opisanimi sistemi opazovali. Za merjenje posamezne lastnosti ravninskega lipidnega dvosloja je na-mreˇc ustrezen svojevrsten pristop. Kar lahko opazujemo z enim merilnim sistemom, ˇse ni nujno da lahko tudi z drugim. Do nedavnega na trˇziˇsˇcu ˇse ni bilo sistema za opazovanje in delo z ravninskimi lipidni dvosloji. Leta 2005 pa se je na spletu pojavil proizvajalec, ki ponuja merilni sistem za opazovanje ravninskih lipidnih dvoslojev [46]. Sistem je zasnovan modularno in ga lahko sestavimo na razliˇcne naˇcine; tako lahko merimo (praktiˇcno) vse lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev. V literaturi opisane sisteme v osnovi lahko razdelimo na napetostne in tokovne. Napetostni merilni sistemi so nepogreˇsljivi za merjenje kapacitivnosti ravninskih lipidnih dvoslojev. Merilni sistemi s tokovnim vzbujanjem pa omogoˇcajo opazovanje majhnih sprememb na ravninskem lipidnem dvosloju, ne da bi le-tega poruˇsili. To je posebej primerno takrat, ko ˇzelimo opazovati majhen tok, ki je posledica vgrajenih proteinov v ravninski lipidni dvosloj. Z napetostnim vzbujanjem bi ravnski lipidni dvosloj poruˇsili, ˇse Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 36 3. Sistemi za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev preden bi sploh opazili majhno spremembo toka. Znotraj obeh skupin razdelimo sisteme ˇse po obliki vzbujalnih signalov. Najpogo-stejˇsi med njimi je pravokotni pulz. Za merjenje kapacitivnoosti in prevodnosti hkrati se uporablja izmeniˇcne signale. Vse nas, ki opazujemo pojav elektroporacije na nivoju ravninskega lipidnega dvosloja, zanima poruˇsitvena napetost. Najpogosteje uporabljen protokol za merjenje poruˇsitvene napetosti je vzbujanje ravninskega lipidnega dvosloja s pravokotnim napetostnim pulzom. Napetost prvega pulza je nizka, tako da ˇse ne poruˇsi ravninskega lipidnega dvosloja. Vsak naslednji pulz, ko ravninski lipidni dvosloj ˇse ni poruˇsen, poveˇcamo za izbran napetostni korak. Amplitudi pulza, pri katerem se ravninski lipidni dvosloj poruˇsi, pravimo poru-ˇsitvena napetost ravninskega lipidnega dvosloja. Pri uporabi takˇsnega protokola ˇstevilo pulzov, ki jih dovedemo na ravninski lipidni dvosloj, ni vnaprej znano. Ravno tako ni znano, kolikˇsen bo vpliv seˇstevka vseh signalov, ki ga definiramo kot pred-izpostavitev ravninskega lipidnega dvosloja. V svojem magistrskem delu sem ˇzelel poiskati metodo, s katero bi omejil vlogo pred-izpostavitve ter nakljuˇcnosti ˇzivljenjskega ˇcasa ravninskega lipidnega dvosloja in mu do-loˇciti pravo” poruˇsitveno napetost. Peter Kramar 37 4 Merjenje porušitvene napetosti ravninskega lipi-dnega dvosloja z linearno naraščajočim signalom Lipidni dvosloji so edinstvene strukture, sestavljene iz dveh plasti lipidnih molekul. Njihove fizikalne lastnosti so osnova za razumevanje obnašanja celične membrane. Pod vplivom mehanskega stresa (pričvrstitev pipete) ali električnega polja (elektroporacija) lahko v membrani nastanejo pore. S tvorjenjem por je omogočen pasivni transport protonov in hidrofilnih delcev skozi ravninski lipidni dvosloj. Prav tako je tvorjenje por pomembno pri elektrofuziji celic ter sprostitvi učinkovin iz liposomov. Točen mehanizem tvorjenja por, njihova velikost, struktura in stabilnost so še zelo slabo poznani [47]. V zadnjem času se v literaturi pojavljajo molekularni modeli, ki opisujejo dinamično nastajanje por in s tem delno pojasnjujejo tudi mehanizme nastajanja [48, 49]. Stabilnost membrane v električnem polju določimo s porušitveno napetostjo. Znano je, da je porušitvena napetost odvisna od narave membrane, sestave in koncentracije okoliškega elektrolita ter od trajanja izpostavitve električnemu polju. [20]. Znano je tudi, da je stabilnost membrane odvisna od trajanja izpostavitve električnemu polju [8, 30]. V teoriji elektromehanike je ravninski lipidni dvosloj predstavljen kot homogen elastični medij, s končno vrednostjo prožnostnega modula. Ko sila električne kompresije preseže silo elastičnosti, se membrana poruši. Rezultate dobimo ob predpostavki, da za omejene deformacije velja Hookov zakon [30]. V literaturi zasledimo, da so porušitveno napetost ravninskih lipidnih dvoslojev določali na različne načine [8, 9, 12, 13, 23, 27, 28, 41]. V večini primerov so za določitev te porušitvene napetosti uporabili pravokotne pulze širine 10 ps [9, 12, 13, 23, 27, 28, 41]. Zasledimo tudi uporabo sestavljenega signala iz pravokotnega pulza ter linearno padajočega signala, kjer je le-ta služila za počasnejše spreminjanje strukture ravninskega lipidnega dvosloja in s tem lažje opazovanje spreminjanja njegove prevodnosti [9]. Opisan pa je bil tudi primer določanja porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja s trikotno obliko signala [27]. Za vzbujanje ravninskih lipidnih dvoslojev so različni avtorji uporabljali tako napetostno [8, 9, 12, 13] kot tokovno [23, 27, 28, 41] vzbujanje. Napetostno vzbujanje ravninskih lipidnih dvoslojev se je zgodovinsko pojavilo pred Meritev porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 38 Merjenje porušitvene napetosti... tokovnim vzbujanjem. Predstavlja neposredno vzpostavitev elektriˇcnega polja na ravninskem lipidnem dvosloju. Uporaba napetostnega vzbujanja je najverjetneje hotela posnemati mirovalno napetost, ki je prisotna na membrani ˇzivih celic. Kasneje se je uveljavila tudi metoda s tokovnim vzbujanjem. Tokovno vzbujanje vzpostavi napetost na lipidnem dvosloju in jo lahko kontrolira, tako da ne preseˇze tako hitro pragovne vrednosti, ˇcesar pri napetostnem vzbujanju ne moremo. Ko vsilimo napetost, je ravninski lipidni dvosloj le-tej izpostavljen v hipu. Najpogosteje uporabljen protokol za merjenje poruˇsitvene napetosti je vzbujanje ravninskega lipidnega dvosloja s pravokotnimi napetostnimi signali. Napetost prvega pulza je nizka, tako da ˇse ne poruˇsi ravninskega lipidnega dvosloja. Vsak naslednji pulz, ko ravninski lipidni dvosloj ˇse ni poruˇsen, poveˇcamo za izbrani napetostni korak. Amplituda pulza, pri katerem se ravninski lipidni dvosloj