Farmacevtski vestnik STROKOVNO GLASILO SLOVENSKE FARMACIJE • PHARMACEUTICAL JOURNAL OF SLOVENIA ĜT 3 • OKTOBER 2005 • LETNIK 56 Odgovorni urednik Borut Ĝtrukelj Œastni glavni urednik Aleĝ Krbavœiœ Glavna urednica Andrijana Tivadar Uredniĝki odbor Tajda Gala Miharija Stanko Gobec Katja Gombaœ Aver Iztok Grabnar Janja Marc Franc Vreœer Izdajateljski svet Stane Srœiœ Mojca Kerec Tatjana Kogovĝek Vidmar Mateja Maleĝiœ Zofija Vitkoviœ Anamarija Zega Magda Zimic Naslov uredniĝtva / Adress of the Editorial Office: Farmacevtski vestnik, Aĝkerœeva 7, SI-1000 Ljubljana, telefon/phone: 386 1 476 95 00 Farmacevtski vestnik izdaja Slovensko farmacevtsko druĝtvo, Dunajska 184a, 1000 Ljubljana, Telefon (01) 569 26 01 Transakcijski raœun pri Novi LB d.d. Ljubljana: 02010-0016686585. Izhaja ĝtirikrat letno. Letna naroœnina je 15.000 SIT, za œlane SFD je vkljuœena v œlanarino. Za tuje naroœnike 100 US$. Avtor fotografije na naslovnici, Silvo Koder Tiska: COLLEGIUM GRAPHICUM Naklada: 2900 izvodov Letnik 2005 sofinancira Javna agencija za raziskovalno dejavnost RS Farmacevtski vestnik (Pharmaceutical Journal of Slovenia) is published quarterly by the Slovenian Pharmaceutical Society, Subscription rate in inland 15.000 SIT other countries US$ 100. Farmacevtski vestnik is regulary abstracted in: BIOLOGICAL ABSTRACTS, CHEMICAL ABSTRACTS, PHARMACEUTICAL ABSTRACTS, MEDICAL & AROMATIC PLANTS ABSTRACTS AND INBASE / Excerpta Medica Ali res lahko pride do pandemije ptiœje gripe? Pandemija ĉe obstaja, a le med ptiœjimi vrstami, pri œemer so doloœene vrste prenaĝalci, doloœene pa tudi zbolijo. Zaradi velike sposobnosti mutacije dveh povrĝinskih proteinov v kapsidi virusa H5N1 (H=hemaglutinin, N=nevraminidaza), obstaja doloœena verjetnost takĝne spremembe , ki bi omogoœala ĝiritev virusa gripe od œloveka do œloveka. A verjetnost je relativno majhna. Vsaj trenutno. Do pandemije pa bo gotovo priĝlo, vmes pa je lahko nekaj let ali tudi desetletje. Verjetno je pretirana brezglavost, ki smo ji priœa, trenutno odveœ. Vsakih nekaj desetletij paœ pride do pandemije virsunih obolenj. S sodobno farmakoterapijo smo kos dobrĝnemu delu bolezenskih stanj, bolezneska znamenja vsaj omilimo, zato verjamem, da bomo tudi pri ptiœji gripi priĝli do reĝitev. Verjetno v obliki aktivne imunizacije prebivalstva. O poteku bolezni in zdravljenju bo izĝel obĝiren œlanek v naslednji, œetrti ĝtevilki Farmacevtskega vestnika, o cepljenju, kot moĉnemu naœinu preventive, pa si lahko preberete noviœko v rubriki ğNovice iz sveta farmacijeĞ V tej ĝtevilki predstavljamo dva izvirna znanstvena œlanka, ki prikazujeta del raziskav dveh raziskovalnih skupin na Fakulteti za farmacijo. Prvi œlanek nas seznanja z genetiko laktozne intolerance. Kakĝen genotip za laktazo imamo Slovenci? Na kakĝen naœin ga doloœimo? Preberite si v priœujoœi preiskavi. Drug œlanek je tehnoloĝko obarvan, vsebuje pa raziskavo s pomoœjo inverzne plinske kromatografije, ki je redkost v srednji Evropi. Na Fakulteti za farmacijo smo ponosni, da aparaturo, predvsem pa veĝœino upravljanja z njo, dobro poznamo. V preglednih œlankih bomo brali o hitro se razvijajoœem podroœju tkivnega inĉenirstva, o prehodu zdravil skozi placento in o ciljani dostavi zdravil z liposomi pri zdravljenju rakavih obolenj. Vsa naĝteta podroœja kaĉejo na veliko raznolikost, ki jih slovenska farmacija premore, kljub skromni finanœni podpori za znanost in tehnologijo. Zanimiva je vzporednica, ki sama nakazuje pravo smer razvoja: drĉave, ki veliko vlagajo v znanost in izobraĉevanje, prevzemajo vodilno vlogo v gospodarstvu. Le upamo lahko, da se bomo tudi iz takih podatkov kaj nauœili. Odgovorni urednik prof. dr. Borut Ĝtrukelj, mag. farm. farm vestn 2005; 56 181 Vsebina Borut Ĝtrukelj Beseda odgovornega urednika 181 Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles Nataĝa Karas Kuĉeliœki, Jana Lukaœ-Bajalo Genetika laktozne intolerance odraslih in pogostost polimorfizma -13910C>T v slovenski populaciji Genetics of adult-type lactose intolerance and frequency of -13910C>T polymorphism in Slovenian population 183 Odon Planinĝek, Jernej Zadnik, Matjaĉ Kunaver, Marjan Bele, Stane Srœiœ Doloœanje povrĝinskih lastnosti vzorcev laktoze, pripravljene s suĝenjem z razprĝevanjem, z liofilizacijo in z obarjanjem Determination of surface properties of lactose samples prepared by spray-drying, lyophilization and precipitation 188 Pregledni œlanki - Review Articles Saĝa Puhar, Matjaĉ Jeras Predpisi za pripravke tkivnega inĉenirstva in za somatsko celiœno zdravljenje Regulative for tissue engineered medical products and somatic cell therapy 194 Matej Avanzo, Alenka Ĝavc, Mojca Kerec Kos Zdravila v noseœnosti I: Prenos uœinkovin skozi placento Drugs in pregnancy I: Drug transport across the placenta 198 Nina Koœevar, Julijana Kristl Ciljana dostava uœinkovin v tumorske celice z liposomi Tumor-specific targeting of drugs by liposomes 202 Novice iz sveta farmacije 207 Osebne vesti 209 182 farm vestn 2005; 56 Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles Genetika laktozne intolerance odraslih in pogostost polimorfizma -13910C>T v slovenski populaciji Genetics of adult-type lactose intolerance and frequency of -13910C>T polymorphism in Slovenian population Nataĝa Karas Kuĉeliœki, Jana Lukaœ-Bajalo POVZETEK: Encim laktaza (EC 3.2.1.23) hidrolizira disaharid laktozo do galaktoze in glukoze. Normalno je aktivnost laktaze v otroĝtvu visoka, pri veœini odraslih pa moœno upade. Vendar pa nekatere osebe ohranijo visoko aktivnost laktaze tudi v odrasli dobi. Leta 2002 so odkrili polimor-fizem -13910C>T, ki se 100-odstotno ujema z visoko aktivnostjo laktaze v odrasli dobi. CC homozigoti imajo nizko, TT homozigoti in TC het-erozigoti pa visoko aktivnost laktaze v odrasli dobi. V slovenski populaciji ima 39 % oseb genotip CC, 61 % pa genotip CT ali TT. Najveœ je oseb z genotipom CT (51 %), najmanj pa homozigotnih TT oseb (10 %). Ujemanje med genotipom CC in znaki laktozne intolerance ni popolno. Pogostost znakov pri osebah z genotipom CC s starostjo naraĝœa. Kljuœne besede: laktoza, laktaza, laktozna intoleranca odraslih ABSTRACT: Enzyme lactose (EC 3.2.1.23) hydrolyzes disaccharide lactose to galactose and glucose. Neonatally, lactase activity is high, but drastically decreases in most adults. However, some adults maintain high lactase activity. In 2002 -13910C>T polymorphism was discovered, which correlates well to high lactase activity in adults. CC homozygotes have low, while TT homozygotes and CT heterozygotes have high lac-tase activity in adulthood. In Slovenian population there are 39 % of CC homozygotes and 61 % of CT heterozygotes and TT homozygotes. The most frequent is CT (51 %) and the least frequent is TT genotype (10 %). Correlation between CC genotype and symptoms of lactose intolerance is only partial. Incidence of symptoms in CC genotype persons increases with age. Key words: lactose, lactase, adult-type lactose intolerance 1 Uvod 1.1 Aktivnost encima laktaze je odvisna od starosti Laktaza (EC 3.2.1.23) oz. s polnim imenom laktaza–florizin hidrolaza (LPH) (EC 3.2.1.23, 3.2.1.62) je encim, ki hidrolizira dve vrsti disahari-dov. Disaharid laktozo hidrolizira v galaktozo in glukozo (b-galaktozi-dazna aktivnost), disaharid florizin pa v glukozo in floretin (b-glukozi-dazna aktivnost) (1, 2). Encim se pojavlja samo pri sesalcih, ne pa pri drugih vretenœarjih, saj je mleko, ki vsebuje velike koliœine laktoze, v obdobju po rojstvu pri sesalcih edini vir energije. Normalno imajo sesalci v otroĝtvu visoko aktivnost laktaze, ki pa pri odraslih sesalcih moœno upade. Ta obrazec velja tudi za veœino ljudi, vendar pa nekatere osebe ohranijo visoko aktivnost laktaze tudi v odrasli dobi. Velik deleĉ takih oseb so opazili v populacijah, ki se intenzivno ukvarjajo z ĉivinorejo (Severna Evropa, Subsaharska Afrika) in je bila sposobnost prebavljanja mleka v odrasli dobi kljuœnega pomena za preĉivetje v obdobjih pomanjkanja drugih virov hrane (1, 2). Predvidevajo, da je do moœnega pozitivnega izbora priĝlo pred 5.000 do 10.000 leti (2, 3). Izraz laktozna intoleranca se uporablja za normalno zniĉanje laktazne aktivnosti pri odraslih, kar pa ni vzrokoslovno pravilno, saj gre za popolnoma normalno in celo prevladujoœe stanje v globalni œloveĝki populaciji. Bolj primerna bi bila uporaba izraza lak-tozna persistenca za oznako ohranitve visoke laktazne aktivnosti v odrasli dobi, saj le-to stanje nastane z mutacijo v normalnem genotipu. Kljub temu se danes ponavadi uporablja izraz laktozna intoleranca, ker so se raziskave laktaze zaœele v severni Evropi, kjer prevladuje visoka aktivnost laktaze pri odraslih (4). dr. Nataĝa Karas Kuĉeliœki, mag. farm., prof. dr. Jana Lukaœ Bajalo, univ. dipl. kem.; Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2005; 56 1 Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles Dolgo ni bilo jasno, kaj povzroœi zniĉanje laktazne aktivnosti pri odraslih. Ĝtudije leta 1966 in 1967 so pokazale, da je aktivnost encima odvisna izkljuœno od regulacije na genskem nivoju in da ni povezana s koliœino zauĉite laktoze (4, 5). Vendar pa na izraĉanje znakov laktozne intolerance lahko vplivajo tudi dejavniki okolja, kot so œrevesna flora posameznika, hormoni (tiroksin, kortizon), koliœina zauĉite laktoze in subjektivno doĉivljanje znakov (5). Leta 1985 so dokazali, da pride do zniĉanja encimske aktivnosti pri odraslih zaradi zmanjĝanja sinteze lak-taze (4). V devetdesetih letih pa so dokazali, da je sinteza laktaze zmanjĝana zaradi zmanjĝane transkripcije gena za laktazo (4, 6). Ugotovili so tudi, da HNF-1 (hepatocyte nuclear factor 1) stimulira transkripcijo gena za laktazo (7, 8). Pri praĝiœih se vezalno mesto HNF-1 nahaja v promotorski regiji gena LPH, pri œloveku pa vezalnega mesta ĝe niso naĝli. Predvidevajo, da bi se lahko nahajalo ĝe bolj navzgor od promotorske regije gena LPH (9). S HNF-1 sproĉeno transkripcijo stimulira produkt gena HOXC11 (Homeo Box C11) (10). Ta gen je œlan druĉine HOX genov, ki poleg SOX in PAX genov spadajo med razvojne gene. Ti geni se moœno izraĉajo v fetalnem razvoju in usmerjajo razvoj osebka. HOXC11 se izraĉa v tankem œrevesu, ledvicah in skeletnih miĝicah. Njegovo izraĉanje je najveœje v fetalnem tkivu (11). 1.2 Laktozna intoleranca odraslih Laktozna intoleranca odraslih je normalno zniĉanje aktivnosti laktaze v odrasli dobi na 5-10 % encimske aktivnosti v otroĝtvu. Znaki vkljuœu-jejo drisko, boleœine v trebuhu, napenjanje in slabost po zauĉitju veœjih koliœin mleka. Do driske pride zaradi zastajanja nerazgrajene laktoze v œrevesu. Laktoza zaradi svojega osmotskega uœinka povzroœi zadrĉevanje vode v œrevesu, kar ima za posledico tekoœe blato. Znaki se pojavijo v razliœnih populacijah pri razliœnih starostih, velike pa so tudi razlike med posamezniki. Tako se pri Afriœanih in Azijcih znaki pojavijo ĉe zgodaj v otroĝtvu (2-7 let), medtem ko se pri belcih ponavadi pojavijo v adolescenci. Pogostost laktozne intolerance je najviĝja v Aziji, kjer doseĉe skoraj 100 %. Visoka je tudi pri veœini Afriœanov (50-80 %), izjema so nekatera ĉivinorejska plemena v subsaharski Afriki. V Evropi niha pogostost od 2-5 % v Skandinaviji, do 70 % v juĉni Evropi. Veœina laktozno intolerantnih oseb doĉivi znake po zauĉitju 50 ali veœ gramov laktoze, vendar pa so pri nekaterih znaki odsotni tudi po zauĉitju zelo velikih koliœin laktoze. Vzrok za to je zaenkrat ĝe neznan. Osebe z laktozno intoleranco lahko brez teĉav uĉivajo jogurt, kjer je laktoza ĉe delno razgrajena s strani bakterijskih kultur. Tudi mleko z veœ maĝœobe naj bi povzroœalo manj teĉav kot manj mastno mleko. Vzrok za to je daljĝe zadrĉevanje mastnega mleka v prebavnem traktu. Prebava mleka pri laktozno intoler-antnih osebah se izboljĝa tudi, œe mleko zauĉijejo ob prisotnosti kakava ali trdne hrane, ki vsebuje veliko vlaknin (12). 1.3 Genetika laktozne intolerance odraslih Genetika laktozne intolerance oz. laktazne persistence je dokaj zapletena, saj ĝe vedno niso odkrili definitivne mutacije, ki je odgovorna za to stanje. Predvsem v zadnjih 2 letih pa je na tem podroœju priĝlo do znatnega napredka. Leta 1995 so v ĝtudiji Harvey et al. (13) odkrili 7 polimorfizmov v genu za laktazo ali v njegovi neposredni bliĉini, ki so kazali povezanost z visoko oz. nizko aktivnostjo laktaze pri odraslih. Ugotovili so, da se ti polimorfizmi vedno dedujejo skupaj oz. vezano, kar je pripeljalo do tvorbe sistema laktaznih haplotipov. V razliœnih kombinacijah so ti polimorfizmi tvorili 42 razliœnih haplotipov. Konœni sistem haplotipov je postavil Hollox s sodelavci leta 2001 (14). Ugotovili so, da laktazni haplotip sestavlja 11 polimorfizmov, ki se nahajajo v genu LPH ali v njegovi neposredni bliĉini. Veœinoma gre za substitucije enega baznega para z drugim, nekaj pa je delecij/insercij enega ali veœ baznih parov. Razliœne kombinacije teh 11 polimorfizmov tvorijo 42 haplotiov: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o in p. Najpogostejĝi haplotipi so A, B, C in U, ki so prisotni pri 45 %, 18 %, 15 % in 5 % svetovne populacije. Ostali haplotipi so zelo redki in imajo pogostost 2 % ali manj. Haplotip k so naĝli pri ĝimpanzih in naj bi bil izvirni haplotip iz katerega so z mutacijami in rekombinacijami nastali vsi ostali haplotipi. Preglednica 1 prikazuje sestavo 4 najpogostejĝih haplotipov A, B, C in U. Haplotip A je povezan s persistenco laktaze v odrasli dobi, vendar samo pri Evropejcih in ne pri Afriœanih in Azijcih (14). Haplotipi se razliœno porazdeljujejo pri razliœnih rasah in narodih (glej preglednico 2) (14). Preglednica 1: Sestava najpogostejĝih haplotipov A, B, C in U Table 1: The makeup of the most widespread haplotypes A, B, C and U C -985 T GG D A -946 C -942 TC -942/3 DD G -875 A A -678 G A8 -552/ -559 A9 C 485 int T G 666 A T 5579 C TG 6236/7 DD C A CT TC A A9 C GC TG TC A A8 C A T DD C A CT TC G A8 C GT TG C A C DD G A A9 CA TG 184 farm vestn 2005; 56 Genetika laktozne intolerance odraslih in pogostost polimorfizma -13910C>T v slovenski populaciji Haplotip Severna Juĉna Indija Evropa Evropa A 86 % 36 % 44 % B 6 % 32 % 22 % C 3 % 12 % 23 % U 0 % 0 %0 % persistenca 75 % 26 % 48 % laktaze Rusija Kitajska Japonska Bantu (Afrika) 44 % 47 % 37 % 10 % 21 % 10 % 10 % 0 % 15 % 9 % 15 % 31 % 1 % 17 % 24 % 7 % 37 % 6 % 10 % 13 % Preglednica 2: Pogostost laktaznih haplotipov v razliœnih populacijah Table 2: The frequency of lactase haplotypes in various populations Haplotip A je najpogostejĝi v severni Evropi in je tudi prevladujoœ hap-lotip v tej populaciji, kar se ujema z velikim deleĉem laktazno persis-tentnih oseb v tem delu sveta. V juĉni Evropi je haplotip A manj pogost, veœ pa je haplotipov B in C. To se ujema z veliko niĉjim odstotkom oseb z visoko aktivnostjo laktaze kot v severni Evropi. Rusija in Indija kaĉeta podobno stanje kot Evropa, kar je razumljivo, saj gre za kavkazijske populacije. Haplotipa U pri kavkazijcih ni, je pa zelo pogost pri Azijcih, ki pa so skoraj 100 % laktozno intolerantni. Populacije v subsaharski Afriki so najbolj haplotipsko heterogene, kar kaĉe na to, da se je Homo Sapiens razvil v Afriki in se od tam v veœ valovih razselil v Evropo in Azijo. Za manjĝo raznolikost haplotipov v neafriĝkih populacijah je torej odgovoren genetski odmik. V severni Evropi pa naj bi z razvojem ĉivinoreje pred 10.000 leti priĝlo do moœne pozitivne selekcije za A haplotip, ki je povezan z laktazno persisten-co. Ker je A haplotip povezan s persistenco samo pri Evropejcih, pomeni, da je mutacija odgovorna za persistenco nastala ĝele po odselitvi H. Sapiens v Evropo. Iz preglednice 2 je tudi razvidno, da je v neevropskih populacijah velik deleĉ oseb z A haplotipom laktozno intolerantnih. Vse to kaĉe na to, da opisani polimorfizmi ne morejo biti vzrok za persistenco laktaze v odrasli dobi, temveœ so samo oznaœeval-ski polimorfizmi, ki se pogosto dedujejo vezano z vzroœno mutacijo (14). Leta 2002 pa so odkrili polimorfizem -13910C>T, ki se 100-odstotno ujema s persistenco laktaze v odrasli dobi. Gre za spremembo C v T na mestu 13910 bp navzgor od iniciacijskega kodona ATG gena za laktazo. Alel C je povezan z nizko, alel T pa z visoko aktivnostjo lak-taze v odrasli dobi. Tako imajo homozigoti CC laktozno intoleranco, homozigoti TT in heterozigoti CT pa laktazno persistenco (15). Homozigoti CC imajo pribliĉno 10 % aktivnosti laktaze homozigotov TT, heterozigoti CT imajo v povpreœju niĉje aktivnosti kot TT, vendar pa se aktivnosti za TT in CT prekrivajo. Aktivnosti laktaze za CC osebe so od 4 do 9 U/g, za CT od 13-49 U/g in za TT 18-87 U/g. Pri het-erozigotih CT se alel T izraĉa 11,5-krat bolj kot alel C in predstavlja 92 % mRNA laktaze (16). Polimorfizem -13910C>T se nahaja v 13. intronu gena MCM6 (Minichromosome maintenence 6), v regiji, ki kaĉe homologijo z LINE (long interspersed nuclear element). MCM6 se nahaja poleg gena LPH, njegov produkt je regulator celiœnega cikla. MCM6 verjetno ni funkcionalno povezan z laktazo, gre le za prekrivanje regulatorne regije gena LPH s koncem transkripcijske regije MCM6 gena (17). -13910C>T vpliva na vezalno mesto transkripcijskega faktorja AP-2. Le-ta verjetno vpliva na razvojno-specifiœno regulacijo laktaze prek cis-transkripci-jskega efekta. Natanœen mehanizem delovanja ĝe ni znan (2). V ĝtudiji Poulter et al. iz leta 2003 (18) so ugotavljali ujemanje polimor-fizma -13910C>T s haplotipi. Ugotovili so, da je pri vseh haplotipih razen A na mestu –13910 vedno prisoten C, kar se ujema z ugotovitvijo, da so vsi haplotipi razen A povezani z laktozno intoleranco. Pri Evropejcih je bil pri haplotipu A na mestu –13910 v veliki veœini primerov prisoten T, kar potrjuje povezanost haplotipa A z laktazno persistenco. Pri ostalih rasah pa je bil v veœjem ĝtevilu primerov na mestu –13910 v haplotipu A prisoten C, kar kaĉe na to, da haplotip A lahko povezujemo z laktazno persistenco samo pri Evropejcih, alel T pa je povezan s persistenco tudi pri drugih rasah (18). Iz tega sklepamo, da je doloœanje polimorfizma -13910C>T boljĝe diagnos-tiœno orodje kot doloœanje haplotipov. Videti je, da je -13910C>T nastal pozneje kot polimorfizmi, ki definirajo haplotip A in je odliœen kandidat za vzroœni polimorfizem za laktazno persistenco. Vendar pa so pred kratkim ugotovili, da navedeni polimorfizem verjetno ni odgovoren za laktazno persistenco v nekaterih ĉivinorejskih plemenih v subsaharski Afriki, saj je v teh populacijah T alel zelo redek in ne more razloĉiti visokega deleĉa laktazno persistentnih oseb (19). Zato bi bilo treba preiskati ĝirĝe obmoœje navzgor od gena LPH. Genotipizacija je najzanesljivejĝi naœin diagnostike laktozne intolerance, saj s to metodo lahko odkrijemo tudi tiste laktozno intolerantne osebe, ki nimajo znakov. Hkrati pa lahko izloœimo osebe z drugimi boleznimi, ki povzroœajo moteno delovanje disaharidaz. S tem prepreœimo nepotrebno umaknitev mleka iz prehrane in omogoœimo zdravljenje morebitnih resnih obolenj. Ker so polimorfizem -13910C>T, ki se pri Evropejcih popolnoma ujema z laktazno persis-tenco odkrili ĝele pred kratkim, pa se genotipizacije ĝe ne uporablja za rutinsko diagnostiko, temveœ samo v raziskovalne namene. Polimorfizem -13910C>T doloœimo s PCR in RFLP, lahko pa uporabimo tudi sekveniranje. V sledeœi ĝtudiji smo prviœ doloœili pogostost laktozne intolerance v slovenski populaciji z metodo genotipizacije. 