Optimiranje pogojev za imobilizacijo tripsina na površino membrane iz celuloznega acetata
Optimization of Terms for the Immobilization of Trypsin on the Surface of Cellulosic Acetate Membrane
Bezjak A.1, Č. Stropnik, Tehniška fakulteta, Oddelek za kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru
V prispevku opisana metoda imobilizacije tripsina temelji na nastanku kovalentne vezi med tripsinom in celulozno acetatno membrano, ki je površinsko aktivirana. Podrobno je raziskana aktivacija membrane s triklortriazinom, ki je odločilna za uspešnost imobilizacije.
Ključne besede: aktivacija, imobilizacija, tripsin, aktivnost
In the paper described method of trypsin immobilization is based on the formation of the covalent bond between the trypsin and the cellulosic acetate membrane vvhieh is activated on the surface. The aetivation of the membrane vvith trichlorotriazine vvhieh is decisive for efficiency of the immobilization has been investigated in details.
Key vvords: aetivation, immobilization, trypsin, activity
1.	Uvod
Kovalentna imobilizacija encimov na trdne nosilce'- je eksperimentalno ena izmed zahtevnejših mobilizacijskih metod, saj poteka v več stopnjah. Nosilec moramo /a vezavo encima aktivirati. za kar uporabljamo aktivirajoče reagente, ki morajo biti sposobni reagirati s funkcionalnimi skupinami nosilca in encima. Izbira aktivirajočega reagenta in potek aktivacije nosilca za vezavo encima je korak, ki odločilno vpliva na uspešnost imobilizacije. Kovalentna vezava encima na aktivirani nosilec poteka preko funkcionalnih skupin encima popolnoma naključno; med imobilizacijskim postopkom zato pogosto pride do deakti-vacije encima, ki je posledica poškodbe aktivnega mesta ali spremembe terciarne (kvarterne) strukture encima. Optimiranje eksperimentalnih pogojev vseh stopenj imobilizacijskega postopka omogoča znižanje deaktivacije encima.
2.	Teoretični del
Celoten postopek imobilizacije tripsina na površino membrane celulozne.'a acetata (CA) poteka v treh stopnjah, kot je prikazano na sliki I.
-CH3C00Na al
CYV
N «y-N
-HCI b)
T T
N^-N
urr
"V
Cl
Slika I: Imobilizacija tripsina na površino membrane i/ CA: a) hidroli/a površine membrane iz CA, hI aktivacija površine membrane s triklortriazinom (TCT). c) kovalentna imobilizacija encima na površino membrane. Figure 1: Immobilization of Trypsin on the surface of CA membrane: a) hydrolysis of the surface of CA membrane, h) aetivation of the membrane surface by trichlorotriazine (TCT), c) covalent immobilization of enzyme on the membrane surface.
Andreja BEZJAK, dipl. in/ kem. lehn. Fakulteta /a kemijo in kem. lehn. Smetanova ut. 17! (>201)11 Maribor
Membrano iz CA je potrebno površinsko hidrolizirati z NaOH (slika l.a); produkt reakcije so hidroksilne skupine celuloze na površini membrane, ki so sposobne reagirati z aktivira-jočim reagentom. Kot aktivirajoči reagent uporabimo triklortri-azin' (TCT), ki je zaradi ugodnega položaja treh dušikovih atomov v s-triazinskem obroču močno reaktiven. Dušikovi atomi povzročajo zaradi svoje elektronegativnosti pomanjkanje elektronov na ogljikovih atomih triazinskega obroča, dodatno pomanjkanje elektronov pa je posledica prisotnosti klorovih atomov. ki polarizirajo C-CI vez. Primankljaj elektronov na ogljikovih atomih omogoča nukleofilno aromatsko substitucijo klorovih atomov s skoraj vsemi nukleofili. Večina substitucij-skih reakcij poteka stopenjsko, kar omogoča izolacijo mono-, di-ali tri- substituiranih produktov, kot prikazuje slika 2.
ciyNYcl
Cl
cyYN
N^N Cl

T T
N^-N
T T
nyN Nu
Slika 2: Nukleofilna aromatska substitucija TCT-ja Figure 2: Nucleophilic aromatic substitution of TCT
Znano je4, da poteče reakcija med hidroksilnimi skupinami na celulozi in enim klorovim atomom na triazinskem obroču (slika lb) v nekaj minutah pri sobni temperaturi. Le močnejši nukleofili. kot npr. -NH, skupine proteinov. lahko nato reagirajo z drugim klorovim atomom (slika lc) v vodni raztopini pri sobni temperaturi; pri nekoliko višjih temperaturah poteče reakcija tudi s tretjim klorovim atomom.
