ERK'2020, Portorož, 388-391 388 Numeriˇ cno modeliranje porazdelitve pH sprememb v tkivu med dovajanjem elektroporacijskih pulzov Rok ˇ Smerc, Samo Mahniˇ c-Kalamiza, Damijan Miklavˇ ciˇ c Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko, Trˇ zaˇ ska cesta 25, 1000 Ljubljana E-poˇ sta: rok.smerc@fe.uni-lj.si Numerical modelling of pH changes distribution in tissue during delivery of electroporation pulses Abstract. During and after delivery of electroporation pulses, tissue damage, caused by various electric current and field effects, may occur. For optimal gene electro- transfer, tissue damage needs to be minimised. One of the possible causes for tissue damage is altered pH, caused by electrolysis of water, i.e. hydrolysis. Numerical model- ling can be used to assess these pH changes in tissue. In the present study we built a two-dimensional numerical model, based on Nernst-Planck system of equations for the concentration of ions in a four-component electrolyte, and used it to calculate the distribution of pH changes in tissue during delivery of gene electrotransfer pulses (ap- plied voltage of100V and total pulse time of60ms). Two mechanisms were taken into account: diffusion, caused by concentration gradients; and migration, caused by po- tential gradients. COMSOL Multiphysics software was used for calculations of pH changes distribution in tissue with finite element method. Our results show that during delivery of pulses, an acidic pH front forms in the vicinity of the anode, and an alkaline pH front forms in the vi- cinity of the cathode. Extreme pH values below 2:5 and above 13 are reached and sharp delineations between the normal pH and altered pH are observed. The model at this stage has difficulties with convergence, which are caused by relatively high voltage used in electroporation, very high concentration gradients, and the fact that five, highly non-linear, coupled partial differential equations need to be solved. 1 Uvod Elektroporacija oz. elektropermabilizacija je pojav, kjer z izpostavitvijo celice elektriˇ cnemu polju dovoljˇ snje ja- kosti povzroˇ cimo spremembe v njeni membrani, zaradi ˇ cesar le-ta zaˇ casno postane bolj prepustna za molekule, za katere je sicer slabo ali neprepustna [1]. Elektropora- cija se uporablja na razliˇ cnih podroˇ cjih, od biomedicine [2] do biotehnologije [3] in predelave hrane [4]. V biomedicini je ena izmed najpogosteje uporablja- nih metod, temeljeˇ cih na elektroporaciji, genska elektro- transfekcija. Pri genski elektrotransfekciji olajˇ samo pre- hajanje genskega materiala (obiˇ cajno plazmidne DNK) v celice z uporabo metode reverzibilne elektroporacije [5]. Za dosego ˇ cim boljˇ se genske izraˇ zave je potrebno mini- mizirati poˇ skodbe tkiva, ki jih povzroˇ cijo razliˇ cni uˇ cinki uporabe elektroporacije in dovajanja elektriˇ cnih pulzov. Eden izmed teh so spremembe pH v tkivu, povzroˇ cene z elektrolizo vode, tj. hidrolizo [6]. Te spremembe lahko ocenimo z uporabo numeriˇ cnega modeliranja. Pri tem uporabimo Nernst-Planckov sistem enaˇ cb, ki popisuje gi- banje nabitih ionov v mediju, ki jih reˇ simo z izbrano nu- meriˇ cno metodo, najpogosteje z metodo konˇ cnih razlik ali z metodo konˇ cnih elementov. Teˇ zava pri tem je, da je potrebno reˇ siti veˇ c, moˇ cno nelinearnih, sklopljenih par- cialnih diferencialnih enaˇ cb – eno, ki popisuje