2 Materiali in metode 2.1 Preiskovanci V raziskavi je sodelovalo 172 zdravih prostovoljcev. Povpreœna starost preiskovancev je bila 32,9 leta ħ 9,6 let. Sestava po spolu je bila: 83 (48 %) ĉensk in 89 (52 %) moĝkih. Vsem preiskovancem je bilo odvzeto dvakrat po 3 ml krvi v sterilne epruvete, ki so vsebovale antikoagulant K-EDTA. Ob odvzemu krvi so preiskovanci izpolnili vpraĝalnik o uĉivanju mleka in mleœnih izdelkov ter o znakih laktozne intolerance. Vsi preiskovanci so podpisali obveĝœeni pristanek. Ĝtudijo je odobrila tudi Medicinska etiœna komisija Slovenije. farm vestn 2005; 56 Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles 2.2 Materiali in metode Za izolacijo DNK iz venske krvi smo uporabili FlexiGene DNA Kit (QIA-GEN). Polimorfizem -13910C>T smo doloœili s polimerazno veriĉno reakcijo (PCR) in z analizo polimorfizmov dolĉin restrikcijskih fragmentov (RFLP). Uspeĝnost PCR in rezultate restrikcije smo ovrednotili z agarozno gelsko elektroforezo. PCR: V reakcijsko zmes za en vzorec s skupnim volumnom 25 µl smo dodali 14,9 µl vode, 2,5 µl 10 x PCR pufra (Perkin Elmer), 2,5 µl 2,5 mM raztopine dNTP (Perkin Elmer), 2 µl 25 mM raztopine MgCl2 (Perkin Elmer), 1 µl 5 µM raztopine F oligonukleotidnega zaœetnika 5`-GGA TGC ACT GCT GTG ATG AG-3`(QIAGEN Operon GmbH), 1 µl 5 µM raztopine R oligonukleotidnega zaœetnika 5`- CCC ACT GAC CTA TCC TCG TG-3`(QIAGEN Operon GmbH), 0,1 µl raztopine DNK polimeraze AmpliTaq GoldTM (5 U/ µl, Perkin Elmer) in 1 µl raztopine DNK. Pogoji PCR so bili: 1 x 95°C 12 minut, 36 x 94°C 30 sekund, 58,5°C 30 sekund in 72°C 1 minuta, 1 x 72°C 7 minut, 1 x 4°C vsaj 6 minut. Produkt PCR je bil 448 baznih parov dolg odsek DNK. RFLP: V reakcijsko zmes za en vzorec s skupnim volumnom 15 µl smo dodali 8,60 µl vode, 1,5 µl restrikcijskega pufra NEBuffer 4 (50 Mm K-acetat, 20 mM Tris acetat, 10 mM Mg-acetat, 1 mM ditiotreitol, pH = 7,9, New England Biolabs), 0,15 µl raztopine acetliranega govejega serumskega albumina (BSA) (100 µg/ml, New England Biolabs), 0,75 µl raztopine restrikcijskega encima Bsm FI (2 U/µl, New England Biolabs) in 4 µl raztopine produkta PCR. Zmes smo inkubirali v vodni kopeli œez noœ na 65°C. Restrikcijski encim Bsm FI selektivno prepozna zaporedje 5`…GGGAC(N)10 …3` v DNK in cepi DNK 10 baznih parov navzdol od prepoznavne sekvence, tako da nastanejo lepljivi konci. Zamenjava nukleotida C z nukleotidom T na mestu -13910 je uvedla novo dodatno mesto delovanja Bsm Fl. Pri agarozni gelski elektroforezi restrikcijskih produktov sta pri homozigotih CC na gelu vidni dve lisi (351 in 97 bp), pri homozigotih TT pa naj bi bile vidne tri lise (253, 98 in 97 bp), vendar se na agarozi odseka 98 in 97 bp vidita kot ena lisa. Heterozigoti CT imajo torej 4 lise (351, 253, 98 in 97 bp), na agarozi pa so vidne 3 (slika 1). Genotip posameznika smo tako doloœili glede na prisotnost oz. odsotnost odsekov 351 bp in 253 bp. Vpraĝalnik: Preiskovanci so izpolnili vpraĝalnik o prisotnosti oz. odsotnosti kliniœnih znakov laktozne intolerance. Poleg tega so opisali pogostost uĉivanja mleka in nekaterih mleœnih izdelkov. Njihove odgovore smo sorazmerno toœkovali, kjer bolj pogostem uĉivanju pripiĝemo veœje ĝtevilo toœk. Podatke smo obdelali s t-testom, upoĝte-vajoœ homogenost oz. nehomogenost variance. farm vestn 2005; 56 3 Rezultati in razprava V skupini zdravih preiskovancev je imelo 39 % oseb genotip CC, ki je povezan z nizko aktivnostjo laktaze v odrasli dobi. 61 % preiskovancev je imelo ohranjeno visoko aktivnost laktaze v odrasli dobi oz. genotip CT ali TT. Najveœ je bilo oseb z genotipom CT (51 %), najmanj pa homozigotnih TT oseb (10 %). Rezultati ĝtudije so prikazani v preglednici 3. Polimorfizem -13910C>T se porazdeljuje po Hardy-Weinbergovem ravnoteĉju, p = 0,699 (c2-test). Preglednica 3: Pogostost genotipov CC, CT in TT , ter alelska frekvenca (AF) alelov C in T v zdravi slovenski populaciji Table 3: The frequency of CC, CT and TT genotypes, and the allelic frequency (AF) of C and T alleles in the healthy Slovenian population Genotip Ĝtevilo oseb n = 172 Odstotek oseb CC 67 39 % CT 87 51 % TT 18 10 % Pogostost posameznih laktaznih genotipov v slovenski populaciji smo primerjali z rezultati drugih podobnih ĝtudij (preglednica 4). Iz preglednice 4 je razvidno, da je deleĉ laktozno intolerantnih oseb v slovenski populaciji viĝji kot v nekaterih severno in zahodno evropskih populacijah (Finska, Nemœija) ter niĉji kot v populacijah afriĝkega izvora. Zelo nizek deleĉ laktozno intolerantnih oseb so ugotovili pri belcih iz ameriĝke zvezne drĉave Utah, kjer je veœina prebivalcev skandinavskega izvora. Porazdelitev genotipov v slovenski populaciji je najbolj podobna porazdelitvi v finski in nemĝki populaciji, kjer prav tako prevladuje genotip CT, vendar je v slovenski populaciji CC genotip veliko bolj pogost kot genotip TT, v finski in nemĝki populaciji pa je ravno obratno. Deleĉ oseb z visoko laktazno aktivnostjo (61 %) je v slovenski populaciji niĉji kot v severni Evropi (75 %), vendar viĝji kot v juĉni Evropi (26 %) (14). Videti je, da je slovenska populacija po deleĉu oseb z visoko laktazno aktivnostjo bliĉje severni kot juĉni Evropi. Odgovore preiskovancev o prisotnosti znakov laktozne intolerance smo primerjali z njihovim dejanskim LPH genotipom. Znaki so bili prisotni pri 10 % vseh preiskovancev. Od oseb, ki so trdile, da imajo znake laktozne intolerance, jih je dejansko imelo genotip CC le 63 %, Slika 1: Agarozna gelska elektroforeza produktov RFLP pri doloœanju polimorfizma -13910C>T; Okrajĝave: M = oznaœevalec, PCR = nere-stringiran produkt PCR, 88ko, 91ko, 95ko = homozigoti CC, 87ko, 89ko, 90ko, 92ko, 93ko, 94ko, 96ko, 97ko, 98ko = heterozigoti CT, 99ko = homozigot TT. Figure 1: Determination of 13910C>T polymorphism by RFLP and agarose gel electrophoresis; Abbreviations: M = marker, PCR = uncut PCR product, 88ko, 91ko, 95ko = CC homozygotes, 87ko, 89ko, 90ko, 92ko, 93ko, 94ko, 96ko, 97ko, 98ko = CT heterozygotes, 99ko = TT homozygote.. Genetika laktozne intolerance odraslih in pogostost polimorfizma -13910C>T v slovenski populaciji Preglednica 4: Pogostost posameznih laktaznih genotipov v razliœnih populacijah (15) Table 4: The frequency of lactase genotypes in various populations (15) populacija n % CC oseb % CT oseb % TT oseb Finska 938 18,1 47,5 34,3 USA (Utah) 92 7,6 35,9 56,5 Ameriœani afriĝkega izvora 96 79,2 15,6 5,2 Nemœija 187 21,4 49,7 28,9 Slovenija 172 39 51 10 ostali pa so imeli genotip CT ali TT. Samo 16 % oseb z genotipom CC je imelo znake laktozne intolerance. Tudi 6 % CT in TT oseb je trdilo, da ima znake laktozne intolerance, vendar le-te verjetno lahko pripiĝe-mo kakim drugim stanjem s podobnimi znaki. c2-test je pokazal, da je v skupini oseb z genotipom CC znaœilno veœ oseb z znaki laktozne intolerance kot v skupini z genotipom CT in TT, p = 0,027. Vendar pa dejstvo, da ujemanje med genotipom CC in znaki ni popolno nakazuje, da diagnosti-ciranje laktozne intolerance samo na osnovi kliniœnih znakov ni zanesljivo. Dokazali smo tudi, da je izraĉanje znakov pri CC osebah odvisno tudi od starosti. Povpreœna starost v skupini CC oseb z znaki je bila 37 ħ 11 let, v skupini CC oseb brez znakov pa 31 ħ 8 let, kar je t-test pokazal kot mejno znaœilno, p = 0,056. To pomeni, da pogostost znakov lak-tozne intolerance pri osebah z genotipom CC s starostjo naraĝœa. Osebe z genotipom CC in osebe z genotipom CT ali TT se med seboj ne razlikujejo po pogostosti uĉivanja mleka in mleœnih izdelkov. Ker pa je imelo le 16 % oseb z genotipom CC veœje teĉave pri uĉivanju mleka, smo primerjali samo CC osebe z znaki in CT/TT osebe. Ugotovili smo, da je razlika v pogostosti uĉivanja polnomastnega in manj mastnega mleka med tema dvema skupinama veœja (œeprav ne statistiœno znaœilna), kot œe primerjamo vse CC osebe s CT/TT osebami. Poraba jogurta je bila v vseh navedenih skupinah podobna, saj prebava le-tega ni v toliki meri povezana z laktazo. Rezultati so prikazani v preglednici 5. Preglednica 5: Pogostost uĉivanja mleka in jogurta pri osebah z razliœnimi genotipi in fenotipi Table 5: The frequency of milk and yogurt consumption in subjects with different genotypes and phenotypes Polnomastno mleko Mleko z manj maĝœobe jogurt CC osebe s simptomi 6,7 (p = 0,318) 6,9 (p = 0,165) 10,6 (p = 0,469) Vse CC osebe 12,1 (p = 0,910) 12,9 (p = 0,763) 14,4 (p = 0,678) CT in TT osebe 11,8 13,6 13,6 4 Sklep Na osnovi rezultatov naĝe ĝtudije lahko sklepamo, da ima v zdravi slovenski populaciji 39 % oseb genotip CC, ki je povezan z nizko aktivnostjo laktaze v odrasli dobi, 61 % pa ima ohranjeno visoko aktivnost laktaze v odrasli dobi oz. genotip CT ali TT. Najveœ je bilo oseb z genotipom CT (51 %), najmanj pa homozigotnih TT oseb (10 %). Slovenska populacija je po deleĉu oseb z visoko laktazno aktivnostjo bliĉje severni kot juĉni Evropi. Ujemanje med genotipom CC in znaki laktozne intolerance ni popolno. Incidenca simptomov pri osebah z genotipom CC s starostjo naraĝœa. 5 Literatura 1. Swallow DM, Poulter M, Hollox EJ. Intolerance to lactose and other dietary sugars. Drug Metabolism and Disposition 2001; 29(4): 513-516. 2. OMIM*603202. On Line Mendelian Inheritance in Man (OMIM): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM 3. Bersaglieri T, Sabeti PC, Patterson N et al. Genetic signatures of strong recent positive selection at the lactase gene. Am J Hum Genet 2004; 74: 1111-1120. 4. OMIM#223100. On Line Mendelian Inheritance in Man (OMIM): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM 5. Montgomery RK, Büller HA, Rings EHHM et al. Lactose intolerance and the genetic regulation of intestinal lactase-phlorizin hydrolase. The FASEB Journal 1991; 5: 2824-2832. 6. Wang Y, Harvey CB, Hollox EJ et al. The genetically programmed down-regulation of lactase in children. Gastroenterology 1998; 114: 1230-1236. 7. Troelsen JT, Olsen J, Noren O et al. A novel intestinal trans-factor (NF-LPH1) interacts with the lactase-phlorizin hydrolase promoter and co-varies with the enzymatic activity. J Biol Chem 1992; 267(28): 20407-20411. 8. Troelsen JT, Olsen J, Mitchelmore C et al. Two intestinal specific nuclear gactors binding to the lactase-phlorizin hydrolase and sucrase-isomaltase promoters are functionally related oligomeric molecules. FEBS Letters 1994: 342: 297-301. 9. Spodsberg N, Troelsen JT, Carlsson P et al. Transcriptional regulation of pig lactase-phlorizin hydrolase: Involvement of HNF-1 and FREACs. Gastroenterology 1999; 116: 842-854. 10. Mitchelmore C, Troelsen JT, Sjöström H et al. The HOXC11 homeodomain protein interacts with the lactase-phlorizin hydrolase promoter and stimulates HNF1a-dependent transcription. J Biol Chem 1998; 273(21): 13297-13306. 11. OMIM*605559. On Line Mendelian Inheritance in Man (OMIM): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM 12. McBean LD, Miller GD. Allaying fears and fallacies about lactose intolerance. Journal of the American Dietetic Association 1998; 98(6): 671-676. 13. Harvey CB, Pratt WS, Islam I et al. DNA polymorphisms in the lactase gene. Eur J Hum Genet 1995; 3: 27-41. 14. Hollox EJ, Poulter M, Zvarik M et al. Lactase haplotype diversity in the Old World. Am J Hum Genet 2001; 68: 160-172. 15. Enattah NS, Sahi T, Savilahti E et al. Identification of a variant associated with adult-type hypolactasia. Nature genetics 2002; 30: 233-237. 16. Kuokkanen M, Enattah NS, Oksanen A et al. Transcriptional regulation of the lactase-phlorizin hydrolase gene by polymorphisms associated with adult-type hypolactasia. Gut 2003; 52: 647-652. 17. Harvey CB, Wang Y, Darmoul D et al. Characterisation of a homologue of a yeast cell division cycle gene, MCM6, located adjacent to the 5’ end of the lactase gene on chromosome 2q21. FEBS Letters 1996; 398: 135-140. 18. Poulter M, Hollox E, Harvey CB et al. The causal element for the lactase persistence/non-pesistence polymorphism is located in a 1 Mb region of linkage disequilibrium in Europeans. Ann Hum Genet 2003; 67: 298-311. 19. Mulcare CA, Weale ME, Jones AL et al. The T allele of a single-nucleotide polymorphism 13,9 kb upstream of the lactase gene (LCT) (C-13,9 kb T) does not predict or cause the lactose-persistence phenotype in Africans. Am J Hum Genet 2004; 74: 1102-1110. farm vestn 2005; 56 Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles Doloœanje povrĝinskih lastnosti vzorcev laktoze, pripravljene s suĝenjem z razprĝevanjem, z liofilizacijo in z obarjanjem Determination of surface properties of lactose samples prepared by spray-drying, lyophilization and precipitation Odon Planinĝek, Jernej Zadnik, Matjaĉ Kunaver, Marjan Bele, Stane Srœiœ POVZETEK: Farmacevtske uœinkovine in pomoĉne snovi izoliramo iz raztopin z uporabo razliœnih postopkov, ki vplivajo na njihovo morfologijo in fizikalno-kemijske lastnosti. Za analizo in vrednotenje takĝnih delcev uporabljamo razliœne metode, ki jih lahko delimo na tiste, kjer merimo in opazujemo celotni vzorec (diferenœna dinamiœna kalorimetrija, rentgenska praĝkovna analiza, kalorimetrija z raztapljanjem) ali samo njegovo povrĝino (merjenje stiœnega kota, gravimetriœna sorpcija, inverzna plinska kromatografija). Namen naĝe raziskave je bil pripraviti razliœne vzorce laktoze in jim z razliœnimi metodami prouœiti povrĝinske lastnosti. Vzorce laktoze smo pripravili iz vodnih raztopin s suĝenjem z razprĝevanjem, z liofilizacijo in z vakuumskim suĝenjem. Razlike med vzorci smo dokazali z inverzno plinsko kromatografijo z merjenjem pri eni in veœ temperaturah. Ugotovili smo, da postopek priprave laktoze vpliva na povrĝinske lastnosti vzorca (gSD, KA, KD). Potrdili smo, da je IGC primerna metoda za prouœevanje majhnih razlik v povrĝinskih lastnostih vzorcev laktoze. Kljuœne besede: fizikalno-kemijske lastnosti, povrĝinske lastnosti, inverzna plinska kromatografija, laktoza ABSTRACT: Pharmaceutical powders are often isolated from solutions by procedures that influence their morphology and physico-chemical properties. Different methods can be used to characterize and evaluate dried powders. They can be divided into those where the bulk sample is analysed (differential scanning calorimetry, x-ray powder diffractometry, solution calorimetry) and those where only the surface of the sample is studied (contact angle measurements, gravimetric sorption, inverse gas chromatography). The purpose of this research was to produce and characterize surfaces of different lactose samples. Spray drying, lyophilization and rota vacuuming were used for preparation of the samples. Differences between samples were confirmed with inverse gas chromatography by measuring at only one and more temperatures. It was established that the method of sample preparation influences the surface properties of lactose (gSD, KA, KD). It was shown that inverse gas chromatography can be used successfully for detecting differences between surfaces of lactose samples. Key words: physico-chemical properties, surface properties, inverse gas chromatography, lactose Jernej Zadnik, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana in Krka, d.d., Ĝmarjeĝka cesta 6, 8501 Novo mesto doc. dr. Odon Planinĝek, mag. farm., prof. dr. Stane Srœiœ, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana dr. Marjan Bele, dipl. ing. kem. tehn., dr. Matjaĉ Kunaver, dipl. ing. kem., Kemijski inĝtitut, Hajdrihova 19, 1000 Ljubljana, Slovenija 188 farm vestn 2005; 56 Doloœanje povrĝinskih lastnosti vzorcev laktoze, pripravljene s suĝenjem z razprĝevanjem, z liofilizacijo in z obarjanjem 1 Uvod Povrĝinska energija trdnih snovi je lastnost, ki vpliva na medfazne interakcije (npr. trdno-trdno ali trdno-tekoœe). Metoda, ki jo lahko uporabimo za njeno doloœitev, je tudi inverzna plinska kromatografija (IGC). Pri tej metodi je postopek merjenja obraten kot pri klasiœni plinski kro-matografiji (slika 1). Kolono napolnimo s trdnim vzorcem (praĝkom) katerega lastnosti prouœujemo in vanjo injiciramo parno fazo znanih tekoœin. Retencija plina v koloni omogoœa oceno lastnosti trdne povrĝine. V farmaciji je bila metoda uspeĝno uporabljena za razlikovanje razliœnih proizvodnih serij uœinkovin (1) in pomoĉnih snovi (2), prouœe-vanje vpliva mletja na lastnosti povrĝine praĝkov (3, 4, 5), prouœevanje vpliva topila za kristalizacijo na lastnosti povrĝine (6), razlikovanje optiœnih oblik manitola (7), vpliva vlage na lastnosti povrĝine itd. (8, 9). Slika 1: Primerjava principov klasiœne plinske kromatografije in IGC Figure 1: Comparison of conventional and inverse gas chromatography Laktoza se lahko nahaja v dveh osnovnih kristalnih oblikah a in b ali v amorfnem stanju. a-laktoza je lahko monohidrat ali brezvodna. Polimorfne oblike laktoze imajo razliœne fizikalno-kemijske lastnosti kot so: hitrost raztapljanja, gostota in trdnost. Suĝenje z razprĝevanjem, vakuumsko suĝenje in liofilizacija so metode s pomoœjo katerih lahko izdelamo snovi v amorfni obliki oziroma spremenimo njihovo kristaliniœnost. Amorfno stanje je v primerjavi s kristalnim nestabilno zato se snovi v tehnoloĝkih procesih proizvodnje oziroma med shranjevanjem in uporabo zdravil razliœno obnaĝajo. 