Interdisciplinarni doktorski študijski program Biomedicina UDK 636.8.09:616.61:616–036;577.161.3:615.03(043.3) Martina Krofič Žel, dr. vet. med. VPLIV VITAMINA E NA OKSIDATIVNI STRES IN POTEK KRONIČNE LEDVIČNE ODPOVEDI PRI MAČKAH Doktorska disertacija THE INFLUENCE OF VITAMIN E ON OXIDATIVE STRESS AND THE COURSE OF FELINE CHRONIC KIDNEY DISEASE Doctoral dissertation Ljubljana, 2015 Martina Krofič Žel Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah Delo je bilo opravljeno na Kliniki za kirurgijo in male živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani, na Inštitutu za higieno in patologijo prehrane živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani, na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani, na Oddelku za genetsko toksikologijo in biologijo raka Nacionalnega inštituta za biologijo ter na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo na Univerzitetnem kliničnem centru v Ljubljani. Javni zagovor je bil opravljen: Mentorica: izr. prof. dr. Alenka Nemec Svete Somentorica: prof. dr. Nataša Tozon Izjava o delu: Izjavljam, da je doktorska disertacija rezultat lastnega raziskovalnega dela, da so rezultati korektno navedeni in nisem kršila avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih. Izjavljam, da je elektronski izvod identičen tiskanemu. Člani strokovne komisije za oceno in zagovor: Predsednica: doc. dr. Alenka Seliškar Član: prof. dr. Janez Salobir Član: prof. dr. Robert Frangež Član: doc. dr. Bojan Knap 4 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija VPLIV VITAMINA E NA OKSIDATIVNI STRES IN POTEK KRONIČNE LEDVIČNE ODPOVEDI PRI MAČKAH Izvleček Ključne besede: Ledvične bolezni – terapija z zdravili; kronične bolezni; oksidativni stres – učinki zdravil; vitamin E – farmakologija – kri – terapevtska raba; antioksidanti – metabolizem; malondialdehid – kri; proteinski karbonili – kri; glutationska peroksidaza – kri; mačke Namen raziskave je bil preučiti oksidativni stres pri mačkah s kronično ledvično odpovedjo. Oksidativni stres smo ovrednotili s stališča poškodb nekaterih bioloških molekul in antioksidantnega statusa. Ugotoviti smo želeli, ali dodatek vitamina E pri zdravljenju izboljša klinično stanje in upočasni napredovanje bolezni. V preliminarni raziskavi smo pri 28 mačkah s kronično ledvično odpovedjo in 30 zdravih mačkah z enkratnim odvzemom krvi določili celokupno antioksidantno kapaciteto, aktivnost superoksidne dismutaze, plazemske in eritrocitne glutation peroksidaze ter koncentracijo selena v serumu. V klinično raziskavo smo vključili 34 mačk s kronično ledvično odpovedjo in 38 zdravih mačk. Zdravim mačkam smo določili koncentracijo malondialdehida in proteinskih karbonilov v plazmi, stopnjo poškodbe jedrne DNA limfocitov, aktivnost plazemske glutation peroksidaze in koncentracijo vitamina E v plazmi. Mačke s kronično ledvično odpovedjo smo zdravili v skladu s smernicami mednarodnega združenja za bolezni ledvic in jim dodajali vitamin E oziroma placebo. Povečane stopnje lipidne peroksidacije, oksidativnih poškodb beljakovin in DNA pri mačkah s kronično ledvično odpovedjo nismo dokazali; antioksidantni mehanizmi niso iztrošeni. Dodajanje vitamina E ni značilno zmanjšalo oksidativnih poškodb bioloških molekul, ni podaljšalo časa preživetja in ni zmanjšalo stopnje izraženosti kliničnih znakov. 5 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija THE INFLUENCE OF VITAMIN E ON OXIDATIVE STRESS AND THE COURSE OF FELINE CHRONIC KIDNEY DISEASE Abstract Key words: Kidney diseases – drug therapy; chronic diseases; oxidative stress – drug effects; vitamin E – pharmacology – blood – therapeutic use; antioxidants – metabolism; malondialdehyde – blood; protein carbonyl – blood; glutathione peroxidase – blood; cats The purpose of this study was to investigate oxidative stress and antioxidant status in cats with chronic kidney disease and to evaluate whether vitamin E supplementation had a beneficial effect on the course of the disease. In the preliminary study, 28 cats with chronic kidney disease and 30 healthy controls were included. Total antioxidant capacity, superoxide dismutase, plasma and erythrocyte glutathion peroxidase activity and serum selenium concentration were measured. In the clinical study, 34 cats with chronic kidney disease and 38 healthy controls were included. Plasma malondialdehyde, protein carbonyl concentration, DNA damage of peripheral lymphocytes, plasma glutathion peroxidase activity, and plasma vitamin E concentration were measured. Cats with chronic kidney disease were treated according to International Renal Interest Society guidelines. They were receiving vitamin E or a placebo in addition to standard therapy. Parameters of oxidative stress and antioxidant status were measured at the initiation of the therapy and 4, 8, 16, and 24 weeks thereafter. The results did not confirm a greater degree of lipid peroxidation or oxidative damage to proteins or DNA in cats with chronic kidney disease. The antioxidant mechanisms might not be exhausted in cats with chronic kidney disease. Vitamin E supplementation did not significantly reduce oxidative damage of biological molecules and did not affect the survival rate or reduce the severity of clinical signs. 6 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Kazalo vsebine 1 UVOD ................................................................................................................... 19 1.1 NAMEN RAZISKAVE ..................................................................................... 21 1.2 HIPOTEZE ......................................................................................................... 21 2 PREGLED LITERATURE ................................................................................ 22 2.1 KRONIČNA LEDVIČNA ODPOVED PRI MAČKAH ................................... 22 2.1.1 Podstopnje bolezni ........................................................................................ 23 2.2 VLOGA REAKTIVNIH KISIKOVIH ZVRSTI PRI KRONIČNI LEDVIČNI ODPOVEDI.............................................................................................................. 24 2.3 POŠKODBE BIOLOŠKIH MOLEKUL ........................................................... 27 2.3.1 Lipidna peroksidacija in malondialdehid ................................................... 27 2.3.2 Oksidativne poškodbe beljakovin ................................................................ 29 2.3.3 Oksidativne poškodbe DNA ......................................................................... 29 2.4 ANTIOKSIDANTNI SISTEM V LEDVICAH ................................................. 30 2.4.1 Glutation peroksidaza ................................................................................... 31 2.4.2 Superoksidna dismutaza ............................................................................... 33 2.4.3 Celokupna antioksidantna kapaciteta ......................................................... 34 2.4.4 Vitamin E ....................................................................................................... 35 2.5 OKSIDATIVNI STRES PRI KRONIČNI LEDVIČNI ODPOVEDI ............... 36 3 MATERIALI IN METODE ............................................................................... 38 3.1 PRELIMINARNA RAZISKAVA ..................................................................... 38 3.2 KLINIČNA RAZISKAVA ................................................................................ 40 3.2.1 Merjenje arterijskega tlaka .......................................................................... 45 3.3 ODVZEM IN PRIPRAVA VZORCEV KRVI .................................................. 45 3.4 ANALIZNE METODE ...................................................................................... 47 7 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3.4.1 Hematološke in biokemijske preiskave ....................................................... 47 3.4.2 Encimsko imunske preiskave ....................................................................... 47 3.4.3 Antioksidantni parametri ............................................................................. 47 3.4.3.1 Superoksidna dismutaza ............................................................................... 48 3.4.3.2 Plazemska in eritrocitna glutation peroksidaza ............................................ 48 3.4.3.3 Celokupna antioksidantna kapaciteta ........................................................... 49 3.4.4 Vitamin E ....................................................................................................... 49 3.4.5 Koncentracija selena v serumu .................................................................... 49 3.4.6 Pokazatelji oksidativnega stresa .................................................................. 50 3.4.6.1 Malondialdehid............................................................................................. 50 3.4.6.2 Proteinski karbonili ...................................................................................... 50 3.4.6.3 Alkalni kometni test ..................................................................................... 50 3.4.6.3.1 Priprava pufrov .......................................................................................... 51 3.4.6.3.2 Priprava preparatov ................................................................................... 51 3.4.6.3.3 Odvijanje DNA in elektroforeza ............................................................... 52 3.4.6.3.4 Nevtralizacija preparatov .......................................................................... 52 3.4.6.3.5 Ovrednotenje poškodb DNA ..................................................................... 52 3.4.7 Preiskave urina .............................................................................................. 52 3.5 STATISTIČNA ANALIZA ............................................................................... 53 4 REZULTATI ....................................................................................................... 55 4.1 PRELIMINARNA RAZISKAVA ..................................................................... 55 4.2 KLINIČNA RAZISKAVA ................................................................................ 57 4.2.1 Parametri oksidativnega stresa in antioksidantnega statusa .................... 57 4.2.1.1 Malondialdehid............................................................................................. 57 4.2.1.2 Proteinski karbonili ...................................................................................... 62 4.2.1.3 Aktivnost plazemske glutation peroksidaze ................................................. 65 8 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 4.2.1.4 Poškodbe DNA ............................................................................................. 66 4.2.1.5 Vitamin E ..................................................................................................... 70 4.2.2 Klinični parametri ......................................................................................... 75 4.2.2.1 Ocena izraženosti kliničnih znakov ............................................................. 75 4.2.2.2 Koncentracija kreatinina v serumu, specifična gostota urina in razmerje med beljakovinami in kreatininom v urinu ...................................................................... 81 4.2.2.3 Preživetje ...................................................................................................... 87 5 RAZPRAVA ........................................................................................................ 89 5.1 OKSIDATIVNI STRES IN ANTIOKSIDANTNI STATUS ............................ 90 5.1.1 Malondialdehid .............................................................................................. 90 5.1.2 Proteinski karbonili ...................................................................................... 91 5.1.3 Poškodbe DNA ............................................................................................... 92 5.1.4 Superoksidna dismutaza ............................................................................... 92 5.1.5 Eritrocitna glutation peroksidaza ................................................................ 93 5.1.6 Plazemska glutation peroksidaza in selen ................................................... 93 5.1.7 Celokupna antioksidantna kapaciteta ......................................................... 95 5.2 DODAJANJE VITAMINA E ............................................................................ 95 5.2.1 Izbrani klinični in laboratorijski parametri ter preživetje ....................... 95 5.2.2 Oksidativni stres in antioksidantni status ................................................... 97 6 ZAKLJUČKI ..................................................................................................... 101 7 POVZETEK ....................................................................................................... 102 8 SUMMARY ........................................................................................................ 104 9 ZAHVALE ......................................................................................................... 107 10 LITERATURA ................................................................................................ 108 11 PRILOGE ........................................................................................................ 116 11.1 VPRAŠALNIK ............................................................................................... 116 9 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 11.2 PRIPOMOČEK ZA OCENO IZRAŽENOSTI KLINIČNIH ZNAKOV ...... 117 11.3 IZBRANI HEMATOLOŠKI IN BIOKEMIJSKI PARAMETRI PRI MAČKAH S CKD, KI SO BILE VKLJUČENE V RAZISKAVO ....................... 118 11.4 ČLANEK (Krofič Žel in sod., 2014)...........................................……….......126 10 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Kazalo tabel Tabela 1: Starost in telesna masa (povprečje ± SD) mačk, vključenih v preliminarno raziskavo Table 1: Age nad body weight (mean ± SD) in cats included in the preliminary study 39 Tabela 2: Starost in telesna masa (povprečje ± SD) mačk, vključenih v klinično raziskavo Table 2: Age nad body weight (mean ± SD) in cats included in the clinical study 40 Tabela 3: Število mačk s CKD glede na stopnjo po IRIS, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo Table 3: Number of cats with CKD according to the stage of the disease in vitamin E and placebo group 44 Tabela 4: Število mačk s CKD pri posameznem odvzemu vzorcev Table 4: Number of cats with CKD at different sampling times 44 Tabela 5: Število mačk s CKD, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo pri posameznem odvzemu vzorcev Table 5: Number of cats with CKD in vitamin E and placebo group at different sampling times 44 Tabela 6: Koncentracija selena v serumu, aktivnost plazemske in eritrocitne GPX ter plazemska TAC pri mačkah s CKD in kontrolni skupini v preliminarni raziskavi Table 6: Serum selenium concentration, plasma and erythrocyte GPX activity and plasma TAC in cats with CKD and in the control group in the preliminary study 56 Tabela 7: Parametri oksidativnega stresa in antioksidantnega statusa (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS I Table 7: Parameters of oxidative stress and antioxidant status (mean ± SD) in cats with CKD IRIS I 60 Tabela 8: Parametri oksidativnega stresa in antioksidantnega statusa (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS II Table 8: Parameters of oxidative stress and antioxidant status (mean ± SD) in cats with CKD IRIS II 61 Tabela 9: Parametri oksidativnega stresa in antioksidantnega statusa (povprečje ± SD; vrednost pri n = 1) pri mačkah s CKD IRIS III in IV Table 9: Parameters of oxidative stress and antioxidant status (mean ± SD; value if n = 1) in cats with CKD IRIS III and IV 62 Tabela 10: Stopnja izraženosti kliničnih znakov na začetku raziskave Table 10: Severity of clinical signs at the beginning of the study 75 Tabela 11: Stopnja izraženosti kliničnih znakov med klinično raziskavo pri mačkah s CKD IRIS I Table 11: Severity of clinical signs during clinical study in cats with CKD IRIS I 77 Tabela 12: Stopnja izraženosti kliničnih znakov med klinično raziskavo pri mačkah s CKD 78 11 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija IRIS II Table 12: Severity of clinical signs during clinical study in cats with CKD IRIS II Tabela 13: Stopnja izraženosti kliničnih znakov med klinično raziskavo pri mačkah s CKD IRIS III in IV Table 13: Severity of clinical signs during clinical study in cats with CKD IRIS III and IV 79 Tabela 14: Koncentracija kreatinina v serumu, specifična gostota urina, UPC in sistolični arterijski tlak (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS I Table 14: Serum creatinine concentration, urine specific gravity, UPC, and arterial blood pressure (mean ± SD) in cats with CKD IRIS I 82 Tabela 15: Koncentracija kreatinina v serumu, specifična gostota urina, UPC in sistolični arterijski tlak (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS II Table 15: Serum creatinine concentration, urine specific gravity, UPC, and arterial blood pressure (mean ± SD) in cats with CKD IRIS II 83 Tabela 16: Koncentracija kreatinina v serumu, specifična gostota urina, UPC in sistolični arterijski tlak (povprečje ± SD; vrednost pri n = 1) pri mačkah s CKD IRIS III in IV Table 16: Serum creatinine concentration, urine specific gravity, UPC, and arterial blood pressure (mean ± SD; value if n = 1) in cats with CKD IRIS III and IV 84 Tabela 17: Ključ za oceno izraženosti kliničnih znakov Table 17: Key for severity of clinical signs assessment 117 Tabela 18: Izbrani hematološki parametri pri mačkah s CKD (povprečje ± SD) na začetku raziskave Table 18: Selected hematological parameters in cats with CKD (mean ± SD) at the beginning of the study 118 Tabela 19: Izbrani biokemijski parametri (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD na začetku raziskave Table 19: Selected biochemical parameters (mean ± SD) in cats with CKD at the beginning of the study 119 Tabela 20: Izbrani hematološki parametri (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS I Table 20: Selected hematological parameters (mean ± SD) in cats with CKD IRIS I 120 Tabela 21: Izbrani hematološki parametri (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS II Table 21: Selected hematological parameters (mean ± SD) in cats with CKD IRIS II 121 Tabela 22: Izbrani hematološki parametri (povprečje ± SD; vrednost pri n = 1) pri mačkah s CKD IRIS III in IV Table 22: Selected hematological parameters (mean ± SD; value if n = 1) in cats with CKD IRIS III and IV 122 Tabela 23: Izbrani biokemijski parametri (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS I Table 23: Selected biochemical parameters (mean ± SD) in cats with CKD IRIS I 123 Tabela 24: Izbrani biokemijski parametri (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS II 124 12 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Table 24: Selected biochemical parameters (mean ± SD) in cats with CKD IRIS II Tabela 25: Izbrani biokemijski parametri (povprečje ± SD; vrednost pri n = 1) pri mačkah s CKD IRIS III in IV Table 25: Selected biochemical parameters (mean ± SD; value if n = 1) in cats with CKD IRIS III and IV 125 13 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Kazalo slik Slika 1: Starost mačk, vključenih v raziskavo Figure 1: Age of cats included in the study 41 Slika 2: Koncentracija MDA (µmol/L) pri mačkah s CKD in kontrolni skupini na začetku raziskave Figure 2: MDA (µmol/L) concentration in cats with CKD and in the control group at the beginning of the study 57 Slika 3: Koncentracija MDA (µmol/L) pri mačkah, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo na začetku raziskave Figure 3: MDA concentration (µmol/L) in the vitamin E and placebo group at the beginning of the study 58 Slika 4: Koncentracija MDA (µmol/L) pri mačkah s CKD glede na stopnjo bolezni na začetku raziskave Figure 4: MDA (µmol/L) concentration in cats with CKD according to the stage of the disease at the beginning of the study 59 Slika 5: Koncentracija MDA (µmol/L) pri mačkah s CKD glede na stopnjo bolezni na začetku raziskave (združeni IRIS I in II v primerjavi z III in IV skupino) Figure 5: MDA (µmol/L) concentration in cats with CKD according to the stage of the disease at the beginning of the study (IRIS I and II together in comparison to III and IV) 59 Slika 6: Koncentracija proteinskih karbonilov (nmol/mL) pri mačkah s CKD in kontrolni skupini na začetku raziskave Figure 6: Protein carbonyl concentration (nmol/mL) in cats with CKD and in the control group at the beginning of the study 63 Slika 7: Koncentracija proteinskih karbonilov (nmol/mL) pri mačkah, ki so prejemale placebo oziroma vitamin E na začetku raziskave Figure 7: Protein carbonyl concentration (nmol/mL) in the placebo and vitamin E group at the beginning of the study 63 Slika 8: Koncentracija proteinskih karbonilov (nmol/mL)pri mačkah s CKD glede na stopnjo bolezni na začetku raziskave Figure 8: Protein carbonyl concentration (nmol/mL) in cats with CKD according to the stage of the disease at the beginning of the study 64 Slika 9: Aktivnost plazemske GPX (U/mL) pri mačkah s CKD glede na stopnjo bolezni na začetku raziskave Figure 9: Plasma GPX activity (U/mL) in cats with CKD according to the stage of the disease at the beginning of the study 65 Slika 10: Odstotek DNA v repu kometov pri mačkah s CKD in kontrolni skupini na začetku raziskave Figure 10: Percentage of DNA in tail in cats with CKD and in the control group at the 67 14 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija beginning of the study Slika 11: Odstotek DNA v repu kometov pri mačkah, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo na začetku raziskave Figure 11: Percentage of DNA in tail in cats in the vitamin E and placebo group at the beginning of the study 67 Slika 12: Odstotek DNA v repu pri mačkah s CKD, ki so dobivale vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo bolezni na začetku raziskave Figure 12: Percentage of DNA in tail in cats with CKD in the vitamin E and placebo group according to the stage of the disease at the beginning of the study 68 Slika 13: Odstotek DNA v repu kometov izoliranih limfocitov pri skupini, ki je prejemala vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo CKD in zaporedni odvzem vzorcev Figure 13: Percentage of DNA in comet tail of isolated lymphocytes at different sampling times in vitamin E and placebo group in cats with CKD according to the stage of the disease 69 Slika 14: Koncentracija vitamina E v plazmi (μmol/L) pri skupini, ki je prejemala vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo CKD in zaporedni odvzem vzorcev Figure 14: Plasma vitamin E concentration (μmol/L) at different sampling times in vitamin E and placebo group in cats with CKD according to the stage of the disease 71 Slika 15: Koncentracija vitamina E v plazmi (μmol/L) pri kontrolni skupini in skupini, ki je prejemala vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo CKD in zaporedni odvzem vzorcev Figure 15: Plasma vitamin E concentration (μmol/L) at different sampling times in the control group, vitamin E and placebo group in cats with CKD according to the stage of the disease 72 Slika 16: Standardizirana koncentracija vitamina E (Vit.E(LS); brez enote) pri skupini, ki je prejemala vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo CKD in zaporedni odvzem vzorcev Figure 16: Standardized plasma vitamin E concentration (unitless) in successive measurements in vitamin E and placebo group according to the stage of the disease 73 Slika 17: Standardizirana koncentracija vitamina E (Vit.E(LS); brez enote) pri skupini, ki je prejemala vitamin E oziroma placebo glede na zaporedni odvzem vzorcev Figure 17: Standardized plasma vitamin E concentration (unitless) in successive measurements in vitamin E and placebo group 74 Slika 18: Seštevek kliničnih znakov pri skupini, ki je prejemala vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo CKD in zaporedni odvzem vzorcev Figure 18: Score of clinical signs severity assessment at different sampling times in vitamin E and placebo group in cats with CKD according to the stage of the disease 80 Slika 19: Preživetje mačk s CKD glede na stopnjo bolezni Figure 19: Survival of cats with CKD according to the stage of the disease 87 15 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Slika 20: Preživetje mačk s CKD, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo bolezni Figure 20: Survival of cats with CKD in the vitamin E and placebo group according to the stage of the disease 88 16 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Seznam okrajšav ABTS*+ 2,2'-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat) – radikal ACE angiotenzin konvertaza; angl. Angiotensin Converting Enzyme ACE 2 angiotenzin konvertaza 2; angl. Angiotensin Converting Enzyme 2 AOPP produkti beljakovin, nastali z napredovalo oksidacijo; angl. Advanced Oxidation Protein Products CAT katalaza CKD kronična ledvična odpoved; angl. Chronic Kidney Disease DNA deoksiribonukleinska kislina 2,4-DNPH 2,4-dinitrofenilhidrazin EDTA etilendiaminotetraocetna kislina ET transfer elektrona; angl. Electron Transfer ETAAS elektrotermalna atomska absorpcijska spektrometrija; Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry FeLV virus mačje levkemije; angl. Feline Leukemia Virus FIV virus mačje imunske pomanjkljivosti; angl. Feline Immunodeficiency Virus FRAP železoreducirajoč antioksidantni potencial; angl. Ferric Ion Reducing Antioxidant Power GPX glutation peroksidaza; angl. Glutathione Peroxidase HAT transfer vodikovega atoma; angl. Hydrogen Atom Transfer HCl klorovodikova kislina 17 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija HClO hipoklorna kislina HDO visoko natančna oscilometrična naprava; angl. High Definition Oscillometry Hgb hemoglobin HNE 4-hidroksinonenal HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti; angl. High Performance Liquid Chromatography H2O2 vodikov peroksid IE internacionalne enote I.N.T 2-(4-jodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-feniltetrazolijev klorid IRIS mednarodno združenje za bolezni ledvic; angl. International Renal Interest Society MDA malondialdehid; angl. Malondialdehyde NaCl natrijev klorid NaOH natrijev hidroksid • O - 2 superoksidni radikal •OH hidroksilni radikal 8-OHdA 8-hidroksi-2-deoksiadenozin 