RobertŠket1,ZalaPrevoršek2,DeniKošeto3,AleksandarSebastijanović4, SimonaKonda5,JercaBajuk6,BlažStres7 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be per so na li zi ra ne več ni voj ske me di ci ne AnalyticalandConceptualChallengesintheInvestigationofHuman IntestinalMicrobiotafortheNeedsofPersonalizedMultidimensional Medicine IZvLEČEK KLJUČNEBESEDE:16Sribosomskaribonukleinskakislina,metagenomika,metabolomika,bioinformatika, personaliziranamedicina Čre ve sna mi kro bio ta ima v člo veš kem pre bav nem trak tu po memb no vlo go. Omo go ča di - na mi čen od nos z go sti te ljem, po ma ga ohra nja ti ho meo sta zo epi te lij skih ce lic, vpli va na pri do bi va nje hra nil in urav na va nje ener gi je, fi zič no pre pre ču je ko lo ni za ci jo po vr ši ne čre - ve sa s pa to ge ni mi mi kroor ga niz mi in so de lu je pri proi zvod nji vi ta mi nov ter krat kih ve - rig maš čob nih ki slin. Čre ve sno mi kro bio to po leg gliv, ar hej in vi ru sov v ve či ni se stav lja 3 × 1013 bak te rij, ki jih uvrš ča mo v vsaj ti soč raz lič nih bak te rij skih vrst. Se sta vo mi kro - bio te in nje no vlo go v čre ves ju lah ko opre de lju je mo s šte vil ni mi me to da mi, ki se raz liku - je jo v loč lji vo sti. Upo rab nost re zul ta tov, ki jih do bi mo, je tako od vi sna od iz bra ne me to de. Z ne ka te ri mi me to da mi lah ko le re la tiv no pri mer ja mo se sta vo mi kro bio te v raz lič nih vzorcih, 1 Dr.RobertŠket,mag.mikrobiol.,Katedrazamikrobiologijoinmikrobnobiotehnologijo,Oddelekzazootehniko, Biotehniškafakulteta,Univerzav Ljubljani,Jamnikarjevaulica101,1000Ljubljana;robert.sket@kclj.si 2 Dr.ZalaPrevoršek,univ.dipl.inž.zoot.,Katedrazagenetiko,animalnobiotehnologijoinimunologijo,Oddelek za zootehniko,Biotehniškafakulteta,Univerzav Ljubljani,Jamnikarjevaulica101,1000Ljubljana 3 DeniKošeto,mag.mikrobiol.,Katedrazamikrobiologijoinmikrobnobiotehnologijo,Oddelekzazootehniko,Biotehniška fakulteta,Univerzav Ljubljani,Jamnikarjevaulica101,1000Ljubljana;SINTEFOcean,Strindveien4,7034Trondheim, Norveška 4 AleksandarSebastijanović,mag.mikrobiol.,Katedrazamikrobiologijoinmikrobnobiotehnologijo,Oddelekza zootehniko,Biotehniškafakulteta,Univerzav Ljubljani,Jamnikarjevaulica101,1000Ljubljana;InstitutJožefStefan, Jamovacesta39,1000Ljubljana 5 SimonaKonda,mag.mikrobiol.,Katedrazamikrobiologijoinmikrobnobiotehnologijo,Oddelekzazootehniko, Biotehniškafakulteta,Univerzav Ljubljani,Jamnikarjevaulica101,1000Ljubljana;Lekfarmacevtskadružba,d. d., Verovškovaulica57,1000Ljubljana 6 JercaBajuk,mag.mikrobiol.,Katedrazamikrobiologijoinmikrobnobiotehnologijo,Oddelekzazootehniko,Biotehniška fakulteta,Univerzav Ljubljani,Jamnikarjevaulica101,1000Ljubljana;Krka,d.d.,Novomesto,Šmarješkacesta6, 8501Novomesto 7 Izr.prof.dr.BlažStres,univ.dipl.mikrobiol.,Katedrazamikrobiologijoinmikrobnobiotehnologijo,Oddelekza zootehniko,Biotehniškafakulteta,Univerzav Ljubljani,Jamnikarjevaulica101,1000Ljubljana;Inštitutzazdravstveno hidrotehniko,Fakultetazagradbeništvoingeodezijo,Univerzav Ljubljani,Hajdrihovaulica28,1000Ljubljana;Center zakliničnotoksikologijoinfarmakologijo,Internaklinika,UniverzitetnikliničnicenterLjubljana,Zaloškacesta7, 1000Ljubljana 211MedRazgl.2019;58(2):211–34 • Pregledni članek dru ge nam do do lo če ne mere omo go ča jo po pis se sta ve mi kro bio te (mi kro mre že, sek ven - ci ra nje pom nož kov ge nov za 16S ri bo som sko RNA, sek ven ci ra nje me ta ge no ma) in kot nad grad nja temu: z ne ka te ri mi opre de li mo tudi de jav nost po sa mez nih pred stav ni kov čre - ve sne mi kro bio te (mi kro mre že tran skrip tov, sek ven ci ra nje me ta tran skrip to ma), ki se odraža v ak ti vi ra nju ge nov za do lo čen pro ces. Iz ka že se, da se li near no s šir šo upo rab nost jo me - to de oz. z ve ča njem ob se ga re zul ta tov po ve ču je jo tudi stroš ki ana li ze. Opi sa ni so pri meri me tod za po sa me zen na čin opre de lje va nja čre ve sne mi kro bio te, iz po stav lje ne so nji ho - ve po zi tiv ne ter ne ga tiv ne last no sti in upo rab nost teh me tod. Tak so nom ska kla si fi ka cija in po pis funk cio nal nih ge nov pa med se boj niso po ve za ni (determinacijski koeficient < 0,3). Prav tako raz lič ne tak so nom ske rav ni dajo raz lič ne sli ke od no sov med vzorci. Majh ne raz - li ke v tak so nom skem po pi su so ne kon si stent ne, saj so za nji hov po pis po tre bo va li ve li - ke ko hor te (šte vi lo prei sko van cev > 2.000). Nas prot no pa lah ko na ravni me ta bo lo mov eno stav no lo či mo raz lič ne sku pi ne, ki jih z upo ra bo po pi sa mi kro bio ma ne mo re mo. aBSTRaCT KEYWORDS:16Sribosomalribonucleicacid,metagenomics,metabolomics,bioinformatics,personalized medicine In te sti nal mi cro bio ta plays an im por tant role in the hu man ga stroin te sti nal tract. It en - ables dyna mic re la tions hip with the host, helps main tain ho meo sta sis of epit he lial cells, af fects the ac qui si tion of nu trients and re gu la tion of energy, physi cally pre vents the co - lo ni za tion of the in te sti ne sur fa ce by pat ho ge nic mi croor ga nisms and it is in vol ved in the pro duc tion of vi ta mins along with short chain fatty. Hu man in te sti nal mi cro bio ta, in ad di tion to the fun gi, arc ha ea, and vi ru ses, con sists of 3 × 1013 bac te ria, which are clas - si fied into at least a thou sand dif fe rent bac te rial spe cies. The com po si tion of the mi cro - bio ta and its role in the gut can be de fi ned using dif fe rent met hods with very dif fe rent re so lu tions. Ap pli ca bi lity of the ob tai ned re sults thus de pends on the met hod cho sen. With some met hods one can only re la ti vely compare the com po si tion of the mi cro bio ta in dif fe rent sam ples ot hers al low us to some ex tent ab so lu te des crip tion of the mi cro - bio ta com po si tion (mi croar rays, am pli con se quen cing of 16S ri bo so mal RNA ge nes, me - ta ge no me se quen cing) and as an up gra de to that some met hods made it pos sib le to de fi ne the ac ti vity of in di vi dual mi cro bes (mi croar rays, me ta trans crip to me se quen cing), which is ref lec ted in the ac ti va tion of ge nes for a spe ci fic pro cess. It turns out that li nearly with the broa der ap pli ca bi lity of the met hods, the cost of analy sis ex pands. Here we des cri - be met hods of de fi ning the hu man in te sti nal mi cro bio ta and ex po se po si ti ve and ne ga - ti ve fea tu res of their usa bi lity. Ta xo no mic clas si fi ca tion and the list of func tio nal ge nes are not well cor re la ted (coef fi cient of de ter mi na tion < 0.3). Also, dif fe rent ta xo no mic le - vels give dif fe rent ima ges of the re la tions hip bet ween sam ples. The small dif fe ren ces in the ta xo no mic in ven tory are in con si stent sin ce they nee ded lar ge co horts for their de li - nea tion (sam ple size > 2,000). On the ot her hand, at the le vel of the me ta bo li tes, we can ea sily di stin guish bet ween dif fe rent groups that could not be se pa ra ted by mi cro bio me analy sis. 212 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be … UvOD Gle de na do se daj zbra ne po dat ke ima čre - ve sna mi kro bio ta ključ no vlo go pri ohranjan - ju zdrav ja lju di. Ude le že na je pri ob li kovan - ju ho meo sta ze epi te lij skih ce lic, omo go ča proi zvod njo vi ta mi nov in fi zič no one mo - goča raz rast pa to ge nih mi kroor ga niz mov (1, 2). Za laž jo opre de li tev vlo ge čre ve sne mi kro bio te je tre ba opre de li ti nje no se sta - vo v čre ves ju zdra ve ga člo ve ka. To je cilj ra - zi skav v ok vi ru pro jek tov Člo veš ki mi kro - biom in MetaHIT (Me ta ge no mics of the Hu man In te sti nal Tract) (3, 4). Več kot 90 % vseh bak te rij skih vrst v čre ve sni mi kro bio - ti spa da v le dve bak te rij ski deb li, to sta Bac - te roi de tes in Fir mi cu tes (4). Nato sle di ta debli Pro teo bac te ria in Ac ti no bac te ria ter v manj - šem de le žu deb la Fu so bac te ria, Ver ru co mi - cro bia in Cya no bac te ria (5). Kaj lah ko po ve - mo o se sta vi ali pa de jav no sti mi kro bio te v prei sko va nem vzor cu, je od vi sno od iz bra - ne me to de. Z raz lič ni mi me to da mi lah ko: • pri mer ja mo se sta vo mi kro bio te med raz - lič ni mi vzor ci, • opre de li mo, ka te ri mi kro bi se stav lja jo mi - kro bio to in kak šna so raz mer ja med nji mi, • ugo to vi mo, kak šen je pre snov ni po ten cial mi kro bov z nji ho vi mi na bo ri ge nov in med se boj no sood vi snost jo in • preu či mo, kak šna je nji ho va pre snov na vlo ga oz. kaj prav za prav poč ne jo v tre nut - ku od vze ma vzor ca. V tej sme ri na raš ča tudi ne do re če nost me - tod, saj za mer je nje de jav no sti in situ ne ob - sta ja jo me to de za mer je nje ve li ke ga šte vi la vzor cev. METODE OPREDELJEvaNJa KOMPLEKSNOSTI MIKROBNE ZDRUŽBE Poz na mo več me tod za opre de li tev čre ve - sne mi kro bio te, ki jih v gro bem de li mo na tra di cio nal ne in mo le ku lar ne. Med tra di cio - nal ne me to de šte je mo ti ste, ki vklju ču je jo go je nje. Pri mer tak šnih me tod sta štet je ko - lo nij na trd nem (se lek tiv nem) go jiš ču in me - to da naj ver jet nej še ga šte vi la ce lic. Po leg tega, da mo ra mo pri delu poz na ti rast ne zah te ve mi kroor ga niz ma, ki ga go ji mo, je glav na sla bost teh me tod ano ma li ja števnih plošč (angl. great pla te count ano maly). Na go jiš čih na mreč lah ko zra ste le 0,01–10 % vseh pri sot nih ce lic v mi krob nem vzor cu, od vi sno od vzor ca (6). Za ra di tega da nes pri ugo tav lja nju se sta ve mi kro bio te in šte vi la po sa mez nih mi kro bov v pre bav nem trak tu upo rab lja mo raz lič ne mo le ku lar ne me to de (ta be la 1) (7). Go ji tve ne teh ni ke s pri dom upo rab lja mo pri ru tin skih ana li zah kli nič - nih vzor cev. Pri ve či ni mo le ku lar nih me tod kot filoge net ski oz na če va lec za tak so nom sko uvršča nje or ga niz mov upo rab lja mo gene za bak te rij sko, ar hej sko, gliv no in pro to zoj sko ri bo som sko RNA (rRNA). Gre za re gi je 16S in 18S rRNA ter no tra nji pre pi sni vme snik ri bo som ske DNA (angl. in ter nal trans cri bed spa cer, ITS). Edins tve na zna čil nost ge nov za rRNA je nji ho va splo šna ohra nje nost pri vseh bak te ri jah, ar he jah ter ev ka rion tih, pa tudi ana lit sko do volj ve li ka med vrst na razno li kost za ugo tav lja nje is to vet no sti (8). Tako lah ko preu ču je mo mi krob no raz no li - kost, do bi mo po dat ke o kva li ta tiv ni (pri sot - nost in od sot nost sku pin) in kvan ti ta tiv ni za sto pa no sti bak te rij skih vrst ter prou ču - je mo di na mi ko spre memb mi krob ne združ - be v pri me ru bo lez ni sko zi čas in v po pu - la ci ji raz lič nih go sti te ljev. Hi bri di za ci ja in situ Hi bri di za ci ja in situ omo go ča pre poz na va - nje po sa mez nih mi krob nih ce lic in s tem fi - lo ge net sko pre poz na va nje. Te