Dedne bulozne epidermolize 107 Strokovni članek 1 Inštitut za biofiziko, Medicinska fakulteta, Univerza v ljubljani, ljubljana, Slovenija 2 Dermatovenerološka klinika, Univerzitetni klinični center ljubljana, ljubljana, Slovenija 3 Medicinski center za molekularno biologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v ljubljani, ljubljana, Slovenija Korespondenca/ Correspondence: Mirjana liovic, e: mirjana. liovic@mf.uni-lj.si Ključne besede: bulozna epidermoliza; mutacija; zdravljenje Key words: epidermolysis bullosa; mutation; therapy Prispelo: 12. 3. 2019 Sprejeto: 5. 8. 2019 @publisher.id: 2937 @primary-language: sl, en @discipline-en: Microbiology and immunology, Stomatology, Neurobiology, Oncology, Human reproduction, Cardiovascular system, Metabolic and hormonal disorders, Public health (occupational medicine), Psychiatry @discipline-sl: Mikrobiologija in imunologija, Stomatologija, nevrobiologija, onkologija, r eprodukcija človeka, Srce in ožilje, Metabolne in hormonske motnje, Javno zdravstvo (varstvo pri delu), Psihiatrija @article-type-en: editorial, original scientific article, r eview article, Short scientific article, Professional article @article-type-sl: Uvodnik, izvirni znanstveni članek, Pregledni znanstveni članek, klinični primer, Strokovni članek @running-header: Dedne bulozne epidermolize @reference-sl: Zdrav vestn | januar – februar 2020 | l etnik 89 @reference-en: Zdrav vestn | January – February 2020 | volume 89 Dedne bulozne epidermolize, oskrba ran in nove možnosti zdravljenja Epidermolysis bullosa, wound management and new therapeutic approaches Špela Zemljič-Jokhadar, 1 Vlasta Dragoš, 2 Mirjana Liovic 3 Izvleček Bulozna epidermoliza (EB) je dedna bolezen krhkosti kože, povezana z mutacijami 18 različnih genov, ki se izražajo v koži. Zaradi raznovrstnosti simptomov se razvršča v 4 osnovne tipe s 30 različnimi podtipi. Osnovni tipi EB so razdeljeni glede na plast kože, ki je z mutacijo prizadeta: EB simpleks, ki je vezana na epidermis, junkcijska EB, ki je vezana na bazalno membrano, ter distrofična EB, ki je vezana na dermis. Poznamo še Kindlerjev sindrom, ki je izredno redka oblika te bolezni. Pri vseh primerih je koža bolnikov zelo krhka, zato so osnovni simptomi mehurji in odprte rane, ki se težko celijo. Bolezen prizadene bolnike telesno in duševno, kronični vnetni procesi pa pogosto povzročijo nastanek agresivnih oblik ploščatoceličnega karcinoma kože. Gre za skupino redkih bolezni z incidenco okoli 1 : 40.000. V Sloveniji imamo 60 bolnikov z EB. V članku predstavljamo trenutno uveljavljen način oskrbe kroničnih ran bolnikov z EB in pregled najnovejših in najsodobnejših genetskih, regenerativnih in farmakoloških pristopov za razvoj na- čina zdravljenja te še vedno neozdravljive bolezni. Abstract Epidermolysis bullosa is a hereditary skin fragility disorder, which is linked to mutations in 18 genes that are expressed in the skin. Today we distinguish 4 main EB types, which include about 30 different disease subtypes with a variety of clinical simptoms. The main types are classified according to the skin layer that is affected: EB simplex linked to the epidermis; junctional EB linked to the basal membrane, and dystrophic EB linked to the dermis. Kindler syndrome is the fourth and very rare type of EB. In all cases, the patient’s skin is very fragile, so the basic clinical symptoms are skin blisters and wounds that heal with difficulty. EB affects patients both physi- cally and psychologically, and the chronic inflammation accompanying the disease often leads to aggressive forms of squamous cell carcinoma. This is a group of rare genetic diseases with an incidence of 1:40000. In Slovenia there are 60 patients with EB. Hereby we present the current standard of care of patients with this still incurable disorder, as well as the newest experimental methodologies aiming at the development of possible genetic, regenerative and pharmacologi- cal treatments of EB. Citirajte kot/Cite as: Špela Zemljič-Jokhadar, vlasta Dragoš, Mirjana liovic. [epidermolysis bullosa, wound management and new therapeutic approaches]. Zdrav vestn. 2020;89(1–2):107–17. DOI: 10.6016/Zdrav vestn.2937 108 Zdrav vestn | januar – februar 2020 | l etnik 89 Metabolne in horMonSke MotnJe 1 Uvod Bulozna epidermoliza (epidermolysis bullosa – EB) je dedna bolezen kože, za katero so značilni pojav mehurjev, erozij in ran, ki nastanejo po blažjem mehan- skem draženju kože (Slika 1). Bolniki z EB imajo pogosto številne pridružene zaplete, ki so odvisni od vrste bulozne epidermolize, kot so dehidracija, sekun- darne okužbe ran, pojav granulacijskega tkiva, atrofičnih brazgotin, povnetnih pigmnetacij, pojavijo se lahko poikilo- derma, hipertrofične brazgotine, milije, palmoplantarne keratodermije, aplazija kože. Pozne posledice osnovne bolezni so karcinomi na koži, tako bazalnoce- lični (BCC) kot ploščatocelični karci- nomi (SCC) (1). Na kožnih priveskih se lahko pojavijo distrofije ali popolna izguba nohtov, brazgotinska in univer- zalna alopecija ali hipotrihoze. Bolniki lahko imajo v področju ustne sluznice mikrostomijo, obliteracijo vestibuloma, hipoplazijo sklenine, številne primere zobne gnilobe, pomanjkljivo zobovje in peridontitise. Na očeh se lahko pojavijo erozije na roženici, vnetja vek, brazgotine na roženici, zlepljenost veznice na zrklu in vekah (simpblefaron), povešenje spo- dnje veke (ektropion), vnetje roženice in motnje vida s slepoto ter granulacije na veznici. V področju zunanjega ušesa se pojavlja zožitev zunanjega ušesnega ka- nala, prevodna naglušnost ter v področju nosu zožitev nosnic zaradi granulacij. Drugi možni zapleti na ostalih organ- skih sistemih pri nekaterih oblikah bulo- znih epidermoliz so v področju prebavil: zapora (atrezija) pilorusa želodca, steno- ze požiralnika, kronično zaprtje, gastro- ezofagealni refluks, analne fisure, entero- patije zaradi izgube beljakovin, kolitisi. V področju sečil in spolovil se lahko po- javijo zožitve sečnice, malfomacije sečil in rodil, vezikoureterne obstrukcije in stenoze, brazgotinenje v področju vul- ve, odpoved ledvic. V področju zgornjih Tabela 1: Glavni tipi in podtipi dednih buloznih epidermoliz. DDBE – Dominantna distrofična bulozna epidermoliza; DBE – distrofična bulozna epidermoliza, BE bulozna epidermoliza; SBE – simpleksna bulozna epidermoliza, JBE – junkcijska bulozna epidermoliza; RDBE – recesivna distrofična bulozna epidermoliza. Prevedeno po (14). Raven razcepa Glavni tipi BE Glavni podtipi BE Tarčne beljakovina/e Intraepidermal SBE Suprabazalna SBE transglutaminaza 5; plakofilin 1; desmoplakin; plakoglobin Bazalna SBE keratin 5 in 14; plektin; eksofilin 5 (Slac2-b); antigen buloznega pemfigoida 1 (angl. bullous pemphigoid antigen 1) Intralamina lucida JBE JBE, generalizirana laminin-332, kolagen XVII; α6β4 integrin; α3 integrin JBE, lokalizirana kolagen XVII; laminin-332; α6β4 integrin Sublamina densa DBE DDBE kolagen VII RDBE kolagen VII Mešana Kindlerjev sindrom — homolog 1 družine fermitin (kindlin-1) Dedne bulozne epidermolize 109 Strokovni članek dihal se pojavljajo traheolaringealne ste- noze. Na mišično-skeletnem sistemu se pojavlja osteopenija, osteoporoza, fle- ksijske kontrakture udov, kontrakture prstov in zlitje prstov (psevdosindaktili- ja), zraščanje prstov rok in nog v obliko rokavic, mišična atrofija. Bolnike lah- ko spremljajo anemije zaradi različnih vzrokov, največkrat zaradi pomanjkanja železa. Pojavlja se tudi dilatacijska kardi- omiopatija. V področju endokrinih mo- tenj se lahko pojavi zakasnitev v razvoju pubertete in amenoreja. Drugi sistemski zapleti so še pojavljanje sepse, zaostanek v rasti in razvoju ter zaradi številnih mo- žnih doslej opisanih pridruženih stanj še invalidnost (2). Vzrok za nastanek bolezni krhkosti kože in epitelnih tkiv je v mutaciji ene- ga od 18 različnih genov, ki kodirajo 18 strukturnih in adhezivnih proteinov ce- lic in zunajceličnega matriksa. Izražajo se v delu kože, debeline le nekaj sto mi- krometrov (Slika 2). Prizadeti sloj zajema bazalni del epi- dermisa, bazalno membrano in delno dermis. Mutacije v tarčnih genih najpo- gosteje povzročijo zamenjavo le ene ami- nokisline (angl. missense) ali predčasno zaključevanje prepisovanja gena (angl. premature termination), kar povzroči nepravilno zvijanje proteina in zaradi tega njegovo nepravilno delovanje, ali pa pomanjkanje proteina (3). Mutacije v teh proteinih tako pripeljejo do nep- ravilnosti, ki posegajo v funkcionalno in strukturno celovitost epidermisa, bazal- ne membrane ali dermisa. Fenotipi EB se izražajo v širokem spektru simptomov (4). Razlikujemo 4 osnovne tipe EB: EB simpleks (EBS), junkcijska EB (EBJ), distrofična EB (DEB) in Kindlerjev sindrom (Tabela 