IZOLACIJA IN IDENTIFIKACIJA POLIETILENSKIH IN
KOVINSKIH DELCEV IZ TKIVA OB KOLANIH
ENDOPROTEZAH
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF UHMWPE AND METAL WEAR PARTICLES FROM PERIPROSTHETIC TISSUES
ALEKSANDRA MINOVIAl, I. MILOŠEV1, V. ANTOLIA2, S. HERMAN2
1lnštitut Jo‘ef Stefan, Jamova 39, 1000 Ljubljana ČOrtopedska klinika, Kl ini—ni center Ljubljana, Zaloška 9, 1000 Ljubljana
Prejem rokopisa - received: 1997-10-01; sprejem za objavo - accepted for publication: 1997-12-19
Uporabili smo metodo razkroja tkiva z natrjjevim hidroksidom za izolacjjo polietilenskih in kovinskih delcev iz periprosteti-nega tkiva. S FTIR in EDS smo potrdili, da so bili izolirani delci res polietilenski in delci zlitine TĚ-6AI-4V. S SEM smo ugotovili morfologijo in velikost delcev. Histološka analiza periprosteti-nega tkiva je potrdila prisotnost obrabnih delcev.
K|jučne besede: endoproteze, obrabni delci, tkivo, kemjjska analiza
A method of tissue digestion using sodium hydroxide was applied to the isolation of ultra-high-molecular-weight polyethylene (UHMWPE) and metal particles from periprosthetic tissues. FTIR and EDS verified that the recovered particles were UHMWPE and TĚ-6AI-4V. When viewed by SEM morphology and size of particles was determined. Histologic analysis of the tissues confirmed the presence of UHMWPE and metal particles.
Key words: endoprostheses, wear particles, tissue, chemical analysis
1 UVOD
V klinični uporabi je več modelov kolčnih endopro-tez, najpogosteje vsebujejo čašico, izdelano iz visoko-molekularnega polietilena, kovinsko steblo in kovinsko ali keramično glavo. Kovinski del implanta je najpogosteje iz nerjavnega jekla, zlitine Co-Cr-Mo ali Ti-Al-V. Kljub veliki korozijski odpornosti in čvrstosti teh materialov se po določenem času na površini implantov pojavijo poškodbe, ki povzročijo vnetne reakcije in razma-janost1. Najpogosteje privede do poškodb nezadostna odpornost materiala proti obrabi v kombinaciji z močnim korozijskim napadom biološkega okolja in mehanskimi napetostmi, ki se pojavijo ob fizičnih aktivnostih. Ko polietilenski in kovinski delci zaradi navedenih procesov obrabe pridejo v tkivo ob implantu, niso inertni, temveč so vključeni v biološke reakcije, ki v končni fazi pripeljejo do osteolize oziroma omajanja implanta. His-tološke analize so pokazale, da so sproščeni delci izpostavljeni procesu fagocitoze, pri čemer aktivirani makrofagi sproščajo v tkivo različne mediatorje - citok-ine in derivate prostaglandina E2, ki povzročajo pa-tološke spremembe v okoliškem tkivu2.
2 EKSPERIMENTALNI DEL
Preučevali smo vzorce človeškega tkiva, ki so bili odvzeti na Ortopedski kliniki v Ljubljani, ob odstranitvi implanta s femoralnim steblom iz zlitine Ti-6Al-4V in polietilensko čašico, po dveh letih zaradi omajanosti in izpaha.
KOVINE, ZLITINE, TEHNOLOGIJE 32 (1998) 1-2
ISSN 1318-0010 KZLTET 32(1-2)067(1998)
A. MINOVIČ ET AL.: IZOLACIJA IN IDENTIFIKACIJA POLIETILENSKIH ...
Vzorce za histološko analizo smo fiksirali v for-malinu, vstavili v parafinski blok in razrezali na lističe debeline 4 mm ter obarvali s hematoksilinom in eosinom.
Vzorce za kemijsko analizo smo razkrojili in izolirali polietilenske in kovinske delce. Pribli‘no 200 mg tkiva smo dodali 2 ml 4 M NaOH in hidrolizirali 48 ur pri 56°C. Nato smo centrifugirali 40 minut pri 10 000 obratih s 6 ml 95% etanola in s tem pospešili sedimentacijo. Sedimentiranemu delu smo zopet dodali 2 ml NaOH in postopek ponovili. Vzorec smo sprali z destilirano vodo in delce separirali v ultrazvočni kopeli. Ločili smo zgornjo plast v epruveti, kjer so se nahajali polietilenski delci, od spodnje, kjer so bili kovinski. 200 ml vzorca izoliranih polietilenskih delcev smo filtrirali skozi 0,2 mm polikarbonatni filter papir, prekrili z zlatom in analizirali s SEM (JEOL JSM 5800). Ostali del izoliranih polietilenskih delcev smo analizirali z FTIR spektosko-pijo (FTIR 1725X, Perkin Elmer) v območju 400 - 4000 cm-1. Vzorec izoliranih delcev zlitine Ti-6Al-4V smo prekrili z zlatom in analizirali s SEM in EDS (JEOL JSM 5800, EDS LINK ISIS).