me lji na hi bri - di za ci ji krat ke ga fluo res cent no oz na če ne ga oli go nu kleo ti da s kom ple men tar no sek - ven co v rRNA. Fluo res cent no oz na če ne ce - li ce lah ko opa zu je mo z epif luo res cenč nim ali kon fo kal nim mi kro sko pom oz. pre toč nim ci to me trom. Me to da je zelo raz šir je na v mi - krob ni eko lo gi ji in zna na pod ime nom fluo - res cenč na in situ hi bri di za ci ja (6). Sla bost me to de je, da ne omo go ča od kri va nja še 213MedRazgl.2019;58(2): 214 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be … Ta be la 1.Pregleduporabljanihmetodzakarakterizacijočrevesnemikrobiote.qPCR –kvantitativnaverižna reakcijas polimerazo(angl.quantitativepolymerasechainreaction),rRNA –ribosomskaRNA,DNA –deok- siribonukleinskakislina,PCR –verižnareakcijas polimerazo(angl.polymerasechainreaction),DGGE –gelska elektroforezav gradientudenaturanta(angl.denaturinggradientgelelectrophoresis),TGGE –gelskaelektro- forezav temperaturnemgradientu(angl.temperaturegradientgelelectrophoresis),T-RFLP –restrikcijski polimorfizemdolžinekončnihfragmentov(angl.terminalrestrictionfragmentlenghtpolymorphism),ARISA – avtomatiziranaanalizanotranjeprepisaneregijeribosomskeDNA(angl.automatedribosomalintergenic spaceranalysis),FISH –fluorescenčnainsitu hibridizacija. Me to da Opis Prednosti Slabosti Go je nje osamitevbakterijna semikvantitativnametoda, velikolaboratorijskegadela, selektivnemmediju poceni gojitijemogočemanjkot 30%črevesnemikrobiote qPCR pomnožitevinkvantifikacija omogočafilogenetsko vplivnapakpriPCR, 16SrRNA,reakcijska identifikacijo,kvantitativna nemoremoprepoznati mešanicavsebujespojino, inhitrametoda neznanihvrst kifluorescira,koseveže nadvoverižnoDNA Po lia kri la mid na ločevanje16SrRNA- semikvantitativnainhitra filogenetskoprepoznavanje gel ska elek tro fo re za -pomnožkovnagelu metoda,liselahkoizrežemo nimogoče,vplivnapakpri v gra dien tu z dodatkomdenaturanta zanadaljnjoanalizo PCR de na tu ran ta (DGGE)alivišanjem temperature(TGGE) T-RFLP pomnožitevs fluorescentno semikvantitativna,poceni filogenetskoprepoznavanje označenimizačetnimi inhitrametoda nimogoče,vplivnapakpri oligonukleotidiinnato PCR,nizkaločljivost restrikcija16SrRNA- pomnožkovz encimi, slediločitevfragmentov z gelskoelektroforezo ARISA pomnožitevodsekamed semikvantitativna,poceni filogenetskoprepoznavanje 16Sin23SRNA,slediločitev inhitrametoda nimogoče,vplivnapakpri fragmentovs kapilarno PCR elektroforezo FISH hibridizacijafluorescentno omogočafilogenetsko uspešnostmetodeje označeniholigonukleotidnih prepoznavanje, odvisnaodnukleotidnega sondz geni16SrRNA, semikvantitativna zaporedjasonde,ne zatemspremljanjepojava metoda,nivpliva moremodoločiti fluorescences pretočnim napakpriPCR neznanihvrst citometrom DNA-mi kro mre že hibridizacijafluorescentno omogočafilogenetsko navzkrižnahibridizacija, označeniholigonukleotidnih prepoznavanje, vplivnapakpriPCR, sonds komplementarnimi semikvantitativna zahtevnozaznavanje nukleotidnimizaporedji, inhitrametoda maloštevilnihvrst spremljanjefluorescence z laserjem Sek ven ci ra nje kloniranjecelotnega omogočafilogenetsko vplivnapakpriPCR, klo ni ra ne 16S pomnožka16SrRNA, identifikacijo,kvantitativna zahtevnoizvedljivain rRNA-ge nov sekvenciranjepoSangerju metoda dragametoda,napake inkapilarnaelektroforeza prikloniranju Sek ven ci ra nje 16S globokosekvenciranje omogočafilogenetsko dragainzahtevnoizvedljiva rRNA-pom nož kov pomnožkov16SrRNA prepoznavanjein metoda,vplivnapakpriPCR prepoznavanjeneznanih bakterij,kvantitativna inhitrametoda nezna nih oz. neo pi sa nih mi kroor ga niz mov in je za ra di de lov ne in ten ziv no sti pri mer - nej ša za sle de nje ene ga ali ne kaj tarč nih mi - kroor ga niz mov kot pa za ugo tav lja nje struk - tu re mi kro bio te. Po lia kri la mid na gel ska elek tro fo re za v gra dien tu de na tu ran ta Gel ska elek tro fo re za v gra dien tu de na tu - ranta (angl. de na tu ring gra dient gel elec trop - ho re sis, DGGE) je elek tro fo ret ska me to da, ki jo naj več krat upo rab lja mo za oce no raz lik v se sta vi mi kro bio te med pri mer ja ni mi vzor ci, saj omo go ča lo če va nje med raz lič - ni mi mi krob ni mi sku pi na mi na os no vi raz - lik v za po red ju DNA, kar vpli va na sta bil - nost DNA. Za ra di teh raz lik pri de do raz lič ne elek tro fo ret ske mo bil no sti del no de na tu ri - ra ne dvo ve riž ne mo le ku le DNA (angl. double stran ded DNA, dsDNA) v po lia kri la midnem gelu z li near nim gra dien tom de na tu ran ta. Več ja kot je vseb nost pa rov gva nin-ci to zin, bolj je mo le ku la dsDNA od por na na de na - tu ra ci jo in kot taka se bo raz kle ni la ter po - sle dič no us ta vi la pri viš ji kon cen tra ci ji de - na tu ran ta. To na gelu vi di mo v ob li ki lise (angl. band) (9). Na da lje lah ko iz DGGE-gela izre že mo do lo če ne lise, z ve riž no reak ci jo s po li me ra zo (angl. poly me ra se chain reac - tion, PCR) po nov no pom no ži mo tam prisotno DNA in s sek ven ci ra njem iz ve de mo filo ge - net sko iden ti fi ka ci jo. Po dob no kot DGGE tudi gel ska elek tro fo re za v tem pe ra turnem gra dien tu (angl. tem pe ra tu re gra dient gel elec - trop ho re sis, TGGE) omo go ča oce ni tev se sta - ve mi kro bio te, le da v tem pri me ru na mesto gra dien ta de na tu ran ta med po te kom ana - li ze vi ša mo tem pe ra tu ro (10). Re strik cij ski po li mor fi zem dol ži ne konč nih frag men tov Re strik cij ski po li mor fi zem dol ži ne konč nih frag men tov (angl. ter mi nal re stric tion frag - ment lenght poly morp hism, T-RFLP) tako kot DGGE in TGGE omo go ča oce no se sta - ve mi kro bio te v vzor cu. Me to da omo go ča lo če va nje med raz lič ni mi mi kro bio ta mi na pod la gi sprem lja nja ve li ko sti konč nih re - strik cij skih frag men tov DNA. Me to do iz ve - de mo tako, da tarč no DNA ob pom no ževanju z me to do PCR na kon cu 5’ oz na či mo s fluo - ro kro mom in po re strik ci ji z en do nu klea - zo lo či mo s ka pi lar no elek tro fo re zo (11, 12). av to ma ti zi ra na ana li za no tra nje pre pi sa ne re gi je ri bo som ske deok si ri bo nu klein ske ki sli ne Av to ma ti zi ra na ana li za no tra nje pre pi sa ne re gi je ri bo som ske DNA (angl. au to ma ted ri - bo so mal in ter ge nic spa cer analy sis, ARISA) je me to da, kjer v po stop ku PCR pom no ži mo raz no li ke ne ko di ra jo če od se ke bak te rij ske DNA med 16S in 23S RNA, ki jih nato po ve li ko sti lo či mo s ka pi lar no elek tro fo re zo. Me to do upo rab lja mo za pri mer ja vo se sta - ve mi kro bio te med raz lič ni mi po pu la ci ja - mi (13, 14). 215MedRazgl.2019;58(2): »Shot gun« globokosekvenciranje omogočafilogenetsko dragametoda,zahtevna sek ven ci ra nje celotnihgenomovcelotne prepoznavanjein zaizvedboinračunsko me ta ge no ma mikrobnezdružbe prepoznavanjeneznanih potratnaanalizapodatkov bakterijternjihovih funkcionalnihskupin genov,kvantitativna metoda »Shot gun« globokosekvenciranje omogočafilogenetsko dragainzahtevnoizvedljiva sek ven ci ra nje izraženihgenovcelotne prepoznavanje, metoda,zahtevnain me ta tran skrip to ma mikrobnezdružbe kvantitativnametoda, računskopotratnaanaliza omogočaspremljanje podatkov bakterijskedejavnosti (izražanjegenov) DNa-mi kro mre že Me to da omo go ča fi lo ge net sko pre poz na va - nje čre ve sne mi kro bio te in se upo rab lja za pri mer ja vo se sta ve mi kro bio te med raz lič - ni mi po pu la ci ja mi. Prin cip me to de te me lji na oli go nu kleo tid nih son dah, ki so pri tr je - ne na ste kle ni ploš či ci. Ko na ploš čo do damo fluo res cent no oz na če ne pom nož ke tarč ne DNA, pri de do hi bri di za ci je med pom nož - ki in spe ci fič ni mi son da mi. Fluo res cen co veza nih pom nož kov nato sprem lja mo z la - ser jem (15, 16). Glav ne te ža ve zgo raj na ve de nih teh nik so pred vsem ve lik ob seg roč ne ga dela, ne - stan dar di zi ra ne pri pra ve ma te ria lov ter po sle dič no ve li ka spre men lji vost v me jah ozad ja, zaz na va nja in kvan ti fi ka ci je ter li - near no sti zaz na va nja teh teh nik. ve riž na reak ci ja s po li me ra zo v real nem ča su Kvan ti ta tiv na ve riž na reak ci ja s po li me razo (angl. quan ti ta ti ve poly me ra se chain reac tion, qPCR) je kvan ti ta tiv na me to da, ki omo go - ča pre poz na va nje že poz na nih bak te rij skih vrst oz. viš jih tak so nom skih sku pin in oce - no šte vi la bak te rij v vzor cih. Prin cip me to - de je po do ben obi čaj ne mu PCR, le da je pri qPCR do da no fluo ro ge no oz na če va nje za - čet nih oli go nu kleo ti dov, sond ali pom nož - kov. Sled nje omo go ča sprot no sprem lja nje po te ka reak ci je. Po ve ča nje ko li či ne pom nož - ka DNA sprem lja mo kot po ve ča nje fluo res - cent ne ga sig na la, ki ga zaz na mo z de tek tor ji v na pra vi za qPCR. Ko li či no sproš če ne fluo res cen ce pri ka že mo gra fič no v od vi sno - sti od šte vi la ci klov PCR in gle de na po tek ra sti iz mer je ne fluo res cen ce do lo či mo ci - kel, kjer je reak ci ja preš la prag zaz na ve. Toč - ka, ime no va na CT (angl. cycle thres hold) je od vi sna od za čet ne ko li či ne tarč ne DNA. Ko - li či no tarč ne DNA v vzor cu kvan ti fi ci ra mo gle de na stan dard no kri vu ljo, ki jo izri še - mo na pod la gi pom no že va nja stan dar da z zna no ko li či no tarč ne DNA (17, 18). Stran - ski uči nek ve li ke ga ob se ga kon tro le v de - lo va nju te teh ni ke je, da lah ko kvan ti ta tiv no sprem lja mo le po sa mez ne spe ci fič ne sku - pi ne, ki smo jih po se bej iz bra li za zaz na va - nje in za nje pri pra vi li ter ume ri li ana lit ski si stem, zato je tak so nom ska ši ri na temu pri - mer no ozka, ome je na na le ne kaj iz bra nih sku pin. Sek ven ci ra nje Sek ven ci ra nje pred stav lja zla ti stan dard ka rak te ri za ci je čre ve sne mi kro bio te in je neod vi sno od go je nja mi kro bov. Gre za po - sto pek do lo ča nja za po red ja deok si ri bo - nukleo ti dov (angl. deox yri bo nuc leo ti de tri - phospha te, d NTP) ade ni na, gva ni na, ci to zi na in ti mi na v mo le ku li DNA ali RNA, pri dob - lje nih iz bak te rij, ar hej, rast lin, ži va li ali ka - kr šne ga koli dru ge ga vira ge net skih po - datkov (19). Upo ra ba sek ven ci ra nja je zelo ši ro ka, tako lah ko do lo či mo za po red ja po - sa mez nih ge nov, več jih ge net skih re gij (kla stri ali ope ro ni), ce lot nih kro mo so mov ali kom plet nih ge no mov. In for ma ci je, pri - dob lje ne s sek ven ci ra njem, omo go ča jo pre - poz na vo spre memb v ge nih, po ve zav med bo lez ni mi in fe no ti pi ter ugo tav lja nje ka - zal cev kro nič nih bo lez ni in tarč nih mest de - lo va nja zdra vil. Sek ven ci ra nje se upo rab lja tudi v evo lu cij ski bio lo gi ji pri prou če va nju raz vo ja in po ve zav med raz lič ni mi or ga niz - mi. Po leg tega, da s sek ven ci ra njem fi lo - genet sko pre poz na va mo in kvan ti fi