izvirno znanstveno delo UDK 665.327.3-543.061 SKUPNI POLIFENOLI, HiDROKSITIROSO L iN T1ROSOL V OLJČNI H OLJIH SLOVENSKE ISTRE V DVEH ZAPOREDNI H LETIH (1996, 1997) Bojan BUTINAR ZRS, SI-6000 Koper, Gartbaidijeva 18, E-mail: Bojan.Butinar@zrs-kp.si Milena BUČAR-MIKI..AVČIČ LABS, 6310 Izola, Zelena ulica 8, E-mail: Milena.Miklavcic@guest.ames.si Darinka ČAUj A LABS, SI-6310 Irola, Zelena ulica 3 IZVLEČEK Polifenoli (PfOH) so antioksidanti rastlinskega izvora. Plodovi oljke (Olea europaea L.) vsebujejo PfOH, ki jih delimo v tri skupine: v iridoidne glikozide - oleuropein (OLE), verbaskozid, ligstrozid (LIC); v flavonoide ter v nefiavonoidne spojine, derivate hidroksibenzojske oziroma cimetne kisline - hidroksitirosol (3,4-DHPEA) in tirosol (p-HPEA). V naSem laboratoriju smo 16 vzorcem oljčnih olj (OO) letnika 1996 in 21 vzorcem OO letnika 1997 določevali skupne PfOH. Vsebnost skupnih PfOH letnika 1996 je bila med 46 in 383 mg/kg, letnika 1997 pa med 56 in 408 mg/kg. Vzorcem OO letnika 1997 smo določili vsebnost PfOH p-HPEA (4,2-57,0 mg/kg) in 3,4-DHPEA (0,0-54,2 mg/kg). Delež vsote p-HPEA in 3,4-DHPEA se je za OO letnika 1997 v povprečju gibal med 3 in 51 odstotki skupnih PfOH. Ključne besede: istrska belica, oljčno olje, oleuropein, polifenoli, iridoidni glikozidi, tirosol, hidroksitirosol UVO D -v iridoide oziroma sekoiridoide (monoterpenske laktone) - oleuropein, verbaskozid, ligstrozid, ... (Hiroshi Družina fenolnih spojin, ki jo iz praktičnih razlogov Kuvvajima et al., 1988; Andary etai, 1982; Gariboldi ef imenujemo tudi polifenoli, je zelo pestra. Sestavlja do-al., 1986). bršen del "polarne frakcije", ki jo definiramo kot seg­ment, pridobljen pri ekstrakciji plodov ali olja z me­šanico metanola in vode. Termin polifenoli pa kljub vsemu ni najbolj posrečen, saj niso vse fenolne spojine, ki sestavljajo polarno frakcijo, polihidroksilne. Najbolj ohlapna definicija polifenolov je zato naslednja: to so rastlinske učinkovine, ki imajo na aromatskem obroču eno ali več hidroksilnih skupin. Polifenoli dajejo rastlinam barvo in okus. PREGLED DOSEDANJIH OBJAV Iz literature je poznano, da vsebujejo tako oljčni brstiči kot tudi listje in plodovi {in posledično olje) oljke (Olea europaea L.) (De Laurentis et al., 1997) polifenole, molekula OLEUROPEINA (zgornji segment je fenolni, ki jih v grobem razdelimo v tri skupine: srednji kislinski, spodnji pa glukozni) Bojan BUTINAR «1,1/.: SKUPNI POLiFENOLI, HSDROKSiTiROSOI. IN TIROSOL V OLJČNIH OLJIH .... 27-36 H0 S HIDROKS1TIROSOL (3,4-DHPEA) H O OH CH2OH O H O— C —CH= C O H \ / TIROSO L (p-HPEA) molekula VERBASKOZIDA C02Me O H VANILINSKA KiSLINA COOH molekula LiGSTROZIDA - v flavonoide (Amiot et al., 1986) - apigenin, kvercetin, luteoiin-7-glikozid... OCH3 OH FERULNA KiSLINA H HC= C COOH generična formula za FLAVONOIDE - in nefJavonoidne spojine, ki so predvsem derivati hidroksibenzojske oziroma cirnetne kisline (e.g. hidro­ •OCH3 ksitirosol, tirosol, vanilinska kislina, kavna kislina,...) ­{Butinar et al., 1996; Vrhovšek, 1996). Za slovensko poimenovanje nekaterih poiifenoiov glej Lavrenčič & Stibilj, 