FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 221 Pregledni članki - Review Articles Gripa in inhibitorji virusne nevraminidaze Influenza and viral neuraminidase inhibitors Tanja Rozman Peterka, Marija Sollner Dolenc POVZETEK: Gripa oz. influenca je visoko infektivna respiratorna bolezen, ki povzroča periodične epidemije in pandemije. Cepiva zaradi velike antigenske variabilnosti virusa influence zagotavljajo le delno zaščito, protivirusna terapija z amantadinom in rimantadinom pa ni široko uporabna zaradi omejenega spektra delovanja, stranskih učinkov in hitrega razvoja rezistence. Nove možnosti za nadzor influence so inhibitorji encima nevraminidaze-b sialidaze. Encim je nujen za virusno replikacijo in infektivnost, njegovo aktivno mesto pa je ohranjeno pri vseh podtipih virusa influence A in B. Uspešen pristop pri razvoju učinkovitih inhibitorjev virusne nevraminidaze je bilo racionalno načrtovanje spojin s pomočjo poznavanja mehanizma delovanja encima, njegove kristalne strukture in kompleksa s substratom ter inhibitorji in z uporabo računalniškega molekulskega modeliranja. Z razvojem učinkovitih in selektivnih inhibitorjev virusne nevraminidaze, kot sta zanamivir in oseltamivir, je encim postal pomembna tarča za zdravljenje in preprečevanje infekcij, povzročenih z virusi influence. Ključne besede: influenca, sialidaza, nevraminidaza, zanamivir, oseltamivir ABSTRACT: Flu or influenza remains a very serious respiratory illness. It is highly infective and causes periodic epidemics and pandemics. Protection against influenza through vaccination is limited due to the antigenic variation of the influenza virus, while the use of older antiviral agents amantadine and rimantadine is limited because of lack of activity against influenza B viruses, unfavorable tolerability and rapid emergence of resistance. Influenza neuraminidase inhibitors comprise a potent new compound class that was specifically designed to target the active site of the neuraminidase - sialidase enzyme, which is conserved across all type A and B influenza neuraminidase subtypes. The enzyme is essential for virus replication and infectivity. The successful strategy which has resulted in the development of potent influenza virus sialidase inhibitors relies on several factors: the information from the X-ray crystallographic studies of influenza virus sialidase; rational drug design techniques like molecular modelling and advances in computational chemistry analysis; and an understanding of the enzyme mechanism. Influenza neuraminidase has been validated as a target for the development of anti-influenza drugs as demonstrated by the efficiacy and selectivity of zanamivir and oseltamivir in the treatment and prevention of influenza virus infections. Key words: influenza, sialidase, neuraminidase, zanamivir, oseltamivir I Uvod Influenca, splošno znana kot gripa, je ena izmed najstarejših in najbolj pogostih bolezni pri človeku. Je visoko infektivna bolezen, ki povzroča periodične epidemije in pandemije (1). V prejšnjem stoletju so zabeležili kar tri velike pandemije influence leta 1918, 1957 in 1968. Največja med njimi, imenovana »španska gripa«, je med leti 1918-1919 zahtevala preko 40 milijonov mrtvih, kar je več, kot je bilo umrlih med prvo svetovno vojno (2). »Azijska influenca« leta 