3. Eksperimentalni del
3.1. Določitev aktivnosti tripsina v raztopini
Za določitev proteolitske aktivnosti tripsina smo uporabili naravni substrat kazein. Metoda'' temelji na dejstvu, da tripsin razgrajuje kazein na produkte, ki so topni v triklorocetni kislini in absorbirajo svetlobo valovne dolžine 280 nm.
Bezjak A., Č. Stropnik: Optimiranje pogojev za imobilizacijo tripsina na površino membrane iz celuloznega acetata
Priprava raztopine substrata: 1 g kazeina (Merck, Casein acc. to Hammarsten) smo raztopili v 100 ml fosfatnega pufra (0.157 g KH:P04 in 1.575 g Na:HP04 \2H,0 raztopimo v 100 ml bidestilirane vode. pH=7.6) in segrevali na vreli vodni kopeli približno 15 minut, dokler ni bil kazein popolnoma raztopljen.
K 1 ml substrata smo dodali 1 ml raztopine tripsina (Serva. M=23800 g/mol) različnih koncentracij v 0.001 M HC1 in inku-birali 20 minut pri temperaturi 35°C. Reakcijo smo prekinili z dodatkom 3 ml 5% vodne raztopine triklorocetne kisline. Nastalo oborino nerazgrajenega ka/.eina smo po tridesetih minutah odstranili s centrifugiranjem (t=20 min. 13000 obratov/min). Bistri raztopini smo izmerili absorbanco pri 280 nm.
.v2. Optimiranje pogojev imobilizacije tripsina na površino membrane i: celuloznega acetata (CA)
Asimetrično porozno membrano iz raztopine CA (14.S g CA. 63.0 g acetona, 2.3 g Mg(C104)2. 19.9 ml vode) smo pripravili s procesom fazne inverzije (debelina nanosa 0.25 mm, netopilo čista deionizirana voda).
Za določitev optimalnih pogojev imobilizacije smo izvedli štiri različne imobilizacijske postopke.
Postopek I: površine membran iz CA smo hidrolizirali 5. 15 in 30 minut z 0.1 M NaOH. Spirali smo jih eno uro z deionizira-no vodo (1000 ml) in z benzenom (500 ml). Za aktivacijo membran smo uporabili 50 ml nasičene raztopine triklortriazina (TCT) v benzenu. Aktivacija je potekala eno uro pri sobni temperaturi; nato smo membrane ponovno spirali deset ur z benzenom (500 ml) in eno uro z deionizirano vodo (1000 ml) pri 0°C. 0.188 g tripsina smo raztopili v 250 ml 0.001 M HC1. reakcijo imobilizacije (slika lc) pa smo vodili s 50 ml raztopine tripsina eno uro. Po imobilizaciji smo membrane spirali z. deionizirano vodo dve uri (1000 ml) in z 0.09% raztopino NaCl (6X 1000 ml) Šest dni, s čimer smo odstranili na površino membrane adsorbiran tripsin.
Reakcije hidrolize. aktivacije in imobilizacije smo vodili na membranah iz CA. ki so bile napete preko dna odprtega steklenega valja; spiranje membran smo izvajali v kristalizirkah z volumnom 1000 ml.
Postopek 2: membrane z imobiliziranim encimom smo pripravili tako kot v postopku 1. le da smo reakcije izvajali pri tlaku 4 bar v ultrafiltracijski celici ob močnem mešanju.
Postopek 3: delali smo enako kot pri postopku 1, le da smo membrane pred aktivacijo s TCT spirali s topili padajoče polarnosti (prehod iz vodnega na nevodni medij) v vrstnem redu metanol (50 ml. 20 min), butanol (50 ml. 20 ml), benzen (50 ml, 20 min). Po aktivaciji smo spirali površine membran s topili naraščajoče polarnosti v vrstnem redu butanol, metanol, voda. Izbrana topila se med seboj mešajo.
Postopek 4: je enak postopku 3. le da membran po aktivaciji nismo spirali z alkoholi, temveč takoj z deionizirano vodo dve uri pri 0°C.
Aktivnost imobiliziranega tripsina smo določili z zgoraj opisano metodo. Reakcija med substratom in imobiliziranim tripsinom je potekala na fazni meji tekoče-trdno, zato smo povečali količino substrata (5 ml) in podaljšali čas inkubacije (ena ura, dva dni).
4. Rezultati in diskusija
Slika 3 prikazuje meritve absorbance v odvisnosti od koncentracije tripsina v raztopini.
