Domen Vozel1, Darja Božič2, Marko Jeran3,, Zala Jan4, Manca Pajnič5, Ljubiša Pađen6, Matej Hočevar7 Nejc Steiner8, Veronika Kralj - Iglič9, Saba Battelino10 Zdravljenje terapevtsko odpornega kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti s plazmo, bogato s trombociti in zunajceličnimi vezikli Treatment of Recalcitrant Chronic Postoperative Inflammation of Temporal Bone with Platelet- and Extracellular Vesicle-rich Plasma iZvleČek KLJUČNE BESEDE: holesteatom, zunajcelični vezikli, mastoidektomija, plazma, bogata s trombociti, kakovost življenja, regenerativna medicina, teranostična nanomedicina IZHODIŠČA. Kronično pooperativno vnetje temporalne kosti pomembno vpliva na kako- vost življenja. Plazma, bogata s trombociti in zunajceličnimi vezikli (angl. platelet- and extracellular vesicle-rich plasma, PVRP), je bila prepoznana kot učinkovito sredstvo za zdra- vljenje kroničnega vnetja na drugih področjih otorinolaringologije. METODE. Bolniki so bili naključno razporejeni na zdravljenje s PVRP (skupina PVRP) ali standardnimi konzer- vativnimi metodami (kontrolna skupina) v okviru štirih mesečnih pregledov in naknadnega spremljanja. Izid zdravljenja je bil merjen z vprašalnikom o kroničnem vnetju srednjega ušesa 12 ( Chronic Otitis Media Questionnaire, COMQ-12), površino vnetja in časom brez simptomov po četrtem pregledu. REZULTATI. Enajst bolnikov iz vsake skupine je konča- lo zdravljenje; 95 % je imelo kronično vnetje radikalne votline. V štirih pregledih se je 1 Asist. dr. Domen Vozel, dr. med., Klinika za otorinolaringologijo in cervikofacialno kirurgijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška cesta 2, 1000 Ljubljana; Katedra za otorinolaringologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška cesta 2, 1000 Ljubljana; domen.vozel@kclj.si 2 Dr. Darja Božič, univ. dipl. biokem., Laboratorij za klinično biofiziko, Zdravstvena fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, in Laboratorij za fiziko, Fakulteta za elektrotehniko, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 3 Marko Jeran, Laboratorij za klinično biofiziko, Zdravstvena fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Zdravstvena pot 5, 1000 Ljubljana; Laboratorij za fiziko, Fakulteta za elektrotehniko, Univerza v Ljubljani, Tržaška cesta 25, 1000 Ljubljana 4 Zala Jan, mag. san. inž., Laboratorij za klinično biofiziko, Zdravstvena fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zdravstvena pot 5, 1000 Ljubljana 5 Dr. Manca Pajnič, dipl. m. s., mag. posl. in ekon. ved, Laboratorij za klinično biofiziko, Zdravstvena fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zdravstvena pot 5, 1000 Ljubljana 6 Dr. Ljubiša Pađen, dipl. zn., mag. zdr. neg., Laboratorij za klinično biofiziko, Zdravstvena fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zdravstvena pot 5, 1000 Ljubljana 7 Dr. Matej Hočevar, Inštitut za kovinske materiale in tehnologije, Lepi pot 11, 1000 Ljubljana 8 Nejc Steiner, dr. med., Klinika za otorinolaringologijo in cervikofacialno kirurgijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška cesta 2, 1000 Ljubljana 9 Prof. dr. Veronika Kralj - Iglič, univ. dipl. fiz., Laboratorij za klinično biofiziko, Zdravstvena fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zdravstvena pot 5, 1000 Ljubljana; 10 Izr. prof. dr. Saba Battelino, dr. med., Klinika za otorinolaringologijo in cervikofacialno kirurgijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška cesta 2, 1000 Ljubljana; Katedra za otorinolaringologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška cesta 2, 1000 Ljubljana, Slovenija. 75Med Razgl. 2022; 61 Suppl 2: 75–91 ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 75 76 Zdravljenje terapevtsko odpornega kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti s plazmo, … seštevek COMQ-12 statistično značilno zmanjšal v skupini PVRP (p < 0,001), ne pa v kon- trolni skupini (p = 0,339). Površina vnetja se je statistično značilno zmanjšala med prvim in drugim pregledom (p < 0,0005), ne pa tudi med drugimi pregledi (p > 0,05) v skupini PVRP. Med pregledi v kontrolni skupini nismo zaznali statistično pomembnih razlik v povr- šini vnetij (p = 0,152). RAZPRAVA. Avtologna PVRP pomeni novo dodatno in uspešno zdra- vljenje kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti, kadar so kirurške in standardne konzervativne metode zdravljenja izčrpane. aBstraCt KEY WORDS: cholesteatoma, extracellular vesicles, mastoidectomy, platelet-rich plasma, quality of life, regenerative medicine, theranostic nanomedicine BACKGROUNDS. Chronic postoperative inflammation of the temporal bone has a signi- ficant impact on the quality of life. Platelet and extracellular vesicle-rich plasma (PVRP) has been identified as an effective agent for the treatment of chronic inflammation in other areas of otorhinolaryngology. METHODS. Patients were randomized to receive PVRP (PVRP group) or standard conservative methods (control group) as part of four month- ly examinations and follow-up. The outcome of treatment, the area of inflammation, and the asymptomatic time after the fourth examination, were measured with the Chronic Otitis Media Questionnaire 12 (COMQ-12). RESULTS. Eleven patients from each group completed treatment; 95% had chronic inflammation of the radical cavity. In four check- ups, the sum of COMQ-12 decreased statistically significantly in the PVRP group (p<0.001) and not in the control group (p = 0.339). The area of inflammation decreased statistical- ly significantly between the first and second check-up (p < 0.0005), but not during the other check-ups (p > 0.05) in the PVRP group. During the check-ups in the control group, no statistically significant differences in the surface area of inflammation were detec- ted (p=0.152). DISCUSSION. Autologous PVRP represents a new additional and successful way to treat chronic postoperative inflammation of the temporal bone when surgical and standard conservative treatment methods are exhausted. iZHoDiŠČa Kronično pooperativno vnetje temporalne kosti običajno pomeni kronično vneto radi- kalno mastoidno votlino z izcedkom, ki je posledica radikalne mastoidektomije (angl. canal wall down) (1). Ta otokirurški poseg se izvede pri približno 53 % operacij hole- steatoma (2). Čeprav kronično pooperativno vnetje temporalne kosti