Imunski sistem pri rakih: predstavitev raziskav s kopenskim rakom 
Porcellio scaber 
Immune system in crustaceans: a presentation of research with terrestrial 
crustacean Porcellio scaber
Andraž Dolar*, Damjana Drobne, Rok Kostanjšek, Anita Jemec Kokalj
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, Večna pot 111,  
SI-1000 Ljubljana, Slovenija
*Korespondenca: andraz.dolar@bf.uni-lj.si
Izvleček: Zaradi stalne interakcije organizmov z okoljem so le ti tekom evolucije 
razvili zmožnost prepoznavanja in razlikovanja med lastnimi in tujimi molekulami in 
oblikovanja ustreznega odziva na tujke, kar je temeljna funkcija imunskega sistema. 
Enakonožci Porcellio scaber so predstavniki kopenskih rakov, podobno kot tudi dru-
ge skupine rakov pa imajo razvito naravno oziroma prirojeno imunost, ki jo tvorijo 
imunske celice ali hemociti ter humoralne komponente. Opisali smo tri različne tipe 
hemocitov, ki se nahajajo v hemolimfi: semigranularne (povprečno 65 %), granularne 
(17 %) in hialine (18 %). Podobno veliki semigranulociti (premer 11,2 ± 0,4 µm) in 
granulociti (premer 12,0 ± 0,3 µm) so ovalno do okrogle oblike, razlikujejo pa se v 
gostoti citoplazemskih granul, ki pri granulocitih prevladujejo. Okrogli hialinociti 
so manjši (8,1 ± 0,3 µm) in brez granul. Pri slednjih smo identificirali dva podtipa, 
pri čemer domnevamo, da podtip 1 z velikim in okroglim jedrom ter prevladujočim 
evkromatinom ustreza lastnostim zarodnih celic. Povprečna gostota prostih hemocitov 
v hemolimfi P� scaber je 3,50 ± 0.19 x 106 celic/mL. Poleg metod za merjenje celičnih 
komponent smo uspešno vpeljali metode za merjenje humoralnih komponent, kot so: 
fenol oksidazi podobna aktivnost, koncentracija dušikovega oksida ter aktivnosti anti-
oksidativnih encimov in alfa-2 makroglobulina. V primeru okužbe P� scaber z bakterijo 
(Rhabdochlamydia porcellionis) smo dokazali aktivacijo celičnega imunskega odziva 
z izrazito tvorbo nodulov s prevladujočim deležem semigranulocitov. S temi bazičnimi 
raziskavami smo si začrtali pot za nadaljnje raziskave na področju ekotoksikologije, 
metodologijo spremljanja imunskih procesov pa bi lahko v prihodnosti prenesli tudi 
na druge vrste rakov.
Ključne besede: enkapsulacija, fagocitoza, hemocit, melanizacija, nodulacija, 
signalna pot 
Abstract: The immune system is crucial to recognise and distinguish between self 
and nonself, and react to challenges posed by the environment. We present a review 
on the innate immunity of crustaceans, in particular terrestrial crustacean woodlice 
Porcellio scaber. The main effectors of immunity in crustaceans are haemocytes which 
 ACTA BIOLOGICA SLOVENICA 
 LJUBLJANA 2021 Vol. 64, Št. 1: 18–35
19Dolar et al.: Imunski sistem pri rakih
carry out the cellular immune processes and synthesise humoral defence components. 
We described three types of haemocytes in P� scaber: semigranulocytes (65% of freely 
circulating haemocytes), granulocytes (17%) and hyalinocytes (18%). The average 
density of free circulating haemocytes is 3.50 ± 0.19 x 106 cells/mL. Semigranulocytes 
and granulocytes are both oval shaped with a similar diameter (11.2 ± 0.4 µm and 12.0 
± 0.3 µm, respectively), but granulocytes have a higher density of granules which are 
also larger than in the case of semigranulocytes. Hyalinocytes are round, agranular 
and smaller (8.1 ± 0.3 µm). Two types of hyalinocytes were discovered. One subtype 
is of particular interest, as it has a very large nucleus with dominating euchromatine 
resembling properties of the stem progenitor cells. We have implemented new me-
thods to measure humoral components in the haemolymph of P� scaber. These are: 
phenoloxidase like activity, nitric oxide levels, antioxidant enzyme activity and alpha-
2-macroglobulin. The formation of nodules was noted in the case of P� scaber infection 
with bacteria Rhabdochlamydia porcellionis. Our future research will be focused to 
investigate the immune response of P� scaber at the proteome and transcriptome level.
Keywords: encapsulation, haemocyte, melanization, nodulation, phagocytosis, 
signal pathway
uvod
Organizmi zaznavajo zunanje in notranje 
okolje, se nanj odzivajo in s tem ohranjajo no-
tranje ravnovesje, kar omogoča njihov razvoj in 
preživetje. Ob soočenju organizma z neznanimi 
dejavniki v okolju, kot so npr. okužbe s potencialno 
patogenimi mikroorganizmi in paraziti, abiotskimi 
spremembami in onesnaženostjo okolja, se sproži 
obrambni odziv ali pa se le-ta prilagodi na nove 
razmere (Boraschi in sod. 2020). Zaradi stalne inte-
rakcije z omenjenimi biotskimi oziroma abiotskimi 
dejavniki v okolju so organizmi tekom evolucije 
razvili zmožnost prepoznave in razlikovanja med 
lastnimi in tujimi molekulami ter nabor imunskih 
odzivov z raznolikimi efektorskimi mehanizmi 
(Jiravanichpaisal in sod. 2006, Milutinović in 
sod. 2016, Ihan 2020). 
V znanstveni literaturi je na voljo veliko 
študij o imunskem odzivu nevretenčarjev na 
različne vrste stresa (Hauton 2012, Labaude in 
sod. 2017, Boraschi in sod. 2020), medtem ko je 
proučevanje odziva imunskega sistema nevre-
tenčarjev v slovenskem raziskovalnem prostoru 
dokaj novo raziskovalno področje (Kostanjšek 
in Marolt 2015, Tesovnik in sod. 2017, Dolar in 
sod. 2020). Na Katedri za zoologijo, Oddelka 
za biologijo, Biotehniške fakultete, Univerze v 
Ljubljani, smo v zadnjih letih opisali imunski odziv 
kopenskega enakonožnega raka vrste Porcellio 
scaber (navadni prašiček), kot odziv na različne 
vrste stresa (Kostanjšek in Marolt 2015, Dolar in 
sod. 2020, 2021, Mayall in sod. 2021). Vpeljali 
smo tehnike za analizo posameznih komponent 
imunskega sistema enakonožnih rakov ter opisali 
ultrastrukturo in morfologijo krvnih celic oziroma 
hemocitov. V tem prispevku želimo širši publiki 
podrobneje predstaviti imunski sistem rakov in 
raziskave, ki so bile opravljene pri kopenskih 
rakih s poudarkom na vrsti P� scaber�  
Imunski sistem rakov
Temeljno obrambo rakov pred zunanjimi 
dejavniki predstavljajo vedenjske prilagoditve 
(izogibanje) ter fizikalna in kemijska pregrada, 
ki jo tvorijo zunajcelični matriksi in izločki žlez 
integumenta (Jiravanichpaisal in sod. 2006, 
Rowley in Powell 2007) in črevesnega epitela 
(npr. kutikula, peritrofna membrana). Struktura 
kutikule telesne površine in prebavne cevi ter 
prisotnost peritrofne membrane se pri različnih 
skupinah rakov zelo razlikujeta (Van Der Zande 
in sod. 2020). Debelina kutikule, prisotnost in 
velikost por ter peritrofna membrana pomembno 
vplivajo na potencialen prehod mikroorganizmov 
v telesno votlino. Poleg omenjenega pa k obrambi 
pred patogenimi mikroorganizmi oziroma tujimi 
molekulami, ki lahko resno ogrozijo organizem, 
20Acta Biologica Slovenica, 2021, 64 (1), 18–35
dodatno prispevajo še encimi, antimikrobni peptidi, 
reaktivne kisikove zvrsti, surfaktanti in nizek pH v 
prebavilu (Jiravanichpaisal in sod. 2006, Buchon 
in sod. 2014, Van Der Zande in sod. 2020). 
Vsi nevretenčarji, vključno z raki, imajo razvite 
mehanizme prirojene imunosti, ki zagotavljajo 
hitro in nespecifično obrambo (Boraschi in sod. 
2020). Poleg teh pa so pri nevretenčarjih potrdili 
tudi obstoj imunskega spomina, ki omogoča hitrejši 
in učinkovitejši odziv organizma ob ponovnem 
stiku s patogenom ali drugim dražljajem (Melillo in 
sod. 2018), kar je sicer osnovna lastnost pridobljene 
imunosti pri vretenčarjih. Eden izmed argumentov 
o obstoju specifične imunosti in imunskega spo-
mina pri dekapodnih rakih je izrazita variabilnost 
vezavne domene celične adhezijske molekule, 
ki so jo prvič opisali pri ljudeh z Downovim 
sindromom (DSCAM, angl. down syndrome cell 
adhesion molecule) (Hauton 2012). Kljub temu 
pri nevretenčarjih redko govorimo o pridobljeni 
imunosti, saj so pojav imunskega spomina doslej 
opisali predvsem na nivoju celotnega organizma, 
(npr. kot povečana imunokompetenca), molekulski 
mehanizmi procesa pa še niso pojasnjeni. 