ci ra mo prei sko va no mi kro bio to, lah ko od kri je mo tudi ne poz na ne in v majh nih ko li či nah pri - sot ne mi kroor ga niz me (19, 20). Za čet ni po sku si sek ven ci ra nja so bili us - mer je ni v sek ven ci ra nje naj bolj do stop nih, re la tiv no či stih vrst mo le kul RNA, kot so mi krob na in for ma cij ska RNA, pre na šal na RNA ali ge no mi eno ve riž nih RNA-bak te rio - fa gov (21). Za čet ke av to ma ti zi ra ne ga sek - ven ci ra nja DNA, ki mu pra vi mo tudi prva ge ne ra ci ja sek ven ci ra nja, so pred sta vi li Fre de rick San ger in so de lav ci leta 1977 (22). Upo rab lja li so ra di oak tiv no oz na če ne ke mič - ne ana lo ge d NTP, t. i. di deok si nu kleo ti de (angl. di deoxy nuc leo ti de trip hosp ha te, ddNTP) Nji ho va zna čil nost je, da ni ma jo 3’ hi drok - 216 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be … sil ne sku pi ne, po treb ne za po dalj ša nje ve - ri ge DNA, zato ne pri de do nji ho ve ve za ve s 5’ fos fat no sku pi no na sled nje ga d NTP. Ra - di oak tiv no oz na če ni ddNTP se na ha ja jo v reak cij ski me ša ni ci sku paj s stan dard ni - mi d NTP. Vsa kič, ko DNA-po li me ra za vgra - di dd NTP, se sin te za ve ri ge DNA us ta vi. Kot re zul tat do bi mo ve li ko šte vi lo frag men tov DNA raz lič nih dol žin. Ka dar iz va ja mo šti - ri vzpo red ne reak ci je, od ka te rih vsa ka vse - bu je svo jo vr sto ra di oak tiv no oz na če ne ga dd NTP, lah ko po lo če va nju vzor cev na po - lia kri la mid nem gelu s po moč jo av to ra dio - gra fi je ugo to vi mo za po red je nu kleo ti dov v iz vir nem za po red ju DNA (22). Ta me to - da sek ven ci ra nja je pre vla do va la od 80. let prejš nje ga sto let ja do leta 2000. V tem ob - dob ju je priš lo do ve li ke ga teh no loš ke ga na - pred ka. Kot iz bolj ša va me tod prve ge ne ra - ci je sek ven ci ra nja se po jav lja jo me to de sek ven ci ra nja na sled njih ge ne ra cij, ki omo - go ča jo učin ko vi tej še sek ven ci ra nje in nižje stroš ke po stop ka (23). Glav na pred nost teh me tod sek ven ci ra nja je, da za sek ven ci ra - nje ni po treb na klo ni ra na DNA kot pri me - to di po San ger ju, am pak lah ko ne po sred no ugo tav lja mo nu kleo tid no za po red je skup - ne DNA mi krob ne združ be. V sklop dru ge ge ne ra ci je sek ven ci ra nja uvrš ča mo trž no do stop ne plat for me, kot so Roc he/454, Il lu mi na/So le xa, Ap plied Biosy - stems/SO li D in He li cos Bio Scien ces. Ome - nje ne me to de sek ven ci ra nja omo go ča jo ka rak te ri za ci jo tarč ne ga ge no ma s pre cej niž ji mi stroš ki v pri mer ja vi s sek ven ciranjem prve ge ne ra ci je (24). Me to da 454-pi ro sek ven ci ra nja (Roc he) te me lji na pom no že va nju mo le kul DNA zno - traj vod nih kap ljic v olj ni raz to pi ni (PCR v emul zi ji), pri če mer vsa ka vod na kap ljica vse bu je eno mo le ku lo DNA, ki je pri tr je na na kro gli co, na ka te ri so za čet ni oli go nu kleo - ti di. Po kon ča nem pom no že va nju na kro glici do bi mo klon sko ko lo ni jo. Sek ve na tor vse - bu je šte vil ne pi ko ti tr ske vdol bi ne, v ka terih se na ha ja jo po ena kap lji ca z DNA in en ci - mi, ki omo go ča jo ke mi lu mi nis cenč no za - zna va nje. Sek ven ci ra nje po te ka tako, da DNA-po li me ra za do da ja po sa mez ne nu kleo - ti de v ve ri go gle de na ori gi nal ni za pis DNA. Ko je po sa me zen nu kleo tid do dan v ve ri go, s po moč jo en ci mov ATP-sul fu ri la ze in lu ci - fe ra ze na sta ne svet lo ba, ki jo me ri mo (25). Pri me to di sek ven ci ra nja Il lu mi na na na ključ ne frag men te DNA ve že mo adap ter - je in frag men te imo bi li zi ra mo na trdo pod - la go, na ka te ri po te ka me to da mo stov ne ga pom no že va nja (angl. brid ge PCR) (26). Mo - le ku le DNA se mno ži jo tako, da se for mirajo lo kal ne klon ske ko lo ni je DNA ali »kla stri DNA«. Za do lo či tev za po red ja DNA do damo šti ri vr ste re ver zi bil nih ter mi na cij skih baz, vse os ta le nu kleo ti de, ki se niso ve zali, pa iz - pe re mo. Ka me ra na re di sli ko fluo res cenč no obe le že nih nu kleo ti dov. Za tem se bar va, vključ no z blo ka tor jem na kon cu 3’, ke mič - no od ce pi od mo le ku le DNA in je na ta na - čin omo go če na na sta vi tev pro ce sa oz. za če - tek no ve ga ci kla. Sled nje omo go ča op ti mal no pre pust nost in teo re tič no neo meje no zmog - lji vost sek ven ci ra nja. Tako je da nes pre - pust nost lah ko več kot 1.000.000 nu kleo ti - dov na se kun do, kar je prib liž no ena ko ene mu člo veš ke mu ge no mu z en kratno po - kri tost jo na uro de lo va nja in stru men ta (27). Ion Tor rent pol pre vod niš ko sek ven ci ra - nje te me lji na stan dard ni teh no lo gi ji sek - ven ci ra nja, ven dar z upo ra bo no ve ga pol - pre vod niš ke ga si ste ma zaz na va nja. Ta me to da sek ven ci ra nja te me lji na zaz na va - nju vo di ko vih io nov, ki se spro sti jo med po - li me ri za ci jo DNA. Upo rab lja se ploš ča z mi - kro luk nja mi, ki vse bu je jo eno ve ri go mo le ku le DNA, ki se sek ven ci ra. Do da ja se en nu kleo tid naen krat. V luk nji, v ka te ri je priš lo do ve za ve nu kleo ti da za ra di ho mo - lo gi je, pri de do spro sti tve vo di ko ve ga iona, ki ga zaz na iz jem no ob čut lji vi sen zor. V pri - me ru, da so pri sot ne ho mo po li mer ne po no - vi tve, se bo več is tih nu kleo ti dov ve za lo na is tem me stu v enem ci klu, več vo di ko vih io nov pa se bo spro sti lo, kar bo pri pe lja lo do so raz mer no viš je ga elek tron ske ga sig - na la (28). 217MedRazgl.2019;58(2): V dru go ge ne ra ci jo sek ven ci ra nja spa - da ta še me to di SOL i D in DNA na no ball. Pri prvi sek ven ci ra mo v kro gli cah pom no že ne mo le ku le DNA kot pri pi ro sek ven ci ra nju in na kon cu do bi mo sek ven ce, ki ima jo pri mer - lji vo ko li či no in dol ži no kot pri Il lu mi na sek ven ci ra nju (29, 30). Pri dru gi me to di pa upo rab lja mo teh ni ko krož ne ga pom no že va - nja (angl. rol ling circ le re pli ca tion) za po - množe va nje majh nih frag men tov ge nom ske DNA v t. i. na no žo ge DNA (angl. DNA na - no balls). Ta me to da omo go ča, da se ve li ko šte vi lo na no žog sek ven ci ra naen krat, pri če - mer so stroš ki rea gen tov v pri mer ja vi z dru - gi mi me to da mi sek ven ci ra nja na slednje ge ne ra ci je zelo niz ki (31). Po dru gi stra ni pa se iz vsa ke na no žo ge do lo či jo le krat ka zapo - red ja, za ra di če sar je ma pi ra nje krat kih odčit - kov z re fe renč nim ge no mom ote že no (32). Hkra ti z raz vo jem teh no lo gij se po ve - ču je pre pust nost me tod in se ni ža jo stroški ter čas, po treb ni za pri do bi va nje re zul ta tov, kar je cilj me tod sek ven ci ra nja tret je ge ne - ra ci je (33). Sem vklju ču je mo me to de, ki te - me lji jo na: • sin te zi, • bra nju za po red ja DNA, do kler mo le ku la DNA pre ha ja sko zi na no po ro in • mi kro skop skih teh ni kah, kot sta mi kro - sko pi ra nje z atom sko silo in tran smi sij - ska elek tron ska mi kro sko pi ja. Te me to de se upo rab lja jo za ugo tav lja nje po lo ža ja po sa mez nih nu kleo ti dov zno traj dol gih frag men tov DNA, ki so več ji od 5.000 baz nih pa rov. Ko mer cial no naj po go ste je upo rab lje ni plat for mi sta Pac Bio (Pa ci fic Bios cien ces) in Min ION (Ox ford Na no po - re Tech no lo gies). Eno mo le kul sko sek ven ci ra nje v real nem ča su (angl. sin gle mo le cu le real time se quen - cing) pod jet ja Pa ci fic Bios cien ces te me lji na pri sto pu sek ven ci ra nja s sin te zo. DNA se sin te ti zi ra v majh nih luk nji cah (angl. zero- mode wave-gui des), v ka te rih je na dno pri - tr je na DNA-po li me ra za. Nato se pri do da - ja nju fluo res cenč no oz na če nih nu kleo ti dov v ve ri go DNA sproš ča fluo res cen ca. Re zul - tat so od čit ki 20.000 ali več nu kleo ti dov s pov preč no dol ži no 5.000 baz nih pa rov (34). Na no por na me to da sek ven ci ra nja DNA pod jet ja Ox ford Na no po re Tech no lo gies te me lji na od čit ku elek trič nih sig na lov, ki se po jav lja jo v ča su pre ho da nu kleo ti dov sko zi be lja ko vin sko na no po ro. Kon cept iz - vi ra iz ide je, da eno ve riž ne mo le ku le DNA ali RNA v li near nem za po red ju elek tro fo - ret sko pre va ja mo sko zi bio loš ko poro, pri tem pa se spre me ni elek tron ski tok. Spre - mem ba je od vi sna od ob li ke, ve li ko sti in dol - ži ne za po red ja DNA, saj vsak od nu kleo ti dov spre me ni elek tron ski tok za raz lič no ča sov - no ob dob je. Sig na li, ki us tre za jo za po red ju nu kleo ti dov, se nato ovred no ti jo (35). Za us - pe šno iz va ja nje je ključ ne ga po me na na tan - čen nad zor pre ho da mo le ku le DNA sko zi poro (36). Ob sta ja ta dve me to di na no por ne - ga sek ven ci ra nja; me to da sek ven ci ra nja v trd nem sta nju in me to da, ki te me lji na upo ra bi be lja ko vin (35, 37). Pra vi len od vzem vzor ca in ka ko vost na ek strak ci ja nu klein skih ki slin (DNA, RNA, de ple ci ja rRNA, re verz na tran skrip ci ja v kom - ple men tar no DNA) sta os no va pra vil ne raz - la ge re zul ta tov. Na sled nji ko rak je sek ven - ci ra nje DNA z zgo raj opi sa ni mi pri sto pi. Po sto pek sek ven ci ra nja je se stav ljen iz pri - pra ve knjiž nic, pom no že va nja in sek ven ci - ra nja dob lje nih pom nož kov ter nato bi oin - for mat ske in sta ti stič ne ana li ze dob lje nih po dat kov. Gle de na na čin iz ved be sek ven - ci ra nja lah ko do lo ča mo: • mi krob ne sek ven ce do lo če ne ga mi krob - ne ga od se ka mi kro bov v združ bi, • na ključ ne od se ke iz ce lot nih sek venc teo re tič no vseh mi kro bov v združ bi in • sek ven ce mi krob nih mo le kul rRNA ce lot - ne združ be. Ana li zo po dat kov sek ven ci ra nja lah ko opra - vi mo na več na či nov in z upo ra bo več pro - gram skih oro dij, od vi sno od tega, ali smo do lo ča li nu kleo tid no za po red je mi krob - nega pom nož ka ali ce lo kup nih mi krob nih 218 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be … ge no mov v vzor cu. Pri tem že li mo od go vo - ri ti na vpra ša nja: • Kako raz no li ka je mi kro bio ta? • Kako se dve ali več mi kro biot raz li ku je - ta/jo med sabo? • Kdo so čla ni prei sko va nih mi kro biot? • Kako so ti čla ni med se boj po ve za ni? Pri is ka nju od go vo rov upo rab lja mo številna sta ti stič na in bi oin for mat ska orod ja (38–40). Od go vo ri so kva li ta tiv ni, če prei sku je mo, ali je do lo čen član pri so ten ali od so ten, ter kvan ti ta tiv ni, če preu ču je mo, npr. kako ve - li ke so sku pi ne, gle da no pri ena kem šte vi - lu upo rab lje nih kakovostnih sek venc. Za do volj in for ma tiv ne po dat ke sek - ven ci ra nja je tre ba za go to vi ti, da je do lo čen od sek prei sko va ne ga mi krob ne ga gena do - volj krat pre bran oz. sek ven ci ran. Teh no logi - je sek ven ci ra nja nove ge ne ra ci je kot re