8-OHdG 8-hidroksi-2-deoksigvanozin 8-oksoG 7,8-dihidro-8-oksogvanin ONOO- peroksinitrit ORAC kapaciteta absorbance kisikovega radikala; angl. Oxygen Radical Absorbance Capacity 18 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija PG prostaglandini RAS os renin angiotenzin aldosteron • ROO lipidni peroksilni radikali ROS reaktivne kisikove zvrsti; angl. Reactive Oxygen Species SH sulfhidrilne skupine SD standardni odklon; angl. Standard Deviation SOD superoksidna dismutaza UPC razmerje med koncentracijo beljakovin in kreatinina v urinu; angl. Urinary Protein to Creatinine Ratio USG specifična gostota urina; angl. Urine Specific Gravity TAC celokupna antioksidantna kapaciteta; angl. Total Antioxidant Capacity TBARS s tiobarbiturno kislino reagirajoče spojine ; angl. Thiobarbituric Acid Reacting Substances TEAC troloksu ekvivalentna antioksidantna kapaciteta; angl. Trolox Equivalent Antioxidant Capacity TGF-β1 transformirajoči rastni faktor β1; angl. Transforming Growth Factor β1 TRAP skupna kapaciteta antioksidantov lovilcev radikalov; angl. Total Radical Trapping Antioxidant Parameter Tris tris (hidroksimetil) aminometan U enote; angl. Units VEGF žilni endotelijski rastni faktor; angl. Vascular Endothelial Growth Factor 19 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 1 UVOD Mačke so med pogosto preučevanimi živalskimi vrstami edinstvene v tem, da so v starosti nagnjene k obolenju enega samega organa ‒ ledvic. Kronična ledvična odpoved (angl. Chronic Kidney Disease, CKD) je med najpogostejšimi vzroki pogina pri mačkah. Gre za ireverzibilno postopno napredujočo izgubo funkcionalnega ledvičnega tkiva, ki v končni fazi ne glede na vzrok privede do ledvične fibroze. Preden se razvijejo klinični znaki uremije, lahko mačke z začetno stopnjo te bolezni živijo več let, nato pride do nenadne dekompenzacije in pogina. Lawler in sodelavci (2006) celo predpostavljajo, da gre pri mačji CKD za prilagoditveni mehanizem, ki bi lahko predstavljal evolucijsko prednost. Navajajo, da izguba ledvičnih cevk in peritubularna fibroza potekata brez znanega začetnega dejavnika, da gre za selektivni proces in da imajo mačke s tubulointersticijskimi procesi daljšo življenjsko dobo kot mačke, pri katerih tovrstna patologija ni prisotna. Raziskave zadnjih let se osredotočajo predvsem na odkrivanje dejavnikov, ki napovedujejo preživetje ali dekompenzacijo bolezni (Lawler in sod., 2006; Elliott in Watson, 2013, Jepson in sod., 2009; Greene in sod., 2014). Klinične raziskave kažejo, da standardna terapija s kalcitriolom in zaviralci angiotenzin konvertaze (angl. Angiotensin Converting Enzyme, ACE), ki upočasni napredovanje CKD pri drugih živalskih vrstah, pri mačkah slabše učinkuje. Trenutno najpomembnejši del zdravljenja je dolgoročno klinično spremljanje pacienta, ustrezna dieta in nudenje podporne terapije, ki blaži klinične znake uremije. Pri zdravljenju se prilagajamo potrebam in kliničnemu stanju posameznega pacienta (Korman in White, 2013; Polzin, 2013). Pri ljudeh in psih s CKD je dokazano porušeno ravnotežje med prooksidativnimi in antioksidativnimi procesi, kar vodi v stanje oksidativnega stresa. Oksidativni stres pomembno sodeluje pri napredovanju bolezni, saj povzroči stanje kroničnega vnetja (Locattelli in sod., 2003), oksidativne poškodbe membranskih in plazemskih lipidov, beljakovin in DNA. Dodajanje antioksidantov, predvsem vitamina E, dokazano zmanjša oksidativni stres, izboljša 20 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija antioksidantne parametre, zmanjša poškodbe bioloških molekul in izboljša klinično stanje ljudi s CKD (Cristol in sod., 1997; Locattelli in sod., 2003; Bhogade in sod., 2008; Kan in sod., 2008; Priya in Vasudha, 2009). Pri mačkah s CKD je področje oksidativnega stresa pri CKD slabo raziskano. Doslej so se z omenjeno problematiko ukvarjale tri raziskave in prišle do različnih zaključkov. Yu in Paetau- Robinson (2006) nista ugotovila značilnega povečanja pokazateljev oksidativnega stresa, medtem ko so Keegan in Webb (2010) ter Krofič Žel in sodelavci (2014) ugotovili, da pri mačkah s CKD pride do aktivacije antioksidantnih mehanizmov. Omenjene raziskave so bile izvedene na majhnem številu živali, pri čemer prvi dve nista upoštevali kliničnih stopenj bolezni po smernicah mednarodnega združenja za bolezni ledvic (angl. International Renal Interest Society, IRIS) (Yu in Paetau-Robinson, 2006; Keegan in Webb, 2010; Krofič Žel in sod., 2014). 21 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 1.1 NAMEN RAZISKAVE Dinamika oksidativnega stresa in vpliv vitamina E na antioksidantni status ter klinično stanje pri mačkah s CKD še niso podrobno raziskani, zato je namen naše raziskave preučiti prisotnost oksidativnega stresa pri mačkah s CKD v vseh kliničnih stopnjah bolezni. Oksidativni stres želimo ovrednotiti s stališča poškodb bioloških molekul in antioksidantnega statusa organizma. Končno želimo ugotoviti, ali dodatek vitamina E k zdravljenju po priporočilih IRIS izboljša klinično stanje in upočasni napredovanje bolezni. 1.2 HIPOTEZE V raziskavi smo si zastavili naslednje hipoteze: 1. Pri mačkah s CKD je oksidativni stres prisoten v vseh stopnjah bolezni (smernice IRIS) in vodi v oksidativne poškodbe lipidov, beljakovin in DNA, katerih obseg se z napredovanjem bolezni povečuje. 2. V vseh stopnjah CKD so parametri antioksidantnega statusa znižani, napredovanje bolezni pa vrednosti parametrov še zniža. 3. Dodajanje vitamina E k prehrani ob standardnem zdravljenju po smernicah IRIS zmanjša oksidativni stres, poveča parametre antioksidantnega statusa ter izboljša klinično stanje, ocenjeno na osnovi izbranih kliničnih in laboratorijskih parametrov ne glede na stopnjo bolezni. 22 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 2 PREGLED LITERATURE 2.1 KRONIČNA LEDVIČNA ODPOVED PRI MAČKAH Kronična ledvična odpoved je med najpogostejšimi vzroki pogina pri mačkah (King in sod., 2007). Pri mačkah, starejših od 15 let, navajajo do 30 % obolevnost (Allen in sod., 2000). Definirana je kot katerakoli ledvična bolezen, ki traja vsaj tri mesece in se odraža na spremenjenih laboratorijskih parametrih (povečana raven sečnine in kreatinina v serumu), spremenjenih kliničnih parametrih (izguba telesne mase, palpatorno majhne ledvice) in strukturnih spremembah ledvic (Polzin, 2013). Za CKD je značilna postopna izguba ledvične funkcije zaradi različnih bolezenskih procesov, ki so lahko prirojeni (dedni) ali pridobljeni (posledica vplivov okolja). Najpogosteje je posledica amiloidoze, tubulonefroze ali policistične bolezni ledvic. Terminalni stadij CKD je tubulointersticialna fibroza, ki nastane zaradi kroničnega vnetja. Stopnja fibroze je v korelaciji s stopnjo azotemije, hiperfosfatemije in anemije (Yabuki in sod., 2010; Chakrabarti in sod., 2012; Polzin, 2013). Pri mačkah s CKD so v urinu ugotovili značilno višjo koncentracijo vnetnih citokinov interlevkina 8 in TGF-β1 (transformirajoči rastni faktor β1, angl. Transforming Growth Factor β1) ter zmanjšano koncentracijo VEGF (žilni endotelijski rastni faktor, angl. Vascular Endothelial Growth Factor) kot pri zdravih mačkah. Koncentracija kreatinina v serumu in koncentracija TGF-β1 v urinu sta bili v pozitivni korelaciji, kar kaže na sodelovanje tega rastnega faktorja pri nastanku ledvične fibroze (Arata in sod., 2005; Habenicht in sod., 2013). Klasifikacija IRIS uvršča mačke s CKD ne glede na vzrok bolezni v klinične stopnje in za vsako stopnjo predvideva smernice zdravljenja (Polzin, 2013; smernice IRIS, 2013a). Glavno merilo za določitev stopnje je raven serumskega kreatinina (1. stopnja: koncentracija kreatinina do 140 µmol/L, 2. stopnja: 140‒249 µmol/L, 3. stopnja: 250‒439 µmol/L, 4. stopnja: nad 440 µmol/L). Stopnjo po IRIS lahko določimo le pri pacientih s stabilno CKD, prav tako 23 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija moramo izključiti druge bolezni, ki bi lahko vplivale na raven kreatinina v serumu. Raven kreatinina v krvi se lahko hitro spreminja, zato je priporočljivo določiti njegovo koncentracijo v štirinajstdnevnem razmiku. Ob odvzemu krvi mora biti žival primerno hidrirana in tešča (Elliott in Watson, 2013). Da nastopi CKD, mora biti poškodovan velik del ledvičnega tkiva. Koncentracija kreatinina v krvi se poveča šele, ko je uničenih približno 75 % nefronov. Raven kreatinina v prvi in delno v drugi stopnji je zato znotraj referenčnih vrednosti. V prvi dve stopnji uvrstimo tiste paciente, pri katerih ugotovimo še katerega od spodaj naštetih parametrov:  nezmožnost koncentracije urina,  prisotnost renalne proteinurije,  nenormalna oblika ali velikost ledvic ob palpaciji, kar potrdimo s slikovno diagnostiko,  trend povečevanja koncentracije kreatinina v zaporednih vzorcih (Elliott in Watson, 2013). 2.1.1 Podstopnje bolezni Razvrstitev v podstopnje glede na višino arterijskega krvnega tlaka in razmerje med koncentracijo beljakovin in kreatinina v urinu (angl. Urinary Protein to Creatinine ratio, UPC) opredeljujeta stopnjo tveganja za napredovanje bolezni in pogin. Povečane vrednosti omenjenih parametrov neodvisno pospešijo razvoj bolezni in pogin (King in sod., 2007; Elliott in Watson, 2013; Jepson in sod., 2009; IRIS 2013a). Arterijski tlak je pri pacientih s CKD pogosto povišan. Trajno povišan tlak predstavlja tveganje za poškodbe možganskega ožilja, za odstop mrežnice in za poškodbo glomerulov. Smernice IRIS določajo stopnjo tveganja na podlagi najnižjega ponovljivo izmerjenega sistolnega arterijskega tlaka: minimalno tveganje (pod 150 mm Hg), nizko tveganje (150‒159 mm Hg), zmerno tveganje (160‒180 mm Hg) in visoko tveganje (nad 180 mm Hg). 24 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija UPC je neposreden odraz 24-urnega izločanja beljakovin z urinom. Za renalno proteinurijo je značilna prisotnost beljakovin v urinu brez prisotnosti vnetnih celic, eritrocitov ali bakterij v urinskem sedimentu. Paciente glede na vrednost UPC razdelimo po naslednjem ključu: brez proteinurije (UPC do 0,2), mejna proteinurija (UPC 0,2‒0,4) in proteinurija (UPC več kot 0,4) (Kuwahara in sod., 2006, Syme in sod., 2006; Grauer, 2007; Elliott in Watson, 2013; Syme, 2009). Dodatni negativni prognostični dejavniki za dekompenzacijo in smrt mačk s CKD so stopnja azotemije (Kuwahara in sod., 2006; Syme in sod., 2006; King in sod., 2007), hiperfosfatemija (King in sod., 2007), anemija (Kuwahara in sod., 2006; King in sod., 2007), levkocitoza (King in sod., 2007), hujšanje, stopnja dehidracije, cistitis, diabetes mellitus (Greene in sod., 2014) in povečana koncentracija fibroblastnega rastnega faktorja 23 v urinu (angl. Fibroblast Growth Factor 23, FGF-23) (Geddes in sod., 2013). 2.2 VLOGA REAKTIVNIH KISIKOVIH ZVRSTI PRI KRONIČNI LEDVIČNI ODPOVEDI Pri presnovi fiziološko nastajajo številne reaktivne kisikove zvrsti (angl. Reactive Oxygen Species ‒ ROS), ki zajemajo tako proste radikale kot tudi reaktivne kisikove spojine in lahko povzročijo oksidativne poškodbe membranskih in plazemskih lipidov, beljakovin in DNA (Galle, 2001). V celicah proksimalnih ledvičnih cevk, ki so med presnovno najaktivnejšimi v organizmu, • nastajajo predvsem superoksidni radikal (O - 2 ), vodikov peroksid (H2O2), hidroksilni radikal • • ( OH), lipidni in DNA hidroperoksidi, lipidni peroksilni radikali (ROO ), hipoklorna kislina (HClO) in peroksinitrit (ONOO-). Superoksidni radikal nastaja predvsem v mitohondrijih pri uhajanju elektronov v dihalni verigi ter pri oksidativnem izbruhu nevtrofilnih granulocitov med fagocitozo s pomočjo NADPH oksidaze. Tudi nefagocitne celice imajo NADPH oksidaze. Superoksidni radikal sintetizirajo v manjši meri, ta pa ima vlogo signalne molekule (Valko in sod., 2007). 25 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Hidroksilni radikal je nevtralna oblika hidroksidnega iona. Je zelo reaktiven, toda njegova razpolovna doba je kratka, zato reagira v bližini mesta svojega nastanka. Najverjetnejša razlaga nastanka hidroksilnega radikala in vivo je naslednja: pod vplivom superoksidnega radikala se v celici iz molekul, ki vsebujejo železo, sprosti železov ion, ki z vodikovim peroksidom reagira v Fentonovi reakciji, da nastane hidroksilni radikal: • Fe+2 + H2O2 →Fe+3 + OH + OH- Na enak način kot železov ion lahko reagirajo tudi bakrov, kromov in kobaltov ion. Superoksidni • • radikal, ki sodeluje v Haber-Weissovi reakciji (O - 2 + H2O2 → O2 + OH + OH-), reducira železov • ion iz Fe+3 v Fe+2: Fe+3 + O - 2 → Fe+2 + O2 (Halliwell, 2006; Valko in sod., 2007). Glavno mesto nastanka vodikovega peroksida v celici so peroksisomi. Vsebujejo encim katalazo, ki vodikov peroksid razgradi na molekularni kisik in vodo. Na ta način se vzdržuje občutljivo ravnotežje v nastajanju in razgradnji ROS. Če se peroksisomi poškodujejo in je aktivnost encimov, ki skrbijo za razgradnjo vodikovega peroksida zmanjšana, se ta sprosti v citosol (Valko in sod., 2007). Peroksilni radikali so derivati superoksidnega aniona. Najenostavnejši je hidroperoksilni radikal • (HOO ), ki je protonirana oblika superoksidnega aniona. Hidroperoksilni radikal je glavni iniciator lipidne peroksidacije. Lipidni in DNA hidroperoksidi nastanejo kot posledica napada peroksilnega radikala na lipidne molekule in DNA (Valko in sod., 2007). Sintaze dušikovega oksida v tkivih sintetizirajo NO•, ki ima v mnogih fizioloških procesih vlogo signalne molekule. Pri vnetnih procesih med oksidativnim izbruhom proizvajajo celice imunskega sistema superoksidni anion in dušikov oksid. Omenjeni molekuli lahko reagirata (NO• • + O - → ONOO-), da nastane peroksinitritni anion, ki je močan oksidant in lahko povzroči 2 fragmentacijo DNA in oksidacijo lipidov. ROS, ki nastajajo v fizioloških pogojih, delujejo tudi kot signalne molekule in povzročijo neposredno aktivacijo provnetnih jedrnih transkripcijskih dejavnikov in mitogenih signalnih poti ter aktivacijo levkocitov (Wardle, 2005; Singh in sod., 2006, Valko in sod., 2007). 26 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Encimski in neencimski antioksidantni sistemi odstranjujejo ROS in s tem preprečujejo oksidativne poškodbe bioloških molekul (Galle, 2001). Porušenje ravnotežja med prooksidativnimi in antioksidativnimi procesi vodi v stanje oksidativnega stresa (Halliwell, 2006). Organizem je pri CKD dolgotrajno podvržen učinkom oksidativnega stresa. Število funkcionalnih nefronov se zmanjša, posledično postanejo zaradi kompenzacije lokalno hiperfunkcionalni, kar vodi v povečano raven oksidativne fosforilacije in posledično do nastanka večjih količin ROS (Agarwal, 2002). Pri bolnikih s CKD je aktivirana os renin-angiotenzin- aldosteron (RAS), ki vodi v sistemsko in ledvično hipertenzijo; ta dodatno poveča glomerulno filtracijo in posledično vodi v hiperfunkcijo nefronov. Angiotenzin II neposredno poveča produkcijo ROS v mezangijskih celicah in gladkih mišičnih celicah krvnih žil (Brown, 2008). Novejše raziskave poudarjajo prisotnost encima angiotenzin konvertaze 2 (angl. Angiotensin Converting Enzyme 2, ACE 2), ki se izraža predvsem v epitelnih celicah proksimalnih ledvičnih cevk. Njeni glavni funkciji sta pretvorba angiotenzina I v neaktivni angiotenzin 1‒9 in katabolizem angiotenzina II v angiotenzin 1‒7. Angiotenzin 1‒7 ima nasproten učinek kot angiotenzin II: zmanjša vazokonstrikcijo, izražanje provnetnih citokinov, proliferacijo celic in oksidativni stres ter pospeši natriurezo. Zato je pri uravnavi RAS v organizmu pomembno razmerje med ACE in ACE 2 (Mizuiri in Ohashi, 2015). Pri psih s CKD so ugotovili zmanjšano izražanje ACE v epitelu proksimalnih cevk na račun povečanega izražanja ACE 2 v epitelu Henlejeve zanke, ki je bilo v pozitivni korelaciji s povečano koncentracijo kreatinina v serumu. Pri mačkah s CKD tovrstne korelacije niso ugotovili (Mitani in sod., 2014). Pri CKD je zaradi povečane prepustnosti glomerulne membrane lahko prisotna proteinurija v katerikoli fazi bolezni in ni odvisna od serumske koncentracije kreatinina. Raven proteinurije določamo s pomočjo UPC, ki predstavlja pomemben prognostičen faktor za preživetje. Beljakovine so v urinu bolj izpostavljene oksidaciji kot v plazmi. Oksidirani albumini vstopijo v celice proksimalnih ledvičnih cevk, kjer stimulirajo nastanek provnetnih citokinov in kemokinov, ki aktivirajo transkripcijske dejavnike in vodijo v iniciacijo intersticijske fibroze. Proteini v urinu torej niso le pokazatelj patoloških procesov v ledvicah, ampak pomembno sodelujejo pri patogenezi CKD (Wardle, 2005; Brown, 2008; Syme, 2009). 27 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 2.3 POŠKODBE BIOLOŠKIH MOLEKUL 2.3.1 Lipidna peroksidacija in malondialdehid Najpogostejša posledica oksidativnega stresa je lipidna peroksidacija. Vključuje oksidativne spremembe večkratnenasičenih maščobnih kislin in privede do poškodbe bioloških membran. Končni produkti lipidne peroksidacije so izoprostani, konjugirani dieni in aldehidi (Dotan in sod., 2004). Raven malondialdehida (MDA) v plazmi (ali serumu) je splošno uporabljan kazalec oksidativnega stresa in je pri ljudeh in psih s CKD povečana na račun vezanega MDA (Kamal- Eldin in Appelqvist, 1996; Kargin in Fidanci, 2001). Glavni vir MDA v bioloških vzorcih je peroksidacija večkrat nenasičenih maščobnih kislin z dvema ali več dvojnimi vezmi, med katerimi je metilen. Pri sesalcih sta najpogostejša prekurzorja arahidonska in dokozaheksaenojska kislina. Nastanek MDA iz večkratnenasičenih maščobnih kislin razlaga več hipotez. Pryor in Stanley (1975) predpostavljata, da je prekurzor MDA biciklični endoperoksid s podobno strukturo kot endoperoksid, ki nastane pri biosintezi prostaglandinov (Del Rio in sod., 2005). Esterbauer in sodelavci (1991) domnevajo, da z β-cepitvijo verige maščobne kisline nastanejo hidroperoksidi, kar vodi v nastanek hidroperoksid aldehida. Z β-cepljenjem le-tega lahko neposredno nastane MDA ali pa akroleinski radikal. Če akroleinski radikal reagira s hidroksilnim radikalom, nastane MDA (Esterbauer in sod., 1991; Del Rio in sod., 2005). MDA naj bi nastajal tudi pri biosintezi tromboksana A2. V nekaterih tkivih s pomočjo encima trombocitne tromboksan sintaze iz prostaglandinov (PG) PGH2, PGH3 in PGG2 nastanejo v razmerju 1 : 1 : 1 MDA, tromboksan A2 in C17 spojine. Iz PGH1, 8-izo-PGH2 in 13(S)hidroksiPGH3 nastaneta le MDA in C17 spojina, tromboksan A2 pa ne (Del Rio in sod., 2005; Esterbauer in sod., 1991). 28 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija V organizmu se MDA nahaja v prosti in vezani obliki z beljakovinami, nukleinskimi kislinami in lipoproteini. Prosti MDA je povečan, kadar so oksidativne poškodbe lipidov nastale akutno, in obenem da podatek o trenutnem stanju lipidne peroksidacije v organizmu, medtem ko se raven vezanega MDA poveča pri kroničnih procesih. Pri podganah se MDA presnovi do ogljikovega dioksida in vode. Presnova poteka v mitohondrijih, kjer aldehid dehidrogenaze MDA najprej pretvorijo v malonsko kislino semialdehid, ki se spontano dekarboksilira v acetaldehid. Aldehid dehidrogenaze ga oksidirajo v acetat, ki se oksidira do ogljikovega dioksida in vode. Majhen del MDA se v jetrih lahko oksidira do malonata, ki se pretvori v malonilkoencim A, nato pa dekarboksilira v acetilkoencim A (Esterbauer in sod., 1991). MDA se z urinom izloča predvsem v obliki adukta z lizinom in z njegovim N-acetiliranim derivatom. V manjših količinah so v urinu ugotovili tudi prost MDA, adukte s serinom in etanolaminom ter z gvaninom in deoksigvanozinom. V primeru oksidativnega stresa v organizmu se v plazmi in urinu poveča koncentracija adukta MDA z lizinom, medtem ko je koncentracija adukta z deoksigvanozinom v jetrih in v urinu nespremenjena (Draper in sod., 2000). V urinu so ugotovili tudi spojine, nastale pri presnovni razgradnji proteinov, spremenjenih z MDA. Večina teh spojin ni endogenega izvora, ampak je nastala z razgradnjo z MDA spremenjenih beljakovin, zaužitih s hrano živalskega izvora. Povečano količino teh spojin so zaznali pri podganah s pomanjkanjem vitamina E, pri zastrupitvi z ogljikovim tetrakloridom in pri dajanju železovega nitriloacetata, ki vzpodbuja lipidno peroksidacijo (Esterbauer in sod., 1991). Pri ljudeh s končno stopnjo CKD so ugotovili povečano plazemsko koncentracijo MDA na račun vezanega MDA, saj je nastajanje MDA zaradi oksidativnega stresa povečano (De Vecchi in sod., 1997; Ozden in sod., 2002; Agarwal, 2002; Priya in Vasudha, 2009). V raziskavi pri mačkah (Yu in Paetau-Robinson, 2006) in psih (Buranakarl in sod., 2009) s CKD z uporabo metode TBARS (s tiobarbiturno kislino reagirajoče spojine, angl. Thiobarbituric Acid Reactive Substances) niso ugotovili značilno povečane koncentracije MDA v serumu oziroma plazmi. 29 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 2.3.2 Oksidativne poškodbe beljakovin Oksidativne poškodbe beljakovin zajemajo oksidacijo polipeptidnih verig, fragmentacijo beljakovin, nastanek novih prečnih povezav med beljakovinami (angl. Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) in oksidacijo stranskih aminokislinskih ostankov ter nastanek tiolnih skupin. Za dokazovanje oksidativnih poškodb beljakovin se najpogosteje uporablja določanje proteinskih karbonilnih skupin v plazmi, ki so pokazatelj dalj časa trajajočega oksidativnega stresa (Dalle-Donne in sod., 2003; Halliwell in Whiteman, 2004; Valko in sod., 2007). ROS, ki povzročajo nastanek proteinskih karbonilnih skupin, so superoksidni, hidroksilni, peroksilni, alkoksilni in hidroperoksilni radikal ter vodikov peroksid, hipoklorna kislina, ozon, singletni kisikov ion in peroksinitrit. Karbonilne skupine in njihovi derivati nastanejo z neposredno oksidacijo stranskih verig beljakovin in preko sekundarne reakcije aminokislinskih ostankov z MDA, 4-hidroksinonenalom in drugimi aldehidi (Dalle-Donne in sod., 2003). Oksidaciji sta najbolj podvrženi aminokislini cistein in metionin; pogosto oksidirajo tudi lizin, arginin, prolin in treonin (Wardle, 2005; Dalle-Donne in sod., 2003). Oksidirane beljakovine (proteinski karbonili) se v celici akumulirajo, nekatere so odporne na proteolizo in lahko preprečijo razgradnjo drugih oksidiranih beljakovin (Berlett in Stadtmann, 1997). Različni avtorji potrjujejo povečano koncentracijo karbonilnih skupin (Himmelfarb in sod., 2000; Mimić-Oka in sod. 2001) in tiolnih skupin (Himmelfarb in sod., 2000) in AOPP (Witko-Sarsat, 1998) pri pacientih s CKD v primerjavi z zdravimi ljudmi. 2.3.3 Oksidativne poškodbe DNA Oksidativne poškodbe DNA zajemajo modifikacije sladkorjev in baz, nastanek kovalentnih prečnih vezi ter sproščanje baznih parov iz DNA, kar privede do enojnega ali dvojnega lomljenja DNA vijačnice. Purinske baze, predvsem gvanin, so posebej dovzetne za oksidacijo. Pri napadu hidroksilnega radikala na purine nastanejo 8-hidroksi-2-deoksigvanozin (8-OHdG), 8-hidroksi-2- 30 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija deoksiadenozin (8-OHdA), 7,8-dihidro-8-oksogvanin (8-oksoG), formamidopirimidini in druge spojine. 8-OHdG je najpogosteje preučevan parameter v zvezi z oksidativnimi poškodbami DNA pri mačkah (Yu in Paetau-Robinson, 2006) in pri ljudeh (Dotan in sod., 2004; Valko in sod., 2007). Pri bolnikih s CKD je raven 8-OHdG v urinu povečana, 8-OHdG se uporablja tudi kot pokazatelj oksidativnega stresa, ki ga povzroči uremija. Pri bolnikih s CKD lahko poškodbe DNA ugotavljamo tudi s pomočjo ocene pogostnosti mikrojeder in fragmentiranosti mitohondrijske DNA ter s testom komet (Sung in sod., 2013). Test komet (angl. Single Cell Gel Electrophoresis assay) je občutljiva metoda za odkrivanje poškodb DNA na nivoju posameznih celic. S testom komet ugotavljamo enojne in dvojne prelome vijačnice DNA, območja DNA, ki so nestabilna v alkalnem okolju, in razrahljan kromatin. Metoda temelji na potovanju negativno nabite DNA v električnem polju proti pozitivnemu polu. Poškodovana fragmentirana DNA potuje hitreje kot intaktna. V primeru poškodovane DNA dobijo celična jedra obliko kometa, po čemer je test dobil ime. Poškodbe DNA ovrednotimo z računalniškim programom za analizo slike. Izmerimo lahko več parametrov, kot so odstotek DNA v tako imenovanem repu kometa oziroma glavi kometa in dolžina repa kometa (Tice in sod., 2000). Z metodo testa komet so ugotovili poškodbe DNA pri ljudeh s CKD, ki se je z napredovanjem bolezni povečevala (Stopper in sod., 2001; Stoyanova in sod., 2010). V nasprotju z raziskavami pri ljudeh pri mačkah z začetno stopnjo CKD med zdravimi in bolnimi živalmi niso ugotovili značilnih razlik (Yu in Paetau-Robinson, 2006). 2.4 ANTIOKSIDANTNI SISTEM V LEDVICAH Najpomembnejši encimski antioksidantni sistemi v ledvicah so plazemska in eritrocitna glutation peroksidaza (GPX), superoksidna dismutaza (SOD), katalaza (CAT) in endotelijska sintaza dušikovega oksida; neencimski pa glutation, vitamina E in C, karotenoidi in sulfhidrilne (SH) skupine albuminov (Locattelli in sod, 2003). Plazemska glutation peroksidaza deluje kot 31 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija antioksdidantni encim lokalno v proksimalnih ledvičnih cevkah in sistemsko v plazmi (Arthur, 2000). 