prostor- sko porazdelitev elektriˇ cnega polja ter dodatno enaˇ cbo za vsako vrsto ionov, ki jo v modelu upoˇ stevamo. Ob- javljene ˇ studije s tega podroˇ cja se osredotoˇ cajo bodisi na elektrokemijsko zdravljenje tumorjev, kjer se upora- bljajo znatno niˇ zje vrednosti elektriˇ cnih tokov in nape- tosti [7-11] bodisi na pojave med elektroporacijo v le enodimenzionalnem prostoru [6, 12-14]. ˇ Studija, kjer bi uspeˇ sno implementirali model v veˇ c dimenzijah z elek- troporacijskimi pogoji, kolikor nam je znano, ˇ se ni obja- vljena. V priˇ cujoˇ ci raziskavi predstavljamo prvi korak v iz- delavi numeriˇ cnega modela, ki bi omogoˇ cal izraˇ cun spre- memb pH v tkivu pri vrednostih elektriˇ cne napetosti in toka, znaˇ cilnih za elektroporacijo. Model smo izde- lali v programskem okolju COMSOL Multiphysics, ki omogoˇ ca numeriˇ cno reˇ sevanje diferencialnih enaˇ cb z me- todo konˇ cnih elementov. 2 Materiali in metode 2.1 Nernst-Planckov sistem enaˇ cb Enaˇ cbe, ki smo jih uporabili za numeriˇ cno modeliranje porazdelitve pH sprememb v tkivu med dovajanjem ele- ktroporacijskih pulzov temeljijo na delu Eve Nilsson s sodelavci [15, 16] s podroˇ cja numeriˇ cnega modeliranja elektrokemijskega zdravljenja tumorjev. Model teme- lji na Nernst-Planckovem sistemu enaˇ cb za koncentra- cijo ionov v ˇ stirikomponentnem elektrolitu. Upoˇ stevamo dva mehanizma: difuzijo vsled koncentracijskih gradien- tov in migracijo zaradi potencialnih gradientov. Za kon- vekcijo predpostavimo, da je zanemarljiva in je torej ne upoˇ stevamo. Model vsebuje pet neznanih spremenljivk: koncentracije vodikovih, hidroksidnih, kloridnih in natri- jevih ionov ter prostrosko porazdelitev elektriˇ cnega polja. 389 Materialno ravnovesje ionov komponentei je podano z: @c i @t =r N i +R i ; (1) kjer jec i koncentracija ionov komponentei (kjer jeiH + , OH ,Cl aliNa + ion),t je ˇ cas,R i je sproˇ sˇ canje ionov komponentei s kemijskimi reakcijami v elektrolitu, N i pa je molarni tok ionov komponentei: N i = D i rc i z i jz i j u i c i r; (2) kjer je D i difuzijski koeficient ionov komponente i, z i je (predznaˇ cen) naboj ionov komponente i, u i je giblji- vost ionov komponente i, pa je elektriˇ cni potencial v elektrolitu. Pogoju elektronevtralnosti je zadoˇ sˇ ceno z na- slednjo enaˇ cbo: 4 X i=1 z i c i = 0: (3) Gibljivost ionov in difuzijski koeficient sta povezana z Nernst-Einsteinovo enaˇ cbo: D i = RT jz i jF u i ; (4) kjer jeR sploˇ sna plinska konstanta,T je temperatura in F je Faradayeva konstanta. Gostoto elektriˇ cnega tokaj v elektrolitu izraˇ cunamo z uporabo Faradayevega zakona: j =F 4 X i=1 z i N i : (5) Enaˇ cbo za ohranitev elektriˇ cnega naboja rj = 0 (6) lahko, upoˇ stevaje enaˇ cbi (2) in (5), zapiˇ semo kot: r 4 X i=1 jz i ju i c i r ! + 4 X i=1 z i D i r 2 c i = 0; (7) kar je enaˇ cba, uporabljena za izraˇ cun porazdelitve elek- triˇ cnega polja. Dve reakciji potekata na anodi, evolucija kisika 2H 2 O * ) O 2 +4H + +4e (8) in evolucija klorida 2Cl * ) Cl 2 +2e (9) ter ena na katodi, evolucija hidroksida 2H 2 O+2e * ) H 2 +2OH : (10) Kinetiko reakcij na elektrodah raˇ cunamo z uporabo kon- centracijsko osnovane Butler-V olmerjeve enaˇ cbe. Edina reakcija v elektrolitu, ki jo upoˇ stevamo, je protolitska re- akcija vode: H + +OH * ) H 2 O: (11) Sproˇ sˇ canje natrijevih in kloridnih ionov je enako 0 (to- rej njuna koncentracija