1957 in pandemija leta 1968 pa sta samo med prebivalci Združenih držav Amerike povzročili okoli 100 000 smrtnih primerov (3). Zaradi velikega števila obolelih v času epidemij in pandemij ter precejšne smrtnosti povzroča influenca ogromne izgube v gospodarstvu (1, 2). Influenca je akutna bolezen, ki jo povzročajo virusi influence tipa A in B. Širijo se po zraku, v oblki kapljic in prizadenejo respiratorni sistem. Simptomi, poleg respiratornih težav, vključujejo oslabelost, bolečine v mišicah in povišano temperaturo od 38 do 40 °C (1, 4). Najpogostejši zaplet povezan z influenco je pljučnica. Tveganje za smrt zarad zapletov je signifikantno večje pri rizičnih skupinah, kot so starejši ljudje, dojenčki in ljudje s kroničnimi obolenji pljuč ter boleznimi srca (1, 5). Svetovna zdravstvena organizacija je zaradi velike obolevnosti, smrtnosti in izgub v gospodarstvu vzpostavila sistem nadzora nad gripo (6). Vsako leto poskušajo oceniti antigenske spremembe virusa influence in izdelati primerno cepivo (1). Vendar so možnosti za nadzor influence omejene. Cepivo zaradi velike antigenske variabilnosti virusa influence zagotavlja le delno zaščito, zato je potrebno stalno spremljanje virusov, njihove spremenljivosti, dopolnjevanje cepiva in revakcinacija ljudi (4). Protivirusna terapija s prvo generacijo pro-tivirusnih zdravil proti influenci, amantadinom in njegovim derivatom rimantadinom (inhibitorji ionskih kanalčkov v virusni ovojnici, ki preprečujejo sproščanje virusnih ribonukleoproteinov), ni široko uporabna zaradi omejenega spektra delovanja le na viruse influence tipa A, stranskih učinkov na centralni živčni sistem in hitrega razvoja rezistence (4, 7, 8). Nove možnosti pri zdravljenju in preventivi gripe je ponudilo odkritje, da je aktivno mesto encima virusne nevraminidaze- sialidaze ohranjeno pri različnih podtipih virusov influence (9). Encim je nujen za virusno replikacijo in infektivnost, njegovo aktivno mesto pa ostaja ohranjeno tudi med genskimi spremembami. Tanja Rozman Peterka, mag. farm., LEK farmacevtska družba d. d., Razvoj in raziskave, Verovškova 57, Ljubljana; izr. prof. dr. Marija Sollner Dolenc, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, Ljubljana farm vestn 2005; 56 2 FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 222 Pregledni članki - Review Articles Encim nevraminidaza je postal tako pomembna tarča pri razvoju pro-tivirusnih zdravil za zdravljenje in preprečevanje influence (4). 1.1 Virusi influence Virusi influence spadajo v družino virusov Orthomyxoviridae. Delimo jih na tipe A, B in C, vendar sta klinično pomembna le tipa A in B (10). Virusi influence tipa A lahko okužijo živali in človeka, medtem ko je tip B patogen le za človeka (4, 11). Viruse influence tipa A delimo na več podtipov, ki se razlikujejo v sestavi glikoproteinov hemaglutinina (HA) in nevraminidaze (NA), ki se nahajata na površini virusa (10, 12). Poznamo 15 različnih HA (H1-H15) in 9 NA (N1-N9) (4, 11), kombinacijo le-teh pa uporablja kot osnovni princip za označevanje tipov in podtipov virusov influence tudi Svetovna zdravstvena organizacija in je pomembna pri epidemioloških analizah ter razločevanju virusov (1). Trenutno prisotni podtipi človeških virusov influence imajo pretežno kombinacijo treh različnih hemaglutininov (H1, H2 in H3) in dveh