2.4.1 Glutation peroksidaza Glutation peroksidaza (GPX) katalizira redukcijo vodikovega peroksida in drugih organskih peroksidov v vodo ali v alkohole. Pri sesalcih najdemo več izoencimov, ki se v različnih tkivih različno izražajo. GPX-1 ali citosolno GPX najdemo v citosolu in mitohondrijih in katalizira pretvorbo hidroperoksidov maščobnih kislin ter vodikovega peroksida na račun oksidacije glutationa (Ursini in sod., 1995; Mates, 2000). ROOH + 2GSH → ROH + GSSG + H2O Glutation se nato z glutation reduktazo reducira, pri čemer se oksidira NADPH: GSSG + NADPH +H+ → 2GSH + NADP+ GPX-1 je prisotna v vseh tkivih, predvsem v eritrocitih, ledvicah in jetrih. Citosolna GPX-2 je prisotna v prebavilih, zunajcelična GPX-3 pa v celicah proksimalnih ledvičnih cevk. GPX-4 ali fosfolipidna GPX se nahaja v citosolu. Neposredno reducira fosfolipidne hidroperokside, hidroperokside maščobnih kislin in holesterolne hidroperokside, ki nastanejo v peroksidiranih membranah in oksidiranih lipoproteinih. GPX-4 je najbolj izražena v epitelnih celicah ledvičnih cevk in v testisih (Ursini in sod., 1995; Arthur, 2000). Prej našteti izoencimi GPX imajo na aktivnem mestu selenocistein, ki se v zaporednih reakcijah najprej oksidira in nato reducira. Pri miših so odkrili tudi GPX-5 in GPX-6, ki imata podobno strukturo kot ostale selenoglutation peroksidaze, vendar na aktivnem mestu nimata selena (Arthur, 2000; Mates, 2000). V krvi sta prisotni plazemska in eritrocitna GPX. Glavni vir GPX v plazmi so celice ledvičnih cevk (Avissar in sod., 1994, Whitin in sod., 2002). Številne raziskave pri ljudeh s CKD ugotavljajo zmanjšano aktivnost plazemske GPX na vseh stopnjah bolezni (Schiavon in sod., 1994; Ceballos-Picot in sod., 1996; Witko-Sarsat in sod., 1998; Zachara in sod., 2004; El-Far in sod., 2005). Zmanjšano aktivnost plazemske GPX razlagajo kot posledico povečane lipidne peroksidacije v organizmu, zmanjšanega števila funkcionalnih nefronov (Ceballos-Picot in sod., 32 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 1996; El-Far in sod., 2005; Zagrodzki in sod., 2007) in prisotnosti uremičnih toksinov (El-Far in sod., 2005; Zagrodzki in sod., 2007), porabe plazemske GPX, inaktivacije GPX ali abnormalne heksoza monofosfatne poti (Zagrodzki in sod., 2007). Zmanjšano aktivnost plazemske GPX ugotavljajo že v zgodnjem stadiju bolezni, zato je primeren diagnostični in prognostični pokazatelj stopnje bolezni in ledvične funkcije (Schiavon in sod., 1994; Ceballos-Picot in sod., 1996). V nasprotju s prej navedenimi raziskavami so pri mačkah s CKD ugotovili značilno povečano aktivnost plazemske GPX v končnem stadiju bolezni, medtem ko je bila njena aktivnost v začetnih stopnjah bolezni nespremenjena. Ti rezultati nakazujejo prisotnost kompenzatornih mehanizmov, ki so, kot odgovor na povečan oksidativni stres, v tej stopnji še vedno prisotni (Krofič Žel in sod., 2014). Pri ljudeh s CKD ugotavljajo znižano koncentracijo selena v polni krvi in plazmi, ki se z napredovanjem bolezni stopnjuje. Kot vzrok navajajo zmanjšan vnos beljakovin z dieto, ki ima zmanjšano vsebnost beljakovin in povečano izločanje selena iz telesa zaradi proteinurije (Ceballos-Picot in sod., 1996; Allan in sod., 1999; Zagrodzki in sod., 2007). Ker je selen kofaktor GPX, navajajo nekateri avtorji pomanjkanje selena kot enega glavnih možnih vzrokov za znižano aktivnost GPX (Zagrodzki in sod., 2007). Druge raziskave tega niso potrdile (Ceballos-Picot in sod., 1996; Zachara in sod., 2004). Pri zdravih mačkah niso ugotovili korelacije med aktivnostjo plazemske GPX in koncentracijo selena v plazmi, tudi če so vnos selena močno povečali. Aktivnost plazemske GPX je korelirala s koncentracijo selena le, če je bil ta element v pomanjkanju (Foster in sod., 2001; Todd in sod., 2012). Pri mačkah s CKD se koncentracija selena v serumu v primerjavi z zdravimi mačkami ne razlikuje in se z napredovanjem bolezni ne spreminja. Selen pri mačkah s CKD ni omejujoč dejavnik (Krofič Žel in sod., 2014). Različni avtorji ugotavljajo različna odstopanja v aktivnosti eritrocitne GPX: Ceballos Picot in sodelavci (1996) so ugotovili povečano aktivnost pri bolnikih s CKD; Ozden, Zachara in El-Far (Ozden in sod., 2002, Zachara in sod., 2004; El-Far in sod., 2005) niso ugotovili značilnih razlik, medtem ko so nekatere raziskave ugotovile zmanjšano aktivnost tega encima (Yoshimura in sod., 1997; Sommerburg in sod., 2002). Pri mačkah s CKD v primerjavi z zdravimi mačkami niso 33 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija ugotovili značilnih razlik v aktivnosti eritrocitne GPX. Značilnih razlik ni bilo niti med posameznimi kliničnimi stopnjami CKD (Krofič Žel in sod., 2014). 2.4.2 Superoksidna dismutaza Encim superoksidna dismutaza (SOD) katalizira reakcijo dismutacije superoksidnega radikala v • • kisik in vodikov peroksid: O - - 2 + O2 + 2H+ → H2O2 + O2 Katalaza (CAT) ali GPX nato vodikov peroksid pretvorita v molekulski kisik in vodo. SOD ščiti dehidrataze pred inaktivacijo s superoksidnim radikalom. Glede na kofaktor uvrščamo superoksidne dismutaze v štiri razrede: Cu, Zn-SOD, Fe-SOD, Ni-SOD in Mn-SOD. Fe-SOD in Mn-SOD imajo homologno strukturo, ostale superoksidne dismutaze se med seboj strukturno razlikujejo. Pri ljudeh so ugotovili tri vrste SOD: citosolno Cu, Zn-SOD, mitohondrijsko Mn- SOD in zunajcelično SOD (angl. Extracellular-SOD, EC-SOD) (Mates, 2000). Mn-SOD je homotetramer. Vsaka podenota vsebuje en atom mangana, ki se pri dismutaciji superoksida pretvarja iz Mn(III) v Mn(II) in nazaj v Mn(III). Njeno aktivnost inducirajo citokini, in oksidanti. Cu, Zn-SOD je homodimer. Vsaka podenota ima aktivno mesto, sestavljeno iz enega bakrovega in enega cinkovega atoma, ki ju povezuje histidin (Mates, 2000). EC-SOD je sekretorni tetramerni glikoprotein, ki vsebuje baker in cink. Ima visoko afiniteto do nekaterih glikozaminoglikanov, predvsem heparina in heparan sulfata. Nahaja se v intersticiju ter v plazmi, limfi in sinovialni tekočini. Je edini zunajcelični encim, ki odstranjuje superoksidni anion. Njene aktivnosti ne inducirajo niti substrat niti drugi oksidanti (Mates, 2000). Raziskave kažejo, da je aktivnost tega encima pri dializnih bolnikih s CKD nižja kot pri zdravih ljudeh (Mates, 2000; Locattelli in sod., 2003). Domnevajo, da gre pri humanih bolnikih s CKD za znižanje ravni izražanja tega encima. Ugotovili so tudi zmanjšano aktivnost Cu, Zn-SOD in Mn SOD v jetrih in ledvicah podgan z eksperimentalno povzročeno CKD (Vaziri in sod., 2003). V nasprotju s prej omenjenimi raziskavami pri mačkah s CKD v primerjavi z zdravimi niso ugotovili značilne razlike v aktivnosti SOD. To razliko bi lahko razložili z drugačno oksidativno 34 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija presnovo pri mačkah. Raziskave aktivnosti SOD pri ljudeh pretežno obravnavajo dializne bolnike, pri katerih je oksidativni stres dokazano večji (Keegan in Webb, 2010). 2.4.3 Celokupna antioksidantna kapaciteta Celokupna antioksidantna kapaciteta (angl. Total Antioxidant Capacity, TAC) zajema skupno delovanje vseh antioksidantov v plazmi in telesnih tekočinah in predstavlja integriran parameter in ne le vsote vseh merljivih antioksidantov (Ghiselli in sod., 2000), kot so urati, askorbinska kislina, bilirubin, proteinske sulfhidrilne (SH) skupine, koencim Q10 in -tokoferol (Aejmelaeus in sod., 1997). Poznamo več metod določanja TAC, katerih rezultati med seboj niso popolnoma primerljivi. Metode razdelimo v dve skupini, in sicer na tiste, ki temeljijo na prenosu vodikovega atoma (angl. Hydrogen Atom Transfer, HAT) in tiste, ki temeljijo na prenosu elektrona (angl. Electron Transfer, ET). Metode HAT večinoma uporabljajo kompetitivno reakcijsko shemo, pri kateri antioksidant in substrat tekmujeta za peroksilni radikal. Najpogosteje uporabljeni metodi HAT sta kapaciteta absorbance kisikovega radikala (angl. Oxygen Radical Absorbance Capacity, ORAC) in skupna kapaciteta antioksidantov lovilcev radikalov (angl. Total Radical Trapping Antioxidant Parameter, TRAP). Metode, ki temeljijo na ET, merijo kapaciteto antioksidanta, da reducira oksidant, ki nato spremeni barvo. Najpogosteje uporabljani metodi sta železoreducirajoč antioksidantni potencial (angl. Ferric Ion Reducing Antioxidant Power, FRAP), in troloksu ekvivalentna antioksidantna kapaciteta (angl. Trolox Equivalent Antioxidant Capacity, TEAC) (Dotan in sod., 2004; Huang in sod., 2005). Pri mačkah so ugotavljali plazemsko TAC v treh raziskavah: Yu in Paetau Robinson (2006) z metodo ORAC pri mačkah z začetno stopnjo CKD v primerjavi z zdravimi živalmi nista ugotovila značilnih razlik. Keegan in Webb (2010) sta pri mačkah s CKD z metodo TEAC ugotovila značilno znižano TAC, medtem ko Krofič Žel in sodelavci (2014) z uporabo iste metode, vendar reagenčnega kompleta drugega proizvajalca, niso ugotovili značilnih razlik med zdravimi in bolnimi živalmi ne glede na stopnjo bolezni. 35 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 2.4.4 Vitamin E Vitamin E (-tokoferol) je v maščobah topni antioksidant, ki ščiti lipidne membrane pred peroksidacijo. Preprečuje verižno reakcijo peroksidacije lipidov tako, da reducira lipidne peroksilne radikale. Vitamin E predstavlja družino osmih v maščobi topnih tokoferolov in se nahaja v celičnih membranah in v plazemskih lipoproteinih. -tokoferol ima med vsemi tokoferoli največjo biorazpoložljivost, zato je njegova uporaba najbolj raziskana. Ker lipidni peroksilni radikali reagirajo z -tokoferolom veliko hitreje kot lipidi, lahko ena molekula vitamina E zaščiti kar 103‒108 molekul večkratnenasičenih maščobnih kislin (Kamal-Eldin in Appelqvist, 1996). Pri tem nastane tokoferilni radikal, ki se regenerira v -tokoferol s pomočjo askorbinske kisline, koencima Q10 ali z glutationom (Valko in sod., 2007; Halliwell, 2006). Pri humanih uremičnih pacientih je raven vitamina E v serumu znižana, kar je najverjetneje posledica povečane porabe tega vitamina zaradi povečanega nastanka ROS (Bhogade in sod., 2008). Dokazana je značilna negativna povezava med koncentracijo vitaminov E in C in koncentracijo kreatinina, sečnine in MDA v serumu (Priya in Vasudha, 2009). Pri dializnih bolnikih so ugotovili pozitiven učinek dodajanja vitamina E k prehrani. Dializni bolniki, ki so dva meseca prejemali vitamin E, so imeli v primerjavi s kontrolno skupino nižjo serumsko koncentracijo MDA, medtem ko je bila aktivnost SOD ter CAT znižana (Bhogade in sod., 2008). Drugi avtorji navajajo izboljšanje kliničnega stanja dializnih bolnikov po dodajanju vitamina E: anemija je bila blažja, odziv na terapijo z eritropoetinom se je izboljšal (Cristol in sod., 1997), pojavnost ateroskleroze in kardiovaskularnih bolezni je bila manjša (Locattelli in sod., 2003; Priya in Vasudha, 2009), poškodbe DNA, ocenjene s testom komet, so se zmanjšale (Kan in sod., 2002). Ali zdravljenje, ki vključuje dajanje vitaminov in antioksidantov, pri mačkah s CKD deluje, zaenkrat ostaja nepojasnjeno (Roudebush in sod., 2009, Korman in White, 2013). 36 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 2.5 OKSIDATIVNI STRES PRI KRONIČNI LEDVIČNI ODPOVEDI Številne raziskave pri ljudeh s CKD (Ceballos-Picot in sod., 1996; Kamal-Eldin in Appelqvist, 1996; Galle, 2001; Dalle-Donne in sod., 2003; Wardle, 2005; Bhogade in sod., 2008; Priya in Vasudha, 2009) potrjujejo stanje oksidativnega stresa, ki se odraža s poškodbami DNA, beljakovin in lipidov ter znižano aktivnostjo plazemske GPX. Raziskave dokazujejo prisotnost oksidativnega stresa že zgodaj v poteku CKD; ta se z napredovanjem bolezni stopnjuje. Tudi pri psih s CKD so raziskave pokazale prisotnost oksidativnega stresa. Kargin in Fidanci (2001) sta ugotovila zmanjšano aktivnost CAT, SOD in GPX v eritrocitih ter povečano koncentracijo MDA v plazmi psov s CKD. Buranakarl in sodelavci (2009) so ugotovili, da je razmerje med MDA in kreatininom v urinu v pozitivni korelaciji z UPC. Merili so tudi aktivnost CAT, koncentracijo glutationa v eritrocitih ter koncentracijo serumskega MDA, vendar korelacije s stopnjo azotemije niso ugotovili. Nedavna raziskava Silve in sodelavcev (2013) je pokazala prisotnost oksidativnega stresa pri uremičnih psih z znižano TAC, zmanjšano produkcijo superoksidnega radikala v nevtrofilnih granulocitih ter pospešeno apoptozo le-teh. Z metodo TBARS so ugotovili manjšo raven lipidne peroksidacije kot pri zdravih psih. Oksidativni stres pri mačkah s CKD še ni podrobno raziskan. Pri vzorcu desetih mačk z začetno stopnjo CKD Yu in Paetau-Robinson (2006) nista ugotovila značilnega povečanja pokazateljev oksidativnega stresa (TAC, serumska koncentracija 8-OHdG, koncentracija MDA v plazmi, poškodba DNA perifernih limfocitov). Po dajanju kombinacije vitamina C, vitamina E in β karotena so se oksidativne poškodbe DNA značilno zmanjšale. Keegan in Webb (2010) sta na vzorcu dvajsetih mačk s CKD ugotovila značilno znižano plazemsko TAC, nespremenjeno aktivnost SOD in povečan oksidativni izbruh nevtrofilnih granulocitov. Zaključila sta, da je pri mačkah s CKD zaradi kroničnega vnetja povečana produkcija superoksidnega radikala v nevtrofilnih granulocitih, kar v organizmu vodi v 37 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija prooksidativne procese. Ker je bilo razmerje med reducirano in oksidirano obliko glutationa povečano, zaključujeta, da so antioksidantni obrambni mehanizmi pri CKD aktivirani. Krofič Žel in sodelavci (2014) so preučevali aktivnost plazemske in eritrocitne GPX, nivo plazemske TAC in koncentracijo selena v serumu šestindvajsetih mačk s CKD ter jih primerjali z zdravimi mačkami. Mačke s CKD so obravnavali po skupinah glede na stopnjo bolezni po smernicah IRIS. Ugotovili so, da se aktivnost eritrocitne GPX, koncentracija selena v serumu in plazemska TAC pri mačkah s CKD ne razlikujejo v primerjavi s skupino zdravih živali. Tudi primerjava navedenih parametrov med posameznimi stopnjami CKD ni pokazala značilnih razlik. Pri mačkah v IRIS IV so v primerjavi s skupino zdravih ugotovili značilno povečano aktivnost plazemske GPX, kar kaže na indukcijo antioksidantnih obrambnih mehanizmov. 38 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3 MATERIALI IN METODE 3.1 PRELIMINARNA RAZISKAVA Preliminarno raziskavo smo izvedli na Kliniki za kirurgijo in male živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani. Obravnavali smo 58 mačk, med njimi je bilo 30 mačk zdravih in 28 s CKD. Na podlagi izključitvenih kriterijev smo izključili dve mački s CKD in 11 iz skupine zdravih živali. Končno smo v preliminarno raziskavo vključili 19 zdravih mačk in 26 mačk s CKD. V skupini zdravih mačk je bilo deset samcev in devet samic. Šest samcev je bilo kastriranih, pet samic steriliziranih. V skupino mačk s CKD smo vključili 15 kastriranih samcev in 11 samic; deset samic je bilo steriliziranih. Mačke smo po smernicah IRIS (IRIS, 2013a) glede na vrednosti kreatinina v serumu razdelili v štiri skupine: pet v IRIS I (koncentracija kreatinina v serumu do 140 µmol/L), devet v IRIS II (koncentracija kreatinina 140‒249 µmol/L), sedem v IRIS III (koncentracija kreatinina 250‒439 µmol/L) in pet v IRIS IV (koncentracija kreatinina v serumu več kot 440 µmol/L). Pri vseh mačkah smo vzeli anamnezo in opravili klinični pregled ter jim odvzeli vzorce krvi in urina. Starost in telesno maso mačk, vključenih v preliminarno raziskavo, prikazuje Tabela 1. Mačke v kontrolni skupini so bile značilno mlajše kot mačke s CKD (p ˂ 0,05). 39 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 1: Starost in telesna masa (povprečje ± SD) mačk, vključenih v preliminarno raziskavo Table 1: Age and body weight (mean ± SD) of cats included in the preliminary study Stopnja CKD Starost (let) Telesna masa (kg) I (n = 5) 11,0 ± 5,4 4,1 ± 0,7 II (n = 9) 12,6 ± 6,6 4,5 ± 1,2 III (n = 7) 13,4 ± 3,6 3,1 ± 0,6 IV (n = 5) 11,6 ± 3,6 3,0 ± 0,7 Kontrolna skupina 5,1 ± 5,1* 4,2 ± 1,5 (n = 19) Legenda: CKD kronična ledvična odpoved; n število mačk; * značilna razlika (p < 0,05) v primerjavi z IRIS I (p = 0,027), II (p = 0,002), III (p = 0,000) in IV (p = 0,011) Legend: CKD chronic kidney disease; n number of cats; * (p < 0,05) control group versus IRIS I (p = 0,027), IRIS II (p = 0,002), IRIS III (P = 0,000), and IRIS IV (p = 0,011) Pri mačkah smo z enkratnim odvzemom določili izbrane hematološke (krvna slika, diferencialna bela krvna slika in relativno ter absolutno število retikulocitov), biokemijske (sečnina, kreatinin, alkalna fosfataza, holesterol, trigliceridi, alanin-aminotransferaza, skupne beljakovine, albumini, kalcij, anorganski fosfat in elektroliti (natrij (Na+), kalij (K+), kloridi (Cl-)) in urinske parametre (specifična gostota, kemijska analiza z reagenčnim trakom, UPC) ter parametre antioksidantnega statusa: celokupna antioksidantna kapaciteta (TAC), aktivnost eritrocitne superoksidne dismutaze (SOD), aktivnost plazemske in eritrocitne glutation peroksidaze (GPX) ter koncentracijo selena v serumu. Na osnovi kliničnega pregleda, izbranih hematoloških, biokemijskih in urinskih preiskav ter hitrega testa za ugotavljanje okužbe z virusom mačje levkemije (angl. Feline Leukemia Virus, FeLV) ali z virusom mačje imunske pomanjkljivosti (angl. Feline Immunodeficiency Virus, FIV) smo iz preliminarne raziskave izključili vse mačke z akutno poškodbo ledvic, akutnim infekcijskim sindromom, prerenalno ali postrenalno azotemijo, nefropatijo iz toksičnih ali infekcijskih vzrokov, obstrukcijo sečil, jetrnimi boleznimi, srčnim popuščanjem, onkološke paciente in mačke s kliničnimi znaki FeLV ali FIV. Na ta način smo izključili vpliv prej naštetih patoloških stanj na oksidativni stres organizma. 40 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3.2 KLINIČNA RAZISKAVA Klinično raziskavo smo izvedli na Kliniki za kirurgijo in male živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani. Obravnavali smo 45 naključno izbranih zdravih mačk in pregledali 90 kartotečnih zapisov mačk s CKD, od katerih je 34 mačk s CKD ustrezalo vključitvenim kriterijem in so njihovi lastniki podpisali soglasje za sodelovanje v klinični raziskavi. Na podlagi istih izključitvenih kriterijev kot v preliminarni raziskavi smo iz skupine zdravih mačk izključili sedem živali. V klinično raziskavo smo vključili 38 zdravih mačk in 34 mačk s CKD. V skupini zdravih mačk je bilo 24 samcev, med njimi 21 kastriranih. Vključili smo 14 zdravih samic, med njimi 11 steriliziranih. V skupini mačk s CKD je bilo 17 samcev, 16 kastriranih, in 17 steriliziranih samic. Starost in telesno maso mačk, vključenih v preliminarno raziskavo, prikazuje Tabela 2. Mačke v kontrolni skupini so bile značilno (p < 0,05) mlajše kot mačke s CKD (Slika 1). Tabela 2: Starost in telesna masa (povprečje ± SD) mačk, vključenih v klinično raziskavo Table 2: Age nad body weight (mean ± SD) in cats included in the clinical study Stopnja CKD Starost (let) Telesna masa (kg) I (n = 7) 10,4 ± 3,7 5,2 ± 1,6 II (n = 15) 9,0 ± 5,6 4,7 ± 1,4 III in IV (n = 12) 11,7 ± 4,7 4,5 ± 1,7 Kontrolna skupina 4,3 ± 3,2 4,6 ± 0,9 (n = 38) Legenda: CKD kronična ledvična odpoved; n število mačk Legend: CKD chronic kidney disease; n number of cats 41 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija * ) a let( ts ro Sta I II III+IV Kontrolna skupina Slika 1: Starost mačk, vključenih v raziskavo Figure 1: Age of cats included in the study Legenda: * značilna razlika (p ˂ 0,05) v primerjavi z IRIS I (p=0,005), v primerjavi z IRIS II (p=0,010) in v primerjavi z IRIS III+IV (p=0,000); ○ osamelec Legend: * p ˂ 0,05 (control group versus IRIS I, IRIS II, and IRIS III+IV); ○ outlier Med raziskavo je ena mačka poginila zaradi piotoraksa, pri sedmih so se lastniki zaradi hudih kliničnih znakov uremije odločili za evtanazijo. Mačke s CKD smo glede na smernice IRIS (IRIS, 2013a) uvrstili v skupine I‒IV, jih zdravili v skladu s prej omenjenimi smernicami in jim dodajali placebo (mineralno olje) oziroma vitamin E v obliki d-alfa-tokoferil acetata (E-oil, Natural Wealth, Hrvaška) v dozi 100 internacionalnih enot (IE)/mačko/dan. Sedem mačk smo uvrstili v skupino IRIS I, 15 v IRIS II, pet v IRIS III in sedem v IRIS IV. Pri mačkah s CKD smo vzeli podrobno anamnezo, opravili natančen klinični pregled in izmerili arterijski krvni tlak. Lastniki so izpolnili vprašalnik (poglavje 11.1 Vprašalnik). Stopnjo izraženosti kliničnih znakov smo ocenjevali glede na počutje živali, odstotek izgube telesne 42 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija mase, stopnjo dehidracije, prisotnost ulceracij v ustni votlini, pogostnost bruhanja in neješčnost (poglavje 11.2 Pripomoček za oceno izraženosti kliničnih znakov, Tabela 14). Glede na končni seštevek točk smo klinične znake opisali kot blage, zaznavne, hude in nesprejemljive. Počutje živali je ocenil lastnik na podlagi njenega obnašanja: aktivnosti, negovanja, zanimanja za okolico in apetita. Počutje je lastnik opisal kot:  zelo dobro: mačka je zelo igriva, zelo aktivna, se neguje, zanima za okolico, normalen apetit,  dobro: mačka je igriva, aktivna, se neguje, zanima za okolico, normalen apetit,  srednje: mačka je manj igriva, več spi, se manj neguje, zmanjšan apetit,  slabo: mačka ni igriva, ni aktivna, pretežno spi ali leži, se ne neguje, zmanjšan apetit,  zelo slabo: mačka ni igriva, pretežno spi ali leži, se ne neguje, se ne zanima za okolico, neješčnost. Stopnjo dehidracije smo ocenili pri kliničnem pregledu (Frantar, 1997; DiBartola in Bateman, 2012):  ≤ 5 %: ni kliničnih znakov,  5-10 %: srednja; zaznavno zmanjšan kožni turgor, podaljšan čas polnjenosti kapilar, rahlo vdrti očesni bulbusi, suhe sluznice,  10-12 %: zmerna; togost kože, podaljšan čas polnjenosti kapilar, vdrti očesni bulbusi, suhe sluznice,  12-15 %: znaki šoka, pogin. Pri zdravljenju smo upoštevali naslednje smernice zdravljenja po IRIS (IRIS, 2013b): I. stopnja: korekcija dehidracije z dajanjem podkožne ali intravenske infuzije (Hartmannova raztopina Braun, B. Braun, Nemčija), korekcija sistemske hipertenzije z dihidropiridinskim zaviralcem kalcijevih kanalčkov amlodipinom (0,625 mg/mačko na dan, Amlopin; Lek, Slovenija); 43 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija II. stopnja: zdravljenje kot v prvi stopnji, znižanje vnosa fosfatov z dietno prehrano, po potrebi dodajanje vezalcev fosfatov (kalcijev karbonat in hitozan, 1 g/mačko/12h p/o; Ipakitine; Vetoquinol, Francija); III. stopnja: zdravljenje kot v drugi stopnji; preprečevanje bruhanja z dajanjem H2 blokatorjev (ranitidin 3 mg/kg/12h p/o ali i/m; Ranital; Lek, Slovenija) in antiemetikov (maropitant 1 mg/kg/dan s/c ali 2 mg/kg/dan p/o; Cerenia; Zoetis, ZDA); IV. stopnja: zdravljenje kot v tretji stopnji; skrbimo za zadosten vnos kalorij in beljakovin s prehrano ter za primerno hidracijo. V času trajanja klinične raziskave so vse mačke prejemale komercialno dieto Royal Canin Renal (Royal canin, Francija). V primeru uporabe terapevtikov smo pri vseh živalih uporabili enake odmerke. Pri zdravih mačkah smo na začetku raziskave kri odvzeli enkrat in določili izbrane hematološke (krvna slika, diferencialna bela krvna slika in relativno ter absolutno število retikulocitov), biokemijske (sečnina, kreatinin, alkalna fosfataza, holesterol, trigliceridi, alanin aminotransferaza, skupne beljakovine, albumini, kalcij, anorganski fosfat in elektroliti) in urinske parametre (specifična gostota, kemijska analiza z reagenčnim trakom, UPC) ter parametre oksidativnega stresa (koncentracija MDA in proteinskih karbonilov v plazmi, poškodba jedrne DNA limfocitov, izražena kot odstotek DNA v repu kometov) in antioksidantni status (aktivnost plazemske GPX in koncentracija vitamina E v plazmi). Koncentracijo MDA in proteinskih karbonilov smo določili pri devetih živalih. Pri mačkah s CKD smo naštete parametre določili pred začetkom zdravljenja in 4, 8, 16 in 24 tednov po začetku zdravljenja. V Tabeli 3 je prikazano število mačk s CKD po posameznih stopnjah bolezni, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo. Tabeli 4 in 5 prikazujeta število mačk s CKD pri posameznem zaporednem odvzemu vzorcev. 44 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 3: Število mačk s CKD glede na stopnjo po IRIS (IRIS, 2013a) , ki so prejemale vitamin E oz. placebo Table 3: Number of cats with CKD according to the stage of the disease in vitamin E and placebo group Stopnja CKD Placebo Vitamin E I 4 3 II 8 7 III in IV 4 8 Legenda: CKD kronična ledvična odpoved Legend: CKD Chronic Kidney Disease Tabela 4: Število mačk s CKD pri posameznem odvzemu vzorcev Table 4: Number of cats with CKD at different sampling times Zaporedni odvzem vzorcev Stopnja CKD 1 2 3 4 5 I 7 6 6 6 6 II 15 13 10 10 10 III in IV 12 6 4 4 2 Legenda: CKD kronična ledvična odpoved Legend: Chronic Kidney Disease Tabela 5: Število mačk s CKD, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo pri posameznem odvzemu vzorcev Table 5: Number of cats with CKD in vitamin E and placebo group at different sampling times Zaporedni odvzem Stopnja CKD vzorcev I II III in IV Vitamin E 3 7 8 1 Placebo 4 8 4 Vitamin E 2 6 4 2 Placebo 4 7 2 Vitamin E 3 4 3 3 Placebo 3 6 1 Vitamin E 3 6 2 4 Placebo 3 4 2 Vitamin E 3 5 1 5 Placebo 3 5 1 Legenda: CKD kronična ledvična odpoved Legend: Chronic Kidney Disease 45 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3.2.1 Merjenje arterijskega tlaka Arterijski tlak smo merili na prednji desni nogi na sredini podlahti z visoko natančno oscilometrično napravo (angl. High Definition Oscillometry, HDO; S+B MedVet GmbH, Nemčija). Uporabili smo manšeto z oznako c1. Med meritvijo so mačke ležale v stranski legi, manšeta se je nahajala v višini desnega atrija. Pri vsakem pregledu smo izvedli pet zaporednih meritev in iz dobljenih rezultatov izračunali povprečje. 3.3 ODVZEM IN PRIPRAVA VZORCEV KRVI Kri za določanje hematoloških in biokemijskih parametrov ter parametrov oksidativnega stresa in antioksidantnega statusa smo odvzeli iz desne jugularne vene. Za hematološke preiskave in alkalni kometni test smo odvzeli 0,5 mL krvi v 0,5 mL epruvete z antikoagulantom EDTA (BD Microtainer Tubes; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey, ZDA). Po opravljeni hematološki analizi smo vzorec polne krvi do priprave preparatov hranili na temperaturi 4 °C. Preparate smo pripravili v času treh ur po odvzemu vzorca. Alkalni kometni test smo izvajali na Nacionalnem inštitutu za biologijo na Oddelku za genetsko toksikologijo in biologijo raka. Kri za biokemijske preiskave in določitev okužbe z virusoma FeLV in FIV smo istočasno odvzeli 2 mL krvi v 4 mL epruvete z aktivatorjem koagulacije in separacijskim gelom (Vacuette; Greiner Bio-One, Kremsmünster, Avstrija). Kri smo centrifugirali v roku 1 ure po odvzemu 10 minut pri 1300 × g na sobni temperaturi (22 – 24 °C) ter odločili serum. Hematološke in biokemijske preiskave ter določitev okužbe z virusoma FeLV in FIV smo izvajali v Diagnostičnem laboratoriju Klinike za kirurgijo in male živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani na dan odvzema. 46 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Za določitev koncentracije selena v serumu smo 1 mL krvi odvzeli v 1,5 mL plastično epruvetko (Eppendorf Brand, Wertheim, Nemčija). Po odvzemu smo vzorce krvi za 30 min pustili na 4 °C, da je kri koagulirala. Vzorce smo nato centrifugirali pri 1300 × g 10 min pri 4 °C. Tako pridobljen serum smo do analize hranili na ‒80 °C. Analizo smo opravili na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo na Univerzitetnem kliničnem centru v Ljubljani v seriji po zaključku raziskave. Analizo smo opravili največ dve leti po začetku raziskave. Za določanje aktivnosti plazemske in eritrocitne GPX, SOD, TAC in koncentracije vitamina E smo odvzeli 4 mL krvi v dve 2 mL epruveti z antikoagulantom litijevim heparinom (Vacuette; Greiner Bio-One, Kremsmünster, Avstrija). Za določanje plazemskega nivoja TAC, aktivnosti plazemske GPX in koncentracije vitamina E smo kri centrifugirali 15 min pri 1500 × g na 4 °C in plazmo takoj po centrifugiranju odpipetirali ter jo do analize shranili na ‒80 °C. Za določitev eritrocitne GPX in SOD smo po navodilih proizvajalca (Ransod kit; Randox, Crumlin, Velika Britanija) pripravili hemolizate eritrocitov in jih do analize shranili na ‒80 °C. Vse vzorce smo analizirali v seriji po zaključku raziskave. Analizo plazemske in eritrocitne GPX, SOD in TAC v preliminarni raziskavi smo opravili največ dve leti po začetku raziskave, medtem ko smo analizo plazemske GPX in koncentracijo vitamina E v klinični raziskavi opravili največ tri leta in šest mesecev po začetku raziskave. Koncentracijo vitamina E v plazmi smo določali v Laboratoriju za kemijske analize krme na Inštitutu za higieno in patologijo prehrane živili Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani. Aktivnost plazemske in eritrocitne GPX, SOD in TAC smo določali v Diagnostičnem laboratoriju Klinike za kirurgijo in male živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani. Za določitev koncentracije MDA in proteinskih karbonilov v plazmi smo odvzeli 2 mL krvi v 2 mL epruveto z antikoagulantom EDTA (Vacuette; Greiner Bio-One, Kremsmünster, Avstrija). Vzorec smo takoj po odvzemu centrifugirali 15 min pri 1500  g na 4 °C, plazmo razdelili na dva dela in jo do analize hranili pri ‒80 °C. Vzorce smo analizirali v laboratoriju na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani v seriji po zaključku raziskave. Analizo smo opravili največ tri leta in osem mesecev po začetku raziskave. 