Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 36 Uvod Spoznanje, da je okužba z onkogenimi HPV (HPV- VT) nujna vmesna stopnja v naravnem poteku nastanka predrakavih in rakavih sprememb ma- terničnega vratu (1−4), je odprlo nove možnosti za pravočasno prepoznavo bolj ogroženih žensk v že obstoječih organiziranih presejalnih programih. Po podatkih iz literature je mogoče s HPV-testiranjem v primerjavi s citološkim pregledom brisa mater- ničnega vratu (BMV) odkriti okrog 30 % več prime- rov CIN2+ in 20 % več primerov CIN3+ pri ženskah, ki so starejše od 30 let. Ker so ženske, ki prebole- vajo okužbo s HPV-VT, bolj ogrožene z rakom ma- terničnega vratu (RMV) kot ženske, ki te okužbe ni- majo, so svoje mesto v presejalnih programih našli presejalni testi za odkrivanje okužb s HPV (PT-HPV). Negativni PT-HPV test je dovolj zanesljiv pokaza- telj, da se RMV ne bo razvil v naslednjem destletju. Klinično preverjeni testi HPV imajo v primerjavi s ci- tološkim pregledom BMV svoje prednosti, kot tudi slabosti (5, 6). Glavna prednost PT-HPV, ki jo izkoriščamo v pre- sejalnih programih, je njegova velika klinična ob- čutljivost in v primeru, da je test HPV negativen, velika negativna napovedna vrednost za predra- kave spremembe visoke stopnje (CIN 2+) in RMV. V primarnem presejanju s testom HPV to omogoča varno podaljšanje presejalnega intervala na 5 let. Nove triažne metode pri HPV-pozitivnih ženskah Ana Pogačnik 1 , Veronika Kloboves Prevodnik 1 , Nataša Nolde 1 , Srdjan Novaković 2 , Uršula Prosenc Zmrzljak 2 , Marina Grgič 2 , Urška Ivanuš 3 , Maja Primic Žakelj 3 1 Oddelek za citopatologijo, Onkološki inštitut Ljubljana, Zaloška 2, Ljubljana 2 Oddelek za molekularno diagnostiko, Onkološki inštitut Ljubljana, Zaloška 2, Ljubljana 3 Epidemiologija in register raka, Program in register ZORA, Onkološki inštitut Ljubljana, Zaloška 2, Ljubljana Povzetek Okužba s humanimi papiloma virusi (HPV) je pogostejša kot so predrakave spremembe ali rak ma- terničnega vratu (RMV). Prav zato so v praksi pomemben izziv HPV-pozitivne ženske z negativnim citološkim izvidom, oziroma brez CIN 2+, ker še vedno ni povsem jasno, kako naj jih obravnavamo. Mednarodna strokovna javnost proučuje različne triažne metode, s katerimi bi prepoznali HPV-po- zitivne ženske in jih ločili na tiste z večjim ali manjšim tveganjem CIN 2+ in RMV. Cilj je, da se manj ogrožene HPV-pozitivne ženske varno vrnejo v presejanje, bolj ogrožene pa napotitjo na nadaljno diagnostiko in zdravljenje. Tako v tujini, kot tudi pri nas v raziskavah proučujemo različne metode, tako citološke kot molekularne, vendar vse še niso preverjene na velikih populacijskih vzorcih. V pri- spevku so predstavljene metode, ki se bodo morda v prihodnje uporabljale za triažo HPV-pozitivnih žensk. Ključne besede: proteinski označevalec, molekularni označevalec, bris materničnega vratu (BMV), humani papiloma virus (HPV), triažne metode, presejalni program Test HPV pa lahko v presejanju uporabimo ne samo kot primarni presejalni test, ampak tudi kot triažni test HPV (TT-HPV) pri ženskah z nekaterimi citolo- škimi spremembami v BMV. Po slovenskih smerni- cah za celostno obravnavo žensk s predrakavimi spremembami materničnega vratu je treba TT-HPV opraviti pri