3 REZULTATI IN DISKUSIJA
Postopek razkroja tkiva in izolacije delcev smo preizkusili na vzorcu govejega mesa, ki smo mu dodali referenčne polietilenske delce (Shamrock, 7 mm) in refe-renčne delce ‘eleza (Ventron, 100 mm). Ugotovili smo, da postopek ne vpliva na velikost in obliko delcev, potrebno jih je le dobro separirati v ultrazvočni kopeli in s tem preprečiti zdru‘evanje v večje gruče, kar bi onemogočilo karakterizacijo delcev3.
67
A. MINOVIČ ET AL.: IZOLACIJA IN IDENTIFIKACIJA POLIETILENSKIH ...
*    _-
Č*
v*».*
8 »> * "¦
i?i" ¦"    T«l      IfrKY  ¦    L*jrft    x28häae
Slika 1: SEM- posnetek morfologije polietilenskih delcev, izoliranih iz tkiva ob kolčnih endoprotezah
Figure 1: Scanning electron micrograph of polyethylene particles recovered from periprosthetic tissue
SEM-posnetek polietilenskih delcev ka‘e na tri karakteristične morfologije delcev (slika 1). Okrogli so veliki 0,05 - 1,5 mm, podolgovati pa 1 - 5 mm in so v obliki vlaken, lahko imajo glavo in rep ali pa so brez glave, v obliki večjih krp. Poleg teh dveh morfologij delcev se pojavljajo še individualni, submikrometrski delci v obliki zrn. Polietilenske delce smo identificirali z FTIR spektroskopijo s primerjavo s spektrom za referenčni material polietilena (slika 2). Karakteristični vrhovi se pojavljajo pri 2917, 2850, 1470 in 721 cm-1.
SEM-posnetek kovinskih delcev ka‘e na gručasto strukturo, delci se pojavljajo v obliki kosmičev in so veliki 1 - 10 mm (slika 3). Delce zlitine Ti-6Al-4V smo identificirali z EDS spektroskopijo. Pojavljajo se značilni vrhovi za titan in aluminij, vrh vanadija pa je skrit za zlatom, s katerim je bil prekrit vzorec.
Histološke analize človeškega tkiva ob kolčni endo-protezi so potrdile prisotnost polietilenskih in kovinskih
Slika 2: FTIR - spektra: a) referenčni polietilen b) polietilen, izoliran iz človeškega tkiva
Figure 2: FTIR spectra of: a) reference polyethylene b) polyethylene particles recovered from periprosthetic tissue
68
Slika 3: SEM posnetek morfologije kovinskih delcev, izoliranih iz tkiva ob kolčnih endoprotezah
Figure 3: Scanning electron micrograph of metal particles recovered from periprosthetic tissues
delcev. Pojavljajo se značilne celice velikanke, ki nastanejo ob napadu makrofagov na obrabne delce. Celice se zaradi ujetih delcev ne delijo pravilno, delijo se le jedra, celice pa ostanejo nedeljene in pri tem nastanejo velikanke. Da celice velikanke vsebujejo polietilenske delce, lahko posredno sklepamo na podlagi analize pod mikroskopom s polarizirano svetlobo, kjer se polietilen zaradi dvolomnih lastnosti sveti4. Žal tudi nekatere druge snovi v tkivu ka‘ejo dvolomnost in smo zato morali poiskati dodatno metodo - FTIR, ki je nedvomno potrdila prisotnost polietilena5.
Študija, ki je novost v raziskavah na področju ortopedije v Sloveniji, je prvi korak k načinu reševanja zahtevnega problema biodegradacije endoprotez, biološke aktivnosti sproščenih delcev in v končni fazi sistemskih efektov, ki jih lahko povzročijo produkti korozijskih in obrabnih procesov na površini implantov.
ZAHVALA
Zahvaljujemo se dr. Ireni An‘ur (Kemijski inštitut), doc.dr. Andreju Cöru (Medicinska fakulteta) in Zoranu Samard‘iji, dipl. ing. (IJS) za pomoč pri delu.
4 LITERATURA
1 J. Frokjaer et al., Polyethylene particles stimulate monocyte chemo-tactic and activating factor production in synovial mononuclear cells in vivo. Acta Orthop. Scand., 66 (1995) 303-307
2 D. G. Hicks et al., Granular Histiocystosis of Pelvic Lymph Nodes following Total Hip Arthroplasty. J. Bone Joint Surg., 78-A (1996) 482-496
3 A. Minovič, Razvoj polarografske metode za določanje kroma in ‘eleza v človeškem tkivu. Diplomsko delo, FKKT, Ljubljana 1997
4 D. Howie, Tissue Response in Relation to Type of Wear Particles Around Failed Hip Arthroplasties. J. Arthrop., 5 (1990) 337-348
5 K. G. Shea et al., Analysis of Lymph Nodes for Polyethylene Particles in Patients Who Have Had a Primary Joint Replacement. J. Bone Joint Surg., 78-A (1996) 497-504
KOVINE, ZLITINE, TEHNOLOGIJE 32 (1998) 1-2