166 Nobelove nagrade za leto 2013 • Nobelova nagrada za fiziologijo ali medicino za leto 2013
Proteus 76/4 • December 2013
Celični promet mešičkov
Nobelova nagrada za fiziologijo ali medicino za leto 2013
Nina Vardjan in Robert Zorec
Prvi ponedeljek v mesecu oktobru podeli Nobelova skupščina na ustanovi Karolinška na Švedskem Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino. V letu 2013 so bili prejemniki nagrade Randy W. Schekman, James E. Rothman in Thomas C. Südhof, in sicer za »svoja odkritja mehanizma uravnavanja prometa mešičkov, glavnega transportnega sistema v naših celicah« (www.nobelprize. org/nobel_prizes/medicine/laureates/2013/). Ti trije raziskovalci so odkrili molekulska načela, kako se mešički z določeno vsebino v pravem času dostavijo na pravo mesto v celici. V tem prispevku je cilj osvetliti mejnike dosežkov letošnjih Nobelovih nagrajencev za fiziologijo v okviru nastanka ev-kariontskih celic kakor tudi v luči raziskav nacionalnega programa Celična fiziologija.
Evkariontske celice, ki sestavljajo naše telo, so drugačne od bakterij. Poleg tega, da so veliko večje od bakterij, vsebujejo pod plaz-malemo, membrano, ki jih obdaja, tudi celične organele, obdane z membrano, na primer mitohondrije, endoplazemski retikulum in mešičke. Zakaj so nastali ti evkarionti, ki poleg drugih celičnih organelov vsebujejo
Slika 1: Nobelovi nagrajenci za fiziologijo ali medicino za leto 2013. Od leve proti desni: Randy W. Schekman, James E. Rothman in Thomas C. Südhof.
http://www.nobelprize. org/nobel_prtzes/medt-cme/laureates/2013/.
tudi pravo jedro, je še zmeraj uganka. Ker je velikost celic evkariontov za tri do štiri velikostne razrede večja od tiste pri proka-riontih, so nekateri mnenja, da so celični organeli nastali kot endosimbionti. Bakteriji podobna oblika živega bitja je prešla v notranjost predhodnice naših celic in tam prevzela neko novo vlogo, takšno, kot jo ima današnji mitohondrij ali pa pri rastlinah kloroplast. Do tega je verjetno prišlo, ker se je z velikostjo celic povečala razdalja za sporazumevanje (komunikacijo) med posameznimi deli celice, ki je temelj usklajenega delovanja celičnih procesov. Sporazumevanje v notranjosti celice - v ci-toplazmi - je določeno z več mehanizmi. Na razmeroma kratkih razdaljah je najbolj učinkovita difuzija. To je proces, kjer se snovi prenesejo z mesta višje na mesto nižje koncentracije, pri tem pa se znižuje vrednost koncentracije snovi, ki se prenaša. Gibalna sila pri tem ni nekaj usmerjenega, pač pa naključni trki med molekulami, kakor je naravo difuzije pojasnil Albert Einstein leta 1905. Ta mehanizem je učinkovit v razmeroma majhnih prostorninah, ko pa je prišlo do povečanja evkariontske celice, se
Nobelova nagrada za fiziologijo ali medicino za leto 2013 • Nobelove nagrade za leto 2013 167
Slika 2: Levo normalna kvasovka, desno mutirana kvasovka, v kateri je moten celični transport mešičkov (prirejeno po: Zierath, J. R, in Lendahl, U, 2013: Machinery Regulating Vesicle Traffic, A Major Transport System in our Cells. Karolinska Institutet, Nobel Assembly »The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2013«.
http://www.nobeiprtze.org/nobei_prtzes/medtctne/iaure-ates/2013/).
je morala privzeti nova rešitev. Ta pa temelji na mehanizmu konvekcije, kjer se snovi prenesejo med deli celice zaradi gibanja mase neke snovi. Primer takega načina sporazumevanja je pretakanje krvi, v kateri so krvne celice, te pa vsebujejo hemoglobin, ki prenaša kisik od pljuč do drugih delov telesa tako, da se krvne celice pretakajo s krvjo. V sami celici pa tak transport predstavlja premikanje oziroma promet celičnih organelov.