zul - tat po da jo od 250 in do več 1.000 baz nih pa rov ve lik od sek. Šte vi lo branj, ki jih do - bi mo pri sek ven ci ra nju, opre de li mo z izra - zom glo bi na sek ven ci ra nja. S teh nič ne ga vidi ka iz ved be sek ven ci ra nja mora biti glo - 219MedRazgl.2019;58(2): bi na sek ven ci ra nja tako ve li ka, da je mo go - če raz liko va ti med ma lo šte vil ni mi mi krob - ni mi sku pi na mi in na pa ka mi sek ven ci ra - nja. Poka že se na mreč, da je pri vsa ki iz ved bi sek ven ci ra nja do lo čen od sto tek branj na pa - čen, iz kus tve no lah ko tudi več kot 50% vseh sek venc v do lo če nem vzor cu. Zato z us trez - no glo bi no sek ven ci ra nja za go to vi mo, da imajo tudi ma lo šte vil ne sku pi ne mi kro bov zadost no šte vi lo branj, in jih lah ko nato lo - či mo od na pak. Z bio loš ke ga vi di ka glo bi - no sek ven ci ra nja po sa mez ne ga vzor ca gra - fič no po na zo ri mo z ra re fak cij sko kri vu ljo, kjer fi lo ge net ska raz no li kost na raš ča z glo - bi no sek ven ci ra nja (sli ka 1) (41). Op ti malna glo bi na sek ven ci ra nja je do se že na ta krat, ko se fi lo ge net ska raz no li kost, kljub ve ča nju glo bi ne sek ven ci ra nja, ne po ve ču je več (42). Z upo ra bo sek ven ci ra nja dru ge ge ne ra - ci je, kjer se proi zve de jo sek ven ce dol ži ne do 1.000 baz nih pa rov z vi so ko ka ko vost jo, mora mo pri me to di sek ven ci ra nja do lo če - ne ga mi krob ne ga od se ka za go to vi ti vsaj 30.000–40.000 branj na vzo rec, pri kom - pleksnih mi krob nih združ bah pa tudi do 105 0 40.000 80.000 Število sekvenc 120.000 160.000 200.000 10 20 40 50 30 60 Š te vi lo r a z li n ih O T U ( d ru ž in a ) č Sli ka 1.Primerrarefakcijskihkrivuljizreanalizebakterijskihmikrobnihzdružbv blatupreiskovancev.Krivulja ponazarjanaraščanjefilogenetskeraznolikostiobpovečevanjuglobinesekvenciranja,kipanedosežepopol- negaplatoja.Zunanječrteponazarjajo95%intervalezaupanja(41).OTU –operacijskataksonomskaenota (angl.operationaltaxonomicunit). branj na vzo rec. Pri sek ven ci ra nju me ta ge - no ma je po treb na glo bi na sek ven ci ra nja vsaj 106 branj na vzo rec in me ta tran skrip to ma vsaj 107 branj na vzo rec po od stra ni tvi 16S rRNA in re verz ni tran skrip ci ji v DNA (43). Med na ključ no sek ven ci ra ni mi od se ki ge - nov bo pri sot nih ve li ko branj ge nov ti stih bak te rij, ki so v združ bi pri sot ne v ve li kem šte vi lu, pri ma lo šte vil nih bak te ri jah pa je po kri tost sla ba. Po kri tost sek ven ci ra nja, ki je izra ču na na kot raz mer je med skup no dol - ži no branj, ki jih us pe mo zdru ži ti v skupke, in ve li ko sti teh skup kov, pa bo pred stavlja - la po da tek o re la tiv ni za sto pa no sti bak te - rij skih pred stav ni kov v združ bi (sli ka 2) (44). SEKvENCIRaNJE 16S RIBOSOMSKE RIBONUKLEINSKE KISLINE aLI RaJE METaGENOMIKa? Nav kljub vses plo šne mu ni ža nju cen sek ven - ci ra nja se z ve ča njem zah tev po glo bi ni sek - 220 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be … ven ci ra nja do lo če ne ga vzor ca ve ča jo tudi stroš ki sek ven ci ra nja, saj lah ko z is tim orod jem se daj ana li zi ra mo manj še šte vi lo vzor cev. Pri dob lje ne sek ven ce mi krob nih fi - lo ge net skih oz na če val cev, iz bra nih funk cio - nal nih ge nov ali ce lot ne ga me ta ge no ma je tre ba nato bi oin for mat sko in sta ti stič no ob - de la ti (38–40). Pri tem je po treb na ra čun ska moč za izra čun, so raz mer na s ko li či no pri - dob lje nih po dat kov oz. z glo bi no sek ven ci - ra nja. Z ve ča njem glo bi ne sek ven ci ra nja se ne po ve ču je le po tre ba po več ji ra čun ski mo - či, am pak je po treb na tudi dru gač na ar hi - tek tu ra cen tral nih pro ce sor skih enot od kla sič nih HPCC (angl. high-per for man ce com - pu ting clu ster), saj ana li ze vse bu je jo ve li ko prei skav raz lič nih za po re dij z več po dat - kovni mi ba za mi. Pot na prej v tem pri me - ru pome ni na jem pro sto ra in ka pa ci tet za izra ču ne v ob la ku, s či mer pa se od pre jo teža ve, ko gre za ohra nja nje ano nim no sti po dat kov o prei sko va nih bol ni kih. 0 1 2 4 5 3 6 7 8 9 10 Operacijske taksonomske enote (OTU) Z a st o p a n o st %[ ] Sli ka 2.Krivuljaporazdelitvemikroorganizmovv posamezneskupinev vzorcuiztrebkov(številovzorcev=340). Grafprikazujemajhnoštevilovisokozastopanihskupin,srednještevilosrednjezastopanihskupinterdolg repnizkozastopanihskupinv vzorcu(angl.speciesabundancecurve).Z večanjemresolucijeproti97%ope- racijskimtaksonomskimenotamsedeležsekvencvzorca,kipredstavljajodoločenooperacijskotaksonomsko enoto,zmanjšananivo,manjšiod0,1%.OTU –operacijskataksonomskaenota(angl.operationaltaxo- nomicunit). Sek ven ci ra nje pom nož kov 16S ri bo som ske ri bo nu klein ske ki sli ne Pri do lo ča nju baz ne se sta ve mi krob ne ga od - se ka do lo če ne ga gena naj več krat do lo ča mo se sta vo ge nov za 16S rRNA, npr. bak te rij, lah ko pa tudi dru gih (ar he je, gli ve, pro to - zo ji, po sa mez ni funk cio nal ni geni). Pr votna ob de la va pri dob lje nih sek venc je v gro bem se stav lje na iz na sled njih sklo pov. Naj prej sek ven ce z upo ra bo fil tra oči - sti mo mo le ku lar nih sig na lov pod mejo zah te va ne ka ko vo sti, po rav na mo na re fe - renč no po rav na vo in od stra ni mo ne bak te - rij ske (ar hej ske, mi to hon drij ske, klo ro plast - ne in ev ka riont ske) sek ven ce ter umet ne kon struk te DNA, ki so na sta li kot po sle dica na pak med po te kom sek ven ci ra nja. Težave pri raz la gi re zul ta tov pred stav lja jo obdela - va dob lje nih branj in od pra va ter po prav - lja nje si stem skih na pak, ne da bi od stra nili tudi sig na le, ki pri pa da jo re snič nim sek ven - cam. Brez pra vil ne ob de la ve lah ko do bi mo pre ce nje ne po dat ke o raz no li ko sti mi kro bio - te v vzor cu in na pač no zdru že vanje v skup - ke ter na pač no kla si fi ka ci jo. Temu se že li - mo izog ni ti, zato (45): • Upo ra bi mo fil ter za od stra ni tev na pak sek ven ci ra nja, s ka te rim od stra ni mo vse sek ven ce, ki niso za doš ča le kri te ri jem. To so mi ni mal na dol ži na sek ven ce, mak si - mal na dol ži na sek ven ce, mak si mal na dolži na sek venc z iden tič ni mi ba za mi ter šte vi lo sek venc, kjer je bila med po te kom sek ven ci ra nja ka te ra od šti rih baz (ade nin, ti min, gva nin, ci to zin) dvoum no do lo če - na (angl. am bi gu ous base calls) ali pa je bil sig nal pod zah te va no mejo ja ko sti in tako pro gram ne more ja sno do lo či ti, ka te ra baza se na ha ja na do tič nem me stu. • Z upo ra bo pro gra ma (npr. UCHIME) od - stra ni mo umet ne kon struk te mo le kul DNA, t. i. hi me re, ki med po te kom sek ven - ci ra nja na sta ne jo kot po sle di ca zdru ži tve raz lič nih sek venc. • Pre poz na mo ter od stra ni mo sek ven ce, ki se niso uvr sti le v prei sko va no deb lo mi - kroor ga niz mov, npr. med bak te ri je, ali so se uvr sti le kot ar he je, ev ka rion ti, klo ro pla - sti ali pa mi to hon dri ji. Po dat ke sek ven ci ra nja po čiš če nju lahko na - da lje ana li zi ra mo tudi tako, da sek vence raz - de li mo v ope ra cij ske tak so nom ske eno te (angl. ope ra tio nal ta xo no mic unit, OTU) raz - lič nih tak so nom skih re so lu cij (od do me ne do vr ste, 97 % OTU). Do teh pri de mo na tri na či ne: na os no vi po dob no sti za po red ja (raz po ni 80–97 % iden tič nost sek venc), gle - de na tak so nom sko uvr sti tev v de fi ni ra ne ka te go ri je spre je te tak so no mi je, npr. NCBI (Na tio nal Cen ter for Bio tech no logy In for - ma tion), Ber gey, UNITE (User-friendly Nor - dic ITS Ec tomy corr hi za) ter gle de na fi loge - net sko dre vo. Prva je fi lo ge net sko neod vi sna ali kar me to da OTU, dru ga je od vi sna od re - pre zen ta tiv nih sek venc, uvrš če nih v do lo - če no tak so nom sko sku pi no, tret ja pa je od fi lo ge ni je od vi sna ali kar fi lo ge net ska me - to da (46–48). Pred nost pri sto pa, ki te me lji na OTU, je, da ni tak so nom ske pri stran sko - sti, ven dar je ra čun sko zelo in ten ziv na in pod vr že na ve li kim vpli vom neod stra nje nih na pak iz sek ven ci ra nja. Med tem ko je fi lo - ge net ski pri stop upo rab nej ši za preu če va - nje po dob no sti in raz lik v združ bi, je ja sno, da je ra čun ska stop nja ge ne ri ra nja ogrom - nih fi lo ge net skih dre ves ena naj bolj vpraš - lji vih in prib liž nih (47). Kljub temu da še ni spre je te ga so glas ja, ka te ra me to da je bolj - ša, tre nut na sli ka v ob ja vah ka že, da ve čina ra zi sko val cev ubi ra sred njo pot in v anali - zah pom nož kov upo rab lja tak so nom sko kla si fi ka ci jo v ob sto je če sku pi ne. Te ža va, ki se po ja vi, je, da je tak so no mi ja kon strukt člo veš ke kla si fi ka ci je in ne odra ža sta nja v na ra vi, saj šte vi lo ka te go rij eksponentno naraš ča z ve ča njem re so lu ci je pro ti rav ni vr ste, med tem ko na rav ni se vov od sto pa (sli ka 3). Prav tako zno traj tak so nom ske ga ni vo ja niso vsi tak so ni (tak so nom ski ni voji) de fi ni ra ni na enak na čin, am pak so ne ka - te re sku pi ne fi li gran sko raz de la ne, čeprav med nji mi na ni vo ju 16S rRNA ni ve li kih raz lik. 221MedRazgl.2019;58(2): Pro sto do stop ni pro gram ski plat for mi, ki nam omo go ča ta iz ved bo zgo raj ome nje - nih ana liz, sta QIIME in mot hur (46, 49). Raz li ka med plat for ma ma je pred vsem v tem, da QIIME pri mar no te me lji na fi lo - ge net ski me to di, mot hur pa pri mar no na me to di OTU, ven dar omo go ča vse tri (takso - nom sko, fi lo ge net sko, OTU). Obe plat formi omo go ča ta ana li zo raz no li ko sti mi kro biote in, po memb ne je, omo go ča ta iz ved bo ana - li ze, s ka te ro po sku ša mo po ja sni ti, kako so čla ni združ be med se boj no po ve za ni. Raz - liku je ta se pred vsem po tem, do kak šne mere lah ko upo rab nik nad zi ra po sa mez ne stop nje ana liz. QIIME iz va ja svo je ana li ze v pro gram skem je zi ku python, med tem ko je mot hur na pi san v pre gled nem pro gram - skem je zi ku C++, kjer upo rab nik sam spre - je ma od lo či tve in na stav lja pa ra me tre po sa mez nih sto penj ana liz, za kar pa je po - treb ne ga več zna nja in iz ku šenj. Za pre poz na va nje in šte vilč no do lo - čanje za sto pa no sti po sa mez nih tak so nov v prei sko va ni mi krob ni združ bi lah ko 222 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be … v prvem ko ra ku očiš če ne sek ven ce se daj raz - vr sti mo z raz vrš če val cem rRNA. Pri mer je naiv ni Ba ye sov raz vrš če va lec rRNA, ki je del baze RDP (50, 51). V upo ra bi so še os ta le baze po dat kov: Green ge nes, SILVA in NCBI, med ka te ri mi se stop nja ažu ri ra no sti raz - li ku je (52–54). Prav sled nje se po go ste je iz - po stav lja kot ve li ko te ža vo, pred vsem pri po dat kov ni bazi Green ge nes, ki je bila zad - nji krat os ve že na maja 2013, in