2 Materiali in metode Materiali Kot izhodni vzorec smo uporabili a-laktozo monohidrat (NF, 200 mesh, DMV International, Nizozemska). Metan (Messer, Slovenija) smo pri doloœanju retencijskih œasov uporabljali kot standard, ki ne reagira. N-heksan, n-heptan (Kemika, Hrvaĝka), n-oktan, n-nonan, n-dekan (Ridel de Haën AG, Nemœija), aceton (Merck, Nemœija), kloro-form, tetrahidrofuran in etilacetat (Kemika, Hrvaĝka) smo uporabljali kot standarde za IGC-meritve. Pridobivanje vzorcev laktoze 10-odstotno vodno raztopino laktoze smo suĝili z razprĝevanjem v aparatu GPCG1 (Glatt, Nemœija). Uporabili smo naslednje pogoje suĝenja: tlak zraka za razprĝevanje 1,5 barov, pretok tekoœine 4 ml/min, pretok zraka skozi procesno komoro 2,5 m/s, vhodna temperatura 80 °C in izhodna temperatura 60 °C. Liofilizirano laktozo smo izdelali s kapljanjem 10-odstotne vodne raztopine v posodo s tekoœim duĝikom in 48-urno liofilizacijo nastalih kroglic pri 20 mTorr in -35 °C. Oborjeno laktozo smo izdelali z vakuumskim suĝenjem 10-odstotne vodne raztopine z uporabo aparata IKA Labortechnik RV05-ST (Nemœija) pri tlaku 100 mbar in temperaturi vodne kopeli 95 °C. Vse vzorce smo hranili nad silikagelom. Termiœna analiza Vzorce smo analizirali z diferenœno dinamiœno kalorimetrijo (Pyris 1 Perkin- Elmer, ZDA). Temperaturo in konstanto grelca smo kalibrirali z uporabo indija. 5-8 mg vzorca smo natehtali in zaprli v aluminijast lonœek in ga analizirali v temperaturnem obmoœju 0-240 °C s hitrostjo 10 °C/min v duĝikovi atmosferi (40 ml/min). Rentgenska praĝkovna analiza Vzorce smo analizirali z rentgenskim praĝkovnim difraktometrom (Philips PW 1710, Nizozemska) Elektronska mikroskopija Za doloœitev morfologije delcev smo uporabili vrstiœni elektronski mikroskop (JEOL T220, Nemœija). Inverzna plinska kromatografija Za analizo vzorcev smo uporabili prirejen plinski kromatograf 6890N (Agilent Technologies, ZDA). Kot nosilni plin smo uporabili helij s pretokom 7 ml/min pri temperaturah 30, 35, 40, 50 in 60 °C. Temperatura injektorja je bila 150 °C in detektorja 250 °C. Vzorce smo redœili s Chromosorbom W (Supelco, ZDA) v masnem razmerju 1:1 in jih s stre-salnikom (VanKel, ZDA) stresli v stekleno kolono (dolĉina 30 cm, notranji premer 3 mm). Pred merjenjem smo tako pripravljeni vzorec prepiho-vali s helijem (pretok 7 ml/min, temperatura 30 °C) najmanj pet ur. Nato smo v kolono injicirali tako majhne mnoĉine parne faze tekoœin, ki ustrezajo meji detekcije aparata, s œimer smo dosegli neskonœno razredœenje. Na osnovi izmerjenega retencijskega œasa smo z uporabo naslednje enaœbe izraœunali neto retencijski volumen Vn (10): V = iF(t —t ) [1] F = volumski pretok nosilnega plina, tr = retencijski œas injicirane kapljevine, t0 = retencijski œas kapljevine, ki ne vstopa v interakcije z vzorcem (metan), j = korekcijski parameter, ki upoĝteva stisljivost nosilnega plina in ga izraœunamo iz naslednje enaœbe: farm vestn 2005; 56 Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles 7 = *{P J P J?-I 2(PJPoulf-l [2] Pin = tlak v koloni Pout = zunanji tlak Pri tehniki neskonœnega razredœenja lahko termodinamsko opiĝemo naslednje ravnoteĉje: AGA = RT\nV+C [3] pri œemer je DGA sprememba proste energije adsorpcije, R sploĝna plinska konstanta, T absolutna temperatura in C konstanta adsorpci-je, ki je odvisna od izbranega referenœnega stanja. Prosta energija adsorpcije kapljevine injicirane v kolono je vsota nepolarnega (D) in polarnega (SP) prispevka. Kadar v kolono injiciramo alkane je sprememba proste energije adsorpcije DGA enaka le spremembi nepolarnega prispevka DGAD: Slika 2: Diagram linearne odvisnosti RTlnVn od aJyf . Iz naklona premice doloœimo nepolarni del proste povrĝinske energije g Figure 2: Schematic diagram showing the dependence of RTlnVn on aJyf . The dispersive component of surface free energy g can be obtained from the slope of the line AGA = AG/ = -RTlnV+C [4] Po metodi, ki so jo razvili Schulz in sodelavci, lahko nepolarni del proste povrĝinske energije trdne snovi gsd izraœunamo iz naslednje enaœbe (10): RT\nV —2N a-Jydyd +C [5] kjer predstavljajo: NA = Avogadrovo ĝtevilo a = povrĝina adsorbirane molekule g= povrĝinska napetost injiciranega alkana gf = disperzijski del proste povrĝinske energije preiskovane trdne snovi V kolono injiciramo alkane z razliœno dolĉino verige (heksan, heptan, oktan, nonan, dekan) in iz naklona (2NAJyf) premice v grafu RTlnVn=f(aA//f) doloœimo vrednost nepolarnega dela proste povrĝinske energije (slika 2). Polarne kapljevine vstopajo v interakcije s trdnimi povrĝinami z nepo-larnimi in polarnimi silami. Tako leĉi toœka za polarno kapljevino v diagramu odvisnosti RTlnVn od aJyf nad premico, ki jo tvorijo alkani. Na osnovi raziskav Draga (11, 12), Gutmana (13) in Fowkesa (14) opredeljujemo polarne interakcije kot Lewisove kislo-baziœne ali kot elektron donor-elektron akceptor interakcije. Tako pride do polarnih interakcij le med kislino in bazo, ne pa med dvema kislinama ali bazama, kljub njihovim velikim polarnostim. Po Gutmanu (13) in Riedlu in Fowkesu (15) lahko kapljevine opredeimo glede na akceptorsko (AN*) ali donorsko ĝtevilo (DN). Lastnosti kapljevin, ki jih uporabljamo pri inverzni plinski kromatografiji so zbrane v preglednici 1 190 farm vestn 2005; 56 Preglednica 1: Povrĝine molekul, povrĝinske napetosti, elektron donorska in elektron akceptorska ĝtevila nekaterih kapljevin Table 1: Surface area, surface free energy, donor and acceptor numbers of some liquids a [A°2] gld [mJ/m2] DN [kJ/mol] AN* [kJ/mol] Heksan 51,5 18,4 0 0 Heptan 57,0 20,3 0 0 Oktan 63,0 21,3 0 0 Nonan 69,0 22,7 0 0 Dekan 75,0 23,4 0 0 Tetrahidrofuran 45,0 22,5 84,4 2,1 Kloroform 45,0 25,0 0 22,7 Aceton 42,5 16,5 71,4 10,5 Etilacetat 50,0 19,6 71,8 6,3 Pri doloœeni vrednosti a^yf predstavlja razlika med toœko, ki ustreza polarni kapljevini in referenœno premico za alkane, specifiœn (polarni) del spremembe proste energije adsorpcije DGASP. Iz krivulje odvisnosti DGASP od temperature lahko izraœunamo spremembo specifiœne proste entalpije DHASP in spremembo specifiœne proste entropije adsorpcije DSASP z uporabo naslednje enaœbe: AG/^AHf-T-ASf [6] Doloœanje povrĝinskih lastnosti vzorcev laktoze, pripravljene s suĝenjem z razprĝevanjem, z liofilizacijo in z obarjanjem Spremembo specifiœne proste entalpije adsorpcije uporabljamo za izraœun kislih (KA) in baziœnih (KD) lastnosti trdnih povrĝin: AH SP AN1 =Kn+KA DN AN* [7] V literaturi pogosto sreœamo poenostavljeno enaœbo (neupoĝtevanje entropijskega œlena), kjer je prosta entalpija adsorpcije zamenjana s prosto energijo adsorpcije, tako da lahko kisle in baziœne lastnosti trdnih povrĝin doloœimo le pri eni temperaturi: AG*SF' -K ħK DN -KD+KA- AN' AN' [8] 3 Rezultati in razprava Vzorce laktoze smo najprej analizirali z diferenœno dinamiœno kalorimetrijo (DSC, slika 3). Originalna laktoza je monohidrat, saj je pri 145 °C prisoten dehidratacijski vrh, ki mu pri 215 °C sledi taljenje a-laktoze. DSC-krivulji originalne laktoze, suĝene z razprĝevanjem in liofilizirane laktoze vsebujeta rekristalizacijski vrh v obmoœju 160-180 °C. Pri originalni laktozi je rekristalizacija komaj opazna in jo lahko prip-iĝemo restrukturiranju kristala po odparitvi kristalno vezane vode, oziroma prisotnosti amorfne oblike. Pri laktozi, suĝeni z razprĝevanjem in liofilizirani laktozi je entalpija rekristalizacije veœja kot pri originalni laktozi in jo lahko pripiĝemo rekristalizaciji amorfnega dela vzorca, podobno kot je to storil Elamin s sodelavci prav tako na primeru laktoze (16). Pri obeh vzorcih rekristalizaciji sledi taljenje a-laktoze. DSC-krivulja oborjene laktoze kaĉe, da je v vzorcu zanemarljiv deleĉ amorfne oblike. Tako pri laktozi, suĝeni z razprĝevanjem, kot pri liofil-izirani in oborjeni laktozi gre za brezvodne vzorce, saj DSC-krivulje ne vsebujejo dehidratacijskega vrha. Slika 3: DSC-krivulje originalne laktoze, laktoze, suĝene z razprĝevanjem, liofilizirane in oborjene laktoze Figure 3: DSC curves of original, spray dried, lyophilized and precipitated lactose Stopnjo kristaliniœnosti in prisotnost razliœnih kristalnih oblik v vzorcu smo prouœevali tudi z rentgensko praĝkovno analizo (slika 4). Ugotovili smo, da se razliœno suĝeni vzorci razlikujejo od originala. Uklonski maksimumi originalne laktoze pripadajo laktozi monohidratu (Powder Diffraction File: 27-1947) (17). Rezultat se ujema z DSC-analizo vzorca. V primeru obor-jene laktoze uklonski maksimumi pripadajo brezvodni obliki laktoze (Powder Diffraction File: 39-1762) (17). Tudi pri laktozi, suĝeni z razprĝevanjem, sklepamo, da je brezvodna, œeprav je ta vzorec preteĉno amorfen in je intenziteta uklonskih maksimumov manjĝa kot pri oborjeni laktozi. Odsotnost vode v tem vzorcu smo potrdili tudi z DSC-analizo. Najbolj amorfna je liofilizirana laktoza, manj laktoza, suĝena z razprĝevanjem, in ĝe manj oborjena laktoza. Originalna laktoza izkazuje med vsemi prouœevanimi vzorci najveœjo kristaliniœnost. Rezultat je priœakovan. Slika 4: Difraktogrami originalne laktoze in vzorcev laktoze pridobljene s suĝenjem Figure 4: XRD patterns of original lactose and samples obtained after drying Tudi morfologija delcev je odvisna od postopka izdelave vzorcev. Elektronsko mikroskopska slika originalne laktoze (slika 5) kaĉe prisotnost kristalov velikih 1-100 mm. Pri oborjeni laktozi so prisotni aglomerati. S suĝenjem z razprĝevanjem so nastali delci sferiœnih oblik, z liofilizacijo pa delci v obliki ploĝœic. farm vestn 2005; 56 191 Originalni znanstveni œlanki - Scientific Articles Slika 5: Elektronsko mikroskopske slike originalne (A), oborjene (B), suĝene z razprĝevanjem (C) in liofilizirane (D) laktoze Figure 5: SEM micrographs of original lactose (A), precipitated lactose (B), spray-dried lactose (C) and lyophilized lactose (D) samples Po uspeĝnem razlikovanju vzorcev, z uporabo nekaterih standardnih metod za doloœanje fizikalno-kemijskih lastnosti praĝkov, smo vzorce laktoze analizirali ĝe z inverzno plinsko kromatografijo (IGC). Za vrednotenje povrĝine vzorcev smo uporabili tri pristope. Najprej smo izraœunali nepolarni del proste povrĝinske energije z uporabo alkanov (C6-C10, preglednica 2). Ugotovili smo, da se vrednost glede na originalno laktozo pri oborjeni laktozi in laktozi, suĝeni z razprĝevanjem, zniĉa, pri liofilizirani laktozi pa zviĝa. Vrednost nepolarnega dela proste povrĝinske energije pri oborjeni laktozi in laktozi, suĝeni z razprĝevanjem, znaĝa pribliĉno 33 mN/m2 in ju s tem parametrom ne moremo razlikovati Za razlikovanje vzorcev smo kislinski (KA) in baziœni del (KD) proste povrĝinske energije najprej doloœili pri 30 °C z uporabo enaœbe, kjer ni upoĝtevan entropijski œlen adsorpcije. Ta pristop je v farmacevtski literaturi najpogosteje uporabljan, saj je meritev kratka. Kljub temu, da je pristop termodinamsko nepravilen, so rezultati ponovljivi in pogosto uporabni za razlikovanje med vzorci, ki so si po veœini izmerjenih fizikalno-kemijskih lastnostih podobni. KA je za vse vzorce podoben, tako da razlikovanje vseh vzorcev na osnovi tega parametra ni moĉno (preglednica 2). Relativno majhne razlike med vzorci kaĉejo tudi vrednost KD. Najveœjo baziœnost izkazujeta originalna in laktoza, suĝena z razprĝevanjem, najmanjĝo pa liofilizirana laktoza. Œe za izraœun KA in KD uporabimo DH, se le-te med vzorci razlikujejo signifikantno. Vrednost KA je podobna le pri oborjeni in laktozi, suĝeni z razprĝevanjem. Vrednosti KD se najbolj razlikujejo. Najbolj baziœna je laktoza, suĝena z razprĝevanjem, najmanj pa oborjena laktoza. 192 farm vestn 2005; 56 Doloœanje povrĝinskih lastnosti vzorcev laktoze, pripravljene s suĝenjem z razprĝevanjem, z liofilizacijo in z obarjanjem Preglednica 2: Izraœunani parametri proste povrĝinske energije vzorcev laktoze Table 2: Calculated surface free energy parameters of lactose samples gsd [mN/m2] KA KD KA KD VZOREC (pri 30 °C) (pri 30 °C) (iz DH) (iz DH) Originalna laktoza 38.0 (0.9) 0.11 (0.01) 0.53 (0.02) 0.50 (0.04) 0.79 (0.09) Oborjena laktoza 33.8 (0.1) 0.12 (0.01) 0.50 (0.03) 0.42 (0.03) 0.40 (0.08) Laktoza, suĝena z razprĝevanjem 32.3 (0.2) 0.10 (0.01) 0.54 (0.02) 0.40 (0.01) 1.24 (0.08) Liofilizirana laktoza 42.3 (0.7) 0.08 (0.01) 0.47 (0.03) 0.19 (0.02) 0.71 (0.02) 4 Zakljuœek Raziskava je pokazala, da lahko z uporabo inverzne plinske kro-matografije uspeĝno razlikujemo med povrĝinami vzorcev laktoze pripravljene z razliœnimi metodami suĝenja. Rezultati so pokazali, da je potrebno za popolno razlikovanje vseh vzorcev meritve izvesti pri veœ temperaturah. Vzorci se razlikujejo tako v nepolarnih kot v speci-fiœnih prispevkih proste povrĝinske energije. Dodatno smo z DSC in rentgensko analizo ugotovili, da se vzorci razlikujejo tudi v tistih lastnostih, ki niso vezane samo na povrĝino. 5 Literatura 1. Ticehurst MD, Rowe RC, York P. Determination of the surface properties of two batches of salbutamol sulphate by inverse gas chromatography. Int J Pharm 1994; 111: 241-249. 2. Ticehurst MD, York P, Rowe RC et al. Characterization of the surface properties of a-lactose monohydrate with inverse gas chromatography, used to detect batch variation. Int J Pharm 1996; 141: 93-99. 3. Roberts RJ, Rowe RC, York P. The relationship between indentation hardness of organic solids and their molecular structure. J Matter Sci 1994; 29: 2289-2296. 4. York P, Ticehurst MD, Osborn JC et al. Characterization of the surface energetics of milled DL propranolol hydrochloride using inverse gas chro-matography and molecular modeling. Int J Pharm 1998; 174: 179-186. 5. Trowbridge L, Grimsey IM, York P. Influence of milling on the surface properties of acetaminophen. Pharm Sci 1998; (Suppl) 1(1): 310. 6. Storey RA. The nucleation, growth and solid state properties of particulate pharmaceuticals, PhD Thesis, 1997, UK, University of Bradford. 7. Grimsey IM, Sunkersett MR, Osborn JC et al. Interpretation of the differences in the surface energetics of two optical forms of mannitol by inverse gas chromatography and molecular modeling. Int J Pharm 1999; 191: 43-50. 8. florfieviċ NM, Rohr M, Hintnerleitner M et al. Adsorption of water on cyclosporine A, from zero to finite coverage. Int J Pharm 1992; 81: 21-29. 9. Sunkersett MR, Grimsey IM, Doughty SW et al. The changes in surface energetics with relative humidity of carbamazepine and paracetamol as measured by inverse gas chromatography. Eur J Pharm Sci 2001; 13: 219-225. 10. Shulz J, Lavielle L, Martin C. The role of the interface of carbon fiber epoxy composites. J Adhesion 1987; 23: 45-60. 11. Drago RS, Vogel GC, Needham TE. A four parameter equation for predicting enthalpies of adduct formation. J Am Chem Soc 1971; 93: 6014-6026. 12. Drago RS, Parr LB, Chamberlain CS. Solvent effects and their relationship to E and C equation. J Am Chem Soc 1977; 99(10): 3203-3209. 