ženskah s patološkimi spremembami nizke stopnje in pri ženskah po zdravljenju CIN (7). Če je TT-HPV pri teh ženskah negativen, se lahko praviloma varno vrnejo v presejanje. Tako se je mo- goče izogniti prepogostim kontrolnim pregledom in nepotrebni dodatni diagnostiki pri manj ogro- ženih ženskah. Pomembna prednost testa HPV je tudi, da ga je možno opraviti tudi na cerviko-va- ginalnih vzorcih, ki si jih lahko ženske odvzamejo same doma in da je zanesljivost tega testa za odkri- vanje CIN 2+ primerljiva zanesljivosti citološkega pregleda BMV, ki ga odvzame ginekolog. Številne države in tudi Slovenija proučujejo možnost, da bi test HPV doma ponudili ženskam, ki se ne udeležu- jejo redno presejalnih pregledov. Prva država, ki se je odločila za tovrstno nadgradnjo organiziranega presejalnega programa, je Nizozemska. Prednost testov HPV je v praksi omejena s (pre-) majhno klinično specifi čnostjo, kadar se test ne uporablja pri priporočenih indikacijah. Glavna sla- bost HPV-testiranja je, da odkrije veliko prehodnih okužb, ki lahko spontano izzvenijo. V Sloveniji je v starosti 20–25 let HPV-pozitivnih okoli 25 % žensk Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 37 (8). Te ženske spadajo v skupino manj ogroženih žensk, ki ne potrebujejo dodatne diagnostike ali zdravljenja, ker bodo okužbe pri njih v veliki večini primerov spontano izzvenele. Okužba s HPV je veliko pogostejša, kot so predra- kave spremembe ali RMV. Prav zato so v praksi pomemben izziv HPV-pozitivne ženske z negativ- nim citološkim izvidom, oziroma brez CIN 2+, ker še vedno ni povsem jasno, kako jih obravnavati. Te ženske lahko prebolevajo klinično nepomemb- no, prehodno okužbo, ali pa klinično pomembno okužbo, ki je v zgodnji fazi in še ne povzroča pato- loških sprememb na ploščatem ali žleznem epitelu materničnega vratu. Čeprav imajo te ženske veliko manjše tveganje, da imajo ali bodo v prihodnjih nekaj letih zbolele za RMV, kot ženske z obema po- zitivnima testoma, je to tveganje še vedno preveli- ko, da bi jih lahko varno vrnili v presejanje. V petih letih bo namreč 6 od 100 žensk s HPV pozitivnim testom in negativno citologijo zbolelo s CIN 3+ (9). HPV-pozitivne ženske brez patoloških sprememb odkrijejo predvsem v primarnem presejanju s te- stom HPV in s citološko triažo, ali pa pri sočasni uporabi testa HPV in pregleda BMV v primarnem presejanju. Ženske so praviloma napotene na kon- trolni pregled s testom HPV čez eno leto, saj v tem času lahko okužba bodisi izzveni, ali pa napreduje v CIN, ki ga na kontrolnem pregledu tudi odkrijejo. S tem se sicer prepreči nepotrebno kolposkopsko in histološko diagnostiko v času čakanja ter dopu- sti okužbi čas, da izzveni. Vendar pa je čakanje za ženske stresno, saj se po eni strani bojijo za svoje zdravje, po drugi strani pa se ukvarjajo s tem, ali naj spremenijo običajno spolno prakso s svojim dolgo- letnim partnerjem, ali lahko zanosijo in podobno. Čakanje je lahko tudi zelo dolgotrajno, saj lahko od okužbe do CIN visoke stopnje mine tudi več let, celo 10 in več (9). Metode za nadaljnjo triažo HPV pozitivnih žensk Mednarodna strokovna javnost proučuje različne triažne metode, s katerimi bi prepoznali HPV-pozi- tivne ženske in jih ločili na tiste z večjim ali manj- šim