tako pred - stav lja pre cej za sta re lo sli ko tak so nom skih raz vr sti tev. Ne na zad nje, na enak na čin, kot ana li - zi ra mo sek ven ce 16S ali 18S rRNA ali ITS, lah ko ana li zi ra mo tudi sek ven ce, pri dob lje - ne iz glo bo ke ga sek ven ci ra nja funk cio nal - nih ge nov (38). Sek ven ci ra nje me ta ge no mov Do lo ča nje za po red ji ge nov 16S rRNA za go - tav lja ve li ko po dat kov o prei sko va ni mi krob - ni združ bi, ven dar je glav na te ža va v tem, da je le del gena za 16S rRNA pom no žen in sek ven ci ran. Z raz vo jem teh no lo gij sek - 0 2.000 4.000 8.000 10.000 6.000 12.000 Š te vi lo s k u p in n a t a k so n o m sk o r a ve n Taksonomska raven 1–domena 2–deblo 3–razred 4–red 5–družina 6–rod 7–vrsta 8–sev y=8.9415e 0.8918x R =0.9303 2 Sli ka 3. Odnosmedštevilomskupinnadoločenitaksonomskiravniv odvisnostiodizbiretaksonomske ravni.Ravensevaodstopaodsplošnegaeksponencialneganaraščanjaštevilataksonovv posameznikate- goriji.R2 –regresijskikoeficient. ven ci ra nja se je po ve ča la ko li či na pri dob - lje nih po dat kov in zmanj ša li so se stroš ki iz ved be take ana li ze. Za ra di tega če da lje več ra zi skav vklju ču je sek ven ci ra nje ce lot ne ga me ta ge no ma, to rej ugo tav lja mo nu kleo - tid no za po red je frag men tov mi krob nih ge - nov, ki so zbra ni v skup ku vseh ge no mov prei sko va ne mi krob ne združ be. Tak šno sek - ven ci ra nje omo go ča ano ta ci jo ve či ne naj - bolj za sto pa nih mi krob nih ge nov zno traj vzor ca, od ka te rih lah ko več ji del predstav - lja jo gos po dinj ski geni mi kroor ga niz mov, ki so nuj ni za pre ži vet je in so kot tak šni ohra nje ni pri ve či ni mi kroor ga niz mov. Z iz - ved bo sek ven ci ra nja me ta ge no ma tako opre de li mo tudi funk cio nal no vlo go mi - krob ne združ be v do lo če nem eko si ste mu in iz ve mo, ali so spre mem be v se sta vi mi krob - ne združ be vzrok ali po sle di ca npr. do lo če - ne ga bo le zen ske ga sta nja (42, 55). Po dat ki me ta ge nom skih ra zi skav so pri dob lje ni v ve - li kih ko li či nah in zelo raz drob lje ni, kar pred stav lja ve lik iz ziv pri is ka nju, zbi ra nju in pre de lo va nju ko rist nih bio loš kih po dat - kov (56, 57). Pri mer je sek ven ci ra nje me tage - no ma člo veš ke ga čre ve sne ga mi kro bioma, kjer je bilo pre poz na nih 3.300.000 ge nov, se - stav lje nih iz 567,7 giga baz nih pa rov sek - ven ci ra nih po dat kov (4). Do da ten vpo gled v de lo va nje in do met me ta ge nom skih ana - liz nam po ka že tudi eno stav na po ve za nost med teh nič ni ma po no vi tva ma sek ven ci ra - nja is te ga vzor ca, ki po ka že, da je za ka - kovostne ana li ze po treb nih pre cej več sek - venc na po sa mez no ka te go ri jo zaz na ne ga funk cio nal ne ga gena (sli ka 4). Pri nizkem števi lu sek venc na ka te go ri jo gena ve li ko skupin ge nov na mreč zaz na mo v eni od po - no vi tev sek ven ci ra nja, v dru gi pa sploh ne. To je po ka za telj, da se li mi te zaz na va nja in kvan ti fi ka ci je sek ven ci ra nja ge nov iz do lo - če nih ka te go rij funk cio nal nih ge nov med se boj raz li ku je jo in jih v prak si ne zna mo do bro nad zo ro va ti. Me ta ge nom ska ana li za je se stav lje na iz več ko ra kov. Po sek ven ci ra nju je tre ba pri - dob lje ne od čit ke naj prej oči sti ti in nato zlo - ži ti v več je skup ke (angl. con tigs). Od vi sno 223MedRazgl.2019;58(2): 0 0 10 1 10 1 10 2 10 2 10 3 10 3 10 4 10 4 Prva tehnična ponovitev metagenomskega sekvenciranja Log (števila sekvenc na posamezno kategorijo funkcionalnega gena)[ ] D ru g a t e h n i č n a p o n o vi t e v m et a g en o m sk eg a se kv en ci ra n ja L o g ( š t e vi la se kv en c n a p o s a m ez n o ka te g o r i jo f u n k c i o n a ln eg a g en a ) [ ] Sli ka 4.Povezanostmedštevilomsekvencnaposameznokategorijofunkcionalnegagenameddvemateh- ničnimaponovitvamasekvenciranjaistegavzorca. od na ših po dat kov se stav lja nje opra vi mo de novo ali gle de na re fe ren co. Sled nje je pri ana li zah kom plek snih me ta ge no mov te - žav no, saj pri se stav lja nju me ta ge no mov pra vi lo ma ne vemo, ka te rim mi kroor ga niz - mom sek ven ce pri pa da jo. Zato se na če lo ma upo rab lja jo od re fe ren ce neod vi sni pri sto - pi. Skup ke ge nov gru pi ra mo v »draft ge no - me«, na po ve mo ko di ra jo če in ne ko di ra jo če gene ter opra vi mo funk cio nal no ano ta ci jo teh s pri mer ja vo s po dat kov ni mi ba za mi. Na kon cu sle di sta ti stič na ob de la va po dat kov in raz la ga re zul ta tov (58). Iz bi ra pro gra mov za iz ved bo ana li ze me ta ge nom ske ga sek - ven ci ra nja je se daj še ved no v fazi pre ver - ja nja si stem ske ga vpli va gle de na iz bi ro do lo če ne ga pro gra ma, s skup nim ci ljem zmanj še va nja al go ri tem ske ga šu ma in po - ve če va nja stan dar di za ci je pro to ko lov za ana li zo po dat kov, kar bi nas v ideal nem pri - me ru pri pe lja lo do pri mer lji vo sti po dat kov med raz lič ni mi ra zi ska va mi, ne gle de na to, ka te ri pro gram oz. pro to kol je bil upo rab - ljen pri ana li zi. Pred za čet kom bi oin for ma cij ske ana li - ze mo ra mo naj prej pre ve ri ti kakovost dob - lje nih sek venc. Po da tek o tem je ko di ran v FASTQ for ma tu sek venc, ki nam po leg baz ne se sta ve pove tudi ver jet nost, da je do - lo če na baza na do lo če nem me stu v za po red - ju na pač na. Orod ja, ki omo go ča jo ana li zo in pri kaz raz po re di tev na pak teh ver jet no sti, so NGS QC Tool kit, Kra ken in HTQC (59–61). V ko ra ku fil tri ra nja sek venc od stra ni mo dvoj ni ke sek venc, ar te fak te in nu kleo tid ne baze z niz ko kakovostjo ter go sti te lje ve sek ven ce. Go sti te lje vo DNA pre poz na va mo z orod jem, ki poiš če uje ma nje z go sti te lje - vo DNA na pod la gi re fe renč ne ga ge no ma. Pri me ra oro dij za od stra nje va nje ev ka riont - skih ge nom skih za po re dij DNA sta Eu-De - tect in De Con seq (62, 63). V na sled njem ko ra ku očiš če ne sek ven - ce zdru ži mo v skup ke. Z vi di ka ra čun ske mo či ta stop nja pred stav lja ozko grlo ana - li ze in ni po pol no ma za nes lji va, saj so me - ta ge nom ski po dat ki zelo zgoš če ni in krat - kih dol žin, kar pa pred stav lja vi so ko ver jet - nost za na pa ko. Ob sta ja več pro gra mov za se stav lja nje od čit kov. Pro gra mi, kot sta Vel vet as semb ler in SOAP de no vo, so bili op - ti mi zi ra ni za kraj še od čit ke, ki jih proi zva - ja sek ven ci ra nje na sled nje ge ne ra ci je z upo - ra bo gra fov De Bruijn (64). Pri se stav lja nju te ža ve pov zro ča jo po nav lja jo če se sek ven - ce DNA, pred vsem za ra di raz li ke v re la tivni šte vilč no sti vrst, ki so pri sot ne v vzor cu, in na sta nek hi mer nih skup kov, kjer pri de do se stav lja nja od čit kov iz več kot ene mi krob - ne vr ste (65). Pri se stav lja nju si lah ko po - ma ga mo z upo ra bo re fe renč nih ge no mov, ki omo go ča jo se stav lja nje če da lje več je ga šte vi la mi krob nih vrst, saj na raš ča šte vi lo mi krob nih de bel, za ka te re so sek ven ci rani ge no mi do stop ni. Kljub temu te ža vo v tem ko ra ku lah ko pred stav lja jo po manj klji vo se stav lje ni re fe renč ni ge no mi, ka te rih ano - ta ci je se sko zi čas spre mi nja jo, zato se pre - fe renč no v prak si upo rab lja jo pro gra mi, ki te me lji jo na ana li zi De Bruij no vih gra fov (65, 66). Se stav lja nju sle di na po ved ge nov oz. oz - na či tev ko di ra jo čih re gij v se stav lje nih skup kih in ano ta ci ja. Na po ved ge nov lah - ko opra vi mo na dva na či na (65). Pre poz nava ge nov v pr vem pri sto pu te me lji na ho mo - lo gi ji z geni, ka te rih za po red ja so že jav no do stop na v po dat kov nih ba zah. Tako pre gle - da mo funk cio nal ne mo ti ve in ce lič ne lo ka - cij ske sig na le za na po ve da ne be lja ko vin ske sek ven ce z orod ji, kot npr. PRIAM za en - cimsko uvrš ča nje, HMM-Pfam in TIGRFAM za funk cio nal ne mo ti ve, TMHMM za pre - pozna va nje tran smem bran skih po ten cial nih do men, ter z upo ra bo br skal ni ka BLAST, kjer za re fe ren co upo ra bi mo nu kleo tid no in be - lja ko vin sko bazo PANDA (67–70). To vr sto pri sto pa upo rab lja pro gram MEGAN (71, 72). Pri dru gem pri sto pu se upo rab lja jo bis tve - ne zna čil no sti za po red ja za na po ved ko di - ra jo čih re gij, ki te me lji jo na sklo pu ge nov iz so rod nih or ga niz mov. Tak šen pri stop je im ple men ti ran v pro gra mih, kot sta Gene - Mark in GLIMMER (73). Glav na pred nost 224 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be … take na po ve di je, da omo go ča od kri va nje ko - di ra jo čih re gij, ki ni ma jo ho mo log nih za po - re dij v po dat kov nih ba zah. Naj bolj na tanč - no na po ve do va nje pa opra vi mo, ko ima mo na vo ljo ve li ke re gi je so sed nje ge nom ske DNA za pri mer ja vo (57). Vsee no pa ni nič ne na vad ne ga, če de lež nea no ti ra nih za po - re dij v me ta ge no mu pred stav lja tudi 60 % vseh sek venc tega vzor ca. Tudi po dat kov - ne baze zna nih be lja ko vin se ne pre sta no raz - vi ja jo in do pol nju je jo, kar ka že, da je po so - dab lja nje po dat kov nih baz nova prio ri te ta pri ana li zah me ta ge nom skih po dat kov na strež ni kih ve li kih zmog lji vo sti. Da bi po ve za li raz no li kost mi krob ne združ be in nje no funk ci jo v me ta ge nomih, je tre ba sek ven ce spo ji ti. Spa ja nje (angl. bin - ning) je pro ces po ve zo va nja sek venc z do - lo če nim or ga niz mom (65). Pri spa ja nju, ki te me lji na po dob no sti, z me to do BLAST iš - če mo fi lo ge net ske oz na če val ce ali po dobna za po red ja v ob sto je čih po dat kov nih bazah. Re zul ta te iz baze BLAST uvo zi mo ne po - sred no v pro gram MEGAN, kjer sek ven ce z upo ra bo baze po dat kov NCBI tak so nom - sko uvr sti mo in nato opra vi mo še funk - cionalno ana li zo in na po ved pred vi de nih pre snov nih poti z upo ra bo si ste ma raz vrš - ča nja SEED ali KEGG (71, 72, 74, 75). V upo - ra bi je tudi orod je Phymm BL, ki upo rab lja in ter po li ra ne Mar ko ve mo de le za do de li - tev ali na ka zo va nje vlo ge branj sek ven cira - nja (57). Meta Phl An in AMPHORA sta dve me to di, ki za oce nje va nje re la tiv ne obil no - sti or ga niz mov upo rab lja ta edins tve ne oz - na če val ce tak so nom skih sku pin (76). Ko so sek ven ce spoje ne, je mo go če iz ve sti pri mer - jal no ana li zo. Ogrom na ko li či na eks po nent no ra sto - čih me ta ge nom skih po dat kov in pri pa da jo - čih me ta po dat kov pred stav lja iz je men iz ziv, ki pa ima zelo ve lik po ten cial za ra zu me - va nje med se boj ne ga de lo va nja mi kro bov ter med se boj ne ga de lo va nja med mi kro bi in go - sti te ljem na raz lič nih ni vo jih, ki jih po kriva si stem ska me di ci na. Me ta po dat ki vključujejo po dat ke o po sku su, prei sko van cih, kemijske/ okolj ske last