13. Gutmann V. The donor acceptor approach to molecular interactions. Plenum press, New York 1982. 14. Fowkes FM, Maruchi S. Surface acidity and basicity of polymers. J Am Chem Soc 1977; 173: 110-117. 15. Riddle FL, Fowkes FM. Spectral shifts in acid base chemistry 1. Van der Waals contributions to acceptor numbers. J Am Chem Soc 1990; 112: 3259-3269. 16. Elamin AA, Sebhatu T, Ahlneck C. The use of amorphous model substances to study mechanically activated materials in the solid state. Int J Pharm 1995; 119: 25-36. 17. PDF-2 Powder Diffraction File Database, The International Centre for Diffraction Data, Newtown Square, PA, USA. http://www.icdd.com/. farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles Predpisi za pripravke tkivnega inĉenirstva in za somatsko celiœno zdravljenje Regulative for tissue engineered medical products and somatic cell therapy Saĝa Puhar, Matjaĉ Jeras Povzetek: Tkivno inĉenirstvo je novo, hitro se razvijajoœe interdisciplinarno podroœje biotehnologije, ki se ukvarja z izdelavo kliniœno uporabnih celiœnih, tkivnih in organotipskih kultur in vitro. Sem sodi tudi celiœno inĉenirstvo, ki predstavlja osnovo za somatsko celiœno zdravljenje s klin-iœno uporabnimi pripravki iz celic, pridobljenimi iz tkiv œloveĝkega izvora in gojenih ex vivo. Nenadzorovana uporaba œloveĝkih celic in tkiv lahko pri prejemniku povzroœi bolezni in druge neĉelene uœinke. Zato mora biti osnovni kriterij vrednotenja in nadzora pripravkov tkivnega inĉenirstva ocena tveganja njihove uporabe za bolnika – prejemnika. Prenos nalezljivih bolezni predstavlja nedvomno najveœjo nevarnost pri tovrstnem zdravljenju, poleg tega pa obstaja tudi tveganje zaradi okuĉb celiœnih kultur ter izgube tkivno specifiœnih lastnosti celic, do katerih lahko pride med njihovim gojenjem. Zaradi kompleksnosti pripravkov tkivnega inĉenirstva in razmeroma omejenih izkuĝenj pri njihovi kliniœni uporabi je nujna pravna ureditev podroœja, in sicer tako, da bo zagotovljena kar najveœja stopnja kakovosti, varnosti in uœinkovitosti tovrstnega zdravljenja. Kljuœne besede: tkivno inĉenirstvo, somatske celice, celiœne kulture, celiœno in tkivno zdravljenje. Abstract:Tissue engineering is a new and rapidly developing interdisciplinary field of biotechnology, dealing with tissues and organs by applying viable cell-, tissue- and organotypic cultures prepared in vitro. Somatic cell therapy is a part of tissue engineering and it encompasses preparation of viable human cells, cultured ex vivo in a way to achieve sufficient number of cells suitable for the re-implantation into recipient. Beside wanted effect, the application of human cells and tissues may cause transferable diseases and other unwanted effects in the patient. Risk estimation for the recipient is therefore the main criteria for their application. Transmission of infectious diseases thus represents the major threat., along with possible contamination of cell cultures and the loss of specific cell characteristics occurring during their in vitro manipulation. Due to the complexity of tissue engineered medical products and the lack of clinical experience following their application it is necessary to thoroughly regulate this field in order to assure quality, safety and effectiveness. Key words: tissue engineering, somatic cells, cell cultures, cell and tissue therapy. 1 Uvod Vse bolj poglobljeno poznavanje patofizioloĝkih mehanizmov bolezni na molekularni in biokemijski ravni ter intenziven razvoj biotehnologije sta privedla do novih pristopov k zdravljenju bolezni. Tkivno inĉenirst-vo je hitro razvijajoœe se interdisciplinarno podroœje, katerega cilji so obnovitev tkiv s pomoœjo ĉivih celic, ki jim lahko po potrebi dodamo tudi pomoĉne snovi in posamezne izbrane biomolekule (1, 2, 3). Ĉive tkivne nadomestke lahko uporabimo za obnovo, vzdrĉevanje ali izboljĝanje funkcij posameznih tkiv in organov. Ti pripravki se razlikujejo od klasiœnih zdravil ter drugih ustaljenih oblik zdravljenja v tem, da se za stalno vgradijo v telo in nato s svojimi specifiœnimi lastnostmi vplivajo na zdravljenje oziroma lajĝanje bolezni ter poĝkodb (3). S tkivnoinĉenirskimi postopki pripravljamo avtologne1 ter alogenske2 tkivne in celiœne pripravke, ki lahko vsebujejo tako ĉive kot mrtve celice, katerim po potrebi dodamo pomoĉne snovi (3). V najoĉjem pomenu tkivno inĉenirstvo ne obsega genskega zdravljenja, ksenogenskih3 pripravkov ter pripravkov iz celic, katerih bioloĝke lastnosti so znatno spremenjene (le-te ureja zakonodaja o zdravilih za napredno zdravljenje) (4, 5). Veœina danaĝnjih pripravkov tkivnega inĉenirstva sestoji iz dveh kljuœnih sestavin (6): 1. Celic, ki so lahko avtolognega ali alogenskega izvora. Teoretiœno bi lahko uporabljali razliœne vrste celic, a znanstvena in tehnoloĝka dognanja tega za sedaj ĝe ne omogoœajo. Celice predstavljajo ğglavno uœinkovinoĞ, njihove lastnosti pa so kljuœne za kakovost, uœinkovitost in varnost konœnih pripravkov. 2. Pomoĉnih snovi, pri œemer lahko uporabljamo tako naravne kot umetne bioloĝko sprejemljive ter najveœkrat razgradljive, vœasih pa Saĝa Puhar, mag. farm., Educell d.o.o., Letaliĝka c. 33, 1000 Ljubljana dr. Matjaĉ Jeras, mag. farm., Center za tipizacijo tkiv, Zavod RS za transfuzijsko medicino, Ĝlajmerjeva 6, 1000 Ljubljana 1 avtologno: uporaba bolnikovih lastnih celic 2 alogensko: uporaba œloveĝkih celic drugega dajalca 3 ksenogensko: uporaba ĉivalskih celic 194 farm vestn 2005; 56 Predpisi za pripravke tkivnega inĉenirstva in za somatsko celiœno zdravljenje tudi nerazgradljive materiale. Najpogosteje uporabljamo polimere mleœne in poliglikolne kisline, estre hialuronske kisline, razliœne kola-gene, alginate, hidroksiapatit ipd. Tovrstne pomoĉne snovi predstavljajo tridimenzionalno okolje, ki omogoœa razrast celic ter pripravo tkiva ex vivo, poleg tega pa zagotavlja ustrezno trdnost konœnih pripravkov, ki je potrebna za uspeĝno implantacijo. Interakcije med celicami in pomoĉnimi snovmi imajo lahko zelo velik vpliv na uœinkovitost konœne-ga pripravka. Glede na raznolikost pripravkov tkivnega inĉenirstva (razliœna tkiva, medceliœnina, sporoœilne molekule...) je tveganje pri njihovi uporabi razliœno. Najpomembnejĝe je povezano s prenosom nalezljivih bolezni, pa tudi s stopnjo bioloĝke prenosljivosti ter s samo uœinkovi-tostjo pripravkov (6). Dodatno tveganje predstavlja tudi sam naœin priprave celic ex vivo, saj lahko pride do spremembe njihovih genotipskih in fenotipskih ter s tem bioloĝkih lastnosti, kar je lahko posledica razliœnih naœinov njihove osamitve, gojenja ali celo farmakoloĝke obdelave (1, 7). Glede na stopnjo tveganja pri kliniœni uporabi lahko pripravke tkivnega inĉenirstva delimo na dve skupini (6, 5): 1. Pripravki z nizko stopnjo tveganja: Sem uvrĝœamo pripravke iz avtolognih ali alogenskih celic oziroma tkiv œloveĝkega izvora, katerih bioloĝke lastnosti se z uporabljenimi postopki za njihovo pripravo in vitro niso znatno spremenile. Med takĝne varne postopke uvrĝœamo rezanje tkiv, mehansko in encimsko osamitev celic, centrifugiranje, liofilizacijo, zamrzovanje ipd. Nasprotno pa lahko uporaba posameznih rastnih in diferenciacijskih dejavnikov ali ekstrakcija zno-trajceliœnih sestavin (mineralov, beljakovin) znatno vplivata na lastnosti celic in tkiv. 2. Pripravki z visoko stopnjo tveganja (t.i. zdravila za napredno zdravljenje): Sem uvrĝœamo pripravke iz œloveĝkih avtolognih ali alo-genskih celic in tkiv, katerih bioloĝke lastnosti so se med pripravo ex vivo znatno spremenile. Tipiœna primera sta namnoĉitev (proliferacija) in antigensko specifiœna aktivacija avtolognih imunsko zmoĉnih celic ex vivo (npr. za privzeto oziroma adoptivno imunsko zdravljenje) ter uporaba alogenskih celic, zdruĉenih z neceliœnimi sestavinami (npr. mikrokapsule, intrinziœni ogrodni nosilci, medicinski pripomoœki). V to skupino sodijo tudi pripravki ĉivalskega izvora oziroma ksenogenske celice in tkiva. 2 Somatsko celiœno zdravljenje Pri somatskem celiœnem zdravljenju uporabljamo ĉive œloveĝke avtologne ali alogenske ter ĉivalske somatske celice, pripravljene ex vivo, in sicer za zdravljenje, preventivno ter diagnostiœno uporabo. Uœinek je lahko lokalen ali sistemski (7, 8, 9). Pripravke za somatsko celiœno zdravljenje pripravljamo iz ĉivih somatskih celic, ki jih osamimo iz doloœenih tkiv in jih gojimo tako dolgo, da jih pripravimo v zadostnem ĝtevilu, potrebnem za uspeĝno implantacijo. Celice lahko kombiniramo tudi z neceliœnimi sestavinami in tako omogoœimo zdravljenje v zelo kratkem œasu. (1, 7). Prednosti somatskega celiœnega zdravljenja so (6): 1. imunosupresija bolnika pri presaditvah avtolognih pripravkov ni potrebna; 2. dostopnost izhodnega tkiva je obiœajno lahka, poleg tega pa najveœkrat potrebujemo le majhen delœek zdravega tkiva; 3. omogoœa uœinkovito nadomestitev funkcij poĝkodovanega organa ali tkiva; 4. zagotovljen dolgotrajen uœinek v primerjavi s kroniœno uporabo klasiœnih zdravil. 3 Kontrola kakovosti Bioloĝki pripravki so najveœkrat zelo kompleksni, zato njihove sestave pogosto ne moremo popolnoma opredeliti. Zaradi tega ne moremo vedno ugotoviti prisotnosti doloœenih naœistot, pa tudi konœna kontrola ni vedno uœinkovita, zato jih pogosto opredelimo z nadzorom procesa priprave (postopki izdelave, oprema, prostori in osebje) (8, 10). Sprva je predelava oziroma priprava celic ex vivo obsegala le njihovo shranjevanje v tekoœem duĝiku, postopek, ki so ga izvajali v transfuzijskih bolniĝniœnih centrih ali v ustreznih raziskovalnih laboratorijih. V tem obdobju sta bila standardizacija in nadzor postopkov predelave celic zelo omejena in popolnoma prepuĝœena izbiri izvajalcev. Danes lahko postopki predelave obsegajo veœ stopenj, npr. razliœne naœine osamitve in selekcije celic, gojenje celic ex vivo, celiœno aktivacijo in diferenciacijo, gensko modificiranje ipd. Vse to pa znatno poveœuje tveganje pri uporabi tovrstnih pripravkov in zato terja poostren nadzor priprave, validacijo uporabljenih postopkov ter ustrezno dokumentiranje (11). 3.1 Pomembni dejavniki, potrebni za razvoj in vrednotenje celiœnih pripravkov Kljuœni dejavniki pri razvoju in vrednotenju celiœnih pripravkov so: izbira zaœetnega tkiva oziroma dajalcev, predelava celic ex vivo ter shranjevanje (1, 8, 12, 13, 14). 1. Izbor celic Pri izboru celic so pomembni podatki o vrsti celic oziroma odvzetega tkiva, ki predstavlja njihov vir. Pri dajalcih (ĉivih ali mrtvih) moramo opraviti vse potrebne medicinske preiskave, s pomoœjo katerih lahko z veliko verjetnostjo predvidimo varnost tako zanje kot za prejemnike ter s tem tudi za uspeh posega. 2. Predelava in shranjevanje celic Tkiva in celice moramo skladno s sprejetimi in odobrenimi postopki asepiœno odvzeti in jih ustrezno oznaœiti. Minimalne zahteve terjajo, da morajo oznake na vsebnikih nedvoumno oznaœevati izvor bioloĝkega vzorca (npr. ğœloveĝko tkivoĞ) ter vsebovati identifikacijsko kodo. Iz priloĉene dokumentacije in oznak vsebnika morajo biti razvidni tudi morebitni posebni pogoji ravnanja z vzorci. Nadzor kakovosti uporabljenih materialov in postopkov predelave celic, validacija opreme oziroma celovit nadzor so kljuœnega pomena. Zagotoviti moramo, da bo ravnanje s celicami in vitro potekalo v takĝnem okolju, ki bo onemogoœalo moĉnost nastanka okuĉb. Kadar ĉelimo celiœne pripravke iz enega samega vira (dajalca) pripraviti veœkrat, moramo vzpostaviti sistem tkivne banke za farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles somatske celice. Pri tem moramo upoĝtevati zahteve za obiœajne celiœne banke in voditi dokumentacijo o izvoru bioloĝkega vzorca ter o opravljenih postopkih predelave celic. 3.2 Kontrola kakovosti celiœnih pripravkov Nadzor kakovosti celiœnih pripravkov lahko smiselno razdelimo na ĝtiri glavna podroœja (8): 1. preverjanje varnosti celiœnih pripravkov (sterilnost, prisotnost miko-plazem, bakterijskih endotoksinov, virusov), ki nam zagotavlja, da le-ti ne vsebujejo zdravju ĝkodljivih kontaminantov; 2. ugotavljanje œistosti oziroma identifikacije (ĝtevilo in ĉivost celic, istovetenje celic – morfologija, zaostale neœistote...) nam zagotavlja, da celiœni pripravki ustrezajo specifikaciji na ovojnini in da ne vsebujejo znanih neœistot; 3. ugotavljanje uœinkovitosti (citotoksiœnost, metabolna aktivnost...) nam zagotavlja vpogled v funkcionalno uœinkovitost celiœnih pripravkov; 4. ugotavljanje stabilnosti (funkcionalna aktivnost po doloœenem œasu) nam zagotavlja, da celiœni pripravki ohranijo svojo uœinkovitost po doloœenem œasu shranjevanja pri doloœenih pogojih. Zakonsko je trenutno obvezen le vhodni nadzor odvzetega tkiva na oznaœevalce okuĉb zaradi prepreœevanja ĝirjenja nalezljivih bolezni (seroloĝki postopki analize dajalca). Preostala kontrola kakovosti pa je prepuĝœena presoji posameznega proizvajalca, obstajajo pa doloœe-na priporoœila zlasti glede konœne kontrole kakovosti, vendar ni predpisov o vrstah analiznih metod, ki naj bi jih pri tem uporabljali (2). Priporoœila skupin za somatsko celiœno zdravljenje glede kontrole kakovosti (15, 16): 1. Vhodna kontrola kakovosti: • seroloĝka analiza odvzetega tkiva (ugotavljanje okuĉbe z virusom hepatitisa B, hepatitisa C, HIV in s povzroœiteljem sifilisa); • analiza mikrobne obremenitve vhodnega materiala. 2. Procesna kontrola kakovosti: • celiœni genotip (genotipizacija); • celiœna morfologija; • ĉivost celic; • aseptiœnost celotnega procesa ravnanja s celicami. 3. Konœna kontrola kakovosti: • celiœna morfologija; • ĉivost celic; • celiœni fenotip; • celiœni genotip; • mikrobna kontaminacija; • apirogenost (bakterijski endotoksini); • ostanki snovi, ki se uporabljajo v postopku proizvodnje (antibiotiki, DMSO, tripsin). Celiœni pripravki imajo omejen rok uporabnosti, zato jih moramo uporabiti v zelo kratkem œasu po izdelavi, tako da pogosto konœne kontrole ni mogoœe izvesti v celoti. Pred uporabo tako izvedemo identifikacijo celic, ostala testiranja pa izvedemo naknadno in nam sluĉijo kot potrditev ustreznosti procesa izdelave (8). 4 Pravni vidiki Podroœje tkivnega inĉenirstva je v Evropi pravno ĝe vedno razmeroma slabo urejeno in vse kaĉe, da bo za izdelavo in sprejem ustrezne zakonodaje potrebnih ĝe kar nekaj let. Zaradi vse pogostejĝe kliniœne uporabe pripravkov tkivnega inĉenirstva in zelo intenzivnega razvoja tega podroœja je potrebno œim hitreje in kar najbolje opredeliti predvsem zahteve za kakovost (6). Izkuĝnje zadnjih desetih let so pokazale, da najveœje tveganje predstavljajo prenos nalezljivih bolezni, bioloĝka prenosljivost in uœinkovi-tost, kar je ĝtevilne drĉave spodbudilo k hitrejĝemu pravnem urejanju tega podroœja (6, 17). V Evropski skupnosti posamezne drĉave œlanice zelo razliœno urejajo podroœje tkivne tehnologije. Zakoni in pravilniki s podroœja darovanja organov in tkivnih bank so bili do sedaj sprejeti oziroma posodobljeni le v nekaterih œlanicah (6, 17). Junija 2002 je Svet Evrope sprejel odloœitev, da pripravki iz tkiv œloveĝkega izvora potrebujejo posebno direktivo, katera je bila sprejeta marca 2004 – Direktiva 2004/23/EC (2, 18). V Sloveniji trenutno ni specifiœnih zakonov in pravilnikov, ki bi obravnavali celiœne in tkivne pripravke, pripravljene ex vivo. Imamo pa sodoben Zakon o odvzemu in presaditvi delov œloveĝkega telesa zaradi zdravljenja (Ur. l. 12/2000) ter pripadajoœe pravilnike, ki urejajo naœin odvzema delov œloveĝkega telesa, izbor in pridobivanje dajalcev ter varovanje osebnih podatkov, vodenje evidenc opravljenih odvzemov in presaditev, naœine shranjevanja in prevoz delov œloveĝkega telesa ter izmenjavo delov œloveĝkega telesa z drugimi drĉavami (Ur. l. 53/2002, 70/2003, 75/2003, 131/2003). 4.1 Kriteriji tveganja pri uporabi pripravkov tkivnega inĉenirstva Glavni kriterij razvrĝœanja pripravkov tkivnega inĉenirstva je ocena tveganja za prejemnika (bolnika). Pripravke z nizko oceno tveganja, pri katerih bioloĝke lastnosti celic niso bile znatno spremenjene med njihovo pripravo ex vivo, v celoti urejajo zakoni s podroœja presajanja organov, tkiv in celic (4, 19, 21). Kadar pripravki vsebujejo celice z znatno spremenjenimi bioloĝkimi lastnostmi, predstavljajo le-ti veœje tveganje za prejemnika in zato sodijo pod okrilje zakonov s podroœja zdravil (zdravila za napredno zdravljenje) in medicinskih pripomoœkov (5, 19, 21). Na tveganje uporabe celiœnih pripravkov pomembno vpliva tudi odnos med dajalcem in prejemnikom tkiva. Pri avtolognih pripravkih je dajalec in prejemnik ista oseba, to pa pomeni veœjo stopnjo varnosti in zato so v tem primeru moĉne tudi doloœene izjeme. Tako lahko takĝne pripravke uvrstimo med pripravke z nizko oceno tveganja tudi v primeru, ko imajo doloœene lastnosti, zaradi katerih bi jih sicer uvrstili v skupino pripravkov z veœjim tveganjem (11). farm vestn 2005; 56 Predpisi za pripravke tkivnega inĉenirstva in za somatsko celiœno zdravljenje 5 Sklep Vse pogostejĝa terapevtska uporaba œloveĝkih celic in tkiv terja œim prejĝnjo vzpostavitev standardov kakovosti in varnosti z namenom, da bi uœinkovito prepreœili predvsem prenos nalezljivih bolezni, kar predstavlja najveœje tveganje pri tovrstnem naœinu zdravljenja. Tveganju se lahko izognemo s skrbno oceno ustreznosti dajalcev ter z njihovim doslednim testiranjem v skladu z veljavnimi sodobnimi zahtevami in postopki. Hkrati moramo zagotoviti zanesljiv sistem sledljivosti œloveĝkih celic in tkiv vse od dajalca do konœnega prejemnika. (2). Med samo predelavo celic predstavlja najveœjo nevarnost zagotovo kontaminacija celiœnih kultur. Zato moramo obvezno preverjati morebitno navzkriĉno kontaminacijo posameznih celiœnih kultur ter seveda vrsto in identiteto povzroœiteljev (20). Vse intenzivnejĝa izmenjava tkiv med posameznimi drĉavami in regijami terja tudi hitro vzpostavitev skupnih smernic za zagotavljanje kakovosti, varnosti in uœinkovitosti. Zakonodaja in ukrepi regulatornih organov morajo zagotoviti, da bodo imele œloveĝke celice in tkiva, pripravljena v razliœnih podroœjih sveta primerljivo kakovost in varnost (2). 