47 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3.4 ANALIZNE METODE Vse serumske in plazemske vzorce ter vzorce polne krvi, kismo jih hranili na ‒80 °C, smo pred izvajanjem analiznih postopkov počasi odmrznili pri sobni temperaturi in jih dobro premešali na vibracijskem mešalniku. 3.4.1 Hematološke in biokemijske preiskave Hematološke parametre smo določali z avtomatskim hematološkim analizatorjem ADVIA 120 (Siemens, München, Nemčija). Biokemijske parametre seruma smo, z izjemo elektrolitov, določali na biokemijskem analizatorju RX Daytona (Randox, Crumlin, Velika Britanija). Elektrolite smo določali z analizatorjem ILyte (Instrumentation Laboratory, Lexington, ZDA). 3.4.2 Encimsko imunske preiskave Okužbo z virusoma FIV in FeLV smo določali iz seruma s hitrim encimskoimunskim testom (SNAP feline triple; IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ZDA). 3.4.3 Antioksidantni parametri Aktivnost plazemske in eritrocitne GPX, eritrocitne SOD in nivo plazemske TAC smo določali spektrofotometrično na biokemijskem analizatorju RX Daytona (Randox, Crumlin, Velika Britanija). 48 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Koncentracijo hemoglobina v hemolizatu eritrocitov smo določili na biokemijskem analizatorju RX Daytona (Randox, Crumlin, Velika Britanija) spektrofotometrično s hemoglobincianidno metodo (Randox, Crumlin, Velika Britanija). 3.4.3.1 Superoksidna dismutaza Aktivnost SOD smo določali v hemolizatu eritrocitov s pomočjo reagenčnega kompleta Ransod (Ransod kit; Randox, Crumlin, Velika Britanija). Postopek temelji na metodi McCorda in Fridovicha (1967). V reagenčnem kompletu je sistem za proizvodnjo superoksidnih radikalov pripravljen iz ksantina in ksantin oksidaze. Nastali superoksidni radikali reagirajo z indikatorsko spojino 2-(4-jodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-feniltetrazolijevim kloridom (I.N.T), da nastane barvilo formazan. Aktivnost SOD v vzorcih smo merili s stopnjo inhibicije prej omenjene reakcije. Aktivnost SOD smo preračunali na koncentracijo hemoglobina v vzorcu in jo izrazili v enotah na gram hemoglobina (U/g Hgb; U ‒ enote, angl. Units). 3.4.3.2 Plazemska in eritrocitna glutation peroksidaza Aktivnost plazemske in eritrocitne GPX smo določali s pomočjo reagenčnega kompleta Ransel (Ransel kit, Randox, Crumlin, Velika Britanija), ki temelji na metodi Paglie in Valentina (1967). Osnova metode je reakcija, kjer GPX katalizira oksidacijo glutationa s kumen hidroperoksidom. V prisotnosti glutation reduktaze in NADPH se oksidirani glutation pretvori v reducirano obliko, pri čemer se NADPH oksidira v NADP+. Hitrost oksidacije NADPH je proporcionalna aktivnosti GPX in jo izmerimo kot padec absorbance pri valovni dolžini 340 nm. Aktivnost plazemske GPX smo izrazili v U/mL, aktivnost eritrocitne GPX pa smo preračunali na koncentracijo hemoglobina v vzorcu in jo izrazili v U/g Hgb. 49 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3.4.3.3 Celokupna antioksidantna kapaciteta Plazemsko TAC smo določali z reagenčnim kompletom TAS (TAS kit, Randox, Crumlin, Velika Britanija), ki temelji na metodi Millerja in sodelavcev (1993). Gre za metodo posrednega določanja, pri kateri antioksidanti v vzorcu reducirajo v reakciji nastale proste radikale (ABTS*+- 2,2'–azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat)), kar izmerimo kot zmanjšanje absorbance pri valovni dolžini 600 nm po 3 min. Rezultate smo izrazili kot mmol/L Trolox ekvivalenta. 3.4.4 Vitamin E Pred meritvijo smo vzorce plazme obdelali po postopku, povzetem po literaturi (Zhao in sod. 2004, Sivertsen in sod. 2005). Vzorcem smo dodali etanol, ki je povzročil precipitacijo beljakovin. Tokoferole smo nato ekstrahirali z dodatkom heksana, centrifugirali in odstranili supernatant, ki smo ga posušili. Suhi preostanek smo raztopili v metanolu in koncentracijo vitamina E določili z metodo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (angl. High Performance Liquid Chromatography, HPLC) in s fluorescenčnim detektorjem. Meritve smo izvedli z analizatorjem Alliance HPLC System 2695 (Waters, Milford, Massachusetts, ZDA). Izmerjeno koncentracijo vitamina E smo standardizirali na vsoto koncentracij holesterola in trigliceridov (Vit.E(LS) – lipidno standardizirana koncentracija vitamina E) v serumu (Thurnham in sod., 1986; Winbauer in sod., 1999). 3.4.5 Koncentracija selena v serumu Koncentracijo selena v serumu smo merili z elektrotermalno atomsko absorpcijsko spektrometrijo (angl. Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry, ETAAS) z elektrotermalnim atomskim absorpcijskim spektrometrom Varian Spektr AA-800 (Varian 50 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Australia Pty Ltd.,Mulgrave, Victoria, Avstralija). 3.4.6 Pokazatelji oksidativnega stresa 3.4.6.1 Malondialdehid Vzorce plazme za določanje celokupnega MDA smo pred meritvijo derivatizirali z 2,4- dinitrofenilhidrazinom (2,4-DNPH), povzeto po literaturi (Pilz in sod., 2000). MDA in 2,4- DNPH reagirata, pri čemer nastane pirazolski derivat. Produkt smo določali z metodo HPLC in metodo ionizacije z razprševanjem raztopin v električnem polju oz. elektrorazprševalno ionizacijo(angl. electrospray ionization, ESI). Meritve smo izvedli z analizatorjem Agilent 6460 (Agilent Technologies, Santa Clara, ZDA) s trojnim kvadrupolnim MS/MS detektorjem. 3.4.6.2 Proteinski karbonili Oksidativne poškodbe proteinov smo določali spektrofotometrično s komercialno dostopnim reagenčnim kompletom za določanje koncentracije proteinskih karbonilnih skupin (Protein carbonyl assay kit, Cayman Chemical, ZDA), ki temelji na metodi Levina in sodelavcev (1994). Proteinski karbonili reagirajo z 2,4-DNPH. Nastane spojina hidrazonski derivat, katerega koncentracijo smo določili spektrofotometrično z mikrotiterskim čitalcem Safire2TM Genios, (Tecan, Genios, Zürich, Švica) pri valovni dolžini 380 nm. 3.4.6.3 Alkalni kometni test Stopnjo poškodb DNA v limfocitih smo določali z alkalno različico testa komet (Östling in Johanson 1984, Singh in sod., 1988). V postopku priprave celic membrane in vsebino razgradimo pri visokem pH (10) v prisotnosti detergentov ter na ta način izoliramo DNA iz jeder limfocitov. 51 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija DNA, ki je negativno nabita v električnem polju, v alkalnem mediju potuje proti pozitivnemu polu. Bolj je DNA poškodovana, več je prepotuje v tako imenovan rep kometa. S pomočjo fluorescenčnega mikroskopa in z računalniškim programom za analizo slike ovrednotimo poškodbe DNA glede na jakost fluorescence v repu. Bolj je DNA poškodovana, več DNA je v repu kometa. 3.4.6.3.1 Priprava pufrov Raztopina za liziranje celic: za 100 mL raztopine za liziranje smo odtehtali 14,6 g NaCl, 3,72 g EDTA, 0,12 g Tris-HCl. pH smo uravnali na 10 z 10 M NaOH. Tik pred uporabo smo dodali 1 % Triton X 100. Raztopino smo pred uporabo ohladili na 4 °C. Elektroforetski pufer: 1 L elektroforetskega pufra smo pripravili tako, da smo zmešali 5 mL 0.2 M EDTA, 30 mL 10 M NaOH in do 1 L dolili destilirano vodo, ohlajeno na 4 °C. Nevtralizacijski pufer: za 200 mL nevtralizacijskega pufra smo zatehtali 9,67 g Tris-HCl ter s pomočjo HCl uravnali pH na 7,5. Pred uporabo smo nevtralizacijski pufer ohladili na 4 °C. 3.4.6.3.2 Priprava preparatov Peskana objektna stekelca smo razmastili tako, da smo jih vsaj za 3 ure namočili v metanol. Nato smo jih z ožiganjem posušili. Nanje smo nanesli plast 1% NMP agaroze (80 μL; Ultrapure Agarose Invitrogen; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, ZDA) ter jo pokrili s krovnim stekelcem. Stekelca smo položili v hladilnik, da se je agaroza strdila, nato smo krovna stekelca previdno odstranili. Nato smo zmešali 10 μL EDTA krvi in 1% LMP agarozo (70 μL; Ultrapure LMP Agarose Invitrogen; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, ZDA) ter suspenzijo 70 μL nanesli na prvo plast agaroze ter jo pokrili s krovnim stekelcem. Preparate smo ponovno dali v hladilnik in krovna stekelca odstranili, ko se je druga plast agaroze strdila. Tako pripravljene preparate smo zaščitili pred svetlobo in jih na temperaturi 4 °C čez noč inkubirali v raztopini za liziranje celic. 52 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3.4.6.3.3 Odvijanje DNA in elektroforeza Stekelca smo naložili v kadičko za elektroforezo in dolili sveže pripravljen, na 4 °C ohlajen elektroforetski pufer (1,25 L). Nato smo 20 min počakali, da poteče alkalna denaturacija DNA. Elektroforeza je potekala 20 min pri napetosti 0,5‒1 V/cm pri temperaturi 4 °C. 3.4.6.3.4 Nevtralizacija preparatov Preparate smo nato nevtralizirali s 15-minutno inkubacijo v hladnem nevtralizacijskem pufru. Preparate smo do računalniške obdelave shranili pri 4 °C in vlažni atmosferi. 3.4.6.3.5 Ovrednotenje poškodb DNA Naslednji dan smo DNA pobarvali tako, da smo na vsak gel nanesli 20 μL etidijevega bromida (5 μg/mL d.H O). Etidijev bromid je agens, ki se vrine med DNA bazne pare in na ta način 2 omogoča vizualizacijo DNA s pomočjo fluorescenčnega mikroskopa. Preparate smo nato pri 400 x povečavi pregledali s fluorescenčnim mikroskopom (Nikon Eclipse E 800 in Nikon Intensilight C-HGFI; oboje Nikon, Tokio, Japonska) in s pomočjo računalniškega programa za analizo slike Comet Assay IV (Perceptive instruments Ltd., Bury St Edmunds Velika Britanija) ovrednotili poškodbe DNA, tako da smo izmerili odstotek jedrne DNA, ki se je nahajala v repu kometov. Pri vsakem vzorcu smo ovrednotili 150 celičnih jeder. 3.4.7 Preiskave urina V sterilno odvzetih urinskih vzorcih smo določili specifično gostoto z refraktometrom, opravili kemijsko analizo urina z reagenčnim trakom z urinskim analizatorjem Clinitek status Plus (Siemens, München, Nemčija) ter urin centrifugirali pri 800  g 10 min na sobni temperaturi. 53 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Nato smo mikroskopsko pregledali urinski sediment in kvantitativno določili koncentracijo beljakovin in kreatinina v supernatantu urina z biokemijskem analizatorjem RX Daytona (Randox, Crumlin, Velika Britanija) ter izračunali razmerje med beljakovinami in kreatininom (UPC). 3.5 STATISTIČNA ANALIZA V okviru preliminarne raziskave, je statistična analiza vključevala obdelavo podatkov kontrolne skupine mačk in posameznih skupin mačk s CKD (skupine IRIS I do IRIS IV). Rezultate smo analizirali s pomočjo računalniškega programa SPSS (SPSS 17.0 for Windows, IBM, Chicago, Illinois, ZDA). Normalnost porazdelitve podatkov smo ugotavljali s Shapiro Wilkovim testom. Rezultate smo podali kot povprečje ± standardni odklon (SD, angl. Standard Deviation). Koncentracijo selena v serumu, aktivnost SOD, plazemske in eritrocitne GPX in plazemski nivo TAC smo primerjali med kontrolno skupino in posameznimi skupinami CKD. Pri tem smo uporabili enosmerno analizo variance za neodvisne vzorce (one-way ANOVA) in Tukeyjev HSD post-hoc test. Kot statistično značilne smo opredelili rezultate pri p ˂ 0,05. V okviru klinične raziskave je statistična analiza vključevala primerjavo rezultatov pri vseh mačkah s CKD z rezultati pri kontrolni skupini na začetku raziskave in primerjavo rezultatov pri skupini, ki je prejemala vitamin E s skupino, ki je prejemala placebo. Nadalje smo primerjali rezultate med posameznimi stopnjami CKD na začetku raziskave. Zaradi majhnega števila živali smo paciente v IRIS III in IV obravnavali skupaj. V primeru testa komet smo zaradi majhnega števila živali paciente v IRIS I in II ter paciente v IRIS III in IV obravnavali skupaj. Za dodatno vrednotenje razlik v koncentraciji MDA, smo, na začetku raziskave, paciente v IRIS I in II ter paciente v IRIS III in IV obravnavali skupaj. Pri rezultatih testa komet smo primerjali IRIS I in II z IRIS III in IV ter s kontrolno skupino. Seštevek kliničnih znakov (Tabela 14) in koncentracijo vitamina E smo primerjali med posameznimi stopnjami CKD glede na zaporedni odvzem vzorcev in glede na to, ali so mačke prejemale vitamin E ali placebo. 54 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Za vse skupine smo za hematološke in biokemijske parametre, sistolični krvni tlak, specifično gostoto urina, UPC ter za parametre antioksidantnega statusa ter oksidativnega stresa izračunali tudi povprečno vrednost in standardno deviacijo, pri analizi rezultatov testa komet smo uporabili mediano vrednost. Za analizo podatkov klinične raziskave ter izračun vpliva vitamina E na verjetnost preživetja smo uporabili računalniški program R (R Core Team, 2015). Del rezultatov klinične raziskave smo analizirali s pomočjo računalniškega programa SPSS (SPSS 22.0 for Windows, IBM, Chicago, Illinois, ZDA). V primeru primerjave parametrov med dvema neodvisnima skupinama (placebo in vitamin E) smo pri vseh skupinah mačk s CKD (IRIS I, II in III+IV) pri posameznih odvzemih uporabili Mann-Whitneyjev test. V primeru primerjave merjenih parametrov med tremi in več skupinami (kontrolna skupina, IRIS I, II in III+IV) smo izvedli Kruskal-Wallisov H test in post-hoc analizo parnih primerjav ter pri tem upoštevali popravljene p vrednosti. Primerjavo parametrov med začetkom in koncem dajanja placeba oziroma vitamina E (prvi in zadnji odvzem vzorcev) smo v posamezni skupini (placebo oziroma vitamin E) pri vseh stopnjah bolezni (IRIS I, IRIS II in IRIS III+IV) vrednotili z Wilcoxonovim testom vsote rangov. Pri tem smo uporabili računalniški program SPSS (SPSS 22.0 for Windows, IBM, Chicago, Illinois, ZDA). Kot statistično značilne smo opredelili rezultate pri p ≤ 0,05. Rezultate smo grafično prikazali z okvirji z ročaji, ki zajemajo območje vrednosti med 5 in 95 percentilom, ki je razdeljeno na:  okvir, ki vključuje vrednosti znotraj 2. in 3. kvartila  odebeljeno vodoravno črto v sivem okvirju, ki je mediana vrednost in  ročaje, ki predstavljajo spodnjih in zgornjih 25 % vrednosti. Točke so vrednosti, ki so izven območja 5 – 95 percentila. Osamelci so prikazani s krožcem oziroma piko (○ ali •). 55 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 4 REZULTATI 4.1 PRELIMINARNA RAZISKAVA Rezultati preliminarne raziskave, z izjemo rezultatov aktivnosti SOD, so objavljeni v članku Krofič Žel in sod. (2014). Rezultate preliminarne raziskave prikazuje Tabela 6. Koncentracija selena v serumu, aktivnost eritrocitne GPX in SOD ter nivo plazemske TAC se pri mačkah s CKD pri primerjavi s kontrolno skupino niso značilno razlikovale. Tudi pri primerjavi omenjenih parametrov med posameznimi stopnjami CKD ni bilo značilnih razlik. Mačke v IRIS IV so imele značilno večjo (p = 0,025) aktivnost plazemske GPX kot mačke v kontrolni skupini. Pri primerjavi aktivnosti plazemske GPX med kontrolno skupino in stopnjami CKD I-III ter med posameznimi stopnjami CKD ni bilo značilnih razlik. 56 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 6: Koncentracija selena v serumu, aktivnost plazemske in eritrocitne GPX ter eritrocitne SOD in plazemska TAC pri mačkah s CKD in kontrolni skupini v preliminarni raziskavi Table 6: Serum selenium concentration, plasma and erythrocyte GPX activity, plasma TAC, and erythrocyte SOD activity in cats with CKD and in the control group in the preliminary study Selen Plazemska Eritrocitna TAC SOD (mg/L) GPX GPX (mmol/L) (U/g Hgb) (U/mL) (U/gHgb) IRIS I 0,465 ± 0,053 21,86 ± 2,04 591,18 ± 56,74 1,47 ± 0,18 3540,10 ± 302,21 (n=5) p vrednost (primerjava s kontrolno 0,807 0,534 1,000 0,990 0,434 skupino) p vrednost (primerjava z IRIS II) 0,934 0,913 0,998 1,000 0,982 p vrednost (primerjava z IRIS III) 0,904 1,000 1,000 0,581 0,581 p vrednost (primerjava z IRIS IV) 0,833 0,719 0,960 0,954 0,556 IRIS II 0,426 ± 0,042 18,67 ± 1,66 582,51 ± 80,79 1,46 ± 0,16 3364,95 ± 137,09 (n=9) p vrednost (primerjava s kontrolno 0,999 0,940 1,000 0,964 0,505 skupino) p vrednost (primerjava z IRIS I) 0,934 0,912 0,998 1,000 0,982 p vrednost (primerjava z IRIS III) 1,000 0,912 0,992 0,482 0,734 p vrednost (primerjava z IRIS IV) 0,994 0,175 0,818 0,916 0,705 IRIS III 0,419 ± 0,173 20,87 ± 2,56 603,92 ± 64,42 1,30 ± 0,13 2995,84 ± 214,74 (n=7) p vrednost (primerjava s kontrolno 1,000 0,464 0,998 0,134 1,000 skupino) p vrednost (primerjava z IRIS I) 0,904 1,000 1,000 0,581 0,581 p vrednost (primerjava z IRIS II) 1,000 0,912 0,992 0,482 0,734 p vrednost (primerjava z IRIS IV) 0,991 0,612 0,967 0,232 1,000 IRIS IV 0,404 ± 0,077 23,44 ± 6,28 639,81 ± 27,78 1,68 ± 0,40 3002,73 ± 176,98 (n=5) p vrednost (primerjava s kontrolno 0,999 0,025* 0,840 0,992 1,000 skupino) p vrednost (primerjava z IRIS I) 0,833 0,719 0,960 0,954 0,556 p vrednost (primerjava z IRIS II) 0,994 0,175 0,818 0,916 0,705 p vrednost (primerjava z IRIS III) 0,999 0,612 0,967 0,232 1,000 Kontrolna skupina 0,415 ± 0,091 17,51 ± 3,75 591,0 ± 111,21 1,51 ± 0,17 3021,88 ± 143,63 (n=19) Legenda: * p ˂ 0,05; CKD kronična ledvična odpoved; GPX glutation peroksidaza; SOD superoksidna dismutaza; TAC celokupna antioksidantna kapaciteta; n število mačk Legend: *p ˂ 0,05; CKD chronic kidney disease; GPX glutathione peroxidase; SOD superoxide dismutase; TAC total antioxidant capacity; n number of cats 57 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 4.2 KLINIČNA RAZISKAVA 4.2.1 Parametri oksidativnega stresa in antioksidantnega statusa 4.2.1.1 Malondialdehid Koncentracija MDA se med mačkami s CKD in kontrolno skupino na začetku raziskave ni značilno razlikovala (Slika 2). ) Ll/ µmo( DA M CKD Kontrolna skupina Slika 2: Koncentracija MDA (µmol/L) pri mačkah s CKD in kontrolni skupini na začetku raziskave Figure 2: MDA (µmol/L) concentration in cats with CKD and in the control group at the beginning of the study Legenda: CKD kronična ledvična odpoved, MDA malondialdehid Legend: CKD Chronic Kidney Disease, MDA Malondialdehyde 58 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Prav tako se koncentracija MDA na začetku raziskave ni značilno razlikovala med mačkami, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo (Slika 3). ) Ll/ µmo( DA M Placebo Vitamin E Slika 3: Koncentracija MDA (µmol/L) pri mačkah, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo na začetku raziskave Figure 3: MDA concentration (µmol/L) in the vitamin E and placebo group at the beginning of the study Legenda: MDA malondialdehid; • osamelec Legend: MDA Malondialdehyde; • outlier Mačke v IRIS III in IV so imele na začetku raziskave nižjo koncentracijo MDA kot tiste v IRIS I in II, vendar razlika ni bila značilna (Slika 4). Razlika je bila značilna (p = 0,037), če smo mačke v IRIS I in II (n = 16) obravnavali skupaj (Slika 5) pri primerjavi s skupino IRIS III+IV (n = 9). 59 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija ) l/L µmo (ADM I II III+IV Slika 4: Koncentracija MDA (µmol/L) pri mačkah s CKD glede na stopnjo bolezni na začetku raziskave Figure 4: MDA (µmol/L) concentration in cats with CKD according to the stage of the disease at the beginning of the study Legenda: MDA malondialdehid; • osamelec Legend: MDA Malondialdehyde; • outlier * ) Ll/ µmo( DA M I+II III+IV Slika 5: Koncentracija MDA (µmol/L) pri mačkah s CKD glede na stopnjo bolezni na začetku raziskave (združeni IRIS I in II v primerjavi z III in IV skupino) Figure 5: MDA (µmol/L) concentration in cats with CKD according to the stage of the disease at the beginning of the study (IRIS I and II together in comparison to III and IV) Legenda: * p ˂ 0,05; MDA malondialdehid; • osamelec Legend: * p ˂ 0,05; MDA Malondialdehyde; • outlier 60 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Pri mačkah s CKD IRIS I, II, III in IV se je v skupini, ki je dobivala placebo, koncentracija MDA v primerjavi med prvim in zadnjim odvzemom vzorcev povečala, in sicer najbolj v skupini IRIS III in IV (na 165 % začetne vrednosti). Razlika ni bila značilna. Pri mačkah, ki so dobivale vitamin E, se je v I. skupini po IRIS koncentracija MDA zmanjšala za 12 % prvotne vrednosti, pri mačkah v II. skupini po IRIS je ostala nespremenjena, medtem ko se je pri mačkah v III. in IV. skupini po 16 tednih dajanja vitamina E povečala na 118 % začetne vrednosti. Razlike niso bile značilne. Tudi pri primerjavi vrednosti na koncu raziskave (oziroma po 16 tednih pri skupini IRIS III+IV) med skupinama placebo in vitamin E razlika pri nobeni skupini (IRIS I, II in III+IV) ni bila značilna. Rezultate prikazujejo Tabele 7, 8 in 9. Tabela 7: Parametri oksidativnega stresa in antioksidantnega statusa (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS I Table 7: Parameters of oxidative stress and antioxidant status (mean ± SD) in cats with CKD IRIS I plazemska GPX MDA Proteinski karbonili Odvzem (U/mL) (μM) (nmol/mL) Vitamin E in placebo 1 21,06 ± 1,50 3,66 ± 0,30 33,30 ± 12,30 n=7 Vitamin E 20,40 ± 1,30 4,03 ± 1,25 33,00 ± 6,30 n=2 2 Placebo 20,87 ± 1,86 2,90 ± 0,85 24,20 ± 1,62 n=4 Vitamin E 21,04 ± 2,25 4,79 ± 1,42 26,10 ± 6,90 n=3 3 Placebo 21,40 ± 1,94 3,79 ± 0,07 28,80 ± 5,33 n=3 Vitamin E 20,77 ± 3,46 3,95 ± 1,25 37,50 ± 13,10 n=3 4 Placebo 20,11 ± 2,39 2,89 ± 0,67 43,52 ± 10,40 n=3 Vitamin E 21,29 ± 2,47 3,24 ± 1,23 30,40 ± 10,9 n=3 5 Placebo 21,08 ± 0,28 3,96 ± 1,01 26,72 ± 12,62 n=3 Legenda: SD standardna deviacija; GPX glutation peroksidaza; MDA malondialdehid; n število mačk Legend: SD Standard Deviation; GPX Glutathione Peroxidase; MDA Malondialdehyd; n number of cats 61 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 8: Parametri oksidativnega stresa in antioksidantnega statusa (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS II Table 8: Parameters of oxidative stress and antioxidant status (mean ± SD) in cats with CKD IRIS II plazemska GPX MDA Proteinski karbonili Odvzem (U/mL) (μM) (nmol/mL) Vitamin E in placebo 1 19,90 ± 2,79 3,86 ± 1,12 35,20 ± 9,82 n=15 Vitamin E 22,20 ± 3,27 3,90 ± 0,59 35,0 ± 12,40 n=6 2 Placebo 19,99 ± 4,49 3,66 ± 0,72 34,94 ± 10,68 n=7 Vitamin E 21,36 ± 4,12 3,15 ± 0,82 33,47 ± 4,02 n=4 3 Placebo 20,87 ± 4,31 4,22 ± 0,66 32,19 ± 9,81 n=6 Vitamin E 21,59 ± 3,13 3,59 ± 0,84 31,40 ± 9,35 n=6 4 Placebo 17,67 ± 2,31 3,56 ± 0,70 40,16 ± 12,25 n=4 Vitamin E 22,78 ± 1,61 3,85 ± 0,73 30,59 ± 7,57 n=5 5 Placebo 22,46 ± 3,62 4,06 ± 1,56 44,15 ± 14,04 n=5 Legenda: SD standardna deviacija; GPX glutation peroksidaza; MDA malondialdehid; n število mačk Legend: SD Standard Deviation; GPX Glutathione Peroxidase; MDA Malondialdehyde; n number of cats 62 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 9: Parametri oksidativnega stresa in antioksidantnega statusa (povprečje ± SD; vrednost pri n = 1) pri mačkah s CKD IRIS III in IV Table 9: Parameters of oxidative stress and antioxidant status (mean ± SD; value if n = 1) in cats with CKD IRIS III and IV plazemska GPX MDA Proteinski karbonili Odvzem (U/mL) (μM) (nmol/mL) Vitamin E in placebo 1 22,76 ± 7,92 2,76 ± 0,4 29,11 ± 8,69 n=12 Vitamin E 19,61 ± 0,27 2,82 ± 0,29 38,52 ± 9,32 n=4 2 Placebo 16,24 ± 2,5 6,12 ± 3,92 24,11 ± 8,58 n=2 Vitamin E 17,5 ± 3,98 5,0 ± 0,57 27,9 ± 11,49 n=3 3 Placebo 22,9 3,41 39,4 n=1 Vitamin E 24,52 ± 3,08 3,25 ± 0,3 44,86 ± 12,76 n=2 4 Placebo 21,21 ± 0,1 3,98 ± 0,36 47,85 ± 21,94 n=2 Vitamin E 20,52 3,48 58,7 n=1 5 Placebo 23,73 4,56 37,8 n=1 Legenda: SD standardna deviacija; GPX glutation peroksidaza; MDA malondialdehid; n število mačk Legend: SD Standard Deviation; GPX Glutathione Peroxidase; MDA Malondialdehyde; n number of cats 4.2.1.2 Proteinski karbonili Koncentracija proteinskih karbonilov je bila na začetku raziskave pri mačkah s CKD večja kot pri mačkah v kontrolni skupini, vendar razlika ni bila značilna (Slika 6). 63 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija ) mLl/ moni ( nil rbo ki ka einst roP CKD Kontrolna skupina Slika 6: Koncentracija proteinskih karbonilov (nmol/mL) pri mačkah s CKD in kontrolni skupini na začetku raziskave Figure 6: Protein carbonyl concentration (nmol/mL) in cats with CKD and in the control group at the beginning of the study Legenda: CKD kronična ledvična odpoved Legend: CKDChronic Kidney Disease Na začetku raziskave se koncentracija proteinskih karbonilov med mačkami, ki so prejemale vitamin E, in tistimi, ki so prejemale placebo, ni značilno razlikovala (Slika 7). ) mLl/ moni ( nil rbo ki ka einst roP Placebo Vitamin E Slika 7: Koncentracija proteinskih karbonilov (nmol/mL) pri mačkah, ki so prejemale placebo oziroma vitamin E na začetku raziskave Figure 7: Protein carbonyl concentration (nmol/mL) in the placebo and vitamin E group at the beginning of the study Legenda: • osamelec Legend: • outlier 64 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Koncentracija proteinskih karbonilov v plazmi se na začetku raziskave med mačkami v posameznih stopnjah bolezni po IRIS ni značilno razlikovala (Slika 8). ) mLl/ moni ( nil rbo ki ka einst roP I II III+IV Slika 8: Koncentracija proteinskih karbonilov (nmol/mL) pri mačkah s CKD glede na stopnjo bolezni na začetku raziskave Figure 8: Protein carbonyl concentration (nmol/mL) in cats with CKD according to the stage of the disease at the beginning of the study Legenda: • osamelec Legend: • outlier Koncentracija proteinskih karbonilov v plazmi se je pri mačkah v I. skupini po IRIS v placebo skupini 24 tednov po začetku klinične raziskave glede na prvi odvzem zmanjšala za 20 %, medtem ko se je pri mačkah, ki so prejemale vitamin E, zmanjšala za 9 % (Tabela 7). Razlika v nobenem primeru ni bila značilna. Tudi pri primerjavi koncentracije proteinskih karbonilov na koncu raziskave med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. Pri mačkah v II. stopnji po IRIS, ki so dobivale placebo, se je po 24 tednih koncentracija proteinskih karbonilov povečala na 125 % začetne vrednosti. Mačke, ki so prejemale vitamin E, so imele na koncu raziskave za 13 % nižjo koncentracijo proteinskih karbonilov kot pri prvem odvzemu vzorcev. Razlika v nobenem primeru ni bila značilna. 