481 STROKOVNI ČLANEK Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic Avtorske pravice (c) 2023 Zdravniški Vestnik. To delo je licencirano pod Creative Commons Priznanje avtorstva-Nekomercialno 4.0 mednarodno licenco. Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic: revolucionarna tehnologija, ki nadgrajuje razumevanje kompleksnih bolezni in spodbuja oseben pristop k zdravljenju – primer melanoma kože Single-cell RNA sequencing: a revolutionary technology that has enhanced our understanding of complex human diseases and paved the way towards precision medicine - melanoma example Tadeja Kuret,1 Polonca Ferk2 Izvleček Tehnologija sekvenciranja RNK na ravni posameznih celic (scRNAseq) nam omogoča, da z visoko ločljivostjo in na- tančnostjo naenkrat določimo nabor vseh molekul RNK v vsaki posamezni celici, ki se nahaja v določenem vzorcu oz. tkivu. Danes je scRNAseq pomembno orodje predvsem za proučevanje kompleksnih bioloških sistemov in tkiv, kot je tumorsko tkivo, kjer je velika celična raznolikost ključnega pomena. V članku navajamo primer melanoma kože, ki je eden najpogo- stejših in najbolj agresivnih rakov v razvitem svetu. Čeprav se je v zadnjem času z uvedbo imunske terapije napoved izida melanoma bistveno izboljšala, pa je še vedno približno 30–40 % bolnikov, pri katerih tovrstno zdravljenje ni uspešno. Novi podatki, pridobljeni z uporabo scRNAseq, so razkrili, da je mehanizem odpornosti na zdravljenje z zaviralci imunskih nad- zornih točk zelo kompleksen, da na to poleg prisotnosti in fenotipa izčrpanih limfocitov T CD8+ vpliva tudi mutacija v genu BRAF, fenotip melanocitov, prisotnost in fenotip celic mieloičnega izvora, prisotnost fibroblastov različnega fenotipa ter interakcije med vsemi celicami, ki tvorijo tumorsko mikrookolje. V prihodnosti bo torej vse bolj pomemben oseben pristop zdravljenja, ki bo temeljil na molekularni in celični opredelitvi tumorja in njegovega mikrookolja ter na napovednih biolo- ških označevalcih. Z uporabo tehnologije scRNAseq se bomo lahko cilju osebne medicine zelo približali, saj nam omogoča identifikacijo posameznih celic in celičnih označevalcev, ki bi lahko napovedali odziv bolnika na zdravljenje in omogoča bolj ciljano odločitev za vrsto zdravljenja za posameznega bolnika. Na ta način bi se izognili principu zdravljenja, ki temelji na “poskusu in napaki” ter tako bistveno izboljšali učinkovitost zdravljenja. Zaenkrat pa se tehnologija scRNAseq uporab- lja zgolj v raziskovalne namene, zato zaradi določenih omejitev ni uvedena v dejansko klinično prakso. Zdravniški VestnikSlovenia Medical Journal 1 Inštitut za biologijo celice, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 Inštitut za biostatistiko in medicinsko informatiko / Središče ELIXIR-SI, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija Korespondenca / Correspondence: Polonca Ferk, e: polonca.ferk@mf.uni-lj.si Ključne besede: posameznocelične analize; sekvenciranje RNK; melanom; odpornost na zdravljenje; osebna medicina Key words: single cell analyses; RNA sequencing; melanoma; therapy resistance; personal medicine Prispelo / Received: 22. 12. 2022 | Sprejeto / Accepted: 5. 9. 2023 Citirajte kot/Cite as: Kuret T, Ferk P. Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic: revolucionarna tehnologija, ki nadgrajuje razumevanje kompleksnih bolezni in spodbuja oseben pristop k zdravljenju – primer melanoma kože. Zdrav Vestn. 2023;92(11–12):481–95. DOI: https:// doi.org/10.6016/ZdravVestn.3411 eng slo element sl article-lang 10.6016/ZdravVestn.3411 doi 22.12.2022 date-received 5.9.2023 date-accepted Dermatology, venereology Dermatologija, venerologija discipline Professional article Strokovni članek article-type Single-cell RNA sequencing: a revolutionary technology that has enhanced our under- standing of complex human diseases and paved the way towards precision medicine - melanoma example Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic: revolucionarna tehnologija, ki nadgrajuje razume- vanje kompleksnih bolezni in spodbuja oseben pristop k zdravljenju – primer melanoma kože article-title Single-cell RNA sequencing Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic alt-title single cell analyses, RNA sequencing, melano- ma, therapy resistance, personal medicine posameznocelične analize, sekvenciranje RNK, melanom, odpornost na zdravljenje, osebna medicina kwd-group The authors declare that there are no conflicts of interest present. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo nobeni konkurenčni interesi. conflict year volume first month last month first page last page 2023 92 11 12 481 495 name surname aff email Polonca Ferk 1 polonca.ferk@mf.uni-lj.si name surname aff Tadeja Kuret 2 eng slo aff-id Institute of Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Inštitut za biologijo celice, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 1 Institute for Biostatistics and Medical Informatics / ELIXIR-SI Centre, Faculty of Medicine, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Inštitut za biostatistiko in medicinsko informatiko / Središče ELIXIR-SI, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 482 DERMATOLOGIJA, VENEROLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2023 | Letnik 92 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3411 1 Uvod 1.1 Sekvenciranje naslednje generacije (NGS) Z odkritjem sekvence celotnega človeškega genoma leta 2003 (1) se je začelo novo obdobje raziskovanja v medicini, ki ne temelji več na principu, omejenem na posamezno molekulo DNK, RNK ali posamezen pro- tein, temveč vključuje sistemsko-orientirani pristop, ki zajema celoten genom, transkriptom ali proteom. To je omogočil projekt Človeški genom, s katerim se je priče- la uporaba visoko zmogljivih tehnologij, predvsem teh- nologije sekvenciranja naslednje generacije (angl. next generation sequencing, NGS), poleg tega pa tudi razvoj različnih bioinformatskih orodij, nujno potrebnih za analizo visokogostotnih podatkov, ki jih z navedenimi tehnologijami pridobimo (2). Z nadaljnjimi tehnološki- mi inovacijami in napredkom v hitrosti in času ter kako- vosti sekvenciranja molekul DNK je metoda NGS posta- la komercialno dostopna, kar je pomenilo tudi znižanje cene analize sekvence DNK (3). 1.2 Sekvenciranje RNK (RNAseq) Metodo NGS danes množično uporabljamo tudi za sekvenciranje celotnega transkriptoma (sekvenciranje RNK), torej nabora vseh molekul RNK, ki se izražajo v določenem organu/tkivu/celicah v določeni časovni toč- ki pod določenimi pogoji (4). Na ta način lahko odkrije- mo, kvantificiramo in analiziramo na milijone molekul RNK naenkrat v različnih vzorcih. Pri tem nas predvsem Abstract Single-cell RNA sequencing (scRNAseq) allows us to simultaneously determine the transcriptome (the set of all RNA mole- cules) in each individual cell in the sample or tissue of interest with high resolution and accuracy. It represents an import- ant tool, especially for studying complex biological systems and tissues, such as tumour tissues, where cellular complex- ity and diversity are extremely important. In this article, we focused on cutaneous melanoma, one of the most common and aggressive cancers in industrialized countries. Although, with the introduction of immunotherapy, the prognosis of melanoma has improved significantly, there are still approximately 30-40% of patients in whom this type of therapy is unsuccessful. Recent data obtained using scRNAseq have shown that the mechanism of resistance to treatment with im- mune checkpoint inhibitors is very complex. Various factors that vary from patient to patient can affect therapy resistance, including the presence and phenotype of exhausted CD8+ T lymphocytes, BRAF gene mutation, melanocyte phenotype, the presence and phenotype of cells of myeloid origin, and the interaction between all cells that make up the tumour microenvironment. In the future, an individualized treatment approach based on the molecular and cellular definition of the tumour and its microenvironment, as well as predictive biomarkers, will become increasingly important by greatly improving the efficacy of treatment. We can also expect a new wave of development of more effective therapies for the treatment of melanoma, mostly due to significant advances in technologies, such as scRNAseq, which allows us to precise- ly determine the genomic and transcriptomic characteristics of thousands of individual cells in the tumour microenviron- ment simultaneously, thus identifying new potential therapeutic targets. However, due to certain limitations, scRNAseq technology is currently used only for research purposes and has yet to be introduced into real clinical practice. zanima razlika v izražanju molekul informacijskih RNK, ki se lahko prevedejo v proteine. Tako lahko sklepamo, kateri proteini so pomembno vpleteni v bolezensko stanje, ki ga proučujemo (5). Do nedavnega se je raz- iskovalo predvsem transkriptom celotne populacije ce- lic v določenem vzorcu (angl. conventional/bulk RNA sequencing, RNAseq), kar je pomenilo, da lahko dolo- čimo le povprečno količino oz. izražanje molekul RNK v celotnem vzorcu tkiva, ki pa je sestavljeno iz velike in raznolike populacije celic (6). Dobljeni rezultati so tako odražali izražanje molekul RNK, značilnih predvsem za tip celic, ki v vzorcu prevladuje, medtem ko so se infor- macije o celičnih populacijah, ki so v vzorcu zastopane v manjši meri, izgubile. Tak pristop v nekaterih primerih zadostuje, npr. pri primerjanju homogene populacije ce- lic (npr. celičnih kultur), večinoma pa ne, npr. pri analizi celic v zgodnjem razvoju ali pri analizi kompleksnih bi- oloških sistemov oz. tkiv, kot sta npr. imunski sistem ali tumorsko tkivo (7). 