no sti vzor ca, fi zič ne po dat ke o me stu in me to do lo gi ji vzor če nja itd. in so nuj no po treb ni, tako za za go tav lja nje po nov - lji vo sti ana li ze kot tudi za nje no us pešnost. Pri mer orod ja za zdru ži tev za po re dij DNA in me ta po dat kov, ki omo go ča jo pri merjalne ana li ze raz lič nih na bo rov po dat kov z upo - ra bo eko loš kih in dek sov, je MG-RAST (77). Da nes, 10 let od us ta no vitve, strež nik vse - bu je 135,08 tera baz nih parov oz. 286.340 me ta ge no mov s 1.024 mi li jar da mi sekvenc. Ser ver omo go ča tudi ano ta ci jo, izra čun tak - so nom ske po raz de li tve vrst, šte vilč no sti in α-raz no li ko sti ter se sta ve na po ve da nih ko di ra jo čih re gij ge nov v funk cio nal ne ka - te go ri je in pod si ste me. Prav tako vse bu je orod ja za pri mer ja vo in vi zua li za ci jo po dat - kov tako iz last nih kot tudi iz prej na lo že - nih baz po dat kov. Zato taka in te gra ci ja ra - čun skih oro dij s shra nje va njem po dat kov pre stav lja in fra struk tu ro za me ta ge no mi - ko in me ta tran skrip to mi ko na ni vo ju ure - je no sti, kot jo je vča sih po me ni la upo ra ba NCBI Gene Bank za ana li ze po sa mez nih sek - venc, le da je se daj ra ven komplek sno sti ne - kaj sto penj viš ja. Za ra di poe no te ne ana li ze so re zul ta ti vse bin sko bolj pri mer lji vi med raz lič ni mi ra zi ska va mi, saj je ana lit ski šum ob čut no zmanj šan. Si stem IMG/M tudi za - go tav lja zbir ko oro dij za funk cio nal no ana - li zo mi krob nih združb, ki te me lji na nji ho - vem me ta genom skem za po red ju ter na ge nom skem za po redju re fe renč nih izo la tov, ki so vključe ni v si stem IMG ter v pro jekt GEBA (Ge no mic Encyc lo pe dia of Bac te ria and Arc ha ea) (78). Za po red je uka zov in oro dij za ano ta ci jo po sa mez nih branj ali pa skup kov branj, pri dob lje nih z me ta ge nom - skim sek ven ci ra njem, pred la ga tudi In šti - tut J. Craig Ven ter (79). Tako po sta ja jo orod - ja, ki so bila na me nje na hkrat nim ana li zam tak so nom ske ga in funk cio nal ne ga opi sa mi kro bio te v dru gih oko ljih po sred no vir in - for ma cij in po dat kov za ana li ze, ki vklju ču - je jo po dat ke z več ni vo jev člo veš ke ga te lesa, to rej si stem ske in bolj per so na li zi ra ne me - di ci ne, ki se ana li zi ra jo v sklo pu pro jek tov, 225MedRazgl.2019;58(2): kot je npr. CA15120 – Open Multiscale Sys - tems Medicine (80). Hkra ti nam za raz voj no vih pri sto pov na po droč ju mikrof lui di ke slu ži tudi Port ASAP (81). Se ve da pa rav no upo ra ba is tih po dat - kov na raz lič nih tak so nom skih ni vo jih vodi v za čet no zme do, ko upo rab ni ki še ne spre - je ma jo dejs tva, da ana li ze is tih po dat kov na raz lič nih ni vo jih tak so nom ske ali funk cio - nal ne re so lu ci je lah ko ge ne ri ra jo zelo raz - lič ne od go vo re in od no se med vzor ci kot tudi med prei sko va ni mi sku pi na mi, ki jim ti vzor ci pri pa da jo (sli ka 5). 226 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be … Sta ti stič na ana li za Pri preu če va nju raz no li ko sti mi kro bio te že li mo iz ve de ti, ko li ko raz lič nih čla nov je v po sa mez ni združ bi (α-raz no li kost). To lah ko pred sta vi mo na gra fu z ra re fak cij sko kri vu ljo, kjer je šte vi lo v vzor cu od kri tih tak - so nov funk ci ja šte vi la sek venc (sli ka 2). Na ta na čin opi še mo bo ga tost združ be in pre - ve ri mo, ali smo za je li ce lot no raz no li kost vzor ca. V tem pri me ru kri vu lja do se že pla - to, kar po me ni, da se z ve ča njem šte vi la sek - venc šte vi lo tak so nov ne ve ča več. Ka zal ca α-raz no li ko sti sta tudi Chao1, ki s pomočjo ek stra po la ci je izra ču na va vrst no bo ga tost, 1,0 100 1. K ral jes tvo 2. De blo 3. Ra zre d 4. Re d 5. Dru žin a 6. Ro d 7. Vrs ta 8. Se v 9. Fu nk cio na lni ge ni 100 100 98 100 10054 100 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3K o re la ci ja m e d r a z li č n im i o p is i o d n o so v m ik ro b n ih z d ru ž b Sli ka 5.Povezavamedopisiodnosovmikrobnihzdružb40metagenomovprebavnegatrakta.Metagenome smoanaliziralinarazličnihtaksonomskihinfunkcionalnihnivojihinnavsakemnivojuizračunalidistančne matrikerazdaljmedposameznimivzorci.Dendrogramprikazujekorelacijemedtemimatrikami,kakose z večanjemtaksonomskeresolucijespreminjajoodnosimedvzorciznotrajposamezneganivoja,predvsem pailustriranizkopovezavomedtaksonomskiminfunkcionalnimnivojemobravnavanihmetagenomov. Številkenavejiščihkažejopodporovejanja(angl.bootstrap). in Simp son, ki odra ža šte vi lo tak so nov, kar opre de li mo z izra zom bo ga tost združ be, ter re la tiv no za sto pa nost tak so nov v vzor cu, kar opre de li mo z izra zom ena ko mer nost združ - be (82–84). Te ža va pri ana li zi so ve li ke asi - me trič ne ma tri ke (majh no šte vi lo vzor cev in ve li ko šte vi lo ka te go rij mi kroor ga niz - mov) z ve li kim šte vi lom ni čel (sli ka 6). Za opis raz lik ali po dob no sti med združ - ba mi (β-raz no li kost) upo ra bi mo ka zal ce po dob no sti, s ka te ri mi izraču na mo ma tri - ko raz dalj, to pa nato upo ra bi mo za gra fični pri kaz uvrš ča nja združb v sku pi ne. Pri tem upo rab lja mo me to de, ki za izra čun ma tri - ke raz dalj in te sti ra nje zna čil no sti raz lik upo rab lja jo evo lu cij sko po ve za nost za po re - dij, npr. me to da Uni Frac, ter ka zal ce raz noli - ko sti kot npr. Bray-Cur tis, Mo ri si ta-Horn in Sören sen (47, 83). Na da lje s te stom HOMOVA te sti ra mo, ali je ge net ska pe strost med dve ma združ ba ma ho mo ge na in s te stom ana li ze mo le ku lar ne va rian ce AMOVA pre - ve ri mo, ali je ge net sko od vi sna pe strost med dve ma ali več mi krob ni mi združ ba mi raz - lič na od pe stro sti vseh združb sku paj (38–40, 84–86). Ka dar pri mer ja mo več sku pin vzor - cev, mo ra mo opra vi ti tudi po pra vek več - kratnih pri mer jav (87, 88). Prav tako lah ko s pri sto pi stroj ne ga uče nja, kot so umet ne ne vron ske mre že, na ključ ni gozd (angl. ran dom fo rest), te sti Lef se, Me ta stats in in - di ka tor ske vr ste pre poz na mo tak so nom - ske ali funk cio nal ne sku pi ne, ki se sta ti stič - no zna čil no raz li ku je jo med vzor ci (38–40, 89–91). S te stom AWKS lah ko te sti ra mo pri - sot nost tak so nom skih ali funk cio nal nih sku pin v raz lič nih vzor cih in to gra fič no pred sta vi mo na os no vi po dat kov o pri sot - no sti, šte vilč no sti in po go sto sti prei sko va - nih sku pin v vzor cih (39, 92). Za gra fič ni pri - kaz raz no li ko sti lah ko upo ra bi mo me to do glav nih kom po nent ali pa ne me trič no več - di men zio nal no les tvi če nje, ki ga lah ko med dru gim iz ve de mo s pa ke tom ve gan v pro - gram skem oko lju R (93). Rav no tako lah ko raz ši ri mo na še ana li ze na ana li ze me ta bol - nih mrež in mrež so po jav no sti mi kroor ga - niz mov ali funk cio nal nih ge nov z do lo če - ni mi last nost mi go sti te lja ali nje go ve ga oko lja (sli ka 7). 227MedRazgl.2019;58(2): Operacijske taksonomske enote (OTU; N = 3.500) V zo rc im ik ro bn ih zd ru ž b (N = 5 4 ) Sli ka 6.Pregledzastopanostiinrazporeditveprisotnostiinodsotnostisekvencpoprvih3.500najboljzasto- panihoperativnihtaksonomskihenotahv 54vzorcih.Najboljzastopaneskupine,kisoprisotnev večini vzorcevz največjimštevilom,soobarvanerdeče(levo),čedaljemanjzastopaneskupinesoobarvanesivo, belapoljaprikazujejoodsotnostdoločeneoperativnetaksonomskeenotev določenemvzorcu.Samapodol- govataoblikamatrikez naraščajočimdeležembelihlisv desnosmernajboljprikažeomenjenonumerično asimetrijoobravnavanihmatrikpodatkov.Zaprimerjavoglejsliko2.OTU –operacijskataksonomskaenota (angl.operationaltaxonomicunit). Pri ce lot ni ana li zi po dat kov se je tre ba za ve da ti ome ji tev, ki iz vi ra jo iz (92): • na ra ve po dat kov, • teh no loš ke (ne)po nov lji vo sti sek ven cira - nja, po ve za ne z naj manj ši mi prei sko va - ni mi sku pi na mi, ki jih še lah ko na tanč no do lo či mo z upo rab lje nim ana lit skim pri - sto pom in so opi sa ne z: • li mi to spo sob no sti zaz na ve, • li mi to spo sob no sti kvan ti fi ka ci je, • li mi to zaz na va nja praz nih sku pin in • li mi to li near ne ga od zi va za po sa mezno tak so nom sko ali funk cio nal no sku pi no, • ne po sred ne ne pri mer lji vo sti po stop kov in prib liž ne oce ni tve po sa mez nih al go rit - mov ter • raz vo ja sta ti stič nih me tod, ki za go tav ljajo do lo če no sta ti stič no moč ra zi skav. Na ra va po dat kov nam ka že pre se net lji vo ugo to vi tev, da ima mo lah ko na ni vo ju tak - so nom skih ana liz ve li ke raz li ke med prou - če va ni mi sku pi na mi prei sko van cev, med - 228 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be … tem ko mi krob ne združ be na ni vo ju funk - cio nal nih ge nov vse bu je jo prak tič no identič - ne funk cio nal ne gene (95). Prav tako ugo - to vi mo, da so ru tin ske ve li ko sti ko hort, ki se upo rab lja jo v me di ci ni za mi kro bio loške ra zi ska ve z upo ra bo sek ven ci ra nja tarčnih fi lo ge net skih ge nov v splo šnem premajh - ne. Za to, da bi lah ko lo či li cen troi di oz. sre - dišč ni toč ki opi sa nih mi krob nih združb med zdra vi mi in de be li mi prei sko van ci za 1 %, bi mo ra li v vsa ki sku pi ni upo ra bi ti več kot 2.000 prei sko van cev (96). Zato upo - raba le ne kaj pet ali de set prei sko van cev z zelo raz lič ni mi pre hran ski mi, živ ljenj ski - mi na va da mi, cir ka dia ni mi rit mi, so cial nimi ni vo ji in oseb no zgo do vi no, kot je po gosto za sle di ti v me di cin ski li te ra tu ri, eno stav no ne za do stu je za po glob lje ne ra zi ska ve, hkrati pa ka že, da ne ka te ri pa ra me tri, ki jih sprem lja jo, mor da niti ni ma jo tako ob sež - ne ga vpli va. Tako se npr. ka že, da so se spre - mem be v člo veš ki fi zio lo gi ji zgo di le dva do tri ted ne prej, pre den je priš lo do kon si stent - Sli ka 7.Primermetabolnemrežemikrobnihoperativnihtaksonomskihenots parametrimikrobnegaokolja v prebavnemtraktu.Z rdečoinzelenobarvosooznačenestatističnoznačilnenegativneinpozitivnepove- zavemedmetabolitiv okoljutermikrobnimioperativnimitaksonomskimienotami.S poglobljenimianali- zamikompleksnihgrafovlahkougotovimo,katerimikroorganizmialinjihovifunkcionalnigenisoključni primedsebojnihpovezavahznotrajmikrobnihzdružb,kateriokoljskiparametriključnovplivajo(pozitivno alinegativno)nadoločenemikrobneskupineterkateriparametrisoključnizarazlikovanjemedposamez- nimiskupinamipreiskovancev.OTU –operacijskataksonomskaenota(angl.operationaltaxonomicunit). nih spre memb v struk tu ri mi krob nih združb ali me ta ge nom skem funk cio nal nem opi su mi krob nih združb, hkra ti pa je bilo na me - ta bo lom skem ni vo ju mož no zaz na ti spre - mem be mi krob ne pre sno ve ve li ko prej, torej so ča sno s spre mem ba mi v člo veš ki fi - zio lo gi ji (38–40). Iz tega bi lah ko