Prirojeno imunost tvorijo celične komponente 
(celice z različnimi obrambnimi mehanizmi) in 
humoralne komponente (proteinski kompleksi v 
tkivih in telesnih tekočinah). Obe komponenti 
sta soodvisni in delujta usklajeno (Hauton 2012). 
Glavni nosilci celične komponente prirojenega 
imunskega odziva rakov so celice hemolimfe 
oz. hemociti, ki poleg vrste obrambnih procesov 
na nivoju celic sintetizirajo tudi večino molekul 
humoralne obrambe. Hkrati pa je znano, da pri 
rakih molekule humoralne telesne obrambe izlo-
čajo tudi celice drugih tkiv, npr. prebavne žleze 
poznane kot hepatopankreas (Xu in sod. 2020). 
Hemociti
Hemociti so celice krvožilnega sistema pri 
rakih, ki se pretežno nahajajo prosto v hemolimfi, 
lahko pa tudi migrirajo v druga tkiva (Chevalier 
in sod. 2011, Söderhäll 2016, Tassanakajon in 
sod. 2018). V splošnem pri rakih ločimo tri tipe 
hemocitov, ki se razlikujejo po velikosti, razmerju 
med citoplazmo in jedrom in v prisotnosti ter 
gostoti citoplazemskih granul (Bauchau 1981). 
Semigranularne (t. i. semigranulociti) in granularne 
celice (t. i. granulociti) imajo podobno velikost, 
manjše okroglo ali ledvičasto jedro in citoplazem-
ske granule različnih velikosti. Ta dva celična tipa 
se ločita v gostoti citoplazemskih granul, ki je pri 
granulocitih občutno večja. Hialine celice (t. i. 
hialinociti) so najmanjše celice z relativno velikim 
jedrom in brez granul v citoplazmi (Jiravanichpai-
sal in sod. 2006, Chevalier in sod. 2011, Söderhäll 
2016). Izraz hialin pomeni »steklast, prosojen«, 
in izhaja iz odsotnosti citoplazemskih granul teh 
celic (Mikrobiološki slovar 2013). Na primeru 
hemocitov pri ostrigah (Crassostrea rhizophorae) 
so pokazali, da različni tipi hemocitov predstavljajo 
različne razvojne stopnje, torej, da se hialinociti 
pretvorijo v semigranulocite ti pa v granulocite. V 
primeru stresa, npr. zaradi okoljskih sprememb ali 
onesnažila, pa granulociti lahko degranulirajo in 
postanejo semigranulociti (Rebelo in sod. 2013). 
Slednje se kaže kot trend povečevanja števila gra-
nulocitov ter manjšanja števila semigranulocitov 
ob naraščanju koncentracije onesnažila, kar smo 
pokazali na primeru P� scaber izpostavljenemu 
pesticidu v zemlji (Dolar in sod. 2021). 
Vsak tip hemocitov opravlja določeno funk-
cijo, ki pa se med različnimi skupinami rakov 
lahko razlikujejo (Söderhäll 2016). Kljub temu 
so hialinociti večine rakov udeleženi zlasti v 
proces fagocitoze, semigranulociti pri nodulaciji 
in enkapsulaciji ter v manjšem obsegu fagoci-
tozi ter sintezi humoralnih molekul, granulociti 
pa so pretežno vključeni v sintezo in izločanje 
molekul humoralne obrambe (Chevalier in sod. 
2011, Mangkalanan in sod. 2014, Kostanjšek in 
Pirc Marolt, 2015, Jia in sod. 2017, Zhou in sod. 
2018) (Sl. 1). Poleg osrednje vloge v procesih 
celične imunosti, hemociti sodelujejo tudi pri 
regeneraciji poškodovane kutikule (Halcrow in 
Smith 1986) in mišičnega tkiva (Uhrík in sod. 
1989) ter nevrogenezi (Da Silva in sod. 2015).
Hematopoetski organ
Podobno kot pri ostalih nevretenčarjih, 
hemociti pri rakih nastajajo in zorijo v special-
iziranem tkivu, t. i. hematopoetskem organu. 
Le-ta je sestavljen iz lobulov, ki vsebujejo 
hemocite različnih razvojnih stopenj: zarodne 
celice, diferencirajoče in zrele celice. Zorenje 
celic poteka od centra nodula navzven, od koder 
21Dolar et al.: Imunski sistem pri rakih
se nato sproščajo v hemolimfo, ki organ obliva, 
kot diferencirani hemociti (Chevalier in sod. 2011, 
Lin in Söderhäll 2011, Söderhäll 2016). Nekatere 
raziskave poročajo, da so hemociti lahko sproščeni 
v hemolimfo tudi kot nediferencirane celice 
(Söderhäll in sod. 2003). Hemociti, ki krožijo v 
hemolimfi se ne delijo, zato se odmrli hemociti 
v obtoku neprestano nadomeščajo s sproščanjem 
novih celic iz hematopoetskega organa (Söderhäll 
in Cerenius 1992). Morfologija lobulov se pri 
različnih vrstah rakov lahko zelo razlikuje (van 
de Braak in sod. 2002). 
Prepoznavanje tujih in lastnih molekul ter 
aktivacija humoralnega in celičnega imunskega 
odziva 
Imunski sistem deluje v treh ključnih zapored-
nih korakih: (i) vezavi molekularnih vzorcev 
mikroorganizmov oziroma patogenov (M/PAMP, 
angl. microbial/pathogen-associated molecular 
patterns) in molekularnih vzorcev povezanih 
s poškodbo (DAMP, angl. damage-associated 
molecular patterns) na receptorje za prepoznavo 
molekularnih vzorcev M/PAMP in DAMP (PRR, 
angl. pattern recognition receptors) (Wang in 
Wang 2013, Tran in sod. 2020), (ii) aktivaciji 
 
Slika 1:   Poenostavljen shematski model celičnih in humoralnih mehanizmov prirojene imunosti rakov. Shema 
prirejena po Smith in sod. (2003) in Dolar (2021). Hd-PO; molekula hemocianina s fenol oksidazno 
aktivnostjo, PRR; receptorji za prepoznavo molekularnih vzorcev, ROS; reaktivne kisikove zvrsti, RNS; 
reaktivne dušikove zvrsti� Puščica s polno črto prikazuje povezavo različnih komponent in odzivov pri-
rojene imunosti, puščica s prekinjeno črto pa prikazuje zaporedje aktivacije komponent telesne obrambe.
Figure 1:  Simplified schematic model of the cellular and humoral mechanisms of innate immunity in crustaceans. 
Scheme adapted from Smith et al. (2003) and Dolar (2021). Hd- PO; molecule of hemocyanin with 
phenoloxidase activity, PRR; pattern recognition receptors, ROS; reactive oxygen species, RNS; reac-
tive nitrogen species. Arrows with solid line indicate the connection of the different components and 
reactions of innate immunity, arrows with dashed line represent the activation sequence of body defense.
22Acta Biologica Slovenica, 2021, 64 (1), 18–35
signalnih poti in (iii) proženju ustreznih celičnih 
in humoralnih efektorskih mehanizmov (Loker in 
sod. 2004, Tassanakajon in sod. 2018). Pri uporabi 
slovenske terminologije smo se deloma oprli na 
strokovna dela avtorjev Kotnik in sod. (2010) in 
Ihan (2020), v priloženem slovarju (Tab. 1) pa smo 
ključne imunološke pojme in kratice tudi razložili. 
tabela 1:  Slovar imunoloških pojmov in kratic.  
table 1:  Glossary of immunological terms and abbreviations.
Pojem Opis
Imunski sistem Organski sistem večceličnih organizmov s sposobnostjo razlikovanja med telesu lastnimi in 
telesu tujimi molekulami ter odstranjevanja tujkov
Naravna ali prirojena 
imunost
Evolucijsko starejši mehanizmi imunskega odziva, ki zagotavljajo hiter in nespecifičen 
odziv na prisotnost tujka in poškodovanih lastnih celic oziroma molekul (angl. innate 
immunity)
Celični imunski mehanizmi Mehanizmi, ki vključujejo fagocitiranje, noduliranje in enkapsuliranje tujkov v telesu 
gostitelja
Humoralni imunski 
mehanizmi 
Odstranjevanje in uničevanje tujkov in lastnih poškodovanih celic oziroma molekul s 
komponentami humoralnega odziva, kot npr. antimikrobni peptidi, melanizacija (profenol 
oksidazni sistem), antioksidativni encimi, citokini, opsonini
Nodulacija Tvorba skupkov hemocitov okoli večjega tujka v telesu gostitelja, ki ga celice ne morejo 
fagocitirati
Enkapsulacija Večje nodulom podobne strukture, ki nastanejo v primeru večjih tujkov v telesu gostitelja 
(npr. gliste)
Fagocitoza Endocitotski proces požiranja tujkov
Hemociti Celice hemolimfe oziroma krvožilnega sistema pri rakih
Semigranulociti Semigranularni hemociti - večje celice hemolimfe z zmerno gostoto citoplazemskih granul
Granulociti Granularni hemociti - večje celice hemolimfe podobne velikosti kot semigranulociti, z 
visoko gostoto granul v citoplazmi
Hialinociti Hialini hemociti - manjše in agranularne celice hemolimfe z velikim jedrom glede na 
citoplazmo
M/PAMP Molekularni vzorci, povezani z mikroorganizmi oziroma patogeni (angl. microbial/
pathogen-associated molecular patterns)
DAMP Molekularni vzorci, povezani s poškodbo (angl. damage-associated molecular patterns)
PRR Receptorji za prepoznavo molekularnih vzorcev tujkov (angl. pattern recognition receptors)
Profenol oksidazni sistem Kompleksen sistem, ključen pri tvorbi rdeče-rjavega pigmenta melanina, ki je reguliran s 
številnimi encimi (npr. fenol oksidaza)
Antimikrobni peptidi Obrambni peptidi gostitelja so evolucijsko ohranjene komponente prirojene imunosti, ki 
sodelujejo pri humoralnem odzivu
NO Dušikov oksid (angl. nitric oxide) je reaktivna dušikova zvrst (RNS, angl. reactive nitrogen 
species), ki ima v celicah vlogo sekundarnega sporočevalca. Kot komponenta humoralne 
telesne obrambe deluje citotoksično in je udeležena pri razgradnji fagocitiranih tujkov
ROS Reaktivne kisikove zvrsti (angl. reactive oxygen species) nastajajo tekom aerobnega 
metabolizma in so udeležene v številne procese, med drugim imajo vlogo sekundarnih 
sporočevalcev, delujejo citotoksično in sodelujejo v razgradnji fagocitiranih tujkov
23Dolar et al.: Imunski sistem pri rakih
Receptorji za prepoznavo molekularnih vzor-
cev so netopni proteini na površini hemocitov in 
celic drugih tkiv (Wang in Wang 2013) oziroma 
topni proteini v hemolimfi (Coates 2012, Jin in 
sod. 2013). Pri rakih je poznana vrsta genov za 
različne skupine PRR, kot na primer: Toll-u po-
dobni receptorji (TLRs, angl. Toll-like receptors), 
vezavni protein za lipopolisaharide (LPS) in 
β-1,3-glukane (LGBPs, angl. lipopolysaccharide 
and β-1,3-glucan-binding proteins), lektin tipa 
C, galektin, odstranjevalni receptor (SR, angl. 