ostane konstantna), vodikovi in hidroksidni ioni pa se sproˇ sˇ cajo in porabljajo skladno s protolitsko reakcijo vode. Tako lahko zapiˇ semo naslednja izraza za sproˇ sˇ canje ionov: R Na + =R Cl = 0; (12) R H + =R OH =k w;b c H2O k w;f c H +c OH ; (13) kjer stak w;b ink w;f hitrostni konstanti protolitske reak- cije vode v smeri nazaj in naprej. Vrednosti parametrov, ki smo jih uporabili v nu- meriˇ cnih izraˇ cunih, so navedene v tabeli 1. Tabela 1: Vrednosti parametrov, uporabljene v numeriˇ cnih izraˇ cunih [15]. Parameter Vrednost k w;f 1;5 10 11 lmol 1 k w;b 2;7 10 5 s 1 D H + 9;31 10 5 cm 2 s 1 D OH 5;26 10 5 cm 2 s 1 D Na + 1;33 10 5 cm 2 s 1 D Cl 2;03 10 5 cm 2 s 1 c 0 H + 1;0 10 7 moll 1 c 0 OH 1;0 10 7 moll 1 c 0 Na + 0;16 10 7 moll 1 c 0 Cl 0;16 10 7 moll 1 c H2O 55;5 10 7 moll 1 2.2 Numeriˇ cno modeliranje Z opisanimi enaˇ cbami smo izvedli numeriˇ cni izraˇ cun pH sprememb v tkivu med dovajanjem elektroporacijskih pulzov, kakrˇ sni se uporabljajo pri genski elektrotransfek- ciji [5]. Uporabili smo ˇ stiri igelne elektrode premera 1mm, ki so razporejene v ogliˇ sˇ cih kvadrata s stranico 10mm. Postavitev elektrod je prikazana na sliki 1. Predpostavimo, da je glavni mehanizem, ki povzroˇ ci spremembe pH v tkivu migracija ionov v ˇ casu aplicira- nega elektriˇ cnega polja, difuzija, ki poteka tekom pavz med pulzi, pa je v primerjavi s tem zanemarljiva. Ta predpostavka nam omogoˇ ci, da izraˇ cune izvedemo z upo- rabo konstantne napetosti, torej ne upoˇ stevamo dejanske oblike pulzov in pavz med njimi. S tem se v modelu znebimo enega izmed izvorov nelinearnosti, s ˇ cimer po- stane model numeriˇ cno nekoliko laˇ zje obvladljiv. Upora- bili smo napetost 100V in pulze skupne dolˇ zine 60ms. Porazdelitev pH vrednosti v tkivu izraˇ cunamo na podlagi porazdelitve vodikovih ionov: pH = log 10 c H +: (14) Enaˇ cbe, navedene v prejˇ snjem in v tem podpoglavju, smo uporabili za izdelavo numeriˇ cnega modela v dveh di- menzijah v programskem okolju COMSOL Multiphysics (COMSOL Inc., ˇ Svedska, razliˇ cica 5.5), ki omogoˇ ca nu- meriˇ cno analizo na osnovi metode konˇ cnih elementov (MKE). 390 Slika 1: Postavitev elektrod, vstavljenih v tkivo, z oznaˇ cenimi ˇ crtami L1, L2 in L3, ki smo jih uporabili za natanˇ cnejˇ si prikaz porazdelitve pH sprememb v tkivu. Vse oznaˇ cene dimenzije so v milimetrih. 3 Rezultati Izraˇ cunano porazdelitev pH sprememb v tkivu po dovaja- nju elektroporacijskih pulzov napetosti 100V in skupne dolˇ zine60ms prikazuje slika 2. Slika 2: Porazdelitev pH sprememb v tkivu po dovajanju elek- troporacijskih pulzov napetosti100V in skupne dolˇ zine60ms. Za natanˇ cnejˇ si prikaz porazdelitve pH sprememb v tkivu smo si izbrali tri ˇ crte, ki so oznaˇ cene na postavitvi elektrod, prikazani na sliki 1. ˇ Crta L1 poteka skozi eno izmed anod in eno izmed katod, ˇ crta L2 poteka skozi obe anodi in ˇ crta L3 poteka skozi obe katodi. Porazdelitev pH sprememb v tkivu po dovajanju elektroporacijskih pulzov napetosti100V in skupne dolˇ zine20,40 ali60ms vzdolˇ z teh ˇ crt je prikazana na sliki 3. V tabeli 2 so navedene izraˇ cunane povrˇ sine obmoˇ cij Slika 3: Porazdelitev pH sprememb v tkivu po dovajanju ele- ktroporacijskih pulzov napetosti 100V in skupne dolˇ zine 20, 40 ali 60ms (a) vzdolˇ z ˇ crte L1, ki poteka skozi eno anodo in eno katodo, (b) vzdolˇ z ˇ crte L2, ki poteka skozi obe anodi