prizadene le 1,5 % bolnikov z radikalno votlino, je njeno breme za kakovost življenja in vpliv na zdravstveno obremenitev pomembno (3, 4). Zdravljenje je zahtevno, še zlasti kadar so uveljavljene metode zdravljenja izčrpane. Ker je kroni- čno pooperativno vnetje temporalne kosti podtip kroničnega vnetja srednjega ušesa, je mogoče kakovost življenja, povezano z zdravjem, oceniti z orodji, namenjenimi bolnikom, kot je vprašalnik o kroničnem vnetju srednjega ušesa (Chronic Otitis Media Questionnaire 12, COMQ-12) (5, 6). Zavedanje o bremenu kroničnega poope- rativnega vnetja temporalne kosti je spod- budilo raziskovanje novih načinov zdra- vljenja, vključno z uporabo medicinskega medu in izpopolnjevanjem kirurških tehnik (7). Po drugi strani pa se plazma, bogata s trombociti (angl. platelet-rich plasma, PRP), ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 76 pogosto uporablja za pospeševanje celjenja ran v številnih kliničnih okoljih, na primer pri rekonstrukciji sluhovoda po mastoi- dektomiji, rekonstrukciji baze lobanje, ope- raciji nosnega pretina, tonzilektomiji in laringektomiji, zaradi koristnih imunskih, hemostatskih in regenerativnih učinkov trombocitov, ki jih povzroča sproščanje ras- tnih dejavnikov iz zrnc in več ekstragranu- larnih molekul (8–12). Kljub temu v otori- nolaringologiji primanjkujejo randomizirane kontrolirane klinične raziskave z uporabo PRP (13). Ker plazma vsebuje zunajcelične vezi- kle (ZV), ki veljajo za pomembne zdravilne vektorje, v tej raziskavi imenujemo pri- pravek kot plazmo, bogato s trombociti in zunajceličnimi vezikli (angl. platelet- and extracellular vesicle-rich plasma, PVRP) (13). ZV so heterogena skupina celičnih mem- branskih veziklov razreda velikosti nano- metra z bistvenimi vlogami v medcelični komunikaciji in imajo izjemen potencial za uporabo pri diagnosticiranju, zdravljenju ali obojem (t. i. teranostiki) (14). ZV so naravno prisotni v krvi. Poleg tega nastajajo iz krvnih celic med vzorčenjem in obdelavo (15). Čeprav je pričakovati, da bodo kon- centracije ZV v PVRP visoke, je literature, ki to opisuje, malo (13, 16). Zaradi navedenih razlogov je bil pre- poznan pomen raziskovanja učinkovitosti PVRP pri zdravljenju kroničnega poopera- tivnega vnetja temporalne kosti. Cilj te prospektivne randomizirane kontrolirane klinične raziskave je primerjati učinkovitost avtologne PVRP, ki se daje prek ušesnega traku, in standardnih konzervativnih metod pri zdravljenju kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti. Izid zdravljenja se meri prvi, drugi in tretji mesec po izhodiščni oceni z meritvami površine vnetja in oceno kakovosti življenja s COMQ-12. Raziskovalna hipoteza je, da je PVRP učinkovita pri zdravljenju kroničnega poope- rativnega vnetja temporalne kosti, kadar so standardne konzervativne in kirurške meto- de izčrpane. Izčrpanost teh metod uteme- ljuje izvedbo te raziskave. MetoDe Raziskava je bila registrirana, rezultati so bili objavljeni na spletni strani ClinicalTrials.gov (št. NCT04281901). Komisija za medicinsko etiko Republike Slovenije je odobrila razi- skavo (št. 0120146/2019/5). Od vseh bol- nikov, vključenih v raziskavo, je bilo prid- obljeno pisno informirano soglasje. vstop v raziskavo Vstop v raziskavo, ki so jo izvajali vodilni raziskovalci, se je začel z vpisom bolnikov na seznam (slika 1) med redno načrtovanimi pregledi med 20. marcem 2019 in 15. sep- tembrom 2019 v terciarnem referenčnem centru za otorinolaringologijo. Ta čas je bil bistveno daljši od obdobja med dvema pre- gledoma pri bolniku s kroničnim poopera- tivnim vnetjem temporalne kosti. Vključitvena merila so bila: • starost > 18 let, • kronično vnetje srednjega ušesa, oprede- ljeno kot prisotnost ≥ 1 kliničnih znakov: • poslabšanje vnetja, • vidnega izcedka iz ušes, • posrednih znakov izcedka iz ušes (npr. na blazini in oblačilih), • srbenja in • občutka polnosti ušes, • izčrpano kirurško zdravljenje: • dodatno kirurško zdravljenje ne bi ohra- nilo uporabnega sluha, • izčrpano standardno konzervativno zdravljenje: • neučinkovito konzervativno zdravlje- nje vsaj osem tednov, ki je vključeva- lo dajanje protimikrobnih, protivnetnih, antiseptičnih pripravkov (tj. kapljice, mazila, paste in praški) in/ali palčke srebrovega nitrata (za izvedbo kemo- kavterizacije granulacijskega tkiva). Izključitvena merila so bila: • vnetje mesta venepunkcije, • nosečnost ali dojenje, 77Med Razgl. 2022; 61 Suppl 2: ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 77 • kronična uporaba imunomodulatornih in/ali protimikrobnih zdravil, • prisotnost sistemske nalezljive bolezni, avtoimunske bolezni in malignosti, • drugi eksperimentalni poskusi zdravlje- nja istega kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti in • nezmožnost in/ali zavrnitev bolnikovega sodelovanja v raziskavi. Enostransko kronično pooperativno vnetje temporalne kosti je bilo obravnavano kot en primer in dvostransko kot dva primera bolezni. razvrstitev in začetek zdravljenja Po vpisu smo bolnike razvrstili v eno od dveh skupin: zdravljenje s standardnimi 78 Zdravljenje terapevtsko odpornega kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti s plazmo, … konzervativnimi metodami (tj. kontrolna skupina), ali zdravljenje s PVRP (tj. skupi- na PRVP) (slika 1). Uporabili smo prepro- sto randomizacijo z uporabo zaprtih ovojnic višjega raziskovalca (natančneje opisano v dopolnilnem gradivu raziskave Vozla in sodelavcev (17)). Nato sta vodilna razi- skovalca bolnike obvestila o razporeditvi v skupine na naslednjih pregledih, ki so bili redno načrtovani med 18. septembrom 2019 in 22. januarjem 2020. Po ponovni oceni vključitvenih in izključitvenih meril je bila na teh pregledih pridobljena pisna privolitev, in ker je bil bolnik z njo sezna- njen, je začel sodelovati v raziskavi. Pozneje smo začeli zdraviti po shemi, ki je vklju- čevala štiri preglede. Po prvem (tj. izho- diščnem) pregledu so bili načrtovani trije pregledi s tedenskimi intervali vodilnih R a z vr st it e v S le d en je V st o p Vstop 25 bolnikov ali 27 primerov v raziskavo (2 bolnika z bilateralnimvnetjem) 1. Razvrstitev bolnikov z bilateralnimvnetjemv kontrolno skupino (n=2 bolnika ali 4 primeri) 2. Naključna razvrstitev bolnikov z unilateralnimvnetjemv kontrolno aliPVRP skupino (n=23 bolnikov ali primerov) A n a li za n=11 bolnikov ali 13 primerov n=11 bolnikov ali 11 primerov Z d ra v lj e n je A Z d ra v lj e n je B Izgubljeni med sledenjem (n=1 bolnik ali 1 primer) zaradi prilagoditev ambulant med COVID-19 Izgubljeni med sledenjem (n=1 bolnik ali 1 primer) zaradi prilagoditev ambulant med COVID-19 Razvrščeni v (n=13 bolnikov ali 13 primerov): PVRP skupinoRazvrščeni v (n=12 bolnikov ali 14 primerov): kontrolno skupino • Prejeli dodeljeno zdravljenje (n=12 bolnikov ali 14 primerov) • Prejeli dodeljeno zdravljenje (n=12 bolnikov ali 12 primerov) • Zavrnili sodelovanje (n=1 bolnik ali 1 primer) Slika 1. Potek raziskave. PVRP – plazma, bogata s trombociti in zunajceličnimi vezikli (angl. platelet- and extra- cellular vesicle-rich plasma, PVRP). COVID-19 – koronavirusna bolezen 2019 (angl. coronavirus disease 2019). ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 78 raziskovalcev. Naslednji pregledi (tj. po četrtem pregledu) so bili definirani kot obdobje spremljanja. Kontrolna skupina je bila ob vsakem pregledu zdravljena s standardnimi kon- zervativnimi metodami (opisanih v vklju- čitvenih merilih). Skupina PVRP je bila na prvem in drugem pregledu zdravljena z avtologno PVRP. Pri vsakem pregledu je bila pri vseh bolnikih opravljena aspiracij- ska toaleta ušes. Vsem bolnikom smo naro- čili, naj upoštevajo splošne previdnostne ukrepe za suho uho. Zavrnitev bolnikovega sodelovanja v preskušanju ni spremenila rednega zdra- vljenja kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti. Primarna merila za določanje izida zdravljenja Pri vsakem od štirih pregledov smo za vsak primer izmerili površino žarišča vne- tja in vsak bolnik je izpolnil vprašalnik COMQ-12, ki je dostopen na spletni strani https://www.kclj.si/dokumenti/COMQ-12.pdf. Ta vprašalnik je bil predhodno potrjen in medkulturno prilagojen slovenščini (18). Vodilna raziskovalca sta identificirala in fotografirala žarišča vnetja (npr. granula- cijsko tkivo, pordelost, edem) z diagnosti- čnim otomikroskopom OPMI pico/S100® (Carl Zeiss Surgical GmbH, Oberkochen, Nemčija) pri 5,1- in 8,5-kratni povečavi, za katero je bila predhodno izvedena kalibra- cija. Žarišče vnetja je bilo takoj anatomsko razvrščeno (17). Pozneje je neodvisni slepi ocenjevalec rezultatov, ki ni vedel za dode- litev zdravljenja, orisal žarišče vnetja in izmeril njegovo površino z uporabo pro- gramske opreme ZEN 3.0 blue edition® (Carl Zeiss Microscopy GmbH, 2019). Površine v kvadratnih milimetrih (mm2) so bile pret- vorjene v odstotek glede na izhodiščno površino žarišča vnetja (tj. 100 % ob prvem pregledu), kot je prikazano na sliki 2. sekundarna merila za določanje izida zdravljenja Sekundarno merilo je bilo trajanje obdob- ja brez simptomov kroničnega poopera- tivnega vnetja temporalne kosti. Analizirali smo ga pri bolnikih, ki med četrtim pre- gledom in naslednjimi pregledi v obdobju spremljanja niso imeli simptomov, pove- zanih s to boleznijo. Ti simptomi so bili izce- dek iz ušes, posredni znaki izcedka iz ušes (npr. na blazini in oblačilih), srbenje, bole- čina in občutek polnosti ušes. neželeni stranski učinki uporabe plazme, bogate s trombociti in zunajceličnimi vezikli Neželeni dogodki uporabe PVRP so bili defi- nirani kot poslabšanje kroničnega poope- rativnega vnetja temporalne kosti v treh dneh po aplikaciji PVRP v obliki intenziv- nejšega izcedka iz ušes, srbenja in/ali občut- ka polnosti ušes. Za spremljanje neželenih stranskih učinkov smo bolnikom naročili, naj vzpostavijo stik z vodilnimi raziskovalci ali terciarnim referenčnim centrom za oto- rinolaringologijo. 79Med Razgl. 2022; 61 Suppl 2: slika 2. Prikaz merjenja površine žarišča kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti. Ta primer prikazuje zmanjšanje površine vnetja. ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 79 izvedli centrifugiranje 5 min 300 × g, 18 °C) krvnih epruvet in ločili dve frakciji (slika 3, plošči 2, 3A): hematokrit (rdeča plast na dnu) in plazmo s trombociti (rumena zgor- nja plast). Občasno je bilo mogoče opazi- ti bel sloj (angl. buffy coat, tj. tanka motna belkasta plast levkocitov) na vrhu hema- tokrita. Plazmo neposredno nad tem slo- jem smo s sterilno pipeto (slika 3, plošča 3A) prenesli v sterilno polipropilensko epruveto (slika 3, plošča 3B). Potrebna je bila previdnost, da se je preprečilo meša- nje plasti, to je hematokrita in belega sloja ter posledično mešanje levkocitov in eri- trocitov. Zbrana plazma je bila enako- merno porazdeljena med dve sterilni poli- propilenski epruveti in nato centrifugirana 80 Zdravljenje terapevtsko odpornega kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti s plazmo, … Postopek priprave plazme, bogate s trombociti in zunajceličnimi vezikli Kri je bila odvzeta v štiri 4,5-mililitrske vakuumske epruvete z natrijevim citra- tom (9 NC natrijev citrat 0,105 M, BD Vacutainer®, Becton Dickinson, pri sobni temperaturi, San Jose, Kalifornija, ZDA) z iglo s krilci 21-G (Set za zbiranje krvi Safety-Lok™, BD Vacutainer®, Becton Dickinson, San Jose, Kalifornija, ZDA) (slika 3, plošča 1). Dve napolnjeni epruveti smo uporabili za pripravo ene enote PVRP, dve enoti pa sta bili pripravljeni vzporedno. Epruvete s krvjo so bile takoj prenešene pri sobni temperaturi (22–24 °C) v laboratorij, kjer se je začela priprava PVRP. Najprej smo 1 2 3a3b4 5a 5c Postopek priprave PVRP 6 1 vnos PVRP 1. centrifugiranje 300 g, 5 min, 18 °C 2. centrifugiranje 700 g, 17 min, 18 °C ločitev eritrocito odstranitev PPP PPP 5b slika 3. Postopek priprave avtologne PVRP. Za vzporedno pripravo dveh enot PVRP smo uporabili štiri citrat- ne epruvete s krvjo. Fotografije 1–6 označujejo korake priprave (16). PVRP – plazma, bogata s trombociti in zunajceličnimi vezikli (angl. platelet- and extracellular vesicle-rich plasma), PPP – plazma, revna s trom- bociti (angl. platelet-poor plasma). ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 80 17 min, 700 × g, 18 °C, da se je sedimenti- rala plazma, bogata s trombociti (slika 3, bele puščice na ploščah 4, 5A in 5B). Zgornjo polovico centrifugirane plazme (obrobljeno z belo črtkano črto, slika 3, plošča 4), imenovano plazma, revna s trom- bociti (angl. platelet-poor plasma), smo previdno odstranili in zavrgli brez meša- nja plasti (slika 3, plošča 5A). Preostali pri- pravek smo resuspendirali v nastalem volumnu (slika 3, plošča 5B) v isti epru- veti (slika 3, plošča 5C) za proizvodnjo PVRP. Dve enoti PVRP smo združili in dali istemu bolniku (tj. avtologna aplikacija) prek ušesnega traku (tj. trak 1 cm × 10 m, razrezan na 7 cm dolge trakove, Tosama d. o. o., Domžale, Slovenija) v območje kro- ničnega pooperativnega vnetja temporal- ne kosti (slika 3, plošča 6). Bolniku smo naročili, naj si po dveh dneh trak odstra- ni. Avtologno aplikacijo PVRP smo opra- vili bolnikom iz skupine PVRP pri prvem in drugem pregledu. analize krvi in plazme, bogate s trombociti in zunajceličnimi vezikli Koncentracijo levkocitov, eritrocitov, hemo- globina, C-reaktivne beljakovine (angl. C-reac- tive protein, CRP), diferencialno število krvnih celic in hitrost sedimentacije eritro- citov (angl. erythrocyte sedimentation rate, ESR) smo določili v vzorcih krvi s stan- dardnimi metodami avtomatske citometrije. Poleg tega so bili vzorci krvi in PVRP analizirani s pretočno citometrijo (preto- čni citometer MACS QUANT™, Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Nemčija, in sorodna programska oprema MACSQuantify™), da smo PVRP razvrstili po DeLongu in sod. glede na koncentracije trombocitov v PVRP (18). Delce smo okarakterizirali na podla- gi signalov sipanja naprej (angl. forward scattering) in stranskega sipanja (angl. side scattering) pretočnega citometra. Vrata so bila postavljena v preliminarni raziskavi, kjer je bila identiteta celic v predstavljenih regijah potrjena z imunskim označevanjem in z analizo skenirne elektronske mikrosko- pije. S slednjim smo zagotovili tudi dokaze o prisotnosti ZV (16). Pozneje smo donos trombocitov in ZV v PVRP določili z raz- merjem (1): Za analizo sterilnosti smo pripravili PVRP iz krvi prostovoljcev z uporabo zgoraj opi- sanega protokola priprave od prostovoljcev, starejših od 18 let in brez kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti ter povezanih bolezni in znakov okužbe. Kemikalije, dodatni materiali in meto- de, uporabljene v analizi PVRP, so opisane v dopolnilnem gradivu (17). statistična analiza Za statistično analizo smo uporabili Microsoft Excel® za Mac (različice 16.9.0–16.36, Microsoft Corp., Redmond, Washington, ZDA) in Statistični paket za družboslovne vede (angl. Statistical Package For Social Sciences,SPSS) (različica 23, IBM Corp., Armonk, New York, ZDA). Vrednost p < 0,05 je veljala za statistično značilno. Dodaten opis statistične analize je na voljo v dopol- nilnem gradivu (17). reZUltati Rezultati vmesnih analiz preskušanja so bili delno predstavljeni drugje, končni rezultati pa v članku Vozla in sod. (17). Bolniki Diagram poteka raziskave je prikazan na sliki 1 in o njem se je poročalo v skladu z izjavo CONSORT v dopolnilnem gradivu (17). Vključenih in razporejenih je bilo 25 bolnikov ali 27 primerov kroničnega poope- rativnega vnetja temporalne kosti (dva bol- nika z obojestransko prizadetostjo). En bolnik, ki je bil razporejen v skupino PVRP, je zavr- nil sodelovanje v raziskavi, dva (tj. po eden 81Med Razgl. 2022; 61 Suppl 2: koncentracija trombocitov in ZV v PVRP koncentracija trombocitov in ZV v krvi ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 81 82 Zdravljenje terapevtsko odpornega kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti s plazmo, … tabela 1. Demografske in klinične značilnosti bolnikov. Čas do začetka zdravljenja – čas od začetka težav zaradi kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti do prvega pregleda v sklopu raziskave, čas od operacije – čas od zadnjega kirurškega zdravljenja kronične bolezni ušesa do prvega pregleda v sklopu razi- skave, PVRP – plazma, bogata s trombociti in zunajceličnimi vezikli (angl. platelet- and extracellular vesic- le-rich plasma), n – število bolnikov, M – povprečje (angl. mean), SD – standardni odklon (angl. standard deviation), Mdn – mediana, ‡ – t- test za neodvisna vzorca, * – Fisherjev natančni test, ** – U-test Mann- Whitney, COMQ-12 – Vprašalnik za oceno prizadetosti zaradi kroničnega vnetja srednjega ušesa (Chronic Otitis Media Questionnaire 12). testna skupina kontrolna skupina p (n = 11) (n = 11) Spol(n,%) Moški 9 (82 %) 9 (82 %) 1,000 Ženski 2 (18 %) 2 (18 %) Starost(leta) M±SD 47 ± 18 52 ± 24 0,632‡ Pridružene bolezni (n, %) Da 6 (55 %) 6 (55 %) 1,000 Ne 5 (45 %) 5 (45 %) Redno jemanje zdravil (n, %) Da 3 (27 %) 6 (55 %) 0,387* Ne 8 (73 %) 5 (45 %) Alergije (n, %) da 5 (45 %) 4 (36 %) 1,000* ne 6 (55 %) 7 (64 %) Koagulopatije (n, %) Da 2 (18 %) 1 (9 %) 1.000* Ne 9 (82 %) 10 (91 %) Kajenje (n, %) Da 2 (18 %) 5 (45 %) 0,361* Ne 9 (82 %) 6 (55 %) Uživanje alkohola (n, %) Da 10 (91 %) 7 (64 %) 0,311* Ne 1 (9 %) 4 (36 %) Čas do začetka zdravljenja (dnevi – leta) Mdn 2688 – 7,4 3172 – 8,7 0,116** Čas od operacije (dnevi – leta) Mdn 4644 – 12,7 5224 – 14,3 0,573** COMQ-12 seštevek točk Mdn 33 34 0,977** ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 82 iz vsake skupine) pa sta bila izgubljena za nadaljnje spremljanje (angl. lost to follow-up). Končna analiza je vključevala 22 bolnikov ali 24 primerov bolezni (tj. dva bolnika z dvostransko prizadetostjo). Koagulopatija pri enem bolniku je bila posledica redne- ga jemanja acetilsalicilne kisline (tabela 1). Pri 21 bolnikih (95 %) ali 23 primerih (96%) se je vnetje pojavilo kot kronično vne- tje radikalne mastoidne votline. Pri enem bolniku (5 %) ali enem primeru (4 %) se je vnetje pojavilo v votlini po subtotalni petrozektomiji, ki je bila izvedena za zdra- vljenje ploščatoceličnega karcinoma zuna- njega sluhovoda, ki se ni ponovil od leta 2004. Pri enem bolniku (5 %) ali enem pri- meru bolezni (4 %) v skupini PVRP je bilo vnetje posledica radikalne mastoidektomi- je zaradi holesteatoma zunanjega sluhovo- da. Pri 20 bolnikih (91 %) ali 22 primerih (92 %) (10 primerov iz skupine PVRP in 12 primerov iz kontrolne skupine) je bila opra- vljena radikalna mastoidektomija zaradi holesteatoma srednjega ušesa (17). Intervali med pregledi niso pokazali sta- tistično značilne razlike med skupinama (mediana (Mdn) = 28 in p > 0,05 za vsak interval med pregledi) (17). Krvni laboratorijski izvidi, določeni s standardnimi avtomatskimi citometrij- skimi metodami, so bili pri vseh bolnikih normalni. Povprečna koncentracija trom- bocitov in ZV, izmerjena s pretočno cito- metrijo v vzorcih krvi skupine PVRP, je bila 199 × 109/l ± 62 × 109/l (17). izid zdravljenja Vprašalnikokroničnemvnetjusrednjegaušesa Način zdravljenja (tj. standardno konzer- vativno zdravljenje ali zdravljenje s PVRP) je statistično pomembno učinkoval na vsote COMQ-12 v štirih pregledih glede na 83Med Razgl. 