1.3. Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic (scRNAseq) Omenjene pomanjkljivosti konvecionalnega sekven- ciranja RNK je odpravila nova tehnologija sekvenciranja RNK na ravni posamezne celice (angl. single cell RNA sequencing, scRNAseq). Metoda scRNAseq so prvič predstavili leta 2009, njena množična uporaba in pri- ljubljenost pa sta začeli naraščati po letu 2014, ko sta 483 STROKOVNI ČLANEK Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic tehnološki napredek in komercialna dostopnost različ- nih platform in protokolov bistveno znižala ceno anali- ze (8). V nasprotju s konvencionalnim sekvenciranjem RNK, pri katerem lahko določimo le povprečno količino izražanja molekul RNK v celotni populaciji celic, ki se v tkivu nahajajo, lahko sedaj določimo nabor vseh mole- kul RNK, ki se izražajo v posameznih celicah. Danes je scRNAseq pomembno orodje predvsem za proučevanje kompleksnih bioloških sistemov in tkiv. Z uporabo te tehnologije lahko odkrijemo nove in redke populacije celic v določenem tkivu ter določimo različna obdobja razvoja in diferenciacije posameznih celic (9). Vzorec spremenjenega (preveč ali premalo) izražanja molekul RNK v posamezni celici nam omogoči vpogled v akti- virane ali zavrte biološke signalne poti in mehanizme, ki lahko vodijo v nastanek bolezni. V primerjavi s prej upo- rabljenimi metodami, pri katerih je bilo naše razumeva- nje omejeno predvsem na prevladujoči tip celic v tkivu, ponuja metoda scRNAseq nov vpogled v funkcionalno različnost posameznih celic, tudi tistih, ki so v vzorcu zastopane v manjši meri, a lahko pomembno vplivajo na razvoj bolezni in odpornosti na zdravljenje (10). 2 Tehnologija scRNAseq 2.1 Princip tehnologije scRNAseq Prvo določitev celotnega transkriptoma na ravni posameznih celic z uporabo tehnologije NGS so opisa- li leta 2009, ko so Tang in sod. (13) preučevali zgodnje stopnje razvoja zarodka miši. S tehnologijo scRNAseq so odkrili izražanje kar 75 % več molekul informacijskih RNK v celici blastomere, kot so jih v preteklosti lahko določili z drugimi metodami (13). Danes nam metoda omogoča sekvenciranje z zelo veliko ločljivostjo, večjo zmogljivostjo in točnostjo ter velikim naborom komer- cialno dostopnih platform in protokolov (14). Tudi dru- ge metode, ki na ravni posameznih celic preučujejo ce- loten genom, metilacijo DNK ali odprtost kromatina in izražanje površinskih proteinov, se v zadnjem času raz- vijajo in se že uporabljajo v raziskovalne namene (15). Običajen protokol scRNAseq vključuje naslednje glavne korake: osamitev posameznih celic, pripravo knjižnice in NGS ter bioinformatsko obdelavo doblje- nih podatkov (16). Osamitev živih in nepoškodovanih posameznih celic iz preučevanega tkiva je ključni korak, ki ga običajno izvedemo s pomočjo encimske ali mehan- ske disociacije (16). Če želimo preučevati samo določen tip celic, se jih lahko osami na podlagi površinskih pro- teinov, ki jih celice izražajo (17). Ko pridobimo suspen- zijo posameznih celic, jih moramo vsako posebej ločiti v posamezno reakcijsko enoto oz. predelek. Obstaja več različnih platform in tehnologij, ki uporabljajo različ- ne postopke fizične ločitve posameznih celic iz vzorca ter priprave knjižnice in pomnoževanja. Trenutno je najbolj zastopana uporaba mikrofluidike, ki omogoča ločitev posameznih celic v kapljice (18). Ta tehnologija nam omogoča tudi, da vse nadaljnje reakcije (liza celic, obogatitev informacijskih RNK, reverzna transkripcija RNK v cDNK) poteka znotraj posameznih enot (ka- pljic), kar je velika prednost, saj tako ne potrebujemo dodatne opreme, poleg tega pa zmanjšamo izgubo ma- teriala in možnost napak (19,20). Tehnologija temelji na uporabi oljne emulzije, ki omogoči enkapsulacijo posameznih celic v vodne kapljice. Vsaka kapljica poleg posamezne celice iz vzorca vsebuje še oligonukleotide, označene z unikatno identifikacijsko črtno kodo, ki se vežejo na molekule informacijske RNK, sproščene iz ce- lice v kapljici. Po reverzni transkripciji RNK v cDNK se unikatna črtna koda integrira v zaporedje DNK, kar nam omogoči identificiranje posameznih celic oz. do- ločitev izvora transkriptoma po sekvenciranju, saj je transkriptom vsake celice označen s svojo črtno kodo (Slika 1). Tehnologija mikrofluidike je pri uporabnikih trenutno najbolj priljubljena, saj zahteva majhen volu- men vzorca, cena pa je sorazmerno nizka v primerjavi z ostalimi dostopnimi platformami (21,22). Označene molekule cDNK iz posameznih celic tarčnega vzorca nato sprostimo iz kapljic, jih združimo v eno reakcijsko enoto, pomnožimo s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR), ter sekvenciramo z upo- rabo NGS, na podoben način kot pri konvencionalnem sekvenciranju RNK (24). Temu sledi še bioinformatska analiza pridobljenih podatkov, ki zahteva znanje izku- šenih bioinformatikov, saj bioinformatski protokoli še niso tako dodelani in standardizirani kot metoda sama (25). Pri sami analizi je zelo pomembno kontroliranje kakovosti sekvenciranja, normalizacija izražanja genov, poravnava sekvenc s tarčnim genomom in kvantifika- cija izražanja genov. V nadaljnjih korakih lahko dolo- čimo, katere celice prevladujejo ali primanjkujejo in katerim genom posameznih celic se izražanje spremeni (poveča ali zmanjša) v patološko spremenjenemu tki- vu v primerjavi z zdravim, celice razvrstimo v različne subpopulacije na podlagi podobnosti izražanja genov, določimo fazo celičnega cikla ter določimo, v kateri fazi razvoja in diferenciacije se celice nahajajo (26). Za namen upravljanja s podatki, bioinformatske analize in shranjevanja podatkov, pridobljenih s pomočjo viso- kozmogljivostnih tehnologij, kot je NGS, je v Sloveniji na voljo raziskovalna infrastruktura ELIXIR-SI (https:// elixir-slovenia.org/). 484 DERMATOLOGIJA, VENEROLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2023 | Letnik 92 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3411 2.2 Glavne prednosti in pomanjkljivosti scRNAseq Glavna prednost tehnologije scRNAseq je ta, da lahko zazna že zelo majhne razlike v izražanju genov med različnimi celicami, kar je predvsem pomembno pri analizi tumorjev, kjer je celična raznolikost velika in lahko le manjše število določenih celic vpliva na ra- zvoj odpornosti na določen tip zdravljenja (27). Poleg tega lahko z njeno pomočjo odkrivamo povsem nove celične tipe in njihove značilne označevalce (28). Tako so npr. že odkrili nov, redek tip dendritičnih celic, ki so podobne plazmacitoidnim dendritičnim celicam in imajo sposobnost aktivacije limfocitov T. Razvoj cepi- va, ki bi povečalo število teh celic, bi lahko pomembno vplivalo na okrepitev imunskega odziva in potencialno delovalo protitumorsko (29). Z uporabo scRNAseq tudi lažje razumemo, kako poteka proces diferenciacije in dozorevanja celic, kar je uporabno predvsem na podro- čju embrionalnega razvoja, kjer imamo običajno ome- jeno število celic (30). Čeprav ima tehnologija številne prednosti, obstaja- jo tudi določene pomanjkljivosti, ki se jih je potrebno zavedati, če želimo rezultate pravilno interpretirati. Slika 1: Postopek izolacije, ločitve celic v posamezne reakcijske enote in priprave knjižnice za sekvenciranje RNK na nivoju posameznih celic (scRNAseq) z uporabo sistema mikrofluidike. Posamezne celice iz preučevanega tkiva običajno izoliramo s pomočjo encimske ali mehanske disociacije. Nato z uporabo mikrofluidike, ki temelji na oljni emulziji, fizično ločimo posamezne celice v vodne kapljice. Vse nadaljnje reakcije (liza celic, obogatitev informacijskih RNK in prepis RNK v cDNK) nato potekajo v posamezni kapljici za vsako celico posebej. Vsaka kapljica tako vsebuje posamezno celico ter oligonukleotid, označen z unikatno črtno kodo, ki se veže na informacijske molekule RNK, sproščene iz celice v kapljici, in po prepisu ostane vezan na cDNK posamezne celice. Tako lahko na koncu, ko celice združimo za sekvenciranje, točno določimo izvor transkriptoma. Povzeto po Kuret in sod. (23). 