nevraminidaz (N1 in N2) (3). Hemaglutinin (HA) omogoča vezavo virusa na receptor, ki vsebuje sialno kislino in se nahaja na površin tarčne celice v respiratornem traktu. Omogoči zlitje virusne in celične membrane gostiteljske celice. Je glavna tarča protiteles in s tem tudi cepiv (4). Nevraminidaza (NA) oz. sialidaza je encim, ki cepi terminalno sialno kislino na receptorju gostiteljske celice za hemaglutinin in s tem omogoča sproščanje novo nastalih virusov iz gostiteljeve celice ter preprečuje njihovo agregacijo (4). Virusi influence so podvrženi pomembni variabilnosti glikoproteinov, ki se nahajajo na površini virusa (HA in NA). Okužba ali vakcinacija z enim podtipom virusa daje le malo ali nič zaščite proti drugim različnim podtipom virusov influence, zato ne moremo doseči trajne imu-nizacije. Genetske spremembe so vzrok epidemij, ki se pojavijo, ko nastane nova variacija virusa (4). Vsako leto cepivo temelji na tistih podtipih virusov influence, za katere pričakujejo, da se bodo pojavil tisto sezono. Cepljenje priporočajo za populacijo ljudi s povečanim tveganjem, to so starejši ljudje, ljudje s kroničnimi obolenji pljuč in boleznimi srca. Občasno pa pride do takšnih genetskih sprememb virusa, ki zelo povečajo njegovo virulentnost, spremenjen virus je usoden ne le za rizično skupino ljudi, ampak za širšo populacijo sicer zdravih ljudi (13, 14). Poznamo dva načina, ki privedeta do antigenskih sprememb (4, 10). Antigenski odmik (antigenic drift) je kopičenje točkovnih mutacij Posledice so spremembe v aminokislinskem zaporedju na antigenskih mestih hemaglutinina in/ali nevraminidaze. Te spremembe zmanjšajo vezavo protiteles in zato zmanjšujejo obstoječo imunost v populaciji. Vzrok je nastanek epidemij. Antigenski odmik se pojavlja pri obeh tipih virusov influence (A in B). Antigenski premik (antigenic shift) je bolj dramatična in nenadna sprememba, ki se pojavi v hemaglutininu in/ali nevraminidazi le pri virusih influence tipa A. Spremembe so posledica nadomestitve celotnega virusnega gena z zapisom za HA ali NA z genom iz živalskega virusa influence (npr. ptičjega). Ker je v populaciji malo ali nič imunosti proti takšnim variacijam virusa, nastanejo pandemije, ki imajo za posledico visoko obolevnost in tudi smrtnost. Za razliko od hemaglutinina je aminokislinsko zaporedje v aktivnem mestu nevraminidaze zelo malo spremenjeno med antigensko zelo različnimi podtipi virusov influence. Kljub temu, da večji del NA variira med posameznimi podtipi virusov influence, kristalografske analize kažejo, da aminokislinsko zaporedje in tridimenzionalna struktura aktivnega mesta nevraminidaze ostaja ohranjena (4). Vseh 11 aminokislinskih ostankov, ki določajo in omejujejo žepe v aktivnem mestu encima, tvori interakcije s substratom. 1.2 Encim nevraminidaza Nevraminidaza oz. sialidaza je glikoprotein - encim, ki se nahaja na površini virusa influence tipa A in B. Ima pomembno vlogo pri virusni replikaciji in njegovi infektivnosti (8, 15). Encim katalizira cepitev a(2-6)- ali a(2-3)-glikozidne vezi med terminalno sialno kislino (N-acetil-nevraminsko kislino) in sladkornim ostankom (8, 10) (slika 1). Cepitev te vezi je nujna za širjenje virusa po dihalnih poteh, saj omogoča sproščanje virusov iz okužene celice in preprečuje agregacijo sproščenih virusov. Aktivno mesto