scavenger receptor), s fibrinogenom povezani 
proteini (FREPs, angl. fibrinogen-related proteins) 
in receptorji DSCAM (Wang in Wang 2013, 
Tassanakajon in sod. 2018, Tran in sod. 2020). 
Vezava molekularnih vzorcev M/PAMP ali 
DAMP na PRR sproži vnetni odziv s sproščan-
jem vnetnih mediatorjev (citokinov), hkrati pa 
se aktivira odstranjevanje tujkov s fagocitozo in 
eksocitoza humoralnih molekul (Ihan 2020). Z 
vezavo M/PAMP ali DAMP povzročena aktivacija 
receptorjev PRR inducira celične signalne poti, 
ki v jedru inducirajo izražanje genov imunskega 
odziva (Huang in Ren 2020, Tran in sod. 2020). 
Pri rakih poznamo tri glavne tovrstne signale poti: 
pot Toll, pot Imd in pot Jak/Stat. Signalno pot Toll 
aktivirajo zlasti po Gramu pozitivne bakterije, glive 
(oz. peptidoglikani in β-1,3-glukani) ter virusni 
proteini, signalno pot Imd aktivirajo po Gramu 
negativne bakterije in RNA virusi, signalna pot Jak/
Stat pa kontrolira številne biološke procese, med 
drugim proliferacijo in diferenciacijo hemocitov, 
embrionalni razvoj, regeneracijo poškodovanih 
tkiv, tvorbo antimikrobnih proteinov in proti-
virusni odziv z RNA interferenco (Li in Xiang 
2013, Morin-Poulard in sod. 2013, Du in sod. 
2016, Huang in Ren 2020). Poznan je tudi širok 
nabor signalni proteinov omenjenih poti. Ta pri 
signalni poti Toll na primer vključuje proteine 
Spätzle, MyD88, Pelle, Dorsal, Cactus, Traf6 
(Tassanakajon in sod. 2018). Aktivacija signalne 
poti Toll se odraža v regulaciji izražanja velikega 
števila z imunskim sistemom povezanih genov, 
ki kodirajo antimikrobne peptide, manjše peptide 
z neznano funkcijo, proteine, ki so udeleženi 
v melanizacijo in sistem strjevanja hemolimfe 
(De Gregorio in sod. 2002). Aktivacija signalne poti 
Imd vodi v aktivacijo transkripcijskega faktorja 
Relish, ki regulira izražanje genov z zapisom za 
antimikrobne peptide, kot so npr. krustin, lizocim 
in armadilidin (Becking in sod. 2020, Huang in 
Ren 2020).  
Celični imunski mehanizmi
Med glavne efektorske mehanizme prirojene 
celične imunosti uvrščamo fagocitozo, nodulacijo 
ter enkapsulacijo tujkov. Fagocitoza je evolucijsko 
ohranjen mehanizem prirojene imunosti. Izraz 
fagocitirati označuje endocitotski proces požiranja 
delcev večjih od 0,5 µm, kot so npr. mikroorganiz-
mi in fragmenti odmrlih celic (Jiravanichpaisal in 
sod. 2006, Liu in sod. 2020). Fagocitoza poteka 
po naslednjem sosledju: i) prepoznavanje mole-
kularnih vzorcev M/PAMP, DAMP ali opsoninov 
vezanih na površino mikroorganizmov s PRR na 
površini hemocitov, ii) pripenjanje fagocitirajočih 
celic na delce, (iii) privzem delcev v notranjost 
celic z reorganizacijo citoskeleta in (iv) znotrajce-
lični vezikularni transport do fagosomov, v katerih 
se delci razgradijo (Jiravanichpaisal in sod. 2006, 
Liu in sod. 2020). Fagocitno aktivnost regulirajo 
komponente melanizacijske kaskade, peroksi-
nektin, reaktivne kisikove zvrsti in antimikrobni 
peptidi (Cerenius in sod. 2008, Boraschi in sod. 
2020, Liu in sod. 2020).
Obrambna mehanizma nodulacije in enkap-
sulacije nastopita v primeru, ko hemociti tujkov 
ne uspejo fagocitirati zaradi njihove velikosti in 
številčnosti. Pri nodulaciji gre za agregacijo hemo-
citov na tujek, pri čemer nastajajo t. i. noduli. Pri 
procesu enkapsulacije pa nastanejo večje, nodulom 
podobne strukture, ko se organizem sooči z večjimi 
tujki v telesu, kot so npr. gliste. V obeh primerih 
je končni rezultat večslojna kapsula iz sploščenih 
hemocitov na površini tujka, ki je pogosto tudi 
melanizirana. Ujeti mikroorganizmi in paraziti 
znotraj nodula navadno odmrejo zaradi odsotnosti 
kisika ali delovanja strupenih reaktivnih kisikovih 
in dušikovih zvrsti, oziroma drugih toksičnih 
molekul, ki nastanejo med melanizacijo. Poleg 
tega fizična izolacija ujetim mikroorganizmom 
preprečuje nadaljnjo rast in širjenje po telesu 
gostitelja (Jiravanichpaisal in sod. 2006). 
24Acta Biologica Slovenica, 2021, 64 (1), 18–35
Humoralni imunski mehanizmi
Ključne komponente humoralne telesne 
obrambe so profenol oksidazni (proPO) sistem, 
reaktivne kisikove (ROS, angl. reactive oxygen 
species) in dušikove zvrsti (RNS, angl. reactive 
nitrogen species), antimikrobni peptidi ter drugi 
encimi in molekule (Tassanakajon in sod. 2018).
Profenol oksidazni sistem je odgovoren za 
sintezo melanina, ki se nalaga okoli poškodovanih 
tkiv in tujkov v telesu gostitelja (Cerenius in 
Söderhäll 2004, Amparyup in sod. 2013), hkrati 
pa je soudeležen tudi v drugih imunskih procesih 
kot sta že omenjeni enkapsulacija in nodulacija, 
ter sintezi citotoksičnih antimikrobnih peptidov. 
Poleg imunske vloge proPO sistem pomembno 
sodeluje tudi pri pigmentaciji in sklerotizaciji tkiv 
(Cerenius in Söderhäll 2004, Lee in sod. 2004, 
Amparyup in sod. 2013). Ključna komponenta 
proPO sistema je aktiven encim fenol oksidaza 
(PO), ki je rezultat aktivacijske kaskade, odgo-
vorne za pretvorbo in aktivacijo neaktivne oblike 
proPO v PO. Aktivacijo proPO sproži vezava M/
PAMP in DAMP na PRR ter aktivnost proteoli-
tičnih encimov mikroorganizmov (Cerenius in 
sod. 2008). ProPO kaskado regulirajo številne 
serinske proteaze, med katerimi sta pomembnejša 
terminalni proPO-aktivacijski encim (Cerenius 
in Söderhäll 2004) in proteazni inhibitor alfa-2 
makroglobulin (Jiravanichpaisal in sod. 2006, 
Ponprateep in sod. 2017).
Aktivna oblika PO deluje kot tirozinaza 
oziroma katehol oksidaza in katalizira pretvorbo 
monofenolov in o-difenolov v o-kinone, iz slednjih 
se nato spontano tvori osrednji končni produkt, 
rdeče-rjavi pigment melanin, ter stranski pro-
dukti, kot so ROS, RNS in semikinoni (Cerenius 
in Söderhäll 2004, Lee in sod. 2004, Amparyup 
in sod. 2013). Zaradi potencialnega kvarnega 
delovanja glavnih in stranskih produktov mela-
nizacije za gostiteljske celice, je proPO kaskada 
negativno regulirana (inhibirana) na več ravneh 
preko (i) inhibicije serinskih proteaz, (ii) inhibi-
cije aktivnosti PO in (iii) sinteze ROS in RNS 
(Amparyup in sod. 2013). Izkazalo se je, da pri 
nekaterih nevretenčarskih skupinah, med drugim 
tudi pipalkarjih in rakih enakonožcih, PO podobno 
aktivnost posedujejo tudi drugi proteini hemolimfe, 
med njimi hemocianin, ki ima podobno kot encim 
PO v aktivnem centru bakrov atom (Fan in sod. 