iz pe lja li eno sta ven pred log, da je pri kom plek snih bo le zen skih sta njih po memb ne je, kaj mi - kroor ga niz mi poč ne jo na me ta bol nem ni - vo ju, kot pa nji ho va tak so nom ska uvr sti tev. Upo ra ba za čet nih oli go nu kleo ti dov pri glo bo kem sek ven ci ra nju je tudi pov zro či - la, da dol go ča sa ni bilo no be ne ga na pred - ka pri od kri va nju še preo sta lih mi krob nih sku pin. Na me sto ve li ke ga šte vi la ve či no ma iz miš lje nih ocen raz no li ko sti mi krob nih sku pin iz sek ven ci ra nja pom nož kov je rav - no me ta ge no mi ka omo go či la od kri va nje ce - lih dru žin bak te rij in ar hej, ki jih do ta krat ni bilo mož no opi sa ti, saj se ve zav na me - sta za za čet ne oli go nu kleo ti de v PCR eno - stav no raz li ku je jo od zna nih ve zav nih mest in jih to rej ni smo mo gli zaz na ti s PCR (95). Rav no kom bi na ci ja glo bo ke ga sek ven ci - ranja ce lot nih me ta ge no mov nam da nes omo go ča re kon struk ci jo »draft ge no mov« mi kroor ga niz mov brez go je nja in nji ho vo evo lu cij sko ana li zo v kon tek stu do se daj zna nih ge no mov, raz vo ja oto kov zno traj ge - no mov, ho ri zon tal nih pre no sov ter re gu la - ci je eks pre si je in pre sno ve. Raz voj al go rit mov je pri pe ljal ce lot no skup nost do toč ke za ve da nja raz no li ko sti v re zul ta tih, ki je po sle di ca upo ra be raz lič - nih al go rit mov. Ni pre se net lji vo, da po tekajo ce lot ne ra zi ska ve, zno traj ka te rih pri mer - ja jo raz lič ne al go rit me z is ti mi po dat ki, z na - me nom stan dar di za ci je ana lit skih poti in iz bo rom al go rit mov, ki da je jo naj bolj še re - zul ta te (96, 97). Raz voj sta ti stič nih me tod ka že, da ži vimo v izred no za ni mi vih ča sih, ko se tehno loš ki raz voj iz ana lit ske ke mi je in mi krof lui di ke zač ne odra ža ti tudi na ko li či ni po dat kov v mi kro bio lo gi ji, s či mer so po ve za ni tudi zelo po memb ni pre bo ji pri upo ra bi sta ti stič - nih me tod pri ana li zi to vrst nih po dat kov. Tipi iz ve de nih ana liz se se daj pre mi ka jo s po droč ja GWAS (angl. ge no me wide as so - cia tion stu dies) na po droč ja, kjer se me ta ge - nom ski, me ta bo lom ski in ge nom ski po - dat ki in te gri ra jo zno traj sku pi ne ter med sku pi na mi po dat kov. Zato mi kro bio lo gi ja kot taka da nes pred stav lja le eno iz med rav - ni ana li ze kom plek snih si ste mov, kot je člo - vek. V ta kem si ste mu med se boj no rea gi rajo ge nom, tran skrip tom, pro teom in me ta bo - lom člo ve ka, z me ta ge no mi, me ta tran skrip - to mi, me ta pro teo mi in me ta me ta bo lo mi mi krob nih združb ter nji ho vi mi kom plek - sni mi ek stra ce lu lar ni mi ve zi kli, zu naj ce lič - no DNA in mi kro RNA. Od zi vi si ste ma se spre mi nja jo sko zi pro stor in čas, v od vi sno - sti od ak tiv no sti, pre hra ne, cir ka dia ne ga rit - ma in dru gih last no sti go sti te lja. Za ra di kom plek sno sti ana liz nam na - predek v tem tre nut ku omo go ča le pri stop od zgo raj navz dol, v ka te rem sprem lja mo mno ži ce po dat kov na vseh teh ni vo jih ter jih in te gri ra mo v sku pen mo del ce lot ne ga si ste ma (38–40, 98–100). Po tr di tve ni fak to - rial ni pri sto pi od spo daj navz gor pa so iz - ve de ni v nad zo ro va nih eks pe ri men tih, kjer mno ži ce prej spre men lji vih pa ra me trov lah ko nad zo ru je mo in ohra nja mo nes pre - men lji ve ter iz luš či mo vpliv po sa mez nih spre men ljivk, pre poz na nih v sklo pu pri sto - pa od zgo raj navz dol (101). ZaKLJUČEK Med me to da mi za opre de lje va nje se sta ve mi krob ne združ be v pre bav nem trak tu člo - ve ka naj bolj za nes lji ve in po ved ne po datke po nu ja sek ven ci ra nje. Med raz lič ni mi iz ved - ba mi sek ven ci ra nja se naj po go ste je upo rab - lja sek ven ci ra nje in for ma tiv nih de lov mi krob nih ge no mov. Za us pe šno in hi tro iz - ved bo ana li ze so med dru gi mi ključ ni de - jav ni ki: ve li kost vzor ca, us trez no rav na nje z vzor ci, upo ra ba kon trol, one sna že nje z go - sti te lje vo DNA ali DNA dru gih vzor cev ali med pot jo od vze ma, ek vi mo lar na raz de li - tev ko li či ne DNA pri več vzor cih in na zadnje 229MedRazgl.2019;58(2): do volj ve li ka ra čun ska moč za iz ved bo bio - in for mat skih in sta ti stič nih ana liz. Kot slabost se pri preu če va nju več je ga šte vi la vzor cev po ka že ve lik fi nanč ni vlo žek, ki je po tre ben za iz ved bo ana li ze. V pri me ru, da ve lik fi nanč ni za lo gaj ni ome ji tev in da pri - ča ko va no one sna že nje z go sti te lje vo DNA ni pre ve li ko, po tem je smi sel no na iz bra nih vzor cih iz ve sti sek ven ci ra nje me ta ge no - mov. Tako pri de mo do do dat nih tak so nom - skih in funk cio nal nih na po ve di. Oro dij, ki omo go ča jo ob de la vo me ta ge nom skih po dat - kov, je ve li ko, saj je do tič no po droč je izred - no ak tiv no in se hi tro raz vi ja. Kljub temu do se daj še ni raz vi te ga pro gra ma, ki bi omo - go čal poe no te no ana li zo po dat kov sek ven - ci ra nja ce lot ne ga ge no ma. Sled nje po go sto pri ve de do tega, da je dob lje ne re zul ta te v raz lič nih ra zi ska vah zelo tež ko pri mer ja - ti med sabo. Za ra di ne pred stav lji ve ga raz vo ja teh nik, pri sto pov, sta ti sti ke ter ne na zad nje na či - na raz miš lja nja zato niti ni več pre se net lji - vo, da se v skup no sti po jav lja ob ču tek, da to vrst ne ana li ze niso več del mi kro bio lo gije. To je v bis tvu na pa čen ok vir raz miš lja nja, ki pred vsem za vra ča spre mem be na po - dročju mi kro bio lo gi je. Če ima mo pred očmi te ža ve Koc ha in Pa steur ja pri uve ljav lja nju znans tve ne ga mi kro bio loš ke ga na či na raz - miš lja nja s per cep ci ja mi ke mi kov, fi zi kov in me di cin cev ta krat ne ga ča sa, se ne mo re mo izog ni ti spoz na nju, da je mi kro bio lo gi ja teh - no loš ko pod pr ta in po ga nja na veda, ki se ple me ni ti s pre sto pa njem psev do tra di cio - nal nih ok vir jev go je nja, z raz vo jem last nih ter s spre je ma njem idej z dru gih po dro čij zna no sti. Na enak na čin je v pre te klo sti spre je la mi kro sko pi jo od as tro no mi je ter DGGE iz me di cin ske ana li ze mu ta cij, tako mi krof lui di ko iz ke mi je, stroj no kr mi lje nje iz elek tro teh ni ke, ro bo te iz stroj niš tva, bio - in for ma ti ko in HPCC od ra ču nal niš tva ter ne pa ra me trič no vejo ana liz iz sta ti sti ke. Šele sku pek znanj z dru gih po dro čij je tako omo go čil pre mik mi kro bio lo gi je na prej s po dro čij, kjer je ko rist no de lo va la pre teklo sto let je, na po droč ja, kjer je nje na po moč še to li ko bolj po treb na: slad kor na bo le zen tipa 2, ast ma, prez god nji po rod, aler gi je, kronič na ob struk tiv na pljuč na bo le zen, de - belost, pre snov ni sin drom, de pre si ja itd. Prav po ve za va znanj z raz lič nih po dro čij, ki obrav na va jo raz lič ne ve li kost ne raz re de, pa po nu ja mož no sti za bolj ci lja ne ana li ze po sa mez nih pri me rov ter nji ho vo bolj in - di vi dual no obrav na vo. Na ta po droč ja vsto - pa jo nove teh no lo gi je s po droč ja sek ven ci - ra nja be lja ko vin, oli go sa ha ri dov, maš čob in dru gih kom plek snih mo le kul. 230 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be … LITERaTURa 1. HooperLV,GordonJI.Commensalhost-bacterialrelationshipsinthegut.Science.2001;292(5519):1115–8. 2. TjalsmaH,BoleijA,MarchesiJR,etal.A bacterialdriver-passengermodelforcolorectalcancer:beyondthe usualsuspects.NatRevMicrobiol.2012;10(8):575–82. 3. TurnbaughPJ,LeyRE,HamadyM,etal.Thehumanmicrobiomeproject.Nature.2007;449(7164):804–10. 4. QinJ,LiR,RaesJ,etal.A humangutmicrobialgenecatalogueestablishedbymetagenomicsequencing.Na- ture.2010;464(7285):59–65. 5. EckburgPB,BikEM,BernsteinCN,etal.Diversityofthehumanintestinalmicrobialflora.Science.2005;308 (5728):1635–8. 6. AmannRI,LudwigW,SchleiferKH.Phylogeneticidentificationandinsitu detectionofindividualmicrobial cellswithoutcultivation.MicrobiolRev.1995;59(1):143–69. 7. FraherMH,O’ToolePW,QuigleyEM.Techniquesusedtocharacterizethegutmicrobiota:a guideforthecli- nician.NatRevGastroenterolHepatol.2012;9(6):312–22. 8. KolbertCP,PersingDH.RibosomalDNAsequencingasa toolforidentificationofbacterialpathogens.Curr OpinMicrobiol.1999;2(3):299–305. 9. FischerSG,LermanLS.DNAfragmentsdifferingbysinglebase-pairsubstitutionsareseparatedindenatu- ringgradientgels:correspondencewithmeltingtheory.ProcNatlAcadSciUSA.1983;80(6):1579–83. 10. MuyzerG,SmallaK.Applicationofdenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)andtemperaturegradient gelelectrophoresis(TGGE)inmicrobialecology.AntonieVanLeeuwenhoek.1998;73(1):127–41. 11. OsbornAM,MooreER,TimmisKN.Anevaluationofterminal-restrictionfragmentlengthpolymorphism(T- RFLP)analysisforthestudyofmicrobialcommunitystructureanddynamics.EnvironMicrobiol.2000;2(1): 39–50. 12. StresB.Thefirstdecadeofterminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism(T-RFLP)inmicrobialeco- logy.ActaAgriculturaeSlovenica.2006;88(2):65–73. 13. FisherMM,TriplettEW.Automatedapproachforribosomalintergenicspaceranalysisofmicrobialdiversity anditsapplicationtofreshwaterbacterialcommunities.ApplEnvironMicrobiol.1999;65(10):4630–6. 14. Franke-WhittleIH,ManiciLM,InsamH,etal.Rhizospherebacteriaandfungiassociatedwithplantgrowth insoilsofthreereplantedappleorchards.PlantandSoil.2015;395(1–2):317–33. 15. PalmerC,BikEM,EisenMB,etal.Rapidquantitativeprofilingofcomplexmicrobialpopulations.NucleicAcids Res.2006;34(1):e5. 16. NovakD,Franke-WhittleIH,PircET,etal.Bioticandabioticprocessescontributetosuccessfulanaerobicde- gradationofcyanidebyUASBreactorbiomasstreatingbrewerywastewater.WaterRes.2013;47(11):3644–53. 17. CareyCM,KirkJL,OjhaS,etal.Currentandfutureusesofreal-timepolymerasechainreactionandmicroar- raysinthestudyofintestinalmicrobiota,andprobioticuseandeffectiveness.CanJMicrobiol.2007;53(5): 537–50. 18. HenryS,BruD,StresB,etal.QuantitativedetectionofthenosZgene,encodingnitrousoxidereductase,and comparisonoftheabundancesof16SrRNA,narG,nirK,andnosZgenesinsoils.ApplEnvironMicrobiol.2006; 72(8):5181–9. 19. HeatherJM,ChainB.Thesequenceofsequencers:thehistoryofsequencingDNA.Genomics.2016;107(1): 1−8. 20. VoelkerdingKV,DamesSA,DurtschiJD.Next-generationsequencing:frombasicresearchtodiagnostics.Clin Chem.2009;55(4):641−58. 21. HolleyRW,ApgarJ,MerrilSH,etal.Nucleotideandoligonucleotidecompositionsofthealanine-,valine-,and tyrosine-acceptorsolubleribonucleicacidsofyeast.JAmChemSoc.1961;83(23):4861–2. 22. SangerF,NicklenS,CoulsonAR.DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.ProcNatlAcadSciUSA. 1977;74(12):5463–7. 23. NHGRI:Thecostofsequencinga humangenome[internet].NationalHumanGenomeResearchInstitute; [citirano2017Apr20].Dosegljivona:https://www.genome.gov/sequencingcosts 24. Chaucheyras-DurandF,OssaF.Therumenmicrobiome:abundance,diversity,andnewinvestigativetools. TheProfAnimSci.2014;30(1):1–12. 