nevraminidaze vsebuje večje število polarnih in ion-iziranih aminokislin, ki interagirajo s polarnim substratom- sialno kislino (9). Vsi aminokislinski ostanki nevraminidaze, ki interagirajo s substratom, so ohranjeni pri obeh tipih virusov influence (9). S temi aminokislinskimi ostanki tvorijo interakcije tudi kompetitivni inhibitorji. Negativno nabita karboksilna skupina substrata in inhibitorjev tvori ionske interakcije z Arg triado (Arg 118, 292 in 371), N-acetilna skupina pa tvori polarne in nepolarne interakcije z Arg 152, Trp 178 in le 222 (15). Aktivno mesto nevraminidaze lahko razdelimo na tri večje dobro definirane vezavne žepe. Žep 1 vsebuje polarne ostanke Glu 276, Glu 277, Arg 292, Asn 294 in hidrofobni Ala 246. Kljub temu, da je žep 1 po strukturi zelo polaren, nova dognanja kažejo tudi na možnost nepolarnih interakcij, s katerimi razlagajo večjo afiniteto novejših inhibitorjev do encima (15). Žep 2 sestavljajo lie 222, Arg 224 in Ala 246. Tretje vezavno mesto - žep 3 je večje in vsebuje hidrofob-nein hidrofilne ostanke (Glu 119, Asp 151, Arg 152, Trp 178, Ser 179, le 222 in Glu 227); sem se vezeta C-4 hidroksilna in 5 N-acetilna HO OH W COOH AcHN—^ analoge sialne kisline z dihidropiranovim obročem (zanamivir), analoge sialne kisline z benzenovim obročem, > cikloheksenske analoge sialne kisline (oseltamivir), > analoge sialne kisline s petčlenskimi obroči. 2.1 Analog! sialne kisline z dihidropiranovim obročem Z določitvijo kristalne strukture kompleksa Neu5Ac2en s sialidazo so dobili informacije potrebne za ustrezne modifikacije Neu5Ac2en za razvoj bolj učinkovitih inhibitorjev. Ugotovili so, da zamenjava hidroksilne skupine na C-4 z amino skupino omogoča ionske interakcije z Glu 119 na aktivnem mestu ter da je žep na tem mestu dovolj velik za vezavo večjih bazičnih skupin, kot je gvanidinska skupina, ki lahko tvori ionske interakcije z Glu 119 in Glu 227 (16). S pripravo spojin 4-amino-Neu5Ac2en (7) in 4-gvanidino-Neu5Ac2en (8) so dobili učinkovita in vitro in in vivo inhibitorja virusne sialidaze A in B tipa virusa influence. Spojina 8 z generičnim imenom zanamivir je učinkovita že v subnanomolarnih koncentracijah (Ki = 10 M) in je tudi registrirana kot zdravilo za zdravljenje ter preventivo gripe (17). Zaradi neustrezne biološke uporabnosti in hitrega metabolizma se uporablja v obliki inhalacij. Pomembna je selektivnost zanamivirja glede na ostale virusne, bakterijske in sesalske sialidaze. Selektivnost razlagajo na podlagi arhitekture aktivnega mesta različnih sialidaz, ki je le pri sialidazi virusa influence takšna, da se vanj lahko prilega relativno velik bazičen C-4 substituent, kot je gvanidinska skupina (16). Raziskovalci so poskusili pripraviti tudi številne analoge zanamivirja, ki bi imeli ustreznejše farmakokinetične lastnosti (16). Substitucija gvanidinskega dušika z različnimi skupinami (11) ali uporaba drugih dušik vsebujočih substituentov (12, 13) na mestu C-4 je negativno vplivala na inhibicijo sialidaze. Tudi acetamidna skupina na mestu C-5 je pomembna za inhibicijo encima, z njeno odstranitvijo (14) se je 25000-krat zmanjšala afiniteta do encima. S substitucijo tega mesta s trifluoroacetamidno (15) in sulfonamidno funkcionalno skupino (16) so dobili še vedno učinkovite inhibitorje, ki pa so imeli manjšo afiniteto do encima