poruˇsi, je definirana kot poruˇsitvena napetost ravninskega lipidnega dvosloja [8]. Pri uporabi takˇsnega protokola ˇstevilo pulzov, ki jih pritisnemo na ravninski lipidni dvosloj, ni vnaprej znano. Ravno tako ni znano, koliko bo znaˇsal seˇstevek ˇcasov vseh pritisnjenih signalov, ki ga definiramo kot pred-izpostavitev ravninskega lipidnega dvo-ˇ sloja. Cas znotraj pulza, v katerem poruˇsimo ravninski lipidni dvosloj, definiramo kot ˇzivljenjsko dobo. Abidor s sodelavci opisuje, da je ˇzivljenjska doba ravninskega lipidnega dvosloja znotraj pravokotnega napetostnega pulza nakljuˇcno porazdeljena [30]. Na vi-ˇsino poruˇsitvene napetosti vplivata pred-izpostavitev in napetostni stres, ki se pojavi ob zaˇcetku pulza. Daljˇsa pred-izpostavitev ravninskega lipidnega dvosloja napetostnemu signalu povzroˇci niˇzjo poruˇsitveno napetost [30]. Prav tako se zaradi napetostnega stresa, katerega povzroˇcijo zaporedne izpostavitve veˇcim napetostnim pulzom, ravninski lipidni ˇ dvosloj poruˇsi pri niˇzji napetosti [8]. Ce je ˇcas med dvema izpostavitvama zadosti dolg, napetostni stres na ravninskem lipidnem dvosloju izzveni in ga obravnavamo, kot da ravninskega lipidnega dvosloja ne bi izpostavili elektriˇcnemu stresu, vendar pa nikoli ne vemo koliko ˇcasa je za to potrebno [50]. Leontiadou s sodelavci je s simulacijami struktur ravninskih lipidnih dvoslojev pokazal, da je za poruˇsitveno napetost potrebno preseˇci napetostni prag, ki sproˇzi proces poruˇsitve ravninskega lipinega dvosloja [48]. Peter Kramar 4.1. Materiali in metode 39 V svojem magistrskem delu sem ˇzelel poiskati metodo, s katero bi omejil vlogo pred-izpostavitve ter nakljuˇcnosti ˇzivljenjskega ˇcasa ravninskega lipidnega dvosloja in mu do-loˇciti pravo” poruˇsitveno napetost. ” 4.1 Materiali in metode 4.1.1 Sistem za elektroporacijo lipidnih dvoslojev Sistem za elektroporacijo ravninskih lipidnih dvoslojev je sestavljen iz signalnega generatorja, teflonske komore z elektrodama, merilnikov toka in napetosti ter osciloskopa za zajem podatkov [51]. Podatke kasneje analiziramo z osebnim raˇcunalnikom (slika 24). Slika 24. Sistem za elektroporacijo ravninskih lipidnih dvoslojev. (1) Signalni generator sestavljen iz krmilnika s mikroprocesorjem MCF5024 in moduloma za tvorjenje signalov ter frekvenˇcno razˇsiritev. (2) Teflonska komora za tvorjenje ravninskih lipidnih dvoslojev z dvema Ag-AgCl elektrodama. (3) Merilnik toka in napetosti. (4) Digitalni osciloskop, kjer shranjujemo meritve za nadaljnjo obdelavo. Signalni generator (slika 24-1) omogoča tvorjenje napetostnih signalov poljubnih oblik. Sestavljen je iz krmilnika z mikroprocesorjem MCF5204, modula za tvorjenje signalov ter modula za frekvenčno razširitev. Mikroprocesorski krmilnik upravljamo z osebnim računalnikom preko RS-232 komunikacije. Preko te komunikacije se prenese oblika signala ter ukazi prednastavitev izhodnega ojačanja in frekvence. Modul za tvorjenje signalov spremeni digitalni vektorski zapis signala v analognega in ga primerno ojači. Modul za frekvenčno razširitev pa omogoča spreminjanje izhodne frekvence signala. Komora (slika 24-2) je sestavljena iz dveh teflonskih delov. Teflon omogoča preprosto čiščenje, saj lahko komoro, kadar je ne uporabljamo, spravimo kar v žvepleno kislino Meritev porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 40 Merjenje porušitvene napetosti... (H2SO4.) Med teflonska dela komore vstavimo posebno teflonsko folijo, ki ima majhno luknjico premera 105(1±0,01) µm. V vsakem delu komore imamo vdolbino velikosti (17,8×15,1×19,75) mm oziroma 5,3 cm3. V oba prostora sta speljana dodatna kanala premera 0,8 mm, skozi katera vbrizgamo slano raztopino. Merilni sistem (slika 24-3,4) je sestavljen iz merilnika toka, diferenˇcnega merilnika napetosti ter osciloskopa za shranjevanje ˇcasovnih potekov obeh koliˇcin. Merilnik toka deluje po principu tokovno napetostnega pretvornika. Napetost na lipidnem dvosloju merimo po naˇcelu razlike potenciala med obema prekatoma komore. Za to smo uporabili diferenˇcni ojaˇcevalnik LeCroy Instruments 1822. Nastavitve ojaˇcevalnika lahko v celoti krmilimo z osciloskopom. Njegova dodatna dobra lastnost je, da lahko razliko dveh signalov ojaˇci ˇ tudi za faktor 1000. Casovne poteke toka in napetosti smo shranili z osciloskopom Le-Croy Waverunner-2 LT354M. Na prvem kanalu smo merili signal iz signalnega generatorja. Drugi kanal je bil namenjen opazovanju napetosti diferencialnega ojaˇcevalnika, s ˇcetrtim kanalom pa smo merili tok oziroma izhodno napetost tokovnega merilnika. Osciloskop je bil nastavljen na normalno proˇzenje na pozitivno fronto. Nastavili smo nekaj deset mikrosekund predproˇzenja. Merjene signale smo shranili v ANSI tabelo vzorˇcnih toˇck signala, ki nam je omogoˇcila kasnejˇso obdelavo signalov s programskim orodjem Matlab. 4.1.2 Priprava raztopin Prevodno raztopino smo pripravili iz 0,1 molarne KCl (MERCK, Nemˇcija) in 0,01 molarne raztopine Hepes (MERCK, Nemˇcija). Zmeˇsali smo ju v enakem razmerju in dodali nekaj kapljic enomolarnega NaOH (MERCK, Nemˇcija), tako da smo dobili kislost raztopine pH 7,4. Na injekciji smo pritrdili prilagojeni injekcijski igli, ki smo ju prikljuˇcili na posebni cevki. Pred tem smo iz injekcijskih igel in cevk odstranili vse zraˇcne mehurˇcke. Raztopino smo skozi kanala v komori vbrizgali v oba prekata komore. Za pripravo lipidnega dvosloja smo uporabili POPC (1-pamitoil 2-oleoil 3-fosfatidiholin), ki smo ga kupili v prahu (Avanti Polar-Lipids, inc., ZDA). POPC smo raztopili v meˇsanici heksana (Riedel-de Ha¨en, Nemˇcija) in etanola (Riedel-de Ha¨en, Nemˇcija) v razmerju 9:1. Meˇsanica heksadekana (MERCK, Nemˇcija) in etanola v razmerju 3:7 je sluˇzila za podporni torus. Tega smo nanesli na teflonsko folijo na komori, da smo laˇzje zgradili lipidni Peter Kramar 4.1. Materiali in metode 41 dvosloj. Teflonsko komoro smo med poizkusi hranili v ˇzvepleni kislini (H2SO4) (MERCK, Nem-ˇcija), ki odstrani vse ostanke lipidov v komori. Tik pred poizkusom smo vzeli oba dela komore iz