485 STROKOVNI ČLANEK Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic Najzahtevnejši izziv je osamitev zadostnega števila ži- vih in nepoškodovanih posameznih celic iz vzorca, ne da bi pri tem kakor koli vplivali na njihov transkrip- tom. Da bi to dosegli, je običajno potrebnih več optimi- zacijskih korakov, kar je odvisno tudi od vrste vzorca oz. tkiva, ki ga proučujemo. Doslej se je pokazalo, da je najbolje celice osamiti takoj, ko tkivo odvzamemo, obstaja pa tudi več protokolov zamrzovanja tkiv, kar nam omogoča, da pripravimo knjižnice za več vzorcev naenkrat (23). Težava pri tehnologiji je tudi velika ra- znolikost med celicami iz vzorca, kar je lahko posledica tehničnega (majhna količina RNK v celicah, slaba učin- kovitost pridobitve RNK iz celice) ali biološkega ozadja (veliko različnih stopenj razvoja in diferenciacije celic, različna velikost celic in različne faze cikla, v katerem se celica nahaja). Nekatere od težav lahko rešimo tako, da povečamo število celic, ki jih bomo analizirali, ali da celice na podlagi podobnosti izražanja genov zdru- žimo v skupine (16,31). Na pridobljene rezultate lahko negativno vpliva tudi učinek različnih šarž (angl. batch effect). To je lahko posledica ravnanja z vzorcem (npr. če različne vzorce sekvenciramo v različnih obdobjih z uporabo različnih platform za sekvenciranje) ali upora- be različnih šarž reagentov. Učinek šarž lahko izničimo z določenimi računalniškimi programi in algoritmi, najbolje pa je, da se jim v celoti izognemo z ustreznej- šim načrtovanjem poskusov, z vključitvijo več različnih bioloških vzorcev ali z zamrzovanjem vzorcev ter nji- hovo pripravo in sekvenciranjem ob istem času z isti- mi šaržami reagentov. Ostale pomanjkljivosti metode vključujejo predvsem sorazmerno visoko ceno, izzive pri bioinformatski obdelavi podatkov in interpretira- nju rezultatov ter translaciji rezultatov v klinično pra- kso (32). 2.3 Uporabnost tehnologije scRNAseq Velika uporabnost tehnologije scRNAseq se je po- kazala predvsem v preučevanju biologije tumorjev, kjer je velika celična raznolikost ključnega pomena. V član- ku navajamo primer melanoma kože, ki je eden najbolj agresivnih rakov v razvitem svetu (11). Čeprav se je v zadnjem času z uvedbo imunske terapije napoved izida melanom bistveno izboljšala, pa je še vedno približno 30–40 % bolnikov, pri katerih tovrstna terapija ni uspe- šna (12). Glavni razlog je velika raznolikost tako ma- lignih celic, ki tumor sestavljajo, kot tudi normalnih, predvsem imunskih celic, ki tumor obdajajo. Poleg tega nekatere raziskave kažejo, da bi bile lahko za nastanek in razvoj tumorja ter za odpornost na zdravljenje ali ponovitev tumorja po zdravljenju odgovorne rakave matične celice. Te so namreč sposobne samoobnove, diferenciacije v bolj specializirane celice, ki imajo bolj- še migracijske lastnosti in sposobnost izogniti se pre- poznavi imunskega sistema (33). Pomembna lastnost rakavih matičnih celic je njihova plastičnost oz. spo- sobnost prilagoditve na novo okolje s pridobitvijo no- vih lastnosti, ki bolj ustrezajo novemu okolju in s tem pridobitev hkratne odpornosti na več vrst zdravljenja (34). V nadaljevanju se bomo usmerili v opis uporabe teh- nologije na področju melanoma s poudarkom na novih dognanjih na področju razumevanja mehanizmov od- pornosti na zdravljenje ter prispevek te tehnologije k povečani učinkovitosti zdravljenja melanoma in razvo- ju posamezniku prilagojene, t.i. osebne medicine. 3 Melanom 3.1 Opredelitev melanoma Melanom je maligni tumor, ki nastane iz maligno transformiranih melanocitov (35). Nastane lahko kot posledica genetskih dejavnikov in dejavnikov okolja, predvsem izpostavljenosti sončnim žarkom. Najpogo- stejša mutacija, ki se pojavi pri 40 % bolnikov z melano- mom, je mutacija v genu BRAF. Gen BRAF nosi zapis za serin-treonin kinazo, ki deluje v signalni poti pre- našanja signalov od celičnih receptorjev do celičnega jedra (RAS/RAF/MAPK signalna pot). Sodi v skupino protoonkogenov, ki zaradi določenih mutacij delujejo kot onkogeni. Protein, ki nastane kot produkt onkoge- na BRAF z mutacijo na kodonu 600 (BrafV600), sproža nenehno signaliziranje preko encimov fibrosarkomske kinaze (angl. rapidly accelerated fibrosarcoma, RAF) in z mitogenom aktivirane proteinske kinaze (angl. mi- togen activated protein kinase, MAPK), kar povzroči številnejše delitve celice in njeno maligno preobrazbo (36). Zato igra onkogen BrafV600 pomembno vlogo pri nastanku in napredovanju tumorja ter verjetno pred- stavlja zgodnji dogodek v procesu nastanka rakaste ce- lice. Mutacij BrafV600 je več: mutacija V600E predsta- vlja več kot 90 % vseh opisanih mutacij v genu BRAF pri različnih tumorjih, mutacija V600K predstavlja 5 %, mutacija V600D pa <5 % vseh mutacij v kodonu V600 gena BRAF (37). Melanom se najpogosteje pojavi na koži, lahko pa tudi drugod, kjer so prisotni melanociti, npr. v očesu ali možganskih ovojnicah. Predstavlja približno 5 % vseh primerov kožnega raka in je glavni vzrok za 90 % smrti zaradi kožnega raka (38). Je eden pogostejših vrst raka v razvitem svetu, ki lahko hitro napreduje in 486 DERMATOLOGIJA, VENEROLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2023 | Letnik 92 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3411 ima najhitreje rastočo incidenco med rakavimi bolez- nimi. Najpogosteje se pojavlja pri svetlopoltih ljudeh, ki se čezmerno izpostavljajo UV žarkom. V Evropi je trenutno ocenjena incidenca 10–25 novih primerov na 100.000 prebivalcev, vendar pa vztrajno narašča v vseh starostnih skupinah, predvsem pa pri starejših od 60 let. Predvidevajo, da bo incidenca strmo naraščala še več desetletij (39). Približno 80–90 % vseh melanomov diagnosticirajo kot primarne tumorje, pri katerih še ni prišlo do zasevanja. Pri teh bolnikih je napoved izida zelo dobra, 10-letno preživetje pa ocenjeno na več kot 90%. Pri približno 10–20 % bolnikih pa bolezen napre- duje in pride do pojava zasevkov, ki so lahko regionalni (področne bezgavke) ali sistemski (drugi organi). Pri bolnikih z napredovalo boleznijo s sistemskim zaseva- njem je bila napoved izida zgodovinsko gledano zelo slaba, saj je bil delež bolnikov, ki so preživeli 5-letno ob- dobje po postavitvi diagnoze le 10–20 % (40). Z uvedbo novega sistemskega pristopa zdravljenja z imunoterapi- jo se je izid bistveno izboljšal, saj se je delež bolnikov, ki preživijo po 5 letih od postavitve diagnoze povečal na 40–50 % (41,42). 3.2 Zdravljenje melanoma 3.2.1 Kirurško zdravljenje Zdravljenje primarnega melanoma poteka s kirurško odstranitvijo celotne spremembe z varnostnim robom, ki je odvisen od debeline primarnega melanoma. Mini- malni varnostni rob je pri vseh invazivnih melanomih vsaj 1 cm. V primeru prisotnosti metastaz v področnih bezgavčnih ložah sledi tudi kirurška odstranitev le-teh. Ustrezno opravljena disekcija bezgavčne lože ne izklju- čuje povsem možnosti ponovitve bolezni v regionalni loži, na kar bistveno vplivata adjuvantno obsevanje in adjuvantno sistemsko zdravljenje (38). Danes se večina melanomov odkrije že v zgodnji fazi (melanom in situ ter začetno invazivni melanom v stadiju pT1a), katerih zdravljenje je izključno kirurško. 3.2.2 Obsevanje Obsevanje se običajno priporoča kot adjuvantna terapija po kirurški odstranitvi primarnega tumorja v primeru tesnega roba in kadar dodatna odstranitev ni več mogoča. Poleg tega se obseva tudi bolnike, pri kate- rih operacija ni mogoča, ko bi npr. operacija povzročila večjo kozmetično ali funkcionalno okvaro, in pri bol- nikih, ki odklonijo operacijo ali zanjo iz medicinskih razlogov niso sposobni. Obsevanje je priporočljivo tudi v primeru regionalne ali sistemsko razširjene bolezni, npr. po kirurški disekciji klinično pozitivnih področnih bezgavk ali pri nastanku zasevkov v možganih (38). 3.2.3 Sistemsko zdravljenje Sistemsko zdravljenje melanoma z zdravili poteka kot adjuvantno zdravljenje in zdravljenje metastastske bolezni. Adjuvantno zdravljenje je pooperativno zdravljenje z namenom zmanjšanja verjetnosti pono- vitve bolezni in podaljšanja celokupnega preživetja. Sistemsko zdravljenje vključuje kemoterapijo, tarčno zdravljenje z zaviralci RAF za bolnike, ki imajo mu- tacijo v genu BRAF, v kombinaciji z zaviralci MEK in imunoterapijo. Za zdravljenje metastatske bolezni se odločamo individualno pri vsakem bolniku, odvisno od prisotnosti mutacije v genu BRAF, obsežnosti me- tastatske bolezni, vrednosti laktatne dehidrogenaze, kliničnih znakov in simptomov bolezni, zmogljivosti bolnika in prisotnosti drugih sočasnih bolezni (38). Sistemska kemoterapija je popolnoma učinkovita pri le manj kot 5 % bolnikov z melanomom, zato se je poslužujemo šele v 2. ali 3. redu zdravljenja, odvisno od predhodne terapije in splošnega stanja bolnika. Kot kemoterapevtiki se večinoma uporabljajo dakarbazin, temozolamid, karboplatin/paklitaksel ter kombinirana terapija s cisplatinom ali njegovimi analogi v kombina- ciji z alkaloidi vinka in derivati nitrosečnine (38). Tarčno zdravljenje pride v poštev pri bolnikih, ki imajo potrjeno mutacijo v genu BRAF. Ne glede na vrsto mutacije (V600E, V600K ali V600D) se najpogo- steje uporabljajo zaviralci RAF v kombinaciji z zaviralci MEK (npr. dabrafenib v kombinaciji s trametinibom, vemurafenib v kombinaciji s kobimetinibom in enko- rafenib v kombinaciji z binimetinibom), saj je pri vseh teh mutacijah čezmerno aktivirana signalna pot RAS/ RAF/MAPK. V primeru kontraindikacij