25. MarguliesM,EgholmM,AltmanWE,etal.Genomesequencinginopenmicrofabricatedhighdensitypico- literreactors.Nature.2005;437(7057):376–80. 231MedRazgl.2019;58(2): 26. KawashimaEH,FarinelliL,MayerP.Methodofnucleicacidamplification.Googlepatents[internet].2005; 8476044:B2. 27. MardisER.Next-generationDNAsequencingmethods.AnnuRevGenomicsHumGenet.2008;9:387–402. 28. RuskN.Torrentsofsequence.NatureMethods.2010;8:44. 29. Valouev,A,IchikawaJ,TonthatT,etal.A high-resolution,nucleosomepositionmapofC.elegans reveals a lackofuniversalsequence-dictatedpositioning.GenomeRes.2008;18(7):1051–63. 30. SchusterSC.Next-generationsequencingtransformstoday’sbiology.NatMethods.2008;5(1):16–8. 31. PorrecaGJ.Genomesequencingonnanoballs.NatureBiotech.2010;28(1):43–4. 32. DrmanacR,SparksAB,CallowMJ,etal.Humangenomesequencingusingunchainedbasereadsinself-as- semblingDNAnanoarrays.Science.2010;327(5961):78–81. 33. SchadtEE,TurnerS,KasarskisA.A windowintothird-generationsequencing.HumMolGenet.2010;19(2): 227–40. 34. RhoadsA,AuKF.PacBiosequencinganditsapplication.Genomics,Proteomics&Bioinformatics.2015;13 (5):278–89. 35. PathakB,LofasH,PrasongkitJ,etal.Double-functionalizednanopore-embeddedgoldelectrodesforrapid DNAsequencing.ApplPhysLetters.2012;100(2):023701. 36. Korlach,J,MarksPJ,CiceroRL,etal.Selectivealuminumpassivationfortargetedimmobilizationofsingle DNApolymerasemoleculesinzero-modewaveguidenanostructures.ProcNatlAcadSciUSA.2008;105(4): 1176–81. 37. delaTorreR,LarkinJ,SingerA,etal.Fabricationandcharacterizationofsolid-statenanoporearraysforhigh- throughputDNAsequencing.Nanotechnology.2012;23(38):385308. 38. SketR,TreichelN,DebevecT,etal.Hypoxiaandinactivityrelatedphysiologicalchanges(constipation,inf- lammation)arenotreflectedatthelevelofgutmetabolitesandbutyrateproducingmicrobialcommunity: ThePlanHabstudy.FrontPhysiol.2017;8:250. 39. SketR,TreichelN,KublikS,etal.Hypoxiaandinactivityrelatedphysiologicalchangesprecedeortakepla- ceinabsenceofsignificantrearrangementsinbacterialcommunitystructure:ThePlanHabrandomizedpi- lottrialstudy.PLoSOne.2017;12(12):e0188556. 40. SketR,DebevecT,KublikS,etal.Intestinalmetagenomesandmetabolomesinhealthyyoungmales:inac- tivityandhypoxiageneratednegativephysiologicalsymptomsprecedemicrobialdysbiosis.FrontPhysiol. 2018;9:198. 41. BajukJ.Metaanalizapodatkovo humanimikrobioti[magistrskodelo].Ljubljana:Univerzav Ljubljani;2017. 42. MendeDR,WallerAS,SunagawaS,etal.Assessmentofmetagenomicassemblyusingsimulatednextge- nerationsequencingdata.PLoSOne.2012;9(11):e114063. 43. LiuY,FergusonJF,XueC,etal.Evaluatingtheimpactofsequencingdepthontranscriptomeprofilinginhu- manadipose.PLoSOne.2013;8(6):1–10. 44. GillSR,PopM,DeBoyR.T,etal.Metagenomicanalysisofthehumandistalgutmicrobiome.Science.2006; 312(5778):1355–9. 45. EdgarRC,HaasBJ,ClementeJC,etal.UCHIMEimprovessensitivityandspeedofchimeradetection.Bioin- formatics.2011;27(16):2194–200. 46. SchlossPD,WestcottSL,RyabinT,etal.Introducingmothur:open-source,platform-independent,commu- nity supported software for describing and comparingmicrobial communities. Appl Environ Microbiol. 2009;75(23):7537–41. 47. LozuponeC,KnightR.UniFrac:a newphylogeneticmethodforcomparingmicrobialcommunities.ApplEn- vironMicrobiol.2005;71(12):8228–35. 48. LozuponeC,LladserME,KnightsD,etal.UniFrac:aneffectivedistancemetricformicrobialcommunitycom- parison.ISMEJ.2011;5(2):169–72. 49. KuczynskiJ,StombaughJ,WaltersWA,etal.UsingQIIMEtoanalyze16SrRNAgenesequencesfrommicro- bialcommunities.CurrProtocBioinformatics.2011;10:934–5. 50. WangQ,GarrityGM,TiedjeJM,etal.NaiveBayesianclassifierforrapidassignmentofrRNAsequencesinto thenewbacterialtaxonomy.ApplEnvironMicrobiol.2007;73(16):5261–7. 51. ColeJR,WangQ,CardenasE,etal.TheRibosomalDatabaseProject:improvedalignments,newtoolsforrRNA analysis.NucleicAcidsRes.2009;37(Databaseissue):141–5. 52. McDonaldD,PriceMN,GoodrichJ,etal.AnimprovedGreengenestaxonomywithexplicitranksforecologi- calandevolutionaryanalysesofbacteriaandarchaea.ISMEJ.2012;6(3):610–8. 232 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be … 53. PruesseE,QuastC,KnittelK,etal.SILVA:a comprehensiveonlineresourceforqualitycheckedandaligned ribosomalRNAsequencedatacompatiblewithARB.NucleicAcidsRes.2007;35(21):7188–96. 54. FederhenS.TheNCBItaxonomydatabase.NucleicAcidsResearch.2012;40:136–43 55. TurnbaughPJ,GordonJI.Aninvitationtothemarriageofmetagenomicsandmetabolomics.Cell.2008;134 (5):708–13. 56. SegataN,BoernigenD,TickleTL,etal.Computationalmeta’omicsformicrobialcommunitystudies.MolSyst Biol.2013;9(1):666. 57. WooleyJC,GodzikA,FriedbergI.A primeronmetagenomics.PLoSComputBiol.2010;6(2):e1000667. 58. ThomasT,GilbertJ,MeyerF.Metagenomics –a guidefromsamplingtodataanalysis.MicrobInformExp. 2012;2:3. 59. PatelRK,JainM.NGSQCToolkit:a toolkitforqualitycontrolofnextgenerationsequencingdata.PLoSOne. 2012;7(2):e30619. 60. DavisMP,vanDongenS,Abreu-GoodgerC,etal.Kraken:a setoftoolsforqualitycontrolandanalysisofhigh- throughputsequencedata.Methods.2013;63(1):41–9. 61. YangX,LiuD,LiuF,etal.HTQC:a fastqualitycontroltoolkitforIlluminasequencingdata.BMCBioinfor- matics.2013;14:33. 62. MohammedMH,ChadaramS,KomanduriD,etal.Eu-Detect:analgorithmfordetectingeukaryoticsequen- cesinmetagenomicdatasets.JBiosci.2011;36(4):709–17. 63. SchmeiderR,EdwardsR.Fastidentificationandremovalofsequencecontaminationfromgenomicandme- tagenomicdatasets.PLoSOne.2011;6(3):e17288. 64. LiR,ZhuH,RuanJ,etal.Denovo assemblyofhumangenomeswithmassivelyparallelshortreadsequen- cing.GenomeRes.2010;20(2):265–72. 65. KuninV,CopelandA,LapidusA,etal.A Bioinformatician’sguidetometagenomics.MicrobiolMolBiolRev. 2008;72(4):557–78. 66. WangM,YeY,TangH.A deBruijngraphapproachtothequantificationofclosely-relatedgenomesina mi- crobialcommunity.JComputBiol.2012;19(6):814–25. 67. Claudel-RenardC,ChevaletC,FarautT,etal.Enzyme-specificprofilesforgenomeannotation:PRIAM.Nuc- leicAcidsRes.2003;31(22):6633–9. 68. BatemanA,CoinL,DurbinR,etal.ThePfamproteinfamiliesdatabase.NucleicAcidsRes.2004;32(Data- baseissue):138–41. 69. HaftDH,SelengutJD,WhiteO.TheTIGRFAMsdatabaseofproteinfamilies.NucleicAcidsRes.2003;31(1): 371–3. 70. SonnhammerEL,VonHeijneG,KroghA.A hiddenMarkovmodelforpredictingtransmembranehelicesin proteinsequences.ProcIntConfIntellSystMolBiol.1998;6:175–82 71. HusonDH,AuchAF,QiJ,etal.MEGANanalysisofmetagenomicdata.GenomeRes.2007;17(3):377–86. 72. HusonDH,MitraS,RuscheweyhHJ,etal.IntegrativeanalysisofenvironmentalsequencesusingMEGAN4. GenomeRes.2011;21(9):1552–60. 73. ZhuW,LomsadzeA,BorodovskyM.Abinitio geneidentificationinmetagenomicsequences.NucleicAcids Res.2010;38(12):e132. 74. Mitra,S,RupekP,RichterCD,etal.FunctionalanalysisofmetagenomesandmetatranscriptomesusingSEED andKEGG.BMCBioinformatics.2011;12Suppl1:21. 75. KanehisaM,GotoS.KEGG:Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes.NucleicAcidsRes.2000;28(1):27–30. 76. SegataN,WaldronL,BallariniA,etal.Metagenomicmicrobialcommunityprofilingusinguniqueclade-spe- cificmarkergenes.NatMethods.2012;9(8):811–4. 77. MeyerF,PaarmannD,D’SouzaM,etal.ThemetagenomicsRASTserver –a publicresourcefortheautoma- ticphylogeneticandfunctionalanalysisofmetagenomes.BMCBioinformatics.2008;9:386. 78. MarkowitzVM,ChenIM,ChuK,etal.IMG/M:theintegratedmetagenomedatamanagementandcompa- rativeanalysissystem.NucleicAcidsRes.2012;40:123–9. 79. TanenbaumDM,GollJ,MurphyS,etal.TheJCVIstandardoperatingprocedureforannotatingprokaryoticme- tagenomicshotgunsequencingdata.StandGenomicSci.2010;2(2):229–37. 80. CA15120OpenMultiMed –OpenMultiscaleMedicine[internet].COSTEuropeanCooperationinScienceand Technology;c2012–2018[citirano2018Jun4].Dosegljivona:http://openmultimed.net/ 233MedRazgl.2019;58(2): 81. PortASAP-Europeannetworkforthepromotionofportable,affordableandsimpleanalyticalplatforms[in- ternet].COSTEuropeanCooperationinScienceandTechnology;c2012–2018[citirano2018Jun4].Doseglji- vona:http://portasap.eu/ 82. ChaoA.Non-parametricestimationofthenumberofclassesina population.ScaJSta.1984;11(4):265–70. 83. MagurranAE.Ecologicaldiversityanditsmeasurement.NewYork:PrincetonUniversityPress;1988. 84. StresB.Compositionanddiversityofdenitrifyingandtotalmicrobialcommunityincultivatedsoilwithge- neticmarkersnosZand16SrDNA[doktorskodelo].Ljubljana:Univerzav Ljubljani;2003. 85. KozichJJ,WestcottSL,BaxterNT,etal.Developmentofa dual-indexsequencingstrategyandcurationpi- pelineforanalyzingampliconsequencedataontheMiseqIlluminasequencingplatform.ApplEnvironMi- crobiol.2013;79(17):5112–20. 86. SchlossPD.Evaluatingdifferentapproachesthattestwhethermicrobialcommunitieshavethesamestruc- ture.ISMEJ.2008;2(3):265–75. 87. BenjaminiY,HochbergY.Controllingthefalsediscoveryrate:a practicalandpowerfulapproachtomultiple testing.JRStatSocSer.1995;57(1):289–300. 88. BenjaminiY,Yekutieli,D.Thecontrolofthefalsediscoveryrateinmultipletestingunderdepencency.Ann Stat.2001;29(4):1165–88. 89. SegataN,IzardJ,WaldronL,etal.Metagenomicbiomarkerdiscoveryandexplanation.GenomeBiol.2011; 12(6):R60. 90. WhiteJR,NagarajanN,PopM.Statisticalmethodsfordetectingdifferentiallyabundantfeaturesinclinical metagenomicsamples.PLoSComputBiol.2009;5(4):e1000352. 91. DufreneM,LegendreP.Speciesassemblagesandindicatorspecies:theneedfora flexibleasymmetricalap- proach.EcolMonogr.1997;67(3):345–66. 92. LiK,BihanM,MethéBA.Analysesofthestabilityandcoretaxonomicmembershipsofthehumanmicro- biome.PLoSOne.2013;8(5):e63139. 93. OksanenJ,BlanchetFG,KindtR,etal.Package»vegan«.Version2.2-1[internet].Nairobi:WorldAgroforestry; c2015[citirano2018Jun4]Dosegljivona:http://outputs.worldagroforestry.org/cgi-bin/koha/opac-detail.pl? biblionumber=39154. 94. ArmbrusterDA,PryT.Limitofblank,limitofdetectionandlimitofquantitation.ClinBiochemRev.2008; 29Suppl1:49–52. 95. TheHumanMicrobiomeProjectConsortium.Structure,functionanddiversityofthehealthyhumanmicro- biome.Nature.2012;486:207–14. 96. SczyrbaA,HofmannP,BelmannP,etal.Criticalassessmentofmetagenomeinterpretation-a benchmark ofmetagenomicssoftware.NatMethods.2017;14(11):1063–71. 97. CriticalAssessmentofMetagenomeInterpretation,CAMIChallenge[internet].Wien:DivisionofComputa- tionalSystemsBiology;c2017–2018[citirano2018Jun4].Dosegljivona:https://data.cami-challenge.org/ 98. SzeMA,SchlossPD.Lookingfora signalinthenoise:revisitingobesityandtheMicrobiome.MBio2016;7 (4):e01018–16. 99. CakirT,KhatibipourMJ.Metabolicnetworkdiscoverybytop-downandbottom-upapproachesandpathsfor reconciliation.FrontBioengBiotechnol.2014;2:62. 100. Perez-RiverolaY,BaiaM,FelipedaVL,etal.Discoveringandlinkingpublic»omics«datasetsusingtheomics discoveryindex.NatBiotechnol.2017;35(5):406–9. 101. EdwardsLM,ThieleI.Applyingsystemsbiologymethodstothestudyofhumanphysiologyinextremeen- vironments.ExtremPhysiolMed.2013;2:8. Prispelo7.8.2018 234 ana lit ski in kon cep tual ni iz zi vi pri ra zi sko va nju člo veš ke čre ve sne mi kro bio te za po tre be …