tveganjem CIN 2+ in RMV.Osnovna naloga tri- ažnih metod je ločevanje HPV-pozitivnih žensk na tiste z visokim in tiste z manjšim tveganjem RMV. Cilj je, da se manj ogrožene HPV-pozitivne ženske varno vrne v presejanje, bolj ogrožene pa napoti na nadaljnjo diagnostiko. Trenutno najpogosteje proučevana triaža je citolo- ški pregled BMV oz. kombinacija citologije in geno- tipizacije vzorcev za HPV16/18, vendar zaenkrat ta triaža še ne omogoča varne vrnitve HPV-pozitivnih žensk z negativnim triažnim testom v presejanje (10). Zato strokovnjaki s tega področja iščejo nove metode, ki bi bile primerne za triažo. Proučujejo številne molekularne označevalce, kot so metila- cijski status različnih virusnih in humanih genov, in proteinske označevalce, kot so nekateri zaviralni proteini, npr. p16, ali jedrnih proteinov, ki so v ce- licah, ki proliferirajo (Ki67). Najverjetnejši pristop k celoviti obravnavi žensk iz presejalnih programov pa bo prej ali slej vključeval kombinacijo različnih molekularnih in citoloških metod. Triaža s citologijo V svetu potekajo različne raziskave, s katerimi išče- jo naprimernejše triažne metode za HPV pozitivne ženske. V presejalni populacijski kohortni študiji VUSA, s katero so preverjali učinkovitost kombi- nacije citološkega presejanja s HPV-VT testiranjem (Hybrid Capture® 2-hc2 test) so ugotovili, da je zelo primerna metoda citološka triaža predvsem v deže- lah z nizkim odstotkom žensk, ki imajo v brisu ma- terničnega vratu neopredeljene atipične ploščate celice (APC-N) in uporabljajo 5-letni presejalni in- terval (11). Ugotovili so, da je triaža s citologijo zelo primerna, ker ima veliko negativno napovedno vrednost (NPV) za CIN3+ in se zato z njo zmanjša število nepotrebnih napotitev na kolposkopijo. Ra- zen tega pa sta pomembna tudi neposreden stik in možnost pogovora med ginekologom in žensko. V deželah, kjer je odstotek APC-N velik in so intervali kontrolnih pregledov krajši (3 leta), pa se kot triaža priporoča kombinacija citologije in genotipizacije HPV (na primer določanje bolj invazivnih genoti- pov 16/18/31/33/45) (11). Druge metode za triažo HPV pozitivnih žensk Onkogeni potencial HPV je povezan s produkti virusnih genov E6 in E7. Virusni beljakovini E6 in E7 vplivata na številne celične procese, ki lahko povzročijo maligno spremembo s HPV okuženih celic. Med njimi so napomembnejši: spodbujanje oziroma vzdrževanje celične proliferacije, zaviranje zaščitnega delovanja beljakovin, ki zavirajo rast tu- morja ter vzpostavitev celične nesmrtnosti. Proteinski označevalci V zadnjem času potekajo številne raziskave, s kate- rimi iščejo proteine, ki so v predrakavih in rakavih spremembah prekomerno izraženi in kažejo na mo- tnje v celičnem ciklu ali maligno transformacijo celic (proteinski označevalci) in bi se lahko uporabljali za triažo HPV-VT pozitivnih žensk. Med njimi so najbolj raziskovani Ki67, p16, minikromosomski vzdrževalni protein 2 (MCM2) in topoizomeraza 2 alfa (Topo2A). To so proteini, ki so se v različnih raziskavah pokazali kot najbolj zanesljivi pokazatelji predrakavih in raka- vih sprememb na materničnem vratu. Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 38 P16 je zaviralec kinaz, odvisnih od ciklina, ki je po izsledkih številnih raziskav zelo povečan pri sko- raj vseh intraepitelijskih lezijah visoke stopnje in RMV (12−15). V celicah, ki so transformirane zara- di okužbe s HPV-VT, se zaradi nenadzorovane ce- lične delitve poveča izražanje p16-proteina, ki pa zaradi delovanja virusnih proteinov nima vpliva na regulacijo celične delitve in se v celici le kopiči (12). Ki67 pa je protein, ki ga najdemo v jedru in jedrcu celice. Izražen je v vseh celicah, ki proliferira- jo, tako normalnih, kot tudi rakasto spremenjenih (16−19). MCM2 in Topo2A sta sta prav tako jedrna proteina, ki se kopičita v celicah, ki so transformi- rane zaradi okužbe s HPV-VT. Minikromosomski vzdrževalni proteini imajo pomembno vlogo v za- četni fazi podvojevanja DNK. Omogočijo vezavo pre-replikacijskega kompleksa na DNK in odvijanje dvojne vijačnice DNK. Topo2A je jedrni encim, ki ima pomembno vlogo med podvojevanjem DNK, kondenzacijo kromosomov, mitozo in pri delitvi kromosomov med dve hčerinski celici (20). Vsi ti proteinski označevalci se že uporabljajo, saj izboljšajo diagnostično zanesljivost histološke preiskave, tako pri opredelitvi stopnje CIN, kot pri razlikovanju med CIN in spremembami, ki so jim morfološko podobne (18, 20, 21). V raziskavah so se za razlikovanje med neneoplastičnimi in neo- plastičnimi spremembami v histološki in v citološki diagnostiki pokazali za boljše in bolj uporabne p16, MCM2 in Topo2A, kot pa Ki67 (20). Različne raziskave so pokazale, da ima p16 imu- nocitokemično barvanje zelo veliko občutljivost za ugotavljanje CIN2+ in da bi lahko bilo dober triažni test pri ženskah, ki so imele BMV ocenjen s APC-N ali PIL-NS ali pri tistih s pozitivnim testom HPV (15, 22, 23). Ker pa s p16 imunocitokemičnim barvanjem v BMV prikažemo ne samo celice s pre- drakavimi in rakavimi spremembami, ampak tudi nekatere normalne celice ter tudi celice z neneo- plastičnimi spremembami (endocervikalne celice, ploščatocelična metaplazija, tubarna metaplazija), specifi čnost metode ni zadovoljiva. Ker je posamezen proteinski označevalec Ki67 in p16 premalo specifi čen, so razvili dvojno imunoci- tokemično barvanje p16/Ki67. To barvanje v vzor- ci h BMV praviloma prikaže le celice s predrakavimi in rakavimi spremembami, zato je test klinično dobro občutljiv in tudi specifi čen. Ker se v celicah, ki so transformirane zaradi HPV-VT okužbe preko- merno izražata tako Ki67, kot tudi p16 protein, je p16/Ki-67 dvojno imunocitokemično barvanje po- zitivno le v celicah, ki so maligno transformirane, ne pa tudi v normalnih celicah. Imunocitokemično barvanje je pozitivno, če se jedro celice obarva rde- če (Ki67), citoplazma pa rjavo (p16). Za pozitiven test zadostuje le ena pozitivna celica. Morfološke značilnosti celic pri interpretaciji rezultatov p16/ Ki67 dvojnega imunocitokemičnega barvanja niso pomembne, zato je ponovljivost rezultatov dobra (24). Dosedanje raziskave so pokazale, da bi p16/Ki67 dvojno imunocitokemično barvanje lahko upora- bljali kot triažni test v primarnem presejanju z BMV ali s testom HPV, lahko pa bi ga uporabljali tudi kot presejalni test. Petry s sodelavci je v svoji raziskavi pokazal, da s p16/Ki67 dvojnim imunocitokemič- nim barvanjem z veliko verjetnostjo odkrijemo večje tveganje CIN2+ tudi pri ženskah, ki