za uporabo zaviralcev MEK bolnike zdravimo z monoterapijo z zaviralci RAF, kot sta npr. dabrafenib in vemurafenib (38). Imunoterapevtiki so v zadnjih letih že nadomestili slabo učinkovito sistemsko zdravljenje s citostatiki pri bolnikih z napredovalim ali razsejanim melanomom, pri bolnikih z melanomom z velikim tveganjem za po- novitev po kirurški odstranitvi pa se uporabljajo kot dopolnilna oblika zdravljenja. Uporaba imunoterapije je tako bistveno izboljšala napoved izida in preživet- je bolnikov z napredovalim stadijem melanoma (43). Imunoterapija vključuje različne biološke molekule za spodbujanje in izboljšanje delovanja bolnikovega imun- skega sistema pri prepoznavanju in odstranjevanju 487 STROKOVNI ČLANEK Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic tumorskih celic (44). Zaviralci imunskih nadzornih točk veljajo za najobetavnejše imunoterapevtike doslej. Gre predvsem za monoklonska protitelesa ali fuzijske proteine, ki se specifično vežejo na imunske nadzorne točke, ki se nahajajo predvsem na citotoksičnih limfoci- tih T CD8+, ki infiltrirajo področje tumorja. Z onemo- gočanjem delovanja imunskih nadzornih točk pride do ponovne aktivacije limfocitov T, kar jim omogoči, da opravijo svojo primarno funkcijo – prepoznajo, uničijo in odstranijo tumorske celice (44). Trenutno so najbolj široko uporabljena monoklonska protitelesa proti cito- toksičnemu T-limfocitnemu antigenu (CTLA-4), pro- gramiranemu proteinu celične smrti 1 (PD-1) ali njego- vemu ligandu – programiranemu smrtnemu ligandu 1 (PD-L1), ki imajo dokazano učinkovite protitumorske učinke (45). Imunoterapija melanoma vključuje mo- noterapijo z nivolumabom ali pembrolizumabom (protitelesa proti PD-1) oz. kombinacijo anti-PD-1 s protitelesi anti-CTLA, tj. kombinacijo nivolumaba in ipilimumaba (38). Kljub napredku v režimu zdravljenja pa se 30–40 % bolnikov z melanomom na terapijo z zaviralci nadzor- nih točk ne odziva, 20–30 % bolnikov pa ponovno raz- vije melanom po koncu zdravljenja (12). To bi lahko pripisali predvsem velikemu številu genetsko različnih celic, ki sestavljajo tumorsko mikrookolje in se od bol- nika do bolnika razlikujejo. Glavni cilj raziskav na po- dročju melanoma je tako predvsem izboljšati učinko- vitost terapije, kar bo mogoče, ko bo odločitev za vrsto zdravljenja temeljila tudi na podatkih o celični in mole- kulski sestavi melanoma posameznega bolnika. Uporabnost tehnologije scRNAseq za vpeljavo bolniku prilagojene terapije se je že pokazala prav v raziskavah na področju onkologije, tudi na primerih melanoma, kjer so raziskovalci odkrili nove celične in molekulske označevalce, katerih izražanje je odvisno od odziva bolnika na zdravljenje. Nekatere primere bo- mo podrobneje opisali v nadaljevanju. 3.3 Tumorsko mikrookolje Melanom običajno nastane kot posledica mutacij v DNK melanocitov, kar vodi v porušenje celične home- ostaze in spremembo normalnega v maligni fenotip. Za melanom je značilno, da se celicam fenotip zelo spre- minja skozi čas in faze rasti tumorja (angl. phenotype switching), kar vodi v nastanek velikega števila različ- nih populacij celic istega tipa, ki sestavljajo tumor (46). Da se tumorske celice lahko neomejeno razmnožujejo in se izognejo prepoznavi imunskim celicam, morajo vzpostaviti svoje lastno mikrookolje, ki ga sestavljajo tudi normalne oz. nespremenjene celice. Sem sodi- jo predvsem imunske celice, celice, ki sestavljajo žilni sistem in fibroblasti. Tumorsko mikrookolje igra po- membno vlogo pri rasti in razraščanju tumorja ter pri odzivu malignih celic na zdravljenje z določeno tera- pijo (47). Manjši del tumorskega mikrookolja so tudi matične rakaste celice, ki v zadnjem času postajajo vse bolj zanimive za raziskave z vidika razumevanja meha- nizmov razraščanja tumorja in odpornosti na zdravlje- nje ter za razvoj novih terapevtskih tarč (33). Da bi razumeli mehanizem nastanka in napredova- nja tumorjev ter odziv na zdravljenje, je nujno prou- čevanje fenotipa in funkcije tako malignih tumorskih celic kot tudi celic tumorskega mikrookolja (rakavih matičnih celic in normalnih celic, predvsem imunskih) ter dinamike medsebojnega delovanja. 3.3.1 Raznolikost maligno spremenjenih celic znotraj tumorjev Prav velika raznolikost v fenotipu malignih celic znotraj tumorja in spreminjanje le-tega je eden glav- nih razlogov, zakaj se nekateri bolniki ne odzivajo na zdravljenje z določeno terapijo oz. po odzivu doživijo ponovni zagon bolezni (48). Ugotovili so že, da obsta- jata dva glavna fenotipa malignih celic, ki sestavljajo melanom. Na podlagi zastopanega fenotipa lahko me- lanome ločujemo med seboj in se odločamo za različno zdravljenje. Za melanocitni fenotip je značilna priso- tnost malignih celic z velikim izražanjem gena MITF, ki kodira transkripcijski faktor za melanocite in spo- sobnost pigmentacije. Za mezenhimski fenotip je zna- čilna večja sposobnost migriranja in izražanje gena za receptor tirozinske kinaze AXL. Bolniki, ki imajo pri- soten mezenhimski fenotip z velikim izražanjem AXL, so odporni na zdravljenje z zaviralci tirozinskih kinaz, kot sta dabrafenib in trametinib (49,50). V preteklosti je veljalo prepričanje, da so lahko v tumorju prisotne ali zgolj maligne celice z velikim izražanjem MITF ali zgolj maligne celice z velikim izražanjem AXL, ne pa obo- je. Nato pa so Tirosh in sod. (51) leta 2019 z uporabo scRNAseq ugotovili, da je tudi pri bolnikih (v študijo je bilo vključenih 19 bolnikov z melanomom), pri katerih prevladujejo celice z velikim izražanjem MITF, v manj- ši meri prisotnih nekaj celic z velikim izražanjem AXL, ki jih s konvencinalnim sekvenciranjem RNK ni bilo moč zaznati. Poleg tega so v tej študiji ugotovili tudi, da se bolnikom po zdravljenju z zaviralci tirozinskih kinaz in po razvoju odpornosti število AXL pozitivnih celic še poveča (51). 488 DERMATOLOGIJA, VENEROLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2023 | Letnik 92 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3411 Na fenotip malignih celic in s tem na fenotip tumor- ja pomembno vpliva komunikacija med tumorskimi celicami in njihovim okoljem (51). Fenotip maligno spremenjenih melanocitov pa vpliva tudi na celični tip infiltriranih imunskih celic, kar je neposredno poveza- no z odzivom na imunoterapijo. Tako je npr. infiltracija tumorja z limfociti T povezana z boljšim odzivom na imunoterapijo in daljšim preživetjem. Povezavo med fenotipom malignih celic in infiltracijo z limfociti T je bilo doslej težko dokazati in razumeti. Z uporabo scR- NAseq pa so Jerby-Arnon in sod. (52) natančno dolo- čili fenotip malignih celic, ki je povezan z infiltracijo limfocitov T CD8+. Pri bolnikih, ki se na zdravljenje z anti-PD1 in anti-CTLA4 ne odzivajo, je prisoten še pred začetkom zdravljenja. Količina celic s tovrstnim fenoti- pom se po uvedbi imunoterapije še poveča, ne vpliva pa na odziv na zdravljenje z zaviralci RAF/MEK. Za ta fe- notip je bilo značilno povečano izražanje genov, vplete- nih v prepoznavo in predstavitev antigenov (npr. B2M, CTSB, HLA-A/B/C), signalna pot interferona gama, odziv na komponente komplementnega sistema (CD59 in C4A), prav tako je bilo značilno povečano izražanje gena za encim od ciklina odvisne kinaze 4 (CDK4). V študiji so dokazali, da lahko zaviralec CDK4/6 palboci- klib spremeni fenotip malignih celic ter omogoči limfo- citom T prepoznavo in odstranitev malignih celic, kar bi za bolnike s tem fenotipom pomenilo boljši odziv na imunoterapijo s palbociklibom (52). 3.3.2 Imunske celice Imunske celice, ki migrirajo na območje tumorja, igrajo pomembno vlogo pri prepoznavi in odstranitvi malignih celic. Za melanom je značilna predvsem in- filtracija z limfociti T CD8+, ki se v tumorskem okolju lahko diferencirajo v efektorske, spominske ali citoto- ksične celice, kar zagotovi ustrezno protitumorsko ak- tivnost in uničenje tumorskih celic (53). Med bolniki z melanomom pa obstajajo razlike v tem, kateri tip imun- skih celic prevladuje v tumorskem okolju, kar je odvis- no tudi od prisotnosti mutacije v genu BRAF. Bolniki z mutacijo v genu BRAF imajo prisotnih več limfocitov T pomagalk in limfocitov B, medtem ko imajo tisti brez mutacije več citotoksičnih limfocitov T in makrofagov. Pri bolnikih z mutacijo BRAF so ugotovili tudi pove- zavo med večjim številom infiltriranih limfocitov B in daljšim časom preživetja. Različno imunsko okolje pa vpliva tudi na odziv na zdravljenje z zaviralci imunskih nadzornih točk, saj je to bolj uspešno pri bolniki z mu- tacijo BRAF (5-letno preživetje pri bolnikih z mutacijo je 60 %, pri bolnikih brez mutacije pa 48 %) (54). Pogosto pri bolnikih z melanomom opazimo tudi infiltracijo drugačne populacije limfocitov T CD8+, t.i. izčrpanih limfocitov (angl. exhausted lymphocytes), ki so fenotipsko spremenjeni, imajo povečano izraža- nje receptorjev za zaviralce imunskih nadzornih točk, npr. PD1, in niso več zmožni opravljati svoje efektorske funkcije. Izčrpani limfociti delujejo imunosupresivno in ne več protitumorsko; na tumorske celice postane- jo tolerantni, jih ne