1 ). Razdelitev temelji na tem, v kateri plasti se pojavi razcep kožnega tkiva. V sklopu osnovnih tipov poznamo vsaj 30 klinično različnih podtipov EB, ki se med seboj razlikujejo glede na ob- seg in resnost sprememb kože in mu- koznih membran, umestitev ter pri- zadetost notranjih organov in tkiv (2). Dedovanje bolezni je lahko dominan- tno ali recesivno. Za EBS je značilno dominantno dedovanje, čeprav pa poz- namo na svetu 18 družin, ki ima rece - sivno obliko bolezni (5-13). V ečinoma je vezana na mutacije v genih za keratina 5 ali 14. EBJ na drugi strani je izključno recesivne narave in je vezana na muta- cije v genih za α6β4 integrin, kolagen 17 ali laminin 5. Za razliko od teh se DEB deduje tako po dominantni kot recesiv- ni poti in je vezana na mutacije v genu, ki kodira kolagen 7. Kindlerjev sindrom je izredno redka oblika bolezni, ki je vezana na mutacije v genu KIND1 (oz. FERMT1), ki kodira protein kindlin. Kindlin igra posebno vlogo pri pove- Slika 1: Nekateri klinični simptomi EB. a) aplasia cutis congenita; b) mehurji, izpoljnjeni s krvavkasto vsebino; c) erozije. 110 Zdrav vestn | januar – februar 2020 | l etnik 89 Metabolne in horMonSke MotnJe zovanju aktinskih filamnetov z zunaj- celičnim matriksom. Bolezen se deduje recesivno. Ocenjena razširjenost EB v ZDA (Nacionalni register EB – NEBR, ki je zbiral podatke 16 let) je približno 11 pri- merov na milijon in pogostost približno 20 primerov na milijon živorojenih (15). V Sloveniji je razširjenost približno 30 primerov na milijon. Ocenjujejo, da je trenutno na svetu okoli 500.000 bolni- kov z EB. Leta 2014 so oblikovali nov klasifika - cijski sistem za diagnosticiranje EB, ki zajema tip EB, način dedovanja, fenotip- ske značilnosti (razsežnost ran in različ- ne zunajkožne simptome), odkritja pri mapiranju imunofluorescentno označe- nih antigenov in mutacije, ki so prisotne pri posameznem bolniku (14). 2 Diagnosticiranje EB Prvi korak pri postavitvi diagnoze tipa EB pri bolniku je določanje ravni mesta nastanka mehurjev v koži, običaj- no z imunofluorescentnim mapiranjem antigenov in/ali s transmisijsko elek- tronsko mikroskopijo (1). Uporaba mo- noklonskih protiteles, usmerjenih proti komponentam kožne bazalne membra- ne in epidermalnim antigenom, lahko dodatno olajšajo razvrščanje (subklasifi- kacijo) (14). Na osnovi ravni razcepa kože razvr- stimo bolnike v eno od štirih EB skupin. Pri nadaljnjem diagnosticiranju je pot- rebno opraviti gensko analizo mutaci- je, ker le-ta omogoča najbolj natančno razvrščanje bolezni in nadaljnje genet- sko svetovanje (14). V primeru, da gen - Histološki prerez kože Epidermis Epidermis Hemidesmosom Bazalna membrana Bazalna membrana Dermis Dermis Kolagen 7 Kolagen 17 Laminin 332 Integrin Plektin Celična membrana Keratinocit bazalnega sloja epidermisa Slika 2: Shematski prikaz predela kože (okvirček) z izraženo EB. Gre za tanko plast, ki zajema spodnji del epidermisa, bazalno membrano in površinski del dermisa, v kateri se izraža 18 proteinov – možnih povzročiteljev dedne EB. Nekateri od najbolj pogostih so označeni na shemi. Dedne bulozne epidermolize 111 Strokovni članek ske analize niso na voljo, razvrstijo EB na podlagi fenotipskih lastnosti, kot so razporeditev (lokalizirana ali splošna), resnost in prisotnost zunajkožnih zaple- tov. Iz družinske zgodovine bolnika lah- ko sklepamo na način dedovanja (1). 3 Oskrba ran Pope in sodelavci (16) so razvili po- stopek za oskrbo ran pri EB, ki obsega štiri korake: 1. Tip EB, spremljajoče bolezni, starost, prehranski status, pridružene sistem- ske prizadetosti drugih organskih sis- temov. 2. Skrb se osredinja na bolnika, ki mu lajšamo bolečino, srbež, dnevne ži- vljenjske aktivnosti in svetovanje v zvezi z zdravljenjem. 3. Lokalna oskrba rane: ugotovitev mes- ta in značilnosti ran, redno nežno či- ščenje, odstranjevanje nekrotičnega tkiva, da se rana hitreje zaceli, obrav- nava kolonizacije/vnetja/okužbe, iz- bira ustrezne lokalne terapije in po- vojev, ocenjevanje celjenja. 