Presevanje mutiranih kvasovk je razkrilo motnje v celičnem prometu organelov
Prav promet celičnih organelov je pritegnil pozornost znanstvenikov. Da bi spoznal genetsko podlago celičnega transportnega sistema, je Randy Schekman v sedemdesetih letih začel poskuse na celicah kvasa (Saccha-romyces cerevisiae), ki so model evkariontske celice. Pri genetskem presejevanju je njegov laboratorij opisal kvasovke z genetskimi okvarami v celičnem transportu. Mešički so se namreč v genetsko mutiranih kvasovkah kopičili v nekaterih delih celice (slika 2). Opisal je 23 genov in jih razvrstil v tri skupine genov, ki imajo zapise za proteine, ki nadzorujejo različne vidike prometa celičnih organelov. S tem je omogočil nov vpogled v mehanizme uravnavanja transporta organe-lov v celici.
Odkritje proteinskih kompleksov za sidranje membrane mešička na plazmalemo
Tudi James Rothman se je pred tremi desetletji navdušil nad raziskavami celičnega transportnega sistema. V osemdesetih in devetdesetih letih je z biokemijskimi po-
skusi in vitro na sesalskih celicah raziskoval mehanizme brstenja, transporta in zlivanja mešičkov s tarčno membrano. Njegov laboratorij je odkril proteinski kompleks, ki omogoča mešičkom, da se sidrajo na določeno mesto plazmaleme, kjer lahko pride do zlitja membrane mešička s plazmalemo. Pokazalo se je, da geni, ki jih je odkril že Randy Schekman, kodirajo prav te proteine. Ti proteini lahko pospešijo proces zlitja membran. So namreč na membrani mešička kot tudi na plazmalemi. Prek posebnih domen se lahko med seboj tesno povežejo, kakor da so deli zadrge, in s tem približajo dve membrani, kar vpliva na zlitje membran. Ta kompleks je danes znan pod imenom SNARE (angleško Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptor). Rothmanov laboratorij je tudi ugotovil, da v celici obstaja več tipov sorodnih proteinov SNARE, ki se med seboj povezujejo na zelo specifične načine, kar določa, da se mešički, ki tovorijo določeno vsebino, prenesejo na točno določeno mesto znotraj celice. Mešički in druge znotrajce-lične membranske strukture se lahko zlivajo tudi med seboj znotraj celice. Na kompleks proteinov SNARE delujejo botulinusni in tetanusni nevrotoksini, o katerih je v Pro-teusu pisal Marko Kreft leta 2002 (Kreft, 2002). Slika 3 prikazuje prostorsko umestitev proteinov kompleksa SNARE (sinapto-brevin, SNAP25 in sintaksin) med membrano mešička in notranjim licem plazmaleme. Pokončni diski kažejo mesta, kjer delujejo različni nevrotoksini. K razumevanju mehanizma delovanja teh toksinov je zaslužen tu-
168 Nobelove nagrade za leto 2013 • Nobelova nagrada za fiziologijo ali medicino za leto 2013
Proteus 76/4 • December 2013
Slika 3: Proteini kompleksa SNARE In mesta delovanja botulinusnih nevrotoksinov A, B, D, F, G, In tetanospazmina.
Povzeto po: Kreft, M., 2002: Proteus.
di laboratorij profesorja Cesarja Montecucca iz Padove (Schiavo in sod., 1992). Njegovo odkritje je pospešilo raziskave prometa mešičkov v nevronih in nenavadno je, da ga je Nobelova komisija spregledala, še posebej, ker ti toksini delujejo predvsem na nevrone.