2009, Jaenicke in sod. 2009, Arockiaraj in sod. 
2013, Pan in sod. 2019, Ramasamy in sod. 2017). 
Za PO podobno aktivnost hemocianina je ključna 
konformacijska pretvorba molekule hemocianina 
v aktivno katehol oksidazo, inducirana pa je z 
enakimi komponentami kot aktivacija kaskade 
proPO (Coates 2012).
Pomemben del humoralne komponente priro-
jenega imunskega sistema predstavljajo ROS in 
RNS, ki sodelujejo pri uničenju fagocitiranih tujih 
delcev znotraj fagosomov hemocitov (Raman in 
sod. 2008, Jia in sod. 2017). Nastanejo tudi kot 
stranski produkti melanizacije in drugih celičnih 
procesov. Njihovo koncentracijo regulirajo anti-
oksidativni encimi in drugi proteini, ki omejujejo 
oksidativni stres induciran s prekomerno sintezo 
reaktivnih spojin (Tassanakajon in sod. 2013). 
Med encimi v tovrstnem omejevanju velja ome-
niti superoksid dismutazo, katalazo in glutation 
reduktazo.
Antimikrobni peptidi ali obrambni peptidi 
gostitelja so evolucijsko ohranjene komponente 
prirojene imunosti. Zanje so značilni: (i) kratka 
aminokislinska zaporedja (7–100), (ii) hidrofobne 
in kationske lastnosti ter (iii) amfipatska struktura. 
Zaradi učinkovite in hitre protimikrobne aktiv-
nosti proti najpogostejšim mikroorganizmom so 
ti peptidi poznani tudi kot »naravni antibiotiki«, 
na mikroorganizme pa delujejo preko tvorbe por 
v njihovi membrani ali vplivajo na različne ce-
lične procese mikrobov (Rosa in Barracco 2010, 
Ageitos in sod. 2017). Pri rakih poznamo kar 15 
različnih družin antimikrobnih peptidov, med 
katerimi so najbolje poznani: krustin, penaedin, 
anti-lipopolisaharidni faktor, lizocim, defenzin in 
armadilidin (Smith in Dyrynda 2015). 
Raziskave kopenskih rakov vrste 
Porcellio scaber
Celični imunski mehanizmi
Večina raziskav imunskega sistema rakov 
je bila opravljena na morskih in sladkovodnih 
predstavnikih, tovrstni mehanizmi kopenskih 
enakonožcev pa so slabo raziskani (Cole in 
Morris 1980, Hess in Poinar 1985, Herbinière 
in sod. 2005, Irmak in sod. 2005, Jaenicke in 
sod. 2009, Sicard in sod. 2010, Chevalier in sod. 
25Dolar et al.: Imunski sistem pri rakih
2011, Lupetti in sod. 2013, Kostanjšek in Pirc 
Marolt 2015, Becking in sod. 2020, Dolar in sod. 
2020). V nedavnih študijah (Dolar in sod. 2020, 
2021) smo pri kopenskem enakonožnem raku 
P� scaber opisali tri različne tipe hemocitov. Ti 
ustrezajo predhodnim opisom semigranularnih, 
granularnih in hialinih hemocitov (Sl. 2) dru-
gih rakov (Ding in sod. 2012, Lv in sod. 2014, 
Zhou in sod. 2018), zlasti hemocitom sorodnega 
kopenskega enakonožca Armadillidium vulgare 
(Chevalier in sod. 2011). Gostota hemocitov v 
hemolimfi P� scaber je podobna vrednostim za vrsto 
Porcellio spinicornis (Alikhan in Naich 1986) in 
približno 10-krat nižja kot pri A� vulgare (Sicard 
in sod. 2010, Chevalier in sod. 2011). Viabilnost 
hemocitov P� scaber je zelo podobna vrednostim 
drugih kopenskih rakov (Tab. 2). Semigranu-
lociti so najpogostejši tip celic, saj predstavljajo 
kar 65 % vseh prostih hemocitov v hemolimfi  
P� scaber (Sl. 2c). Gre za celice ovalne do okro-
gle oblike, ki v premeru merijo 11,2 ± 0,4 µm, 
v citoplazmi pa imajo majhno gostoto citoplazem-
skih granul manjše velikosti (premer 0,3 ± 0,1 µm). 
Granulociti predstavljajo 17 % vseh prostih celic 
hemolimfe in so po velikosti in obliki zelo podobni 
semigranulocitom (12,0 ± 0,3 µm), medtem ko 
je gostota citoplazemskih granul pri njih večja 
(Sl. 2d). Povprečna velikost citoplazemskih granul 
pa je 0,8 ± 0,1 µm. Hialinociti v premeru merijo 
le 8,1 ± 0,3 µm in predstavljajo v povprečju 
18 % vseh prostih hemocitov hemolimfe (Sl. 2e 
in f). So okrogli in agranularni.
Razmerja med posameznimi hemociti pri 
P� scaber s prevladujočim deležem semigranuloci-
tov ustrezajo podatkom za vrsto A� vulgare (Cheva-
lier in sod. 2011), medtem, ko so pri P� spinicornis 
poročali o precej manjšem deležu semigranulo-
citov (12 %) (Alikhan in Naich 1986), kar pa ni 
v skladu s podatki za nekatere morske rake dese-
teronožce (Martin in Graves 1985, Jussila in sod. 
1997). 
S transmisijsko elektronsko mikroskopijo 
smo identificirali dva podtipa agranularnih hia-
linocitov (Dolar in sod. 2020). Podtip 1 hialino-
cita ima veliko in okroglo jedro s prevladujočim 
evkromatinom in tanko plastjo heterokromatina 
tik pod notranjo membrano jedrnega ovoja (Sl. 
2e). Podtip 2 hialinocita pa ima manjše celično 
jedro s prevladujočim heterokromatinom (Sl. 2f). 
Nekateri avtorji predvidevajo, da bi lahko celice 
s podobnimi morfološkimi znaki (majhne celice 
z velikim razmerjem med jedrom in citoplazmo) 
kot smo jih opisali pri podtipu 1 hialinocita, 
predstavljale nezrele hemocite oziroma zarodne 
celice (Roulston in Smith 2011, Rebelo in sod. 
2013, Ramlingam in sod. 2015). Slednje bi lahko 
potrdili z nadaljnjimi analizami, kot so npr. genska 
ekspresija transkripcijskih faktorjev udeleženih v 
proliferaciji in diferenciaciji zarodnih celic ali pa 
z imunolokalizacijo omenjenih molekul (Mata-
tall in sod. 2018). Podobne razlike med podtipi 
hemocitov so bile sicer opažene tudi pri drugih 
rakih (Battison in sod. 2003, Lv in sod. 2014, 
Mangkalanan in sod. 2014). 
Z vrstično elektronsko mikroskopijo smo 
glede na velikost in prisotnost citoplazemskih 
granul prepoznali dve populaciji celic (Sl. 2h-j). 
Pri populaciji večjih celic smo na površini oziro-
ma v liziranih celicah prepoznali citoplazemske 
granule (Dolar in sod. 2020), podobno kot Zhou 
in sod. (2018), ki so jih na površini hemocitov 
in v liziranih hemocitih rakovice Scylla para-
mamosain opisali kot citoplazemskim granulam 
podobne izbokline. Prisotnost citoplazemskih 
granul v citoplazmi večjih celic smo potrdili tudi 
s kombinacijo tehnik fokusiranega ionskega žarka 
in vrstične elektronske mikroskopije (FIB-SEM) 
(Sl. 2g). Za razliko od večjih celic, pa je površina 
manjših celic (Sl. 2h in i) gladka, brez granulam 
podobnih izboklin, hkrati pa so na površini bolj 
pogosto opazne filopodijem podobne strukture 
(Sl. 2i in j). Domnevamo, da populacija manjših 
celic predstavlja hialinocite, katerih glavna funkcija 
je fagocitoza (Sl. 2j). 
26Acta Biologica Slovenica, 2021, 64 (1), 18–35
Slika 2:   Mikrografije hemocitov kopenskega enakonožca Porcellio scaber. A - DIC mikroskopska tehnika 
hemocitov; B - presevna svetlobna mikroskopija poltankih rezin hemocitov barvanih z barvilom 
Azur II-metilen modro. Transmisijska elektronska mikroskopija c- semigranulocita, D - granulocita, 
E - hialinocita podtipa 1 in F - hialinocita podtipa 2. G - FIB-SEM analiza granularnega hemocita. 
h, I, j - vrstična elektronska mikroskopija hemocitov.
Figure 2:  Micrographs of haemocytes of the terrestrial isopod Porcellio scaber.  A - DIC microscopic technique of 
haemocytes and B - transmitted light microscopy of semi-thin slices of haemocytes stained with Azure 
II -methylene blue dye. Transmission electron microscopy of c - semigranulocyte, D - granulocyte, 
E - subtype 1 hyalinocyte and  F - subtype 2 hyalinocyte. G - FIB-SEM analysis of granular haemocyte. 
h, I, j - scanning electron microscopy of haemocytes.
27Dolar et al.: Imunski sistem pri rakih
Pri kopenskih rakih enakonožcih so za fagoci-
tiranje odgovorne hialine celice, v manjšem obsegu 
pa tudi semigranularne celice (Chevalier in sod. 