kisline in ju sprali z deionizirano vodo. Med dela komore smo poloˇzili tanko folijo, ki je bila pred tem spravljena v kloroformu (Riedel-de Ha¨en, Nemˇcija). Pazili smo, ˇ da je bila majhna luknjica ˇcim bolj na sredini luknje v komori. Ce je bila luknjica preveˇc pri robu odprtine komore, se je zaradi razlike v omoˇcevanju folije in komore lipidni dvosloj teˇzje tvoril. Komoro smo stisnili in jo privili z vijakoma. Prepriˇcali smo se, kje je bila luknjica, in ˇce ni bila dovolj dobro postavljena, smo postopek nameˇsˇcanja ponovili. Na vsako stran folije smo dodali 1 µl raztopine lipida. Poˇcakali smo, da se je topilo posuˇsilo, nato pa smo dodali 1,5 µl heksadekana in etanola ter poˇcakali, da se je tudi ta meˇsanica posuˇsila. Komoro smo pritrdili na paliˇcno stojalo in jo postavili pred stereolupo. Skozi stranska kanala smo vstavili cevki s slano raztopino KCl. Na komoro smo poloˇzili poseben pokrovˇcek, na katerega so bile pritrjene elektrode iz Ag-AgCl (IVM, ZDA). Pri postavitvi elektrod je treba paziti, da ne prekrivajo luknjice in da je ta ˇse vedno vidna skozi stereolupo. Vedno moramo elektrode vstaviti v komoro, ko v njej ˇse nimamo lipidov, da ne zmotimo” lipidne plasti. V prekata komore vbrizgamo toliko raztopine, da ” gladina seˇze tik pod rob luknje v komori. V vsak prekat kanemo po 2 µl lipida, raztopljenega v meˇsanici heksana in etanola. Gladine se dotaknemo samo s kapljico, da omogoˇcimo ˇcim laˇzje raztezanje lipidne plasti po gladini raztopine KCl. Po dvajsetih minutah se lipidi razporedijo po gladini in imamo pripravljen sistem za postavljanje lipidnih dvoslojev. Lipidni dvosloj postavimo z metodo dviganja gladine, ki je opisana v uvodu (slika 3). 4.1.3 Merilni protokol Merilni protokol je sestavljen iz dveh delov: merjenja kapacitivnosti lipidnega dvosloja ter merjenja poruˇsitvene napetosti lipidnega dvosloja (slika 25). Kapacitivnost in poruˇsitvena napetost sta bili doloˇceni za vsak lipidni dvosloj posebej. Z meritvijo kapacitivnosti preverimo, ali imamo postavljen dovolj dober ravninski li-pidni dvosloj. Vˇcasih se nam lahko tvori veˇcsloj, ki ga prepoznamo z meritvijo kapa-citivnosti. Izmerjeno kapacitivnost smo primerjali z vrednostmi, podanimi v literaturi Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 42 Merjenje porušitvene napetosti... U(V)a Slika 25. Merilni protokol. A) Meritev kapacitivnosti. Kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja je razlika med kapacitivnostjo sistema brez ravninskega lipidnega dvosloja (Csis) ter kapacitivnostjo sistema z ravninskim lipidnim dvoslo-jem {Csblm)- B) Merjenje porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja z linearno naraščajočim signalom. Porušitvena napetost (Ubr) je definirana kot napetost ob času tbr, ko prične teči transmembranski tok. Čas tbr je definiran kot življenjska doba ravninskega lipidnega dvosloja pri izbranem naklonu (k) linearno naraščajočega signala. za ravninske lipidne dvosloje, sestavljene iz POPC lipidnih molekul [8]. Kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja je merjena z metodo merjenja ˇcasovne razelektritve, ki je opisana v poglavju 2.1. Meritev vsebuje dva koraka. V prvem koraku smo izmerili kapa-citivnost sistema brez ravninskega lipidnega dvosloja (Csis), v drugem pa kapacitivnost sistema z ravninskim lipidnim dvoslojem (CSBLM). Kapacitivnosti smo nato med seboj odˇsteli, kot je to prikazano v enaˇcbi 3, in dobili pravo kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja (CBLM) (slika 8). Specifiˇcno kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja c smo doloˇcili z normiranjem kapacitivnosti ravninskega lipidnega dvosloja CBLM na njegovo povrˇsino povrˇsino A: Cblm A (15) V našem primeru je površina ravninskega lipidnega dvosloja znašala 8,66 xl0"9 m2. Porušitveno napetost ravninskega lipidnega dvosloja (Ubr) določimo z linearno naraščajočim signalom. Naklon (k) ter končno napetost linearno naraščajočega signala je potrebno predhodno izbrati. Izbira končne napetosti mora zagotavljati, da se bo ravninski lipidni dvosloj zagotovo porušil. Za določitev porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja smo uporabili štiri različne naklone. Najvišja in najnižja strmina naklona je omejena z ločljivostjo sistema. Vse naklone linearno naraščajočih signalov smo c _ Peter Kramar 4.1. Materiali in metode 43 želeli opraviti pri enaki ločljivosti tvorjenega signala [51]. Zato smo se omejili na naklone k med 4 in 22 V/ms. V tem območju smo se odločili za štiri različne naklone linearno naraščajočega signala. Porušitvena napetost je definirana kot napetost ob času tbr, ko prične preko ravninskega lipidnega dvosloja teči tok. Čas tbr je definiran kot življenjska doba ravninskega lipidnega dvosloja pri izbranem naklonu linearno naraščajočega signala (k) (slika 25). Z novim protokolom smo dosegli, da imamo vedno enak postopek merjenja porušitvene napetosti, torej imamo vedno enako pred-izpostavitev ravninskega lipidnega dvosloja. Linearno naraščajoč signal nam zagotavlja, da se bo ravninski lipidni dvosloj porušil ob enkratni izpostavitvi. Hkrati ob začetku signala ravninski lipidni dvosloj ni izpostavljen napetostnemu stresu. 