in (c) vzdolˇ z ˇ crte L3, ki poteka skozi obe katodi. ˇ Crtkane ˇ crte oznaˇ cujejo lokacije elektrod. okoli vsake izmed elektrod, kjer je priˇ slo do spremembe vrednosti pH (vrednost pH < 6,9 oz. > 7,1) po dovaja- nju elektroporacijskih pulzov napetosti 100V in skupne dolˇ zine20,40 ali60ms. Kot meje obmoˇ cij, kjer pride do sprememb vrednosti pH, smo izbrali vrednosti 6,9 oz. 7,1 zato, da v obmoˇ cje ne zajamemo vrednosti, ki se od 7,0 razlikujejo zaradi numeriˇ cne napake. Marino in sodelavci navajajo, da poˇ skodbe plazmidne DNK nastopijo, kadar je le ta izpostavljena kislemu mediju s pH niˇ zjim od4;5, ali baziˇ cnemu mediju s pH viˇ sjim od8;4. Izraˇ cunane vre- dnosti obmoˇ cij okoli vsake izmed elektrod, ki ustrezajo temu pogoju, so prav tako navedene v tabeli 2. 391 Tabela 2: Izraˇ cunane povrˇ sine obmoˇ cij, kjer je priˇ slo do spre- membe vrednosti pH (vrednost pH< 6,9 oz.> 7,1) in obmoˇ cij, kjer priˇ cakujemo poˇ skodbe plazmidne DNK (vrednost pH< 4,5 oz.> 8,4) okoli vsake izmed elektrod (tj. ene izmed ˇ stirih elek- trod, anode oz. katode) po dovajanju elektroporacijskih pulzov napetosti 100V in skupne dolˇ zine 20, 40 ali 60ms. Kot meje obmoˇ cij, kjer pride do sprememb vrednosti pH, smo izbrali vre- dnosti 6,9 oz. 7,1 zato, da v obmoˇ cje ne zajamemo vrednosti, ki se od 7,0 razlikujejo zaradi numeriˇ cne napake. t(ms) 20 40 60 pH < 4;5(mm 2 ) 1;583 2;528 3;437 pH < 6;9(mm 2 ) 4;973 6;777 8;301 pH > 7;1(mm 2 ) 6;013 7;353 8;384 pH > 8;4(mm 2 ) 2;870 3;872 4;693 4 Razprava Na grafih, ki jih prikazuje slika 3 opazimo, da se med do- vajanjem elektroporacijskih pulzov v bliˇ zini anod pojavi kislo obmoˇ cje, v bliˇ zini katod pa baziˇ cno. V bliˇ zini anod se pojavi skrajna vrednost pH, niˇ zja od 2;5, v bliˇ zini ka- tod pa viˇ sja od13. Opazimo ostre razmejitve med nespre- menjenimi in spremenjenimi vrednostmi pH, tj. podroˇ cja pH front. Kot je priˇ cakovano, se z daljˇ sanjem skupnega ˇ casa dovedenih pulzov poveˇ cuje obmoˇ cje spremenjenih vrednosti pH, prav tako pa se zniˇ zujejo oz. zviˇ sujejo skrajne doseˇ zene vrednosti v bliˇ zini elektrod. Opazimo, da je v bliˇ zini katod povrˇ sina obmoˇ cja spremenjenega pH veˇ cja, kot v bliˇ zini anod, prav tako pa je v bliˇ zini katod veˇ cja povrˇ sina obmoˇ cja, kjer priˇ cakujemo poˇ skodbe plaz- midne DNK. V tem prispevku smo predstavili prvi korak pri izde- lavi numeriˇ cnega modela, ki omogoˇ ca izraˇ cun porazde- litve pH sprememb v tkivu med dovajanjem elektropora- cijskih pulzov. Model smo uporabili za izraˇ cun poraz- delitve pH sprememb v tkivu med dovajanjem elektro- poracijskih pulzov, ki se uporabljajo pri genski transfek- ciji. Numeriˇ cni model ima na tej stopnji razvoja teˇ zave s konvergenco in potrebuje nadaljnji razvoj. Teˇ zave pov- zroˇ cajo relativno visoke napetosti, ki se uporabljajo v ele- ktroporaciji, visoki koncentracijski gradienti in pa dej- stvo, da reˇ sujemo sistem petih moˇ cno nelinearnih sklo- pljenih parcialnih diferencialnih enaˇ cb. Prav tako v tej fazi ˇ se niso upoˇ stevane naravne sposobnosti tkiva za nev- tralizacijo povzroˇ cenih pH sprememb, rezultati izraˇ cunov pa niso bili validirani z rezultati realnih eksperimentov. Zahvala ˇ Studijo sta delno financirali Javna agencija za razisko- valno dejavnost Republike Slovenije in podjetje RenBio. Literatura [1] T. Kotnik, L. Rems, M. Tarek, in D. Miklavˇ ciˇ c, ” Membrane Electroporation and Electropermeabilization: Mechanisms and Models“, Annu. Rev. Biophys., let. 48, ˇ st. 1, str. 63–91, maj 2019. [2] M. L. Yarmush, A. Golberg, G. Serˇ sa, T. Kotnik, in D. Miklavˇ ciˇ c, ” Electroporation-Based Technologies for Me- dicine: Principles, Applications, and Challenges“, Annu. Rev. Biomed. Eng., let. 16, ˇ st. 1, str. 295–320, jul. 2014. [3] T. Kotnik, W. Frey, M. Sack, S. Haberl Megliˇ c, M. Peterka, in D. Miklavˇ ciˇ c, ” Electroporation-based applications in bi- otechnology“, Trends in Biotechnology, let. 33, ˇ st. 8, str. 480–488, avg. 2015. [4] S. Mahniˇ c-Kalamiza, E. V orobiev, in D. Miklavˇ ciˇ c, ” Elec- troporation in Food Processing and Biorefinery“, J Mem- brane Biol, let. 247, ˇ st. 12, str. 1279–1304, dec. 2014. [5] C. Rosazza, S. Haberl Megliˇ c, A. Zumbusch, M.-P. Rols, in D. Miklavˇ ciˇ c, ” Gene Electrotransfer: A Mechanistic Per- spective“, CGT, let. 16, ˇ st. 2, str. 98–129, apr. 2016. [6] N. Olaiz idr., ” Tissue damage modeling in gene electro- transfer: The role of pH“, Bioelectrochemistry, let. 100, str. 105–111, dec. 2014. [7] P. Turjanski, N. Olaiz, P. Abou-Adal, C. Su´ arez, M. Risk, in G. Marshall, ” pH front tracking in the electrochemical tre- atment (EChT) of tumors: Experiments and simulations“, Electrochimica Acta, let. 54, ˇ st. 26, str. 6199–6206, nov. 2009. [8] E. Luj´ an idr., ” Optimal dose-response relationship in elec- trolytic ablation of tumors with a one-probe-two-electrode device“, Electrochimica Acta, let. 186, str. 494–503, dec. 2015. [9] A. Soba idr., ” Integrated analysis of the potential, electric field, temperature, pH and tissue damage generated by di- fferent electrode arrays in a tumor under electrochemical treatment“, Mathematics and Computers in Simulation, let. 146, str. 160–176, apr. 2018. [10] A. Mokhtare, M. Shiv Krishna Reddy, V . A. Roodan, E. P. Furlani, in A. Abbaspourrad, ” The role of pH fronts, chlo- rination and physicochemical reactions in tumor necrosis in the electrochemical treatment of tumors: A numerical study“, Electrochimica Acta, let. 307, str. 129–147, jun. 2019. [11] E. M. Calzado, H. Schinca, L. E. B. Cabrales, F. M. Garc´ ıa, P. Turjanski, in N. Olaiz, ” Impact of permeabili- zation and pH effects in the electrochemical treatment of tumors: Experiments and simulations“, Applied Mathema- tical Modelling, let. 74, str. 62–72, okt. 2019. [12] P. Turjanski idr., ” The Role of pH Fronts in Reversible Electroporation“, PLoS ONE, let. 6, ˇ st. 4, str. e17303, apr. 2011. [13] F. Maglietti, S. Michinski, N. Olaiz, M. Castro, C. Su´ arez, in G. Marshall, ” The Role of Ph Fronts in Tissue Electro- poration Based Treatments“, PLoS ONE, let. 8, ˇ st. 11, str. e80167, nov. 2013. [14] M. Marino idr., ” pH fronts and tissue natural buffer inte- raction in gene electrotransfer protocols“, Electrochimica Acta, let. 255, str. 463–471, nov. 2017. [15] E. Nilsson, J. Berendson, in E. Fontes, ” Electrochemical treatment of tumours: a simplified mathematical model“, Journal of Electroanalytical Chemistry, let. 460, ˇ st. 1–2, str. 88–99, jan. 1999. [16] E. Nilsson in E. Fontes, ” Mathematical modelling of physicochemical reactions and transport processes occur- ring around a platinum cathode during the electrochemical treatment of tumours“, Bioelectrochemistry, let. 53, ˇ st. 2, str. 213–224, mar. 2001.