1999). OH Bojan BUTINAR ei si.: SKUPNI POUFENOLI, K I D ROKS IIIK050 L IN TIR0501. V OLIČNI H OLJI H ...,27-36 o,p-KUMARNA KISLiNA H HC = C COOH KAVN A KISLINA H HC = C COOH V zadnjih letih je pri oljčnih polifenolih težnja raziskav na sekoiridoidnih polifenolih - predvsem na oleuropetnu in na njegovih razpadnih produktih (Walter el al., 1973). Oleuropein je glikozid, spojina hidroksi­tirosolnega estra elenolne kisline z S-D-glukopiranozo ­oglejmo si ju na si. 1. COOH C02Me H SIRINGILNA KISLINA COOH CH30' vOCH3 OH CIMETNA KISLINA H HC= C COOH SI. 1: Molekuli ELENOLNE KISLINE in G-D-GLU­KOPIRANOZE. Fig. 1: Molecules of ELENOLIC ACID and fs-D-GLU­COP YRA N OSE. Koncentracija oleuropeina je v plodovih najvišja na prehodu pomladi v poletje, z dozorevanjem pa potekajo predvsem reakcije encimatske hidrolize - nastanek agli­kona (3,4-OHPEA-EA) (Capasso et al., 1996), ki kasneje prek vrste reakcij zreagira do končnih stopenj - elenolne kisline in hidroksitirosola (3,4-DHPEA) (Montedoro et al., 1992a, 1992b, 1993). Podobno je pri ligstrozidu, le hidroksitirosol je v vseh stopnjah zamenjan s tirosolom (p-HPEA). Na si. 2 je prikazana shema encimatske hidrolize oleuropeina do oleuropein aglikona (3,4-DHPEA-EA) ter njegova izomerizacija prek dialdehidne oblike (3,4­DHPEA-EDA) oziroma (p-HPEA-EDA). Bojan S (J TINA Si cl al.: SKUPNt POU F EN OU, H S DROKSiTI ROSO t [N TIROSOL V OIJČNSH OU ! H .... 27-36 COjMe SI. 2: Encimatska hidroliza oleuropeina do oleuropein aglikona (3,4-DHPEA-EA) ter njegova tzomerizacija prek dialdehidne oblike (3,4-DHPEA-EDA) -(Marsilio et al., 1996). Fig. 2: Enzymatic hydrolysis of oleuropeine to oleuropeine aglycone (3,4-DHPEA-EA) and its isomerisation through the dialdehydic form (3,4-DHPEA-EDA) step - (Marsilio et al., 1996). Del raziskav oieuropeinske razpadne verige skuša tako v primeru oij kot tudi plodov te produkte analitsko ločiti, okarakterizirati in določiti njihovo vsebnost (Cinquanta et al., 1997). Ločba in ovrednotenje potekata skoraj izključno ob pomoči preparativne kromatografije visoke ločljivosti {HPI.Q (Evangelisti et al., 1997). Pri karakterizaciji pa je treba uporabiti različne spektro­kopske metode (NMR, UV, !R, MS) (Limiroii et. al., 1995; Angerosa ef al., 1995). Tako je bilo v zadnjih letih na osnovi HPi.C polarne frakcije oljčnih olj (oziroma oljk) določenih kar nekaj produktov oieuropeinske razpadne verige (Baldioli ef al., 1996). MATERIAL IN METODE Material Olja Raziskavo smo naredili na 16 vzorcih oljčnih olj letnika 1996 in na 21 vzorcih letnika 1997. Prt letniku 1996 je bila sortna sestava naslednja: istrska belica (!B) ­6 vzorcev, istrska belica cepljena na črnico (I8C) -3 vzorci. 5 vzorcev je bilo mešanic (MIX), za 2 vzorca pa nismo imeli podatka (BP). 