6 Literatura 1. Points to consider on manufacture and quality control of human somatic cell therapy medical products. EMEA 2001, London; CPMP/BWP/41450/98: 1-10. 2. Directive 2004/23/EC. Official Journal of the European Union, 2004; L102: 46-94. 3. Need for a legislative framework of Human tissue engineering and tissue-engineered products. European Commission 2002; Consultation document: 1-5. 4. Proposed Approach to regulation of cellular and tissue-based products. FDA, CBER 1997; 97N-0068: 1-37. 5. Directive 2003/63/EC. Official Journal of the European Union, 2003: L159; 46-94. 6. Tissue engineered medical products (TEMPs): A prelude to risk management. RIVM Report 605148 009, 2001: 1-57. 7. Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy, Guidance for Industry. FDA, CBER 1998:1-27. 8. Guidance on application for products comprised of living autologous cells manipulated ex vivo and intended for structural repair or reconstruction. FDA, CBER 1996; 95N-0200: 1-10. 9. Directive 2001/83/EC, Annex 1, part IV. European Commission 2001; Working document 2002: 53-57. 10. Guidance concerning demonstration of comparability of human biological products, including therapeutic biotechnology-derived products. FDA, CBER, CDER 1996: 1-9. 11. Burger SR. Current regulatory issues in cell and tissue therapy. Cytotherapy 2003, Vol.5, No.4: 289-298. 12. Zakon o odvzemu in presaditvi delov œloveĝkega telesa zaradi zdravljenja. Uradni list RS, Ljubljana; 12/00:1569-1572. 13. Pravilnik o naœinu shranjevanja in prevoza delov œloveĝkega telesa, namenjenih za presaditev. Uradni list RS, Ljubljana; 70/03:10825-10827. 14. Pravilnik o naœinu varstva osebnih podatkov dajalcev in prejemnikov delov œloveĝkega telesa zaradi zdravljenja. Uradni list RS, Ljubljana 2003; 75/03:11369-11370. 15. Guidance for the submission of chemistry, manufacturing, and controls information and establishment description for autologous somatic cell therapy products. FDA, CBER 1997; 95N-0200: 1-19. 16. Opinion on the state of the art concerning tissue engineering. European Commission 2001; SANCO/SCMPMD/2001/0006 Final: 1-15. 17. Warwick RM, Kearney JN. Safety of human tissues and cells for transplantation. Future Strategies for tissue and organ replacement. Imperial College Press 2002: 381-419. 18. Human Tissue and cell engineering products. European Commission; Commission’s Consultation paper 2004: 1-12. 19. Smith DS. Understanding external controls over the commercial introduction of engineered human tissue. Tissue engineering 1999: Vol.26, No 4: 537-548. 20. Validation of procedures for processing of human tissue intended for transplantation. Guidance for industry. FDA, CBER 2002: 1-3. 21. Human tissue engineering and beyond: Proposal for a Community regulatory framework on advanced therapies. European Commission 2005; Consultation document: 1-15. farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles Zdravila v noseœnosti I: Prenos uœinkovin skozi placento Drugs in pregnancy I: Drug transport across the placenta Matej Avanzo, Alenka Ĝavc, Mojca Kerec Kos Povzetek: Placenta ali posteljica je visoko specializiran organ v noseœnosti, ki omogoœa normalno rast in razvoj ploda. Predstavlja vez med materjo in plodom, hkrati pa deluje kot polprepustna membrana med njunima krvnima obtokoma. Skoraj vsaka uœinkovina, ki je prisotna v krvnem obtoku matere, lahko skozi placento preide v krvni obtok ploda, vendar v razliœnem obsegu in razliœno hitro. Poznavanje mehanizmov prenosa uœinkovin skozi placento pomaga pri odloœitvah o odmerjanju zdravil noseœnicam z namenom zmanjĝati izpostavljenost ploda potencialno toksiœnim koncentracijam uœinkovin. Po drugi strani je transplacentarni prenos uœinkovin pomemben pri zagotovitvi terapevtskih koncentracij uœinkovin v krvnem obtoku ploda. Kjuœne besede: placenta, plod, placentarna membrana, prenos uœinkovin Abstract: Placenta is a highly specialized organ developed in pregnancy that supports normal growth and development of the fetus. It represents a connection between a mother and the fetus, but at the same time it acts as a semi permeable membrane between their blood circulations. Almost every active substance in maternal blood circulation can cross placenta and enter into fetal blood circulation, but in different extent and rate. The knowledge on mechanisms of active substance transfer across placenta enables making decisions about dosage regimes for pregnant women and minimizes fetal exposure to potentially toxic concentrations of active substances. On the other hand, the placental transfer of active substances into fetal blood circulation is decisive when therapeutic concentrations of the substances are necessary in fetal blood. Keywords: placenta, fetus, placental membrane, drug transport 1 Uvod Glavna naloga placente je prenos hranil in kisika iz krvnega obtoka matere v krvni obtok ploda ter odstranjevanje odpadnih produktov iz krvnega obtoka ploda. Placenta ima tudi pomembno vlogo pri sintezi hormonov, peptidov in steroidov, ki so kljuœni za uspeĝno noseœnost (1, 2, 3). Uœinkovine, prisotne v materinem krvnem obtoku, lahko v razliœnem obsegu in razliœno hitro prehajajo placento. Nekatere uœinkovine prehajajo placento hitro ter so prisotne v krvnem obtoku matere in ploda v signifikantnih koncentracijah (t.i. popolni prenos). Doloœene uœinkovine ne prehajajo placente popolno, zato je njihova koncentracija veœja v krvnem obtoku matere. Le omejeno ĝtevilo uœinkovin doseĉe veœjo koncentracijo v plodovem krvnem obtoku (4). 2 Anatomija placente Placenta œloveka je hemohorialni tip placente, pri kateri je tkivo ploda v direktnem stiku z materino krvjo (5). Placenta je sestavljena iz 20-40 osnovnih anatomskih enot, imenovanih kotiledoni, ki vsebujejo posamezne vaskularne enote - viluse. Vilus je razvejan pleteĉ kapilar, skozi katerega prehajajo snovi iz materine krvi na plod in obratno. Materina kri priteœe v kotiledone skozi arterije endometrija, kroĉi med razvejanimi vilusi in se vrne v materin krvoĉilni sistem po endometri-jskih venah (3). Plodova kri priteœe v placento skozi dve popkovni arteriji, ki preideta v arterije horionske ploĝœe, arterije vilusov in kapi- lare, ter se bogata s kisikom in drugimi snovmi vrne po popkovni veni v plod (slika 1) (5). Slika 1: Lega placente v maternici. Preko placente se med materino in plodovo krvjo izmenjujejo hranila, odpadne snovi in plini (6). Figure 1: Location of the placenta in uterus. In the placenta nutrients, wastes, and gases are exchanged between the maternal and the fetal blood (6). Matej Avanzo, mag. farm., Lek farmacevtska druĉba d.d., Verovĝkova 57, 1526 Ljubljana, Slovenija Alenka Ĝavc, mag. farm., Lek farmacevtska druĉba d.d., Verovĝkova 57, 1526 Ljubljana, Slovenija dr. Mojca Kerec Kos, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana, Slovenija 198 farm vestn 2005; 56 Zdravila v noseœnosti I: Prenos uœinkovin skozi placento Kapilare vilusov, po katerih teœe plodova kri, nudijo veliko povrĝino, in tam se vrĝi glavni transplacentarni prenos med materjo (njena kri obliva viluse) in plodom (njegova kri teœe po kapilarah vilusov). Na preœnem prerezu veje vilusa je vidna zgradba placentarne membrane (slika 2), ki predstavlja bariero za transplacentarni prenos. To sestavljajo sinciciotrofoblasti, citotrofoblasti in endotelij plodovih kapilar. Po pribliĉno 10. tednu noseœnosti se prepustnost placentarne membrane moœno zveœa predvsem kot posledica tanjĝanja plasti sinciciotro-foblastov ter razpada citotrofoblastov (1). Slika 2: Shematski prikaz placentarne membrane med krvjo matere in ploda. ST- sinciciotrofoblast; CT- citotrofoblast; PK - plodova kapilara (2). Figure 2: Schematic presentation of placental membrane between maternal and fetal blood. ST-syncytiotrophoblast; CT- cytotophoblast; PK - fetal capillary (2). 3 Mehanizem prenosa uœinkovin Uœinkovine lahko prehajajo placento s pasivno difuzijo, olajĝano difuzijo, aktivnim prenosom, fagocitozo in pinocitozo. Fagocitoza in pinoc-itoza nimata pomembnega vpliva pri prehodu uœinkovin skozi placen-to, ker potekata prepoœasi. 3.1 Pasivna difuzija Pri pasivni difuziji poteka prenos uœinkovin skozi placento v smeri koncentracijskega gradienta. Koliœina preneĝene uœinkovine je odvisna od koncentracije uœinkovine v materinem obtoku, njenih fizikalno-kemijskih lastnosti in lastnosti placentarne membrane. Prenos hidrofilnih uœinkovin je omejen s permeabilnostjo placente, medtem ko je pri lipofilnih uœinkovinah kljuœnega pomena prekrvavljenost placente. Pasivna difuzija skozi placento je odvisna tudi od povrĝine, kjer poteka prenos (3,4–12,6 m2), in debeline placentarne membrane (4–100 µm). Pri transplacentarnem prehodu ima pomembno vlogo tudi vezava uœinkovin na plazemske proteine, saj uœinkovine prehajajo membrano ĝele ob loœitvi od proteina. V noseœnosti lahko fizioloĝki ter nekateri patoloĝki procesi spremenijo koncentracijo proteinov v plazmi (1, 4). S pasivno difuzijo najlaĉje prehajajo lipofilne uœinkovine z majhno molekulsko teĉo, ki so neionizirane. Molekule, ki imajo molekulsko teĉo veœjo od 500 Da, nepopolno prehajajo skozi placento, medtem ko molekule z molekulsko teĉo veœjo od 1000 Da placente skoraj ne prehajajo. Veœina uœinkovin ima molekulsko teĉo manjĝo od 500 Da. Pomemben faktor pri prehodu uœinkovin skozi placento je tudi topnost v lipidih. V nasprotju s hidrofilnimi, lipofilne uœinkovine hitreje prehajajo placento. Veœina uœinkovin je ĝibkih kislin ali baz in disociirajo pri fizioloĝkem pH. V ionizirani obliki uœinkovine ne morejo prehajati membrane placente. V normalnih pogojih je pH krvi ploda za 0,1 enote niĉji kot pri materi in ta majhna razlika nima pomembnega vpliva na ion-izacijo uœinkovine ter s tem na njen prehod skozi placento. V doloœenih primerih (npr. fiziœni napor) pa lahko pH plodove krvi znatno pade in posledica je zmanjĝan prenos baziœnih uœinkovin iz krvnega obtoka ploda v krvni obtok matere ter zveœanje koncentracije teh uœinkovin v plodu (1, 4). 3.2 Olajĝana difuzija Olajĝana difuzija poteka v smeri koncentracijskega gradienta ob prisotnosti prenaĝalca. Ta mehanizem naj bi bil pomemben za prenos ogljikovih hidratov, hormonov ter nukleozidov. Ima manjĝi pomen pri prenosu uœinkovin skozi placento, saj je bila olajĝana difuzija uœinkovin v sinciciotrofoblaste opaĉena le pri cefaleksinu in glukokortikoidih (1, 4). 3.3 Aktivni prenos Aktivni prenos skozi placento poteka ob hidrolizi ATP ali z energijo shranjeno v transmembranskem elektrokemijskem gradientu Na+, Cl-in H+ ionov. Prenos poteka z ustreznimi prenaĝalci, ki se nahajajo na materini (apikalni) ali plodovi bazolateralni (bazalni) strani placentarne membrane in so odgovorni za prehod uœinkovin v ali iz sinciciotro-foblasta (preglednica 1). 4 Presnova v placenti Med prehodom skozi placento se uœinkovina lahko tudi presnavlja, kar vpliva na koliœino uœinkovine, ki se pojavi v plodovi krvi (1). Ĝtevilo encimov in njihova substratna specifiœnost je v placenti v primerjavi z encimi jeter zelo omejena. Dozorela jetra ploda lahko presnavljajo substance boljĝe kakor placenta (5, 7). Med encimi faze I prevladujejo v placenti encimi citokrom P450 (CYP). Njihova ekspresija je v placenti regulirana drugaœe kakor v jetrih (1, 7). Vrsta in koliœina encima je odvisna od fizioloĝkega stanja matere in trajanja noseœnosti. V sploĝnem je ekspresija CYP najveœja v prvem trimeseœju noseœnosti, ko je plod najbolj obœutljiv na uœinke teratogenov, CYP1A1 pa se npr. aktivira ob kajenju v prvem trimeseœju noseœnosti (1). Izmed encimov metabolne faze II najdemo v placenti glutation-S-transferazo, ki je aktivna skozi celotno obdobje noseœnosti, epoksid hidrolazo in sulfoniltransferazo (1, 7). 5 Tehnike spremljanja prenosa skozi placento Jemanje zdravil med noseœnostjo lahko deluje ĝkodljivo na plod, zato so zelo pomembne raziskave prehoda uœinkovin skozi placento. Ker so ğin vivoĞ poskusi na noseœnicah zaradi potencialne nevarnosti za plod etiœno sporni, razen v primerih direktne koristi za plod, so razvili ğin vitroĞ metode za prouœevanje transplacentarnega prehoda spojin. Te metode odstranijo vpraĝanje etiœnosti, s katerim se sreœamo pri ğin vivoĞ ĝtudijah na noseœnicah, a ne upoĝtevajo vseh fizioloĝkih in farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles Preglednica 1: Pomembnejĝi placentarni prenaĝalci, njihova funkcija, lokalizacija in substrati (1). Table 1: Major placental transporters, their function, localization and substrates (1). AKTIVNI PRENAĜALEC FIZIOLOĜKA FUNKCIJA V PLACENTI LOKALIZACIJA V PLACENTI SUBSTRATI P-glikoprotein (PGP) prenos hidrofobnih kationskih spojin od ploda do matere apikalni sinciciotrofoblast digoksin, ciklosporin, sakvinavir, vinkristin, vinblastin, paklitaksel, deksametazon, terfenadin, loperamid ondansetron Multidrug resistance protein 1 (MRP1) prenos glutationa, sulfatov in konjugatov glukoronida od ploda do matere kapilarne endotelijske celice, bazalni sinciciotrofoblast metotreksat, etopozid, vinkristin, vinblastin, cisplatin, Multidrug resistance protein 2 (MRP2) prenos glutationa, sulfatov in konjugatov glukoronida od ploda do matere apikalni sinciciotrofoblast etopozid, cisplatin, ampicilin, doksorubicin, vinkristin, vinblastin, metotreksat, Multidrug resistance protein 3 (MRP3) prenos anionskih konjugatov od ploda do matere kapilarne endotelijske celice, bazalni sinciciotrofoblast metotreksat, etopozid Breast cancer resistant protein (BCRP) neznana verjetno apikalna membrana topotekan, mitoksantron, doksorubicin Serotoninski prenaĝalec (SERT) in noradrenalinski prenaĝalec (NET) prenos serotonina in dopamina apikalni sinciciotrofoblast amfetamini Ekstraneuralni monoaminski prenaĝalec (OCT3) prenos serotonina, dopamina, noradrenalina in histamina verjetno bazalni sinciciotrofoblast amfetamini, cimetidin Monokarboksilatni prenaĝalec (MCT) prenos laktata in piruvata od ploda do matere apikalni in verjetno tudi bazalni sinciciotrofoblast valprojska kislina Dikarboksilatni prenaĝalec (NaDC3) prenos sukcinata in a-ketoglutarata od matere do ploda apikalni sinciciotrofoblast niso znani Natrijev / multivitaminski prenaĝalec (SMVT) prenos biotina in pantotenata od matere do ploda apikalni sinciciotrofoblast karbamazepin biokemiœnih parametrov matere, ploda in placente. Pri teh metodah lahko preuœujemo transplacentarni prenos snovi s pomoœjo preœiĝœenih, po porodu pridobljenih placent. Za ĝtudij prenosa substance iz materine krvi v sinciciotrofoblastne celice in za ĝtudij metab-olizma v placenti se lahko uporabijo tudi rezine placente, secirano sin-ciciotrofoblastno tkivo, membranski vezikli vilusov ali subceliœne frakcije (mikrosomi) (1, 5). Za nekatere raziskave so bolj primerne tkivne in celiœne kulture, s katerimi lahko prouœujejo vplive snovi na regulacijo receptorjev placente. Za ta namen se uporablja primarne tro-foblastne kulture in trajne celiœne linije (BeWo, JAr, JEG) pridobljene iz œloveĝkega horiokarcinoma (5). Veliko podatkov o uœinkih zdravil med noseœnostjo izhaja iz ğin vivoĞ ĝtudij na ĉivalih. Placentarni prenos se v teh ĝtudijah ugotavlja iz razmerja koncentracij uœinkovine v plodovi in materini krvi ter s pomoœjo oœistkov mater/plod in plod/mater. Ti se izraœunajo iz istoœasno vzetih vzorcev krvi matere in ploda, vzete iz popkovnih ĉil takoj po porodu (5, 8). Druge dostopne informacije so ĝe koncentracijsko razmerje tekoœin plod/amnijska tekoœina in mater/amnijska tekoœina, iz vzorca placente po porodu pa ĝe razmerja plod/placenta in mater/placenta (1). Omenjena razmerja kaĉejo na skladiĝœenje in kopiœenje uœinkovine v amnijski tekoœini, kar nakazuje transplacen-tarni prenos uœinkovine in plodovo eliminacijo v amnijsko tekoœino (5). Zaradi anatomskih in funkcionalnih razlik med sesalskimi placentami rezultati teh ĝtudij pogosto niso direktno prenosljivi na œloveka, a so v nekaterih primerih dobili dobro korelacijo med rezultati ğin vitroĞ metod ter ğin vivoĞ testi na primatih. Pomemben vir informacij o varnosti uporabe zdravil med noseœnostjo so tudi poroœila o neĉelenih uœinkih pri posameznih noseœnicah (case reports). Problem pri teh poroœilih je le, da je teĉko direktno povezati neko uœinkovino z neĉelenim uœinkom. Vendar œe se za posamezno uœinkovino pojavi veœ takĝnih poroœil, to nakazuje na njeno ĝkodljivost za plod (9). Ameriĝka agencija za hrano in zdravila Food and drug administration (FDA) in pa Evropska agencija za zdravila European Medicines Agency (EMEA) skuĝata uvesti tudi bolj organizirano poroœanje neĉe-lenih uœinkov pri noseœnicah in pa spodbujata industrijo k oblikovanju registrov noseœnic, kjer se identificira noseœnice, ki jemljejo doloœeno zdravilo in potem se pri njih opazuje izid noseœnosti (9, 10). 