A (280 nm)
C (ug trypslna/ml)
Slika 3: Odvisnost absorbance (X=280 nm) od koncentracije tripsina
Figure 3: Absorbance (A.=280 nm) as a function of Trypsin concentration
Iz slike 3 je razvidno, da med absorbanco in koncentracijo tripsina ni linearne zveze, zato moramo za izračun aktivnosti tripsina vrednosti ekstrapolirati na začetno hitrost reakcije.
Ena tripsinska enota" (TU1'1") je definirana kot količina tripsina, ki pod opisanimi pogoji (čas reakcije je 20 min, T=35°C, V=2 ml) razkroji toliko kazeina, da naraste absorbanca pri 280 nm v eni minuti na vrednost 1.000.
1/. slike 3 izračunamo:
TUC:IS = AE2s„,„,,/2()min jUg (trip. ) (jlg (trip. M ml)- 20 min
50-20
1 mg trgovskega tripsina vsebuje 0.4 TUc'lk aktivnostnih enot.
Encim, imobiliziran po postopku 1 in 3, ne kaže aktivnosti, pri encimu, imobiliziranem po postopku 2, zasledimo aktivnost, ki je zelo nizka in je lahko v okviru eksperimentalne napake. Visoko aktivnost tripsina zasledimo le v primeru, če imobilizacijo izvedemo po postopku 4. Slika 4 prikazuje odvisnost absorbance pri 280 nm od časa hidrolize za postopek 4.
A (280 nm)
C (ug trypslna/ml)
Slika 4: Odvisnost absorbance (X=280 nm) od časa hidrolize membrane
Figure 4: Absorbance (>.=280 nm) as a function of hydrolysis tirne
Bezjak A.. Č. Stropnik: Optimiranje pogojev za imobilizacijo tripsina na površino membrane iz celuloznega acetata
Domnevamo, da daljši čas hidrolize CA povzroči večjo poroznost površine membrane in da se v tem primeru tripsin imobilizira tudi v pore membrane. Z daljšanjem kontaktnega časa med tripsinom in kazeinom lahko pri reakciji sodeluje tudi tripsin, ki je imobiliziran v porah membrane (slika 4).
Iz. primerjave rezultatov in postopkov imobilizacije je razvidno, da je za uspešnost imobilizacije ključnega pomena reakcija aktivacije membrane s TCT. Spiranje membran s topili padajoče polarnosti do benzena (postopek 4) povzroči omočitev površine membrane z benzenom in s tem lažji dostop TCT do površine membrane. Koncentracija TCT-na ob površini membrane je bila pri postopku I zelo nizka zaradi slabe topnosti TCT-ja v vodi. V vodnem filmu lahko poteče tudi hidrolizaTCT-ja. kar še dodatno zniža njegovo reaktivnost za reakcijo s hidroksilnimi skupinami na membrani. Uporaba tlaka in močnega mešanja v postopku 2 je povzročila tanjšanje vodnega filma ob površini membrane, zato smo pri tem postopku zasledili aktivnost tripsina, ki pa je bila zelo nizka. Spiranje že aktivirane membrane z alkoholi (postopek 3) je povzročilo alkoholizo TCT-ja in zato reakcija vezave encima ni mogla poteči.
5.	Zaključki
Na površino membrane iz CA smo kovalentno imobilizirali tripsin. TCT je kot aktivirajoči reagent zelo reaktiven z. nu-kleofili, zato je imobilizacijo potrebno izvesti takoj po vezavi TCT-ja na membrano. Kondicioniranje membrane z alkoholi pri prehodu nazaj na vodni medij povzroči alkoholizo vezanega TCT-ja. Učinkovito je že spiranje z ledeno mrzlo vodo.
6.	Literatura
O. Zaborsky: Immobilized Enzymes. CTR Press. Inc.. Boca Raton. Fla., 1973
2 A. NViseman: Handbook of Enzyme Biotechnologv, Halsted Press.
John Wile_v and Sons, Chichester, England, 1985 ' W. F. Beech: Fibre-Reactive Dyes. Logos Press Ltd., London, 1970 1 G. Kav. L. M. Crook: Coupling of enzymes to cellulose using chloro-s-triazines. Nalure, 216, 1967. 524
H. U. Bergmever. K. Gauehn: Methoden der enzymatischen Analyse. Verlag Chemie VVeinhein, 1975. 1056 " D- Podvršnik: Fazno inverzne membrane iz celuloznega acetata. Magistrsko delo, Ljubljana. 1991