4 vzorci (3 MIX in 1 !8) so bili stisnjeni iz oljk, ki so bile med trganjem in predelavo hranjene v morski vodi oziroma slanici. Pri letniku 1997 pa: istrska belica (10 vzorcev), lec­cino (5 vzorcev), mešanice (6 vzorcev). Vsi vzorci so bili skladiščeni pri temperaturi 20 DC, nepredušno zaprti v temne steklenice. Standardi Skupni in orto dtfenoli Za standardizacijo pri določevanju količine skupnih polifenolov smo uporabili Folin-Gocalteau reagent pro­izvajalca Fluka Chemie A G (Buchs, Švica), kataloška številka 47641, in pa kavno kislino proizvajalca Fluka Chemie A G (Buchs, Švica), kataloška številka 60020. Ti roso! za H PLC Proizvajalec standarda je Fluka Chemie A G (Buchs, Švica), njegova kataloška številka je 56105. Z a umeritev smo pripravili metanolno raztopino tirosola koncen­tracije 420 mg/L (5 pL vbrizg). BDjan BUTINAR et a f.: SKUPNI POL I FL NOLI, HIDROKSITIROSOL IN TIROSOL V OUCNI H OL]!H ..., 27-36 Metode Ekstrakcija pol i fenolov 5 g olja smo raztopili v 50 mL heksana in iz tako pripravljene raztopine ekstrahirali polifenole s trikrat po 20 mL 60% vodne raztopine metanola. Pri vsaki ekstrak­ciji smo fazi stresali 2 minuti, iz združenih ekstraktov smo na rotavaporju pri temperaturi 40 °C odparili topilo. Suhi preostanek smo rekonstituirali v 1 mL metanola in ga do analize hranili pri temperaturi -20 aC . Določevanje skupnih polifenolov Skupne polifenole smo določevali tako, kot je to opisano v literaturi (Gutfinger, 1981). Princip metode sloni na modro obarvanem kompleksu, ki nastane pri oksidaciji polifenolov v alkalnem mediju ob pomoči fosforvolframove (VI) in fosformolibdenove (V!) kisline (Ranalli et al., 1999). 100 pL ekstrakta smo v 10 mL merilni bučki z vodo razredčili na 5 mL. Raztopini smo dodali 500 pL Folin-Ciocalteau reagenta. Po 3 minutah smo v bučko prilili 1 mL nasičene raztopine natrijevega karbonata (cca. 35%) ter vsebino premešali in dolili vodo do 10 mL oznake. Po 1 uri smo izmerili absor­banco pri 725E-9 m glede na slepi vzorec, ki so ga sestavljali vsi omenjeni reagenti. Umeritveno krivuljo smo izvedli s kavno kislino v koncentracijskem območju 0-100 pg na 10 mL raztopine. Absorbance smo izmerili s spektrofotometrom proizvajalca Milton Roy, model Spectronic Genesys S. Določevanje tirosola in hidroksitirosola Tirosol smo določili s tekočinsko kromatografijo vi­soke (HPLC) na osnovi retenzijskih časov uporabljenega standarda in znane umeritvene koncentracije. Hidro­ks iti roso I nega standarda nismo našli v nobenem kata­logu kemikalij, zato smo njegovo koncentracijo v vzorcih določili na osnovi literaturne primerjave reten­zijskega časa in pa privzetega odgovora detektorja (response factor) za tirosol. HPLC Uporabljali smo sistem, opremljen z gradientno črpalko, z avtoinjektorjem in U V/V i S detektorjem, mo­del 1050, proizvajalca Hewlett Packard. Polifenole smo ločevali na koloni Hypersii OD S 5pm, 4.6 x 200 mm (HP). Absorbanco eiuata smo merili pri 280E-9 m. Z a ločevanje smo uporabili mobilno fazo, ki je omenjena v literaturi (Brenes et al., 1992). Sestavljena je bila iz vode, nakisane s fosforno kislino do pH 2 (A), in acetonitrila (B), za lastne potrebe pa smo jo modificirali tako, da smo dosegli čim boljše ločevanje polifenolov. Pretok mobilne faze je bil 1 mL/min, čas analize pa 40 minut. Začeli smo s 95% A in 5% B. V 20 minutah smo A znižali na 75%, B pa zvišali na 25%. V naslednjih 20 minutah se je A spustil na 50%, 8 pa