65 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Pri mačkah v III. in IV. stopnji po IRIS se je po 16 tednih (pri četrtem odvzemu) koncentracija proteinskih karbonilov povečala pri placebo skupini na 164 % začetne vrednosti, pri mačkah, ki so prejemale vitamin E, pa na 154 % začetne vrednosti. Razlika v nobenem primeru ni bila značilna. Tudi pri primerjavi koncentracije proteinskih karbonilov po 16 tednih med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. Rezultati so prikazani v Tabeli 9. 4.2.1.3 Aktivnost plazemske glutation peroksidaze Na začetku raziskave je bila aktivnost plazemske GPX največja pri mačkah z IRIS I in najnižja pri mačkah z IRIS III in IV, vendar razlika ni bila značilna (Slika 9). ) U/mL( X PG I II III+IV Slika 9: Aktivnost plazemske GPX (U/mL) pri mačkah s CKD glede na stopnjo bolezni na začetku raziskave Figure 9: Plasma GPX activity (U/mL) in cats with CKD according to the stage of the disease at the beginning of the study Legenda: GPX glutation peroksidaza; • osamelec Legend: GPX Glutathione Peroxidase; • outlier 66 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Pri mačkah v IRIS I se aktivnost plazemske GPX v primerjavi med prvim in zadnjim odvzemom (24 tednov po začetku raziskave) ni značilno spremenila niti pri placebo skupini niti pri skupini, ki je prejemala vitamin E (Tabela 7). Tudi pri primerjavi aktivnosti plazemske GPX na koncu raziskave med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. Pri mačkah v IRIS II se je v primerjavi med prvim in zadnjim odvzemom vzorcev 24 tednov po začetku raziskave aktivnost plazemske GPX povečala. Pri skupini, ki je dobivala placebo, se je aktivnost tega encima povečala na 114 %, in v skupini, ki je prejemala vitamin E, na 113 % začetne aktivnosti (Tabela 8). Razlika v nobenem primeru ni bila značilna. Tudi pri primerjavi aktivnosti plazemske GPX na koncu raziskave med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. Aktivnost plazemske GPX se je pri mačkah v III. in IV. skupini po IRIS, ki so prejemale placebo, v primerjavi med prvim in četrtim odvzemom vzorcev 16 tednov po začetku raziskave zmanjšala za 17 %. V skupini, ki je prejemala vitamin E, se je aktivnost tega encima povečala za 7 % (Tabela 9). Razlika v nobenem primeru ni bila značilna. Tudi pri primerjavi aktivnosti plazemske GPX po 16 tednih med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. 4.2.1.4 Poškodbe DNA Mačke v kontrolni skupini so imele značilno višji odstotek jedrne DNA v repu kometov kot mačke s CKD ne glede na stopnjo bolezni (p = 0,05) (Slika 10). 67 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija I + II čk ma III+ ilo IV v Šte Ko ntrolna sk . % DNA v repu Slika 10: Odstotek DNA v repu kometov pri mačkah s CKD in kontrolni skupini na začetku raziskave Figure 10: Percentage of DNA in tail in cats with CKD and in the control group at the beginning of the study Na začetku raziskave odvzemu ni bilo značilne razlike v odstotku jedrne DNA v repu kometov med skupino mačk, ki so prejemale vitamin E, in tistimi, ki so prejemale placebo (Slika 11). pure v DNA % Placebo Vitamin E Slika 11: Odstotek DNA v repu kometov pri mačkah, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo na začetku raziskave Figure 11: Percentage DNA in tail in cats in the vitamin E and placebo group at the beginning of the study Legenda: • osamelec Legend: • outlier 68 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Mačke v IRIS III in IV so imele nižji odstotek jedrne DNA v repu kometov kot mačke v IRIS I in II, vendar razlika ni bila značilna (Slika 12). Odstotek jedrne DNA v repu kometov se med mačkami, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo, znotraj posameznih skupin po IRIS na začetku raziskave ni razlikoval (Slika 12). I+II III+IV pure v DNA % Placebo Vitamin E Placebo Vitamin E Slika 12: Odstotek DNA v repu pri mačkah s CKD, ki so dobivale vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo bolezni na začetku raziskave Figure 12: Percentage of DNA in tail in cats with CKD in the vitamin E and placebo group according to the stage of the disease at the beginning of the study Legenda: • osamelec Legend: • outlier 69 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Pri primerjavi med prvim in zadnjim odvzemom 24 tednov po začetku raziskave se je pri mačkah s CKD IRIS I in II odstotek DNA v repu kometov povečal v placebo skupini in skupini, ki je prejemala vitamin E. Pri mačkah s CKD IRIS III in IV se je odstotek DNA v repu kometov v primerjavi med prvim in četrtim odvzemom vzorcev 16 tednov po začetku raziskave zmanjšal ne glede na to, ali so prejemale placebo ali vitamin E. Rezultati so prikazani na Sliki 13. Placebo Vitamin E I+II pure v DNA % III+IV Zaporedna meritev Slika 13: Odstotek DNA v repu kometov izoliranih limfocitov pri mačkah, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo CKD in zaporedni odvzem vzorcev Figure 13: Percentage of DNA in comet tail of isolated lymphocytes at different sampling times in vitamin E and placebo group in cats with CKD according to the stage of the disease Legenda: • osamelec Legend: • outlier 70 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 4.2.1.5 Vitamin E Koncentracija vitamina E se na začetku raziskave med kontrolno skupino, placebo skupino in skupino, ki je prejemala vitamin E, ni značilno razlikovala. Koncentracija vitamina E v plazmi se je pri vseh skupinah mačk s CKD, ki so prejemale vitamin E, pri vseh vzorčenjih povečala vendar razlike niso bile značilne. Pri primerjavi koncentracije vitamina E po posamenih stopnjah CKD med skupinama placebo in vitamin E pri nobenem odvzemu nismo ugotovili značilnih razlik (Slika 14). Razlika v koncentraciji je bila značilna pri primerjavi med skupino placebo in skupino, ki je prejemala vitamin E, če smo združili mačke v vseh stopnjah CKD. Značilni porast koncentracije vitamina E smo ugotovili v skupini, ki je ta vitamin prejemala, in sicer sicer štiri (p = 0,013) in osem (p = 0,017) tednov po začetku dajanja vitamina E. Razlika na koncu raziskave (po 24 tednih) ni bila značilna (p = 0,074, Slika 15). 71 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija I II III+IV Placebo ) L l/ μmo( E mina Vit Vit amin E Zaporedna meritev Slika 14: Koncentracija vitamina E v plazmi (μmol/L) pri skupini, ki je prejemala vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo CKD in zaporedni odvzem vzorcev Figure 14: Plasma vitamin E concentration (μmol/L) at different sampling times in vitamin E and placebo group in cats with CKD according to the stage of the disease Legenda: • osamelec Legend: • outlier 72 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija * ) Z L a l/ po * re μmo( dn E a merit mina ev Vit Kontrolna Placebo Vitamin E skupina Slika 15: Koncentracija vitamina E v plazmi (μmol/L) pri kontrolni skupini in skupini, ki je prejemala vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo CKD in zaporedni odvzem vzorcev Figure 15: Plasma vitamin E concentration (μmol/L) at different sampling times in the control group, vitamin E, and placebo group in cats with CKD according to the stage of the disease Legenda: * p˂0,05 (placebo skupina v primerjavi s skupino vitamin E); • osamelec Legend: * p˂0,05 (placebo group versus vitamin E group); • outlier Slika 16 prikazuje plazemsko koncentracije vitamina E, standardizirano na koncentracijo lipidov v serumu pri mačkah, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo, glede na stopnjo CKD in zaporedni odvzem vzorcev. Koncentracija vitamina E se na začetku raziskave med placebo skupino in skupino, ki je prejemala vitamin E, pri nobeni stopnji ni značilno razlikovala. Koncentracija lipidno standardiziranega vitamina E v plazmi se je po dajanju vitamina E pri vseh skupinah mačk s CKD, ki so prejemale vitamin E, pri vseh vzorčenjih povečala (Slika 16). Pri primerjavi lipidno standardizirane koncentracije vitamina E po posamenih stopnjah CKD med skupino placebo in skupino, ki je prejemala vitamin E, smo značilno razliko ugotovili le pri 73 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija mačkah v IRIS II štiri (p = 0,041) in osem tednov (p = 0,038) po začetku dajanja vitamina E. Pri mačkah v IRIS I in IRIS III ter IV nismo ugotovili značilnih razlik med skupinama placebo in vitamin E pri nobenem odvzemu (Slika 16). Na Sliki 17 je prikazana plazemska koncentracija vitamina E, standardizirana na koncentracijo lipidov pri placebo skupini in skupini, ki je prejemala vitamin E, glede na zaporedni odvzem, po tem, ko smo združili mačke v vseh stopnjah CKD. Na začetku raziskave med skupinama placebo in vitamin E ni bilo razlik (p = 0,069); značilno razliko med skupinama smo ugotovili štiri tedne (p = 0,001) in osem tednov (p = 0,007) po začetku dajanja vitamina E. Razlika med skupinama placebo in vitamin E na koncu raziskave (po 24 tednih) je bila na meji značilnosti (p = 0,077). I II III+IV Pla e)t cebo eno brez(3 -01 × S) L Vit ( * * E. amin Vit E Zaporedna meritev Slika 16: Standardizirana koncentracija vitamina E (Vit.E(LS); brez enote) pri skupini, ki je prejemala vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo CKD in zaporedni odvzem vzorcev Figure 16: Standardized plasma vitamin E concentration (unitless) in successive measurements in vitamin E and placebo group according to the stage of the disease Legenda: Vit.E(LS) lipidno standardizirana koncentracija vitamina E; * p ˂ 0,05 (skupina placebo v primerjavi s skupino, ki je prejemala vitamin E); • osamelec Legend: Vit.E(LS) lipid-standardized vitamin E concentration; * p ˂ 0,05 (placebo group versus vitamin E group); • outlier 74 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija * e)t Z eno apo * re brez( dn 3 - 0 a 1 merit × S) L( ev E. Vit Placebo Vitamin E Slika 17: Standardizirana koncentracija vitamina E (Vit.E(LS); brez enote) pri skupini, ki je prejemala vitamin E oziroma placebo glede na zaporedni odvzem vzorcev Figure 17: Standardized plasma vitamin E concentration (unitless) in successive measurements in vitamin E and placebo group Legenda: * p ˂ 0,05 (skupina placebo v primerjavi s skupino, ki je prejemala vitamin E); • osamelec Legend: * p ˂ 0,05 (placebo group versus vitamin E group); • outlier 75 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 4.2.2 Klinični parametri 4.2.2.1 Ocena izraženosti kliničnih znakov Pri prvem kliničnem pregledu na začetku klinične raziskave so lastniki pri šestih mačkah v IRIS I počutje svoje živali ocenili kot zelo dobro, pri eni kot srednje dobro. Mačke so bile brez kliničnih znakov ali pa so ti bili blagi (Tabela 10). Nobena mačka ni v obdobju enega meseca pred začetkom raziskave izgubila več kot 5 % telesne mase. Tabela 10: Stopnja izraženosti kliničnih znakov na začetku raziskave Table 10: Severity of clinical signs at the beginning of the study Ulceracije Stopnja Počutje Odstotek izgube Slabost, Dehidracija Apetit v ustni CKD telesne mase bruhanje votlini Seštevek zelo dobro: 6 ≤ 5 %: 7 ≤ 5 %: 7 normalen: 6 ne bruha: 5 0‒4: 7 I srednje: 1 do 10 %: 0 5 do10%: 0 zmanjšan: 1 občasno: 2 5‒7: 0 n=7 slabo: 0 do 15 %: 0 ≥ 0 10 %: 0 neješčnost: 0 pogosto: 0 8‒10: 0 zelo slabo: 0 ≥15 %: 0 10: 0 zelo dobro: ≤ 5 %: 13 0‒4: 14 13 ≤5 %: 14 normalen: 12 ne bruha: 12 II do 10 %: 2 5‒7: 1 srednje: 1 5 do 10 %: 1 zmanjšan: 3 občasno: 3 0 n=15 do 15 %: 0 8‒10: 0 slabo: 1 ≥ neješčnost: ≥ 10 %: 0 0 pogosto: 0 15 %: 0 10: 0 zelo slabo: 0 zelo dobro: 3 ≤5 %: 4 ≤5 %: 6 normalen: 3 ne bruha: 3 0‒4: 5 III+IV srednje: 3 do 10 %: 5 5 do 10 %: 6 zmanjšan: 5 občasno: 4 1 5‒7: 3 n=12 slabo: 5 do 15 %: 3 ≥10 %: 0 neješčnost: 4 pogosto: 5 8‒10: 4 zelo slabo: 1 ≥15 %: 0 10: 0 Legenda: n število mačk, vključenih v skupino; Seštevek kliničnih znakov: 0‒4: blagi klinični znaki; 5‒7: zaznavni klinični znaki; 8‒10: hudi klinični znaki; 10: nesprejemljivi klinični znaki; evtanazija Legend: n number of included cats; Score: 0‒4 mild clinical signs; 5‒7: moderate clininal signs; 8‒10: severe clinical signs; 10:unacceptable clicical signs; euthanasia 76 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Pri nobeni mački nismo ugotovili dehidracije, ki bi bila večja od 5 %. Ena mačka je imela zmanjšan apetit. Dve mački sta občasno kazali znake slabosti in bruhali. Nobena ni imela ulceracij v sluznici ustne votline. Pri mačkah v IRIS II je 13 lastnikov ocenilo počutje kot zelo dobro, eden kot srednje in eden kot slabo (Tabela 10). Pri eni mački smo ugotovili 5 do 10 % dehidracijo, pri dveh do 10 % izgubo telesne mase v enem mesecu pred začetkom raziskave. Tri mačke so imele zmanjšan apetit, tri so občasno bruhale. Nobena ni imela ulceracij v ustni votlini. Pri 14 mačkah je šlo za blage klinične znake, pri eni mački so bili klinični znaki zaznavni. Tri mačke v IRIS III in IV so se po oceni lastnika počutile zelo dobro, tri srednje, pet slabo in ena zelo slabo (Tabela 10). Štiri mačke so v zadnjem mesecu izgubile 5 % telesne mase, pet do 10 % in tri do 15 %. Pri šestih mačkah smo ugotovili do 5 %, pri šestih 10 % dehidracijo. Tri mačke so imele normalen apetit, pet zmanjšan, štiri so bile neješče. Štiri mačke so bruhale občasno, pet pogosto. Ena mačka je imela ulceracije v ustni votlini. Pet mačk je imelo blage klinične znake, tri zaznavne in štiri hude klinične znake. Mačke v IRIS I, ki so prejemale vitamin E, so bile brez kliničnih znakov. Tiste, ki so prejemale placebo, so bile v času raziskave brez kliničnih znakov ali pa so ti bili blagi. Ena mačka v skupini, ki je prejemala placebo, je izgubila med 5 in 10 % telesne mase, pri eni je lastnik počutje ocenil kot srednje (Tabela 11). 77 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 11: Stopnja izraženosti kliničnih znakov med klinično raziskavo pri mačkah s CKD IRIS I Table 11: Severity of clinical signs during clinical study in cats with CKD IRIS I Odstotek Počutje Slabost, izgube Apetit bruhanje telesne mase Ulceracije Dehidracija Seštevek Zaporedni odvzem or n a o b je ≤ v ustni 5 % len h 0‒4 o n % a jša sn votlini d d ru 10% n a b č re ≤ 5 ‒ rm S 5 Ob Zelo No Zma Ne Vitamin E (n=3) 3 0 3 0 3 3 0 3 0 0 3 1 Placebo (n=4) 3 1 4 0 4 3 1 2 2 0 4 Vitamin E (n=2) 2 0 2 0 2 2 0 2 0 0 2 2 Placebo (n=4) 3 1 3 1 4 2 2 4 0 0 4 Vitamin E (n=3) 3 0 3 0 3 3 0 3 0 1 3 3 Placebo(n=3) 2 1 3 0 3 3 0 3 0 0 3 Vitamin E (n=3) 3 0 3 0 3 3 0 3 0 0 3 4 Placebo(n=3) 3 0 2 1 3 3 0 3 0 0 3 Vitamin E (n=3) 3 0 3 0 3 3 0 3 0 0 3 5 Placebo (n=3) 3 0 2 1 3 3 0 3 0 0 3 Legenda: n število mačk, vključenih v skupino; Seštevek kliničnih znakov: 0‒4: blagi klinični znaki; 5‒7: zaznavni klinični znaki; 8‒10: hudi klinični znaki; 10: nesprejemljivi klinični znaki; evtanazija Legend: n number of included cats; Score: 0‒4 mild clinical signs; 5‒7: moderate clinical signs; 8‒10: severe clinical signs; 10:unacceptable clicical signs; euthanasia Mačke v IRIS II, ki so prejemale vitamin E, so imele blage klinične znake. V manjši meri so bili prisotni izguba telesne mase, slabost in bruhanje. Mačke, ki so prejemale placebo, so v času raziskave imele blage do zmerne klinične znake. Najpogostejši klinični znaki so bili zmanjšan apetit, občasna slabost in bruhanje, dehidracija in izguba telesne mase. Pri eni mački so se lastniki odločili za evtanazijo. Rezultati so prikazani v Tabeli 12. 78 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 12: Stopnja izraženosti kliničnih znakov med klinično raziskavo pri mačkah s CKD IRIS II Table 12: Severity of clinical signs during clinical study in cats with CKD IRIS II Odstotek Počutje Slabost, izgube Dehidracija Apetit Seštevek bruhanje telesne mase Ulceracije Zaporedni o r n a o v ustni odvzem b % h o je len n o % % % % % a jša sn sto votlini 5 d d 0 ru 1 0 0 n a b č o re lab 1‒ ‒ 1‒ rm go S S ≤ 5 ≤ 5 5 5 ≥ 1 Ob P Zelo 10 No Zma Ne 0‒4 5‒7 Vitamin E 6 1 0 7 0 0 7 0 0 6 1 7 0 0 0 7 0 (n=7) 1 Placebo 7 1 0 8 0 0 8 0 0 7 1 5 3 0 0 8 0 (n=8) Vitamin E 6 0 0 5 1 0 6 0 0 6 0 6 0 0 0 6 0 (n=6) 2 Placebo 6 1 0 4 3 0 7 0 0 6 1 7 0 0 0 7 0 (n=7) Vitamin E 3 1 0 4 0 0 4 0 0 3 1 3 1 0 0 4 0 (n=4) 3 Placebo 4 2 0 6 0 0 5 0 1 5 1 2 4 0 0 5 1 (n=6) Vitamin E 6 0 0 5 1 0 5 1 0 5 1 6 0 0 0 6 0 (n=6) 4 Placebo 4 0 0 4 0 0 4 0 0 4 0 2 2 0 0 4 0 (n=4) Vitamin E 4 1 0 4 1 0 4 1 0 4 1 4 1 0 1 5 0 (n=5) 5 Placebo 4 0 1 4 0 1 4 1 0 4 1 4 0 1 1 4 1 (n=5) Legenda: n število mačk, vključenih v skupino; Seštevek kliničnih znakov: 0‒4: blagi klinični znaki; 5‒7: zaznavni klinični znaki; 8‒10: hudi klinični znaki; 10: nesprejemljivi klinični znaki; evtanazija Legend: n number of included cats; Score: 0‒4 mild clinical signs; 5‒7: moderate clinical signs; 8‒10: severe clinical signs; 10:unacceptable clicical signs; euthanasia Na začetku raziskave so imele mačke v IRIS III in IV blage, zmerne ali hude klinične znake CKD. Pri šestih mačkah z zaznavnimi oziroma hudimi kliničnimi znaki so se lastniki nekaj dni po prvem odvzemu odločili za evtanazijo. Pri nadaljnjih odvzemih vzorcev so imele mačke v IRIS III in IV naslednje klinične znake: občasno so bruhale ter imele zmanjšan apetit. Rezultate prikazuje Tabela 13. 79 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 13: Stopnja izraženosti kliničnih znakov med klinično raziskavo pri mačkah s CKD IRIS III in IV Table 13: Severity of clinical signs during clinical study in cats with CKD IRIS III and IV Počutje Odstotek izgube Slabost, Dehidracija Apetit telesne mase bruhanje v i Seštevek e in tl Zaporedni ij o n st a o c o je b % % o h v % len odvzem o 5 % % n ra ro n % 0 % a jša č 0 ru sn sto e i b d sla 1 1 5 0 0 n a o 1 o lab ‒ 1 rm b č g stn ‒ Zelo 0‒4 5‒7 d re S ≤ 5 ‒ ≥ 1 ≤ 5 ‒ ≥ 1 ješ o Ulc u 8 S 5 Ob P Zelo 5 10 No Zma Ne Ne Vitamin E 2 3 2 1 3 3 2 0 4 4 0 2 3 3 2 2 4 0 4 1 3 (n=8) 1 Placebo 1 0 3 0 1 2 1 0 2 2 0 1 2 1 1 2 1 1 1 2 1 (n=4) Vitamin E 1 3 0 0 1 0 2 1 3 1 0 1 3 0 3 0 1 0 2 2 0 (n=4) 2 Placebo 2 0 0 0 2 0 0 0 2 0 0 2 0 0 1 1 0 0 2 0 0 (n=2) Vitamin E 3 0 0 0 1 2 0 0 3 0 0 1 2 0 3 0 0 0 3 0 0 (n=3) 3 Placebo 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 (n=1) Vitamin E 1 1 0 0 2 0 0 0 2 0 0 1 0 1 1 1 0 0 2 0 0 (n=2) 4 Placebo 2 0 0 0 1 0 1 0 2 0 0 2 0 0 1 0 1 0 2 0 0 (n=2) Vitamin E 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 (n=1) 5 Placebo 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 (n=1) Legenda: n število mačk, vključenih v skupino; Seštevek kliničnih znakov: 0‒4: blagi klinični znaki; 5‒7: zaznavni klinični znaki; 8‒10: hudi klinični znaki; 10: nesprejemljivi klinični znaki; evtanazija Legend: n number of included cats; Score: 0‒4 mild clinical signs; 5‒7: moderate clinical signs; 8‒10: severe clinical signs; 10:unacceptable clicical signs; euthanasia Seštevek kliničnih znakov se med skupinama mačk, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo, ni značilno razlikoval ne glede na stopnjo bolezni (Slika 18). 80 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Placebo Vitamin E I v konaz II ičnihn kli ek evt Seš III+IV Odvzem Slika 18: Seštevek kliničnih znakov pri skupini, ki je prejemala vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo CKD in zaporedni odvzem vzorcev Figure 18: Scoreof clinical signs severity assessment at different sampling times in vitamin E and placebo group in cats with CKD according to the stage of the disease Legenda: n število mačk, vključenih v skupino; Seštevek kliničnih znakov: 0‒4: blagi klinični znaki; 5‒7: zaznavni klinični znaki; 8‒10: hudi klinični znaki;  10: nesprejemljivi klinični znaki; evtanazija; • osamelec Legend: n number of included cats; Score: 0‒4 mild clinical signs; 5‒7: moderate clinical signs; 8‒10: severe clinical signs;  10:unacceptable clicical signs; euthanasia; • outlier 81 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 4.2.2.2 Koncentracija kreatinina v serumu, specifična gostota urina in razmerje med beljakovinami in kreatininom v urinu Mačke v IRIS I so imele pred začetkom dajanja vitamina E oziroma placeba (na začetku klinične raziskave) koncentracijo kreatinina pod 140 μmol/L (Tabela 14). Po osmih tednih je pri mačkah, ki so prejemale vitamin E, povprečna koncentracija kreatinina narasla nad 140 μmol/L in se po 16 tednih zmanjšala pod to vrednost. Pri placebo skupini se je povprečna koncentracija kreatinina štiri tedne po začetku klinične raziskave povečala nad 140 μmol/L in ostala nad to vrednostjo do zadnjega odvzema 24 tednov po začetku klinične raziskave. Razlika v koncentraciji kreatinina pri primerjavi med začetkom in koncem raziskave ni bila značilna. Tudi pri primerjavi koncentracije kreatinina na koncu raziskave med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. 82 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 14: Koncentracija kreatinina v serumu, specifična gostota urina, UPC in sistolični arterijski tlak (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS I Table 14: Serum creatinine concentration, urine specific gravity, UPC, and arterial blood pressure (mean ± SD) in cats with CKD IRIS I Sistolični arterijski Kreatinin Odvzem (μmol/L) USG UPC tlak (mm Hg) Vitamin E 132,00 ± 5,94 1,059 ± 0,009 0,19 ± 0,12 133,00 ± 29,82 n=3 1 Placebo 132,00 ± 5,94 1,047 ± 0,025 0,14 ± 0,07 133,25 ± 24,88 n=4 Vitamin E 137,98 ± 0,81 1,030 ± 0,014 0,14 ± 0,06 122,00 ± 11,31 n=2 2 Placebo 145,36 ± 12,49 1,044 ± 0,015 0,11 ± 0,04 149,25 ± 36,94 n=4 Vitamin E 144,52 ± 21,90 1,053 ± 0,003 0,22 ± 0,13 142,33 ± 10,97 n=3 3 Placebo 141,04 ± 15,28 1,031 ± 0,009 0,14 ± 0,02 146,50 ± 13,44 n=3 Vitamin E 136,30 ± 36,87 1,051 ± 0,006 0,23 ± 0,22 146,50 ± 13,44 n=3 4 Placebo 140,39 ± 42,70 1,046 ± 0,017 0,21 ± 0,05 177,00 ± 12,10 n=3 Vitamin E 129,17 ± 11,53 1,068 ± 0,003 0,12 ± 0,02 137,33 ± 4,16 n=3 5 Placebo 142,08 ± 35,75 1,027 ± 0,008 0,16 ± 0,06 163,00 ± 12,17* n=3 Legenda: SD standardna deviacija; USG specifična gostota urina; UPC razmerje med beljakovinami in kreatininom v urinu; * p = 0,05 (primerjava med skupinama placebo in vitamin E); n število mačk Legend: SD Standard Deviation; USG Urine Specific Gravity; UPC Urinary Protein to Creatinine Ratio; * p = 0,05 (placebo group vesrus vitamin E); n number of cats Pri mačkah v IRIS II, ki so dobivale vitamin E, je bila povprečna koncentracija kreatinina v serumu (Tabela 15) največja osem tednov po začetku klinične raziskave (204,43 μmol/L). Pri četrtem in petem odvzemu vzorcev (po 16 in 24 tednih) je bila povprečna koncentracija kreatinina pod 200 μmol/L, vendar večja kot v placebo skupini. Pri mačkah v IRIS II se je v placebo skupini serumska koncentracija kreatinina po štirih in osmih tednih povečala in se po 16 83 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija tednih zmanjšala pod 150 μmol/L. Razlika v koncentraciji kreatinina pri primerjavi med začetkom in koncem raziskave ni bila značilna niti v skupini placebo niti v skupini, ki je prejemala vitamin E. Tudi pri primerjavi koncentracije kreatinina na koncu raziskave med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. Tabela 15: Koncentracija kreatinina v serumu, specifična gostota urina, UPC in sistolični arterijski tlak (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS II Table 15: Serum creatinine concentration, urine specific gravity, UPC, and arterial blood pressure (mean ± SD) in cats with CKD IRIS II Kreatinin Sistolični arterijski tlak Odvzem (μmol/L) USG UPC (mm Hg) Vitamin E 169,70 ± 19,72 1,050 ± 0,018 0,20 ± 0,07 146,00 ± 22,29 n=7 1 Placebo 184,89 ± 34,23 1,044 ± 0,024 0,42 ± 0,41 136,71 ± 23,36 n=8 Vitamin E 174,12 ± 32,87 1,039 ± 0,017 0,20 ± 0,11 150,83 ± 40,30 n=6 2 Placebo 189,08 ± 56,35 1,040 ± 0,022 0,49 ± 0,37 136,29 ± 14,60 n=7 Vitamin E 204,43 ± 41,45 1,028 ± 0,014 0,18 ± 0,05 146,50 ± 47,38 n=4 3 Placebo 193,57 ± 95,57 1,045 ± 0,026 0,25 ± 0,19 148,67 ± 23,57 n=6 Vitamin E 184,62 ± 43,21 1,018 ± 0,016 0,36 ± 0,03 173,00 ± 21,26 n=4 4 Placebo 141,36 ± 14,01 1,064 ± 0,030 0,23 ± 0,31 144,25 ± 18,61 n=6 Vitamin E 192,22 ± 61,79 1,047 ± 0,020 0,18 ± 0,05 161,67 ± 31,39 n=5 5 Placebo 153,77 ± 9,23 1,045 ± 0,020 0,27 ± 0,22 138,40 ± 21,84 n=5 Legenda: SD standardna deviacija; USG specifična gostota urina; UPC razmerje med beljakovinami in kreatininom v urinu; n število mačk Legend: SD Standard Deviation; USG Urine Specific Gravity; UPC Urinary Protein to Creatinine Ratio; n number of cats Mačke v IRIS III in IV so imele na začetku klinične raziskave povprečno koncentracijo kreatinina v serumu večjo kot 400 μmol/L (Tabela 16). Pri mačkah v obeh skupinah je bila najnižja povprečna vrednost osem tednov po začetku klinične raziskave. Pri mačkah, ki sta 84 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija dobivali vitamin E, se je koncentracija kreatinina po 16 tednih povečala. Razlika v koncentraciji kreatinina pri primerjavi med začetkom raziskave in po 16 tednih ni bila značilna niti v skupini placebo niti v skupini, ki je prejemala vitamin E. Tudi pri primerjavi koncentracije kreatinina po 16 tednih med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. Tabela 16: Koncentracija kreatinina v serumu, specifična gostota urina, UPC in sistolični arterijski tlak (povprečje ± SD; vrednost pri n = 1) pri mačkah s CKD IRIS III in IV Table 16: Serum creatinine concentration, urine specific gravity, UPC, and arterial blood pressure (mean ± SD; value if n = 1) in cats with CKD IRIS III and IV Kreatinin Sistolični arterijski tlak Odvzem (μmol/L) USG UPC (mm Hg) Vitamin E 582,19 ± 301,14 1,016 ± 0,008 0,48 ± 0,28 163,60 ± 21,59 n=8 1 Placebo 441,65 ± 178,58 1,021 ± 0,06 1,18 ± 1,47 146,75 ± 33,06 n=4 Vitamin E 433,96 ± 218,90 1,013 ± 0,001 0,42 ± 0,41 134,00 ± 21,65 n=4 2 Placebo 338,74 ± 41,81 1,020a 0,30 ± 0,18 114,00 ± 15,61 n=2 Vitamin E 295,72 ± 171,73 1,036 ± 0,034 0,44 ± 0,50 152,00 ± 1,41 n=3 3 Placebo 292,03 1,018 0,53 142,00 n=1 Vitamin E 382,36 ± 317,12 1,018 ± 0,008 0,25 ± 0,15 133,00 ± 21,20 n=2 4 Placebo 281,84 ± 13,73 1,020 ± 0,003 1,07 ± 1,16 159,50 ± 60,10 n=2 Vitamin E 537,00 1,010 0,79 118,00 n=1 5 Placebo 288,80 1,020 0,35 119,00 n=1 Legenda: SD standardna deviacija; USG specifična gostota urina; UPC razmerje med beljakovinami in kreatininom v urinu; n število mačk; a vrednost izmerjena samo pri eni mački Legend: SD Standard Deviation, USG Urine Specific Gravity; UPC Urinary Protein to Creatinine Ratio; n number of cats; a value measured in one cat Pri mačkah v IRIS I na začetku razsikave proteinurija ni bila prisotna. Pri mačkah, ki so dobivale vitamin E, je bila pri tretjem in četrtem odvzemu vzorcev proteinurija mejna. Mačke v placebo skupini so imele mejno proteinurijo le pri četrtem odvzemu vzorcev (Tabela 14). Razlika v UPC 85 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija primerjavi med začetkom in koncem raziskave v nobenem primeru ni bila značilna. Tudi pri primerjavi UPC na koncu raziskave med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. Mačke v IRIS II, ki so dobivale vitamin E, so imele pri vseh odvzemih, razen pri tretjem in petem odvzemu, mejno proteinurijo (Tabela 