imajo ob pozitivnem testu HPV negativen izvid BMV (25). Prav te ženske v presejalnih programih predsta- vljajo izziv za obravnavo, saj je tveganje CIN2+ pri njih preveliko, da bi jih vrnili v presejanje, zato jih je treba spremljati in čakati, ali bo okužba s HPV iz- zvenela (pri večini), ali pa se bo razvil CIN 2+. Poleg tega je ugotovil, da se je zaradi uporabe testa števi- lo napotitev na kolposkopske preglede zmanjšalo za 75 % (25). Genotipizacija Do junija 2014 je bilo opredeljeno že skoraj 200 različnih genotipov HPV (26). Klinično najpo- membnejši so genotipi HPV iz rodu alfa. Približno 40 od teh lahko okuži ploščatocelični epitel sluznic in jih delimo na genotipe z visokim tveganjem in z nizkim tveganjem (NT). Med HPV-VT prištevamo 12 genotipov, ki so odgovorni za nastanek več kot 99 % primerov RMV (26). Najpomembnejša geno- tipa sta HPV-VT 16 in18, ki sta povezana z več kot 70 % RMV (27). Na svetovnem tržišču je bilo ob koncu leta 2013 vsaj 145 različnih komercialno dostopnih testov HPV in skoraj 90 njihovih različic, vendar jih zelo malo zadostuje minimalnim merilom za varno uporabo v klinične namene (28). Različni testi za HPV-genotipizacijo imajo različne rezultate: • na svetovnem tržišču najbolj pogosto upora- bljen test Hybrid Capture® 2 (hc2 ) HPV DNA Test (Qiagen) zazna prisotnost 13 HPV-VT, ven- dar ne loči med različnimi genotipi; • testi, ki zaznajo HPV-VT in hkrati povedo, ali sta v vzorcu prisotna genotipa HPV-16 in HPV- 18. Prednost teh testov je določitev HPV-16 in HPV-18, ki sta najbolj onkogena izmed HPV, ter s tem določitev žensk z največjimi tveganjem CIN2+ ter možnost manj agresivnega zdravlje- nja žensk okuženih z ostalimi HPV; • testi, ki zaznajo posamezne HPV genotipe; • testi, ki temeljijo bodisi na določevanju virusne mRNA za virusna proteina E6 in E7; Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 39 • testi, ki temeljijo na metodi in-situ hibridizacije (27, 29). Večina testov je zelo analitično občutljivih, vendar klinična specifi čnost ni zagotovljena. Velika anali- tična občutljivost testov je dobrodošla pri razvoju cepiv, ni pa primerna za presejanje/triažo HPV-po- zitivnih žensk. Pri presejanju/triaži je pomembna klinična specifi čnost, saj tako številnim ženskam s klinično nepomembnimi HPV okužbami prihrani- mo nepotrebne preglede. Metilacija DNK Metilacija DNK je bila v zadnjih letih zelo prouče- vana molekularna metoda za triažo HPV pozitivnih žensk. Metilacija DNK je normalen pojav, s katerim se uravnava izražanje genov v različnih tkivih, ra- zvoj tkiv v ontogenetskem razvoju itd. Za mnoge oblike raka je opisano, da se spremeni delovanje encimov DNK-metiltransferaze (DNMT). DNMT en- cimi omogočajo, da se na citozinske baze v DNK pripnejo metilne skupine, ki kondenzirajo kro- matin, kar pomeni, da se geni, ki so na tej regiji, ne prepisujejo. Ali je metilacija vzrok ali posledica kancerogeneze ni znano, se pa podre uravnavanje celičnega cikla, če so metilirani tumorski zaviralni geni ali zaviralni elementi protonkogenov. V strokovni literaturi se že več let opisuje meritev ravni metilacije kot možen označevalec za triažo HPV pozitivnih žensk (30). Meritev metilacije je mogoče izvesti na DNK, izolirani iz različnih (tudi