prepoznajo in ne uničijo, posledi- ca pa je razrast tumorja (55). Infiltracija večjega števila izčrpanih limfocitov T je povezana s slabšo napovedjo izida, medtem ko je infiltracija večjega števila spomin- skih in citotoksičnih limfocitov T povezana z boljšim izidom. Številčno se populacija citotoksičnih limfo- citov T zmanjša v poznejših stadijih boleznih, število izčrpanih limfocitov T pa se poveča. Izčrpani limfociti T so fenotipsko različni od ostalih subpopulacij limfo- citov T CD8+, saj imajo povečano izražanje genov, ki so vpleteni v signalne poti imunskih nadzornih točk PD-1 in CTLA-4. Prav tako izčrpani limfociti T CD8+ po- večano izražajo 3 gene (PMEL, TYRP1 in EDNRB), ki so povezani s slabšim izidom in bi lahko v prihodnosti predstavljali pomembne tarče za zdravljenje melanoma (56). Prisotnost različnih populacij infiltriranih imun- skih celic je povezana z odzivom na zdravljenje z za- viralci imunskih nadzornih točk. V študiji, ki je vklju- čevala največje število bolnikov z melanomom doslej, so Sade-Feldman in sod. (57) s pomočjo scRNAseq določili transkriptome več kot 16.000 imunskih celic iz 48 bolnikov z melanomom, zdravljenih z zaviralci imunskih nadzornih točk. Ugotovili so prisotnost dveh populacij citotoksičnih limfocitov T, ki se razlikujeta v izražanju transkripcijskega dejavnika TCF7. Prisotnost TCF7 na limfocitih T CD8+ je napovedala dober od- ziv na zdravljenje z zaviralci imunskih nadzornih točk in ugoden klinični izid. V študiji so odkrili tudi pove- čano izražanje gena za CD39 na populaciji izčrpanih limfocitov T. Odstranitev limfocitov T CD8+ CD39+ ex vivo iz tumorskih infiltratov pred uvedbo zdravlje- nja z anti-PD1 je prispevala k večji učinkovitosti pre- poznave in odstranjevanja tumorskih celic. Uporabo zaviralcev CD39 v kombinaciji s protitelesi proti PD1 ali CTLA4 predlagajo kot novo kombinirano terapijo, ki bi lahko bila bolj uspešna pri zdravljenju melanoma (57). Prisotnost dveh populacij citotoksičnih limfoci- tov T v tumorskem okolju so kasneje potrdili tudi Li in sod. (58). Ugotovili so tudi, da se le ena od obeh po- pulacij fenotipsko spremeni in postane nefunkcional- na oz. izčrpana. Na začetku fenotipske spremembe se limfociti T intenzivno razmnožujejo, vendar se kasne- je, ko že pridobijo fenotip izčrpanih celic in postanejo 489 STROKOVNI ČLANEK Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic nefunkcionalni, njihovo razmnoževanje ustavi. Količi- na izčrpanih limfocitov T CD8+ je neposredno pove- zana z odzivom imunskega sistema na tumorske celice. Čim več je izčrpanih celic, tem slabši je imunski od- ziv in slabši je izid (58). Kim in sod. (59) so analizirali obstoječe zbirke podatkov, pridobljenih s tehnologijo scRNAseq, pri čemer so se osredinili na limfocite T CD8+, ki tvorijo tumorsko mikrookolje. Ugotovili so, da se izražanje transkripcijskega dejavnika TOX pove- ča, ko limfociti CD8+ postanejo izčrpani in da lahko na podlagi izražanja TOX predvidimo preživetje in učin- kovitost terapije s protitelesi proti PD1. Avtorji študije predlagajo, da bi na podlagi izražanja TOX bolnike lah- ko razdelili v podskupine in se bolj ciljano odločali za terapijo. TOX pa bi lahko predstavljal tudi pomembno novo tarčo za zdravljenje melanoma (59). Čeprav je uvedba imunoterapije z zaviralci imun- skih nadzornih točk bolnikom z melanomom omogo- čila veliko boljši izid in preživetje, še vedno ostaja velik delež bolnikov, ki se na tovrstno terapijo ne odziva ali pa doživi ponovni zagon bolezni po tem, ko je terapija že pokazala učinkovitost. Kljub intenzivnim raziska- vam na tem področju trenutno še ni na voljo biolo- škega označevalca, ki bi zanesljivo napovedal odziv na zdravljenje ali ponovni zagon bolezni. Idealno bi bilo biološki označevalec, ki bi nam napovedal izid zdravlje- nja, meriti v krvi ali serumu bolnikov, saj bi tako vzorec pridobili na minimalno invaziven način brez potrebe po biopsiji. S tem namenom so z aplikacijo scRNAseq Li in sod. (60) preučevali populacije limfocitov T CD8+ v krvi in v tumorskem tkivu bolnikov z melanomom. Ugotovili so, da je tako v tumorju kot v krvi prisotna specifična populacija limfocitov T CD8+, ki imajo po- večano izražanje genov, povezanih z oksidativnim stre- som (OXPHOS). Ti limfociti T pa izražajo tako gene, ki označujejo sposobnost citotoksičnosti kot tudi gene, ki nakazujejo na nefunkcionalnost oz. izčrpanost. Pri- sotnost OXPHOS pozitivnih limfocitov T CD8+ v krvi je povezana z odpornostjo na zdravljenje z zaviralci imunskih nadzornih točk. Določanje deleža OXPHOS pozitivnih celic v krvi bi tako lahko prispevala k napo- vedovanju odziva na zdravljenje z imunoterapijo, obe- nem pa bi lahko z inhibicijo teh celic izboljšali učinko- vitost zdravljenja (60). V zadnjem času se pri raziskovanju tumorje infil- trirajočih imunskih celic pozornost poleg limfocitom T posveča tudi celicam, ki pripadajo mieloični liniji in so značilne za prirojeni imunski odziv. Uporaba scR- NAseq na izoliranih mononuklearnih celicah iz krvi je pokazala, da sta prisotnost večjega števila monocitov in manjše razmerje med številom limfocitov T pomagalk in monocitov povezana s slabšim izidom in slabšim od- zivom na zdravljenje s protitelesi anti-PD1. Tudi večje izražanje gena za S100A9 na monocitih je bilo poveza- no s slabšim izidom, kar bi nam lahko predstavljajo po- tencialen biološki označevalec za odziv na zdravljenje, pridobljen z minimalno invazivnim odvzemom venske krvi (61). Tudi Choi in sod. (62) so ugotovili, da je pri- sotnost specifičnih s tumorjem povezanih makrofagov povezana z odpornostjo na zdravljenje z imunoterapi- jo. Posameznocelična analiza tumorskih tkiv pred in po uvedbi zdravljenja z imunoterapevtiki je pokazala, da se izražanje genov, vpletenih v metabolizem gluko- ze (npr. GLUT1 in GLUT3), na makrofagih razlikuje glede na odziv bolnika na zdravljenje. Bolnikom, ki se na zdravljenje niso odzvali, se je povečalo število spe- cifične populacije makrofagov s povečanim izražanjem genov za GLUT1, PDL1, OXPHOS in genov, značilnih za fenotip M2 (62). S ponovno analizo že obstoječih podatkov scRNA- seq bolnikov z melanomom, zdravljenih z zaviralci imunskih nadzornih točk, so Xiong in sod. (63) pri bol- nikih, ki se na terapijo niso odzvali, prepoznali skupino makrofagov s povečanim izražanjem gena za TREM2, ki imajo tudi povečano izražanje genov, vpletenih v aktiviranje komplementnega sistema, kar je dokazano povezano z razraščanjem tumorja in slabšim izidom. Poleg tega so pri bolnikih, ki se na zdravljenje niso od- zvali, določili večje število limfocitov T gama-delta, ki imajo zmanjšano aktivnost protitumorskega interfero- na gama in s tem zmanjšano učinkovitost odstranje- vanja tumorskih celic (63). Kasneje so povezavo med aktivirano signalno potjo interferona gama in boljšim odzivom na zdravljenje z imunoterapijo potrdili v več različnih študijah (64,65). Vendar pa so Vanmeerbeek in sod. (66) ugotovili, da interferon gama ni zanesljiv biološki označevalec odziva na imunoterapijo s proti- telesi anti-PD1 pri bolnikih, ki so bili najprej zdravljeni s protitelesi anti-CTLA4, v primerjavi z bolniki, ki prej še niso prejeli imunoterapije, zato so v svojo študijo vključili bolnike, ki so zaporedoma prejemali terapijo anti-CTLA4 in anti-PD1. Ugotovili so, da so v tem pri- meru označevalci, povezani z aktiviranjem spominskih limfocitov T, ki so odporni na apoptozo, boljša izbira za napoved ugodnega odziva na zdravljenje z anti-PD1. Tako so dokazali, da uvedba imunoterapije lahko bi- stveno vpliva na tumorsko mikrookolje, predvsem na fenotip limfocitov T, kar lahko značilno vpliva na napo- vedno vrednost tumorskih označevalcev (66). Pregled uporabe tehnologije sekvenciranja RNK na ravni posameznih celic (scRNAseq) pri bolnikih z me- lanomom prikazuje Tabela 1. 