dvignil na 50%. V tej točki smo prenehali meriti absorbanco eiuata. Začeli smo s čiščenjem kolone, in sicer tako, da se je v naslednjih 5 minutah A znižal na 25%, B pa dvignil na 75%. Pri taki sestavi mobilne faze smo kolono čistili 10 minut in nato v naslednji minuti vzpostavili začetno sta­nje (95% A in 5% B) ter stabilizirali kolono še 14 minut pred naslednjim vbrizgom. Vbrizg je bil 50 pL rrteta­nolnega ekstrakta. Umeritev smo izvedli z metanolno raztopino tirosola koncentracije 420 mg/L. REZULTATI V tab. 1 so zbrani statistični podatki vsebnosti skup­nih polifenolov v oljčnih oljih letnika 1996 in 1997 v mg/kg: povprečje, standardna napaka (SD), mediana, min, max, število vzorcev (n). Pri vzorcih O O letnika 1996 smo vrednosti podali samo za vzorce OO , ki niso bili stisnjeni iz oljk, hranjenih v slanici. Tab. 1: Vsebnost polifenolov v oljčnih oljih letnikov 1996 in 1997 v mg/kg OO. letnik 1996 letnik 1997 Povprečje 207 213 SD 90 103 Mediana 184 210 Min 86 56 Max 383 408 n 12 21 Podatki o vsebnosti skupnih polifenolov v vzorcih ločljivosti letnika 1996 so grafično ponazorjeni na si. 3. Kot smo že ugotovili v prejšnjih letih (Butinar ef al.., 1996), so vrednosti najvišje pri vzorcih, ki so stisnjeni iz sorte istrska betica oziroma iz mešanic, kjer ima istrska belica največji delež. Zanimive so vrednosti za vzorce, ki so označeni temno - pri teh vzorcih so bile oljke pred prešanjem hranjene v slanici oziroma morski vodi. Kljub dejstvu da je sorta istrska belica prevladujoča sorta, so vrednosti relativno nizke. Te podatke gre pripisati dejstvu, da so glavni polifenoli (oleuropein in njegovi derivati) izredno dobro topni v polarnih topilih in se zato pri daljšem skladiščenju oljk v morski vodi oziroma slanici preprosto izločijo (»izlužtjo«) iz plodov. Taka olja so seveda tudi senzorično in antioksidativno revnejša. Na si. 4 smo prikazali vsebnost skupnih polifenolov v vzorcih oljčnih olj letnika 1997 - vzorci so razvrščeni po sortah. IB - istrska belica, L - leccino, M - mešanice dveh ali več sort. Bojan BUTINAR a .if.: SKUPNI POLIFENOLI, KIDROKSITIROSOL iN TIROSOL V OLIČNIH Olil H ..., 17H, VSEBNOST SKUPNIH POLIFENOLOV (mg/kg) V VZORCIH OLJČNIH OL J LETNIKA 1996 4SQ 300 IBC IBC IBC MIX IB BP IB IB IB IB MIX MIX IB MIX MIX BP SORTA (IBC - Istrska belica cepljena na črrtico, MIX - meSanica sort, (I SI. 3; Vsebnost skupnih poli fenolov v vzorcih OO letnika 1996. Fig. 3: Total polyphenols content In OO samples from the 1996 crop. VSEBNOST SKUPNIH POLIFENOLOV V VZORCIH 0 0 LETNIKA 1997 ! 3 I B I B I B I B SORTA {IS > isiTsks bofjca, L * Isccitio, M fttossfljcsi sort) SI. 4: Vsebnost skupnih polifenolov v vzorcih OO letnika 1997. Fig. 4: Total polyphenols content in OO samples from the 1997 crop. Bojsn 8UTINAR ei si: SKUPNI POIIFCNOU, HIDROKSSTIROSOI. !M TIROSOl V OUČNIH Ol.jlH ..., 37-36 VSEBNOSTI HIDROKSITIROSOLA !N TIROSOLA V VZORCIH OLJČNIH OL J LETNIKA 1957 408 380 392 33S 310 280 23? 220 212 211 210 173 173 144 142 136 122 121 111 100 56 KONCENTRACIJA SKUPNIH POUPENOLOV {mgikgj ZA POSAMEZNI VZOREC • HiDROKSITIROSOLffflgiKg) S71ROSOL