kot zanamivir (Ki = 2-10~8 M in 9-10~8 M). Modifikacije stranske glicerolne verige zanamivirja so dale vpogled za strukturne zahteve na tem mestu. Skrajšanje stranske verige (17) je vplivalo na izgubo afintete. Najbolj zanimiva modifikacije stranke H /l\L /COOH N Y O H COOH HO AcHN OH OH OH AcHN HO AcHN 10 COOH P03H2 5 R=—OH Neu5Ac2en NHC(0)CF3 6 R= 7 R= 8 R= -NH„ 4-amino-Neu5Ac2en NH zanamivir NH2 r Slika 2: Inhibitorji virusne nevraminidaze Figure 2: Virus neuraminidase inhibitors farm vestn 2005; 56 22i FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 224 Pregledni članki - Review Articles OH OH OH AcHN COOH HN^NH NHR 11 R1 =-N02, -C02 Et, -Me, -OH OH OH OH OH COOH OH AcHN H 12 R= /N-— 13 R= -NMe, COOH HN-^NH NH2 14 X= -H 15 X= -NC(0)CF3 16 X= -NHS02CH3 AcHN OH lv.OvXOOH HN-v^NH NH, 17 O R2x *N AcHN Jl^XL^COOH XT v // HN-^NH \ ^v^/O^^COOH AcHN JU NH, 18 R1/R2= alkil, feniletil, aril HN^NH NK 19 Slika 3: Inhibitorji virusne nevraminidaze: analogi sialne kisline z dihidropiranovim obročem Figure 3: Virus neuraminidase inhibitors: dihydropyran analogs of sialic acid verige na C-6 je karboksamidna skupina, substituirana z alkilnimi verigami, feniletilnim ali arilnim fragmentom (18). Spojine imajo primerljivo inhibicijo z zanamivirjem. Vendar pa niso primerne za per-oralno aplikacijo niti ne za inhalacijo. Substitucija glicerolne stranske verige s heterocikli (oksadiazoli, triazoli) (19) je povečala selektivnost za tip A glede na tip B virusa influence. 2.2 Analogi sialne kisline z benzenovim obročem Veliko napora so raziskovalci vložili v iskanje manj polarnih inhibitorjev virusne sialidaze, ki bi imeli ugodnejše fizikalno-kemične lastnosti Z nadomestitvijo dihidropiranskega obroča s planarnim benzenovim obročem so dobili številne derivate benzojske kisline (20. 21. 22. 23 24, 25) (16, 18). Najučinkovitejši derivat benzojske kisline kot inhibitor virusne sialidaze in vitro je bil 22 (BANA 113), vendar ni kazal in vivo inhibicije na modelih miši. Predvidevajo, da je vzrok hitro odstranjevanje z mesta delovanja - pljuč z metabolizmom in/ali absorpcijo (16). 2.3 Cikloheksenski analogi sialne kisline Pri iskanju učinkovitega inhibitorja sialidaze, ki bi bil uporaben za per-oralno aplikacijo, so uporabili kot osnovni skelet tudi cikloheksen Predvidevali so, da je dvojna vez v cikloheksenu primerna izosterna zamenjava za planaren oksonijev kation, ki nastane v prehodnem stanju encimske cepitve sialne kisline (16, 19). Cikloheksenov obroč je tudi kemično in encimsko stabilen ter primeren za kemične modifikacije substituentov za optimizacijo biološke aktivnosti (15). Pri načrtovanju peroralno aktivne protivirusne spojine so želel povečati lipofilnost molekule in s tem uravnati učinke polarnih funkcionalnih skupin v molekuli (C-1 karboksilno skupino, C-4 acetamidno in C-5 amino skupino), ki so nujno potrebne za inhibitorno aktivnost. Z dodatkom ustreznih stranskih verig na mestu C-3 so želeli povečati celokupno biološko uporabnost (15). Pripravili so številne analoge (26-39) z različnimi alkilnimi in arilnimi stranskimi verigami na C-3 in sistematično raziskali možnosti za hidrofobne interakcije (15, 19, 20). Ugotovili so, da sprememba dolžine in geometrije stranskih alkilnih verig vpliva na inhibitorno aktivnost za sialidazo (15, 19, 20). Najučinkovitejši