V nevronih je mehanizem za hitro odzivanje mešičkov, ki skladiščijo živčne prenašalce, na porast Ca2+ v citoplazmi
Promet mešičkov v nevronu je pritegnil zanimanje Thomasa Südhofa. Predvsem zato, ker se v živčevju prek kemične sinapse (stik med dvema nevronoma) prenaša informacija z minimalno zakasnitvijo. V tem procesu se iz presinaptičnega končiča izločijo živčni prenašalci (nevrotransmiterji), ki so skladiščeni v mešičkih in z difuzijo preidejo do postsinaptične celice, kjer se vzdraženje nadaljuje po sosednjem nevronu. Pri izločanju živčnih prenašalcev sodelujejo molekule, ki so jih odkrili v laboratorijih R. Schekma-na in J. Rothmana. Ni pa bilo znano, katere molekule v presinaptičnem končiču zaznajo zvišanje citosolne aktivnosti ionov Ca2+, dražljaja, ki sproži komunikacijo med dvema živčnima celicama prek kemične sinapse. Thomas Südhof je torej iskal proteine, ki v odvisnosti od Ca2+ uravnavajo izločanje
živčnih prenašalcev iz mešičkov. Poleg kom-pleksina je odkril protein sinaptotagmin,
ki je na mešičkih in veže	vezavi
2 +
Ca + na sinaptotagmin se verjetno spremeni konformacija proteinov SNARE v zadrgi in kompleksin se sprosti iz kompleksa SNARE. To pa naj bi omogočilo (neposrednega dokaza še nimamo), da se membrana mešičkov, ki so prek kompleksa SNARE sidrani na plazmalemi, zlije s plazmalemo. Nastane fuzijska pora, ozek kanal, skozi katerega se izločijo molekule živčnih prenašalcev v zu-najcelični prostor. Te raziskave so pokazale sklopljenost procesov uravnavane eksocitoze v času in prostoru in kako se vsebina mešičkov sprosti na dražljaj.
V primerjavi z nevroni je uravnavana eksocitoza v astrocitih zelo počasen proces
Kako je delo v naših laboratorjih povezano z razumevanjem celičnega prometa mešičkov? Poleg nevronov imamo v možganih še kar nekaj drugih celičnih tipov. Mednje sodijo astrociti, najštevilčnejše celice nevrogli-je. V nekaterih predelih možganov je astro-citov celo več kot nevronov. A več kot sto let je veljalo, da so te celice glije le pasivna podpora nevronom. V zadnjih dveh desetle-
Nobelova nagrada za fiziologijo ali medicino za leto 2013 • Nobelove nagrade za leto 2013 169
Slika 4: Tripartitna sinapsa. Povzeto iz: Allen, N. J,, in Barres, B. A,., 2009: Neuroscience: Glia — more than just brain glue. Nature, 457: 675-677. Astrocyte process - odstavek astrocita; Neuron - nevron; Substance release - izločanje substanc; Calcium rise - porast aktivnosti Ca2 v citoplazmi; Presynaptic terminal - presinaptični končič; Postsynaptic terminal -postsinaptični končič.
tjih se je ta tako imenovani nevrocentrični pogled na delovanje možganov nekoliko spremenil. Rezultati poskusov so pokazali, da astrociti dejavno sodelujejo pri prenašanju signalov v možganih. Pri tem tako kot nevroni uporabljajo mešičke za sporazumevanje med celicami. Ti mešički vsebujejo kemične prenašalce - glijotransmiterje. Na dražljaj, povečano citosolno aktivnost Ca2+, se astrociti odzovejo tudi tako, da vsebina mešičkov izstopi v zunajcelični prostor v bližino kemične sinapse. S tem astrocit vpliva na prenos informacije prek sinapse nevronov. Astrociti predstavljajo tretjo enoto sinapse, ki ji pravimo tripartitna sinapsa (slika 4). V našem laboratoriju smo primerjali odzivnost procesa uravnavane eksocitoze v nevronih in v astrocitih. V uravnavani eksocitozi pride do zlitja membrane mešička s plazmalemo, zato se površina plazmaleme poveča. Slika
5 prikazuje dinamiko povečanja membranske kapacitete - parametra, ki je sorazmeren površini plazmaleme - v nevronu in v astro-citu. Poskusi kažejo, da je v nevronu povečanje površine plazmaleme, ki jo sprožimo s fotolitičnim razpadom molekul, ki imajo vklenjen	več kot velikostni razred hi-
trejše kot v astrocitih (Kreft in sod., 2004). Elektrofiziološko metodo za te meritve (Ri-tuper in sod., 2013) smo razvili v Sloveniji neodvisno od drugih laboratorijev po svetu. Počasnost uravnavane eksocitoze v astrocitih kaže, da te celice sodelujejo pri počasnem signaliziranju v možganih. Zakaj pa je urav-navana eksocitoza v astrocitih tako zelo počasna, še ni znano. Eden od procesov, ki k temu prispeva, je promet mešičkov v astro-citih do mesta zlitja s tarčno membrano.