4. Pri ranah, ki se slabo ali ne celijo, op- ravimo biopsijo in histološko prever- janje ob sumu na kožni karcinom. Pomembna je podpora različnih izva- jalcev v zdravstvu, kot so specializirane medicinske sestre ali sodelovanje s klini- ki različnih strok pri obravnavi bolnikov. Lokalna obravnava ran je odvisna od tipa rane, s katero se ukvarjamo. Na trgu so številne obloge za rane, ki jih delimo v tri skupine: neokluzivne, delno oklu- zivne, okluzivne in aktivne ali biološke obloge (16 ,17). Izbira ustrezne oblo- ge je odvisna od stopnje celjenja rane. Nekrotično rano je potrebno oskrbeti s povojem s hidrogelom v kombinaciji s poliuretanskim filmom ali alginatom. V fazi vnetja rane bo alginatni povoj omo- gočil ustrezne pogoje za celjenje ran. V proliferativni fazi in fazi dozorevanja rane je potrebna obloga, ki uravnava vla- go, s tem da vpija odvečen izcedek (po- liuretanske in silikonske pene in drugo). Pri okuženi rani je potrebno uporabiti topikalna antimikrobna sredstva in an- timikrobne povoje (s srebrom, medom, ogljem, poliaminopropil biguanidom, dialkilkarbamoil kloridom) (16,17). Za varovanje pred nastankom novih me- hurjev se pogosto uporabljajo obloge s silikonom (16). 4 Oskrba bolnikov v Sloveniji Redkost EB in različna vpletenost številnih drugih organov in sistemov (ne samo kože) so poseben izziv za ustrezno obravnavo teh bolnikov (2). V Sloveniji se je v zadnjih desetletjih razvila inter- disciplinarna obravnava bolnikov, v ka- teri so v skupini poleg dermatologov vključeni še drugi specialisti medicin- skih področij. V obravnavo so vključeni neonatologi, pediatri in internisti, pato- log, medicinski genetik, otorinolaringo- log, oftalmolog, kirurg plastik, ortoped, pediater gastroenterolog, hematolog, stomatolog, anesteziolog, endokrinolog, nevrolog, radiolog, kardiolog, nefrolog, specialist fizikalne medicine. V obrav- navo tudi zgodaj vključimo patronažno službo in dietetika. Glavna skrb skupine je redno spremljanje kože in ran, zgo- dnje diagnosticiranje karcinomov kože, redno spremljanje zapletov na drugih organskih sistemih, odprava srbenja in preprečevanje bolečin. 5 Razvoj novih terapevtskih pristopov Osnovni vzrok za nastanek EB so ge- netske spremembe ključnih strukturnih genov, ki kodirajo različne strukturne proteine, ki med seboj povezujejo tri pla- 112 Zdrav vestn | januar – februar 2020 | l etnik 89 Metabolne in horMonSke MotnJe sti kože. Za popolno ozdravitev bi bilo potrebno popraviti mutacijo. Koža je po velikosti naš največji organ. Terapevtski pristop, ki bi pozdravil to bolezen, bi moral popraviti prav vse celice, ki tvorijo okvarjene proteine. Za razliko od drugih organov, kot so pljuča, srce, jetra, itd., je koža lahko dostopna. Zato bi za zdravlje- nje dednih bolezni kože lahko potenci- alno uporabili pristop, ki bi omilil bo- lezenske znake. V zadnjih desetih letih smo doživeli velik preboj na tem podro- čju, čeprav še nobeden od številnih obe- tavnih in že preizkušenih pristopov ni odkril možnosti za rutinsko zdravljenje EB. Poleg dolgotrajnega postopka uva- janja novih zdravil in kliničnih študij je eden glavnih razlogov verjetno visoka cena, ki znaša za gensko zdravljenje: tudi do 6 milijonov evrov za enega bolnika. Doslej testirani novi terapevtski pris- topi se lahko razdelijo na: celično tera- pijo, gensko terapijo, proteinsko terapijo in sistemsko terapijo (Slika 3). V nada- ljevanju članka bomo predstavili le nekaj najzanimivejših pristopov. 5.1 Celične terapije Celične terapije vključujejo doseda- nje poskuse z alogenimi fibroblasti, me- zenhimskimi matičnimi celicami, matič- nimi celicami iz popkovine in presaditev kostnega mozga. Kern in sodelavci (18) so leta 2009 v več kot 50 miši z recesivno distrofično EB v ločenih poskusih pod- kožno vbrizgali zdrave mišje fibroblaste in fibroblaste človeka. Ugotovili so, da je poseg varen (pojavilo se je rahlo pre- hodno vnetje). Raven kolagena 7 (nanj je vezana distrofična oblika EB) se je na dermo-epidermalni povezavi zvišala za 3,5- do 4,7-krat. Zanimivo je, da so vbriz- gane celice zdrav kolagen 7 proizvajale en mesec, medtem ko je bil protein sta- bilen dlje časa. Koža mišk je zato zadr- Genska terapija Proteinska terapija Celična terapija Tarčne celice za in vitro izražanje zdravega gena Zdrava kopija gena Transfekcija Vektor Rekombinanten konstrukt Prečiščevanje proteina Gene editing tehnologija Retrovirus z zdravo kopijo gena Transfekcija pacientovih celic Dostava zdravega proteina pacientu Izrezovanje mutiranega gena in zamenjava z zdravo kopijo Dostava popravljenih pacientovih celic Dostava zdravih matičnih celic donorja pacientu Pacient Biopsija tkiva Gojenje donorjevih celic v kulturi Pacientove celice gojene v kulturi Zdrav donor