2011). Znano je, da so pri navadnem pasavčku 
Armadillidium vulgare v tvorbo nodulov in enkap-
sulacijo udeleženi predvsem semigranulociti in v 
manjšem obsegu tudi granulociti, medtem ko so pri 
P� scaber za to odgovorni predvsem semigranulociti 
(Kostanjšek in Pirc Marolt 2015). Pri P� scaber 
sta Kostanjšek in Pirc Marolt (2015) podrobno 
opisala tvorbo nodulov v primeru okužbe z bak-
terijo Rhabdochlamydia porcellionis. Opisala sta 
različne oblike nodulov na organih z znotrajcelično 
okužbo z omenjeno bakterijo. Avtorja sta sklepala, 
da je tvorba nodulov velikosti med 20 in 200 µm 
na površini organov posledica odstranjevanja teh 
bakterij v telesni votlini oziroma hemocelu. Na 
podlagi R� porcellionis v hemocitih hemolimfe 
in semigranulocitih hematopoetskega tkiva sta 
potrdila njihovo fagocitno aktivnost.
Pri rakih enakonožcih je hematopoetski organ 
sestavljen iz treh parnih nodulov, ki se nahajajo v 
6. in 7. segmentu pereona ter v 1. segmentu pleona 
(Chevalier in sod. 2011). Procese enkapsulacije in 
melanizacije so ob vstavitvi sintetičnih filamentov 
v telesno votlino P� scaber opisali tudi Irmak in 
sod. (2005). Kot primer celičnega odziva P� scaber 
lahko pokažemo primer okužbe z glisto, pri kateri 
smo v hemolimfi opazili aglutinacijo hemocitov 
na njeni površini. V skupkih smo opazili pred-
vsem granulocite, vendar pa so za potrditev tega 
potrebne nadaljnje raziskave z večjim številom 
vzorcev (Sl. 3).    
Humoralni obrambni mehanizmi
V hemolimfi P� scaber smo analizirali fenol 
oksidazno (PO) oziroma PO podobno aktivnost 
(Dolar in sod. 2020). Slednjo, pa tako kot pri 
drugih rakih, poleg fenol oksidaze posedujejo 
tudi drugi proteini hemolimfe, med drugim he-
mocianin. Kljub številnim raziskavam še vedno 
ni povsem jasno ali je dokazana PO aktivnost 
pri rakih enakonožcih posledica plazemske PO, 
PO podobne aktivnost hemocianina ali kar obeh 
(Sicard in sod. 2010). Pri P� scaber (Jaenicke in 
sod. 2009) in dveh morskih enakonožcih (Smith 
in Söderhäll 1991, Pless in sod. 2003) je najvišja 
PO aktivnost hemocianina v in vitro pogojih do-
sežena z dodatkom detergentov (npr. natrijevega 
dodecilsulfata; SDS) v reakcijsko mešanico, ki 
posnemajo naravne aktivatorje in povzročijo 
konformacijsko pretvorbo molekule hemocianina 
in s tem sprostitev aktivnega mesta za fenolne 
spojine (Baird in sod. 2007). Slednje smo potrdili 
Slika 3:   Aglutinacija hemocitov na površini gliste v hemolimfi Porcellio scaber.
Figure 3:  Agglutination of haemocytes on the surface of nematode in the Porcellio scaber haemolymph. 
28Acta Biologica Slovenica, 2021, 64 (1), 18–35
tudi v naših raziskavah, v katerih brez dodatka 
SDS hemolimfi aktivnosti nismo zasledili, ta pa 
se je povečevala z večanjem koncentracije SDS v 
hemolimfi. Ker ne moremo z gotovostjo trditi, da 
je bila z meritvami potrjena encimska aktivnost 
zgolj posledica aktivnost encima PO, smo jo 
opredelili kot PO podobno encimsko aktivnost 
(analogno z ustaljenim angleškim izrazom »PO-
-like«). Aktivnosti smo merili po optimiziranem 
protokolu Jaenicke in sod. (2009), kot je opisano 
v Dolar in sod. (2020). Vrednosti PO podobne 
aktivnosti za P� scaber ustrezajo vrednostim, ki 
so jih podali Jaenicke in sod. (2009), primerjava 
z literaturo pa je zahtevna, saj avtorji za izražanje 
aktivnosti uporabljajo različne enote (Irmak in 
sod. 2005, Sicard in sod. 2010). 
Dušikov oksid (NO) v hemolimfi enakonožca 
smo merili z uporabo Griessovega reagenta, po 
prilagojeni metodi Faraldo in sod. (2005). Zaznane 
vrednosti NO pri P� scaber ustrezajo vrednostim, 
ki so jih pri tem organizmu pomerili tudi Mayall 
in sod. (2021) (Tab. 2). Poleg meritev reaktivnih 
dušikovih spojin smo spremljali tudi aktivnost 
antioksidativnih encimov katalaze in superoksid 
dismutaze, ki posredno nakazujeta prisotnost 
ROS. Ustaljene protokole za merjenje aktivnosti 
na nivoju celotnega organizma (Beauchamp in 
Frodovich 1971, Jemec in sod. 2008) smo prila-
godili za merjenje na majhnih vzorcih hemolimfe 
(5 µl), kar je omogočilo merjenje na vzorcih 
posameznih živali (Dolar 2021). Z uporabo spe-
cifičnega inhibitorja katalaze, natrijevega azida, 
smo dodatno dokazali, da v hemolimfi merimo 
katalazno aktivnost. V literaturi podatkov o ka-
talazni aktivnosti v hemolimfi drugih kopenskih 
rakov sicer nismo našli. Poleg reaktivnih zvrsti smo 
v naših raziskavah kot prvi vpeljali tudi meritve 
aktivnosti alfa-2 makroglobulina (Dolar 2021).
tabela 2:  Vrednosti imunskih komponent merjenih v vzorcih hemolimfe osebkov Porcellio scaber, iz kontrolne 
  laboratorijske populacije brez simptomov okužbe ali stresa (povzeto po Dolar in sod. 2020, 2021).   
table 2:  Values of immune components measured in samples of haemolymph from Porcellio scaber individuals 
 from the control laboratory population without symptoms of infection or stress (summarized after Dolar 
  et  al. 2020, 2021). 
Imunska komponenta Povprečna vrednost
± standardna napaka
Podatki iz 
literature
Gostota hemocitov v hemolimfi 
(št. celic/mL hemolimfe)
3,50 ± 0,19 x 106 25-41 x 106 a
32 ± 4 x 106 b
4,93 x 106 c
4,3 x 106 d
Viabilnost hemocitov
(%)
93,77 ± 0,42 91 b
92,16 ± 0,66 c
78 e
Delež semigranulocitov 
(odstotek vseh hemocitov, %)
65,01 ± 1,89 72 b
12 d
Delež granulocitovov
(odstotek vseh hemocitov, %)
17,25 ± 1,55 21 b
28 d
Delež hialinocitov 
(odstotek vseh hemocitov, %)
17,74 ± 1,30 7 b
60 d
Fenol oksidazi podobna aktivnost (ΔA/min mL hemolimfe) 10,23 ± 0,22 15 f
Koncentracija dušikovega oksida (µM) 14,16 ± 1,24 10,5 c
Aktivnost superoksid dismutaze 
(U/mg proteinov)
4,58 ± 0,66 n.p.
Aktivnost katalaze
(ΔA/min mg proteinov)
0,55 ± 0,07 n.p.
Aktivnost alfa-2 makroglobulina
(ΔA/min mg proteinov)
1,06 ± 0,12 n.p.
a Armadillidium vulgare (Sicard in sod. 2010); b A�vulgare (Chevalier in sod. 2011); c P� scaber (Mayall in sod. 
2021); d P� spinicornis (Alikhan in Naich 1986); e P� laevis (Snyman in Odendaal 2009); f P� scaber (Jaenicke in 
sod. 2009); n.p., ni podatka
29Dolar et al.: Imunski sistem pri rakih
Med pomembnejše komponente humoralnega 
imunskega odziva sodijo tudi antimikrobni peptidi, 
ki pri P� scaber do sedaj še niso bili opisani, medtem 
ko so Herbinière in sod. (2005) iz hemocitov in 
plazme hemolimfe A� vulgare izolirali in opisali 
nov antimikrobni peptid imenovan armadillidin. 
V nedavni raziskavi so Becking in sod. (2020) 
z in silico analizami dokazali, da so sekvence 
armadillidinov pogosto zastopane v transkrip-
tomih kopenskih rakov enakonožcev, vključno 
s P� scaber. 
Transkriptomske analize in dostopnost nukle-
otidnih zaporedij je spodbudilo uporabo omskih 
pristopov tudi v okoljskih študijah. Chevalier in 
sod. (2012) so tako analizirali izražanje genov 
povezanih z imunskim sistemom v hemocitih 
A� vulgare, okuženih z bakterijo iz rodu Wolbachia. 
Podobno so izražanje tarčnih genov preverjali tudi 
Ferreira in sod. (2019), pri kopenskem enakonožcu 
Porcellionides pruinosus� Podatki o tovrstnih štu-
dijah pri P� scaber zaenkrat še niso poznani, smo 
pa v našem laboratoriju že optimizirali metodo in 
naredili prve poskuse izražanja genov povezanih 
z imunskim sistemom.