170 Nobelove nagrade za leto 2013 • Nobelova nagrada za fiziologijo ali medicino za leto 2013
Proteus 76/4 • December 2013
Slika 5: Dinamika porasta membranske kapacitete v nevronu in v astrocitu. Porast površine plazmaleme (membranske kapacitete) v nevronu (a), ki jo sprožimo s fotolitičnim razpadom molekul, ki imajo vklenjen Ca2+, je več kot velikostni razred hitrejša kot v astrocitih (b).
Prirejeno po: Kreft in sod., 2003, J. Neurophysiol., Kreft in sod., 2004, Glia.
J

Slika 6: Trajektorije poti, ki so jih opravili posamezni mešički v 30 sekundah. S številkama 2 in 3 sta označena mešička, ki imata usmerjeno mobilnost. Mešička z oznakama 1 in 4 pa sta primera neusmerjene mobilnosti.
Prirejeno po: Potokar in sod., 2005, BBRC.

Uravnavanje mobilnosti mešičkov v astrocitih v normalnih in bolezenskih stanjih
Prva opazovanja fluorescenčno označenih mešičkov pod mikroskopom so razkrila, da so ti zelo mobilni (Stenovec in sod., 2007, Potokar in sod., 2007). Da bi opredelili lastnosti njihovega transporta, je bilo treba najprej razviti metodologijo za spremljanje premikajočih se delov mikroskopske slike. Slika 6 kaže točkasto fluorescenco, ki predstavlja fluorescenčno označene peptidne mešičke v astrocitih. Za spremljanje položaja teh struktur v času se na vsako piko
prilagodi dvodimenzinalno Gaussovo krivuljo, katere vrh določa koordinate x in y v ravnini in v času. Na sliki 6 so vidne trajektorije - potovanja -mešičkov v času 30 sekund. Nekateri mešički opravijo v času opazovanja razmeroma velik odmik od mesta začetka opazovanja (mešička 2 in 3), to so tako imenovani mešički z usmerjeno mobilnostjo. Drugi mešički pa se zadržujejo v bližini izhodišča opazovanja (mešička z oznako 1 in 4) - mobilnost mešičkov je torej neusmerjena. Usmerjeno mobilnost zrcali potovanje mešičkov vzdolž citoskeletnih vlaken (Potokar in sod., 2007). Če astrocite spodbujamo, da se v njih poveča citosolna aktivnost Ca2+, se nekaterim mešičkom (vsebujejo glijotransmiter gluta-mat) poveča mobilnost in več takšnih mešičkov kaže usmerjeno mobilnost (Stenovec in sod., 2007). Nekaterim mešičkom (vsebujejo peptide in ATP) pa se mobilnost po spodbujanju močno zmanjša (Potokar in sod.,
Nobelova nagrada za fiziologijo ali medicino za leto 2013 • Nobelove nagrade za leto 2013 171
Ctrl.
+ IFN
l-T
Dextran	MHC II	Mask	
D extra n ■ ■ .■.. .	MHC if	Mask."1"" % »i ■ .' t ' i	_
Slika 7: Astrociti postanejo antigen predstavitvene celice v patoloških procesih, v prisotnosti citokina IFN-J izražajo proteine skupine MHC II (merilo: 10 mikrometrov;
prirejeno po: Vardjan in sod., 2012, J. Neuroinflamm.).