490 DERMATOLOGIJA, VENEROLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2023 | Letnik 92 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3411 Vrsta vzorca (število) Tip celic (število) Glavne ugotovitve Doprinos tehnologije scRNAseq Ref. Tkivo kožnega melanoma bolnikov (n=19) maligne, imunske in stromalne (n=4.645) Pri bolnikih, pri katerih prevladujejo maligne celice z velikim izražanjem gena za MITF, so v manjšem številu prisotne tudi celice z velikim izražanjem AXL in so odporne na zdravljenje z zaviralci RAF/ MEK, njihovo število se po zdravljenju še poveča. Hkratna določitev vseh glavnih celičnih komponent tumorja, njihovih genomskih in molekulskih značilnosti ter določitev dejavnikov, ki vplivajo na klinični odziv bolnika na zdravljenje. Natančna določitev subpopulacij celic in vzorcev njihovega genskega izražanja bo omogočila bolj informirano analizo rezultatov konvencionalnih metod sekvenciranja in bolj ciljan pristop zdravljenja. (51) Tkivo kožnega melanoma bolnikov (n=21) maligne, imunske in stromalne (n=7.186) Fenotip malignih celic (povečano izražanje CDK4) vpliva na infiltracijo limfocitov T CD8+, zaviralec CDK4/6 palbociklib vpliva na fenotip malignih celic in izboljša odziv na zdravljenje z imunoterapevtiki. Določitev fenotipa malignih celic, ki vplivajo na razvoj odpornosti na zdravljenje z anti-PD1 imunoterapijo, določitev novih terapevtskih tarč (CDK4), ki bi ob hkratni uvedbi imunoterapije bistveno izboljšale odziv na zdravljenje. (52) Analiza obstoječih zbirk podatkov levkociti CD45+ (ND) Bolniki z mutacijo v genu BRAF imajo prisotnih več limfocitov T CD4+ in limfocitov B, medtem ko imajo tisti brez mutacije več limfocitov T CD8+ in makrofagov. Večje število infiltriranih limfocitov B je povezano z daljšim časom preživetja. Sestava imunskih celičnih populacij v tumorskem mikrookolju je različna pri bolnikih z mutacijo gena BRAF v primerjavi z bolniki, ki te mutacije nimajo. Ne le fenotip imunskih in malignih celic, tudi mutacija v genu BRAF vpliva na odziv na zdravljenje z imunoterapevtiki. (54) Analiza obstoječih zbirk podatkov limfociti T CD8+ (n=10.861) Večja infiltracija izčrpanih limfocitov T je povezana s slabšo napovedjo izida, večja infiltracija spominskih in citotoksičnih limfocitov T CD8+ pa z boljšo. Število izčrpanih limfocitov T CD8+ se poveča v poznejših stadijih boleznih. Izčrpani limfociti T povečano izražajo 3 gene (PMEL, TYRP1, EDNRB), ki so povezani s slabšim izidom. Različne subpopulacije limfocitov T CD8+ različno vplivajo na prognozo bolezni, napredovanje rasti tumorja in na odziv bolnika na imunoterapijo. Odkritje novih potencialnih tarč (PMEL, TYRP1 in EDNRB) za zdravljenje melanoma. (56) Tkivo kožnega melanoma bolnikov (n=48) levkociti CD45+ (n=16.291) Prisotnost TCF7 na limfocitih T CD8+ je napovedala dober odziv na zdravljenje z zaviralci nadzornih točk in ugoden klinični izid. V študiji so odkrili tudi povečano izražanje gena za CD39 na populaciji izčrpanih limfocitov T. Odstranitev limfocitov T CD8+ CD39+ ex vivo iz tumorskih infiltratov pred uvedbo zdravljenja z anti-PD1 je prispevala k večji učinkovitosti prepoznave in odstranjevanja tumorskih celic. Odkritje nove tarče za zdravljenje melanoma CD39, ki ga izražajo izčrpani limfociti T. Kombinacija terapije, usmerjene proti CD39, z imunoterapevtiki bi lahko bistveno izboljšala odziv na zdravljenje bolnikov z melanomom. Rezultati študije bi lahko vplivali na načrtovanje kliničnih preskušanj za anti-PD1 imunoterapijo, v katere bi selektivno vključili bolnike na podlagi prisotnosti različnih subpopulacij limfocitov T, kar bi pripomoglo k večjemu uspehu kliničnega preskušanja. (57) Tkivo kožnega melanoma bolnikov (n=25) limfociti T CD3+ (n=29.825) Večje število izčrpanih limfocitov T CD8+ je povezano s slabšim imunskim odzivom in slabšim izidom. Izčrpani limfociti T CD8+ so največja prisotna populacija v tumorskem mikrookolju, ki se intenzivno deli in diferencira. Določitev dinamike spreminjanja infiltratov limfocitov T skozi časovna obdobja. Populacijo izčrpanih limfocitov T CD8+ bi v prihodnje bilo smiselno dojemati kot aktivno in intenzivno delečo se populacijo celic, ki pomembno vpliva na odzivnost tumorja. (58) Analiza obstoječih zbirk podatkov limfociti T CD8+ (n=4.645) Izražanje transkripcijskega dejavnika TOX se poveča, ko limfociti T CD8+ postanejo izčrpani. Izražanje TOX je povezano z večjim izražanjem imunskih nadzornih točk. Na podlagi izražanja TOX lahko predvidimo preživetje in učinkovitost terapije s protitelesi proti PD1. Določitev dejavnikov, ki so vpleteni v razvoj izčrpanih limfocitov T. Zaviralci TOX bi lahko zmanjšali število izčrpanih limfocitov T CD8+ in izboljšali učinkovitost imunoterapije. No podlagi izražanja TOX bi lahko bolnike selektivno izbrali za terapijo z anti-PD1 protitelesi. (59) Tabela 1: Pregled uporabe tehnologije sekvenciranja RNK na ravni posameznih celic (scRNAseq) pri bolnikih z melanomom. 491 STROKOVNI ČLANEK Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic Legenda: AXL – tirozinsko-kinazni receptor; BRAF – serin/treonin-protein kinaza B-Raf; CDK – od ciklina odvisna kinaza; CTLA4 – citotoksični T-limfocitni antigen 4; EDNRB – endotelni receptor tipa B; GLUT1 – prenešalec glukoze 1; IFN – interferon; MEK – z mitogenom aktivirana proteinska kinaza; mononuk. – mononuklearne; ND – nedefinirano; OXPHOS – oksidativna fosforilacija; PD1 – programirani protein celične smrti 1; PDL1 – programirani smrtni ligand 1; PMEL – pre-melanosomski protein; RAF – fibrosarkomska kinaza; Ref. – referenca; TCF7 – transkripcijski dejavnik 7; TOX – visokomobilni protein, povezan s selekcijo timocitov; TREM2 – sprožilni receptor, izražen na mieloidnih celicah 2; TYRP1 – s tirozinazo povezan protein 1. Vrsta vzorca (število) Tip celic (število) Glavne ugotovitve Doprinos tehnologije scRNAseq Ref. Tkivo kožnega melanoma in kri bolnikov (n=8) limfociti T CD8+ (n=173.061) Povečano izražanje genov OXPHOS na limfocitih T CD8+ iz tumorskega tkiva in krvi bolnikov je povezano z odpornostjo na zdravljenje z zaviralci imunskih nadzornih točk. Razvoj modela na podlagi limfocitov T CD8+ OXPHOS+, ki z veliko točnostjo razlikuje med bolniki, ki se odzivajo na zdravljenje z zaviralci imunskih nadzornih točk, in tistimi, ki se ne. Na novo identificirana populacija celic bi lahko predstavljala tudi novo tarčo za zdravljenje melanoma. (60) Kri bolnikov z melanomom (n=8) mononuk. celice (n=50.000) Večje število monocitov in manjše razmerje med številom limfocitov T pomagalk in monocitov v krvi sta povezana s slabšo prognozo in slabšim odzivom na zdravljenje s protitelesi anti-PD1. Večje izražanje gena za S100A9 na monocitih je povezano s slabšo prognozo. Poleg limfocitne lahko tudi mieloična linija celic vpliva na odziv bolnikov na zdravljenje z anti-PD1 terapijo. Določanje izražanja S100A9 bi lahko služilo kot napovedni biološki označevalec za odziv na zdravljenje z anti-PD1. (61) Analiza obstoječih zbirk podatkov levkociti CD45+ (ND) Bolniki, ki se na zdravljenje z imunoterapijo niso odzvali, imajo v tumorskem mikrookolju prisotno populacijo makrofagov s povečanim izražanjem genov za GLUT1, PDL1, OXPHOS in genov, značilnih za fenotip M2. Poglobljena analiza genov vpletenih v metabolizem glukoze, izraženih predvsem na makrofagih v tumorskem mikrookolju, bi lahko vplivala na razvoj novih terapevtskih tarč in izboljšala odziv na zdravljenje melanoma z imunoterapijo. (62) Analiza obstoječih zbirk podatkov levkociti CD45+ (n=16.291) Bolniki, ki se na terapijo z zaviralci nadzornih točk ne odzivajo, imajo prisotne makrofage s povečanim izražanjem gena za TREM2 in genov, vpletenih v aktivacijo komplementnega sistema, ter večje število limfocitov T gama-delta, ki imajo zmanjšano protitumorsko aktivnost. Razvoj novega algoritma (ImmuneCells.Sig), s katerim lahko na podlagi analize izražanja genov imunskih celic napovemo odziv bolnikov na imunoterapijo. (63) Tkivo kožnega melanoma bolnikov (n=48) maligne, imunske in stromalne (16.291) Označevalec IFN gama, prisoten na limfocitih T CD8+ in CD4+, ni uporaben za napoved odziva na zdravljenje s protitelesi anti-PD1 pri bolnikih, ki so bili predhodno že zdravljeni s protitelesi anti-CTLA4. Geni, ki so povezani s spominskimi limfociti T, sposobnimi odpornosti na celično apoptozo, so bolj uporabni za napoved odziva na zdravljenje pri teh bolnikih. Uvedba imunoterapije lahko bistveno vpliva na tumorsko mikrookolje, predvsem na fenotip limfocitov T, kar lahko bistveno vpliva na napovedno vrednost tumorskih označevalcev. (66) 4 Vloga tehnologije scRNAseq na drugih področjih znanosti/medicine Tehnologija scRNAseq se danes že uporablja na pod- ročjih raziskav tako pri človeku kot pri živalih in rastli- nah. Omogoča bolj točno in hitro prepoznavanje redkih in novih celic v tkivu. S pridobljenimi informacijami o izražanju genov na ravni mRNA in beljakovin ter med- celični komunikaciji in prostorski organizaciji različnih tipov celic v tkivu je mogoče ugotavljati tovrstne razlike med zdravim in bolezenskim stanjem. Tako se na področju humane medicine z scRNAseq profilirajo, identificirajo, klasificirajo in odkrivajo novi in redki tipi in podtipi celic v organih in tkivih, npr. v raziskavah biologije raka, razvojne biologije, imuno- logije, sladkorne bolezni, mikrobiologije (vključno s covidom-19), žilne biologije, nevrobiologije, klinične diagnostike in na številnih drugih področjih. Na nobe- nem področju pa trenutno tehnologija scRNAseq še ni uvedena v rutinsko klinično prakso (67). 492 DERMATOLOGIJA, VENEROLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2023 | Letnik 92 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3411 Slika 2: Uporaba tehnologije sekvenciranja RNK na nivoju posamezne celice (scRNAseq) za razvoj osebne medicine pri bolnikih z melanomom. Tehnologijo lahko uporabimo tako na tkivnih vzorcih tumorja kot tudi na vzorcih odvzete krvi, da z visoko ločljivostjo določimo fenotip različnih vrst celic (malignih, imunskih, stromalnih) v različnih obdobjih bolezni pri različnih bolnikih na nivoju posamezne celice. Tako lahko natančno opredelimo celično in molekulsko sestavo tumorja pri določenem bolniku in določimo zanesljive in specifične biološke označevalce ter molekularne poti, povezane z boleznijo in odpornostjo na zdravljenje. Na podlagi celičnih in molekulskih značilnosti ter bioloških označevalcev bomo lahko bolnike po podobnosti razdelili v posamezne manjše skupine in jim prilagodili zdravljenje, ki bo bolj učinkovito. Legenda: MM – melanom; scRNAseq – sekvenciranje RNK na nivoju posamezne celice. Vir: Tadeja Kuret, lasten arhiv. 