Zaključek in pogled v prihodnost
V prispevku smo predstavili pregled temeljnih 
komponent in procesov prirojene imunosti pri 
rakih. Podrobneje smo orisali raziskave s ko-
penskimi raki vrste Porcellio scaber, ki jih na 
tem področju izvajamo na Katedri za zoologijo, 
Oddelka za Biologijo. Trenutno se intenzivno 
ukvarjamo s proteomom hemolimfe P� scaber, v 
teku pa so tudi raziskave, v sklopu katerih bomo v 
celicah hemolimfe (hemocitih) analizirali izražanje 
genov, ki so povezani z imunostjo. V ta namen 
smo že optimizirali protokole za izolacijo zadostne 
količine RNA ustrezne kvalitete. Transkriptom P� 
scaber, ki smo ga pridobili iz Univerze v Cardiffu 
(Velika Britanija, Wales) in iz podatkovne baze 
NCBI (SRA), smo z orodjem BLAST primerjali 
proti znanim zaporedjem iz podatkovne baze 
(NCBI) in tako identificirali tarčne sekvence ter 
pripravili oligonukleotidne začetnike. Za slednje 
smo tudi preverili učinkovitost naleganja na cDNA 
prevedene iz RNA zaporedja hemocitov P� scaber. 
Z opisanimi raziskavami smo začrtali pot za 
nadaljnje raziskave na področju fiziologije rakov, 
biologije stresa in ekotoksikologije, kjer izbrane 
imunske komponente merimo pri organizmih 
izpostavljenih različnim pogojem in vrstam 
onesnažil (Dolar in sod. 2021, Mayall in sod. 
2021). Pričakujemo, da bo na ta način omogočen 
celostni vpogled v delovanje prirojenega imun-
skega sistema pri kopenskih rakih, hkrati pa tudi 
možnost presoje vplivov okoljskih sprememb in 
onesnažil na več nivojih biološke organizacije 
organizma. Vpeljano metodologijo spremljanja 
imunskih procesov, na podlagi merjenja imunskih 
komponent, bi v prihodnosti lahko prenesli tudi 
na druge vrste rakov, ki jih proučujemo v okviru 
programske skupine P1-0184.  
Summary
Organisms interact with their environment 
in an attempt to maintain a dynamic equilibrium 
that allows for the survival and development 
of the organism. The immune system is crucial 
to recognise and distinguish between self and 
nonself, and react to challenges posed by the 
environment. The purpose of this review is to 
present the basic features of innate immunity of 
crustaceans and in particular of terrestrial crus-
tacean woodlice Porcellio scaber. This organism 
has been an established test model at the Chair 
of Zoology, Department of Biology (Biotechnical 
Faculty, University of Ljubljana) for more than 3 
decades. In the last decade we have implemented 
the methods for tracking the cellular and humoral 
immune response to infections and other types of 
interactions, such as pollutants. We have performed 
basic research on the ultrastructure and morphol-
ogy of haemocytes in P� scaber. Three types 
were identified: semigranulocytes (65% of freely 
circulating haemocytes), granulocytes (17%), 
and hyalinocytes (18%). The average density of 
free circulating haemocytes is 3.50 ± 0.19 x 106 
cells/mL. Semigranulocytes and granulocytes 
are both oval shaped and similar in diameter 
(11.2 ± 0.4 µm and 12.0 ± 0.3 µm, respectively), 
but granulocytes have a higher density of granules, 
which are also larger than in semigranulocytes. 
Hyalinocytes are round, agranular and smaller 
(8.1 ± 0.3 µm). Two types of hyalinocytes have 
been discovered: subtype 1 has a very large nucleus 
with dominant euchromatin, while subtype 2 has a 
30Acta Biologica Slovenica, 2021, 64 (1), 18–35
smaller nucleus with predominant heterochroma-
tin. Subtype 1 is of particular interest because it 
resembles the properties of stem progenitor cells. 
We have implemented new methods to measure 
humoral components in P� scaber haemolymph, 
including: Phenoloxidase-like activity, nitric oxide 
levels, antioxidant enzyme activity, and alpha-2 
macroglobulin. Similarly, as for other crustaceans, 
the activity of phenoloxidase was not limited only 
to this enzyme, but also included other proteins in 
the haemolymph, most likely hemocyanin. As for 
the cellular immune response in P� scaber, when 
infected with the bacterium Rhabdochlamydia 
porcellionis, the formation of nodules by mostly 
semigranulocytes was noted, and agglutination 
of haemocytes on the parasite (nematode) was 
observed. Our future goal is to study the immune 
response of P� scaber at the proteome and tran-
scriptome levels. We intend to use these immune 
components in other research areas, for example 
in ecotoxicology, to study the effects of pollut-
ants and other types of biotic and abiotic stress 
on organisms. Finally, newly developed methods 
can be implemented to crustaceans from other 
phylogenetic groups which are also studied in the 
framework of our Research programme P1-0184. 
Zahvala
Raziskovalno delo predstavljeno v prispevku 
je bilo financirano s strani javne agencije za razis-
kovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS), 
v okviru raziskovalnega programa Integrativna 
zoologija in speleobiologija (P1-0184), razisko-
valnega projekta J1-2482 in pogodbe sklenjene 
z Univerzo v Ljubljani, Biotehniško fakulteto, 
za usposabljanje mladega raziskovalca (Andraž 
Dolar). Del raziskav je bil krit iz Evropske unije 
v okviru sheme EU H2020 (projekt PANDORA, 
GA 671881). Uporabljena oprema za svetlobno in 
elektronsko mikroskopijo je del infrastrukturnega 
centra Mikroskopija bioloških vzorcev (IC MBV). 
Zahvaljujemo se prof. dr. Mojci Narat za stro-
kovno podporo in dostop do raziskovalne opreme 
v laboratoriju na Katedri za genetiko, animalno 
biotehnologijo in imunologijo, Oddelka za zoo-
tehniko, Biotehniške fakultete. Zahvaljujemo se 
tudi izr. prof. dr. Nataši Štajner in prof. dr. Jerneju 
Jakšetu za pomoč pri pripravi oligonukleotidnih 
začetnikov in obdelavi rezultatov izražanja genov. 
Zahvala gre Sari Novak in Mateju Hočevarju 
za deljenje slike hemocita posnetega s tehniko 
FIB-SEM. 
Literatura
Ageitos, J.M., Sánchez-Pérez, A., Calo-Mata, P., Villa, T.G., 2017. Antimicrobial peptides (AMPs): 
Ancient compounds that represent novel weapons in the fight against bacteria. Biochemical Phar-
macology, 133, 117-138.
Alikhan, M.A., Naich, M., 1987. Changes in counts of haemocytes and in their physicochemical pro-
perties during the moult cycle in Porcellio spinicornis Say (Porcellionidae, Isopoda). Canadian 
Journal of Zoology, 65 (7), 1685-1688.
Amparyup, P., Charoensapsri, W., Tassanakajon, A., 2013. Prophenoloxidase system and its role in 
shrimp immune responses against major pathogens. Fish and Shellfish Immunology, 34 (4), 990-
1001.
Arockiaraj, J., Gnanam, A.J., Pothikasalam, G., Milton, J., Pasupuleti, M., Bhatt, P., Palanisamy, 
R., Kumaresan, V., Thirumalai, M.K., Arasu, A., Sathyamoorthi, A., Prabha, N., 2013. A novel 
prophenoloxidase, hemocyanin encoded copper containing active enzyme from prawn: gene cha-
racterization. Gene, 524 (2), 139-151.
Baird, S., Kelly, S.M., Price, N.C., Jaenicke, E., Meesters, C., Nillius, D., Decker, H., Nairn, J., 2007. 
Hemocyanin conformational changes associated with SDS-induced phenol oxidase activation. 
Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, 1774 (11), 1380-1394.
Battison, A., Cawthorn, R., Horney, B., 2003. Classification of Homarus americanus hemocytes and 
the use of differential hemocyte counts in lobsters infected with Aerococcus viridans var. homari 
(Gaffkemia). Journal of Invertebrate Pathology, 84 (3), 177-197.
Bauchau, A.G., 1981. Crustaceans. In: Ratcliffe, N.A., Powel, A.F. (eds.): Invertebrate Blood Cells. 
Academic Press, New York, pp. 385-420.
31Dolar et al.: Imunski sistem pri rakih
Beauchamp, C., Fridovich, I., 1971. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable 
to acrylamide gels. Analytical Biochemistry, 44 (1), 276-287.
Becking, T., Delaunay, C., Cordaux, R., Berjeaud, J.M., Braquart-Varnier, C., Verdon, J., 2020. Shed-
ding light on the antimicrobial peptide arsenal of terrestrial isopods: focus on armadillidins, a new 
crustacean AMP family. Genes, 11 (1), 93.  
Bogataj, U., Mrak, P., Štrus, J., Žnidaršič, N., 2019. Ultrastructural differentiation of plasma membra-
ne and cell junctions in the hindgut cells is synchronized with key developmental transitions in 
Porcellio scaber. Arthropod Structure and Development, 50, 78-93.
Boraschi, D., Alijagic, A., Auguste, M., Barbero, F., Ferrari, E., Hernadi, S., Mayall, C., Michelini, 
S., Navarro, N.P.I., Prinelli A., Swart E., Swartzwelter B. J., Bastús N. G., Canesi L., Drobne D., 
Duschl A., Ewa, M.A., Horejs-Hoeck, J., Italiani, P., Kemmerling, B., Kille, P., Prochazkova, P., 
Puntes, V.F., Spurgeon, D.J., Svendsen, C., Wilde, C.J., Pinsino, A., 2020. Addressing nanomate-
rial immunosafety by evaluating innate immunity across living species. Small, 16 (21), 2000598.
Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S., 2014. Immunity in Drosophila melanogaster-from microbial 
recognition to whole-organism physiology. Nature Reviews Immunology, 14 (12), 796-810.
Cerenius, L., Lee, B.L., Söderhäll, K., 2008. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate 
immunity. Trends in Immunology, 29 (6), 263-271.
Cerenius, L., Söderhäll, K., 2004. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immuno-
logical Reviews, 198 (1), 116-126.
Chevalier, F., Herbiniére-Gaboreau, J., Bertaux, J., Raimond, M., Morel, F., Bouchon, D., Grѐve, P., 
Braquart-Varnier, C., 2011. The immune cellular effectors of terrestrial isopod Armadillidium 
vulgare: meeting with their invaders, Wolbachia. PLoS One, 6 (4), e18531.
Chevalier, F., Herbinière-Gaboreau, J., Charif, D., Mitta, G., Gavory, F., Wincker, P., Greve, P., Braquart-
Varnier, C., Bouchon, D., 2012. Feminizing Wolbachia: a transcriptomics approach with insights 
on the immune response genes in Armadillidium vulgare. BMC Microbiology, 12 (1), 1-18.
Coates, C.J., 2012. Hemocyanin-derived phenoloxidase; biochemical and cellular investigations of 
innate immunity. Doktorsko delo. Stirling, University of Stirling.
Cole, A., Morris, J., 1980. A new iridovirus of two species of terrestrial isopods, Armadillidium vulgare 
and Porcellio scaber. Intervirology, 14 (1), 21-30.
Da Silva, P.C., de Abreu, I.S., Cavalcante, L.A., De Barros, C.M., Allodi, S., 2015. Role of hemocytes 
in invertebrate adult neurogenesis and brain repair. Invertebrate Survival Journal, 12 (1), 142-154.
De Gregorio, E., Spellman, P.T., Tzou, P., Rubin, G.M., Lemaitre, B., 2002. The Toll and Imd pathways 
are the major regulators of the immune response in Drosophila. The EMBO Journal, 21 (11), 
2568-2579.
Ding, Z., Du, J., Ou, J., Li, W., Wu, T., Xiu, Y., Meng, Q., Ren, Q., Gu, W., Xue, H., Tang, J., Wang, 
W., 2012. Classification of circulating hemocytes from the red swamp crayfish Procambarus clarkii 
and their susceptibility to the novel pathogen Spiroplasma eriocheiris in vitro. Aquaculture, 356, 
371-380.
Dolar, A., 2021. Optimizacija metod za spremljanje procesov, povezanih z imunostjo pri kopenskih 
enakonožcih. Magistrsko delo. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta.  
Dolar, A., Kostanjšek, R., Mayall, C., Drobne, D., Kokalj, A.J., 2020. Modulations of immune pa-
rameters caused by bacterial and viral infections in the terrestrial crustacean Porcellio scaber: 
Implications for potential markers in environmental research. Developmental and Comparative 
Immunology, 113, 103789.
Dolar, A., Selonen, S., van Gestel, C.A.M., Perc, V., Drobne, D., Kokalj, A.J., 2021. Microplastics, 
chlorpyrifos and their mixtures modulate immune processes in the terrestrial crustacean Porcellio 
scaber. Science of the Total Environment, 772, 144900.
Du, Z., Ji, Y., Ren, D., 2016. In-depth comparative transcriptome analysis of intestines of red swamp 
crayfish, Procambarus clarkii, infected with WSSV. Scientific Reports, 6 (1), 1-12.
32Acta Biologica Slovenica, 2021, 64 (1), 18–35
Fan, T., Zhang, Y., Yang, L., Yang, X., Jiang, G., Yu, M., Cong, R., 2009. Identification and characte-
rization of a hemocyanin-derived phenoloxidase from the crab Charybdis japonica. Comparative 
Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 152 (2), 144-149.
Faraldo, A.C., Sá-Nunes, A., Del Bel, E.A., Faccioli, L.H., Lello, E., 2005. Nitric oxide production in 
blowfly hemolymph after yeast inoculation. Nitric Oxide, 13 (4), 240-246.
Ferreira, N.G., Morgado, R.G., Cunha, L., Novo, M., Soares, A.M., Morgan, A.J., Loureiro, S., Kille, 
P., 2019. Unravelling the molecular mechanisms of nickel in woodlice. Environmental Research, 
176, 108507.
Halcrow, K., Smith, J.C., 1986. Wound closure in the crab Carcinus maenas (L.). Canadian Journal of 
Zoology, 64 (12), 2770-2778.
Hames, C.A.C., Hopkin, S.P., 1989. The structure and function of the digestive system of terrestrial 
isopods. Journal of Zoology, 217 (4), 599-627.
Hauton, C., 2012. The scope of the crustacean immune system for disease control. Journal of Inver-
tebrate Pathology, 110 (2), 251-260.
Herbinière, J., Braquart-Varnier, C., Grève, P., Strub, J.M., Frère, J., Van Dorsselaer, A., Martin, G., 
2005. Armadillidin: a novel glycine-rich antibacterial peptide directed against gram-positive bac-
teria in the woodlouse Armadillidium vulgare (terrestrial isopod, crustacean). Developmental and 
Comparative Immunology, 29 (6), 489-499.
Hess, R.T., Poinar, G.O., 1985. Iridoviruses infecting terrestrial isopods and nematodes. Current Topics 
in Microbiology and Immunology, 116, 49-76.
Huang, Y., Ren, Q., 2020. Research progress in innate immunity of freshwater crustaceans. Develop-
mental and Comparative Immunology, 104, 103569.  
Ihan, A. 2020: Osnove medicinske imunologije. Medicinska fakulteta, Inštitut za mikrobiologijo in 
imunologijo, Katedra za mikrobiologijo in imunologijo, Ljubljana, 223 pp.
Irmak, P., Kurtz, J., Zimmer, M., 2005. Immune response in Porcellio scaber (Isopoda: Oniscidea): 
copper revisited. European Journal of Soil Biology, 41 (3–4), 77-83.
Jaenicke, E., Fraune, S., May, S., Irmak, P., Augustin, R., Meesters, C., Decker, H., Zimmer, M., 2009. 
Is activated hemocyanin instead of phenoloxidase involved in immune response in woodlice? 
Developmental and Comparative Immunology, 33 (10), 1055-1063.
Jemec, A., Tišler, T., Drobne, D., Sepčić, K., Jamnik, P., Roš, M., 2008. Biochemical biomarkers in 
chronically metal-stressed daphnids. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology 
& Pharmacology, 147 (1), 61-68.
Jia, Z., Wang, L., Jiang, S., Sun, M., Wang, M., Yi, Q., Song, L., 2017. Functional characterization 
of hemocytes from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis by flow cytometry. Fish and Shellfish 
Immunology, 69, 15-25.
Jin, X.K., Li, W.W., Wu, M.H., Guo, X.N., Li, S., Yu, A.Q., Zhu, Y.T., He, L., Wang Q., 2013. Im-
munoglobulin superfamily protein Dscam exhibited molecular diversity by alternative splicing 
in hemocytes of crustacean, Eriocheir sinensis. Fish and Shellfish Immunology, 35 (3), 900-909.
Jiravanichpaisal, P., Lee, B.L., Söderhäll, K., 2006. Cell-mediated immunity in arthropods: hematopo-
iesis, coagulation, melanization and opsonization. Immunobiology, 211 (4), 213-236.
Jussila, J., Jago, J., Tsvetnenko, E., Dunstan, B., Evans, L.H., 1997. Total and differential haemocyte 
counts in western rock lobsters (Panulirus cygnus George) under post-harvest stress. Marine and 
Freshwater research, 48 (8), 863-868.
Kostanjšek, R., Marolt, T.P., 2015. Pathogenesis, tissue distribution and host response to Rhabdochlamy-
dia porcellionis infection in rough woodlouse Porcellio scaber. Journal of Invertebrate Pathology, 
125, 56-67.
Kotnik, V., Čurin-Šerbec, V., Pretnar-Hartman, K., Ihan, A., Jeras, M., Kopitar, A.N., Malovrh, T., 
Simčič, S., Stopinšek, S., Skvarč, M., Vidan-Jeras, B., Wraber-Herzog, B., 2010. Imunološki pri-
ročnik. Medicinska fakulteta, Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Katedra za mikrobiologijo 
in imunologijo, Ljubljana, 194 pp.
33Dolar et al.: Imunski sistem pri rakih
Labaude, S., Moret, Y., Cézilly, F., Reuland, C., Rigaud, T., 2017. Variation in the immune state of 
Gammarus pulex (Crustacea, Amphipoda) according to temperature: Are extreme temperatures a 
stress? Developmental and Comparative Immunology, 76, 25-33.
Lee, S.Y., Lee, B.L., Söderhäll, K., 2004. Processing of crayfish hemocyanin subunits into phenoloxi-
dase. Biochemical and biophysical research communications, 322 (2), 490-496.
Li, F., Xiang, J., 2013. Signaling pathways regulating innate immune responses in shrimp. Fish and 
Shellfish Immunology, 34 (4), 973-980. 
Lin, X, Söderhäll, I., 2011. Crustacean hematopoiesis and the astakine cytokines. Blood, 117, 6417-6424. 
Liu, S., Zheng, S.C., Li, Y.L., Li, J., Liu, H.P., 2020. Hemocyte-mediated phagocytosis in crustaceans. 
Frontiers in Immunology, 11, 268. 