15). Mačke v placebo skupini so imele pri prvem in drugem odvzemu proteinurijo, pri nadaljnjih odvzemih je bila proteinurija mejna. Razlika v UPC primerjavi med začetkom in koncem raziskave v nobenem primeru ni bila značilna. Tudi pri primerjavi UPC na koncu raziskave med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. Na začetku raziskave so imele vse mačke v IRIS III in IV proteinurijo. Mačke, ki so dobivale vitamin E, so imele ves čas raziskave, razen pri četrtem odvzemu vzorcev po 16 tednih, proteinurijo. Pri drugem odvzemu vzorcev so imele mačke v placebo skupini mejno proteinurijo, ki je kasneje napredovala v proteinurijo (Tabela 16). Razlika v UPC primerjavi med začetkom in koncem raziskave ni bila značilna niti v skupini placebo niti v skupini, ki je prejemala vitamin E. Tudi pri primerjavi UPC pri četrtem vzorčenju med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. Na začetku klinične raziskave so imele mačke v IRIS I specifično gostoto urina nad 1,035. Pri mačkah, ki so dobivale vitamin E, se je specifična gostota urina pri drugem odvzemu vzorcev zmanjšala pod 1,035, to je pod mejo referenčne vrednosti (IRIS 2013a), in je pri nadaljnjih odvzemih narasla nad 1,050. Razlika ni bila značilna. V placebo skupini se je specifična gostota pri tretjem odvzemu vzorcev zmanjšala pod mejo referenčne vrednosti, se pri četrtem odvzemu povečala in pri petem odvzemu spet zmanjšala pod referenčno vrednost (Tabela 14). Razlika ni bila značilna niti v skupini placebo niti v skupini, ki je prejemala vitamin E. Na koncu raziskave je bila specifična gostota urina pri skupini, ki je prejemala vitamin E precej višja (1,068 ± 0,003) kot v skupini placebo (1,027 ± 0,008), vendar razlika ni bila značilna (p = 0,083). Mačke v IRIS II so imele na začetku raziskave specifično gostoto urina nad 1,035. Mačke, ki so dobivale vitamin E, so imele pri tretjem in četrtem odvzemu hipostenurijo. Pri mačkah, ki so dobivale placebo, se specifična gostota urina ni zmanjšala pod 1,035 (Tabela 15). Razlika v specifični gostoti primerjavi med začetkom in koncem raziskave v nobenem primeru ni bila 86 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija značilna. Tudi pri primerjavi specifične gostote urina na koncu raziskave med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. Mačke v IRIS III in IV, ki so dobivale vitamin E, so imele ves čas raziskave, razen pri tretjem odvzemu, hipostenurijo. Mačke v placebo skupini so imele ves čas raziskave hipostenurijo. (Tabela 16). Razlika v specifični gostoti primerjavi med začetkom raziskave in pri četrtem vzorčenju po 16 tednih v nobenem primeru ni bila značilna. Tudi pri primerjavi specifične gostote urina pri četrtem vzorčenju med skupinama placebo in vitamin E razlika ni bila značilna. Na začetku raziskave so imele mačke v IRIS I sistolični arterijski tlak pod 150 mm Hg, torej so bile normotenzivne z minimalnim tveganjem za poškodbo tarčnih organov (IRIS 2013a). Mačke, ki so dobivale vitamin E, so bile ves čas klinične raziskave normotenzivne. Mačke v placebo skupini so imele pri četrtem in petem odvzemu vzorcev zmerno povečan sistolični arterijski tlak (Tabela 14). Razlika med sistoličnim arterijskim tlakom na začetku in koncu raziskave v nobenem primeru ni bila značilna. Na koncu raziskave so imele mačke v placebo skupini značilno višji arterijski krvni tlak (163,00 ± 12,17 mm Hg) kot mačke, ki so prejemale vitamin E (137,33 ± 4,16 mm Hg; p = 0,05). Mačke v II. skupini po IRIS so bile na začetku klinične raziskave normotenzivne. V placebo skupini so bile mačke pri vseh odvzemih normotenzivne, medtem ko so imele mačke, ki so prejemale vitamin E, pri zadnjih dveh odvzemih vzorcev zmerno povečan sistolični arterijski tlak (Tabela 15). Razlika med sistoličnim arterijskim tlakom na začetku in koncu raziskave v nobenem primeru ni bila značilna. Tudi pri primerjavi sistoličnega arterijskega tlaka med skupinama placebo in vitamin E na koncu raziskave razlika ni bila značilna. Mačke v III. in IV. skupini po IRIS, ki so dobivale placebo, so imele povečan sistolični arterijski tlak pri četrtem odvzemu vzorcev. Mačke, ki so prejemale vitamin E, so imele na začetku raziskave zmerno povečan sistolični arterijski tlak, kasneje so bile normotenzivne (Tabela 16). Razlika v sistoličnem krvnem tlaku pri primerjavi med začetkom raziskave in po 16 tednih ni bila značilna. Tudi pri primerjavi sistoličnega arterijskega tlaka med skupinama placebo in vitamin E po 16 tednih razlika ni bila značilna. 87 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 4.2.2.3 Preživetje Preživetje mačk s CKD je bilo značilno odvisno od stopnje CKD pri prvem odvzemu vzorcev (p = 0,001). Mediana vrednost preživetja pri mačkah v IRIS III in IV je bila 2,5 meseca, pri mačkah v IRIS II pa 37,5 mesecev. Pri mačkah v prvi stopnji CKD ni bilo poginov. Verjetnost preživetja glede na stopnjo bolezni prikazuje Slika 19. Čas preživetja smo računali od začetka raziskave do pogina, pri tem pa upoštevali stopnjo CKD na začetku raziskave. Paciente smo spremljali do največ 45 mesecev po prvem odvzemu vzorcev. Verjetnost preživetja je bila odvisna od stopnje CKD. Kratke navpične črte označujejo zadnji zabeleženi klinični pregled. a jetiv prež tsnoetj Ver I II III+IV Čas (meseci) Slika 19: Preživetje mačk s CKD glede na stopnjo bolezni Figure 19: Survival of cats with CKD according to the stage of the disease Čas preživetja se med skupinama mačk, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo, glede na stopnjo bolezni ni značilno razlikoval (Slika 20). 88 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija a jetiv prež tsnoetj Ver I: Placebo I: Vitamin E II: Placebo II: Vitamin E III+IV: Placebo III+IV: Vitamin E Čas (meseci) Slika 20: Preživetje mačk s CKD, ki so prejemale vitamin E oziroma placebo glede na stopnjo bolezni Figure 20: Survival of cats with CKD in the vitamin E and placebo group according to the stage of the disease 89 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 5 RAZPRAVA Številne raziskave (Ceballos-Picot in sod., 1996; Kamal-Eldin in Appelqvist , 1996; Galle, 2001; Dalle-Donne in sod., 2003; Wardle, 2005; Bhogade in sod., 2008; Priya in Vasudha, 2009) potrjujejo stanje oksidativnega stresa pri ljudeh s CKD. Pri dializnih bolnikih so ugotovili pozitiven učinek dodajanja vitamina E k prehrani. Izboljšalo se je njihovo klinično stanje (Cristol in sod., 1997), pojavnost ateroskleroze in kardiovaskularnih bolezni je bila manjša (Locattelli in sod., 2003; Priya in Vasudha, 2009), obseg poškodb DNA, ocenjenih s testom komet, se je zmanjšal (Kan in sod., 2002), serumska koncentracija MDA je bila nižja ter aktivnost SOD ter CAT znižana v primerjavi s kontrolno skupino (Bhogade in sod., 2008). Podobnih raziskav pri mačkah s CKD še ni bilo izvedenih, zato smo v naši raziskavi preučevali prisotnost oksidativnega stresa pri mačkah s CKD v vseh kliničnih stopnjah bolezni. Oksidativni stres smo ovrednotili s stališča poškodb bioloških molekul in antioksidantnega statusa organizma. Ugotoviti smo želeli, ali dodatek vitamina E k zdravljenju po priporočilih IRIS izboljša klinično stanje in upočasni napredovanje bolezni in v napredovalih stopnjah podaljša čas preživetja. Pri mačkah s kronično ledvično odpovedjo nismo ugotovili povečane stopnje lipidne peroksidacije, oksidativnih poškodb beljakovin in DNA; antioksidantni mehanizmi niso iztrošeni. Dodajanje vitamina E ni značilno zmanjšalo stopnje oksidativnih poškodb bioloških molekul in ni značilno pripomoglo k povečanju antioksidantne kapacitete. Prav tako ni podaljšalo preživetja ali zmanjšalo izraženosti kliničnih znakov. Glede na rezultate naše raziskave lahko povzamemo, da dodajanje vitamina E pri mačkah s CKD ni smiselno, saj ne vpliva na klinični potek CKD. 90 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 5.1 OKSIDATIVNI STRES IN ANTIOKSIDANTNI STATUS 5.1.1 Malondialdehid Ugotovljena koncentracija MDA pri zdravih mačkah se nekoliko razlikuje od podatkov iz literature: Todorova in sodelavci (2005) kot referenčno vrednost MDA pri zdravih mačkah za samce navajajo 2,317 ± 0,376 μM in 1,959 ± 0,336 μM za samice, pri čemer ne navajajo, ali so bile mačke kastrirane ali sterilizirane, medtem ko so bile v naši raziskavi izmerjene vrednosti pri kontrolni skupini obeh spolov 3,15 ± 0,77 μM. Razlike v izmerjenih vrednostih so najverjetneje posledica uporabe različnih metod za določanje koncentracije MDA. Todorova in sodelavci (2005) so za določanje MDA uporabili metodo TBARS, ki z metodo, uporabljeno v naši raziskavi, ni popolnoma primerljiva. Metoda TBARS je nizko specifična, saj lahko MDA in podobne spojine nastanejo med samim postopkom določanja (Esterbauer in sod., 1991; Draper in sod., 2000; Del Rio in sod., 2005). Metoda določanja MDA s pomočjo derivatizacije z 2,4-DNPH in tekočinsko kromatografijo s tandemsko masno spektroskopijo, ki smo jo uporabili v naši raziskavi, je bolj občutljiva in specifična (Del Rio in sod., 2005). Rezultati naše raziskave niso pokazali značilne razlike v koncentraciji MDA med kontrolno skupino in mačkami s CKD, kar kaže na to, da pri mačkah s CKD oksidativne poškodbe lipidov kot posledica oksidativnega stresa še niso prisotne. Podobno so ugotovili Yu in Paetau-Robinson (2006) pri mačkah ter Buranakarl in sodelavci (2009) pri psih. Rezultati nakazujejo, da dieta mačk s CKD najverjetneje vsebuje zadostno količino antioksidantov, ki preprečujejo pojav lipidne peroksidacije. Mačke v IRIS III in IV so imele pri prvem odvzemu vzorcev nižjo koncentracijo MDA (2,76 ± 0,4 μM) kot tiste v IRIS I (3,66 ± 0,30 μM) in II (3,86 ± 1,12 μM). Razlika je bila značilna, če smo skupaj primerjali mačke v IRIS I in II s tistimi v IRIS III in IV (p = 0,037). Glede na to, da smo v napredovalih stadijih CKD ugotovili nižjo raven lipidne peroksidacije kot v začetnih 91 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija stadijih CKD, lahko sklepamo, da pri mačkah v IRIS III in IV antioksidantni mehanizmi niso iztrošeni oziroma oksidativni stres ni prisoten v taki meri, da bi povzročil značilno povečanje obsega lipidne peroksidacije. Raziskave pri ljudeh (De Vecchi in sod., 1997; Ozden in sod., 2002; Agarwal, 2002; Priya in Vasudha, 2009) so pokazale nasprotno. V končni stopnji CKD je plazemska koncentracijo MDA povečana. Sklepamo lahko, da je potek CKD pri mačkah drugačen in da gre za različno etiologijo in patogenezo. Glede na to, da so dosedanje raziskave pri mačkah, vključno z našo, obravnavale relativno majhno število živali, lahko razlike v ugotovitvah morda pripišemo tudi temu. 5.1.2 Proteinski karbonili Pri ljudeh s CKD so različni avtorji ugotovili povečano koncentracijo karbonilnih skupin (Himmelfarb in sod., 2000; Mimić-Oka in sod., 2001), tiolnih skupin (Himmelfarb in sod., 2000) in AOPP (Witko-Sarsat in sod., 1998). Do sedaj še ni bilo objav o koncentraciji proteinskih karbonilov pri mačkah s CKD. V naši raziskavi ni bilo značilnih razlik pri primerjavi koncentracije proteinskih karbonilov med mačkami s CKD in kontrolno skupino. Povečane ravni oksidativnih poškodb beljakovin pri mačkah s CKD torej nismo dokazali. Koncentracija proteinskih karbonilov je bila pri mačkah v IRIS III in IV nekoliko nižja (29,11 ± 8,69 nmol/mL), kot pri mačkah v IRIS I (33,30 ± 12,30 nmol/mL) in II (35,20 ± 9,82 nmol/mL), vendar razlika ni bila značilna. Zaradi majhnega vzorca bi razlika lahko nastala tudi naključno, lahko pa bi šlo tudi za posledico aktivacije antioksidantnih mehanizmov oziroma oksidativni stres pri mačkah v IRIS III in IV ni prisoten v taki meri, da bi povzročil značilno povečanje koncentracije proteinskih karbonilov. Do sedaj še ni bilo objav o vplivu vitamina E na koncentracijo proteinskih karbonilov pri mačkah ali ljudeh s CKD. 92 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 5.1.3 Poškodbe DNA Mačke v kontrolni skupini so imele značilno večji odstotek jedrne DNA v repu kometov kot mačke s CKD, in sicer ne glede na stopnjo bolezni (p = 0,05). Vzrok so lahko individualne razlike med preučevanimi živalmi in relativno majhen vzorec. Ker s testom komet ugotavljamo tudi prelome, ki nastanejo kot vmesna stopnja v procesu popravljanja DNA, bi ugotovitev morda lahko pripisali tudi dejstvu, da so pri skupini zdravih mačk popravljalni mehanizmi DNA bolj aktivni kot pri mačkah s CKD (Tice in sod., 2000). Rezultati naše raziskave se razlikujejo od podatkov iz literature (Yu in Paetau-Robinson, 2006), kjer ne navajajo značilnih razlik med zdravimi mačkami in mačkami s CKD. Omenjeno raziskavo so izvedli na manjšem številu živali, saj so primerjali le deset zdravih mačk in deset mačk z začetno stopnjo CKD. V omenjeni raziskavi so poškodbe DNA ugotavljali tako s testom komet kot tudi z ugotavljanjem koncentracije 8-OHdG v serumu. V nasprotju z raziskavama pri mačkah so pri ljudeh s CKD z metodo testa komet ugotovili povečano poškodbo genoma, ki se je z napredovanjem bolezni še povečevala (Stopper in sod., 2001; Stoyanova in sod., 2010). 5.1.4 Superoksidna dismutaza Rezultati preliminarne raziskave pri zdravih mačkah so primerljivi z rezultati, ki jih kot referenčne navajajo Todorova in sodelavci (2005). Pri primerjavi aktivnosti SOD pri mačkah v kontrolni skupini in mačkah s CKD ni bilo značilnih razlik ne glede na stopnjo bolezni. Rezultati so v skladu z objavo Keegana in Webba (2010), ki pri mačkah z uremijo nista ugotovila razlike v aktivnosti tega encima. Pri mačkah s CKD se aktivnost SOD z napredovanjem bolezni ne spremeni. 93 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 5.1.5 Eritrocitna glutation peroksidaza Pri ljudeh s CKD opisujejo povečano (Ceballos Picot in sod., 1996), zmanjšano (Yoshimura in sod., 1997; Sommerburg in sod., 2002) oziroma nespremenjeno (Ozden in sod., 2002, Zachara in sod., 2004; El-Far in sod., 2005) aktivnost eritrocitne GPX. V naši preliminarni raziskavi pri mačkah s CKD pri primerjavi z zdravimi mačkami ni bilo značilnih razlik v aktivnosti eritrocitne GPX. Tudi med posameznimi stopnjami bolezni po IRIS ni bilo razlik (Krofič Žel in sod., 2014). Zaključimo lahko, da se aktivnost tega encima pri CKD ne spremeni. 5.1.6 Plazemska glutation peroksidaza in selen Raziskave pri ljudeh s CKD kažejo, da je aktivnost plazemske GPX ne glede na stopnjo bolezni znižana (Schiavon in sod., 1994; Ceballos-Picot in sod., 1996; Witko-Sarsat in sod., 1998; Zachara in sod., 2004; El-Far in sod., 2005) in navajajo, da je stopnja aktivnosti tega encima primeren diagnostični in prognostični pokazatelj stopnje bolezni in ledvične funkcije (Schiavon in sod., 1994; Ceballos-Picot in sod., 1996). V preliminarni raziskavi je bila aktivnost plazemske GPX pri mačkah v IRIS IV v primerjavi s kontrolno skupino značilno povečana (p = 0,025, n= 5), pri mačkah v ostalih stopnjah CKD pa nespremenjena (Krofič Žel in sod., 2014). Rezultati klinične raziskave niso pokazali značilnih razlik v aktivnosti plazemske GPX med posameznimi stopnjami CKD. V klinični raziskavi smo zaradi premajhnega števila podatke pacientov v IRIS III in IV obravnavali skupaj (n = 12), v preliminarni raziskavi pa ločeno, zato rezultati niso popolnoma primerljivi. Razlika v rezultatih obeh raziskav je lahko nastala tudi zato, ker je bila v obe raziskavi vključena relativno majhna skupina živali in so na rezultate vplivale individualne razlike med živalmi. Glede na to, da aktivnost plazemske GPX v nobenem primeru ni bila zmanjšana, lahko zaključimo, da antioksidantni mehanizmi pri mačkah s CKD niso iztrošeni. 94 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Mačke s CKD so bile značilno starejše kot mačke v kontrolni skupini. Pri pregledu literaturnih podatkov nismo našli objavljenih rezultatov raziskav, ki bi preučevale vpliv starosti na aktivnost plazemske GPX pri mačkah. Rezultati raziskav pri ljudeh so si nasprotujoči. Raziskave pri starejših ljudeh večinoma ugotavljajo zmanjšanje aktivnosti plazemske GPX (Guemouri in sod., 1991; Mendoza-Núñez in sod., 2007). Nekateri avtorji so ugotovili tudi povečano (Bolzán in sod., 1997; Inal in sod., 2001; Hübner-Woźniak in sod., 2011) ali nespremenjeno aktivnost plazemske GPX (Andersen in sod., 1997; Kasapoglu in Ozben, 2001). Pri starejših psih so ugotovili povečanje aktivnosti plazemske GPX (Vajdovich in sod., 1997; Stowe in sod., 2006). Vpliva značilne razlike v starosti med mačkami s CKD in kontrolno skupino na aktivnost plazemske GPX v naši raziskavi ne moremo izključiti. Rezultati preliminarne raziskave (Krofič Žel in sod., 2014) kažejo, da se koncentracija selena v serumu pri mačkah s CKD in zdravih mačkah ne razlikuje. V nasprotju z ugotovitvami pri mačkah so pri ljudeh s CKD ugotovili zmanjšano koncentracijo selena v plazmi in polni krvi. Predvidevajo, da je vzrok za to zmanjšan vnos, ki je posledica dietne hrane z zmanjšano vsebnostjo beljakovin in povečano izločanje selena iz telesa zaradi proteinurije (Ceballos-Picot in sod., 1996; Allan in sod., 1999; Zagrodzki in sod., 2007). Pomanjkanje selena navajajo kot enega izmed vzrokov za znižano aktivnost GPX pri ljudeh s CKD (Zagrodzki in sod., 2007), medtem ko druge raziskave tega niso potrdile (Ceballos-Picot in sod., 1996; Zachara in sod., 2004). Foster in sodelavci (2001) ter Todd in sodelavci (2012) pri zdravih mačkah niso ugotovili korelacije med aktivnostjo plazemske GPX in koncentracijo selena v plazmi. Tovrstna korelacija je bila zaznavna le eksperimentalno, če so mačke zaužile manj selena, kot je priporočeno.V prehrani mačk je ta mikroelement prisoten v zadostni količini (Foster in sod., 2001; Todd in sod., 2012). Zaključimo lahko, da selen pri mačkah ni omejujoč dejavnik in pri mačkah s CKD pri normalni prehrani ne vpliva na aktivnost plazemske GPX. 95 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 5.1.7 Celokupna antioksidantna kapaciteta V preliminarni raziskavi (Krofič Žel in sod., 2014) nismo ugotovili značilnih razlik v plazemski TAC med zdravimi mačkami in mačkami s CKD ne glede na stopnjo bolezni. Podobne rezultate opisujeta Yu in Paetau-Robinson (2006) pri desetih mačkah z začetno stopnjo CKD, medtem ko sta Keegan in Webb (2010) pri mačkah s CKD ugotovila značilno znižano TAC. Razlike v rezultatih lahko pripišemo dejstvu, da Keegan in Webb v raziskavi nista upoštevala razdelitve po IRIS, individualnim razlikam med preučevanimi živalmi in uporabi reagenčnega kompleta drugega proizvajalca. Glede na to, da nismo ugotovili razlik v koncentraciji MDA, proteinskih karbonilov in stopnji poškodb DNA, povečane stopnje lipidne peroksidacije, oksidativnih poškodb beljakovin in DNA pri mačkah s CKD nismo dokazali. Nadalje ugotavljamo, da aktivnost antioksidantnih encimov SOD, plazemske in eritrocitne GPX ter TAC niso bili zmanjšani, zato lahko zaključimo, da antioksidantni mehanizmi pri mačkah s CKD niso iztrošeni. Pri preliminarni raziskavi smo ugotovili značilno povečano aktivnost plazemske GPX pri mačkah v IRIS IV, kar lahko kaže na prisotnost kompenzatornih mehanizmov kot odgovor na povečan oksidativni stres v tej stopnji bolezni. Sklepamo, da so mehanizmi pojava in napredovanja CKD pri mačkah drugačni kot pri ljudeh. 5.2 DODAJANJE VITAMINA E 5.2.1 Izbrani klinični in laboratorijski parametri ter preživetje Pri preučevanih pacientih s CKD so bili najpogostejši ugotovljeni klinični znaki zmanjšan apetit, izguba telesne mase, slabost in bruhanje. Klinični znaki so se z napredovanjem bolezni slabšali, kar je v skladu z že objavljenimi podatki (King in sod., 2007; Krofič Žel in sod., 2014, IRIS, 96 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 2013b). Seštevek kliničnih znakov se pri mačkah, ki so prejemale vitamin E, v primerjavi s tistimi, ki so prejemale placebo, na koncu raziskave ni značilno razlikoval. Po dodajanju vitamina E pri mačkah s CKD se serumska koncentracija kreatinina, UPC in sistolični arterijski tlak kot glavni klinični kazalci za napoved napredovanja bolezni in pogin (King in sod., 2007; Elliott in Watson, 2013; Jepson in sod., 2009) niso izboljšali, razen v IRIS I, kjer je bil sistolični arterijski tlak na koncu raziskave značilno nižji pri mačkah, ki so prejemale vitamin E (p = 0,05). Mačke, ki so prejemale vitamin E, so bile ves čas raziskave normotenzivne, medtem ko so mačke v placebo imele zmerno povišan sistolični arterijski tlak, ki predstavlja nizko tveganje za poškodbo tarčnih organov. Nobena mačka v IRIS I v času raziskave ni prejemala antihipertenzivov; razliko v sistoličnem arterijskem tlaku bi lahko pripisali učinku dajanja vitamina E. Pri primerjavi specifične gostote urina smo ugotovili precej višjo vrednost tega parametra pri mačkah, ki so prejemale vitamin E kot pri mačkah v placebo skupini, vendar razlika ni bila značilna (p = 0,083). Čas preživetja mačk s CKD je bil značilno odvisen od stopnje CKD pri prvem odvzemu vzorcev. Pri mačkah v IRIS III in IV je bil čas preživetja 2,5 meseca, pri mačkah v IRIS II pa 37,5 mesecev, kar je v skladu z že objavljenimi podatki (Kuwahara in sod., 2006, King in sod., 2007; Boyd in sod., 2008). Čas preživetja mačk v skupini, ki je prejemala vitamin E, se ni značilno razlikoval od časa preživetja mačk, ki so prejemale placebo. Pri mačkah s CKD sta vpliv kombinacije antioksidantov na oksidativni stres preučevala Yu in Paetau-Robinson (2006) in ugotovila značilno zmanjšanje oksidativnih poškodb DNA, vendar izraženosti kliničnih znakov in časa preživetja nista ugotavljala. Glede na rezultate klinične raziskave lahko povzamemo, da dodajanje vitamina E pri mačkah s CKD ni smiselno, saj ne vpliva na klinični potek CKD in čas preživetja. 97 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 5.2.2 Oksidativni stres in antioksidantni status Ugotovljena koncentracija vitamina E pri mačkah s CKD na začetku raziskave je primerljiva s podatki iz literature (Yu in Paetau-Robinson, 2006) in se je v skupini, ki je prejemala vitamin E, pri vseh stopnjah CKD povečala, medtem ko je v placebo skupini ostala nespremenjena. Pri drugem odvzemu vzorcev se je koncentracija vitamina E pri mačkah v IRIS 1 povečala na 154 %, v IRIS II na 119 % in v IRIS III in IV na 172 % prvotne vrednosti. Pri primerjavi koncentracije vitamina E po posamenih stopnjah CKD med skupinama placebo in vitamin E pri nobenem odvzemu nismo ugotovili značilnih razlik. Razlika v koncentraciji je bila značilna, če smo združili mačke v vseh stopnjah CKD. Pri primerjavi s skupino placebo je bila koncentracija vitamina E značilno višja pri skupini, ki je prejemala vitamin E, štiri (p = 0,013) in osem (p = 0,017) tednov po začetku raziskave. Na koncu raziskave po 24 tednih je bila koncentracija vitamina E še vedno višja v skupini, ki je prejemala vitamin E kot v placebo skupini, vendar razlika ni bila značilna (p = 0,074). Tudi koncentracija lipidno standardiziranega vitamina E v plazmi se je po dajanju vitamina E pri vseh skupinah mačk s CKD, ki so prejemale vitamin E, v vseh vzorcih povečala. Pri primerjavi lipidno standardizirane koncentracije vitamina E po posamenih stopnjah CKD med skupino placebo in skupino, ki je prejemala vitamin E, smo značilno razliko ugotovili le pri mačkah v IRIS II štiri (p = 0,041) in osem (p = 0,038) tednov po začetku dajanja vitamina E. Po tem, ko smo združili mačke v vseh stopnjah CKD, smo značilno razliko med skupinama placebo in vitamin E ugotovili štiri (p = 0,001) in osem (p = 0,007) tednov po začetku dajanja vitamina E. Razlika med skupinama placebo in vitamin E na koncu raziskave (po 24 tednih) ni bila značilna (p = 0,077). Dejstvo, da smo ugotovili značilno razliko v koncentraciji vitamina E med skupinama placebo in vitamin E šele, ko smo združili mačke v vseh stopnjah CKD, bi lahko pripisali majhnemu številu živali v poskusnih skupinah. Drug razlog, da nismo ugotovili značilnega povečanja koncentracije vitamina E v plazmi pri vseh odvzemih in v vseh stopnjah CKD, bi lahko bilo skladiščenje vitamina E v maščobnem tkivu (Plumb, 2015). 