5 Vizija tehnologije scRNAseq v prihodnosti Čeprav je v zadnjih letih uvedba zdravljenja z zaviral- ci imunskih nadzornih točk bistveno izboljšala napoved izida za bolnike z napredovalim stadijem melanoma, se še vedno veliko bolnikov ne odzove na terapijo ali pa ne dosežejo dolgotrajne remisije. Trenutno pri zdravljenju melanoma ostajata dva glavna izziva: prvi je iskanje no- vih načinov, terapevtskih tarč in kombinacij zdravljenja, ki bi povečali učinkovitost zaviralcev imunskih nadzor- nih točk, brez sočasnega povečanja sistemske toksič- nosti, drugi izziv pa predstavlja ustrezen način selekcije kandidatnih bolnikov, ki se bodo ustrezno odzvali na imunoterapijo in ne bodo razvili odpornosti. Razlogov za razvoj odpornosti na zdravljenje posamezne ali več različnih vrst terapij je lahko več in se lahko razlikuje- jo od bolnika do bolnika. Prav zato bo v prihodnosti postala pomembna poglobljena analiza celične sestave melanoma vsakega posameznega bolnika ter vpliv le-te na učinkovitost zdravljenja. Novi podatki, pridobljeni z naprednimi visokozmogljivostnimi tehnologijami z ločljivostjo posamezne celice, so razkrili, da je meha- nizem odpornosti na zdravljenje z zaviralci imunskih nadzornih točk zelo kompleksen, da na to poleg priso- tnosti in fenotipa izčrpanih limfocitov T CD8+ vpliva tudi mutacija v genu BRAF, fenotip malignih melano- citov, prisotnost in fenotip celic mieloičnega izvora, pri- sotnost fibroblastov različnega fenotipa ter interakcije med vsemi celicami, ki tvorijo tumorsko mikrookolje. V prihodnosti bo torej vse bolj pomemben oseben pristop zdravljenja, ki bo temeljil na molekularni in ce- lični opredelitvi tumorja in njegovega mikrookolja ter na napovednih bioloških označevalcih (Slika 2). Z ra- zvojem in uporabo tehnologije scRNAseq se bomo lah- ko cilju osebne medicine zelo približali, saj nam omogo- ča identificirati posamezne celice in celične označevalce, ki bi lahko napovedali odziv bolnika na zdravljenje in omogoča bolj ciljano odločitev za vrsto zdravljenja, ki bi jo uporabili pri posameznem bolniku ali manjši skupini bolnikov. Na ta način bi se lahko izognili pogosto upo- rabljenemu principu zdravljenja, ki temelji na “poskusu in napaki (angl. trial-and-error)” ter tako bistveno iz- boljšali učinkovitost zdravljenja. Tovrsten princip, ki se bolj osredinja na posamezne- ga bolnika in temelji na celični in molekulski opredelitvi tumorja, bi lahko v prihodnosti pomembno vplival tudi na ustreznejše načrtovanje in izbor ustreznih bolnikov za določeno klinično študijo ter tako povečal uspeh kli- ničnih preskušanj. V prihodnosti lahko pričakujemo nov val razvoja učinkovitejših terapij za zdravljenje me- lanoma prav zaradi bistvenega napredka v tehnologijah, kot je scRNAseq, s katerimi lahko zelo natančno določi- mo genomske in transkriptomske značilnosti na tisoče posameznih celic v tumorskem mikrookolju naenkrat. Tako prepoznamo nove možne napovedne označevalce za odziv na zdravljenje in nove terapevske tarče, ki bi povečale učinkovitost imunoterapije. 493 STROKOVNI ČLANEK Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic 6 Zaključek Trenutno je uporaba tehnologije scRNAseq v medici- ni, vključno z obravnavo bolnikov z melanomom, ome- jena le na znanstveno-raziskovalno delo in še ni uvedena v klinično prakso. Verjamemo, da bo zaradi velike ko- ličine celično specifičnih transkriptomskih podatkov in velikega potenciala za odkrivanje novih znanj na osnovi teh podatkov z nadaljnjim tehnoloških razvojem, z ra- zvojem standardnih laboratorijskih in bioinformatskih delotokov ter z znižanjem cene kmalu omogočen tudi prenos rezultatov scRNAseq v klinično prakso. Izjava o navzkrižju interesov Avtorji nimamo navzkrižja interesov. Zahvala Članek je nastal ob podpori raziskovalne infrastruk- ture ELIXIR-SI (https://elixir-slovenia.org), ki jo finan- cirajo Evropski sklad za regionalni razvoj, Ministrstvo za izobraževanje, znanost in šport ter Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije. Literatura 1. International Human Genome Sequencing ConsortiumFinishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 2004;431(7011):931-45. DOI: 10.1038/nature03001 PMID: 15496913 2. Hood L, Rowen L. The Human Genome Project: big science transforms biology and medicine. Genome Med. 2013;5(9):79. DOI: 10.1186/gm483 PMID: 24040834 3. Preston J, VanZeeland A, Peiffer DA. Innovation at Illumina: The road to the $600 human genome. San Diego: Illumina; 2023 [cited 2023 Mar 20]. Available from: https://www.nature.com/articles/d42473-021-00030-9. 4. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 2009;10(1):57-63. DOI: 10.1038/nrg2484 PMID: 19015660 5. Anchang CG, Xu C, Raimondo MG, Atreya R, Maier A, Schett G, et al. The Potential of OMICs Technologies for the Treatment of Immune-Mediated Inflammatory Diseases. Int J Mol Sci. 2021;22(14):7506. DOI: 10.3390/ ijms22147506 PMID: 34299122 6. 6Kuksin M, Morel D, Aglave M, Danlos FX, Marabelle A, Zinovyev A, et al. Applications of single-cell and bulk RNA sequencing in onco-immunology. Eur J Cancer. 2021;149:193-210. DOI: 10.1016/j.ejca.2021.03.005 PMID: 33866228 7. Zhao M, Jiang J, Zhao M, Chang C, Wu H, Lu Q. The Application of Single-Cell RNA Sequencing in Studies of Autoimmune Diseases: a Comprehensive Review. Clin Rev Allergy Immunol. 2021;60(1):68-86. DOI: 10.1007/s12016-020-08813-6 PMID: 33236283 8. Method of the year 2013. Nat Methods. 2014;11(1):1. DOI: 10.1038/ nmeth.2801 PMID: 24524124 9. Shaffer SM, Dunagin MC, Torborg SR, Torre EA, Emert B, Krepler C, et al. Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance. Nature. 2017;546(7658):431-5. DOI: 10.1038/ nature22794 PMID: 28607484 10. Picelli S. Single-cell RNA-sequencing: the future of genome biology is now. RNA Biol. 2017;14(5):637-50. DOI: 10.1080/15476286.2016.1201618 PMID: 27442339 11. Matthews NH, Li WQ, Qureshi AA, Weinstock MA, Cho E. Epidemiology of Melanoma. In: Ward WH, Farma JM, eds. Cutaneous Melanoma: Etiology and Therapy. 5th ed. Brisbane: codon Publications; 2017. 12. Vukadin S, Khaznadar F, Kizivat T, Vcev A, Smolic M. Molecular Mechanisms of Resistance to Immune Checkpoint Inhibitors in Melanoma Treatment: an Update. Biomedicines. 2021;9(7):835. DOI: 10.3390/biomedicines9070835 PMID: 34356899 13. Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 2009;6(5):377- 82. DOI: 10.1038/nmeth.1315 PMID: 19349980 14. Liu S, Trapnell C. Single-cell transcriptome sequencing: recent advances and remaining challenges. F1000 Res. 2016;5:5. DOI: 10.12688/ f1000research.7223.1 PMID: 26949524 15. Lee J, Hyeon DY, Hwang D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Exp Mol Med. 2020;52(9):1428-42. DOI: 10.1038/ s12276-020-0420-2 PMID: 32929225 16. Hedlund E, Deng Q. Single-cell RNA sequencing: technical advancements and biological applications. Mol Aspects Med. 2018;59:36-46. DOI: 10.1016/j.mam.2017.07.003 PMID: 28754496 17. Hu P, Zhang W, Xin H, Deng G. Single Cell Isolation and Analysis. Front Cell Dev Biol. 2016;4:116. DOI: 10.3389/fcell.2016.00116 PMID: 27826548 18. Kolodziejczyk AA, Kim JK, Svensson V, Marioni JC, Teichmann SA. The technology and biology of single-cell RNA sequencing. Mol Cell. 2015;58(4):610-20. DOI: 10.1016/j.molcel.2015.04.005 PMID: 26000846 19. Prakadan SM, Shalek AK, Weitz DA. Scaling by shrinking: empowering single-cell ‘omics’ with microfluidic devices. Nat Rev Genet. 2017;18(6):345-61. DOI: 10.1038/nrg.2017.15 PMID: 28392571 20. Jammes FC, Maerkl SJ. How single-cell immunology is benefiting from microfluidic technologies. Microsyst Nanoeng. 2020;6(1):45. DOI: 10.1038/s41378-020-0140-8 PMID: 34567657 21. Klein AM, Mazutis L, Akartuna I, Tallapragada N, Veres A, Li V, et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 2015;161(5):1187-201. DOI: 10.1016/j.cell.2015.04.044 PMID: 26000487 22. Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 2015;161(5):1202-14. DOI: 10.1016/j. cell.2015.05.002 PMID: 26000488 23. Kuret T, Sodin-Šemrl S, Leskošek B, Ferk P. Single Cell RNA Sequencing in Autoimmune Inflammatory Rheumatic Diseases: Current Applications, Challenges and a Step Toward Precision Medicine. Front Med (Lausanne). 2022;8(8):822804. DOI: 10.3389/fmed.2021.822804 PMID: 35118101 24. Islam S, Zeisel A, Joost S, La Manno G, Zajac P, Kasper M, et al. Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers. Nat Methods. 2014;11(2):163-6. DOI: 10.1038/nmeth.2772 PMID: 24363023 25. Yang J, Liao B, Zhang T, Xu Y. Editorial: Bioinformatics Analysis of Single Cell Sequencing Data and Applications in Precision Medicine. Front Genet. 2020;10:1358. DOI: 10.3389/fgene.2019.01358 PMID: 32038714 26. Chen G, Ning B, Shi T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Front Genet. 