Biopsija tkiva Izolacija in namnoževanje donorjevih matičnih celic Gojenje in namnoževanje popravljenih celic Bioreaktor, izražanje rekombinantnega proteina Slika 3: Osnovna načela nekaterih novih terapevtskih pristopov za EB. Dedne bulozne epidermolize 113 Strokovni članek žala izboljšan fenotip več kot 100 dni po posegu. Vbrizgane celice so ostale na mestu injiciranja, niso se delile, tvorile tumorjev ali fibroznega tkiva. Leta 2010 so objavili študijo (19), v kateri so dvema bolnikoma z RDEB okoli ran subkutano vbrizgali alogene mezenhimske matič- ne celice, izolirane iz kostnega mozga. Celice so čez nekaj časa sicer izginile, njihov učinek pa je bil viden že po ene- mu tednu (dermo-epidermalna pregra- da se je ponovno vzpostavila) in je trajal do 4 mesece. Leta 2013 je bila objavljena študija (20), v kateri so pristop, podoben prejšnjemu na miškah, testirali tudi na bolnikih z RDEB. Alogene fibroblaste so prav tako vbrizgali v kožo okoli ran. Celice so preživele nekaj tednov v tkivu, nato pa izginile, medtem ko je njihov po- zitiven učinek trajal do 28 dni po pose- gu. Leta 2015 so Petrof in sodelavci (21) objavili novo študijo na desetih bolnikih z RDEB. Z infuzijo so jim dostavili alo- gene mezenhimske matične celice iz ko- stnega mozga. Učinek je bil ob večkratni ponovitvi posega viden v dveh mesecih. Površina prizadete kože se je pospešeno zaraščala, vnetje kože pa se je bistveno zmanjšalo. Bolniki so povedali, da je bil pozitivni učinek prisoten 4–6 mesecev. El-Darouti in sodelavci (22) pa so leta 2016 objavili študijo, v kateri so opravili celično infuzijo nehematopoetskih celic kostnega mozga, za katere je dokazano, da se lahko diferencirajo v fibroblaste. Imeli so dve skupini bolnikov z RDEB: v prvi so prejeli infuzijo matičnih celic z dodatkom ciklosporina, v drugi sku- pini pa matične celice brez ciklospori- na. V obeh skupinah je bil učinek zelo podoben (med njima ni bilo statistično značilnih razlik): zdravstveno stanje bol- nikov se je očitno izboljšalo, rane so se pospešeno zaraščale in leto po opravlje- nem testiranju ni bilo večjih negativnih posledic. Pri posegih, ki zajemajo me- zenhimske matične celice, so ugotovili, da se le-te po presaditvi ne delijo ali dife- rencirajo v zdrave celice, temveč delujejo posredno z izločanjem številnih rastnih faktorjev in citokinov, ki delujejo na okolno tkivo in s tem sprožijo pospeše- no zaraščanje ran in zmanjšanje vnetja. Žal je bil njihov učinek, čeprav zelo do- ber, spet le prehoden in ne dolgotrajen. Radi bi omenili tudi izjemen poskus, pri katerem so presadili kostni mozeg izbra- ni skupini otrok z RDEB (23). Med sed - mimi bolniki je eden umrl že pred samo presaditvijo zaradi izredno agresivnega zdravljenja (imunomieloablativna tera- pija), ki je potrebno pred samo presa- ditvijo. Po presaditvi kostnega mozga je umrl še en bolnik zaradi posledic zavr- nitve presadka in okužbe. Pri ostalih 5 bolnikih pa so v roku pol leta po posegu ugotovili znatno izboljšanje stanja, ki je bilo posledica kopičenja zdravega kola- gena 7 v predelu bazalne membrane. Dve leti po posegu so še vedno ugotavljali prisotnost tujih celic v koži (kimerizem) ter izboljšano zdravstveno stanje. 5.2 Genske terapije Poskusi genskih terapij zajemajo: dostavo zdrave kopije gena z virusom v ex vivo pogojih, retrovirusne in len- tivirusne vektorje (24-28) ter nevirus - ne poskuse. Med slednje spadajo: RNA interferenca oz. utišanje okvarjenega gena (29), uporaba AON (angl. antisense oligoribonucleotides) za preskakovanje mutiranih eksonov gena pri prepisova- nju RNA v protein, aminoglikozide za preskok predčasnih stop kodonov (30) kot tudi uporaba različnih proteinov, ki režejo DNA na specifičnih zaporedjih (angl. gene editing), kot so ZFN-ji (angl. zinc finger nucleases), Taleni, Crispr/ Cas9 (31). Pri ex vivo genski terapiji bolniku odvzamejo celice z biopsijo kože in jih nato gojijo v in vitro pogojih. Popravilo 114 Zdrav vestn | januar – februar 2020 | l etnik 89 Metabolne in horMonSke MotnJe mutiranega gena v celicah se prav tako opravi in vitro v kulturi. Nato se popra- vljene celice vstavijo nazaj bolniku. Vsi ti pristopi so popisani v preglednih član- kih (32-34), medtem ko bomo več pove- dali o nedavno objavljenem prvem uspe- šnem postopku genske terapije, ki je zajel skoraj celotno površino kože bolnika (80 %) z EBJ, vezano na mutacije v