samoodvzetih) vzorcev, kar ima velik pomen pri nadaljnjem razvoju presejalnih programov za RMV (31). Spremembe v metilacijskem statusu HPV po- zitivnih žensk naj bi nastale zaradi neposrednega vpliva virusnih proteinov na delovanje DNMT enci- mov in/ali zaradi sprožene obrambne reakcije oku- ženih celic, ki s spremenjeno metilacijo virusnih in človeških genov poskušajo nadzorovati izdelova- nje proteinov in število celičnih delitev (32). Za triažo se lahko določa stopnjo metiliranosti človeških genov ali pa HPV genov. Pri slednjih so največkrat opisani testi za merjenje ravni metilacije virusnega genotipa HPV16, katerega okužba vodi v največji delež RMV (33, 34). Najbolj informativen pristop je verjetno kom- binacija meritev ravni metilacije na virusnih in človeških genih. Pred kratkim je bil v literaturi opisan takšen test: analitična občutljivost testa je 90 %, klinična specifi čnost za HPV 16, HPV 18 in HPV 31 je: 38 %, 53 % in 44 %. Pri hkratnih okužbah s HPV 16, 18 in 31 je klinična specifi č- nost 44 % in pri okužbah z drugimi HPV geno- tipi 17 %. Test je bil preverjen na kolposkopsko pregledani populaciji, njegova prava vrednost pa se bo pokazala šele pri uporabi v primarnem presejanju (35). Zaključek V zadnjih desetletjih je bilo citološko presejanje iz- jemno pomembno za zmanjšanje incidence RMV. Nova spoznanja na področju naravnega poteka nastanka RMV in nove tehnologije pa predstavljajo nove izzive za presejalne programe in nalagajo dr- žavam resen razmislek o primarni preventivi RMV s cepljenjem in morebitni uvedbi HPV testiranja v primarno presejanje. Seveda pa se bomo morali pri tem odločiti, kako obravnavati HPV-VT pozitivne ženske, da jih ne bomo po nepotrebnem obreme- njevali z dodatnimi preiskavami in nepotrebnim zdravljenjem. Na vse te spremembe bo treba misliti tudi pri nadaljnjem razvoju programa ZORA. Na podlagi izsledkov iz literature lahko potrdimo, da uporaba dodatnih označevalcev znatno pripo- more k povečanju občutljivosti in specifi čnosti od- krivanja CIN2+ in s tem pripomore k večji kakovosti presejalnega programa. Na ta način se tudi zmanj- šajo stroški programa, zmanjša se negotovost žensk, izognemo pa se tudi nepotrebnim diagno- stičnim in terapevtskim posegom. Literatura 1. Durst M, Gissmann L, zur Hausen H. A papilloma virus DNA from a cervical carcinoma and its preva- lence in cancer biopsy from diff erent geographic regions. Proc Natl Acad Sci 1983; 12: 3812−5. 2. Bosch FX, Lorincz A, Muñoz N, Meijer CJ, Shan KV. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J Clin Pathol 2002; 55: 244−65. 3. Muñoz N, Castellsague X, de Gonsales AB,Gissmann L. Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer. Vaccine 2006; 24 (Suppl. 3): 1−10. 4. Bosch FX, Broker TR, Forman D. Moscicki AB, Gillison ML, Doorbar J, et al. Comprehensive control of hu- man papillomavirus infections and related diseases. Vaccine 2012; Suppl 5: G1−G3. 5. Arbyn M, Roelens J, Simoens C, Buntinx F , Paraskeva- idis E, Martin-Hirsch PP , et al. Human papillomavirus testing versus repeat cytology for triage of minor cytological cervical lesions. Cochrane Database Syst Rev 2013; 3: CD008054. Epub 2013/04/02. 