4.1.4 Določitev življenjske dobe ravninskega lipidnega dvosloja Ob pritisku linearno naraščajočega signala smo opazovali napetost in tok. Dokler se ravninski lipidni dvosloj ni pričel rušiti, toka ni bilo. Ko se je pojavil, je po začetnem prehodnem pojavu sledil pritisnjeni napetosti linearno naraščajočega signala (slika 26). Čas od začetka dvigovanja vsiljenega napetostnega signala do naraščanja tokovnega signala zaradi procesa porušitve ravninskega lipidnega dvosloja imenujemo življenjska doba. Meritev toka in napetosti smo shranili na trdi disk osciloskopa v formatu Matlab. Po končanih poizkusih smo signala obdelali tako, da smo izmerili čas začetka naraščanja napetosti in toka. Napisali smo program v Matlab-u, ki je iz vektorjev izmerjenih signalov toka in napetosti poiskal koleno, točko, ko prične tok naraščati. Algoritem je za iskanje kolena potreboval dve točki. Prvo točko je postavil na začetek vektorja, kjer je bila vrednost vektorja 0 V. Druga točka se je postopoma premikala po signalu. Izračun naklona daljice med začetno točko ter premikajočo se točko je podal, ali je točka že pri kolenu signala. Ko je bil naklon večji od neke določene vrednosti, ki je preprečevala definicijo točke zaradi šuma smo definirali koleno signala. Ker algoritem ni bil dovolj optimiziran, smo omogočili ročno premikanje točke po krivulji ter s tem določanje kolena signala. Za vsak izmerjen ravninski lipidni dvosloj sta se časa kolena toka in napetosti shranila v tabelo, ki smo jo izvozili v MS Excel, datoteko pa smo uporabili pri statistični obdelavi. Meritev porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 44 Merjenje porušitvene napetosti... U (V)' l(mA) 1,6 1,2 0,8 0,4 0 -0,2 Ubr « ô~ 100 t > 200 300 400 — U (V) l(mA) tfos) Slika 26. Določitev življenjske dobe ter porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja. Rdeča krivulja predstavlja pritisnjeno napetost, zelena krivulja pa tok skozi ravninski lipidni dvosloj. Čas med začetkom naraščanja pritisnjene napetosti ter začetkom naraščanja toka definiramo kot življenjsko dobo ravninskega lipidnega dvosloja tbr. Ob času ko začne naraščati tok iz napetostnega signala odčitamo porušitveno napetost ravninskega lipidnega dvosloja Ubr. 4.1.5 Statistika Za primerjavo izmerjenih porušitvenih napetosti ter specifičnih kapacitivnosti ravninskih lipidnih dvoslojev, vzbujanih z linearno naraščajočim signalom z različnim naklonom, smo uporabili neparametričen Kruskal-Wallis-ov enosmerni test. Le-ta je namenjen obdelavi podatkov več kot treh skupin z majhnim in različnim številom izmerjenih vzorcev. Deskriptivna statistika je vključevala povprečno vrednost ter standardno deviacijo. Povezava med vzbujanjem in časom tvorjenja vzbujanja je poznana iz nevrologije kot intenzivnostno časovna krivulja. Opisuje, da je za sprožitev akcijskega potenciala potrebno membrano živčnega vlakna depolarizirati do pragovne vrednosti [52]. Tudi na nivoju ravninskih lipidnih dvoslojev na podlagi simulacij vemo, daje za porušitev potrebno preseči prag [48]. Na izmerjene rezultate o porušitveni napetosti za posamezen naklon linearno narašča- Peter Kramar 4.2. Rezultati 45 jočega signala smo napeli dvoparametersko krivuljo: U=-----^-r, (16) 1 - e~ fb pri čemer je U enak porušitveni napetosti Ubr, ki je bila merjena pri različnih naklonih; t ustreza življenjski dobi ravninskega lipidnega dvosloja tbr; a in 6 pa sta prosta parametra. Parameter a podaja asimptoto krivulje, ki ustreza minimalni porušitveni napetosti U^min za specifičen ravninski lipidni dvosloj. Parameter b vpliva na naklon krivulje. 4.2 Rezultati Število opravljenih in veljavnih meritev je 33. Od tega smo 18 ravninskih lipidnih dvo-slojev izpostavili naklonu 4,8 V/ms, 6 ravninskih lipidnih dvoslojev naklonu 5,5 V/ms, 4 ravninske lipidne dvosloje naklonu 7,8 V/ms ter 5 ravninskih lipidnih dvoslojev naklonu 21,6 V/ms. V tabeli 3 smo zbrali c, Ubr, in tbr za vse štiri izbrane naklone k linearno naraščajočega signala. Specifična kapacitivnost c ravninskega lipidnega dvosloja je bila pri vseh eksperimentalnih skupinah enaka, tudi Kruskal-Wallis-ova analiza ni pokazala statistično značilnih razlik. Povprečna vrednost specifične kapacitivnosti vseh ravninskih lipidnih dvoslojev, ki so bili vključeni v analizo, je znašala 0,5 ± 0,1 //F/cm2. Tabela 3. Povprečne vrednosti specifične kapacitivnosti (c), porušitvene napetosti {Ubr) ter življenjske dobe (tbr) ravninskih lipidnih dvoslojev, ki so bili izpostavljeni linearno naraščajočim signalom z različnimi nakloni (k). Podane so povprečne vrednosti ter standardne deviacije. k (V/ms) c QuF/cm2) Ubr (V) tbr (fis) 4,8 0,5 ± 0,1 0,51 ± 0,02 104 ± 4 5,5 0,5 ± 0,1 0,48 ± 0,01 86 ± 3 7,8 0,6 ± 0,1 0,49 ± 0,01 61 ± 2 21,6 0,4 ± 0,1 0,59 ± 0,02 27 ± 1 Porušitvena napetost Ubr narašča z naraščanjem naklona linearno naraščajočega signala. Za naklon 21,6 V/ms je porušitvena napetost ravninskega lipidnega dvosloja enaka 0,59 V. Vrednost je statistično značilno različna od izmerjenih vrednosti porušitvene napetosti pri ostalih naklonih. Izmerjeni podatki so prikazani grafično (slika 26). Parametra Meritev porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 46 Merjenje porušitvene napetosti... krivulje, ki je napeta na izmerjene podatke, ustrezata vrednostima a=0,49 V in 6=14,77 (is. To pomeni, daje „prava” porušitvena napetost ravninskega lipidnega dvosloja U^min, zgrajenega iz POPC lipidnih molekul, enaka 0,49 V. 0,7 0,6 0,5 0,4 D 0,3 0,2 0,1 0,0 0 20 40 60 80 100 120 tbr (MS) Slika 27. Porušitvena napetost (U*) v odvisnosti od življenjske dobe (t6r) ravninskih lipidnih dvoslojev. Rdeče črte predstavljajo različno izbrane naklone (k) linearno naraščajočega signala. Črna črtasta krivulja predstavlja napeto krivuljo na izmerjene podatke po enačbi (16). Parameter a oziroma asimptota enačbe (16) predstavlja pravo” porušitveno napetost UbrMiN- 4.3 Razprava Kadar raziskujemo metodo elektroporacije v biomedicini in biotehnologiji, je poruˇsitvena napetost ena izmed pomembnejˇsih lastnosti ravninskega lipidnega dvosloja. Vrednost poruˇsitvene napetosti je odvisna od trdnosti ravninskega lipidnega dvosloja. Ravninski lipidni dvosloj je sicer le preprost model celiˇcne membrane, a predvidevamo, da so osnovni principi pojava elektroporacije enaki. Cilj te raziskave je bil poiskati merilni protokol za doloˇcitev poruˇsitvene napetosti, s katerim bi se izognili veˇckratni izpostavitvi ravninskega lipidnega dvosloja elektriˇcnim pulzom in napetostnemu stresu, ki se pri tem ustvari. Ker je iz literature znano, da prihaja pri izpostavitvah elektriˇcnim pulzom do velike razprˇsenosti meritev, si ˇzelimo veˇcjo ponovljivost pri doloˇcanju ˇzivljenjske dobe ravninskih lipidnih dvoslojev. Peter Kramar - — u„ \ / y rs / --/ -,Z^ / / / / / / / / / ' / y 1/^ / y / / y y ^y y^y y^y y y^ ---------------5,5 V/ms ---------------7,8 V/ms ----------------21,6 V/ms 4.3. Razprava 47 V svojem magistrskem delu sem želel poiskati metodo, s katero bi omejil vlogo pred-izpostavitve ter naključnosti življenjske dobe ravninskega lipidnega dvosloja in mu določiti „pravo” porušitveno napetost. Z novim merilnim protokolom je ravninski lipidni dvosloj izpostavljen električnemu stresu le dvakrat. Prvič je izpostavljen električnemu pulzu amplitude 300 mV med merjenjem kapacitivnosti. Z meritvijo kapacitivnosti najlažje kontroliramo kvaliteto ravninskega lipidnega dvosloja. V naslednjem koraku uporabimo linearno naraščajoč signal ter porušimo ravninski lipidni dvosloj. Trenutek, ko začne skozi ravninski lipidni dvosloj teči tok, določa porušitveno napetost ter življenjsko dobo ravninskega lipidnega dvosloja. Pri poizkusih smo uporabili štiri različne naklone linearno naraščajočega signala. Za izbiro različnih naklonov smo se odločili na podlagi člankov, ki opisujejo določanje poruši-tvene napetosti ravninskih lipidnih dvoslojev ter njihovo življenjsko dobo glede na amplitudo pulza [8, 50] in vpliva pred-izpostavitve ravninskih lipidnih dvoslojev na življenjsko dobo [30]. Naši rezultati kažejo, da sta porušitvena napetost ter življenjska doba ravninskega lipidnega dvosloja funkciji naklona linearno naraščajočega napetostnega signala. Linearno naraščajoča napetost z manjšim naklonom izpostavlja ravninski lipidni dvosloj napetosti dlje časa (daljša pred-izpostavitev), zato je porušitvena napetost nižja kot pri signalih z bolj strmim naklonom. Joshi s sodelavci je predstavil teoretični model, v katerem je preučeval nastajanje pore v celični membrani v odvisnosti od membranske napetosti ter časa izpostavitve [53]. S simulacijami so pokazali, da visokonapetostni pulzi ne povzročijo irreverzibilne poracije na celici, če so le ti dovolj kratki. V našem primeru imamo pri strmem naklonu linearno naraščajočega signala krajšo pred-izpostavitev ravninskega lipidnega dvosloja napetosti. Zaradi krajše pred-izpostavitve ima ravninski lipidni dvosloj višjo porušitveno napetost. Asimptota dvo-parametrske krivulje (enačba 16) ustreza po-rušitveni napetosti specifičnega lipidnega dvosloja, kar pomeni, da bi za ravninske lipidne dvosloje, tvorjene iz različnih lipidnih molekul, dobili različne porušitvene napetosti. Evans s sodelavci je namesto ravninskega lipidnega dvosloja uporabil strukturo lipidnih veziklov, vzbujanje z električnim poljem pa je zamenjal s tlakom [54]. Tlak so ustvarjali s pipeto, ki je srkala membrano vezikla v svojo notranjost. Tlak srkanja so nadzorovali in ga linearno povečevali. Pri počasnem naraščanju tlaka se je membrana vezikla porušila pri Meritev porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 48 Merjenje porušitvene napetosti... nižjem tlaku, kot če so tlak povečevali hitro. Opazimo analogijo rezultatov, le vzbujanje je v opisanem primeru „mehansko” v našem pa „električno”. Pri položnem linearno naraščajočem signalu je porušitvena napetost nižja. Pri strmem naklonu linearno naračajočega signala pa je porušitvena napetost višja. Poizkuse z enakimi molekulami lipidov (POPC) najdemo še v delu Troiana s sodelavci [8]. Iz njihovih rezultatov je razvidno, da je ob dolgih pravokotnih pulzih (10 s) porušitvena napetost komaj 167 mV. Vzrok tako nizki porušitveni napetosti je izpostavitev ravninskih lipidnih dvoslojev večjemu številu pulzov, ki je od ravninskega lipidnega dvosloja do ravninskega lipidnega dvosloja različno in ni vnaprej znano. Z našim novim protokolom ravninski lipidni dvosloj postavimo samo enkrat. Ko je defekt prisoten, z linearno naraščajočim signalom prisilimo membrano, da se podre. Abidor s sodelavci je v svojem delu opisal veliko naključnost v življenskem času ravninskega lipidnega dvosloja znotraj pulza [30]. Z novim protokolom smo omejili relativno napako na povprečno 3,5%, kar je ponovljivo pri vseh k. To predstavlja dovolj kontrolirano opazovanje porušitve ravninskega lipidnega dvosloja, da lahko v določeni meri zaupamo podatku o njegovi stabilnosti. Rezultati so v skladu z modelom Joshija s sodelavci, ki trdijo, da se bo membrana porušila, če je pri določeni velikosti pore na membrani še vedno prisotna napetost [53]. Asimptota krivulje enačbe (16) nas v svoji limiti vodi proti vrednosti, ki ustreza „pravi” porušitveni napetosti ravninskega lipidnega dvosloja UbrMiN- V našem primeru, za POPC, smo na ta način določili porušitveno napetost UbrMiN=0,i9 V (slika 27). Peter Kramar 49 5 Zakljuˇcek Ravninski lipidni dvosloj je izredno preprost model celične membrane. Njegova preprostost in dostopnost nam omogoča enostavno merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvo-slojev. Ker principi elektroporacije še niso povsem znani, je tako preprost model, kot je ravninski lipidni dvosloj, izredno primeren za študij osnovnih principov. V zgodovini je bilo narejenih veliko poizkusov na ravninskih lipidnih dvoslojih. Raziskovalci so sestavljali različno zahtevne strukture membran, v različnih okoljih in različne sisteme za merjenje njihovih lastnosti. Ker so posamezne raziskovalne skupine zanimale različne lastnosti, so se tudi sistemi med seboj zelo razlikovali. V Laboratoriju za biokibernetiko na Fakulteti za elektrotehniko Univerze v Ljubljani, smo se glede na našo raziskovalno usmeritev odločili spremljati elektroporacijo ravninskih lipidnih dvoslojev. Glavna lastnost, ki jo želelimo opazovati, je porušitvena napetost. Kapacitivnost, ki jo prav tako merimo, potrjuje pravilno strukturo ravninskega lipidnega dvosloj a. Predlagamo novo metodo opazovanja porušitvene napetosti, ki bi bila predvsem bolj enostavna in učinkovita od tistih, ki so jih uporabljali do sedaj. Pregled sistemov, podanih v literaturi, nam je omogočil narediti oceno, kaj je že bilo narejenega, do kakšnih zaključkov so raziskovalci prišli ter kako se ujemajo z našimi rezultati z novo metodo. Porušitveno napetost ravninskega lipidnega dvosloja določimo z linearno naraščajočim signalom. Naklon ter končno napetost linearno naraščajočega signala je potrebno predhodno