6 Uporaba zdravil v noseœnosti Na sploĝno velja, da se v noseœnosti skuĝamo œim bolj izogniti zdravljenju z zdravili, vendar lahko noseœe ĉenske akutno zbolijo (npr. dobijo pljuœnico) ali pa imajo neko kroniœno obolenje (npr. astmo, hipertenzi-jo, epilepsijo, od inzulina odvisno sladkorno bolezen, motnjo delovanja ĝœitnice), ki lahko brez zdravljenja predstavlja preveliko tveganje za zdravje in v teh primerih je smiselna uporaba zdravil. V raziskavi (11), ki so jo izvedli v Franciji, Italiji, Veliki Britaniji in na Nizozemskem, so 1134 mater, ki so rodile zdrave otroke, vpraĝali o uporabi zdravil v prvem trimeseœju noseœnosti. V povpreœju je 36,2% mater v tem obdobju uporabilo vsaj eno zdravilo, brez upoĝtevanja vitaminov in mineralov. V veœini primerov so bila zdravila namenjena akutnemu zdravljenju, najpogosteje pa so bila uporabljena zdravila za sistemsko zdravljenje bak- 200 farm vestn 2005; 56 Zdravila v noseœnosti I: Prenos uœinkovin skozi placento terijskih infekcij ter antiemetiki. V Franciji pa so v raziskavi (12), ki je zajela 1000 noseœnic, ugotovili, da je 99% noseœnic v celotnem obdobju noseœnosti prejelo vsaj eno zdravilo na recept in v povpreœju so zdravniki predpisali 13,6 zdravil na noseœnico. Upoĝtevali so vsa zdravila, ki se v Franciji lahko predpiĝejo na recept, tudi vitamine, minerale in homeopatske pripravke. Poraba zdravil je najmanjĝa v prvem trime-seœju noseœnosti in naraĝœa s starostjo noseœnice (10, 12). Zaradi pomanjkanja podatkov o varnosti uporabe zdravil med noseœnos-tjo, se noseœnicam navadno predpisujejo zdravila, ki so ĉe daljĝe obdobje prisotna na trĉiĝœu in jih v tem œasu niso povezali z resnimi zapleti pri noseœnicah. Pojavlja se tudi problem pri odmerjanju zdravil. Fizioloĝke spremembe telesa, ki se pojavijo v posameznem trimeseœju noseœnosti, vplivajo tudi na farmakokinetiœne procese. Noseœnice imajo poveœan volumen plazme, kar vpliva na delovanje srca in ledvic. Poslediœno je poveœana renalna eliminacija uœinkovin. Zdravniki noseœnicam pogosto zmanjĝajo odmerke zdravil, z namenom zaĝœititi plod, vendar lahko noseœnice potrebujejo celo veœje odmerke zdravil (10). Nekatere drĉave razvrĝœajo uœinkovine glede na njihovo varnost uporabe v noseœnosti. FDA deli uœinkovine v pet skupin glede na njihovo sposobnost povzroœanja poĝkodb ploda ter glede na vpliv na reprodukcijo in noseœnost (preglednica 2). Pri delitvi uœinkovin v skupine gre za razmerje med koristjo in tveganjem terapije in tako ni nujno, da so uœinkovine v skupini X bolj toksiœne kot uœinkovine v skupini C ali D. Hormonski sistemski kontraceptivi sodijo v skupino X le zato, ker njihova uporaba v noseœnosti ni smiselna. Nekatere uœinkovine pa so lahko v skupini C samo zato, ker ĝtudij na ĉivali ni bilo opravljenih. FDA se zato zavzema za vpeljavo nove klasifikacije, ki bi œrkovne kategorije zamenjal z bolj podrobnimi opisnimi informacijami, vkljuœujoœ podatke o vplivu uœinkovin na plodnost in dojenje (10). Mednarodno se uporabljata ĝe dva klasifikacijska sistema in sicer klasifikacijski sistem ADEC (Australian Drug Evaluation Committee) ter FASS klasifikacijski sistem (Swedish Catalogue of Approved Drugs). Oba sistema imata podobne œrkovne kategorije kot FDA sistem, le da FASS sistem nima kategorije X. Od 236 uœinkovin, ki jih najdemo v vseh treh klasifikacijskih sistemih, jih je le 26% razvrĝœenih v isto kategorijo. To omejuje uporabnost in zaupanje v klasifikacijske sisteme (13). 7 Sklep Placenta ni uœinkovita bariera za zaĝœito ploda pred ksenobiotiki. Skoraj vse uœinkovine prehajajo placento, vendar v zelo razliœnem obsegu in razliœno hitro. Tako rezultati ğin vitroĞ metod kot tudi ğin vivoĞ preizkuĝanj na ĉivalih dajejo informacije o prehodu uœinkovin skozi pla-cento, vendar je to podroœje ĝe vedno slabo raziskano in pridobljene informacije so pogosto teĉko prenosljive na œloveka. Pomanjkanje znanja oteĉuje varnejĝe in uœinkovitejĝe zdravljenja noseœnice in/ali ploda. Ker za nobeno uœinkovino ne moremo z zagotovostjo trditi, da je njena uporaba med noseœnostjo varna, se zdravila v noseœnosti jemljejo le v primerih, ko priœakovana korist opraviœuje tveganje za plod. 8 Literatura 1. Syme MR, Paxton JW, Keelan JA. Drug transfer and metabolism by the human placenta. Clin Pharmacokinet 2004; 43 (8): 487–514. 2. Ganapathy V, Prasad PD, Ganapathy ME et al. Placental transporters relevant to drug distribution across the maternal-fetal interface. J Pharmacol Exp Ther 2000; 294: 413–420. 3. Gude NM, Roberts CT, Kalionis B et al. Growth and function of the normal human placenta. Thromb Res 2004; 114: 397–407. 4. Pacifici GM, Nottoli R. Placental transfer of drugs administered to the mother. Clin Pharmacokinet 1995; 28 (3): 235–269. 5. Sastry BVR. Techniques to study human placental transport. Adv Drug Deliv Rev 1999; 38: 17–39. 6. Adam Health Encyclopedia. 7. St-Pierre MV, Ugele B, Gambling L et al. Mechanisms of drug transfer across the human placenta – A workshop report. Placenta 2002, 23, Supplement A. Trophobl Res 16: 159–164. 8. Unadkat JD, Dahlin A, Vijay S. Placental drug transporters. Curr Drug Metab 2004; 5: 125–131. 9. Note for guidance on the exposure to medicinal products during pregnancy: need for post-authorisation data, EMEA, 2004 10. Meadows M. Pregnancy and the drug dilemma. FDA Consumer magazine 2001; 35 (3) (http://www.fda.gov/fdac/) 11. De Vigan C, De Walle HEK, Cordier S et al. Therapeutic drug use during pregnancy: A comparison in four European countries. J Clin Epidemiol 1999; 52 (10): 977–982. 12. Lacroix I, Damase-Michel C, Lapeyre-Mestre M et al. Prescription of drugs during pregnancy in France. Lancet 2000; 356: 1735–1736. 13. Addis A, Sharabi S, Bonati M. Risk classification systems for drug use during pregnancy. Drug Saf 2000; 23 (3): 245–253. Preglednica 2: FDA razvrstitev uœinkovin glede varnosti uporabe v noseœnosti (10). Table 2: FDA drug classification regarding safety in pregnancy (10). KATEGORIJA DEFINICIJA A Kontrolirane ĝtudije pri noseœnicah niso dokazale poveœane nevarnosti za abnormalnosti ploda. B Ĝtudije na ĉivalih niso dokazale ĝkodljivosti za plod, vendar kontrolirane raziskave na noseœnicah niso bile opravljene. ALI Ĝtudije na ĉivalih so dokazale ĝkodljivost za plod, vendar kontrolirane raziskave na noseœnicah ĝkodljivosti za plod niso potrdile. C Ĝtudije na ĉivalih so dokazale ĝkodljivost za plod, kontrolirane raziskave na noseœnicah pa niso bile opravljene. ALI Ĝtudije na ĉivalih in kontrolirane raziskave na noseœnicah niso bile opravljene. D Kontrolirane ali opazovalne ĝtudije na noseœnicah so potrdile ĝkodljivost za plod, vendar lahko korist terapije pretehta potencialno nevarnost. X Kontrolirane ali opazovalne ĝtudije na ĉivalih ali noseœnicah so potrdile ĝkodljivost za plod. Uporaba uœinkovin je kontraindicirana pri ĉenskah, ki so ali lahko postanejo noseœe. farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles Ciljana dostava uœinkovin v tumorske celice z liposomi Tumor-specific targeting of drugs by liposomes Nina Koœevar, Julijana Kristl POVZETEK: Liposomi so danes predmet intenzivnih raziskav na podroœju zdravljenja rakavih obolenj. Novejĝi liposomski sistemi omogoœajo doseganje dobrih terapevtskih uœinkov, ki so posledica zmanjĝane toksiœnosti zaradi omejenega porazdeljevanja uœinkovin v zdrava tkiva in poveœanega zadrĉevanja v tumorjih. Poleg tega predstavljajo tudi velik potencial v genski terapiji. V œlanku so predstavljene novejĝe strategije oblikovanja liposomskih sistemov, s katerimi dosegamo selektivno kopiœenje uœinkovin v tumorskih celicah in nadzorovano sproĝœanje. Kljuœne besede: liposomi, tumorske celice, ciljano dostavljanje, ciljano sproĝœanje, genska terapija ABSTRACT: Liposomes have been studied extensively as drug carriers in cancer therapy. Advanced strategies can decrease toxicity and therefore enhance therapeutic effects through limited distribution to healthy tissues and selective accumulation at the diseased site. Liposomes also offer a promising potencial in gene therapy. The article represents some novel developments in liposome-based drug delivery that enhance tumor-specific targeting and controlled drug release. Key words: liposomes, tumor cells, targeted delivery, targeted release, gene therapy 1 Uvod Odkrivanje novih uœinkovitejĝih protitumornih uœinkovin postaja vodilna smer razvoja farmacevtske znanosti in je posledica naraĝœajoœega ĝtevila rakavih obolenj v svetovnem merilu. Obetavni citostatiœni uœin-ki ĝtevilnih novih molekul na celiœnih kulturah so le zaœetek zahtevnih raziskav, ki pa se velikokrat konœajo zaradi slabe terapevtske uœinkovitosti oziroma hudih toksiœnih uœinkov kot posledice neselek-tivnega delovanja na zdrava tkiva. Liposomi so danes predmet intenzivnega raziskovanja na podroœju razvoja novih farmacevtskih oblik za zdravljenje rakavih obolenj. Omogoœajo doseganje optimalnih terapevtskih uœinkov, ki so posledica podaljĝanega zadrĉevanja v centralnem krvnem obtoku, visoke stopnje kopiœenja v tumorskem tkivu ter nadzorovanega sproĝœanja uœinkovine s hitrim privzemom v rakave celice. 2 Znaœilnosti liposomov Liposomi so mikroskopski lipidni vezikli velikosti od 20 nm do 4 µm (slika 1). Sestavljeni so iz enega (enoslojni liposomi) ali veœ lipidnih dvoslojev, ki so urejeni koncentriœno in vsebujejo enako ĝtevilo prostorov z vodo (veœslojni liposomi). Manjĝi enoslojni liposomi dosegajo velikosti 20-100 nm, veœji enoslojni 100-800 nm, veœslojni pa 100-4000 nm. Debelina lipidnega dvosloja je 4 nm (1, 2). Glavne sestavine membrane liposoma so fosfolipidi (slika 2) in holesterol, ki zmanjĝa prepustnost za hidrofilne molekule ter poveœa stabilnost v prisotnosti bioloĝkih tekoœin, kot sta kri oziroma plazma (3). V liposome lahko vgrajujemo tako hidrofilne in amfifilne kot tudi lipofilne uœinkovine (nizkomolekularne uœinkovine, peptide, proteine, RNK, DNK). Hidrofilne se nahajajo v vodnem mediju v osrednjem delu liposoma in ob njegovi membrani. Amfifilne so razporejene ob membrani in se z lipofilnim delom vanjo delno vgradijo. Lipofilne uœinkovine pa so popolnoma vkljuœene v lipidni dvosloj (4). Liposomi prihajajo v stik s celicami na ĝtiri naœine: z adsorpcijo na celiœno membrano, zlitjem in izmenjavo lipidnih komponent z njo ter endocitozo kot najpomembnejĝo vrsto interakcij (slika 3) (2, 5). Slika 1: Shematska predstavitev enoslojnega liposoma Figure 1: Schematic representation of an unilamellar liposome Nina Koœevar, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana Prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana 202 farm vestn 2005; 56 Ciljana dostava uœinkovin v tumorske celice z liposomi MAŠCOBNI VERIGI GLICEROLNI DEL FOSFATNA SKUPINA Slika 2: Molekula fosfolipida – najpogosteje uporabljane maĝœobne kisline so lavrinska, miristinska, oleinska, palmitinska in stearinska, alkoholi (R) pa etanolamin, glicerol in holin. Figure 2: A phospholipid molecule – the most used fatty acids are lau-ryl, myristic, oleic, palmitic and stearic acid and alcohols (R) ethanolamine, glycerol and cholin. 3 Liposomi kot dostavni sistemi za protitumorske uœinkovine Osnovni pogoj za doseganje optimalnih terapevtskih uœinkov je izpolnitev treh pomembnih zahtev: podaljĝano zadrĉevanje liposomov v centralnem krvnem obtoku, visoka stopnja kopiœenja v tumorskem tkivu ter kontrolirano sproĝœanje uœinkovine s hitrim privzemom v rakave celice (6). Razvoj liposomskih sistemov se je zaœel s prvo generacijo, ki jo predstavljajo strukturno najenostavnejĝi liposomi (slika 4, preglednica 1). Zanje je znaœilno, da jih retikuloendotelijski sistem zelo hitro odstrani iz krvi (6). V drugo generacijo uvrĝœamo steriœno stabilizirane sisteme, ki imajo membrano prekrito z molekulami hidrofilnega polietilenglikola (PEG; slika 5). Pegilirani lipidi s stopnjo polimerizacije od 30 do 120 navadno predstavljajo 5 molskih odstotkov lipidnega dela. Povrĝina liposo-ma je zato moœno hidratirana in zaĝœitena pred adsorpcijo na plazemske proteine in opsonizacijo. Razpolovni œas v krvi s tem podaljĝamo tudi do 72 ur (6). Slika 3: Vrste in posledice interakcij med liposomi in celicami: speci-fiœna (a) in nespecifiœna (b) adsorpcija na povrĝino celice s poslediœno destabilizacijo membrane liposoma in mikropinocitozo sproĝœene uœinkovine (c); zlitje s celiœno membrano (d) in sprostitev uœinkovine direktno v citoplazmo; izmenjava lipidnih molekul s celiœno membrano (e); specifiœna ali nespecifiœna endocitoza (f) in nastanek endosoma s poslediœno zdruĉitvijo z lizosomom in razgradnjo vsebine (g) ali z razpadom membrane endosoma (h) in sprostitvijo uœinkovine v citoplazmo. Figure 3: Liposome-cell interactions and their effects: specific (a) and non-specific (b) adsorption onto the cell surface with subsequent destabilization of liposome membrane and micropinocytosis of the released drug (c); fusion with the cell membrane (d) and drug release directly into the cytoplasm; exchange of lipid molecules with the cell membrane (e); specific or non-specific endocytosis (f) and the formation of an endosome with subsequent fusion with the lysosome and drug degradation (g) or with subsequent endosome membrane degradation (h) and drug release into the cytoplasm. Preglednica 1: Razdelitev liposomov glede na zapletenost zgradbe lipidnega dvosloja, njihove funkcionalne in bioloĝke lastnosti ter stopnja razvoja (6) Table 1: Liposome classification according to their membrane complexity, functional and biological properties and stage of development (6) OPIS PREDNOST STOPNJA RAZVOJA PRVA GENERACIJA enostavni liposomi: naravni ali sintezni fosfolipidi Ĝ toksiœnost, ? uœinkovitost pasivno akumuliranje v tumorju odobrena pri FDA DRUGA GENERACIJA steriœno stabilizirani liposomi: pegilirani lipidi T t1/2, izboljĝano pasivno akumuliranje v tumorju odobrena pri FDA TRETJA GENERACIJA steriœno stabilizirani liposomi z ligandi za ciljano dostavo in kontrolirano sproĝœanje T terapevtski indeks ciljana dostava, sproĝœanje eksperimentalno farm vestn 2005; 56 203 Pregledni œlanki - Review Articles Slika 4: Shematska predstavitev enoslojnih liposomov z razliœno stopnjo kompleksnosti lipidnega dvosloja. A: Enostavni liposom z vgrajenima hidrofilno (a) in lipofilno uœinkovino (b). B: Steriœno stabilizirani liposom z molekulami PEG (c), ki ĝœitijo povrĝino liposoma pred opsonizirajoœimi proteini (d). C: Razliœno modificirani steriœno stabilizirani liposom tretje generacije – veriga PEG (e), veriga PEG z lig-andom za ciljano dostavo (f), kationski lipidi (g), ki omogoœajo vgrajevanje DNK (h), fuzogeni lipidi (i), lipidni konjugati, ki omogoœajo cil-jano sproĝœanje uœinkovine (j), fuzogeni virusni proteini (k). Figure 4: Schematic representation of unilamellar liposomes with different degrees of membrane complexity. A: Plain liposome with incorporated hydrophilic (a) and lipophilic drug (b). B: Sterically stabilized liposome with PEG molecules (c), which protect the liposome from opsonizing proteins (d). C: Different modifications of sterically stabilized third generation liposome: PEG chain (e), PEG chain with targeting ligand (f), cationic lipids (g) which enable the incorporation of DNA (h), fusogenic lipids (i), lipid conjugates, which enable site-specific drug release (j), fusogenic viral proteins (k). Predstavniki tretje generacije so prav tako steriœno stabilizirani pegilirani liposomi, ki pa na svoji povrĝini vsebujejo tudi informacijo za ciljano dostavo uœinkovine v tumorsko tkivo oziroma ciljano sproĝœanje uœinkovine. Prvi pristop temelji na pripenjanju ligandov, ki so sposobni prepoznati specifiœne tarœne molekule na tumorskih celicah, drugi pa na specifiœnih dejavnikih, ki sproĉijo sprostitev uœinkovine. Kombinacija obeh omenjenih pristopov – dostava uœinkovine na specifiœno mesto in sledeœe sproĝœanje – znaœilno poveœa koncentracijo uœinkovine v tumorju in s tem bioloĝko uporabnost (6, 7). Dokazano je, da se liposomi v veliki meri kopiœijo v tumorskem tkivu, kar je posledica dobro prepustnih ĉil in odsotnosti limfnega sistema (6). Velikost por ĉilnih sten v tumorskem tkivu se giblje v obmoœju 100-780 nm, medtem ko znaĝa v normalnem oĉilju manj kot 6 nm. 3.1 Ciljano dostavljanje Poveœano koliœino protitumorne uœinkovine v rakavem tkivu lahko doseĉemo s procesom ciljane dostave. Liposomi na svoji povrĝini nosijo ligande (protitelesa ali njihove fragmente, proteine, glikoproteine, ogljikove hidrate), ki prepoznajo tarœni antigen ali receptor na membrani tumorske oziroma endotelijske neovaskularne celice (7, 8, 9). 