2007). V patoloških razmerah se v astrocitih zgodijo spremembe in med drugim začnejo čezmerno izražati posebno obliko citoskele-ta - intermedijarne filamente. Zaradi teh se tudi mobilnost mešičkov močno spremeni, kar določi spremenjeno odzivnost astrocitov na bolezensko spremenjeno okolje. Slika 7 prikazuje mešičke, ki so v astrocitih le, če se v okoliškem možganskem tkivu pojavi cito-kin interferon-y. Ta pa se pojavi pri vnetjih v možganih. Astrociti v takšnih razmerah začnejo izražati molekule MHC II (angleško Major Histocompatibility Complex class II molecules), ki so potrebne za anti-
100 0 100 200 300
Time (s)
gen, predstavitvene procese, značilne predvsem za imunski sistem. Ta vloga astro-citov v normalnih razmerah ni izražena. Mešički, ki tovorijo molekule MHC II, pa postanejo bolj mobilni zaradi povečanega izražanja intermedijarnih citoskeletnih fi-lamentov (Vardjan in sod., 2012, Guček in sod., 2012). Takšne spremembe astrocitov bi veljalo farmakološko obvladati, tako da bi potek sprememb astrocitov v bolezni zavrli. V zadnjem času napredujejo napori, da bi za zdravljenje nevroloških bolezni uporabili zdravila, ki selektivno delujejo le na astroci-te, ki so odzivni in tudi prispevajo k poteku bolezni. Prvo od takih zdravil, ki verjetno deluje prek astrocitov, je oralno zdravilo za zdravljenje pogoste oblike multiple skleroze - Fingolimod (Gilenya, Novartis) -, čeprav izdelovalec tega zdravila navaja drugačen mehanizem delovanja.
Dinamika prometa mešičkov v astrocitih se ujema z razpoložljivostjo presnovkov za nastanek glijotransmiterjev
Astrociti so edine celice v možganih, ki skladiščijo zaloge energije v obliki gliko-gena. Iz glikogena prek glukoze nastaneta dva pomembna glijotransmiterja, ki se tudi
Slika 8: Časovni porast citosolne koncentracije sekundarnega prenašalca cAMP in glukoze po dodatku noradrenalina. V bolezenskih stanjih zmožnost astrocitov, da tvorijo zadostne količine glukoze za sintezo gliotransmiterjev, lahko upade (diagram spodaj; črni krogi - miške divji tip, beli krogi -miške z intelektualno manjzmožnostjo).
172 Nobelove nagrade za leto 2013 • Nobelova nagrada za fiziologijo ali medicino za leto 2013
Proteus 76/4 • December 2013
skladiščita v mešičkih (ATP in glutamat). Polnjenje mešičkov s tema glijotransmiter-jema bi lahko opredelilo počasno sporazumevanje astrocitov z okoliškimi celicami. Da bi določili razpoložljivost glukoze, iz katere nastaneta glutamat in ATP (poleg vloge skladiščenja kemične energije je ATP tudi pomemben glijotransmiter), smo merili spremembe citosolne koncentracije glukoze v astrocitih. Živčni prenašalec noradrenalin prek znotrajceličnega porasta sekundarnega prenašalca cikličnega adenozin monofosfata (cAMP) povzroči zvišanje citosolne koncentracije glukoze v obdobju dobre minute (Kreft in sod., 2013), kar se ujema z odzivnostjo uravnavane eksocitoze astrocitov. Ta proces bi lahko določal počasnost sporazumevanja astrocita z okoliškimi celicami. Slika 8 prikazuje časovni porast koncentracije sekundarnega prenašalca cAMP, pod njim pa je prikazan zakasnjeni porast citosolne koncentracije glukoze. Predvidevamo, da v
bolezenskih stanjih zmožnost astrocitov, da tvorijo zadostne količine glukoze za sintezo glijotransmiterjev, lahko upade in s tem se sklopljenost procesov sporazumevanja v možganih spremeni.