98 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Na začetku raziskave nismo pri nobeni mački ugotovili koncentracije vitamina E pod 8,13 μmol/L, kar bi nakazovalo na pomanjkanje tega vitamina (Hendriks in sod., 2002). Nekateri lastniki so poročali, da so bile mačke po uvedbi placeba in vitamina E v hrano zaradi drugačnega okusa in vonja manj ješče. Dva lastnika sta zaradi tega, ker je mačka hrano po dodajanju vitamina E oziroma placeba zavračala, po prvem odvzemu prekinila sodelovanje v raziskavi. Mačke so vitamin E dobivale v obliki olja, pomešanega v hrano, saj je vitamin E na ta način najbolje biorazpoložljiv, hkrati pa je povečana možnost variacij v plazemski koncentraciji zaradi bruhanja in različne resorpcije. Jewell in sodelavci (2000) navajajo, da je za skupno zmanjšanje alkenalov (MDA in HNE) v serumu zdravih mačk potrebno najmanj 540 IE vitamina E na kilogram suhe snovi hrane.Vitamin E je nizko toksičen. Pri zdravih psih ne priporočajo večjega odmerka od 1000‒2000 IE/kg suhe snovi hrane, medtem ko pri mačkah največji varen odmerek ni znan. Za različna bolezenska stanja priporočajo tudi večje odmerke (Zicker in Wedekind, 2010). Različni viri priporočajo naslednje odmerke vitamina E kot antioksidanta za mačke: 30 IE/mačko/dan (Ramsey, 2012; Kuehn, 2013); 10‒15 IE/kg/dan (Plumb, 2015); do 10‒20 IE/kg/12h (Kuehn, 2013). Pripravljena dietna hrana za mačke ima ne glede na priporočila študij dodano količino vitamina E, ki ustreza dnevnemu vnosu 30-50 IE/mačko/dan. Mačke v naši raziskavi so prejemale komercialno hrano z vsebnostjo vitamina E 750 IE/kg suhe snovi (30 IE/mačko/dan) in dodatek 100 IE na dan vitamina E v obliki alfa tokoferola, kar je v zgornjem območju odmerjanja (30 IE/kg/dan), ki ga navajajo prej omenjeni viri. Za ta odmerek smo se odločili, ker je zadostil naši predpostavki, da je pri mačkah tako kot pri ljudeh s CKD oksidativni stres prisoten in da je zaradi tega potreba po vitaminu E povečana. Koncentracija MDA se je pri mačkah, ki so prejemale placebo, med prvim in zadnjim odvzemom povečala. Pri mačkah v IRIS I, ki so prejemale vitamin E, se je koncentracija MDA zmanjšala, pri mačkah v IRIS II pa je ostala nespremenjena. Pri mačkah v IRIS III in IV, ki so prejemale vitamin E, se je koncentracija MDA povečala v manjši meri kot v placebo skupini. Največji učinek dodajanja vitamina E na zmanjšanje koncentracije MDA smo opazili pri mačkah z začetno stopnjo CKD. V nobenem primeru razlika ni bila značilna. Tudi Yu in Paetau-Robinson (2006) 99 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija po dodajanju kombinacije antioksidantov nista ugotovila značilnih sprememb v koncentraciji MDA. Pri skupini mačk, ki so prejemale antioksidante, je bila koncentracija tega parametra na koncu raziskave podobno kot v naši raziskavi nekoliko nižja kot v skupini placebo. V omenjeni raziskavi so sicer spremljali manjše število živali, ki so pretežno imele začetno stopnjo CKD. Mačk niso obravnavali glede na stopnjo bolezni, hkrati pa niso ugotavljali učinka posameznih antioksidantov, zato izsledke obeh raziskav težko primerjamo. Koncentracija proteinskih karbonilov se je pri mačkah v IRIS I v obeh skupinah nekoliko zmanjšala, medtem ko se je pri mačkah v IRIS III in IV v obeh skupinah povečala. Razlika ni bila značilna. Pri mačkah v IRIS II, ki so prejemale vitamin E, se je koncentracija proteinskih karbonilov glede na prvi odvzem zmanjšala za 13 %, pri placebo skupini pa za 25 % povečala. Na koncu raziskave je bila koncentracija proteinskih karbonilov nižja v skupini, ki je prejemala vitamin E kot v placebo skupini, vendar razlika ni bila značilna (p = 0,086). Nižjo koncentracijo proteinskih karbonilov v tej skupini bi morda lahko pripisali antioksidantnemu učinku vitamina E. Pri mačkah v IRIS I in II se je raven poškodb DNA povečala ne glede na to, ali so prejemale vitamin E ali placebo. V nasprotju z našimi ugotovitvami sta Yu in Paetau-Robinson (2006) po dodajanju kombinacije antioksidantov ugotovila zmanjšanje oksidativnih poškodb DNA. Ker so v omenjeni raziskavi mačkam dodajali kombinacijo vitamina E, vitamina C in β karotena, lahko učinek pripišemo kateremukoli naštetemu antioksidantu ali njihovi kombinaciji, tako da rezultati obeh raziskav niso primerljivi. Pri mačkah v IRIS III in IV se je odstotek jedrne DNA v repu kometov v primerjavi med prvim in četrtim odvzemom vzorcev zmanjšal ne glede na to, ali so prejemale vitamin E ali placebo. Zmanjšan odstotek poškodovane DNA je lahko odraz dejstva, da je velik delež mačk v IRIS III in IV poginil kmalu po prvem odvzemu vzorcev, le-te pa so imele večji odstotek poškodovane DNA od preživelih. Pri mačkah v IRIS I in II se aktivnost plazemske GPX v skupini, ki je dobivala vitamin E, ni razlikovala od aktivnosti pri placebo skupini. Pri mačkah v IRIS III in IV se je aktivnost plazemske GPX v skupini, ki je prejemala vitamin E, glede na prvi odvzem GPX povečala za 7 100 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija %, pri placebo skupini pa za 17 % zmanjšala. Razlika v nobenem primeru ni bila značilna. Glede na rezultate lahko sklepamo, da dodajanje vitamina E v IRIS I in II ni vplivalo na aktivnost plazemske GPX. Aktivnost plazemske GPX pri mačkah v IRIS III in IV se na koncu raziskave med placebo skupino in mačkami, ki so prejemale vitamin E, ni značilno razlikovala. Sklepamo, da tudi v napredovali stopnji CKD antioksidantni mehanizmi niso bili iztrošeni. Iz navedenega lahko povzamemo, da dodajanje vitamina E pri mačkah s CKD ne zmanjša oksidativnih poškodb bioloških molekul in ne pripomore k aktivaciji antioksidantnih mehanizmov. Čas preživetja in stopnja izraženosti kliničnih znakov nista spremenila, zato sklepamo, da dodajanje vitamina E k standardnemu zdravljenju ni smiselno, saj mačke večinoma dobivajo pripravljeno hrano, ki ji je že v osnovi dodana visoka koncentracija vitamina E. Naša raziskava kot prva obravnava celosten pregled dinamike oksidativnega stresa pri mačkah s CKD ter vpliv vitamina E na potek CKD, pri čemer upošteva razvrstitev glede na klinične stopnje bolezni. Glavna omejitev raziskave je majhen vzorec živali, predvsem v IRIS III in IV, kjer je verjetnost za pogin v enem mesecu največja (Kuwahara in sod., 2006). Iz tega razloga so potrebne nadaljnje raziskave na večjem številu mačk. Smiselno bi bilo raziskati, ali je potrebno dodajati vitamin E pri mačkah, ki uživajo izključno doma pripravljeno hrano z nizko vsebnostjo vitamina E in pri tistih mačkah s CKD, ki se iz različnih vzrokov ne zdravijo. 101 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 6 ZAKLJUČKI 1. Oksidativnih poškodb bioloških molekul pri mačkah s CKD nismo dokazali pri nobeni stopnji bolezni. 2. Antioksidantni mehanizmi pri mačkah s CKD niso iztrošeni, saj nismo ugotovili značilnih sprememb parametrov oksidativnega stresa. 3. Dodajanje vitamina E mačkam s CKD ne zmanjša oksidativnih poškodb bioloških molekul in ne pripomore k večji antioksidantni kapaciteti. 4. Dodajanje vitamina E k pripravljeni komercialni dietni hrani za mačke s CKD ob standardnem zdravljenju ni smiselno, saj ne zmanjša izražanja kliničnih znakov in ne podaljša časa preživetja. 102 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 7 POVZETEK Kronična ledvična odpoved (CKD) je med najpogostejšimi vzroki pogina pri mačkah. Pri ljudeh in psih s CKD je dokazano stanje oksidativnega stresa, ki pomembno sodeluje pri napredovanju bolezni, saj povzroči stanje kroničnega vnetja, oksidativne poškodbe membranskih in plazemskih lipidov, beljakovin in DNA. Dodajanje antioksidantov, predvsem vitamina E, dokazano zmanjša oksidativni stres, izboljša antioksidantne parametre, zmanjša poškodbe bioloških molekul in izboljša klinično stanje ljudi s CKD. Pri mačkah s CKD je področje oksidativnega stresa slabo raziskano, zato je bil namen naše raziskave preučiti prisotnost oksidativnega stresa pri mačkah s CKD na vseh kliničnih stopnjah bolezni. Oksidativni stres smo želeli ovrednotiti s stališča poškodb bioloških molekul in antioksidantnega statusa organizma. Končno smo želeli ugotoviti, ali dodatek vitamina E k zdravljenju po priporočilih IRIS izboljša klinično stanje in upočasni napredovanje bolezni. V preliminarni raziskavi smo pri mačkah s CKD in kontrolni skupini z enkratnim odvzemom krvi določili celokupno antioksidantno kapaciteto (TAC), aktivnost superoksidne dismutaze (SOD), plazemske in eritrocitne glutation peroksidaze (GPX) ter koncentracijo selena v serumu. V klinični raziskavi smo mačkam s CKD in zdravim mačkam določali koncentracijo malondialdehida (MDA) in proteinskih karbonilov v plazmi, stopnjo poškodbe jedrne DNA limfocitov, aktivnost plazemske GPX in koncentracijo vitamina E v plazmi. Mačke s kronično ledvično odpovedjo smo zdravili v skladu s smernicami IRIS in jim dodajali vitamin E oziroma placebo. Izbrane klinične, hematološke in biokemijske parametre ter parametre oksidativnega stresa in antioksidantnega statusa smo določili pred začetkom zdravljenja in 4, 8, 16 in 24 tednov po začetku zdravljenja. Pri mačkah s CKD v primerjavi s kontrolno skupino nismo ugotovili razlik v koncentraciji MDA, proteinskih karbonilov in stopnji poškodb DNA. Povečane stopnje lipidne peroksidacije, 103 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija oksidativnih poškodb beljakovin in DNA pri mačkah s CKD torej nismo dokazali. Nadalje smo ugotovili, da aktivnost SOD in TAC pri mačkah s CKD v primerjavi z zdravimi živalmi ni bila spremenjena. Tudi koncentracija selena se pri mačkah s CKD v primerjavi z zdravimi živalmi ni razlikovala. V preliminarni raziskavi smo pri mačkah v IRIS IV ugotovili značilno povečano aktivnost plazemske GPX, medtem ko v klinični raziskavi pri primerjavi aktivnosti tega encima pri mačkah v IRIS III in IV z IRIS I in II te razlike ni bilo. Zaključimo lahko, da antioksidantni mehanizmi pri mačkah s CKD niso iztrošeni in da selen ni omejujoč dejavnik. Pri mačkah v IRIS III in IV smo ugotovili nižjo koncentracijo MDA (2,76 ± 0,4 μM) kot pri mačkah z začetno stopnjo bolezni (3,66 ± 0,30 μM pri mačkah v IRIS I in 3,86 ± 1,12 μM pri mačkah v IRIS II). Razlika je bila značilna, če smo skupaj primerjali mačke v IRIS I in II s tistimi v IRIS III in IV (p = 0,037). Tudi koncentracija proteinskih karbonilov je bila pri mačkah v IRIS III in IV nekoliko nižja (29,11 ± 8,69 nmol/mL), kot pri mačkah v IRIS I (33,30 ± 12,30 nmol/mL) in II (35,20 ± 9,82 nmol/mL), vendar razlika ni bila značilna. Pri primerjavi stopnje poškodb DNA po posameznih stopnjah bolezni nismo ugotovili razlik. Zaključimo lahko, da antioksidantni mehanizmi pri mačkah v napredovalih stopnjah CKD niso iztrošeni. Dodajanje vitamina E je v primerjavi s placebo skupino v vseh stopnjah CKD nekoliko zmanjšalo nastajanje MDA, vendar razlika ni bila značilna. Dodajanje vitamina E ni imelo vpliva na stopnjo poškodb DNA. Pri mačkah v IRIS II se je po dajanju vitamina E koncentracija proteinskih karbonilov zmanjšala za 13 %, v placebo skupini pa povečala na 125 % začetne vrednosti, vendar razlika ni bila značilna (p = 0,086). Povzamemo lahko, da je dodajanje vitamina E ni značilno zmanjšalo oksidativnih poškodb bioloških molekul. Aktivnost plazemske GPX se je po dodajanju vitamina E pri mačkah v IRIS III in IV povečala za 7 % prvotne vrednosti, vendar razlika ni bila značilna. Mačke v IRIS I, ki so prejemale vitamin E, so imele na koncu raziskave značilno nižji tlak od mačk v skupini placebo (p = 0,05). Dodajanje vitamina E ni podaljšalo časa preživetja in ni zmanjšalo izraženosti kliničnih znakov, zato menimo, da ni smiselno. 104 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 8 SUMMARY Chronic kidney disease (CKD) is one of the most common reasons for mortality in cats. Oxidative stress has been identified as an important factor in the progression of the disease in dogs and human patients. It is an important mediator of chronic inflammation and causes oxidative damage to membrane and plasma lipids, proteins and DNA. Antioxidant supplementation decreases oxidative stress, increases antioxidant defence mechanisms, decreases the oxidative damage of biological molecules, and enhances the clinical status in human CKD patients. The purpose of this study was to test the hypotheses that oxidative stress is present in all clinical stages of feline CKD and that the activity of antioxidant enzymes is lowered. The authors also intended to study whether vitamin E supplementation enhances clinical and antioxidant parameters and reduces oxidative stress in cats with CKD. In the preliminary study, 28 cats with chronic kidney disease and 30 healthy controls were included. Total antioxidant capacity (TAC), superoxide dismutase (SOD) activity, plasma and erythrocyte glutathion peroxidase (GPX) activity and serum selenium concentration were measured. A total of 34 cats with chronic kidney disease and 38 healthy controls were included in the clinical study. Plasma malondialdehyde (MDA), protein carbonyls, DNA damage of peripheral lymphocytes, plasma GPX activity, and vitamin E concentration were measured. Cats with CKD were treated according to IRIS guidelines. In addition to standard therapy, they received vitamin E or a placebo. Selected clinical, haematological, biochemical, and antioxidant parameters as well as parameters of oxidative stress were measured at the beginning of the study and after they had been treated for 4, 8, 16, and 24 weeks. 105 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija There were no differences in plasma MDA concentration, protein carbonyl concentration or DNA damage in cats with CKD in comparison to the control group. A greater degree of lipid peroxidation and oxidative damage to proteins and DNA was not confirmed in cats with CKD. Furthermore, there was no difference in SOD and TAC in cats with CKD in comparison to the control group. Serum selenium was not found to be a limiting factor in feline CKD. Plasma GPX activity was found to be significantly increased in cats in IRIS IV in the preliminary study. However, no difference was found in plasma GPX activity in cats with IRIS III and IV compared to cats in IRIS I and II in the clinical study. To conclude, antioxidant parameters were not lowered; therefore, antioxidant defence mechanisms may not be exhausted in feline CKD. Cats in IRIS III and IV had a lower MDA concentration (2,76 ± 0,4 μM) than cats in IRIS I (3,66 ± 0,30 μM) and II (3,86 ± 1,12 μM). The difference was significant if cats in IRIS I and II were grouped together (p = 0,037). Moreover, plasma protein carbonyl concentration in cats with IRIS III and IV (29,11 ± 8,69 nmol/mL) was lower than in cats with IRIS I (33,30 ± 12,30 nmol/mL) and II (35,20 ± 9,82 nmol/mL). The difference was not significant. No difference in DNA damage in peripheral lymphocytes was found. Therefore, antioxidant defence mechanisms may not be exhausted in feline CKD. Vitamin E supplementation decreased MDA production to some extent, but the difference was not significant. Vitamin E supplementation had no effect on the extent of DNA damage. At the end of the study, protein carbonyl concentration was 13 % lower in the vitamin E group in cats with IRIS II when compared to the values at the beginning of the study. In contrast, there was a 25 % increase of the same parameter in the placebo group. However, the difference was not significant (p = 0,086). To sum up, vitamin E supplementation did not significantly decrease oxidative damage to biological molecules. Furthermore, vitamin E supplementation increased plasma GPX activity in cats with IRIS III and IV to some extent, but the difference was not significant. At the end of the study, cats in IRIS I that received vitamin E had significantly lower sistolic blood pressure than cats in the placebo group (p = 0,05). 106 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija In general, vitamn E supplementation had no effect on the course of the disease, clinical signs or survival. 107 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 9 ZAHVALE Iskrena hvala mentorici izr. prof. dr. Alenki Nemec Svete za vso podporo, vzpodbudo, potrpljenje in požrtvovalnost. Hvala za vaš čas in zaupanje. S svojim znanjem in zagonom dajete zgled, da tudi nemogoče situacije postanejo rešljive. Iskrena hvala somentorici prof. dr. Nataši Tozon za vzpodbudo in pomoč ter za vse kreativne predloge glede raziskovalnega in kliničnega dela. Cenim, da so vaša vrata vedno na stežaj odprta in da najdete prost trenutek, kadarkoli potrebujem vaš nasvet. Doc. dr. Bojani Žegura za potrpljenje, pomoč in neizčrpno dobro voljo. Vesela sem, da sem lahko sodelovala z vami. Prof. dr. Tomažu Vovku za pomoč pri določanju malondialdehida in proteinskih karbonilov. Dr. Gabrijeli Tavčar Kalcher za določanje vitamina E v vzorcih. Barbari Celinšek, dr. vet. med. in Aleksandru Jenku za pomoč pri obdelavi vzorcev. Zahvaljujem se veterinarskim tehnikom Biljani Grubišić, Mojci Juvan, Editi Okršlar, Katarini Ramljak in Renati Šušnjara za oporo in kreativni pristop pri rokovanju z ne vedno kooperativnimi mačjimi pacienti. Doc. dr. Lari Lusa za pomoč pri statistični analizi podatkov. Hvala Juretu, Vesni in ostalim družinskim članom, saj ste me razvedrili in mi stali ob strani tudi v najbolj stresnih trenutkih. Hvala, ker ste ves čas verjeli, da zmorem. Mag. Mateji Gaber za lektoriranje disertacije in Terryju Troyu Jacksonu za lektoriranje besedila v angleškem jeziku. Mag. Giti Grecs Smole za pomoč pri citiranju literature. 108 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 10 LITERATURA Aejmelaeus RT, Holm P, Kaukinen U, et al. Age-related changes in the peoxyl radical scavenging capacity of human plasma. Free Radic Biol Med 1997; 23(1): 69‒57. Agarwal R. Proinflammatory effects of oxidative stress in chronic renal disease: role of additional angiotensin II blockade. Am J Renal Physiol 2003; 284: F863‒9. Allan CB, Lacourciere GM, Stadtman TC. Responsiveness of selenoproteins to dietary selenium. Annu Rev Nutr 1999; 19: 1–16. Allen TA, Polzin DJ, Adams LG. Renal disease. In: Hand MS, Thatcher CD, Remillard RL, Roudebush P eds. Small animal clinical nutrition. 4th ed, Topeka: Mark Norris Institute, 2000: 536‒604. Andersen HR, Nielsen JB, Nielsen F, Grandjean P. Antioxidative enzyme activities in human erythrocytes. Clin Chem 1997; 43: 562‒8. Arthur JR. The glutatione peroxidases. Cell Mol Life Sci 2000; 57: 1825‒35. Avissar N, Ornt D, Yagil Y, et al. Human kidney proximal tubules are the main source of plasma glutathione peroxidase. Am J Physiol 1994; 266: C367-75. Arata S, Ohmi A, Mizukoshi F, Baba K, Setoguchi A, Tsujimoto H. Urinary transforming growth factor-β1 in feline chronic renal failure. J Vet Med Sci 2005; 67(12): 1253‒5. Berlett BS, Stadtman ER. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J Biol Chem1997; 272(33): 20313‒6. Bhogade RB, Suryakar AN, Joshi NG, Patil RY. Effect of vitamin E supplementation on oxidative stress in hemodialysis patients. Indian J Clin Biochem 2008; 23(3): 233‒7. Bolzán AD, Bianchi MS, Bianchi NO. Superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase activities in human blood: influence of sex, age and cigarette smoking. Clin Biochem 1997; 30: 449‒54. Brown SA. Oxidative stress and chronic kidney disease. Vet Clin Small Anim 2008; 38: 157‒66. Buranakarl C, Trisiriroj M, Pondeenana S, Tungjitpeanpong T, Jarutakanon P, Penchome R. Relationship between oxidative stress and red blood cell characteristics in renal azotemic dogs. Res Vet Sci 2009; 86(2): 309‒13. 109 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Ceballos-Picot I, Witko-Sarsat V, Merad-Boudia M, et al. Glutathione antioxidant system as a marker of oxidative stress in chronic renal failure. Free Radic Biol Med 1996; 21: 845‒53. Chakrabarti S, Syme HM, Brown CA, Elliott J. Histomorphometry of feline chronic kidney disease and correlation with markers of renal dysfunction. Vet Pathol 2012; 50(1):147‒55. Cristol JP, Bosc JY, Badiou S, et al. Erythropoietin and oxidative stress in haemodialysis: beneficial effects of vitamin E supplementation. Nephrol Dial Transplant 1997; 12:2312‒7. Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D, Milzani A, Colombo R. Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clin Chim Acta 2003; 3291: 23‒38. Del Rio D, Stewart AJ, Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule nad biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2005; 15: 316‒28. De Vecchi AF, Bamonti F, Novembrino C, et al. Free and total plasma malondialdehyde in chronic renal insufficiency and in dialysis patients Nephrol Dial Transplant 2009; 24: 2524–9. DiBartola SP, Bateman S. Introduction to fluid therapy. In: DiBartola SP, ed. Fluid, electrolyte, and acid-base disorders in small animal practice. 4th ed, St Louis: Saunders, 2012: 331‒350. Dotan Y, Lichtenberg D, Pinchuk I. Lipid peroxidation cannot be used as a universsal criterion of oxidative stress. Prog Lipid Res 2004; 43: 200‒27. Draper HH, Csallany AS, Hadley M. Urinary aldehydes as indicators of lipid peroxidation in vivo. Free Radical Biol Med 2000; 29: 1071‒7. Elliott J, Watson ADJ. Overview of the IRIS staging system for CKD. Basel: Novartis, 2013: 4 str.http://www.iris-kidney.com/education/staging-system.shtml (20.mar.2015) El-Far M, Bakr MA, Farahat SE, El-Fattah EA. Glutathione peroxidase activity in patients with renal disorders. Clin Exp Nephrol 2005; 9: 127‒31. Esterbauer H, Schaur RJ, Zollner Helmward. Chemistry aand biochemistry of 4-hydroxynonenal, malondialdehyde and related aldehydes. Free Radic Biol Med 1991; 11: 81‒128. Frantar B. Uporaba infuzijskih raztopin med anestezijo. In: Butinar J, Vintar N, Frantar B, Podgornik D, Seliškar A. Osnove anestezije malih živali. Ljubljana: Veterinarska fakulteta, 1997: 87‒99. Foster DJ, Thoday KL, Arthur JR, et al. Selenium status of cats in four regions of the world and comparison with reported incidence of hyperthyroidism in cats in those regions. Am J Vet Res 2001; 62: 934‒7. Galle J. Oxidative stress in chronic renal failure. Nephrol Dial Transplant 2001; 16: 2135‒7. 110 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Geddes RF, Finch NC, Elliott J, Syme HM. Fibroblast growth factor 23 in feline chronic kidney disease. J Vet Intern Med 2013; 27: 234‒1. Ghiselli A, Serafini M, Natella F, Scaccini C. Total antioxidant capacity as a tool to assess redox status: critical view and experimental data. Free Radic Biol Med 2000; 29(11): 1106‒14. Grauer GF. Measurement, interpretation, and implications of proteinuria and albuminuria. Vet Clin N AmSmall Pract 2007; 37: 283‒95. Greene JP, Lefebvre SL, Wang M, Yang M, Lund EM, Polzin DJ. Risk factors associated with the development of chronic kidney disease in cats evaluated at primary care veterinary hospitals. J Am Vet Med Assoc 2014; 244(3): 320‒7. Guemouri L, Artur Y, Herbeth B, Jeandel C, Cuny G, Siest G. Biological variability of superoxide dismutase, glutathione peroxidase, and catalase in blood. Clin Chem 1991; 37: 1932‒7. Habenicht LM, Webb TL, Clauss LA, Dow SW, Quimby JM. Urinary cytokine levels in apparently healthy cats and cats with chronic kidney disease. J Feline Med Surg 2013; 15(2): 99‒104. Halliwell B. Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life. Plant Physiol Biochem 2006; 141: 312‒22. Halliwell B, Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? Br J Clin Pharmacol 2004; 142: 231‒55. Hendriks WH, Wu YB, Shields RG. Vitamin E requirement of adult cats increases slightly with high dietary intake of polyunsaturated fatty acids J Nutr 2002; 132(6 Suppl. 2): 1613S-5S. Himmelfarb J, McMonagle E, Mc Menamin. Plasma thiol oxidation and carbonyl formation in chronic renal failure. Kidney Int 2000; 58: 2571‒78. Huang D, Ou B, Prior R. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J Agric Food Chem 2005; 53: 1841‒56. Hübner-Woźniak E, Okecka-Szymańska J, Stupnicki R, Malara M, Kozdroń E. Age-related blood antioxidant capacity in men and women. J Med Biochem 2011; 30:103–8. International Renal Interest Society. IRIS staging of CKD. Basel: Novartis, 2013a:8 str. http://www.iris-kidney.com/guidelines/staging.shtml (20.mar.2015) International Renal Interest Society: CKD Treatment guidelines. Basel: Novartis, 2013b:14 str. http://www.iris-kidney.com/guidelines/recommendations.shtml (20.mar.2015) Inal ME, Kanbak G, Sunal E. Antioxidant enzyme activities and malondialdehyde levels related to aging. Clin Chim Acta 2001; 305: 75‒80. 111 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Jepson RE, Brodbelt D, Vallance C, Syme HM, Elliott J. Evaluation of predictors of the development of azotemia in cats. J Vet Intern Med 2009; 23: 806‒13. Jewell, DE, Toll PW, Wedekind KJ, Zicker SC. Effect of increasing antioxidants on concentrations of vitamin E and total alkenals in serum of dogs and cats. Vet Ther 2000; 4(1): 264‒72. Kan E, Undeger U, Bali M, Basaran N. Assessment of DNA strand breakage by the alkaline COMET assay in dialysis patients and the role of vitamin E supplementation. Mutat Res 2002; 26(1/2): 151‒9. Kamal-Eldin A, Appelqvist LĂ. The chemistry and antioxidant properties of tocopherols and tocotrienols. Lipids 1996; 31(1): 671‒701. Kargin F, Fidanci UR. Kidney diseases and antioxidative metabolism in dogs. Turk J Vet Anim Sci 2001; 25(4): 607-13. Kasapoglu M, Ozben T. Alterations of antioxidant enzymes and oxidative stress markers in aging. Exp Gerontol 2001; 36(2): 209‒20. Keegan RF, Webb CB. Oxidative stress and neutrophil function in cats with chronic renal failure. J Vet Intern Med 2010; 24: 514‒9. King JN, Tasker S, Gunn-Moore DA, Stehlau G, BENRIC Study Group. Prognostic factors in cats with chronic kidney disease. J Vet Intern Med 2007; 21: 906‒16. Korman R, White J. Feline CKD. Current therapies-what is achievable? J Feline Med Surg 2013; 15(Suppl. 1): 29‒44. Krofič Žel M, Tozon N, Nemec Svete A. Plasma and erythrocyte glutathione peroxidase activity, serum selenium concentration, and plasma total antioxidant capacity in cats with IRIS stages I-IV chronic kidney disease. J Vet Intern Med 2014; 28(1): 130‒6. Kuehn NF: North American companion animal formulary. (online) 10th ed. Port Huron: North American Compendiums,2013:Vitamin E (2 str.) https://vsh.nacaf.naccvp.com(19. jun. 2015) Kuwahara Y, Ohba Y, Kitoh K, Kuwahara N, Kitagawa H. Association of laboratory data and death within one month in cats with chronic renal failure. J Small Anim Pract 2006; 47: 446‒50. Lawler DF, Evans RH, Chase K, et al. The aging feline kidney: a model mortality antagonist? J Feline Med Surg 2006; 8: 363‒71. Levine RL, Williams JA, Stadtman ER, et al. Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins. Methods Enzymol 1994; 233: 346‒57. Locattelli F, Canaud B, Eckardt KU, Stenvinkel P, Wanner C, Zoccali C. Oxidative stress in end- stage renal disease: an emerging threat to patient outcome. Nephrol Dial Transplant 2003; 18: 1272‒1280. 112 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Mates JM. Effects of antioxidant enzymes in the molecular control of reactive oxygen species toxicology. J Toxicol 2000; 153: 83-104. McCord JM, Fridovich I. Superoxide dismutase. J Biol Chem 1969; 244(22): 6049–55. Mendoza-Núñez VM, Ruiz-Ramos M, Sánchez-Rodríguez MA, Retana-Ugalde R, Muñoz- Sánchez JL. Aging-related oxidative stress in healthy humans. Tohoku J Exp Med 2007; 213: 261‒8. Miller NJ, Rice–Evans CA, Davies MJ, et al. A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clin Sci 1993; 84: 407‒12. Mitani S, Yabuki A, Sawa M, Chang HS, Yamato O. Intrarenal distributions and changes of angiotensin-converting enzyme and angiotensin-converting enzyme 2 in feline and canine chronic kidney disease. J Vet Med Sci 2014; 76(1): 45‒50. Mimić-Oka J, Simić T, Plješa M, Stupar N, Turković S. Oxidative modifications of plasma proteins in different stages of chronic renal failure. FU Med Biol 2001; 8(1): 1‒5. Mizuiri S, Ohashi Y. ACE and ACE 2 in kidney disease. World J Nephrol 2015; 4(1): 74‒82. Östling O, Johanson KJ. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damage in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun 1984; 123: 291‒8. Ozden M, Maral H, Akaydin D, et al. Erythrocyte glutathione peroxidase activity, plasma malondialdehyde and erythrocyte glutathione levels in hemodialysis and CAPD patients. J Clin Chem Clin Biochem 2002; 35: 269‒73. Paglia, DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 1967; 70: 158‒69. Pilz J, Meineke I, Gleiter C. Measurement of free and bound malondialdehyde in plasma by high- performance liquid chromatography as the 2,4-dinitrophenylhydrazine derivative. J Chromatogr B 2000; 742: 315‒25. Plumb DC. Plumb's veterinary drug handbook. (online) Ames: Wiley Blackwell, 2015:Vitamin E (3 str.)https://www.plumbsveterinarydrugs.com (19.jun. 2015) Polzin DJ. Evidence-based step-wise approach to managing chronic kidney disease in dogs and cats. J Vet Emerg Crit Care 2013; 23(2): 205‒15. Priya R, Vasudha KC. Antioxidant vitamins in chronic renal failure. Int J Biomed Res 2009; 20(1): 67‒70. Pryor WA, Stanley JP. A suggested mechanism for the production of malondialdehyde during the autoxidation of polyunsaturated fatty acids. Nonenzymatic production of prostaglandin endoperoxides during autoxiation. J Org Chem 1975; 40: 3615‒7. 113 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing 2015.http://www.R-project.org/(15. jun. 2015) Ramsey I, ed. Small animal formulary. 