3.1.1 Ciljanje s protitelesi S protitelesi prekrite liposome imenujemo tudi imunoliposomi. Protitelesa lahko pripnemo direktno na polarni fosfolipidni del ali na 204 farm vestn 2005; 56 Slika 5: Molekula pegiliranega fosfolipida Figure 5: A pegylated phospholipid molecule konœni del verige polietilenglikola. Slednji pristop daje ugodnejĝe rezultate, saj protitelo laĉje doseĉe antigen. Ĝtevilo na liposom pripetih protiteles odloœa o stopnji vezave na tumorsko celico, poudariti pa je potrebno, da je hkrati sorazmerno z obsegom odstranjevanja veziklov z retikuloendotelijskim sistemom. Optimalno razmerje med dostavo uœinkovine do tumorskega tkiva in ĝe sprejemljivim poveœanjem privzema v monocite in makrofage doseĉemo z vezavo 10-30 molekul protiteles na liposom. Primeri laboratorijskih raziskav s to vrsto liposomov na ĉivalih dajejo dobre rezultate. Z imunoliposomi z monoklonskim protitelesom IgG 34A proti glikoproteinskemu receptorju gp112 na pulmonalnih endotelijskih celicah miĝi so tako ugotovili, da se ĉe po 30 minutah veœ kot 50 % odmerka nahaja v pljuœih (7). V drugi ĝtudji so uporabljali na pH obœutljive liposome (3.2.1) z dok-sorubicinom, prekrite s protitelesi proti receptorju CD19 na limfomskih celicah B. Miĝi, ki so prejemale doksorubicin, so dosegale v primerjavi s kontrolno skupino znaœilno viĝje stopnje preĉivetja (9). 3.1.2 Ciljanje na integrinski receptor Nekatere vrste integrinskih receptorjev (aub3 in a5b1) so prekomerno izraĉene na neovaskularnih celicah tumorjev, ki nastajajo v procesu tumorske angiogeneze (10). Za vezavo peptidnega liganda na te inte-grine je kljuœnega pomena njegovo aminokislinsko zaporedje Arg-Gly-Asp (sekvenca RGD). Z liposomi, ki imajo na terminalnem poli-etilenglikolnem delu vezano zaporedje RGD, doseĉemo znaœilno veœjo protitumorno aktivnost (7). 3.1.3 Ciljanje na folatni receptor Folna kislina je vitaminska substanca, ki jo celice transportirajo v svojo notranjost preko folatnega membranskega prenaĝalca ali folatnega receptorja; prvi se nahaja praktiœno v vseh normalnih celicah, drugi pa na endotelijskih celicah, aktiviranih makrofagih in rakavih celicah. Prekomerna ekspresija folatnega receptorja na hitro deleœih se tumorskih celicah predstavlja mehanizem, ki ga izkoriĝœamo za ciljano dostavo liposomov do tumorja – prekrijemo jih s folatnimi molekulami. V eksperimentih in vitro na celiœnih linijah HeLa in KB so uporabljali liposome z doksorubicinom, prekrite s folatom. Raziskovalci so dokazali znaœilno poveœan privzem uœinkovine, poleg tega pa so nakazali tudi moĉnost, da se s takĝnim naœinom dostave uœinkovine izognemo rezistenci (7). Ciljana dostava uœinkovin v tumorske celice z liposomi Omeniti moramo tudi naraĝœajoœe zanimanje za nove specifiœne pep-tidne ligande, pridobljene z metodami bakteriofagnega prikaza. Gre za posebne proteine, ki so sposobni penetrirati v tumorske celice in v pogojih in vivo ĉe dajejo zelo obetavne rezultate (11). 3.2 Ciljano sproĝœanje Z liposomi, pri katerih akumuliranje v tumorju doseĉemo le s ciljanim dostavljanjem, niso dosegli znaœilno boljĝe terapevtske uœinkovitosti v primerjavi z enostavnimi pegiliranimi liposomi. Razlog leĉi v lizosom-ski razgradnji, do katere pride po vstopu liposoma v rakavo celico. Da bi se liposom razgradnji izognil, bi moral iz endosoma takoj difundirati oziroma hitro sprostiti uœinkovino v citoplazmo. Raziskovalci so razvili kar nekaj pristopov za doseganje ciljanega sproĝœanja v tumorskih tkivih, ki so predstavljeni v nadaljevanju (7). 3.2.1 S spremembo pH-ja povzroœeno ciljano sproĝœanje Prvotna ideja o razpadu v krvnem obtoku sicer stabilnih liposomov in sprostitvi uœinkovine v metabolno aktivnem tumorskem tkivu (pH pribliĉno 6,5) ni dala ĉelenih rezultatov. Priprava liposomov, ki bi prepoznavali tako majhne razlike pH-ja, namreœ s tehnoloĝkega vidika ni izvedljiva. Raziskovalci so se zato osredotoœili na zelo kislo okolje v endosomih in lizosomih, kjer pH pade pod 5. Liposomi, ki omogoœajo tak pristop, imajo posebno sposobnost, da se ob spremembi pH-ja zlijejo z membrano endosoma ali lizosoma (fuzogeni liposomi) Uœinkovina se pri tem sprosti v celiœno citoplazmo. V raziskovalnih krogih ta pristop v kombinaciji s ciljano dostavo ĝtejejo za eno izmed najobetavnejĝih moĉnosti uœinkovite protitumorne terapije. 3.2.2 S svetlobo povzroœeno ciljano sproĝœanje Fotosenzitivnost liposomov doseĉemo z vgraditvijo fosfolipidnih molekul, ki po fotoekscitaciji z vidno ali UV-svetlobo izomerizirajo, razpadejo ali polimerizirajo. Ti procesi povzroœijo spremembe v strukturi ipidne membrane (izomerizacija cis-trans, hidroliza ali premreĉenje ipidov), ki postane prepustna zaradi nastalih defektov in sprosti uœinkovino. Te metode ĝe vedno razvijajo le na eksperimentalnem nivoju in njihova uœinkovitost in vivoni dokazana. Veliko pomanjkljivost predstavlja tudi dejstvo, da predpostavljajo lokalizacijo tumorja, kar je v realnosti le redko primer, saj veœina rakavih bolnikov umre zaradi metastazne razĝiritve bolezni 3.2.3 S toploto povzroœeno ciljano sproĝœanje Tudi ta naœin je omejen na lokalizirane tumorje, ki morajo biti viru toplote dobro dostopni. Zaenkrat ga uporabljamo le za zdravljenje povrĝinskih tumorjev, ki jih ne moremo odstraniti kirurĝko. Nasprotno pa ta naœin v primerjavi z drugimi naœini ciljanega sproĝœanja prinaĝa pomembne prednosti. Zaradi poviĝane temperature na mestu tumorja prihaja do kopiœenja liposomov v tkivu, ki je posledica poveœane prekrvavitve in poveœane ĉilne permeabilnosti Dokazano je celo, da je hipertermija ĉe sama po sebi citotoksiœna. Termosenzibilni liposomi morajo izkazovati dve pomembni lastnosti fazni prehod mora biti le rahlo viĝji od fizioloĝke telesne temperature, hkrati pa mora obsegati zelo ozko temperaturno obmoœje. Uœinkovini s tem omogoœimo, da se po spremembi integritete membrane ob temperaturi faznega prehoda hitro in popolnoma sprosti 3.2.4 Z encimi povzroœeno ciljano sproĝœanje V rakavih tkivih je zaradi poveœanega metabolizma veœje izraĉanje doloœenih vrst encimov. To lastnost izkoriĝœamo pri pripravi liposo-mov, sestavljenih iz lipidnih konjugatov, ki so obœutljivi na celiœne pro-teaze. Pod vplivom teh encimov pride do cepitve konjugatov, iz katerih nastanejo fuzogeni lipidi in povzroœijo zlitje liposoma z membrano endogenega vezikla. V literaturi najdemo ĝe ĝtevilne metode. Uporaba alkalne fosfataze temelji na vgraditvi fosfoholesterola v lipidni dvosloj, kar vodi do odcepitve fosfatne skupine iz holesterola in hitre destabilizacije lipo-soma. Fosfolipaza A2 cepi fosfolipidne molekule, zaradi œesar pride do razpada liposomov in sprostitve uœinkovine. Prouœujejo tudi primernost transglutaminaze, sfingomielinaze in fosfolipaze C. 4 Liposomi v genski terapiji rakavih obolenj Osnovni cilj genske terapije je uspeĝen vnos genskega materiala v tarœno tkivo. Genska terapija rakavih celic posega v procese ekspresije tumorskih supresorskih genov, ki inducirajo apoptozo, in onkogenov, ki sodelujejo pri proliferaciji. Z geni za citokine pa se vpleta tudi v procese imunskega sistema. Sistemi za dostavo DNK do celic so bioloĝki (virusni) in nebioloĝki (kationski polimeri, kationski peptidi in kationski lipidi). Liposomi iz kationskih lipidov z vgrajenim genetskim materialom se imenujejo tudi lipopleksi ali genosomi in so za razliko od klasiœnih liposomov, katerih membrana je nevtralna ali negativna, pozitivno nabiti (12). Tipiœen primer kationskega lipida, ki ga pogosto uporabljamo, je DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilaminopropan; slika 6). V vodnem okolju se negativno nabita DNK najprej razporedi tik ob zunanji, pozitivno nabiti povrĝini membrane liposoma. Zaradi elektrostatskih interakcij med molekulami DNK in lipidi zaœne nato prihajati do agregacije in zlivanja liposomov, pri œemer se DNK vgradi v njihovo notranjost. Liposomi, ki nastanejo, so veœslojne oblike (12, 13). Glavna omejitev uporabnosti liposomov iz kationskih lipidov je njihova toksiœnost. Kot pozitivno nabiti delci inducirajo agregacijo fizioloĝko prisotnih makromolekul in celic v krvi (agregacija trombocitov, plazemskih proteinov), kar lahko povzroœi hemolizo (2). Slika 6: Molekula kationskega lipida DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetil-aminopropan) Figure 6: The cationic lipid DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammoni-umpropane). farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles Ena od uspeĝnejĝih smeri razvoja liposomov na podroœju dostave genov so virosomi. Gre za kationske liposome, ki imajo v membrano vgrajene ali nanjo pripete fuzogene proteine virusne ovojnice (14). Po vezavi virosomov na celico pride do fuzije z membrano in direktne sprostitve DNK v citoplazmo, s œimer se izognemo razgradnji uœinkovine v endosomih in lizosomih. Zlitje z membrano se v primerjavi s klasiœnimi liposomi iz kationskih lipidov konœa veliko hitreje (15). 5 Sklep Liposomi so danes eni izmed najbolj prouœevanih dostavnih sistemov za zdravljenje rakavih obolenj. Na sploĝno niso toksiœni niti imunogeni in so kompatibilni s ĝtevilnimi citostatiki. Ker je uœinkovina ujeta v njihovi notranjosti, predstavljajo dobro zaĝœito pred kemijsko in metabol-no razgradnjo po injiciranju v krvni obtok. Toksiœnost je moœno zmanj-ĝana zaradi omejene porazdelitve citostatika v zdrava tkiva, uœinkovi-tost pa je veœja zaradi podaljĝanega zadrĉevanja v tumorjih. Te lastnosti so posledica njihove kompleksnosti – tako na nivoju zgradbe kot mehanizmov za ciljano dostavo in ciljano sproĝœanje – ki se nenazadnje kaĉe v tehnoloĝkih omejitvah. Te pa so eden od glavnih razlogov, da je danes za terapevtske namene registriranih le nekaj liposomskih pripravkov. Toda intenzivne raziskave so ĉe prinesle obetaven napredek, ki ga dokazuje mnoĉica predkliniœnih in kliniœnih raziskav. Ĉe v bliĉnji prihodnosti lahko zato na trĉiĝœu priœakujemo kar nekaj novih pripravkov iz liposomov. 6 Literatura 1. Bauer KH, Frömming KH, Führer C. Mikropathrtikeln, Nanopartikeln, Liposomen. In: Pharmazeutische Technologie, 5 ed. Stuttgart: Gustav Fischer Verlag, 1997: 354-360. 2. Lasic DD. Liposomes. In: Liposomes in Gene Delivery, Boca Raton: CRC Press LLC, 1997: 67-112. 3. Vemuri S, Rhodes CT. Preparation and characterization of liposomes as therapeutic delivery systems: a review. Pharm Acta Helv 1995; 70: 95-111. 4. El Maghraby GMM, Williams AC, Barry BW. Drug interaction and location in liposomes: correlation with polar surface areas. Int J Pharm 2005; 292: 179-185. 5. Torchillin VP. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nat Rev Drug Discov 2005; 4: 145-160. 6. Mayer LD. Future developments in the selectivity of anticancer agents: Drug delivery and molecular strategies. Cancer Metast Rev 1998; 17: 211-218. 7. Andresen TL, Jensen SS, Jĝrgensen K. Advanced strategies in liposomal cancer therapy: Problems and prospects of active and tumor specific drug release. Prog Lipid Res 2005; 44: 68-97. 8. Simġes S, Moreira JN, Fonseca C et al. On the formulation of pH-sensitive liposomes with long circulation times. Adv Drug Deliv Rev 2004; 56: 947-965. 9. Sapra P, Allen TM. Ligand-targeted liposomal anticancer drugs. Prog Lipid Res 2003; 42: 439-462. 10. Xiong XB, Huang Y, Lu WL et al. Enhanced intracellular delivery and improved antitumor efficacy of doxorubicin by sterically stabilized liposomes modified with a sinthetic RGD mimetic. J Control Release 2005 (v tisku). 11. Marcucci F, Lefoulon F. Active targeting with particulate drug carriers in tumor therapy: fundamentals and recent progress. Drug Disc Today 2004; 9 (5): 219-228. 12. El-Aneed A. An overview of current delivery systems in cancer gene therapy. J Control Release 2004; 94: 1-14. 13. Zhdanov RI, Podobed OV, Vlassov VV. Cationic lipid-DNA complexes – lipoplexes – for gene transfer and therapy. Bioelectrochemistry 2002; 58: 53-64. 14. Felnerova D, Viret JF, Glück R et al. Liposomes and virosomes as delivery systems for antigens, nucleic acids and drugs. Curr Opin Biotech 2004; 15: 518-529. 15. Kaneda Y. Virosomes: evolution of the liposome as a targeted drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev 2000; 43: 197-205. farm vestn 2005; 56 Zanimivosti iz stroke Novice iz sveta farmacije Urejajo: dr. Andrijana Tivadar, mag. farm.; Petra Slanc, mag. farm.; dr. Bojan Doljak, mag. farm.; prof. dr. Borut Ĝtrukelj, mag. farm. Bakterije, ki proizvajajo nove antibiotike Pripravila: Petra Slanc Odpornost bakterij na antibiotike predstavlja v zadnjih desetletjih vedno bolj pereœ problem. Odpornost se stopnjuje, kar ima za posledico, da so doloœeni sevi odporni do te mere, da so kljub zdravljenju lahko za œlove-ka tudi usodni. Vedno veœja je tudi pojavnost bolniĝniœnih sevov, za katere je na voljo vedno manj vrst antibiotikov, s katerimi je mogoœe infekcije takĝnega tipa uspeĝno zdraviti. Modelne molekule antibiotikov so navadno predstavljale spojine, ki so izvirale iz naravnega sveta gliv, pa tudi bakterij. Pri poskusih proizvodnje so raziskovalci poskuĝali bakterije, ki jih uporabljamo za proizvodnjo osnovnih skeletov molekul antibiotikov, genetsko spremeniti do te mere, da bi kemijsko polsintezo zamenjal proces izzvan v sami bakteriji in bi na ta naœin ciljno molekulo lahko pridobivali neposredno v fermentaci-jskem procesu. Kljub ĝtevilnim poskusom je bila na omenjeni naœin pridobljena le peĝœica potencialnih antibiotikov med katerimi najdemo tudi razred lantibiotikov. Lantibiotiki so bakteriocini, peptidi ali protei-ni, ki delujejo bakteriocidno na sorodne vrste bakterij. Bakteriocine delimo v tri razrede na podlagi njihove strukture. Prvi razred predstavljajo lantibiotiki, ki so po svoji strukturi toplotno odporni majhni peptidi, ki nastanejo s post-translacijsko modifikacijo le-teh, kar vodi v nastanek obroœnega sistema zaradi reakcije med dehidroserinom in treoninom z sulfahidrilnimi skupinami cistina. Za lantibi-otike je znaœilno, da v njihovi strukturi najdemo ĝtevilne nekonvencionalne aminokisline, ki nastanejo kot post-translacijske modifikaci- je stranskih verig prekurzorjev proteinov ob njihovi sintezi na ribosomih. Predstavnik tipa A lantibiotikov je nisin, ki ga proizvaja Lactococcus lactis subsp. lactis. Mehanizem antibiotiœnega delovanja nisina je tvorba por v membrani celice, kar ima za posledico poveœano prepustnost membrane ter kolaps vitalnega ionskega gradienta in s tem izœr-panja celice, kar vodi do njenega uniœenja. Poleg lantibiotikov je pred nedavnim raziskovalcem uspelo premostiti ovire proizvodnje poliketidnih antibiotikov med katere uvrĝœamo eritromicin. Znanstveniki so iz razliœnih vrst bakterij vzeli genetski zapis za proteine, ki so odgovorni za potek biosinteze poliketidov, vse zapise pa so uspeĝno zdruĉili in jih integrirali v bakteriji Escherichia coli. Integracija genskega zapisa je predstavljala laĉji del naloge, saj je omejujoœi korak uspeĝne sinteze funkcionalno zdruĉe-vanje posameznih poliketidov. Proteini, ki so odgovorni za sintezo poliketidov, so zelo veliki, kar predstavlja glavno oviro zdruĉevanja. Napredek pri zdruĉevanju predstavlja uvedba dodatnega genetskega zapisa, ki ima za posledico uvedbo dodatnega fragmenta na vsak protein, preko katerega se ti proteini lahko poveĉejo. Zaradi uvedbe teh fragmentov se posamezni proteini lahko med sabo poveĉejo kot lego kocke, pri tem pa nastanejo nove konformacijske oblike proteinov in novi poliketidi. Aktivnosti novih spojin ĝe niso preverjali, vendar pa skupina, ki je razvila to novo, naravno kombinatoriœno knjiĉnico poliketidov priœakuje, da bodo nekatere kombinacije uporabne kot modelne spojine ali pa same kot take. Poleg antibiotiœnega delovanja bo skupina preverila tudi njihovo protitu-morno delovanje, saj so znani primeri, ko imajo naravni poliketidi tudi to lastnost. Viri: Bauer R, Dicks LMT. (2005) Int J Food Microbiol 101: 201-216. Menzella HG et al.