Nova spoznanja o mehanizmih bolezni
Odkritja treh Nobelovih nagrajencev so omogočila boljše razumevanje univerzalnih procesov na ravni celične fiziologije evkari-ontov. Celični promet mešičkov, ki pomeni pomemben temelj za sporazumevanje med celicami, je s podelitvijo Nobelove nagrade za fiziologijo ali medicino v letu 2013 pridobil na »teži«, ki jo pri razumevanju delovanja celice tudi zasluži. S tem so nastali novi vzvodi za razumevanje mehanizmov delovanja tudi tako kompleksnega tkiva, kot so možgani. Ni nemogoče, da bodo zdaj lahko odkrili tudi motnje, ki so razlog za nekatera nevrološka obolenja, s tem pa tudi nove možnosti za njihovo zdravljenje.
Slovarček:
Nevron. Živčna celica z vsemi svojimi izrastki (Slovar slovenskega knjižnega jezika); celica v živčevju s perikarionom, dendriti in nevritom, ki sprejema, prevaja in predeluje vzburjenje (Medicinski terminološki slovar). Nevrotransmiter. Spojina, ki se sintetizira v presinaptičnem nevronu, hrani v sinaptičnih mešičkih, se sprosti ob vzburjenju živčnega končiča, z difuzijo prek sinapse doseže postsinaptično membrano, kjer po vezavi na receptor spodbuja (stimulira) ali zavira (inhibira) delovanje postsinaptične celice (Medicinski terminološki slovar).
Literatura:
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/ laureates/2013/advanced-medicineprize2013.pdf Machinery Regulating Vesicle Traffic, A Major Transport System in our Cells.
Kreft, M., 2002: Toksina botulin in tetanospazmin. Proteus, 64 (5): 207-211.
Schiavo, G., Benfenati, F., Poulain, B, Rossetto, O,, Polverino de Laureto, P., B. R., Montecucco, C., 1992: Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature, 359: 832-835. Kreft, M., Stenovec, M., Rupnik, M., Grilc, S., Kržan, M., Potokar, M., Pangršič, T., Haydon, P. G., Zorec, R, 2004: Properties of Ca2+-Dependent Exocytosis in Cultured Astrocytes. Glia, 46: 437-445.
Rituper, B, Guček, A, Jorgačevski, J, Flašker, A, Kreft, M., Zorec, R, 2013: High-resolution membrane capacitance measurements for the study of exocytosis and endocytosis. Nature Protocols, 8: 1169-1183. Stenovec, M., Kreft, M, Grilc, S, Potokar, M, Erdani Kreft, Pangršič, T., Zorec, R, 2007: Ca2+-dependent mobility of vesicles capturing anti-VGLUT1 antibodies. Exp. Cell Res., 313: 3809-3818.
Potokar, M, Kreft, M, Li, L, Andersson, D, Chowdhury, H. H., Pangršič, T., Pekny, M., Zorec, R, 2007: Cytoskeleton and Vesicle Mobility in Astrocytes Traffic, 8: 12-20. Vardjan, N, Gabrijel, M, Potokar, M., Svajger, U., Kreft, M, Jeras, M, de Pablo, Y, Faiz, M, Pekny M,, Zorec, R,, 2012: IFN-Y-induced increase in the mobility of MHC class II compartments in astrocytes depends on intermediate filaments. J. Neuroinflammation, 26 (9): 144. PMID: 22734718. Guček, A, Vardjan, N, Zorec, R, 2012: Exocytosis in astrocytes: transmitter release and membrane signal regulation. Neurochem. Res, 37(11): 2351-63. doi: 10.1007/ s11064-012-0773-6. Epub 2012 Apr 21. Kreft, M,, Lukšič, M, Zorec, T. M, Prebil, M, Zorec, R, 2013: Diffusion of D-glucose measured in the cytosol of a single astrocyte. CMLS, 70: 1483-1492.