inhibitor virusne sialidaze je bila spojina 31. Kristalna struktura spojine 31 (GS 4071) kaže na to, da je vezava karbocikličnih inhibitorjev iz te serije podobna vezavi spojine 4-amino-Neu5Ac2en. Polarne funkcionalne skupine interagirajo z istimi aminokislinskimi ostanki v aktivnem mestu. Kristalna struktura kaže spremembe v 4 farm vestn 2005; 56 FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 225 Gripa in inhibitorji virusne nevraminidaze AcHN COOH COOH OH AcHN HINk^NH NH, 20 R= -H 21 R= -OCH(CH2CH3)2 23 H .N^^NH 22 R= \ BANA 113 NH, Slika 4: Inhibitorji virusne nevraminidaze: analogi sialne kisline z benzenovim obročem Figure 4: Virus neuraminidase inhibitors: benzene analogs of sialic acid COOH AcHN 24 R= -NH, 25 R= H -N^NH NH, 26 R: 27 R: H- :CHq AcHN' NH 28 R= CH3 CH2 -2? R=CH3(CH2)n 30 R= CF3 CH2 CH2 - 31 R= (CH3CH2)2CH 33 R= (CH3)2CHCH2 n= 2-9 34 R= 35 R= 36 R= Slika 5: Inhibitorji virusne nevraminidaze: analogi sialne kisline z cikoheksenovim obročem Figure 5: Virus neuraminidase inhibitors: cyclohexene analogs of sialic acid vezavi 3-pentilne stranske skupine GS 4071, ki tvori hidrofobne interakcije, ki jih pred tem niso opazili pri vezavi sialne kisline. Na podlag kristalografskih študij analogov so ugotovili, da v aktivnem mestu encima obstaja hidrofobni žep, ki ga sestavljajo aminokisline Glu276; Ala246, Arg224 in Ile222 in v katerega se po velikosti in obliki prilega 3-pentilna skupina in signifikantno vpliva na povečanje vezavne afinitete spojine 31 (15, 19, 20). Izkazalo se je, da ima GS 4071, ki je bil razvit za peroralno uporabo, zelo slabo biološko uporabnost. Pretvorba GS 4071 v ustrezen etilni ester- predzdravilo oseltamivir (GS 4104) (30). je izrazito povečala biološko uporabnost, tako da je spojina primerna za peroralno aplikacijo (15). Vpliv mesta dvojne vezi v cikloheksenskem obroču je dobro viden pri primerjavi inhibitorne aktivnosti analogov s 3-pentilno stransko verigo (40, 41, 42). Spremembe mesta dvojne vezi zelo zmanšajo afiniteto do encima, iz česar lahko sklepamo, da je le izomer 31 dober mimetik strukture prehodnega stanja (15). Izosterne zamenjave O z S, NH in CH2 so pokazale, da imajo C-3 karba, tio in aza izosteri primerljivo inhibitorno aktivnost (15). 2.4 Analogi sialne kisline s peklenskimi obroči Pripravili so tudi analoge sialne kisline, kjer so za osnovni skelet uporabili ciklopentanski, pirolidinski in tetrahidrofuranski obroč (21 22, 23). Od teh sta zelo učinkovita inhibitorja nevraminidaze peramivir oz. BCX-1812 (43) s ciklopentanskim skeletom in spojina A-315675 (44) s pirolidinskim obročem, medtem ko so derivati s tetrahidrofura-novim obročem (45, 46) slabši inhibitorji nevraminidaze kot njihovi pirolidinski analogi (22). Učinkovina peramivir je v fazi kliničnih testiranj, spojina A-315677 (predzdravilo A-315675) pa v predklinični fazi razvoja (21). 