2022; 61 Suppl 2: C O M Q 12 – 0 10 20 30 40 50 Pregled 4.3.2.1. Skupina * * * kontrolna PVRP slika 4. Prikaz kakovosti življenja, povezane s kroničnim pooperativnim vnetjem temporalne kosti, merje- ne s COMQ-12. V 95-% interval zaupanja so vključeni v graf. * – statistično značilne razlike med skupinama v seštevkih točk pri posameznih pregledih (2., 3. in 4.), PVRP – plazma, bogata s trombociti in zunajceličnimi vezikli (angl. platelet- and extracellular vesicle-rich plasma), COMQ-12 – vprašalnik za oceno prizadetosti zaradi kroničnega vnetja srednjega ušesa (Chronic Otitis Media Questionnaire 12). ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 83 dvosmerno mešano analizo variance (tj. ANOVA) (F(3, 60) = 8,755, p < 0,0005, delni η2 = 0,304) (slika 4) (17). Pri prvem pregledu ni bilo statistično značilne razlike v rezultatih med skupina- ma (F(1, 20) = 0,00, p = 0,949), razlika pa je bila statistično značilna pri drugem (F(1, 20) = 6,48, p = 0,019, delni η2 = 0,245), tretjem (F(1, 20) = 7,30, p = 0,014, delni η2 = 0,267) in četrtem pregledu (F(1, 20) = 15,29, p = 0,001, delni η2 = 0.433). Seštevek točk COMQ-12 se je med zdravljenjem statisti- čno značilno znižal v skupini PVRP (F(3, 30) = 9,78, p < 0,001, delni η2 = 0,494) in ne v kontrolni skupini (F(3, 30) = 1,17, p = 0,339). Znižanje seštevka točk COMQ-12 je bilo statistično značilno v skupini PVRP med prvim in tretjim (M = 11 točk, SE = 3 točke, p = 0,029) ter med prvim in četrtim pregledom (M = 15 točk, SE = 2 točki, p = 0,001), ne pa tudi med drugimi pregledi (p > 0,05) (17). 84 Zdravljenje terapevtsko odpornega kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti s plazmo, … Površina žarišč kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti Razlike površin žarišč kroničnega poope- rativnega vnetja temporalne kosti so bile v skupini PVRP statistično značilno razli- čne med prvim (povprečje (angl. mean, M) = 100 %, (standardni odklon, angl. stan- dard deviation, SD)=0%), drugim (M=43%, SD = 30 %), tretjim (M = 36 %, SD = 30 %) in četrtim pregledom (M = 36 %, SD = 28 %) glede na enosmerno ANOVA s ponavljajo- čimi se meritvami (F(3, 30)=28,59, p<0,0005, delni ω2 =0,650) (slika 5) (17). Glede na ana- lizo post-hoc z Bonferronijevim poprav- kom je bilo zmanjšanje statistično zna- čilno med prvim in drugim pregledom (M = 57 %, 95 % interval zaupanja (IZ) (28, 87), p<0,0005), med drugimi pregledi pa ne (p > 0,05). Med pregledi v kontrolni skupi- ni po enosmerni ANOVA s ponavljajočimi se meritvami, popravljeni zaradi kršitve P o vr š in a v n et ja ( % ) # 0 50 100 150 200 250 Pregled 4.3.2.1. Skupina kontrolna PVRP slika 5. Prikaz površine žarišča kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti izmerjene otomikro- skopsko. V 95 % interval zaupanja so vključeni v graf. # – statistično značilna razlika med prvim in drugim pregledom v skupini PVRP. PVRP – plazma, bogata s trombociti in zunajceličnimi vezikli (angl. platelet- and extracellular vesicle-rich plasma). ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 84 sferičnosti, niso bile zaznane statistično zna- čilne razlike (popravek z ε = 0,611, F(1,834, 22,010) = 2,079, p = 0,152). spremljanje Pri četrtem pregledu je bilo 82 % (tj. devet bolnikov) iz skupine PVRP in 27 % (tj. trije bolniki) iz kontrolne skupine brez simpto- mov kroničnega pooperativega vnetja tem- poralne kosti; zato je bil za te bolnike izmer- jen čas brez simptomov (slika 6, dopolnilno gradivo). Zbiranje podatkov je bilo preki- njeno 22. februarja 2021 za bolnike, ki so bili ta dan brez simptomov. Mediana trajanja obdobja brez simptomov je znašala 9,2 meseca (95% IZ (7,4; 11,9)) v skupini s PVRP. Glede na Kaplan-Meierjevo analizo je skup- no 49% bolnikov v skupini PVRP ostalo brez simptomov 12,7 meseca po četrtem pre- gledu. Približno 89 % teh bolnikov je osta- lo brez simptomov do 3,9 meseca, 78 % do 5,1 meseca in 65 % do 7,8 meseca (17). neželeni stranski učinki plazme, bogate s trombociti in zunajceličnimi vezikli Neželenih stranskih učinkov, povezanih s PVRP, nismo odkrili. Priprava plazme, bogate s trombociti in zunajceličnimi vezikli Priprava PVRP je v povprečju trajala 80 minut (SD = 26 min). Povprečni volumen PVRP za eno aplikacijo (tj. dve enoti PVRP) je bil 2,1 ml (SD = 0,7 ml), kar je dovolj, da se ušesni trakec vsakič v celoti namoči. Povprečna koncentracija trombocitov in ZV v PVRP je bila 504 × 109/l (SD = 190 × 109/l). Povprečni donos trombocitov in ZV v PVRP (enačba 1) je bil 276 % (SD = 157 %) (17). Vrstična elektronska mikroskopija vzor- cev PVRP je pokazala veliko trombocitov, kot je prikazano na sliki 7. V PVRP nismo zazna- li mirujočih diskom podobnih trombocitov. 85Med Razgl. 2022; 61 Suppl 2: K u m u la ti vn o a si m p to m at sk o s ta n je Cenzurirano Funkcija preživetja 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Asimptomatsko obdobje (meseci) 12 5,10 0,7 5,5 0,2 5,0,0 slika 6. Prikaz trajanja obdobja brez simptomov s Kaplan-Meierjevo krivuljo. Analiza temelji na podatkih deve- tih od enajstih (82 %) bolnikov, zdravljenih s PVRP, ki so bili po četrtem pregledu preskušanja brez simptomov. Kumulativno je 49 % bolnikov iz skupine PVRP ostalo brez simptomov 12,7 meseca po četrtem pregledu. PVRP – plazma, bogata s trombociti in zunajceličnimi vezikli (angl. platelet- and extracellular vesicle-rich plasma). ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 85 Namesto tega smo opazili trombocite razli- čnih velikosti in oblik nekateri so imeli ceva- ste izrastke. Razdrobljeni ali deformirani trombociti, ki so izgubili precejšen del svoje membrane, se štejejo za ZV (slika 7), saj ni ostre meje med trombociti in ZV (16). Analiza sterilnosti protokola za pripra- vo PVRP, pripravljene od osmih prosto- voljcev iz PVRP, je v vseh vzorcih pokazala odsotnost rasti bakterij ali gliv. raZPrava Ta randomizirana kontrolirana klinična raziskava primerja učinkovitost avtologne sterilne PVRP in standardnih konzervativ- nih metod pri zdravljenju kroničnega poope- rativnega vnetja temporalne kosti. Avtologna 86 Zdravljenje terapevtsko odpornega kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti s plazmo, … PVRP ugodno učinkuje, če jo nanesemo dvakrat v mesečnem intervalu prek ušesnega traku glede na rezultate ocene kakovosti življenja, povezane s kroničnim vnetjem srednjega ušesa (slika 4), in meritve povr- šine žarišč vnetja (slika 5). Zdravljenje s PVRP je pomembneje izboljšalo kakovost življenja kot zdravljenje s standardnimi konzervativnimi metodami (slika 4). Poleg tega so se površine žarišč vnetja statistično značilno zmanjšale v šti- rih mesecih v skupini PVRP, ne pa tudi v kontrolni skupini (slika 5). Ta raziskava lahko kaže na dolgoročne učinke zdravlje- nja kroničnega pooperativnega vnetja tem- poralne kosti, ki temelji na PVRP, glede na odsotnost simptomov pri večini bolnikov slika 7. Vrstična elektronska mikroskopija PVRP. Fotografija (A) prikazuje veliko trombocitov in ZV. Bela puščica na fotografiji (A) prikazuje levkocite, bela puščica na fotografiji (B) prikazuje brsteč trombocit, ki tvori cevast izrastek, trikotniki na fotografijah (C, D) prikazujejo ZV. Fotografija (D) prikazuje trombocite in ZV, ki so kroglasti fragmenti velikosti 300–1000 nm, ki nastanejo s tem, da aktivirani trombociti izgu- bijo cevaste izrastke. PVRP – plazma, bogata s trombociti in zunajceličnimi vezikli (angl. platelet- and extra- cellular vesicle-rich plasma), ZV – zunajcelični vezikli. ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 86 več mesecev po zadnjem (tj. četrtem) pre- gledu režima zdravljenja (slika 6). To ustre- za dolgotrajnim učinkom pripravkov, bogatih s trombociti, ki so jih opisali Altamura in sodelavci (19). V tej raziskavi nismo odkrili nobenih neželenih učinkov, povezanih s PVRP, kar je skladno z ugoto- vitvami o nizki stopnji neželenih stranskih učinkov v metaanalizi Wanga in sodelav- cev (20). Zato je uporaba PVRP varna za zdravljenje kroničnega pooperativnega vne- tja temporalne kosti. Dopustni odvzeti volumen krvi (tj. 18ml) in čas, potreben za pripravo PVRP (tj. 80 min ± 26 min), ponujata možnost zdra- vljenja s PVRP na ambulantni ali bolniš- nični osnovi drugih otorinolaringoloških bolezni. Za optimizacijo donosa tromboci- tov in zmanjšanje odvzetega volumna krvi, torej največji izkoristek krvi, bi v prihodnje lahko upoštevali novejše teoretične mate- matične modele raziskovalne skupine, ki temeljijo na hitrosti sedimentacije eritro- citov pri določitvi trajanja centrifugiranja (21). Ti modeli so bili do pred kratkim kli- nično uveljavljeni v raziskavi uporabe PVRP pri zdravljenju osteoradionekroze lateralne lobanjske baze, rekonstrukciji kronične perforacije bobniča in zapori likvorske fistule po transnazalni transse- larni endoskopski resekciji adenoma hipo- fize (22). Ker obstajata heterogenost in samo 10 % ponovljivost protokolov za pripravo PVRP, je bila prepoznana nuja po natančnem opisu PVRP in protokola priprave (23). Temeljito opisan protokol priprave steril- nega PVRP, uporabljen v tej raziskavi, je pri- nesel zmerne koncentracije trombocitov, ki so bile opredeljene za ugodne pri regene- raciji PVRP, kot so preučevali DeLong in sodelavci (23). V nedavni raziskavi uporabe personaliziranega protokola priprave PVRP so navodila za pripravo PVRP za različne indikacije opisana še natančneje (22). Na podlagi rezultatov zdravljenja kro- ničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti in identifikacije ZV v PVRP (slika 7) se domneva, da ZV skupaj s trombociti pozitivno vplivajo na regenerativne last- nosti PVRP (17, 24). Poročali smo že, da imajo ZV, ki izvirajo iz trombocitov, pomem- bno vlogo pri regeneraciji tkiva, hemosta- zi in imunskem odzivu (13). Te vloge bi lahko posredoval dvojni mehanizem: ZV imajo večje razmerje med površino in pro- stornino kot trombociti in zagotavljajo razširjeno katalitično območje za biološko pomembne reakcije. S posredovanjem inte- rakcij med celicami prenašajo ZV signalne molekule za fenotipsko transformacijo in delujejo kot celični mehanizem, da se zne- bijo neželenih sestavin (25). Poleg tega ZV, ki izvirajo iz trombocitov, vsebujejo gla- vne rastne dejavnike iz trombocitov in so še posebej bogati s transformirajočim ras- tnim dejavnikom β (angl. transforming growth factor β, TGF-β), bazičnim fibro- blastnim rastnim dejavnikom (angl. basic fibroblast growth factor, bFGF), trombocitnim rastnim dejavnikom (angl. platelet-derived growth factor, PDGF) in žilnim endotelij- skim rastnim dejavnikom (angl. vascular endothelial growth factor, VEGF) (13). Regenerativne vloge trombocitnih ZV, prid- obljenih iz PVRP, so bile potrjene v nedavni in vitro raziskavi, ki so jo opravili Otahal in sodelavci, v kateri so ugotovili indukcijo hondrogene genske ekspresije v hondroci- tih in preprečevanje sproščanja provne- tnih citokinov (26). Ta raziskava utemelju- je regulativne vloge ZV pri vnetju in presnovi zunajceličnega matriksa hrustanca (26). Zgoraj navedene lastnosti ZV bi lahko pojasnile regenerativno, hemostatsko in imunološko vlogo PVRP pri zdravljenju kroničnega pooperativnega vnetja tempo- ralne kosti. Te vloge bi lahko regulirali z izbiro ustreznega postopka aktivacije PVRP (tj. eksogenega ali endogenega) in uporabo nedavno objavljenega optimiziranega pro- tokola priprave PVRP raziskovalne skupi- ne (21, 22), saj je tvorba ZV odvisna od izlo- čanja trombocitov in vivo ali ex vivo (13). 87Med Razgl. 2022; 61 Suppl 2: ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 87 Med skupinami ni bilo razlik v izhodiš- čnih demografskih, kliničnih značilnostih in rezultatih COMQ-12, kar potrjuje randomi- zacijo. Kolikor nam je znano, ni literature, ki bi poročala o točkovanju COMQ-12 za oceno kakovosti življenja, povezane s kro- ničnim pooperativnim vnetjem temporal- ne kosti. Poleg tega je povprečna ocena COMQ-12 bolnikov s to boleznijo (Mdn=34) podobna rezultatu neholesteatomskega kroničnega vnetja srednjega ušesa (M=33), kot so poročali Demir in sodelavci (6). Zato ta raziskava potrjuje pomembno socialno- ekonomsko in zdravstveno breme kroni- čnega pooperativnega vnetja temporalne kosti (predvsem kronično vnetje radikal- ne mastoidne votline), ki je primerljivo s kroničnim vnetjem srednjega ušesa (3). To breme, skupaj z dolgotrajno zaveza- nostjo otorinolaringologa bolniku in izčrpa- nostjo standardnih konzervativnih metod zdravljenja, potrjuje mediani čas do zdra- vljenja (tj. 8,1 leta) v naši raziskavi in o tem so že poročali Dornhoffer in sodelavci (4). Analiza