genu za laminin 332 (LAMB3) (35). Avtorji so po biopsiji kože, osamitvi bolnikovih keratinocitov, gojenju celic ter in vitro popravilu okvarjenega gena z dostavo kopije zdravega gena z lentivirusnim vektorjem, naredili še klonsko selekcijo (angl. clonal tracing) avtolognih popra- vljenih celic. Dokazano je namreč, da se epidermis pri človeku obnavlja zahva- ljujoč skupini progenitorskih celic, ki se imenujejo holokloni. To so dolgotrajno živeče matične celice epidermisa kože, ki jih lahko in vivo in in vitro uspešno nam- nožimo. T e diferencirajo v druge skupine progenitorskih celic, ki se nato na koncu diferencirajo v keratinocite epidermi- sa. Po selekciji so jih zato uporabili kot osnovo za gojenje epidermalnih ”plaht” zdravih, avtolognih celic bolnika, ki so mu jih nato presadili na najbolj okvar- jene predele kože. Osemletnemu dečku so s tem postopkom zamenjali (presadi- li) 80 % kože, ki sedaj, razen na obmo- čjih, ki niso bila zajeta s transplantacijo, nima več težav. Dosežek je izjemen, saj je bil deček v zelo slabem zdravstvenem stanju, in zdaj že nekaj let po zadnjem posegu normalno živi. Kljub temu, da je študija izjemna in izredno uspešna, so možnosti uporabe podobnega pristopa za druge bolnike z EB zaenkrat majhne. Poleg zelo visokih stroškov tovrstne obravnave obstaja še vedno skrb glede možnih stranskih učinkov same virus- ne dostave zdravega gena, saj bi ta lahko povzročila maligne spremembe tudi po- zneje v življenju, kar odpira vrsto novih etičnih vprašanj glede uporabe takega zdravljenja EB. 5.3 Proteinske terapije Proteinska terapija zajema intrader- malno ali intravensko dostavo ex vivo in v in vitro pogojih rekombinantno pridobljenega zdravega proteina (36,37). Zdravi kolagen 7 so običajno poskusili dostaviti topično, kar je dalo dobre re- zultate (38). Vse tovrstne študije so do sedaj izvedli na ravni predkliničnih štu- dij in na mišjih modelih, vendar so kljub pozitivnim učinkom še vedno le eksperi- mentalnega značaja. 5.4 Sistemske terapije Sistemska terapija zajema uporabo že obstoječih zdravil za zdravljenje drugih zdravstvenih težav z namenom, da se nekateri njihovi učinki izkoristijo za iz- boljšanje zdravstvenega stanja pri bolni- kih z EB. Gre predvsem za zmanjševanje vnetnega odgovora, zmanjševanja braz- gotinjenja ran, hitrejšega zaraščanja ran itd. Do sedaj so testirali že učinek mino- ciklina (39,40) , ki ima protikolagenazno delovanje, a žal povzroči tudi težave s hi- perpigmentacijo kože. Ciklosporin (41) ima protivnetno delovanje, povzroči pa lahko tudi raka kože. Etanercept (42), ki inhibira TNFalpha (protivnetno de- lovanje), ter Losartan (43), ki inhibira TGFbeta (zmanjšuje brazgotinjenje), lahko delujeta na vse procese, vezane na te faktorje v telesu. Poskusili so tudi s stimulacijo kostnega mozga bolnikov s proteinom HMG (44), da bi povečali šte- vilo matičnih celic v koži in izboljšali za- raščanje ran, saj menijo, da se pri bolni- kih z EB zaradi konstantnega aktiviranja procesa zaraščanja ran število matičnih celic v koži v življenju zmanjšuje. Dedne bulozne epidermolize 115 Strokovni članek 6 Raziskave v Sloveniji Z raziskavami EB na genetski, pro- teinski in celični ravni se že skoraj 20 let ukvarjamo na Medicinskem cen- tru za molekularno biologijo (Inštitut za biokemijo, Medicinske fakultete, Univerze v Ljubljani). Sodelujemo z Dermatovenerološko kliniko UKC Ljubljana in številnimi mednarodni- mi raziskovalnimi in zdravstvenimi centri (Guy’s Hospital, King’s College London, Velika Britanija; Miller School of Medicine, University of Miami, ZDA; Institute of Medical Biology, AStar, Singapur; Department of Medical Sciences, Uppsala University, Švedska, itd). V zadnjih letih smo se v svojih razi- skavah usmerili v preučevanje mehaniz- ma razvoja bolezni in novih dostavnih sistemov, ki bi bili uporabni predvsem za dostavo terapevtskih molekul v kožo (45-48). Posebno pomemben do - sežek je preboj na področje regenerativ- ne medicine in priprava prve inducira- ne pluripotentne matične celične linije (iPSC) EBS s pomočjo reprogramiranja (dediferenciacije) keratinocitov bolni- ka z EBS (49). To celično linijo bomo v nadaljnjih raziskavah uporabili kot celič- ni model in osnovo za in vitro pripravo tkivnega ekvivalenta EBS kože. Te bomo nato uporabili za presejalne teste šte- vilnih učinkovin, ki bi lahko prispevale k pospešenemu zaraščanju ran, ali pa k odpravljanju nekaterih kliničnih simp- tomov EB (npr. vnetje). 