6. Arbyn M, Ronco G, Anttila A, Meijer CJ, Poljak M, Ogilvie G, et al. Evidence regarding human papil- lomavirus testing in secondary prevention of cervi- cal cancer. Vaccine 2012; 30 Suppl 5: F88-99. Epub 2012/12/05. 7. Uršič-Vrščaj M, Rakar S, Možina A, Kobal B, Takač I, Deisinger D, et al. Smernice za celostno obravnavo žensk s predrakavimi spremembami materničnega vratu. Posodobitev 2011. Ljubljana: Onkološki inšti- tut Ljubljana, 2011. Zbornik predavanj, 5. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2014 40 8. Učakar V, Poljak M, Klavs I. Pre-vaccination preva- lence and distribution of high-risk human papillo- mavirus (HPV) types in Slovenian women: a cervical cancer screening based study. Vaccine 2012; 30(2): 116−20. Epub 2011/11/15. 9. Katki HA, Kinney WK, Fetterman B, Lorey T, Poitras NE, Cheung L, et al. Cervical cancer risk for women undergoing concurrent testing for human papillo- mavirus and cervical cytology: a population-based s tudy in routine clinical practice. The Lancet oncolo- gy 2011; 12(7): 663−72. Epub 2011/06/21. 10. Cuzick J, Bergeron C, von Knebel Doeberitz M, Gra- vitt P , Jeronimo J, Lorincz AT, et al. New technologies and procedures for cervical c ancer screening. Vacci- ne 2012; 30 Suppl 5: F107−16. Epub 2012/12/05. 11. Rijkaart DC, Berkhof J, van Kemenade FJ, Coupe VMH, Hesselink AT, Rozendaal L, et al. Evaluation of 14 triage strategies for HPV DNA-positive women in population based cervical screening. Int J Cancer 2012; 130: 602−10. 12. Wentzensen N, von Knebel Doeberitz M. Biomarkers in cervical cancer screening. Dis Markers 2007; 23: 315−30. 13. Van Niekerk DV, Guillaud M, Matisic J, Benedet JL, Freeberg JA, Follen M, et al. P16 and MIB1 improve the sensitivity and specifi city of the diagnosis of high grade squamous intraepithelial lesions: Me- thodological issues in a report of 447 biopsies with consensus diagnosis and HPV HC II testing. Ginecol Oncol 2007; 107: 233−40. 14. Cushieri K, Wentzensen N. Human papillomavirus mRNA and p16 detections as biomarkers for the im- proved diagnosis of cevical neoplasia. Cancer Epide- miol Biomarkers Prev 2008; 17: 2536−45. 15. Tsoumpou I, Arbyn M, Kyrgiou M, Wentzensen N, Koliopoulos G, Martin-Hirsch P, et al. p16 immuno- staining in cytological in histological specimen from the uterine cervix: a sistematic review and meta- analysis. Cancer Treatment Rev 2009; 35: 21 16. Al-Saleh W, Delvenn P , Greimers R, Fridman V, Doyen J, Boniver J. Assessment of Ki-67 antigen immuno- staining in squamous intraepithelial lesions of the uterine cevix. Correlation with the histologic grade and human papilloma virus type. Am J Clin Pathol 1995; 104: 154−60. 17. Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D, Ridder R, Rudy W, Petry U, et al. Overexpression of p16 INK4A as a specifi c marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cerviks uteri. Int J Cancer 2001; 92: 276−84. 18. Strojan Fležar M, Gutnik H. Biološka označevalca p16 in Ki-67 za opredelitev cervikalne intraepitelijske neoplazije v biopsijskih vzorcih materničnega vratu. Onkologija 2012;1: 40−3. 19. Endl E, Gerdes J. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. Exp Cell Res 2000; 257: 231−7. 20. Pinto AP , Crum CP , Hirsch MS. Molecular markers of early cancer neoplasia. Dign Histopathol (Oxf ) 2010; 16 : 445−54. 