(2005) Nature Biotech 9: 1171-1176. Sherman HD. (2005) Nature Biotech 9: 1083-1084. Nova cepiva s hitrim odgovorom – ali DNA predstavlja novo reĝitev? Pripravila: Petra Slanc Vsako leto se populacije sveta sreœujemo z razliœnimi epidemijami gripe. Svetovna zdravstvena organizacija (SZO, angl. WHO) je sporoœila, da je ptiœja gripa potencialno ĝe bolj smrtonosna kot SARS (severe acute respiratory syndrome), za posledicami katerega je do danes umrlo 774 ljudi. SZO je tudi potrdila, da je do osemindvajsetega junija 2005 za posledicami ptiœje gripe umrlo ĉe 54 ljudi. Virus ptiœje gripe tipa A podtip H5N1 (hemaglutinin 5/neuraminidaza 1) je ĝe posebej problematiœen, saj je zanj znaœilno, da zelo hitro mutira in ima zmoĉnost uporabe genov virusov, ki okuĉujejo razliœne ĉivalske vrste. V veœini primerov je bilo dokazano, da je bila infekcija posledica prenosa virusa iz ĉivali na œloveka. Kot odgovor na sporoœilo SZO so Zdruĉene drĉave Amerike pridobile 4 milijone odmerkov cepiva, Italija in Francija priœakuje-ta 2 milijona, Velika Britanija (UK) pa je pred nedavnim naroœila 14 milijonov odmerkov protivirusnega cepiva. Glede na podatke SZO letna proizvodnja cepiv znaĝa 300 milijonov odmerkov. Razlog pomanjkanja proizvodnih kapacitet predstavlja dejstvo, da na svetu danes proizvaja cepiva le pet glavnih proizvajalcev (GlaxoSmithKline – London, Sanofi-Avensis/Pasteur – Paris, Merck – Rahway, New Jesery, Wyeth – Madison, New Jersey in Chiron – Emeryville). Vzrok so vse stroĉje zahteve za pridobitev dovoljenja za trĉenje, nizek zasluĉek glede na zasluĉek, pridobljen z zdravili z visokim doprinosom, kot so na primer antilipemiki, ter dejstvo, da je trg za cepiva ocenjen zgolj na 2 % celotnega farmacevtskega trga. Poleg trĉnih ğomejitevĞ k manjĝemu zanimanju proizvajalcev za cepiva prispeva tudi dejstvo, da je sama proizvodnja cepiv relativno dolgotrajna, zelo nezanesljiva, zahtevna in draga. farm vestn 2005; 56 207 Zanimivosti iz stroke Trenutno cepiva proti gripi proizvajajo z uporabo kemiœno deaktiviranih virusov epi-demiœnega seva in drugega seva gripe, za katerega je znaœilno, da dobro raste znotraj kurjega jajca. Po doloœenem œasu jajca pre-reĝetajo in izloœijo tista, v katerih je priĝlo do uspeĝne rekombinacije obeh virusov, se le-ti v jajcih uspeĝno mnoĉijo ter proizvajajo uspeĝno zaĝœito proti epidemioloĝkemu sevu. Zaradi tega je proizvodnja relativno dolga, saj lahko traja mesece, preden pride do izpolnitve vseh treh zgoraj omenjenih pogojev. V primeru epidemije z H5N1 je ocenjeno, da takĝna proizvodnja ne bi predstavljala uspeĝne zaĝœite, saj bi preteklo pre-veœ œasa in bi umrlo preveliko ĝtevilo ljudi, preden bi izdelali cepivo. V iskanju novih reĝitev za hitrejĝo proizvodnjo cepiv poskuĝajo raziskovalci razviti tudi cepiva osnovana na plazmidni DNA (izven kromosomska kroĉna DNA). Razvoj same tehnologije proizvodnje DNA-cepiv je ĉe na stopnji, ko potekajo kliniœne ĝtudije, zato predstavljajo cepiva na osnovi plazmidne DNA resen izbor. DNA-cepiva niso osnovana na vbrizganju antigenov (proteinov, ki izzovejo imunski odziv), ampak na dajanju genskega zapisa za njih. Genski zapis za antigene je integriran v plazmidno DNA, ki predstavlja vektor vnosa. DNA-cepiva nato vnesemo v organizem prav tako kot obiœajna cepiva. Po vbrizganju cepiva v celice, navadno koĉne ali miĝiœne dendritiœne celice, se plazmidna DNA v njih pomnoĉi neodvisno od kromosomske in uporabi celiœni aparat za proizvodnjo proteinov, ki so kodirani v njegovem zapisu. Fragmenti izraĉenega proteina se nato lahko veĉejo na oba histokompatibilna kompleksa razreda I ali II. Tako nastali hapten predstavi izbrani antigen, kar ima za posledico imunski odziv na osnovi protiteles, kot tudi celiœni imunski odziv. Prva uporaba plazmidnih DNA-cepiv izven poskusov v laboratorijih, je bilo cepljenje kalifornijskih kondorjev proti ğWest NileĞ virusu z genskima zapisoma za prM in prE proteine. Celotna proizvodnja cepiv je bila narejena v mesecu dni. Seveda pa je najbolj pomembno vpraĝanje, ali je cepivo delovalo? Glede na podatke ĉivalskega vrta v Los Angelesu niti eden od kondorjev ni imel neĉelenih uœinkov, njihova krvna slika pa je pokazala zelo dober imunski odziv. Zelo spodbudno. Kljub ĝtevil-nim prednostim plazmidnih DNA-cepiv, pa so ĝe vedno odprta doloœena vpraĝanja. Ta vkljuœujejo slabe rezultate testiranj na miĝjih modelih, kjer so ta cepiva v doloœenih primerih izzvala zelo visoko stopnjo imunskega odziva. Dodatni pomisleki uporabe cepiv s plazmidi predstavlja tudi moĉnost tvorbe protiteles proti sami dvojni vijaœnici, saj je znano, da lahko doloœeni motivi dvojne vijaœnice izzovejo imunski odziv z aktivacijo celic T pomagalk. Ta vidik bo mogoœe v prihodnje, ko bodo natanœni mehanizmi tega delovanja bolje poznani, moĉno tudi uporabiti kot adju-vantno aktivacijo doloœenega tipa celic ali za spodbujanje doloœenega tipa imunske zaĝœite. Œeprav je glede cepiv s plazmidnimi DNA ĝe veliko stvari nedoreœenih, pa predstavljajo le-ta potencialno novo pot za ğhitre-jĝaĞ in prav tako uœinkovita cepiva, ki bi v primeru velikih epidemij vsekakor lahko reĝe-vala ĉivljenja. Postaja namreœ jasno, da je mogoœe imunski odziv s plazmidi izboljĝati z vkljuœitvijo genskega zapisa za razliœne imunostimulativne molekule. Vir: Forde GM. (2005) Nature Biotech 9: 1059-1062. Ugodno delovanje morfina na potek Alzheimerjeve bolezni Mehanizem bolezni ĝe ni pojasnjen, znani pa so ĉe nekateri dejavniki, ki so vpleteni v patologijo bolezni in katerih posledica naj bi bila degeneracija nevronov in odpoved nevroloĝkih funkcij. Znano je, da se na ĉivœnih vlaknih pojavijo lehe, ki vsebujejo Pripravil: Bojan Doljak Alzheimerjeva bolezen je najbolj pogosta oblika demence pri starostnikih. Vzroki za bolezen, ki ima vedno moœnejĝi vpliv na œlovekovo psiho, so ĝe vedno neznani. Bolezen je dobila ime po nemĝkem zdravniku Aloisu Alzheimerju, ki je leta 1906 opisal spremembe moĉganskega tkiva pri duĝevni bolnici v obliki nenavadnih kepic ter zamotanih vlaken, danes znanih kot amiloidne lehe oziroma nevrofibrilarni vozli. Bolezen je neozdravljiva, kljub ĝtevilnim poskusom zdravljenja do danes ĝe ni na voljo nobene uœinkovite terapije. Prva stopnja bolezni je vezana na poĝkodbe tistih delov moĉganov, ki so povezani s spoznavnimi funkcijami, predvsem so prizadete sposobnosti pomnjenja, uœenja in razmiĝljanja. V Zdruĉenih drĉavah Amerike je vsako leto prizadetih vsaj 4,5 milijonov prebivalcev, glede na napovedi, pa naj bi se do leta 2050 ĝtevilo bolnikov povzpelo kar na 11,3 do 60 milijonov. veœje koliœine proteina, imenovanega b-amiloid. Ta protein se lahko kopiœi v lehah veœ let preden se pojavijo prvi znaki bolezni. Potrjeno pa je bilo tudi, da je za njegovo kopiœenje potrebna doloœena stopnja genetske predispozicije. Do nedavnega je bila v ospredju predvsem nevrotoksiœna oz. amiloidna hipoteza, po kateri naj bi bili vzrok razvoja bolezni nevrotoksiœni uœinki b-amiloida na celice na nivoju celiœnih membran. Danes pa vse bolj velja, da poĝkodbe ĉivœevja ne morejo biti edini vzrok bolezni. Epidemioloĝke ĝtudije so namreœ ĉe pred leti potrdile, da igra pomembno vlogo tudi mikro-prekrvavitev v moĉganih. Znano je, da med dejavnike tveganja za Alzheimerjevo bolezen spadajo tista stanja, ki slabĝajo stanje oĉilja (npr. kajenje, sladkorna bolezen, ateroskleroza, atrialna fibrilacija srca in druge). Na podlagi teh raziskav je bila razvita alternativna vaskularna hipoteza, po kateri naj bi eden izmed glavnih posrednikov pri sproĝœanju gladkih miĝic ĉilja, duĝikov oksid (NO), vplival na krvni tlak in pretok krvi tudi v moĉganih. NO je med drugim pomemben tudi kot posrednik signala v ĉivœnih konœiœih in ĉivœnih stikih. Nastajanje NO iz naravnega prekurzorja, aminokisline L-arginina, regulira encim NO-sintaza. Mnoĉina sproĝœenega NO pa je odvisna od mnoĉine encima. Vœasih se mnoĉina encima dodatno poveœa in dodatno nastali NO zaœne delovati nevro-toksiœno. Drugaœe je, kadar je mnoĉina in aktivnost NO-sintaze normalna. V takĝnih primerih nastali konstitutivni NO regulira nevroloĝke in endotelijske funkcije, sproĝœa steno ĉilja ter deluje zaĝœitno na nevrone. 208 farm vestn 2005; 56 Zanimivosti iz stroke Osebne vesti V najnovejĝi ĝtudiji, ki so jo objavili oktobra letos, so na nevroblastomskih celicah (tumorskih celicah, odvzetih otrokom, ki so zboleli za nevroblastomom) ugotovili, da deluje morfin nevroprotektivno. Ĉe nekaj let je sicer znano, da morfin deluje kot signalna molekula, saj po vezavi na doloœene opiatne receptorje µ3 sprosti NO, ki nadalje prenese signal v endotelijskih celicah, granulocitih in monocitih. Ni bilo pa znano, da NO zavira nastajanje b-amiloida. Po drugi strani tudi b-amiloid zavira nastajanje konstitutivnega NO, kar vodi do izgube nevrotransmiterske sposobnosti, zmanjĝane prekrvavitve moĉganov in zmanjĝanega zaĝœitnega delovanja NO na ĉivœevje. Morfin poveœa mnoĉi-no NO in s tem potencira njegov uœinek ter posredno zmanjĝuje nastajanje b-amiloida. Znanstveniki predvidevajo, da predstavlja prav morfin manjkajoœi vezni œlen, ki preko vpliva na metabolizem b-amiloida na molekulskem nivoju, smiselno povezuje do sedaj znano amiloidno in vaskularno hipotezo nastanka Alzheimerjeve bolezni. Ĝtudija je prav tako dokazala, da morfin preko regulacije izraĉanja dveh encimov (BACE-1 in BACE-2) deluje nevroprotektivno ex vivo. Naslednje ĝtudije znanstvenikov bodo usmerjene na dokazovanje njegove terapevtske uporabnosti za zdravljenje oziroma prepreœe-vanje Alzheimerjeve bolezni in vivo. Pri tem pa bodo najbrĉ poskuĝali potencirati oziroma regulirati delovanje zlasti endogenega morfi-na, ki nastaja v centralnem ĉivœnem sistemu. Vir: Pak T, Cadet P, Mantione KJ, Stefano GB. Med Sci Monit 11: 357-366. V prejĝnji ĝtevilki smo v rubriki Novice iz sveta farmacije naknadno opazili nekaj veœjih napak, ki jih tokrat popravljamo: Najbolj prodajana humana zdravila v letih 2002-2004 Preglednica 2. Lista najbolj prodajanih pripravkov z rekombinantnimi uœinkovinami: • namesto Araneps – Aranesp • namesto a in a eritropoetin - a in b eritropoetin • namesto a in a interferon - a in b interferon Rastni hormon proizvajata tudi Roche in Serono (v preglednici je ena œrta odveœ). Lilijani Cilenĝek, mag. farm. v slovo 23. marca 2005 smo se na izolskem pokopaliĝœu poslovili od dolgoletne sodelavke in kolegice Lilijane Cilenĝek, roj. Staniœ. V spominu nam bo ostala kot marljiva in skromna kolegica. Stroka Ti je pomenila ĉivljenje in veselila si se vsakega napredka v farmaciji, a Tebi na ĉalost tudi stroka ni mogla veœ pomagati. S trdoĉivo naravo in voljo si se dolgo upirala bolezni, a priĝel je trenutek, ko ĝe tako pogumna nisi zmogla veœ. Lilijana - Lili Cilenĝek je bila rojena 7. maja 1937 v Kanalu ob Soœi, kjer je ĉivela do leta 1954, ko se je njena druĉina preselila v Izolo. V Kanalu ob Soœi se je spominjajo kot izredno ĉivahnega, marljivega in druĉabnega dekleta. Sodelovala je pri telovadnem druĝtvu Partizan in se udeleĉevala atletskih tekmovanj, niœ manj aktivna ni bila kot tabornica v taborniĝki organizaciji “Rod bistre Soœe”. V Kanalu je bilo ustanovljeno prvo ĉensko gasilsko druĝtvo na Primorskem in kolegica Lili je vodila mladinsko desetino. Ĉe kot otrok se je vkljuœila v dramski kroĉek, kasneje pa je sodelovala pri Prosvetnem druĝtvu Kanal. Osnovno ĝolo in niĉjo gimnazijo je obiskovala v Kanalu, viĝjo gimnazijo v Novi Gorici in Kopru, kjer je maturirala leta 1956. Ĝtudij farmacije je zaœela v Ljubljani in nadaljevala v Zagrebu, kjer je leta 1963 diplomirala. Poroœila se je ĝe v ĝtudentskih letih 1961. Imela je dve hœerki; obe sta se zapisali glasbi. Po konœanem ĝtudiju se je zaposlila v bolniĝniœni lekarni v Kopru, ki je delovala v zelo slabih pogojih. Kasneje se je bolniĝniœna lekarna preselila v Izolo in kolegica Lili si je prizadevala, da je lekarna dobila oddelek za izdelavo sterilnih pripravkov. Leta 1971 je zapustila bolniĝniœno lekarno in se zaposlila v Obalnih lekarnah Koper v enoti Izola. Kasneje je prevzela vodenje te lekarne in na tem mestu ostala do konca leta 1999, ko se je upokojila. Ob grobu se je od nje poslovila njena dolgoletna sodelavka in prijateljica Marta Ambroĉiœ z naslednjimi besedami: ğBila si nam sodelavka in svetovalka hkrati, vedno pripravljena pomagati z nasveti ali z delom. In, kot da nisi dovolj posluĝala teĉav drugih ljudi, smo ti ĝe mi, tvoji sodelavci radi potoĉili o lastnih problemih. S svojim optimizmom si znala pripeljati probleme do uspeĝne reĝitve. Z vsem srcem si bila predana stroki in delu. Spoĝtovala si starejĝe kolege, razveselila pa si se tudi vsakega mladega farmacevta. S svojim delom si jim bila za zgled. Velikokrat si ostala v lekarni in delala, druge pa si poslala na strokovna sreœanja. Draga Lili, ĉivljenje se izteœe kot reka in reka tvojega ĉivljenja se je iztekla na tako ĉalostno lep, z mandljevim cvetjem okraĝen spomladanski dan.Ğ Marija Brenœiœ farm vestn 2005; 56 209 Navodila avtorjem Prispevke, ki so namenjeni objavi v Farmacevtskem vestniku, avtorji poĝljejo na naslov glavne urednice Farmacevtskega vestnika: dr. Andrijana Tivadar, mag. farm. Fakulteta za farmacijo Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana tel: 00 386 1 476 95 00 e-naslov: andrijana.tivadar@ffa.uni-lj.si Strokovne œlanke in druge prispevke objavljamo v slovenskem jeziku, po dogovoru z uredniĝtvom tudi v angleĝkem. Vsi poslani rokopisi morajo biti jezikovno in slogovno neoporeœni. Uporabljena terminologija mora biti ustrezna, s posluhom za uveljavljanje ustreznih strokovnih izrazov v slovenskem jeziku. Navajanje zaĝœitenih imen zdravil in drugih izdelkov ali imen proizvajalcev je nedopustno. Dovoljeno je le v poglavju Materiali in metode, izjemoma pa ĝe v primeru, œe se objavi popoln seznam vseh na trĉiĝœu dostopnih izdelkov. Strokovni œlanki so recenzirani, kar pomeni, da bodo avtorji oddali najmanj dve verziji besedila: t. i. prvo verzijo, ki jo uredniĝtvo poĝlje najmanj dvema recenzentoma v strokovno oceno, in t. i. konœno verzijo. Med postopkom ugotavljanja primernosti prispevka za objavo v Farmacevtskem vestniku je zagotovljena tajnost. Prvo verzijo predstavljajo trije na papir natisnjeni izvodi prispevka, na katerih avtorji niso imenovani, slike in preglednice pa so vkljuœene v besedilo, ter prispevek v elektronski obliki. Avtorji strokovnih œlankov priloĉijo lastnoroœno podpisan spremni dopis z naslednjimi podatki: naslov prispevka, imena in priimki avtorjev z vsemi nazivi, imena in naslovi inĝtitucij, v katerih so zaposleni, telefonska ĝtevila in elektronski naslov kontaktne osebe, in izjavo, da prispevek ĝe ni bil objavljen ali poslan v objavo v drugo revijo, ter da se z vsebino strinjajo vsi soavtorji. V primeru ponatisa slik ali drugih elementov v prispevku mora avtor priloĉiti dovoljenje zaloĉbe, ki ima avtorske pravice. Rokopisi strokovnih œlankov praviloma obsegajo najveœ 20.000 znakov, vkljuœno s presledki, obseg prispevkov za rubriki zanimivosti iz stroke in iz druĝtvenega ĉivljenja je lahko najveœ 6.000 znakov vkljuœno s presledki. Prispevki za rubriko osebne vesti ne smejo presegati 3.000 znakov vkljuœno s presledki. Prispevke o osebnih vesteh objavlja uredniĝtvo ob jubilejih, smrti ali za posebne doseĉke v aktualnem obdobju. Uredniĝtvo si pridrĉuje pravico, da po strokovni presoji prispevke skrajĝa ali objavi daljĝe prispevke. Vsebina naj bo sistematiœno strukturno urejena in razdeljena na poglavja (izvirni raziskovalni œlanki naj imajo najmanj naslednja poglavja: Uvod, Materiali in metode, Rezultati in razprava), vsak prispevek pa mora imeti ĝe Povzetek v slovenskem in angleĝkem jeziku (vsak po najveœ 150 besed) in najveœ 5 kljuœnih besed v slovenskem in angleĝkem jeziku. Obvezni poglavji sta ĝe Sklep in Literatura, takoj za povzetkom in kljuœ-nimi besedami pa naj bo ĝe Kazalo vsebine. Besedilo (Times New Roman 12, razmik vrstice 1,5) naj bo obojestransko poravnano. Slike in preglednice morajo biti opremljene s pripadajoœim besedilom v slovenskem in angleĝkem jeziku. Vsako trditev je potrebno potrditi z literaturnim virom, zaporedno ĝtevilko literaturnega vira pa navesti na koncu trditve, v oklepaju pred piko. Œe je referenc veœ, so ĝtevilke loœene z vejicami in presledki, npr. (1, 3, 8). Na koncu prispevka naj bo navedenih najveœ 30 literaturnih virov, po vrstnem redu, kot se pojavljajo v besedilu: 1. Obreza A. Vanadij v ĉivem organizmu in farmaciji. Farm Vestn 2003; 54: 713–718. 2. Danesh A, Chen X, Davies MC et al. The discrimination of drug polymorphic forms from single crystals using atomic force microscopy. Pharm Res 2000; 17 (7): 887–890. 3. Doekler E. Cellulose derivatives. In: Peppas NA, Langer RS. Advances in polymer science 107; Biopolymers I. Springer-Verlag, 1993: 200–262. Konœna verzija: Avtor stokovnega œlanka prejme po opravljenem recenzijskem postopku najmanj dve strokovni oceni in navodila glede sprejetja v objavo in potrebnih popravkov. Uredniĝtvo priœakuje, da bo avtor pripombe recenzentov in uredniĝtva upoĝteval in najkasneje dva tedna po prejetju recenzij poslal popravljen prispevek v elektronski obliki na e-naslov: , ter eno natisnjeno verzijo besedila na zgornji naslov. Vse slike morajo biti shranjene v ustreznem slikovnem formatu (zaĉeleno v jpg, bmp), tudi v natisnjeni verziji je potrebno slikovni material priloĉi-ti loœeno od besedila, oĝtevilœeno in oznaœeno s pripadajoœimi podnapisi. Fotografije morajo biti posnete z visoko loœljivostjo, najmanj 250 do 300 dpi, v enakih velikostih, kot jih avtor ĉeli objaviti oz. prilagojene obliki revije. Naslov prispevka (v slovenskem in angleĝkem jeziku), naslovi poglavij in podpoglavij naj bodo napisani krepko, vendar z malimi œrkami (kakor v stavku). V konœni verziji morajo biti pod naslovom prispevka v slovenskem in angleĝkem jeziku napisana polna imena vseh avtorjev brez nazivov. Imena in priimke vseh avtorjev z nazivi, skupaj z imeni in naslovi ustanov, v katerih so zaposleni, je potrebno navesti loœeno na prvi strani. Elektronska in natisnjena verzija morata biti identiœni. Korekture: Krtaœne odtise prispevka je avtor dolĉan natanœno pregledati in oznaœiti nujne popravke (tiskarske ĝkrate), s katerimi ne sme posegati v vsebino prispevka. Korekture poĝlje avtor v treh delovnih dneh na zgornji naslov. Prvi avtor prejme 10 separatnih kopij œlanka in en izvod Farmacevtskega vestnika brezplaœno. farm vestn 2005; 56