7 Zaključek V zadnjem desetletju je prišlo do iz- jemnega preboja pri raziskovanju meha- nizmov EB, razumevanju same bolezni in razvoju številnih strategij za poskus- ne pristope zdravljenja, ki so imeli veči- noma pozitivne učinke. Prav tako se je zelo spremenila klinična obravnava teh bolnikov, kar kljub izredno težki bolezni prispeva k njihovi boljši kakovosti življe- nja. Poseben poudarek imajo tudi pod- porne skupine, med katerimi ima vodil- no vlogo krovna organizacija DEBRA International (dystrophic epidermolysis bullosa research association, http://www. debra-international.org/about-debra. html), v več kot 50 državah pa že obsta- jajo lokalne organizacije DEBRA, med njimi tudi v Sloveniji (Debra Slovenia, http://www.debra-slovenia.si/). 8 Zahvala Zahvaljujemo se Javni agenciji za raz- iskovalno dejavnost Republike Slovenije (program P1–0390), Ministrstvu za izo- braževanje, znanost in šport Republike Slovenije in razpisu EraCoSysMed (pro- jekt 4D-HEALING), Razvojnemu skladu Univerze v Ljubljani in ustanovi CELSA Alliance (projekt ”Molecular basis of ke- ratinopathies”) za izkazano podporo in financiranje naših raziskav. Literatura 1. Fine JD, Johnson lb, Weiner M, Suchindran C. Cause-specific risks of childhood death in inherited epider - molysis bullosa. J Pediatr. 2008;152(2):276-80. 2. el hachem M, Zambruno G, bourdon-lanoy e, Ciasulli a, buisson C, hadj-rabia S, et al. Multicentre con- sensus recommendations for skin care in inherited epidermolysis bullosa. orphanet J rare Dis. 2014;9(1):76. 3. has C, Fischer J. inherited epidermolysis bullosa: new diagnostics and new clinical phenotypes. exp Der- matol. 2018;28(1146):52. 4. Fine JD, Mellerio Je. extracutaneous manifestations and complications of inherited epidermolysis bullosa: part ii. other organs. J am acad Dermatol. 2009;61(3):387-402. 5. Corden lD, Mellerio Je, Gratian MJ, eady ra, harper Ji, lacour M, et al. homozygous nonsense mutation in helix 2 of k14 causes severe recessive epidermolysis bullosa simplex. hum Mutat. 1998;11(4):279-85. 116 Zdrav vestn | januar – februar 2020 | l etnik 89 Metabolne in horMonSke MotnJe 6. Ciubotaru D, bergman r, baty D, indelman M, Pfendner e, Petronius D, et al. epidermolysis bullosa simplex in israel: clinical and genetic features. arch Dermatol. 2003;139(4):498-505. 7. rugg el, Mcl ean Wh, lane eb, Pitera r, McMillan Jr, Dopping-hepenstal P J, et al. a functional “knockout” of human keratin 14. Genes Dev. 1994;8(21):2563-73. 8. Jonkman MF, heeres k, Pas hh, van l uyn MJ, elema JD, Corden lD, et al. effects of keratin 14 ablation on the clinical and cellular phenotype in a kindred with recessive epidermolysis bullosa simplex. J invest Der- matol. 1996;107(5):764-9. 9. batta k, rugg el, Wilson nJ, West n, Goodyear h, lane eb, et al. a keratin 14 ‘knockout’ mutation in recessi- ve epidermolysis bullosa simplex resulting in less severe disease. br J Dermatol. 2000;143(3):621-7. 10. lanschuetzer CM, klausegger a, Pohla-Gubo G, hametner r, richard G, Uitto J, et al. a novel homozygous nonsense deletion/insertion mutation in the keratin 14 gene (Y248X; 744delC/insa G) causes recessive epi- dermolysis bullosa simplex type köbner. Clin e xp Dermatol. 2003;28(1):77-9. 11. has C, Chang Yr, volz a, hoeping D, kohlhase J, bruckner-t uderman l. novel keratin 14 mutations in pati- ents with severe recessive epidermolysis bullosa simplex. J invest Dermatol. 2006;126(8):1912-4. 12. Yiasemides e, t risnowati n, Su J, Dang n, klingberg S, Marr P , et al. Clinical heterogeneity in recessive epi- dermolysis bullosa due to mutations in the keratin 14 gene, krt14. Clin e xp Dermatol. 2008;33(6):689-97. 13. García M, Santiago Jl, t errón a, hernández-Martín a, vicente a, Fortuny C, et al. t wo novel recessive mutati- ons in krt14 identified in a cohort of 21 Spanish families with epidermolysis bullosa simplex. br J Dermatol. 2011;165(3):683-92. 14. Fine JD, bruckner-t uderman l, eady ra, bauer ea, bauer JW, has C, et al. inherited epidermolysis bullosa: updated recommendations on diagnosis and classification. J am acad Dermatol. 2014;70(6):1103-26. 15. Fine JD. epidemiology of inherited epidermolysis bullosa based on incidence and Prevalence estimates From the national epidermolysis bullosa r egistry. JaMa Dermatol. 