3 Terapevtska uporaba inhibitorjev virusne nevraminidaze Zanamivir (8) in oseltamivir (32) sta učinkovita in vitro in in vivo inhibitorja sialidaze virusa influence tipa A in B, ki se uporabljata za zdravljenje in preprečevanje gripe (24, 25, 26). Zanamivir ima neustrezno biološko uporabnost po peroralni aplikaciji, zato se uporablja lokalno v obliki inhalacij. Oseltamivir (32) pa je predzdravi- farm vestn 2005; 56 2 FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 226 Pregledni članki - Review Articles COOH AcHN NH AcHN NH. 31 GS4071 IC50 = 1 nM tip A influenze IC50 =3 nM tip B influenze 32 GS 4104 oseltamivir ¦COOH AcHN NH, AcHN' .COOH NH, 0„„ -^ ^COOH AcHN NH, 40 41 42 IC50=30nM tip A IC50=500nM tipB IC50=1500nMtipA IC50= 6600nM tip B Slika 6: Inhibitorji virusne nevraminidaze: GS 4071, oseltamivir in analogi Figure 6: Virus neuraminidase inhibitors: GS 4071, oseltamivir and analogs ...iCOOH HN HN NH, 43 peramivir (BCX-1812) ll4COOH 44 A-315675 IC50=380nM tip A IC50= 1800nMtipB ...»COOH 45 X 46 X -COOCH3 H najbolj pogosta je bila mutacija Arg292Lys (27, 28) > v manjšem obsegu je prišlo do mutacij Glu119Val, opazili pa so še druge mutacije na mestu 119 (Glu119Gly, Glu119Ala; Glu119Asp)(27) > opisani so posamezni primeri mutacije His274Tyr (27), en primer mutacije Arg152Lys pri otroku z oslabljenim imunskim sistemom (27) in muatcijo Asp198Asn pri virusu influence tipa B (21). Mutirani virusi kažejo zmanjšano infektivnost in virulentnost in vivo ter se težko prenašajo iz človeka na človeka. Študije na živalih potrjujejo podatke kliničnih študij, da so virusi odporni na inhibitorje virusne nevraminidaze manj virulentni kot divji tipi virusa, imajo zmanjšano patogenost in infektivnost. To je tudi pričakovano, saj mutacije, na sicer strogo ohranjenem aktivnem mestu encima, zelo oslabijo funkcionalnost nevraminidaze, ki je nujna za širjenje virusov (27, 28). 5 Sklep Podatki o žrtvah v času velikih pandemij influence v letih 1918, 1957 in 1968 ter pojav ptičje gripe v zadnjih letih v Aziji, v tem letu pa tud v Evropi, vsekakor vplivajo na zavedanje o nevarnosti gripe. Vendar Gripa in inhibitorji virusne nevraminidaze ljudje kljub temu gripo še vedno prepogosto enačijo z navadnim prehladom in le-ta pogosto velja za bolezen, ki ogroža le starejše ljudi. Danes, ko živimo v času globalizacije in velike mobilnosti ljudi, lahko hitro pride do širjenja mutiranega virusa in pandemije gripe. Cepiva in zdravila, kot so inhibitorji nevraminidaze, so le začetek nove dobe v boju proti gripi. V literaturi so opisani kot potencialna zdravila za zdravljenje gripe še inhibitorji virusne RNA transkriptaze in replikaze, inhibitorji vezave virusov influence na receptor gostiteljske celice za hemaglutinin in spojine, ki stabilizirajo konformacijo hemaglutinina ter inhibitorni oligoribonukleotidi (29, 30). Vprašanje pa je, katera od njih bodo sploh dosegla fazo kliničnih testiranj in ali bo farmacevtska industija vlagala denar v drag razvoj novih zdravil, ki morda ne bodo povrnila stroškov razvoja. Zato je toliko bolj pomembno, kako cepiva in zdravila, ki so na razpolago za zdravljenje in preventivo influence, v primeru pandemije ali epidemije uporabiti v klinični praksi, da bo njihov učinek največji. 6 Literatura 1. Kuszewski K, Brydak L. The epidemiology and history of influenza. Biomed & Pharmacother 2000; 54: 188-195. 2. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ 3. Palese P. Influenza: Old and new threats. Nature Medicine 2004; 10: 82-87 4. Oxford JS, Lambkin R. Targeting influenza virus neuraminidase - a new strategy for antiviral therapy. DDT 1998; 3: 448-456. 5. Cox NJ. Subbarao K. Influenza. Lancet 1999; 354: 1277-1282. 6. http://www.who.int/csr/disease/influenza/en/ 7. Gubareva LV, Kaiser L, Hayden FG. Influenza virus neuraminidase inhibitors. Lancet 2000; 355: 827-835. 