izbrati. Izbira končne napetosti mora zagotavljati, da se bo ravninski lipidni dvosloj zagotovo porušil. Izkazalo se je, da je metoda dobra, saj lahko s pomočjo različnih naklonov linearno naraščajočih signalov pridemo do krivulje, katere parameter podaja prag poracije za opa-zovni ravninski lipidni dvosloj. Porušitvena napetost ravninskih lipidnih dvoslojev, sestavljene iz molekul POPC, je enaka 0,49 V. Prav tako lahko zaupamo vrednostim porušitvene napetosti zato, ker je ravninski lipidni dvosloj porušen z enkratno izpostavitvijo napetostnemu signalu. Pokazali pa smo tudi, da je meritev porušitvene napetosti in ži-vljenske dobe znotraj enega naklona linearno naraščajočega signala ponovljiva. V prihodnosti bomo predlagano metodo preizkusili na ravninskih lipidnih dvoslojih, Meritev porušitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 50 5. Zakljuˇcek zgrajenih iz različnih lipidnih molekul. Prav tako bomo lahko izmerili porušitveno napetost na ravninskem lipidnem dvosloju sestavljenem iz dveh ali več različnih vrst lipidnih molekul ali mešanice lipidnih molekul ter površinsko aktivnih molekul. Peter Kramar LITERATURA 51 Literatura [1] H.T.Tien, A.Ottova, The lipid bilayer concept: Experimental realization and current applications, In Planar lipid bilayers (BLMs) and their applications, (Ed. H.T.Tien, A.Ottova-Leitmannova) pp. 1-74, Elsevier, New York 2003. [2] A.L.Ottova, H.T.Tien, The 40th anniversary of bilayer lipid membrane research, Bi-oelectrochemistry 56, 171-173 (2001). [3] H.T.Tien, Bilayer Lipid Membranes (BLM), Marcel Dekker, inc., New York 1974. [4] H.T.Tien, S.H.Wurster, A.L.Ottova, Electrochemistry of supported bilayer lipid membranes: background and techniques for biosensor development, Bioelectrochemistry and Bioenergetics 42, 77-49 (1997). [5] Avanti polar lipids inc. www.avantilipids.com, 2005. [6] M.Smeyers, M.Leonetti, E.Goormaghtigh, F.Homble, Structure and function of plant membrane ion channels reconstituted in planar lipid bilayers, In Planar Lipid Bilayers (BLMs) and their Applications. (Ed. H.T.Tien, A.Ottova-Leitmannova) pp. 449-478, Elsevier, New York 2003. [7] B.E.Ehrlich, Incorporation of Ion Channels in Planar Lipid Bilayers: How to Make Bilayers Work for You, In The Heart and Cardiovascular System, (Ed. H.A.Fozzard et al.) pp. 551-560, Raven Press, New York 1992. [8] G.C.Troiano, L.Tung, V.Sharma, K.J.Stebe, The Reduction in Electroporation Voltages by the Addition of Surfactant to Planar Lipid Bilayer, Biophisical Journal 75, 880-888 (1998). [9] V.Sharma, K.Uma Maheswari, J.C.Murphy, L.Tung, Poloxamer 188 Decreases Susceptibility of Artificial Lipid Membranes to Electroporation, Biophisical Journal 71, 3229-3241 (1996). [10] T.F.Eibert, M.Alaydrus, F.Wilczewski, V.W.Hansen, Electromagnetic and Thermal Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 52 LITERATURA Analysis for Lipid Bilayer Membranes Exposed to RF Fields, IEEE transactions on biomedical engineering 46, 1013-1021 (1999). [11] A.Igliˇc, V.Kralj-Igliˇc, Effect of anisotropic properties of membrane constituents on stable shapes of membrane bilayer structure, In Planar Lipid Bilayers (BLMs) and their Applications, (Ed. H.T.Tien, A.Ottova-Leitmannova) pp. 143-172, Elsevier, New York 2003. [12] W.Meier, A.Graff, A.Diederich, M.Winterhalter, Stabilization of planar lipid membranes: A stratified layer approach, Biochimica et Biophysica Acta 2000, 4559-4562 (2000). [13] A.Diederich, G.Bahr, M.Winterhalter, Influence of surface charges on the rapture of black lipid membranes, Physical Review E 58, 4883-4889 (1998). [14] R.Benz, K.Janko, Voltage-induced capacitance relaxation of lipid bilayer membranes; effects on membrane composition, Biochimica et Biophysica Acta 455, 721-738 (1976). [15] J.Vargas, J.M.Alarcon, E.Rojas, Displacement Currents Associated with the insertion of Alzheimer Disease Amyloid (Beta)-Peptide into Planar Bilayer Membranes, Biophisical Journal 79, 934-944 (2000). [16] C.Wilhelm, M.Winterhalter, U.Zimmermann, R.Benz, Kinetics o pore size during irreversible electrical breakdown of lipid bilayer membranes, Biophisical Journal 64, 121-128 (1993). [17] R.Benz, F.Beckers, U.Zimmermann, Reversible Electrical Breakdown of Lipid Bilayer Membranes: A Charge-Pulse Relaxation Study, Journal of Membrane Biology 48, 181-204 (1979). [18] S.Micelli, E.Gallucci, D.Meleleo, V.Stipani, V.Picciarelli, Mitochondrial porin incorporation into black lipid membranes: ionic and gating contribution to the total current, Bioelectrochemistry 75, 97-106 (2002). Peter Kramar LITERATURA 53 [19] S.Micelli, E.Gallucci, V.Picciarelli, Studies of mitochondrial porin incorporation parameters and voltage-gated mechanism with different black lipid membranes, Bioelec-trochemistry 52, 63-75 (2000). [20] E.Gallucci, S.Micelli, G.Monticelli, Pore Formation in Lipid Bilayer Membranes Made of Phosphatidylinositol and Oxidized Cholesterol Followed by Means of Alternating Current, Biophisical Journal 71, 824-831 (1996). [21] S.Kalinowski, Z.Figaszewski, A new system for bilayer lipid membrane capacitance measurements: method, apparatus and applications, Biochimica et Biophysica Acta 1112, 57-66 (1992). [22] S.Koronkiewicz, S.Kalinowski, K.Bryl, Programmable chronopotentiometry as a tool for the study of electroporation and resealing of pores in bilayer lipid membranes, Biochimica et Biophysica Acta 1561, 222-229 (2004). [23] A.Ridi, E.Scalas, M.Robello, A.Gliozzi, Linear response of a fluctuating lipid bilayer, Thin Solid Films 327-329, 796-799 (1998). [24] K.C.Melikov, V.A.Frolov, A.Shcherbakov, A.V.Samsonov, Y.A.Chizmadzhev, L.V.Chernomordik, Voltage-Induced Nonconductive Pre-Pores and Metastable Single Pores in Unmodified Planar Lipid Bilayer, Biophisical Journal 80, 1829-1836 (2001). [25] S.Kalinowski, G.Ibron, K.Bryl, Z.Figaszewski, Chronopotentiometric studies of elec-troporation of bilayer lipid membranes, Biochimica et Biophysica Acta 1396, 204-212 (1998). [26] R.W.Glaser, S.L.Leikin, L.V.Chernomordik, V.F.Pastushenko, A.I.Sokirko, Reversible electrical breakdown of lipid bilayers: formation and evolution of pores, Biochimica et Biophysica Acta 940, 275-287 (1988). [27] M.Robello, A.Gliozzi, Conductance transition induced by an electric field in lipid bilayers, Biochimica et Biophysica Acta 982, 173-176 (1989). [28] A.Ridi, E.Scalas, A.Gliozzi, Noise measurements in bilayer lipid membranes during electroporation, The European Physical Journal E 2, 161-168 (2000). Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 54 LITERATURA [29] E.Scalas, A.Ridi, M.Robello, A.Gliozzi, Flicker noise in bilayer lipid membranes, Europhysical Letters 43, 101-105 (1998). [30] I.G.Abidor, V.B.Arakelyan, L.V.Chernomordik, Y.A.Chizmadzhev, V.F.Pastushenko, M.R.Tarasevich, 246 - Electric Breakdown of Bilayer Lipid Membranes I. The Main Experimental Facts and Their Qualitative Discussion, Bioelectrochemistry and Bioenergetics 6, 37-52 (1979). [31] L.V.Chernomordik, S.I.Sukharev, S.V.Popov, V.F.Pastushenko, A.V.Sokirko, I.G.Abidor, Y.A.Chizmadzhev, The electrical breakdown of cell and lipid membranes: the similarity of phenomenologies, Biochimica et Biophysica Acta 902, 360-373 (1987). [32] A.N.Chanturiya, Detection of transient capacitance increase associated with channel formation in lipid bilayers, Biochimica et Biophysica Acta 1026, 248-250 (1990). [33] Y.Hanyu, T.Yamada, G.Matsumoto, Simultaneous Measurement of Spectroscopic and Physiological Signals from a Planar Bilayer System: Detecting Voltage-Dependent Movement of a Membrane-Incorporated Peptide, Biochemistry 1998, 15376-15382 (1998). [34] Y. Hanyu, Simultaneous Measurement of Spectroscopic and Physiological Signals from a Planar Bilayer System, In Planar lipid bilayers (BLMs) and their applications, (Ed. H.T.Tien, A.Ottova-Leitmannova) pp. 1017-1029, Elsevier, New York 2003. [35] D.Rosen, A.M.Sutton, The effects of a direct current potential bias on the electrical properties of bimolecular lipid membranes, Biochimica et Biophysica Acta 163, 226-233 (1968). [36] D.Wobschall, Voltage Dependance of Bilayer Membrane Capacitance, Journal of Colloid and Interface Science 40, 417-423 (1972). [37] S.H.White, T.E.Thompson, Capacitance, Area, and Thickness Variations in thin Lipid Films, Biochimica et Biophysica Acta 323, 7-22 (1973). Peter Kramar LITERATURA 55 [38] H.Yamaguchi, H.Nakanishi, Characterization of the preparation process and the photochemical control of electrical properties of bilayer lipid membranes containing azo-benzene chromopores, Biochimica et Biophysica Acta 1148, 179-184 (1993). [39] K.Uma Maheswari, T.Ramachandran, D.Rajaji, Interaction of cisplatin with planar model membranes - dose dependent change in electrical characteristics, Biochimica et Biophysica Acta 1463, 230-240 (2004). [40] M.Naumowicz, A.D.Petelska, Z.A.Figaszewski, Capacitance and resistance of the bi-layer lipid membrane formed of Phosphatidylcholine and cholesterol, Cellular & Molecular Biology Letters 8, 5-18 (2003). [41] I.Genco, A.Gliozzi, A.Relini, M.Robello, E.Scalas, Electroporation in symmetric and asymmetric membranes, Biochimica et Biophysica Acta 1149, 10-18 (1993). [42] E.Pescio, A.Ridi, A.Gliozzi, A picoampere current generator for membrane electro-poration, Review of scientific instruments 71, 1740-1744 (2000). [43] M.Robello, M.Fresia, L.Maga, A.Grasso, S.Ciani, Permeation of Divalent Cations Trough (alpha)-Latrotoxin Channels in Lipid Bilayers: Steady-State Current-Voltage Relationship, Journal of Membrane Biology 95, 55-62 (1987). [44] S.Kalinowski, Z.Figaszewski, A four-electrode system for measurement of bilayer lipid membrane capacitance, Meas Sci Technol 6, 1034-1049 (1995). [45] S.Kalinowski, Z.Figaszewski, A four-electrode potentiostat-galvanostat for studies of bilayer lipid membranes, Meas Sci Technol 6, 1050-1055 (1995). [46] Warner Instruments www.warneronline.com, 2005. [47] D.P.Tieleman, H.Leontiadou, A.E.Mark, S.J.Marrink, Simulation of Pore Formation in Lipid Bilayers by Mechanical Stress and Electric Fields, JACS Communications, objavljeno na spletu (2003). [48] H.Leontiadou, A.E.Mark, S.J.Marrink, Molecular Dynamics Simulations of Hydro-philic Pores in Lipid Bilayers, Biophisical Journal 86, 2156-2164 (2004). Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 56 LITERATURA [49] M.Tarek, Membrane electroporation: A Molecular Dynamics Simulation, Biophysical Journal 88, 4045-4053, 2005. [50] A.Maˇcek Lebar, G.C.Troiano, L.Tung, D.Miklavˇciˇc, Inter-pulse interval between rectangular voltage pulses affects electroporation treshold of artificial lipid bilayers, IEEE Transactions on Nanobioscience 3, 116-120 (2002). [51] P.Kramar Sistem za elektroporacijo ravninskih lipidnih dvoslojev, Fakulteta za Elektrotehniko, Univerza v ljubljani, Diplomsko delo univerzitetnega ˇstudija, (2003). [52] L.Vodovnik Nevrokibernetika, Fakulteta za Elektrotehniko, Univerza v ljubljani, (1991). [53] R.P.Joshi, K.H.Schoenbach, Electroporation dynamics in biological cells subjected to ultrafast electrical pulses: A numerical simulation study, Physical Review E 1025-1033 (2000). [54] E.Evans, V.Heinrich, F.Ludwig, W. Rawicz, Dynamic Tension Spectroscopy and Strength of Biomembranes, Biophisical Journal 85, 2342-2350 (2003). Peter Kramar 57 A Tabela pregleda sistemov za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev Tabela vsebuje ime merilnega sistema z oznako navedene publikacije, tip vzbujalnega signala, vrsto lipidne molekule, koncentracijo soli v vodni raztopini, volumen lipida glede na vodno raztopino, volumen komore, ˇstevilo in vrsto elektrod, premer d ali povrˇsino A luknjice ter temperaturo okolice T med poizkusi. Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 59 Sistem Signal Lipid Vodna raztopina Volumen lipida Volumen komore elektrode A/d T Napetostno vzbujanje -> pravokotna oblika signalov Benz [14, 17] 10 mV - 2 V /BOO /lis - BOO ms PC, DPhPC, DOPC, POPC, PE, Ox Ch 1 M KCl, 0,1 M NaCl 2% (w:v) 3 cm3 / prekat 2-Ag-AgCl 2 mm2 2B°C Benz - Zimmermann - Winterhalter [12, 13, 16, 17, 24, 26, 31] 10 mV - 2 V / BOO /Lis- BOO ms Ox Ch (+ DOPC ali + PE), azolecitin, DPHPC, PS, DOPC, DOPE pH=6,7 10 mM, 100 mM, 1 M, 2 M, 3 M KCl 1 fi\, B mg/ml, 10 mg/ml, 40 mg/ml 5 ml / prekat, 15 ml / prekat 2-Ag-AgCl 100 200 /um, 0,3 - 3 mm, 1 mm, 2 mm2 20°C, 22°C, 25°C, 30° C Abidor - Cher-nomordik - Chiz-madzhev - Pastu-shenko [30] 100 mV / 1 /lis, 400 mV / 1/LiS Ch:lecitin 3:1, sint. lecitin 0,1 M NaCl + 10 M Tris HCl 40 mg/cm3 - - - 27?C, (62?C za sint. leci-tin) Chanturya [32] 10 mV - 1 V / 10 - 100 /lis PC:Ch 2:1 10 mM Tris, ph=7,4 20 mg/ml 9 ml - Ag-AgCl 0,6 mm - Sharma - Stebe -Tung [8, 9] 100 mV / 10 /Lis, BIO /Lis: JV POPC, azoleci-tin 100 mM KCl, pH=7,4 10 mg/ml, 20 mg/ml 3 ml / prekat 4-Ag-AgCl 75-100 /Lim, 10B /um 22°C-24° C Hanyu - Yamada - Matsumoto [33, 34] 0,1 - 1 V TRITC DHPE - 5 mg/ml - 4-Ag-AgCl 120 /um - Vargas - Alorcon -Rojas [15] -300 mV, 300 mV, 30 s POPE, PS 50 mM KCl 50 mg/ml 1 cm3 /prekat - Ag-AgCl BO /um - Napetostno vzbujanje -> sinusna oblika signala Rosen - Sutton [35] AC 5 mV/ 500 Hz, DC ± 200 mV Lecitin 1 mM, 10 mM, 100 mM, 1 M KCl ali NaCl - - Pt 1 mm 22°C Wobshall [36] B-1B mVfiMS / 4 kHz + DC pulz 0,1 - 0,2 Hz Ch + HDTAC 1B0 /liM HDTAC + 40 mM KCl, pH=6,7 12 mg/ml - 4 Ag-AgCl - 30° C White - Tompson [37] 20 mV / 100 Hz Lecitin 0,1 M KCl, pH=B,6-B,8 1 /jI - - 1 mm 20°C Yamaguchi - Na-kanishi [38] 7 mVBMS / 1 kHz + optic GMO 0,1 M KCl - - 2-Pt 0,7 mm 25°C Gallucci - Micelli [18-20] poljubna napetost / 1 Hz + 2 mV / 1 kHz PI, Ox Ch 0,1, 0,5, 1 M KCl 1% (w:v) 4 ml /pre-kat 2-Pt 1,3 mm 22-24±1 °C Maheswari - Ra-machandran - Ra-jaji [39] 40 mVfiMS / 40 Hz - 200 kHz (30 korakov) PC + PE 0,01, 0,1, 1 M NaCl, pH=6,0 in 7,0 5 mg/ml - 4-Ag-AgCl 120 /um - Naumowicz Petelska Pigaszewski [40] 4 mV / 0,01-10 kHz Lecitin:Ch 1:1 0,1 M KCl 20 mg - 2-Ag-AgCl, 1 Pt - - Tokovno vzbujanje Robello - Gliozzi [23, 27-29, 41-43] Žaga 2,6 -.Q-3 TT C-meritev z U (10 mVpp), stopnica Lecitin:Ch 1:1, PC:Ch 4:1, PC, Ch, DPhPC,PS 10 mM Tri-sCl, pH=7,5, 0,1 M, 1 M KCl 10 mg/ml 2 ml /pre-kat 2-Ag-AgCl 100-160 /Lim, 160 /Lim, 200 /um - Kalinovski - Figa-zevski [21, 22, 25, 44, 45] Tok=konst.: 0,005, 0,2, 0,3, 2 nA; stopnica 0,2 nA / 10 s. Pravokot. 8x 0,2 nA / 10 s PC:Ch, Lecitin, PS, memb. člo-vešk. eritrocita 0,1 M KCl 20 mg/ml 10 cm3 4-Ag-AgCl (0,6x80) mm 1 mm 23-25±1 °C Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 61 B Tabela lipidnih molekul Tabela lipidnih molekul je sestavljena iz oznake, polnega imena in strukturne formule. Navedene so vse lipidne molekule, ki sem jih zasledil med pregledom sistemov za merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev. Polno ime je zapisano v angleˇski nomenklaturi, ker ga je tako laˇzje najti v strokovni literaturi ali na spletu. Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 63 oznaka polno ime strukturna formula 5-SLPC l-palmitoyol-2-stearoyl(5-DOXYL)-3-phosphocholine B-X-DPPE N- ( ( 6-biotyinyl) aminohexanoyle)-1, dihexadecanoyl-3-phosphoethanolamine 2- Ch holesterol DOPC dioleoyl phosphatidylcholine DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine DOPS dioleoyl phosphatidylserine DPhPC diphytanoyl phosphatidylcholine DPhPS diphytanoyl phosphatidylserine Lecitin lecitin PC phosphatidylcholine PE phosphatidylethanolamine PI phosphatidylinosital POPC l-palmitoyl-2-oleoyl-3-phosphocholine POPE l-palmitoyl-2-oleoyl-3-phosphatidylethanolamine POPS l-palmitoyl-2-oleoyl-3-phosphatidylserine PS phosphatidylserine TRITC DHPE N-6(6-tetramethylrhodaminethiocarbamoyl)1 2-dihexadecananoyl-3-phosphoethanolamine triethylammonium salt Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 65 C Pregled izmerjenih lastnosti ravninskih lipidnih dvo-slojev Tabela vsebuje podatke o lipidnih molekulah, koncentracij soli v vodni raztopini, ˇcasu pravokotnega pulza T, ˇce je le-ta podan, obliki vzbujalnega signala, izmerjeni poruˇsitveni napetost ravninskegi lipidnega dvosloja Ubr, kapacitivnosti ravninskega lipidnega dvosloja c normirani na povrˇsino, upornosti ravninskega lipidnega dvosloja r normirani na povrˇsino, debelini ravninskega lipidnega dvosloja d ter oznako navedene publikacije. Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 67 Lipid Vodna raztopina T [pis] Signal ubr [mV] C [MF/cm2] r [MfW] d [nm] Ref. Azolecitin 0,1 M KCl 10 J L 423,4±29,4 0,59±0,21 - - [9] 510 JV 441,6±23,2 DOPC 0,1 M NaCl - J L - 0,37±0,01 0,40 4,97±0,17 [14] DOPE 0,1 M NaCl - J L - 0,37±0,01 0,40 5,00±0,16 [14] DPhPC 0,1 M KCl - J L 390±20 0,6-0,75 7,85-17,76 - [23, 27, 28, 41] 1 M KCl - J L - 0,74-1,13 24,3-54,9 - [23, 29] 0,1 M KCl 10 J L 546±15 - - - [12, 13] 0,1 M NaCl - J L - 0,36±0,02 0,40 5,08 ±0,21 [14] 0,1 M KCl - J L - 0,9-1 - - [24] DPhPS 0,1 M KCl 10 J~L 530±15 - - - [12, 13] Lecitili 103-1 M NaCl ali KCl - 'V - 0,32-0,64 1-10 - [35] Ox Ch 1 M KCl - '\j - 0,40 0,25 - [18] 0,1 M KCl - 'V - 0,45±0,01 0,21±0,01 - [20] 0,5 M KCl 0,47±0,04 0,23±0,01 1 M KCl 0,40±0,01 0,20±0,03 1 M KCl 10 J L - 0,56 - 3,3 [17] PC 0,1 M KCl - "V 280±30 0,75 - - [27, 41] 0,1 M NaCl - JV - 0,34±0,01 0,40 5,48 ±0,17 [14] PE 0,1 M NaCl - J L - 0,33±0,01 0,40 5,67±0,22 [14] PI 1 M KCl - '\s - 0,25 0,4 - [18] 0,1 M KCl - "\y - 0,30±0,01 0,37±0,01 - [20] 0,5 M KCl 0,27±0,01 0,34±0,01 1 M KCl 0,25±0,01 0,38 ±0,06 POPC 0,1 M KCl 10 J L 400±6 - - - [12, 13] 0,1 M KCl 10 n 450±24 0,59±0,15 - - [8] 100 398±19 IO3 331±20 IO4 282±26 105 258±9 IO6 213±18 IO7 167±6 POPS 0,1 M KCl 10 J L 410±20 - - - [12, 13] PS 0,1 M KCl - J L 500±50 - - - [41] Kombinacije lipidov PC+Ch 0,1 M KCl - J L 270±20 - - - [41] PC+PE 0,1 M NaCl - '\s - 0,1 - - [32] Lecitin + Ch 1:1 0,1 M KCl - 'V - 0,38-0,61 0,014-2,12 - [36] 10 mM TrisCl - n - - - - [39] Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja 69 Izjavljam, da sem magistersko delo izdelal samostojno pod vodstvom mentorice doc. dr. Alenke Maček Lebar, univ. dipl. inž. el. Izkazano pomoč drugih sodelavcev sem v celoti navedel v zahvali. Peter Kramar, univ. dipl. inž. el. Meritev poruˇsitvene napetosti ravninskega lipidnega dvosloja