21. Brown CA, Bogers J, Sahebali S, Depuydt CE, De Prins F, Malinovski DP . Role of protein biomarkers in the detection of high grade disease in cervical can- cer screening programs. J Oncol 2012; 2012 Article ID 289315. doi: 10.1155/2012/289315:1−11. 22. Carozzi F, Confortini M, Dalla Palma M et al. Use of p16INK4a overexpression to increase the specifi city of human papillomaviru s testing: a nested study of the NTCC randomized controlled trial. Lancet Oncol 2008; 9: 937−45. 23. Roelens J, Reuschenbach M, von Knebel Doeberitz M, Wentzensen N, Bergeron C, Arbyn M. p16 INK4a im- munocytochemistry versus human papillomavirus testing for triage women with minor cytological ab- normalities. A systematic review and meta-analysisy. Cancer Cytopathology 2012; 120: 294−307. 24. Edgerton N, Cohen C, Siddiqui MT. Evaluation of CINtec PLUS® testing as an adjunctive test in ASC- US diagnosed Surepath® preparations. Diagnostic cytopathology 2011; 41; 35−40. 25. Petry U, Schmidt D, Scherbring S, Luyten A, Rei- necke-Lüthge A, Bergeron C, Kommoss F, Löning T, Ordi J, Regauer S, Ridder R. Triaging Pap cytology negative, HPV positive cervical cancer screening re- sults with p16/Ki67 dual-stained cytology. Gyneco- logy Oncology 2011; 121: 505−9. 26. IARC. Human papillomaviruses. In: A Review of Hu- man Carcinogens: Biological Agents. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum 100B. Lyon: IARC; 2012: 255–313. 27. Poljak M, Cuzick J, Kocjan BJ, Iftner T, Dillner J, Arbyn M. Nucleic Acid Tests for the Detection of Alpha Hu- man Papillomaviruses. Vaccine 2012; Supplement 30: F100–F106. 28. Li N, Franceschi S, Howell-Jones R, Snijders PJF, Clif- ford GM. Human papillomavirus type distribution in 30,848 invasive cervical cancers worldwide: Vari- ation by geographical region, histological type and year of publication. Int J Cancer 2011; 128, 927–35. 29. Cubie HA, Cuschieri K. Understanding HPV tests and their appropriate applications. Cytopathology 2013; 24, 289–308. 30. Wentzensen N, Sherman ME, Schiff man M, Wang SS. Utility of methylation markers in cervical cancer ear- ly detection: Appraisal of the state-of-the-science. Gynecol. Oncol. 2009; 112, 293–99. 31. Hesselink AT, et al. Methylation marker analysis of self-sampled cervico-vaginal lavage specimens to triage high-risk HPV-positive women for colposco- py. Int J Cancer 2014; 135, 880–6. 32. Johannsen E, Lambert PF. Epigenetics of human pa- pillomaviruses. Virology 2013; 445, 205–12. 33. Mirabello L, Schiff man M, Ghosh A, Rodriguez AC, Vasiljević N, Wentzensen N, et al. Elevated methyla- tion of HPV16 DNA is associated with the develo- pment of high grade cervical intraepithelial neopla- sia. Int. J. Cancer 2013; 132, 1412–22. 34. Lorincz AT, Brentnall AR, Vasiljević N, Scibior-Bent- kowska D, Castanon A, Fiander A, et al. HPV16 L1 and L2 DNA methylation predicts high-grade cer- vical intraepithelial neoplasia in women with mildly abnormal cervical cytology. Int J Cancer 2013; 133, 637–44. 35. Brentnall AR, Vasiljević N, Scibior-Bentkowska D, Cadman L, Austin J, Szarewski A, et al. A DNA me- thylation classifi er of cervical precancer based on human papillomavirus and human genes. Int J Can- cer 2014; 135, 1425–32.