7th ed. Quedgelly: British Small Animal Veterinary Association, 2012:Vitamin E (1 str.) http://www.vin.com/members/cms/project/defaultadv1.aspx?pId=286(19.jun. 2015) Roudebush P, Polzin DJ, Ross SJ, Towell TL, Adams LG, Forrester SD. Therapies for feline chronic kidney disease, What is the evidence? J Feline Med Surg 2009; 11: 195‒210. Schiavon R, Guidi GC, Biasioli S, De Fanti E, Targa L. Plasma glutathione peroxidase activity as an index of renal function. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1994; 32: 759‒65. Silva AC, de Almeida BF, Soeiro CS, Ferreira WL, de Lima VM, Ciarlini PC. Oxidative stress, superoxide production, and apoptosis of neutrophils in dogs with chronic kidney disease. Can J Vet Res 2013; 77(2): 136‒41. Singh D Kaur R, Chander V, Chopra K. Antioxidants in the prevention of renal disease. J Med Food 2006; 9(4): 443‒50 Singh N, McCoy MT, Tice RR, Schneider L. A simple technique for quantitation of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res 1988; 175: 184‒91. Sivertsen T, Øvernes G, Østerås O, Nymoen Uand T. LunderT. Plasma vitamin E and blood selenium concentrations in norwegian dairy cows: regional differences and relations to feeding and health. Acta Vet Scand 2005; 46(4): 177‒91. Sommerburg O, Grune T, Ehrich JH et al. Adaptation of glutathion-peroxidase activity to oxidative stress occurs in children but not in adult patients with end-stage renal failure undergoing hemodialysis. Clin Nephrol 2002; 58(1): 31‒6. Stopper, H, Boullay F, Heidland A, Vienken J, Bahner U. Comet-assay analysis identifies genomic damage in lymphocytes of uremic patients. Am J Kidney Dis 2001; 38(2): 296‒301. Stowe HD, Lawler DF, Kealy RD. Antioxidant status of pair-fed labrador retrievers is affected by diet restriction and aging. J Nutr 2006; 136: 1844‒1848. Stoyanova E, Sandoval SB, Zuniga LA, et al. Oxidative DNA damage in chronic renal failure patients. Nephrol Dial Transplant 2010; 25(3): 879‒85. Sung CC, Hsu YC, Chen CC, Lin YF, Wu CC. Oxidative stress and nucleic acid oxidation in patients with chronic kidney disease. Oxid Med Cell Longev 2013; 2013:e301982. (15 str.)http://dx.doi.org/10.1155/2013/301982 (20. mar.2015) Syme H. Proteinuria in cats. Prognostic marker or mediator? J Feline Med Surg 2009; 11: 211‒8. Syme HM, Markwell PJ, Pfeiffer D, Elliott J. Survival of cats with naturally occuring chronic renal failure is related to severity of proteinuria. J Vet Intern Med 2006; 20: 528‒35. 114 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Todd SE, Thomas DG, Bosch G, et al. Selenium status in adult cats and dogs fed high levels of dietary inorganic and organic selenium. J Anim Sci 2012; 90: 2549‒455. Todorova I, Simeonova G, Kyuchkova D, Dinev D, Gadjeva V. Reference values of oxidative stress parameters (MDA, SOD, CAT) in dogs and cats. Comp Clin Pathol 2005; 13: 190‒4. Thurnham DI, Davies JA, Crump BJ, Situnayake RD, Davis M. The use of different lipids to express serum tocopherol:lipid ratios for the measuremnent of vitamin E status. Ann Clin Biochem 1986; 23: 514‒20. Tice RR, Agurell E, Anderson D, et al. Single cell gel/comet assay: guidelines fot in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen 2000; 35: 206‒21. Ursini F, Maiorino M, Brigelius-Flohé R, et al. Diversity of glutathione peroxidases. Methods Enzymol 1995; 252: 38‒53. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39: 44‒84. Vajdovich P, Gaál T, Szilágyi A, Harnos A. Changes in some red blood cell and clinical laboratory parameters in young and old Beagle dogs. Vet Res Commun 1997; 21: 463‒ 70. Vaziri ND, Dicus M, Ho ND, Boroujerdi-Rad L, Sindhu RK. Oxidative stress and dysregulation of superoxide dismutaze and NADPH oxidase in renal insufficiency. Kidney Int 2003; 63: 179‒85. Wardle EN. Cellular oxidative processes in relation to renal disease. Am J Nephrol 2005; 25: 13‒22. Whitin JC, Bhamre S, Tham DM, Cohen HJ. Extracellular glutathione peroxidase is secreted basolaterally ba human renal proximal tubule cells. Am J Physiol Renal Physiol 2002; 283: F20‒8. Winbauer AN, Pingree SS, Nuttall KL. Evaluating serum α-tocopherol (vitamin E) in terms of a lipid ratio. Ann Clin Lab Sci 1999; 29(3): 185‒91. Witko-Sarsat W, Friedlander M, Khoa TN, et al. Advanced oxidation protein products as novel mediators of inflammation and monocyte activation in chronic renal failure 1,2. J Immunol 1998; 161: 2524‒32. Yabuki A Mitani S, Fujiki M, et al. Comparative study of chronic kidney disease in dogs and cats: Induction of myofibroblasts. Res Vet Sci 2010; 88: 294‒9. Yoshimura S, Suemizu H, Nomoto Y, et al. Plasma glutathione peroxidase deficiency caused by renal dysfunction. Nephron 1996; 73(2): 207‒11. 115 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Yu S, Paetau-Robinson I. Dietary supplements of vitamins E and C and β-carotene reduce oxidative stress in cats with renal insufficiency. Vet Res Commun 2006; 30: 403‒13. Zachara B, Gromadzinska J, Wasowicz W. Zbrog Z. Red blood cell and plasm glutathione peroxidase activities and selenium concentration in patients with chronic kidney disease: a review. Acta Biochim Pol 2006; 53(4): 663‒77. Zagrodzki P, Barton H, Walas S, et al. Selenium status indices, laboratory data, and selected biochemical parameters in end-stage renal disease patients. Biol Trace Elem Res 2007; 116: 29‒41. Zhao B, Tham SY, Lu J, Lai MH, Lee LK, Moochhala SM. Simultaneous determination of vitamins C, E and beta-carotene in human plasma by high-performance liquid chromatography with photodiode-array detection. J Pharm Pharmaceut Sci. 2004; 7(2): 200‒4. Zicker SC, Wedekind KJ. Antioxidants. In: Hand MS, Thatcher CD, Remillard RL, Roudebush P, Novotny BJ, eds. Small animal clinical nutrition. 5th ed. Topeka: Mark Norris Institute, 2010: 149‒55. 116 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 11 PRILOGE 11.1 VPRAŠALNIK 1. Ali je vaša mačka redno cepljena? DA NE 2. Ali je kastriran/sterilizirana? DA NE 3. Katero hrano dobiva (znamka, oblika)? 4. Katere dodatke k hrani je dobila v zadnjem mesecu? 5. Ali je vaša mačka v zadnjem mesecu dobila zdravila? DA NE Če ste odgovorili z »da«, katera? 6. Kdaj je vaša mačka nazadnje jedla? 7. Kdaj je nazadnje pila? 8. Ali vsakodnevno dobiva zdravila? DA NE Če ste odgovorili z »da«, katera? 9. Ali normalno odvaja blato? DA NE 10. Kako pogosto odvaja vodo? NORMALNO POGOSTO 11. Koliko vode popije? 117 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija OBIČAJNO VEČ MANJ Ocena količine popite vode: 12. Ali je vaša mačka v zadnjem mesecu kazala katere od naštetih znakov bolezni? (ustrezno obkrožite) Neješčnost Hujšanje Bruhanje Driska Kihanje Kašelj Izcedek iz nosu ali oči 11.2 PRIPOMOČEK ZA OCENO IZRAŽENOSTI KLINIČNIH ZNAKOV Tabela 17: Ključ za oceno izraženosti kliničnih znakov Table 17: Key for severity of clinical signs assessment Počutje (ocena Odstotek izgube Dehidracija Apetit Slabost, Ulceracije v ustni lastnika) telesne mase bruhanje votlini 0 (zelo dobro) 0 (do 5 %) 0 (do 5 %) 0 (normalen) 0 (ne bruha) 0 (niso prisotne) 1 (srednje) 1 (do 10 %) 1 (5 do 10 %) 1 (zmanjšan) 1 (občasno) 1 (prisotne) 2 (slabo) 2 (do 15 %) 2 (10 %) 2 (neješčnost) 2 (pogosto) 3 (zelo slabo) 3 (15 %) Legenda: Seštevek točk: 0‒4: blagi klinični znaki; 5‒7: zaznavni klinični znaki; 8‒10: hudi klinični znaki; 10: nesprejemljivi klinični znaki, evtanazija Legend: Score: 0‒4 mild clinical signs; 5‒7: moderate clinical signs; 8‒10: severe clinical signs; 10:unacceptable clicical signs; euthanasia 118 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 11.3 IZBRANI HEMATOLOŠKI IN BIOKEMIJSKI PARAMETRI PRI MAČKAH S CKD, KI SO BILE VKLJUČENE V RAZISKAVO Tabela 18: Izbrani hematološki parametri pri mačkah s CKD (povprečje ± SD) pri prvem odvzemu vzorcev Table 18: Selected haematological parameters in cats with CKD (mean ± SD) at the beginning of the study Stopnja WBC neut lym mono eos baso luc RBC Hgb HCT PLT ret ret CKD (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×1012/L) (g/L) (1/1) (×109/L) (%) (×1012/L) I 4,92 3,03 1,55 0,1 0,59 0,02 0,01 8,72 121,83 0,40 211,33 0,43 0,039 n=7 ± 2,16 ± 1,69 ± 0,70 ± 0,03 ± 0,29 ± 0,04 ± 0,01 ± 0,82 ± 11,89 ± 0,03 ± 85,00 ± 0,31 ± 0,026 II 7,36 5,00 2,33 0,18 0,55 0,01 0,01 8,90 121,57 0,40 324,50 0,35 0,038 n=15 ± 3,01 ± 3,55 ± 2,23 ± 0,10 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 ± 1,40 ± 18,25 ± 0,06 ± 178,55 ± 0,24 ± 0,022 III+IV 10,24 8,2 1,47 0,29 0,41 0,00 0,02 6,89 100,58 0,33 340,42 0,22 0,024 n=12 ± 3,75 ± 3,45 ± 0,34 ± 0,20 ± 0,36 ± 0,00 ± 0,03 ± 1,17 ± 20,07 ± 0,06 ± 115,04 ± 0,13 ± 0,040 Legenda: CKD kronična ledvična odpoved; SD standardna deviacija; WBC levkociti; neut nevtrofilni granulociti; lym limfociti; mono monociti; eos eozinofilni granulociti; baso bazofilni granulociti; luc velike peroksidazno neaktivne celice; RBC eritrociti; Hgb hemoglobin; HCT hematokrit; PLT trombociti; ret retikulociti; n število mačk Legend: CKD Chronic Kidney Disease; SD Standard Deviation; WBC White Blood Cells; neut Neutrophils; lym Lymphocytes; mono Monocytes; eos Eosinophils; baso Basophils; luc Large Unstained Cells; RBC Red Blood Cells; HgbHemoglobin; HCT Hematocrit; PLT Platelets; ret reticulocytes; n number of cats 119 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 19: Izbrani biokemijski parametri (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD pri prvem odvzemu vzorcev Table 19: Selected biochemical parameters (mean ± SD) in cats with CKD at the beginning of the study Holesterol- Stopnja Na K Cl Ca aP Sečnina Kreatinin AP ALT TP Albumini Trigliceridi skupni CKD (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (μmol/L) (U/L) (U/L) (g/L) (g/L) (mmol/L) (mmol/L) I 154,71 4,33 121,93 2,50 1,36 10,44 133,24 22,36 49,16 75,02 33,45 5,43 0,94 n=7 ± 2,62 ± 0,37 ± 2,49 ± 0,15 ± 0,23 ± 3,17 ± 6,53 ± 5,73 ± 10,81 ± 5,55 ± 2,02 ± 1,56 ± 0,67 II 155,06 4,47 122,37 2,60 1,40 11,83 178,38 24,70 46,69 75,56 32,53 5,16 0,62 n=15 ± 5,74 ± 0,61 ± 5,24 ± 0,15 ± 0,31 ± 4,47 ± 29,01 ± 9,11 ± 16,30 ± 4,90 ± 4,21 ± 1,86 ± 0,34 III+IV 150,56 4,75 116,93 2,56 3,75 51,52 703,47 14,53 71,31 83,01 32,65 5,99 0,90 n=12 ± 3,45 ± 1,03 ± 3,72 ± 0,22 ± 1,36 ± 15,01 ± 225,92 ± 5,24 ± 35,27 ± 7,37 ± 3,65 ± 2,71 ± 0,25 Legenda: CKD kronična ledvična odpoved; SD standardna deviacija; Na natrij; K kalij; Cl klorid; Ca kalcij; aP anorganski fosfat; AP alkalna fosfataza; ALT alanin-aminotransferaza; TP skupne beljakovine; n število mačk Legend: CKD Chronic Kidney Disease; SD Standard Deviation; Na Sodium; K Potassium; Cl Chloride; Ca Calcium; aP Inorganic Phosphate; AP Alkaline Phosphatase; ALT Alanine Aminotransferase; TP Total Proteins; n number of cats 120 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 20: Izbrani hematološki parametri (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS I Table 20: Selected hematological parameters (mean ± SD) in cats with CKD IRIS I Odvzem WBC neut lym mono eos baso luc RBC Hgb PLT ret ret HCT (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109L) (×1012/L) (g/L) (×109/L) (%) (×1012/L) Vitamin E 5,19 3,39 1,52 0,11 0,50 0,00 0,00 8,40 116,67 0,39 157,33 0,43 0,039 1 n=3 ± 2,58 ± 1,96 ± 1,01 ± 0,04 ± 0,14 ± 0,00 ± 0,01 ± 1,05 ± 14,36 ± 0,05 ± 70,19 ± 0,25 ± 0,021 Placebo 4,64 2,67 1,59 0,09 0,68 0,03 0,01 9,04 127 0,41 265,33 0,43 0,040 n=4 ± 2,18 ± 1,71 ± 0,45 ± 0,02 ± 0,45 ± 0,06 ± 0,01 ± 0,5 ± 8,19 ± 0,02 ± 69,29 ± 0,42 ± 0,04 Vitamin E 3,86 2,19 1,28 0,11 0,27 0,01 0,01 7,77 114,00 0,36 265,00 0,10 0,011 2 n=1 - - - - - - - - - - - - - Placebo 4,94 2,89 1,56 0,10 0,38 0,00 0,01 9,31 132,33 0,43 174,00 0,37 0,033 n=4 ± 0,88 ± 0,48 ± 0,92 ± 0,03 ± 0,34 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,55 ± 9,29 ± 0,03 ± 65,14 ± 0,29 ± 0,026 Vitamin E 5,51 2,63 2,23 0,09 0,55 0,00 0,01 8,87 118,33 0,40 207,67 0,53 0,052 3 n=3 ± 2,71 ± 1,47 ± 1,27 ± 0,02 ± 0,15 ± 0,01 ± 0,01 ± 1,19 ± 10,97 ± 0,04 ± 66,40 ± 0,45 ± 0,048 Placebo 4,83 2,80 1,33 0,13 0,55 0,01 0,00 8,77 127,00 0,40 218,00 0,50 0,042 n=3 ± 2,19 ± 1,49 ± 0,74 ± 0,10 ± 0,15 ± 0,02 ± 0,01 ± 0,20 ± 2,00 ± 0,02 ± 66,16 ± 0,61 ± 0,050 Vitamin E 5,32 2,68 1,94 0,13 0,56 0,00 0,01 8,63 109,00 0,38 242,67 0,30 0,027 4 n=3 ±1,73 ± 1,02 ± 1,01 ± 0,06 ± 0,09 ± 0,00 ± 0,01 ± 1,64 ± 16,52 ± 0,06 ± 66,21 ± 0,20 ± 0,023 Placebo 5,58 3,49 1,39 0,14 0,55 0,01 0,01 9,21 123,00 0,40 211,00 0,30 0,027 n=3 ± 2,38 ± 1,99 ± 0,99 ± 0,10 ± 0,27 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,56 ± 7,55 ± 0,04 ± 95,17 ± 0,10 ± 0,007 Vitamin E 5,54 3,19 2,01 0,11 0,22 0,00 0,01 9,18 118,00 0,38 142,67 0,40 0,040 5 n=3 ± 1,59 ± 1,05 ± 1,20 ± 0,01 ± 0,03 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,76 ± 6,08 ± 0,01 ± 87,96 ± 0,36 ± 0,04 Placebo 5,43 2,88 1,92 0,09 0,64 0,00 0,01 8,59 115,33 0,38 210,33 0,37 0,030 n=3 ± 1,72 ± 0,45 ± 1,08 ± 0,01 ± 0,22 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,98 ± 13,87 ± 0,03 ± 78,01 ± 0,23 ± 0,020 Legenda: SD standardna deviacija; WBC levkociti; neut nevtrofilni granulociti; lym limfociti; mono monociti; eos eozinofilni granulociti; baso bazofilni granulociti; luc velike peroksodazno neaktivne celice; RBC eritrociti; Hgb hemoglobin; HCT hematokrit; PLT trombociti; ret retikulociti; n število mačk Legend: SD Standard Deviation; WBC White Blood Cells; neut Neutrophils; lym Lymphocytes; mono Monocytes; eos Eosinophils; baso Basophils; luc Large Unstained Cells; RBC Red Blood Cells; Hgb Hemoglobin; HCT Hematocrit; PLT Platelets; ret reticulocytes; n number of cats 121 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 21: Izbrani hematološki parametri (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS II Table 21: Selected hematological parameters (mean ± SD) in cats with CKD IRIS II WBC neut lym mono eos baso luc RBC Hgb PLT ret ret Odvzem (×109 HCT /L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×1012/L) (g/L) (×109/L) (%) (×1012/L) Vitamin E 7,11 3,43 3,02 0,15 0,49 0,01 0,02 8,91 120,67 0,40 316,50 0,19 0,029 1 n=7 ± 4,02 ± 1,19 ± 3,39 ± 0,06 ± 0,32 ± 0,01 ± 0,02 ± 1,76 ± 17,45 ± 0,06 ± 167,28 ± 0,16 ± 0,020 Placebo 7,56 5,99 1,81 0,21 0,59 0,01 0,01 8,90 122,25 0,40 330,50 0,46 0,04 n=8 ± 2,26 ± 4,32 ± 0,54 ± 0,12 ± 0,31 ± 0,02 ± 0,01 ± 1,19 ± 19,99 ± 0,06 ± 197,80 ± 0,23 ± 0,02 Vitamin E 5,81 3,11 1,59 0,12 0,97 0,00 0,02 9,53 130,80 0,42 251,80 0,32 0,032 n=6 2 ± 2,46 ± 1,36 ± 0,39 ± 0,07 ± 1,91 ± 0,01 ± 0,02 ± 1,27 ± 11,95 ± 0,04 ± 142,14 ± 0,25 ± 0,028 Placebo 10,64 7,75 1,90 0,28 0,68 0,00 0,02 8,94 121,43 0,40 370,57 0,24 0,021 n=7 ± 6,02 ± 5,94 ± 0,70 ± 0,29 ± 0,45 ± 0,01 ± 0,04 ± 1,06 ± 17,70 ± 0,04 ± 208,09 ± 0,14 ± 0,012 Vitamin E 7,42 2,62 4,00 0,14 0,66 0,00 0,01 9,37 135,00 0,43 233,00 0,30 0,025 3 n=4 ± 4,50 ± 0,82 ± 3,48 ± 0,06 ± 0,37 ± 0,00 ± 0,01 ± 0,59 ± 12,49 ± 0,04 ± 30,79 ± 0,17 ± 0,015 Placebo 7,50 4,74 1,80 0,25 0,70 0,00 0,02 8,84 118,33 0,39 321,33 0,32 0,027 n=6 ± 1,81 ± 1,48 ± 0,55 ± 0,15 ± 0,39 ± 0,01 ± 0,02 ± 1,12 ± 17,55 ± 0,05 ± 142,21 ± 0,21 ± 0,019 Vitamin E 5,47 2,78 2,17 0,12 0,39 0,00 0,01 8,71 119,40 0,39 256,40 0,28 0,023 4 n=6 ± 2,37 ± 0,89 ± 1,30 ± 0,04 ± 0,43 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,79 ± 14,84 ± 0,04 ± 37,71 ± 0,18 ± 0,016 Placebo 7,77 3,91 2,87 0,22 0,76 0,00 0,01 9,16 120,25 0,41 288,75 0,55 0,052 n=4 ± 2,76 ± 2,41 ± 0,53 ± 0,17 ± 0,43 ± 0,00 ± 0,01 ± 1,29 ± 19,59 ± 0,07 ± 149,36 ± 0,39 ± 0,037 Vitamin E 4,97 2,86 1,50 0,13 0,46 0,00 0,01 9,27 124,80 0,41 262,40 0,26 0,03 5 n=5 ± 0,52 ± 0,37 ± 0,40 ± 0,04 ± 0,34 ± 0,01 ± 0,01 ± 2,02 ± 19,99 ± 0,06 ± 80,61 ± 0,17 ± 0,01 Placebo 10,04 6,43 2,74 0,30 0,53 0,01 0,02 9,13 124,00 0,41 271,40 0,32 0,03 n=5 ± 3,60 ± 3,94 ± 1,18 ± 0,24 ± 0,27 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,64 ± 9,41 ± 0,04 ± 156,08 ± 0,11 ± 0,01 Legenda: SD standardna deviacija; WBC levkociti; neut nevtrofilni granulociti; lym limfociti; mono monociti; eos eozinofilni granulociti; baso bazofilni granulociti; luc velike peroksidazno neaktivne celice RBC eritrociti; Hgb hemoglobin; HCT hematokrit; PLT trombociti; ret retikulociti; n število mačk Legend: SD Standard Deviation; WBC White Blood Cells; neut Neutrophils; lym Lymphocytes; mono Monocytes; eos Eosinophils; baso Basophils; luc Large Unstained Cells; RBC Red Blood Cells; Hgb Hemoglobin; HCT Hematocrit; PLT Platelets; ret reticulocytes; n number of cats 122 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 22: Izbrani hematološki parametri (povprečje ± SD; vrednost pri n = 1) pri mačkah s CKD IRIS III in IV Table 22: Selected hematological parameters (mean ± SD; value if n = 1) in cats with CKD IRIS III and IV Odvzem WBC neut lym mono eos baso luc RBC Hgb PLT ret ret HCT (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×109/L) (×1012/L) (g/L) (×109/L) (%) (×1012/L) 11,34 9,03 1,47 0,35 0,46 0,00 0,03 7,03 103,00 0,34 368,38 0,16 0,010 Vitamin E n=8 ± ± 3,70 ± 3,43 ± 0,35 ± 0,22 ± 0,42 ± 0,00 ± 0,03 ± 1,32 ± 24,45 ± 0,07 ± 0,10 ± 0,010 110,49 1 8,49 6,54 1,48 0,16 0,31 0,00 0,00 6,62 95,75 0,31 284,50 0,33 0,050 Placebo n=4 ± ± 2,93 ± 3,28 ± 0,36 ± 0,07 ± 0,22 ± 0,00 ± 0,01 ± 0,89 ± 5,91 ± 0,03 ± 0,10 ± 0,070 117,41 8,22 6,01 1,69 0,24 0,27 0,00 0,00 7,56 108,67 0,34 350,00 0,13 0,011 Vitamin E 2 n=4 ± ± 5,27 ± 3,47 ± 1,46 ± 0,15 ± 0,26 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,35 ± 14,98 ± 0,05 ± 0,06 ± 0,007 186,66 9,50 6,94 2,21 0,19 0,17 0,00 0,01 7,32 99,50 0,33 280,00 0,25 0,018 Placebo n=2 ± 3,27 ± 2,31 ± 0,81 ± 0,18 ± 0,02 ± 0,00 ± 0,01 ± 0,47 ± 6,36 ± 0,01 ± 11,31 ± 0,07 ± 0,006 6,51 4,13 1,78 0,22 0,38 0,00 0,00 7,97 113,67 0,37 176,33 0,30 0,025 Vitamin E 3 n=3 ± ± 3,01 ± 2,31 ± 1,22 ± 0,08 ± 0,22 ± 0,00 ± 0,01 ± 1,83 ± 34,31 ± 0,11 ± 0,10 ± 0,012 186,74 7,25 4,69 2,01 0,10 0,42 0,01 0,02 7,67 107,00 0,34 274,00 0,40 0,031 Placebo n=1 - - - - - - - - - - - - - Vitamin E 11,34 8,49 1,97 0,42 0,45 0,00 0,01 7,41 107,50 0,35 317,50 0,25 0,018 4 n=2 ± 9,64 ± 9,52 ± 0,05 ± 0,36 ± 0,17 ± 0,00 ± 0,01 ± 2,22 ± 43,13 ± 0,13 ± 27,58 ± 0,07 ± 0,009 Placebo 7,54 5,41 1,69 0,14 0,29 0,01 0,02 7,69 108,00 0,35 248,00 0,25 0,021 n=2 ± 1,56 ± 2,02 ± 0,23 ± 0,11 ± 0,36 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,35 ± 4,24 ± 0,01 ± 28,28 ± 0,07 ± 0,008 Vitamin E 12,69 8,69 2,89 0,27 0,83 0,02 0,00 4,78 64,00 0,20 73 0,40 0,021 5 n=1 - - - - - - - - - - - - - Placebo 7,86 5,66 1,36 0,14 0,69 0,00 0,01 7,21 101,00 0,33 295,00 0,10 0,010 n=1 - - - - - - - - - - - - - Legenda: CKD kronična ledvična odpoved; SD standardna deviacija; WBC levkociti; neut nevtrofilni granulociti; lym limfociti; mono monociti; eos eozinofilni granulociti; baso bazofilni granulociti; luc velike peroksidazno neaktivne celice; RBC eritrociti; Hgb hemoglobin; HCT hematokrit; PLT trombociti; ret retikulociti; n število mačk Legend: CKD Chronic Kidney Disease; SD Standard Deviation; WBC White Blood Cells; neut Neutrophils; lym Lymphocytes; mono Monocytes; eos Eosinophils; baso Basophils; luc Large Unstained Cells; RBC Red Blood Cells; Hgb Hemoglobin; HCT Hematocrit; PLT Platelets; ret reticulocytes; n number of cats 123 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 23: Izbrani biokemijski parametri (povprečje ± SD; vrednost pri n = 1) pri mačkah s CKD IRIS I Table 23: Selected biochemical parameters (mean ± SD; value in n = 1) in cats with CKD IRIS I Holesterols Odvzem Na K Cl Ca aP Sečnina Kreatinin AP ALT TP Albumini Trigliceridi kupni (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (μmol/L) (U/L) (U/L) (g/L) (g/L) (mmol/L) (mmol/L) Vitamin E 155,43 4,35 120,55 2,45 1,45 10,85 132,00 25,23 50,85 76,78 34,74 5,21 1,19 1 n=3 ± 3,33 ± 0,47 ± 2,32 ± 0,20 ± 0,27 ± 4,39 ± 5,94 ± 5,40 ± 14,76 ± 5,19 ± 0,99 ± 2,16 ± 0,83 Placebo 155,43 4,35 120,55 2,45 1,45 10,85 132,00 25,23 50,85 76,78 34,74 5,21 1,19 n=4 ± 3,33 ± 0,47 ± 2,32 ± 0,20 ± 0,27 ± 4,39 ± 5,94 ± 5,40 ± 14,76 ± 5,19 ± 0,99 ± 2,16 ± 0,83 Vitamin E 150,70 4,29 120,30 2,50 1,30 8,47 137,98 19,05 48,10 71,34 32,75 6,50 0,41 2 n=2 - - - ± 0,01 ±0,18 ± 0,47 ± 0,81 ± 8,13 ± 4,24 ± 0,37 ± 2,19 ± 0,75 ± 0,16 Placebo 155,60 4,62 121,20 2,48 1,54 9,18 145,36 28,60 51,38 77,65 34,00 4,83 0,85 n=4 ± 2,12 ± 0,27 ± 1,49 ± 0,18 ± 0,07 ± 3,35 ± 12,49 ± 5,25 ± 25,32 ± 9,25 ±0,82 ± 1,27 ± 0,44 Vitamin E 153,10 4,43 121,33 2,44 1,31 10,47 144,52 21,13 47,77 72,59 31,75 6,31 0,93 3 n=3 ± 1,56 ± 0,20 ± 0,98 ± 0,04 ± 0,19 ± 1,67 ± 21,90 ± 3,37 ± 11,79 ± 11,49 ± 0,22 ± 0,49 ± 0,43 Placebo 156,00 4,53 122,10 2,58 1,43 10,11 141,04 23,20 44,80 77,1 32,62 4,90 0,73 n=3 ± 2,12 ± 0,13 ± 0,14 ± 0,25 ± 0,19 ± 3,81 ± 15,28 ± 16,53 ± 6,36 ± 6,01 ± 1,25 ± 0,35 ± 0,39 Vitamin E 152,63 4,06 122,63 2,43 1,40 9,15 136,30 24,03 49,63 71,65 31,98 4,91 0,52 4 n=3 ± 1,39 ± 0,39 ± 0,90 ± 0,04 ± 0,08 ± 0,69 ± 36,87 ± 4,43 ± 8,28 ± 10,20 ± 1,32 ± 1,11 ± 0,17 Placebo 155,73 4,47 121,53 2,62 1,53 9,74 140,39 21,60 43,40 71,27 32,85 4,24 0,69 n=3 ± 2,40 ± 0,47 ± 1,77 ± 0,08 ± 0,18 ± 2,22 ± 42,70 ± 7,99 ± 1,95 ± 2,21 ± 1,60 ± 1,50 ± 0,33 Vitamin E 153,20 4,09 121,37 2,55 1,26 10,02 129,17 26,23 45,17 71,29 31,87 5,77 1,57 5 n=3 ± 0,78 ± 0,24 ± 0,75 ± 0,10 ± 0,25 ± 0,82 ± 11,53 ± 8,31 ± 6,62 ± 6,01 ± 0,99 ± 0,63 ± 1,65 Placebo 154,23 4,47 121,33 2,48 1,61 9,95 142,08 18,40 37,87 75,84 33,35 4,59 0,88 n=3 ± 2,50 ± 0,51 ± 1,44 ± 0,09 ± 0,07 ± 3,65 ± 35,75 ± 5,03 ± 6,60 ± 7,12 ± 1,06 ± 0,34 ± 0,53 Legenda: CKD kronična ledvična odpoved; SDstandardna deviacija; Nanatrij; Kkalij; Cl klorid; Ca kalcij; aP anorganski fosfat; AP alkalna fosfataza; ALT alanin-aminotransferaza; TP skupne beljakovine; n število mačk Legend: CKD Chronic Kidney Disease; SD Standard Deviation; Na Sodium; K Potassium; Cl Chloride; Ca Calcium; aP Inorganic Phosphate; AP Alkaline Phosphatase; ALT Alanine Aminotransferase; TP Total Proteins; n number of cats 124 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 24: Izbrani biokemijski parametri (povprečje ± SD) pri mačkah s CKD IRIS II Table 24: Selected biochemical parameters (mean ± SD) in cats with CKD IRIS II Holesterol- Odvzem Na K Cl Ca aP Sečnina Kreatinin AP ALT TP Albumini Trigliceridi skupni (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (μmol/L) (U/L) (U/L) (g/L) (g/L) (mmol/L) (mmol/L) Vitamin E 157,50 4,72 125,72 2,61 1,32 9,57 169,70 28,26 37,22 75,52 32,52 5,22 0,48 1 n=7 ± 7,13 ± 0,62 ± 4,80 ± 0,21 ± 0,13 ± 1,31 ± 19,72 ± 12,97 ± 15,39 ± 4,86 ± 2,90 ± 1,95 ± 0,08 Placebo 153,24 4,28 119,86 2,59 1,45 13,52 184,89 22,48 52,61 75,59 32,53 5,12 0,73 n=8 ± 4,00 ± 0,56 ± 4,22 ± 0,11 ± 0,40 ± 5,31 ± 34,23 ± 5,62 ± 14,70 ± 5,27 ± 5,19 ± 1,91 ± 0,43 Vitamin E 153,93 4,45 122,23 2,60 1,34 11,11 174,12 32,38 74,20 76,77 32,11 5,75 0,63 2 n=6 ± 1,48 ± 0,49 ± 2,34 ± 0,14 ± 0,25 ± 4,09 ± 32,87 ± 13,41 ± 66,02 ± 4,35 ± 1,88 ± 1,31 ± 0,11 153,76 4,35 121,86 2,56 1,42 12,66 189,08 26,06 61,52 74,69 30,77 5,71 0,94 Placebo n=7 ± 1,95 ± 0,61 ± 2,02 ± 0,09 ± 0,34 ± 3,87 ± 56,35 ± 11,35 ± 10,34 ± 4,87 ± 4,75 ± 2,53 ± 0,90 Vitamin E 153,70 4,38 120,43 2,55 1,41 14,35 204,43 21,98 72,00 76,42 33,33 5,58 0,64 3 n=4 ± 1,43 ± 0,60 ± 1,84 ± 0,21 ± 0,23 ± 8,73 ± 41,45 ± 9,32 ± 66,64 ± 7,51 ± 3,24 ± 1,18 ± 0,32 154,37 4,79 123,35 2,51 1,32 15,35 193,57 22,05 59,10 75,26 31,09 6,01 0,71 Placebo n=6 ± 1,97 ± 0,73 ± 2,42 ± 0,10 ± 0,25 ± 10,58 ± 95,57 ± 7,63 ± 7,48 ± 5,90 ± 4,24 ± 2,42 ± 0,44 Vitamin E 152,10 4,39 122,00 2,56 1,31 11,27 184,62 21,24 66,98 75,53 32,75 5,07 0,64 4 n=6 ± 2,98 ± 0,69 ± 2,27 ± 0,09 ± 0,15 ± 5,04 ± 43,21 ± 5,25 ± 32,60 ± 4,00 ± 2,68 ± 1,29 ± 0,32 152,93 4,41 121,80 2,55 1,44 11,63 141,36 22,98 54,05 72,82 32,87 5,70 1,15 Placebo n=4 ± 2,15 ± 0,43 ± 3,20 ± 0,15 ± 0,42 ± 5,19 ± 14,01 ± 3,28 ± 11,35 ± 8,92 ± 6,25 ± 3,54 ± 1,35 Vitamin E 151,33 4,46 124,30 2,62 1,35 12,99 192,22 26,00 51,48 74,89 31,20 5,90 0,81 5 n=5 ± 3,55 ± 0,63 ± 2,79 ± 0,24 ± 0,29 ± 6,23 ± 61,79 ± 13,76 ± 32,33 ± 7,46 ± 1,27 ± 1,60 ± 0,45 154,48 4,28 125,08 2,62 1,40 11,51 153,77 24,62 131,04 76,59 32,65 6,38 0,72 Placebo n=5 ± 4,34 ± 0,54 ± 6,06 ± 0,18 ± 0,26 ± 4,60 ± 9,23 ± 7,46 ± 155,63 ± 8,20 ± 4,30 ± 2,75 ± 0,52 Legenda: CKD kronična ledvična odpoved; SD standardna deviacija; Na natrij; K kalij; Cl klorid; Ca kalcij; aP anorganski fosfat; AP alkalna fosfataza; ALT alanin-aminotransferaza; TP skupne beljakovine; n število mačk Legend: CKD Chronic Kidney Disease; SD Standard Deviation; Na Sodium; K Potassium; Cl Chloride; Ca Calcium; aP Inorganic Phosphate; AP Alkaline Phosphatase; ALT Alanine Aminotransferase; TP Total Proteins; n number of cats 125 M. Krofič Žel: Vpliv vitamina E na oksidativni stres in potek kronične ledvične odpovedi pri mačkah. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Tabela 25: Izbrani biokemijski parametri (povprečje ± SD; vrednost pri n = 1) pri mačkah s CKD IRIS III in IV Table 25: Selected biochemical parameters (mean ± SD; value in n = 1) in cats with CKD IRIS III and IV holesterol- Odvzem Na K Cl Ca aP sečnina kreatinin AP ALT TP albumini trigliceridi skupni (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (μmol/L) (U/L) (U/L) (g/L) (g/L) (mmol/L) (mmol/L) Vitamin E 151,48 4,69 118,95 2,57 3,12 41,61 582,19 17,14 56,24 79,67 32,01 5,06 0,85 1 n=8 ± 3,22 ± 0,96 ± 3,63 ± 0,15 ± 1,6 ± 19,81 ± 301,14 ± 5,3 ± 14,87 ± 9,55 ± 4,3 ± 0,87 ± 0,29 152,33 4,58 118,1 2,64 2,67 36,88 441,65 12,9 76,73 80,95 30,93 7,22 0,52 Placebo n=4 ± 4,12 ± 0,67 ± 4,13 ± 0,27 ± 1,3 ± 16,99 ± 178,58 ± 6,37 ± 49,72 ± 9,04 ± 2,79 ± 3,28 ± 0,21 Vitami E 154,90 4,94 120,17 2,50 1,65 20,02 433,96 30,67 37,80 73,65 32,42 4,79 0,82 2 n=4 ± 1,01 ± 0,69 ± 5,08 ± 0,30 ± 0,71 ± 12,81 ± 218,90 ± 12,55 ± 10,94 ± 14,21 ± 0,84 ± 1,11 ± 0,06 155,10 4,48 119,10 2,48 1,59 23,47 338,74 6,60 40,10 75,02 27,27 7,84 0,46 Placebo n=2 - - - - - ± 2,31 ± 41,81 - - - - - - Vitamin E 156,37 4,58 122,57 2,63 1,26 12,21 295,72 33,80 81,27 71,63 33,02 5,15 0,90 3 n=3 ± 2,22 ± 0,33 ± 2,27 ± 0,08 ± 0,42 ± 8,74 ± 171,73 ± 10,13 ± 36,97 ± 9,45 ± 3,14 ± 0,88 ± 0,29 152,80 4,10 122,70 2,71 2,86 29,03 292,03 5,60 34,80 83,24 28,94 8,92 0,81 Placebo n=1 - - - - - - - - - - - - Vitamin E 156,05 4,59 122,60 2,63 1,49 24,65 382,36 21,55 45,25 77,15 33,01 5,78 1,06 4 n=2 ± 6,43 ± 0,38 ± 6,51 ± 0,07 ± 0,49 ± 24,11 ± 317,12 ± 14,78 ± 1,77 ± 3,05 ± 5,53 ± 0,76 ± 0,30 154,75 4,73 122,10 2,62 1,50 20,33 281,84 11,60 53,75 80,51 29,56 6,82 0,36 Placebo n=2 ± 1,77 ± 0,23 ± 2,69 ± 0,21 ± 0,17 ± 0,07 ± 13,73 ± 4,81 ± 34,15 ± 3,87 ± 2,03 ± 0,26 ± 0,04 Vitamin E 152,4 4,67 115,7 3,05 2,72 34,2 537,0 18,1 52,8 88,6 34,7 7,2 0,90 5 n=1 - - - - - - - - - - - - - 157,40 3,99 124,10 2,51 2,01 25,45 288,80 7,30 37,50 78,02 29,44 6,09 0,49 Placebo n=1 - - - - - - - - - - - - - Legenda: CKD kronična ledvična odpoved; SD standardna deviacija; Na natrij; K kalij; Cl klorid; Ca kalcij; aP anorganski fosfat; AP alkalna fosfataza; ALT alanin-aminotransferaza; TP skupne beljakovine; n število mačk Legend: CKD Chronic Kidney disease; SD Standard deviation; Na Sodium; K Potassium; Cl Chloride; Ca Calcium; aP Inorganic Phosphate; AP Alkaline Phosphatase; ALT Alanine Aminotransferase; TP Total Proteins; n number of cats