2019;10:317. DOI: 10.3389/ fgene.2019.00317 PMID: 31024627 494 DERMATOLOGIJA, VENEROLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2023 | Letnik 92 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3411 27. Zhang Y, Wang D, Peng M, Tang L, Ouyang J, Xiong F, et al. Single-cell RNA sequencing in cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 2021;40(1):81. DOI: 10.1186/s13046-021-01874-1 PMID: 33648534 28. Perkel JM. Single-cell sequencing made simple. Nature. 2017;547(7661):125-6. DOI: 10.1038/547125a PMID: 28682345 29. Villani AC, Satija R, Reynolds G, Sarkizova S, Shekhar K, Fletcher J, et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 2017;356(6335). DOI: 10.1126/ science.aah4573 PMID: 28428369 30. Jiang M, Xu X, Guo G. Understanding embryonic development at single- cell resolution. Cell Regen (Lond). 2021;10(1):10. DOI: 10.1186/s13619- 020-00074-0 PMID: 33501559 31. Hicks SC, Townes FW, Teng M, Irizarry RA. Missing data and technical variability in single-cell RNA-sequencing experiments. Biostatistics. 2018;19(4):562-78. DOI: 10.1093/biostatistics/kxx053 PMID: 29121214 32. Shaham U, Stanton KP, Zhao J, Li H, Raddassi K, Montgomery R, et al. Removal of batch effects using distribution-matching residual networks. Bioinformatics. 2017;33(16):2539-46. DOI: 10.1093/bioinformatics/btx196 PMID: 28419223 33. Girouard SD, Murphy GF. Melanoma stem cells: not rare, but well done. Lab Invest. 2011;91(5):647-64. DOI: 10.1038/labinvest.2011.50 PMID: 21445060 34. Prunk T, Šalamon Š. Rakaste matične celice: ključ do uspešnejšega zdravljenja malignega melanoma? Med Razgl. 2014;53(2):233-44. 35. Maja Primic Žakelj TŽ. Vesna Zadnik. Epidemiologija malignega melanoma. Radiol Oncol. 2007;41:1-12. 36. Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 2002;417(6892):949-54. DOI: 10.1038/nature00766 PMID: 12068308 37. Cerkovnik P, Ličar A, Novaković S. Določanje mutacije V600E v genu BRAF. Onkologija. 2010;14(2):97-100. 38. Hočevar M, Strojan P, Ocvirk J, Perić B, Blatnik O, Luzar B, et al., eds. Priporočila za obravnavo bolnikov z melanomom. Ljubljana: Onkološki inštitut; 2020. 39. Garbe C, Amaral T, Peris K, Hauschild A, Arenberger P, Basset-Seguin N, et al.; European Dermatology Forum (EDF), the European Association of Dermato-Oncology (EADO), and the European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC). European consensus-based interdisciplinary guideline for melanoma. Part 1: Diagnostics: Update 2022. Eur J Cancer. 2022;170:236-55. DOI: 10.1016/j.ejca.2022.03.008 PMID: 35570085 40. Balch CM, Gershenwald JE, Soong SJ, Thompson JF, Atkins MB, Byrd DR, et al. Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification. J Clin Oncol. 2009;27(36):6199-206. DOI: 10.1200/JCO.2009.23.4799 PMID: 19917835 41. Larkin J, Chiarion-Sileni V, Gonzalez R, Grob JJ, Rutkowski P, Lao CD, et al. Five-Year Survival with Combined Nivolumab and Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med. 2019;381(16):1535-46. DOI: 10.1056/ NEJMoa1910836 PMID: 31562797 42. Robert C, Grob JJ, Stroyakovskiy D, Karaszewska B, Hauschild A, Levchenko E, et al. Five-Year Outcomes with Dabrafenib plus Trametinib in Metastatic Melanoma. N Engl J Med. 2019;381(7):626-36. DOI: 10.1056/ NEJMoa1904059 PMID: 31166680 43. Karner KB. Imunoterapija in obsevanje pri nemelanomskem kožnem raku in malignem melanomu kože. Ljubljana: Onkološki inštitut; 2021. pp. 27-30. 44. Esfahani K, Roudaia L, Buhlaiga N, Del Rincon SV, Papneja N, Miller WH. A review of cancer immunotherapy: from the past, to the present, to the future. Curr Oncol. 2020;27(12):S87-97. DOI: 10.3747/co.27.5223 PMID: 32368178 45. Carlino MS, Larkin J, Long GV. Immune checkpoint inhibitors in melanoma. Lancet. 2021;398(10304):1002-14. DOI: 10.1016/S0140- 6736(21)01206-X PMID: 34509219 46. O’Connell MP, Weeraratna AT. Change is in the air: the hypoxic induction of phenotype switching in melanoma. J Invest Dermatol. 2013;133(10):2316-7. DOI: 10.1038/jid.2013.208 PMID: 24030649 47. Labani-Motlagh A, Ashja-Mahdavi M, Loskog A. The Tumor Microenvironment: A Milieu Hindering and Obstructing Antitumor Immune Responses. Front Immunol. 2020;11:940. DOI: 10.3389/ fimmu.2020.00940 PMID: 32499786 48. Quek C, Bai X, Long GV, Scolyer RA, Wilmott JS. High-Dimensional Single- Cell Transcriptomics in Melanoma and Cancer Immunotherapy. Genes (Basel). 2021;12(10):1629. DOI: 10.3390/genes12101629 PMID: 34681023 49. Konieczkowski DJ, Johannessen CM, Abudayyeh O, Kim JW, Cooper ZA, Piris A, et al. A melanoma cell state distinction influences sensitivity to MAPK pathway inhibitors. Cancer Discov. 2014;4(7):816-27. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-13-0424 PMID: 24771846 50. Müller J, Krijgsman O, Tsoi J, Robert L, Hugo W, Song C, et al. Low MITF/AXL ratio predicts early resistance to multiple targeted drugs in melanoma. Nat Commun. 2014;5(1):5712. DOI: 10.1038/ncomms6712 PMID: 25502142 51. Tirosh I, Izar B, Prakadan SM, Wadsworth MH, Treacy D, Trombetta JJ, et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science. 2016;352(6282):189-96. DOI: 10.1126/ science.aad0501 PMID: 27124452 52. Jerby-Arnon L, Shah P, Cuoco MS, Rodman C, Su MJ, Melms JC, et al. A Cancer Cell Program Promotes T Cell Exclusion and Resistance to Checkpoint Blockade. Cell. 2018;175(4):984-997.e24. DOI: 10.1016/j. cell.2018.09.006 PMID: 30388455 53. van der Leun AM, Thommen DS, Schumacher TN. CD8+ T cell states in human cancer: insights from single-cell analysis. Nat Rev Cancer. 2020;20(4):218-32. DOI: 10.1038/s41568-019-0235-4 PMID: 32024970 54. Wang M, Zadeh S, Pizzolla A, Thia K, Gyorki DE, McArthur GA, et al. Characterization of the treatment-naive immune microenvironment in melanoma with BRAF mutation. J Immunother Cancer. 2022;10(4):e004095. DOI: 10.1136/jitc-2021-004095 PMID: 35383113 55. Miller BC, Sen DR, Al Abosy R, Bi K, Virkud YV, LaFleur MW, et al. Subsets of exhausted CD8+ T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nat Immunol. 2019;20(3):326-36. DOI: 10.1038/ s41590-019-0312-6 PMID: 30778252 56. Deng W, Ma Y, Su Z, Liu Y, Liang P, Huang C, et al. Single-cell RNA-sequencing analyses identify heterogeneity of CD8+ T cell subpopulations and novel therapy targets in melanoma. Mol Ther Oncolytics. 2020;20:105-18. DOI: 10.1016/j.omto.2020.12.003 PMID: 33575475 57. Sade-Feldman M, Yizhak K, Bjorgaard SL, Ray JP, de Boer CG, Jenkins RW, et al. Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma. Cell. 2018;175(4):998-1013.e20. DOI: 10.1016/j.cell.2018.10.038 PMID: 30388456 58. Li H, van der Leun AM, Yofe I, Lubling Y, Gelbard-Solodkin D, van Akkooi AC, et al. Dysfunctional CD8 T Cells Form a Proliferative, Dynamically Regulated Compartment within Human Melanoma. Cell. 2019;176(4):775- 789.e18. DOI: 10.1016/j.cell.2018.11.043 PMID: 30595452 59. Kim K, Park S, Park SY, Kim G, Park SM, Cho JW, et al. Single-cell transcriptome analysis reveals TOX as a promoting factor for T cell exhaustion and a predictor for anti-PD-1 responses in human cancer. Genome Med. 2020;12(1):22. DOI: 10.1186/s13073-020-00722-9 PMID: 32111241 60. Li C, Phoon YP, Karlinsey K, Tian YF, Thapaliya S, Thongkum A, et al. A high OXPHOS CD8 T cell subset is predictive of immunotherapy resistance in melanoma patients. J Exp Med. 2022;219(1):e20202084. DOI: 10.1084/ jem.20202084 PMID: 34807232 61. Rad Pour S, Pico de Coaña Y, Demorentin XM, Melief J, Thimma M, Wolodarski M, et al. Predicting anti-PD-1 responders in malignant melanoma from the frequency of S100A9+ monocytes in the blood. J Immunother Cancer. 2021;9(5):e002171. DOI: 10.1136/jitc-2020-002171 PMID: 33963011 495 STROKOVNI ČLANEK Sekvenciranje RNK na ravni posameznih celic 62. Choi H, Na KJ. Different Glucose Metabolic Features According to Cancer and Immune Cells in the Tumor Microenvironment. Front Oncol. 2021;11:769393. DOI: 10.3389/fonc.2021.769393 PMID: 34966676 63. Xiong D, Wang Y, You M. A gene expression signature of TREM2hi macrophages and γδ T cells predicts immunotherapy response. Nat Commun. 2020;11(1):5084. DOI: 10.1038/s41467-020-18546-x PMID: 33033253 64. McKean WB, Moser JC, Rimm D, Hu-Lieskovan S. Biomarkers in precision cancer immunotherapy: promise and challenges. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2020;40(40):e275-91. DOI: 10.1200/EDBK_280571 PMID: 32453632 65. Jiang P, Gu S, Pan D, Fu J, Sahu A, Hu X, et al. Signatures of T cell dysfunction and exclusion predict cancer immunotherapy response. Nat Med. 2018;24(10):1550-8. DOI: 10.1038/s41591-018-0136-1 PMID: 30127393 66. Vanmeerbeek I, Borras DM, Sprooten J, Bechter O, Tejpar S, Garg AD. Early memory differentiation and cell death resistance in T cells predicts melanoma response to sequential anti-CTLA4 and anti-PD1 immunotherapy. Genes Immun. 2021;22:108-19. DOI: 10.1038/s41435- 022-00189-1 PMID: 36456662 67. Jovic D, Liang X, Zeng H, Lin L, Xu F, Luo Y. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 2022;12(3):e694. DOI: 10.1002/ctm2.694 PMID: 35352511