opravljenih posegov pri naših bol- nikih je potrdila izčrpanost kirurških metod zdravljenja. Bolj radikalni kirurški posegi (tj. subtotalna petrozektomija) bi povzročili izgubo uporabnega sluha in ne bi nujno ozdravili kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti (27). Poleg tega sta odsto- tek radikalne mastoidektomije, opravljene za zdravljenje holesteatoma (92 %), in prev- lada moških bolnikov (82 %) skladna z razi- skavo Khalila in Windle-Taylorja (3). Rezultati dejavnikov tveganja za bolnika (tj. komorbidnosti, redno uživanje zdravil, škodljive navade) so edinstveni, saj teh podatkov, kolikor nam je znano, za zdaj ni. Vendar pa glede na analizo dejavnikov tve- ganja ni očitne predispozicije za kronično pooperativno vnetje temporalne kosti. Dva bolnika s koagulopatijami (tj. redno uživa- nje acetilsalicilne kisline) sta bila učinko- vito zdravljena s PVRP. To lahko dopolnjuje rezultate raziskave Smitha in sod., ki poro- ča, da acetilsalicilna kislina ne zmanjša sproščanja PDGF, ki ima bistveno regene- rativno vlogo PVRP (28). Zaradi neslepe dodelitve zdravljenja bi lahko izid zdravljenja, izmerjen s COMQ-12, predstavljal pristranskost v raziskavi. Vendar pa je to primarno merilo izida zdravljenja, specifično za bolezen, o katerem poroča- jo bolniki in ne zdravnik, verjetno najpri- mernejše orodje za oceno kakovosti življe- nja. Kolikor nam je znano, COMQ-12 še ni bil uporabljen za merjenje izida zdravlje- nja kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti. Poleg tega smo, kolikor nam je znano, prvi poročali o uporabi PVRP pri zdravljenju te bolezni. Poleg tega naša raziskava temelji na razmeroma majh- nem vzorcu, zbranem v eni sami ustano- vi. Kronično pooperativno vnetje tempo- ralne kosti je redko, saj prizadene približno 1,5 % bolnikov z radikalno mastoidno vot- lino (2) ali 0,8 % po operaciji holesteato- ma (29). Poleg tega je tveganje razvoja terapevtsko odporne oblike tega vnetja še manjše. Potrebne bi bile multicentrične raziskave, da bi premagali omejitev majh- nosti vzorca. Avtologna PVRP pomeni novo dodatno in uspešno zdravljenje kroničnega vnetja radikalne mastoidne votline, kadar so izčrpane kirurške in standardne konzerva- tivne metode zdravljenja. Ta bolezen je vrsta kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti in je podobna kroničnemu vnetju srednjega ušesa brez holesteatoma po svojem vplivu na kakovost življenja, povezano z zdravjem, v skladu s COMQ-12. Ta raziskava prispeva k nadaljnjemu raziskovanju uporabe PVRP za zdravljenje naglušnosti, paralize obraznega živca in regereracije živcev, za zdravljenje disfoni- je, disfagije, anozmije, kritje mehkotkivnih vrzeli, pri laringotrahealni rekonstrukciji ali rekonstrukciji lobanjske baze (30–41). Poleg tega se lahko sterilna PVRP aplicira na ste- rilna področja človeškega telesa. Ker se domneva, da trombociti in ZV posredujejo glavne funkcije PVRP, bi lahko izolate ZV 88 Zdravljenje terapevtsko odpornega kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti s plazmo, … ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 88 iz PVRP ali različnih telesnih tekočin v pri- hodnosti uporabljali za zdravljenje in dia- gnostiko različnih bolezni v otorinolarin- gologiji (13). ZaHvale Sodelavcem in osebju Klinike za otorino- laringologijo in cervikofacialno kirurgijo Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana ter Laboratorijev za klinično biofiziko Medi- cinske fakultete in Zdravstvene fakultete Univerze v Ljubljani. Zahvaljujemo se vsem prostovoljcem za darovanje krvi. navZkriŽja interesov Ni navzkrižij interesov. FinanCiranje To raziskavo sta podprli Evropska komi- sija (Ves4us) in Agencija za raziskovanje Republike Slovenije (P3-0388, J3-3066, L3-2621, J2-8166 in J2-8169). soglasje koMisije Za MeDiCinsko etiko Komisija za medicinsko etiko Republike Slovenije je odobrila raziskavo (št. 0120146/ 2019/5) 89Med Razgl. 2022; 61 Suppl 2: literatUra 1. Gluth MB, Tan BYB, Santa Maria PL, et al. Unique microbiology of chronically unstable canal wall down tym- panomastoid cavities: Considerations for surgical revision. J Laryngol Otol. 2013;127 (5): 458–62. 2. Pareschi R, Lepera D, Nucci R. Canal wall down approach for tympano-mastoid cholesteatoma: Long-term results and prognostic factors. Acta Otorhinolaryngol Ital. 2019; 39 (2): 122–9. 3. Khalil HS, Windle-Taylor PC. Canal wall down mastoidectomy: A long term commitmentto the outpatients? BMC Ear Nose Throat Disord. 2003; 3 (1): 1. 4. Dornhoffer JL, Smith J, Richter G, et al. Impact on Quality of Life After Mastoid Obliteration. Laryngoscope. 2008; 118 (8): 1427–32. 5. Phillips JS, Haggard M, Yung M. A new health-related quality of life measure for active chronic otitis media (COMQ-12): Development and initial validation. Otol Neurotol. 2014; 35 (3): 454–8. 6. Demir B, Sahin A, Binnetoglu A, et al. The utilization of chronic Otitis Media Questionnaire-12 in chronic otitis media with or without cholesteatoma. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2020; 277 (11): 3037–43. 7. Henatsch D, Wesseling F, Briedé JJ, et al. Treatment of chronically infected open mastoid cavities with medical honey: A randomized controlled trial. Otol Neurotol. 2015; 36 (5): 782–7. 8. Askar SM, Saber IM, Omar M. Mastoid reconstruction with platelet-rich plasma and bone pate after canal wall down mastoidectomy: A preliminary report. Ear Nose Throat J. 2019; 100 (7): 485-489 9. Khafagy YW, Abd Elfattah AM, Moneir W, et al. Leukocyte- and platelet-rich fibrin: A new graft material in endoscopic repair of spontaneous CSF leaks. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2018; 275 (9): 2245–52. 10. Tutar B, Ekincioglu E, Karaketir S, et al. The impact of platelet-rich fibrin (PRF) on olfactory function and pain after septoplasty operations. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2020; 277 (4): 1115–20. 11. Gökçe Kütük S, Özdaş T. The impact of platelet-rich plasma therapy on short-term postoperative outcomes of pediatric tonsillectomy patients. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2019; 276 (2): 489–95. 12. Eid AM, Ebada HA, El-Fattah AMA, et al. Platelet-rich fibrin: An autologous biomaterialfor healing assistance of pharyngeal repair in total laryngectomy. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2021. 278: 463–70. ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 89 13. Vozel D,Božič D,Jeran M, et al.Treatment with platelet- andextracellular vesicle-richplasma inotorhinolaryn- gology. A review and future perspectives. In: Advances in biomembranes and lipid self-assembly [internet]. Academic Press.2020[citirano 2022 Jan 15].Dosegljivona:http://www.sciencedirect.com/science/article/ pii/S2451963420300224 14. Sluga M, Battelino S, Vozel D. Prospects of extracellular vesicles in otorhinolaryngology, head and neck surgery. J Nanotheranostics. 2021; 2 (4): 208–23. 15. Šuštar V, Bedina-Zavec A, Štukelj R, et al. Nanoparticles isolated from blood: A reflection of vesiculability of blood cells during the isolation process. Int J Nanomedicine. 2011; 6: 2737–48. 16. Tao SC, Guo SC, Zhang CQ. Platelet-derived extracellular vesicles: An emerging therapeutic approach. Int J Biol Sci. Jul 2017; 13 (7): 828–34. 17. Vozel D, Božič D, Jeran M, et al. Autologous platelet- and extracellular vesicle-rich plasma is an effective treat- ment modality for chronic postoperative temporal bone cavity inflammation: Randomized controlled clini- caltrial. Front Bioeng Biotechnol. 2021; 7: 677541. 18. Vozel D, Steiner N, Božanić Urbančič N, et al. Slovenian cross-cultural adaptation and validation of health related quality of life measures for chronic otitis media (COMQ-12), vertigo (DHI, NVI) and tinnitus (THI). Zdr Varst. 2020; 59 (3): 120–7. 19. Altamura SA, Di Martino A, Andriolo L, et al. Platelet-rich plasma for sport-active patients with knee osteoarthritis: Limited return to sport. Biomed Res Int. 2020; 2020: 8243865. 20. Wang C, Xu M, Guo W, et al. Clinical efficacy and safety of platelet-rich plasma in arthroscopic full-thickness rotator cuff repair: A meta-analysis. PLOS ONE. 2019; 14 (7): e0220392. 21. Božič D, Vozel D, Hočevar M, et al. Enrichment of plasma in platelets and extracellular vesicles by the coun- terflow to erythrocyte settling. Platelets. 2022; 33 (4): 592–602. 22. Steiner N, Vozel D, Urbančič J, et al. Clinical implementation of platelet- and extracellular vesicle-rich product preparation protocols. Tissue Eng Part A. 2022; 10: 1089. 23. DeLong JM, Russell RP, Mazzocca AD. Platelet-rich plasma: The paw classification system. Arthroscopy. 2012; 28 (7): 998–1009. 24. Guo SC, Tao SC, Yin WJ, et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma promote the re-epithelization of chronic cutaneous wounds via activation of YAP in a diabetic rat model. Theranostics. 2017; 7 (1): 81–96. 25. Ogorevc E, Hudoklin S, Veranič P, et al. Extracellular vesicle-mediated transfer of membranous components from the highly malignant T24 urinary carcinoma cell line to the non-malignant RT4 urinary papilloma cell line. Protoplasma. 2014; 251 (3): 699–702. 26. Otahal A, Kramer K, Kuten-Pella O, et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Front Bioeng Biotechnol. 2020; 8: 1114. 27. Yung M. The use of temporoparietal fascial flap to eliminate wound breakdown in subtotal petrosectomy for chronic discharging ears. Otol Neurotol. 2016; 37 (3): 248–51. 28. Smith CW, Binford RS, Holt DW, et al. Quality assessment of platelet rich plasma during anti-platelet therapy. Perfusion. 2007; 22 (1): 41–50. 29. Wilkie MD, Chudek D, Webb CJ, et al. Canal wall down mastoidectomy with obliteration versus canal wall up mastoidectomy in primary cholesteatoma surgery. J Laryngol Otol. 2019; 133 (12): 1074–8. 30. Stolle M, Schulze J, Roemer A, et al.Humanplasma richingrowthfactors improves survival andneurite outgrowth of spiral ganglion neurons in vitro. Tissue Eng Part A. 2018; 24 (5–6): 493–501. 31. Sánchez M, Garate A, Bilbao AM, et al. Platelet-rich plasma for injured peripheral nerves: Biological repair process and clinical application guidelines. In: AmbrosiPB, ed. Demystifying polyneuropathy –Recent advances and new directions [Internet]. London: IntechOpen; 2018 [cited 2022 Jul 30]. Dosegljivo na: https://www.inte-chopen.com/ chapters/63566 32. Wang S, Liu X, Wang Y. Evaluation of platelet-rich plasma therapy for peripheral nerve regeneration: A critical review of literature. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2022: 1; 10:808248 33. Cobden SB, Oztürk K, Duman S, et al. Treatment of acute vocal fold injury with platelet-rich plasma. J Voice. 2016; 30 (6): 731–5. 34. Özgürsoy SK, Tunçkaşık F, Tunçkaşık ME, et al. Histopathologic evaluation of hyaluronic acid and plasma-rich platelet injection into rabbit vocal cords: An experimental study. Turk Arch Otorhinolar. 2018; 56 (1): 30–5. 35. Vidovic A, Delling U. Aryepiglottic fold augmentation as treatmentfor late-onset dysphagia following surgical treatment of recurrent laryngeal neuropathy. Tierarztl Prax Ausg G Grosstiere Nutztiere. 2017; 45 (4): 219–25. 90 Zdravljenje terapevtsko odpornega kroničnega pooperativnega vnetja temporalne kosti s plazmo, … ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 90 36. Yasak AG, Yigit O, Araz Server E, et al. The effectiveness of platelet-rich plasma in an anosmia-induced mice model. Laryngoscope. 2018; 128 (5): 157–62. 37. EryılmazA,Demirci B, Gunel C, et al. Can tissue adhesives and platelet-rich plasma prevent pharyngocutaneous fistula formation? Auris Nasus Larynx. 2016; 43 (1): 62–7. 38. Tambella AM, Attili AR, Dupré G, et al. Platelet-rich plasma to treat experimentally-induced skin wounds in animals: A systematic review and meta-analysis. Plos one. 2018; 13 (1): e0191093. 39. Sahin Onder S, Sahin Yilmaz A, Erkmen B, et al. Platelet-rich plasma for laryngotracheal reconstruction: An experimental study. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2020; 277 (11): 3103–9. 40. Vozel D, Battelino S. Preparation of platelet- and extracellular vesicle-rich gel and its role in the management of cerebrospinal fluid leak in anterior and lateral skull-base surgery [internet]. In: Kralj-Iglič V, eds. Sokratska predavanja. Zbornik recenziranih prispevkov; 2020 [citirano 2022 Jun 1] Dosegljivo na: http://www2.zf.unilj.si/ images/stories/datoteke/Zalozba/Sokratska_2019.pdf 41. Rasmussen J, Ruggeri C, Ciraolo C, et al. Application of fibrin rich in leukocytes and platelets in the recon- struction of endoscopic approaches to the skull base. World Neurosurgery. 2018; 118: 32–41. 91Med Razgl. 2022; 61 Suppl 2: ORL 2022_Mr10_2.qxd 2.9.2022 12:59 Page 91