8. Calfee DP, Hayden FG. New Approaches to Influenza Chemotherapy-Neuraminidase inhibitors. Drugs 1998; 56: 537-553. 9. Colman PM, Varghese JN, Laver WG. Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virus neuraminidase. Nature 1983; 303: 41-44. 10. Brown EG. Influenza virus genetics. Biomed & Pharmacother 2000; 54: 196-209. 11. http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/Orthomvxoviruses.html 12. Varghese JN. Develpoment of Neuraminidase Inhibitors as Anti-Influenza Virus Drugs. Drug Development Research 1999; 46: 176-196. 13. Bradbury J. What makes an influenza virus virulent? Lancet 1998; 352: 629. 14. Claas ECJ, Osterhaus ADME. New clues to the emergence of flu pandemics. Nature medicine 1998; 4: 1122-1123. 15. Lew W, Chen X, Kim CU. Discovery and Development of GS 4104 (oseltamivir): An Orally Active Influenza Neuraminidase Inhibitor. Current Medicinal Chemistry 2000; 7: 663-672. 16. Kiefel MJ, ItzsteinM. Influenza Virus Sialidase: A Target for Drug Discovery. Progress in medicinal Chemistry 1999; 36: 1-28. 17. http://www.gov.si/ivz/knjiznica/reg_zdravil/RZ_ATCJ.HTM 18. Atigadda VR, Brouillette WJ, Duarte F et al. Hydrophobic Benzoic Acids as Inhibitors of Influenza Neuraminidase. Bioorg. Med. Chem. 1999; 7: 2487-2497. 19. Williams MA, Lew W; Mendel DB et al. Structure-activity relationships of carbocyclic influenza neuraminidase inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1997; 7 (14): 1837-1842. 20. Kim CU, Lew W, Williams MA et al. Structure-Activity Relationship Studies of Novel Carbocyclic Influenza Neuraminidase Inhibitors. J. Med. Chem 1998; 41: 2451-2460. 21. Gubareva LV. Molecular mechanism of influenza virus resistance to neuraminidase inhibitors. Virus Research 2004; 103: 199-203. 22. Wang GT, Wang S, Gentles R et al. Design, synthesis, and structural analysis of inhibitors of influenza neuraminidase containing a 2,3-disubstituted tetrahy-drofuran-5-carboxylic acid core. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005; 15: 125-128. 23. Kati WM, Montgomery D, Carrick R et al. In Vitro Characterization of A-315675, a Highly Potent Inhibitor of A and B Strain Influenza Neuraminidases and Influenza Virus Replication. Antimicrob. Agents Chemother 2002; 46: 1014-1021. 24. McNicholl IR, McNicholl JJ. Neuraminidase Inhibitors: Zanamivir and Oseltamivir. Ann Pharmacother 2001; 35: 57-70. 25. Waghorn SL, Goa KL. Zanamivir. Drugs 1998; 55: 721-725. 26. Bardsley-Elliot A, Noble S. Oseltamivir. Drugs 1999; 58: 851-860. 27. Jackson HC, Roberts N, Wang ZM etal. Managmentof Influenza. Clin Drug Invest 2000; 20: 447-454. 28. Carr J, Ives J, Kelly L et al. Influenza virus carrying neuramindase with reduced sensitivity to oseltamivir carboxylate has altered properties in vitro and is compromised for infectivity and replicateive ability in vivo. Antiviral Research 2002; 54: 79-88. 29. Oxford JS, Bossuyt S, Eswarasaran R, Lambkin R. Drugs to combat the epidemic and pandemic faces of influenza. In: Potter CW. Perspectives in medicinal virology 7; Influenza. Elsevier Science 2002: 201-234. 30. Ge Q, Filip L, Bai A et al. Inhibition of influenza virus production in virus-infected mice by RNA interference. PNAS 2004; 101: 8676-8681 farm vestn 2005; 56 2