Loker, E.S., Adema, C.M., Zhang, S.M., Kepler, T.B., 2004. Invertebrate immune systems–not homo-
geneous, not simple, not well understood. Immunological Reviews, 198 (1), 10-24.
Lupetti, P., Montesanto, G., Ciolfi, S., Marri, L., Gentile, M., Paccagnini, E., Lombardo, B.M., 2013. 
Iridovirus infection in terrestrial isopods from Sicily (Italy). Tissue Cell, 45 (5), 321-327.
Lv, S., Xu, J., Zhao, J., Yin, N., Lu, B., Li, S., Chen, Y., Xu, H., 2014. Classification and phagocytosis 
of circulating haemocytes in Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) and the effect of extrinsic 
stimulation on circulating haemocytes invivo. Fish and Shellfish Immunology, 39 (2), 415-422.
Mangkalanan, S., Sanguanrat, P., Utairangsri, T., Sritunyalucksana, K., Krittanai, C., 2014. Characteri-
zation of the circulating hemocytes in mud crab (Scylla olivacea) revealed phenoloxidase activity. 
Developmental and Comparative Immunology, 44 (1), 116-123.
Martin, G.G., Graves, B.L., 1985. Fine structure and classification of shrimp hemocytes. Journal of 
Morphology, 185- (3), 339-348.
Matatall, K.A., Kadmon, C.S., King, K.Y., 2018. Detecting hematopoietic stem cell proliferation using 
BrdU incorporation. In: Lacorazza, H. (ed.): Cellular Quiescence� Humana Press, New York, pp. 
91-103.
Mayall, C., Dolar, A., Jemec Kokalj, A., Novak, S., Razinger, J., Barbero, F., Puntes, V., Drobne, D., 
2021. Stressor-dependant changes in immune parameters in the terrestrial isopod crustacean, Por-
cellio scaber: A focus on nanomaterials. Nanomaterials, 11 (4), 934.
Melillo, D., Marino, R., Italiani, P., Boraschi, D., 2018. Innate immune memory in invertebrate meta-
zoans: a critical appraisal. Frontiers in Immunology, 9, 1915. 
Mikrobiološki slovar, 2013. http://www.termania.net/slovarji/96/mikrobioloski-slovar (3. 5. 2021). 
Milutinović, B., Peuß, R., Ferro, K., Kurtz, J., 2016. Immune priming in arthropods: an update focusing 
on the red flour beetle. Zoology, 119 (4), 254-261.
Morin-Poulard, I., Vincent, A., Crozatier, M., 2013. The Drosophila JAK-STAT pathway in blood cell 
formation and immunity. Jak-Stat, 2 (3), e25700. 
Pan, L., Zhang, X., Yang, L., Pan, S., 2019. Effects of Vibro harveyi and Staphyloccocus aureus infection 
on hemocyanin synthesis and innate immune responses in white shrimp Litopenaeus vannamei. 
Fish and Shellfish Immunology, 93, 659-668.
Pless, D.D., Aguilar, M.B., Falcón, A., Lozano-Alvarez, E., de la Cotera, E.P.H., 2003. Latent pheno-
loxidase activity and N-terminal amino acid sequence of hemocyanin from Bathynomus giganteus, 
a primitive crustacean. Archives of Biochemistry and Biophysics, 409 (2), 402-410.
Raman, T., Arumugam, M., Mullainadhan, P., 2008. Agglutinin-mediated phagocytosis-associated 
generation of superoxide anion and nitric oxide by the hemocytes of the giant freshwater prawn 
Macrobrachium rosenbergii. Fish and Shellfish Immunology, 24 (3), 337-345.
Ramasamy, S.M., Denis, M., Sivakumar, S., Munusamy, A., 2017. Phenoloxidase activity in humoral 
plasma, hemocyanin and hemocyanin separated proteins of the giant freshwater prawn Macrobra-
chium rosenbergii. International Journal of Biological Macromolecules, 102, 977-985.
Ramlingam, K., Rajan, U.B., Kumaran, N.S., Jaffar, A., 2015. Hemocytes profile of mud crab Scylla 
tranquebarica - an analysis of light, phase contrast and electron microscopic observation. Journal 
of Marine Biosciences, 1 (1), 20-32.
34Acta Biologica Slovenica, 2021, 64 (1), 18–35
Rebelo, M. de F., Figueiredo, E. de S., Mariante, R.M., Nóbrega, A., de Barros, C.M., Allodi, S., 2013. 
New insights from the oyster Crassostrea rhizophorae on bivalve circulating hemocytes. PloS 
One, 8 (2), e57384.
Rosa, R.D., Barracco, M.A., 2010. Antimicrobial peptides in crustaceans. Invertebrate Survival Journal, 
7 (2), 262-284.
Roulston, C., Smith, V.J., 2011. Isolation and in vitro characterisation of prohaemocytes from the 
spider crab, Hyas araneus (L.). Developmental and Comparative Immunology, 35 (5), 537-544.
Rowley, A.F., Powell, A., 2007. Invertebrate immune systems–specific, quasi-specific, or nonspecific? 
The Journal of Immunology, 179 (11), 7209-7214.
Sicard, M., Chevalier, F., De Vlechouver, M., Bouchon, D., Grève, P., Braquart-Varnier, C., 2010. 
Variations of immune parameters in terrestrial isopods: a matter of gender, aging and Wolbachia. 
Naturwissenschaften, 97 (9), 819-826.
Smith, V.J., Brown, J.H., Hauton, C., 2003. Immunostimulation in crustaceans: does it really protect 
against infection? Fish and Shellfish Immunology, 15 (1), 71-90.
Smith, V.J., Dyrynda, E.A., 2015. Antimicrobial proteins: from old proteins, new tricks. Molecular 
Immunology, 68 (2), 383-398.
Smith, V.J., Söderhäll, K., 1991. A comparison of phenoloxidase activity in the blood of marine inver-
tebrates. Developmental and Comparative Immunology, 15 (4), 251-261.
Snyman, R.G., Odendaal, J.P., 2009. Effect of cadmium on haemocyte viability of the woodlouse 
Porcellio laevis (Isopoda, Crustacea). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 
83 (4), 525-529.
Söderhäll, I., 2016. Crustacean hematopoiesis. Developmental and Comparative Immunology, 58, 
129-141.
Söderhäll, I., Bangyeekhun, E., Mayo, S., Söderhäll, K., 2003. Hemocyte production and maturation in 
an invertebrate animal; proliferation and gene expression in hematopoietic stem cells of Pacifastacus 
leniusculus. Developmental and Comparative Immunology, 27 (8), 661-672.
Söderhäll, K, Cerenius, L., 1992. Crustacean immunity. Annual Review of Fish Diseases, 2, 3-23. 
Tassanakajon, A., Rimphanitchayakit, V., Visetnan, S., Amparyup, P., Somboonwiwat, K., Charoen-
sapsri, W., Tang, S., 2018. Shrimp humoral responses against pathogens: antimicrobial peptides 
and melanization. Developmental and Comparative Immunology, 80, 81-93.
Tassanakajon, A., Somboonwiwat, K., Supungul, P., Tang, S., 2013. Discovery of immune molecules 
and their crucial functions in shrimp immunity. Fish and Shellfish Immunology, 34 (4), 954-967.
Tesovnik, T., Cizelj, I., Zorc, M., Čitar, M., Božič, J., Glavan, G., Narat, M., 2017. Immune related 
gene expression in worker honey bee (Apis mellifera carnica) pupae exposed to neonicotinoid 
thiamethoxam and Varroa mites (Varroa destructor). PLoS One, 12 (10), e0187079.
Tran, N.T., Kong, T., Zhang, M., Li, S., 2020. Pattern recognition receptors and their roles on the 
innate immune system of mud crab (Scylla paramamosain). Developmental and Comparative 
Immunology, 102, 103469. 
Uhrík, B., Rýdlová, K., Zacharová, D., 1989. The roles of haemocytes during degeneration and rege-
neration of crayfish muscle fibres. Cell and Tissue Research, 255 (2), 443-449.
Van de Braak, C.B.T., Botterblom, M.H.A., Liu, W., Taverne, N., Van der Knaap, W.P.W., Rombout, 
J.H.W.M., 2002. The role of the haematopoietic tissue in haemocyte production and maturation in 
the black tiger shrimp (Penaeus monodon). Fish Shellfish Immunol, 12, 253-272. 
Van Der Zande, M., Kokalj, A.J., Spurgeon, D.J., Loureiro, S., Silva, P.V., Khodaparast, Z., Drobne, 
D., Clark, J.N., van den Brink, N.W., Baccaro, M., van Gestel, C.A.M., Bouwmeester, H., Handy, 
R.D., 2020. The gut barrier and the fate of engineered nanomaterials: a view from comparative 
physiology. Environmental Science: Nano, 7 (7), 1874-1898.
Wang, X.W., Wang, J.X., 2013. Pattern recognition receptors acting in innate immune system of shrimp 
against pathogen infections. Fish and Shellfish Immunology, 34, 981-989.
35Dolar et al.: Imunski sistem pri rakih
Xu, Z., Liu, A., Li, S., Wang, G., Ye, H., 2020. Hepatopancreas immune response during molt cycle in 
the mud crab, Scylla paramamosain. Scientific Reports, 10 (1), 1-14.
Zhou, Y.L., Gu, W.B., Tu, D.D., Zhu, Q.H., Zhou, Z.K., Chen, Y.Y., Shu, M.A., 2018. Hemocytes of 
the mud crab Scylla paramamosain: cytometric, morphological characterization and involvement 
in immune responses. Fish and Shellfish Immunology, 72, 459-469.