2016;152(11):1231-8. 16. Pope e, lara-Corrales i, Mellerio J, Martinez a, Schultz G, burrell r, et al. a consensus approach to wound care in epidermolysis bullosa. J am acad Dermatol. 2012;67(5):904-17. 17. Denyer J, Pillay e, Clapham J. international Consensus best Practice Guidelines for Skin and Wound Care in epidermolysis bullosa. l ondon: Wounds international; 2017. 18. kern JS, l oeckermann S, Fritsch a, hausser i, r oth W, Magin tM, et al. Mechanisms of fibroblast cell therapy for dystrophic epidermolysis bullosa: high stability of collagen vii favors long-term skin integrity. Mol ther. 2009;17(9):1605-15. 19. Conget P , r odriguez F, kramer S, allers C, Simon v, Palisson F, et al. r eplenishment of type vii collagen and re-epithelialization of chronically ulcerated skin after intradermal administration of allogeneic me- senchymal stromal cells in two patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cytotherapy. 2010;12(3):429-31. 20. Petrof G, Martinez-Queipo M, Mellerio Je, kemp P , McGrath Ja. Fibroblast cell therapy enhances initial hea- ling in recessive dystrophic epidermolysis bullosa wounds: results of a randomized, vehicle-controlled trial. br J Dermatol. 2013;169(5):1025-33. 21. Petrof G, l win SM, Martinez-Queipo M, abdul-Wahab a, t so S, Mellerio Je, et al. Potential of Systemic allo- geneic Mesenchymal Stromal Cell therapy for Children with r ecessive Dystrophic epidermolysis bullosa. J invest Dermatol. 2015;135(9):2319-21. 22. el-Darouti M, Fawzy M, amin i, abdel hay r, hegazy r, Gabr h, et al. t reatment of dystrophic epidermolysis bullosa with bone marrow non-hematopoeitic stem cells: a randomized controlled trial. Dermatol ther (heidelb). 2016;29(2):96-100. 23. Wagner Je, ishida-Yamamoto a, McGrath Ja, hordinsky M, keene Dr, Woodley D t , et al. bone marrow tran- splantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa. n engl J Med. 2010;363(7):629-39. 24. Chen M, kasahara n, keene Dr, Chan l, hoeffler Wk, Finlay D, et al. r estoration of type vii collagen expressi- on and function in dystrophic epidermolysis bullosa. nat Genet. 2002;32(4):670-5. 25. Woodley Dt , krueger GG, Jorgensen CM, Fairley Ja, atha t , huang Y, et al. normal and gene-corrected dystrophic epidermolysis bullosa fibroblasts alone can produce type VII collagen at the basement mem- brane zone. J invest Dermatol. 2003;121(5):1021-8. 26. titeux M, Pendaries v, Zanta-boussif Ma, Décha a, Pironon n, t onasso l, et al. Sin retroviral vectors expressing Col7a1 under human promoters for ex vivo gene therapy of recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Mol ther. 2010;18(8):1509-18. 27. Mavilio F, Pellegrini G, Ferrari S, Di nunzio F, Di iorio e, r ecchia a, et al. Correction of junctional epider- molysis bullosa by transplantation of genetically modified epidermal stem cells. nat Med. 2006;12(12):1397- 402. 28. Chen M, o’t oole ea, Muellenhoff M, Medina e, kasahara n, Woodley D t . Development and characterization of a recombinant truncated type vii collagen “minigene” . implication for gene therapy of dystrophic epider- molysis bullosa. J biol Chem. 2000;275(32):24429-35. 29. Morgan CP, allen DS, Millington-Ward S, o’Dwyer Ge, Palfi a, Jane Farrar G. a mutation-independent the- rapeutic strategy for dominant dystrophic epidermolysis bullosa. J invest Dermatol. 2013;133(12):2793-6. 30. Zingman lv , Park S, olson tM, alekseev ae, t erzic a. aminoglycoside-induced translational read-through in disease: overcoming nonsense mutations by pharmacogenetic therapy. Clin Pharmacol ther. 2007;81(1):99- 103. 31. Jinek M, Chylinski k, Fonfara i, hauer M, Doudna Ja, Charpentier e. a programmable dual-rna-guided Dna endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-21. Dedne bulozne epidermolize 117 Strokovni članek 32. Gorell e, nguyen n, lane a, Siprashvili Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring harb Perspect Med. 2014;4(4):a015149. 33. abdul-Wahab a, Qasim W, McGrath Ja. Gene therapies for inherited skin disorders. Semin Cutan Med Surg. 2014;33(2):83-90. 34. rashidghamat e, McGrath Ja. novel and emerging therapies in the treatment of recessive dystrophic epi- dermolysis bullosa. intractable rare Dis r es. 2017;6(1):6-20. 35. hirsch t , r othoeft t , t eig n, bauer JW, Pellegrini G, De r osa l, et al. r egeneration of the entire human epi- dermis using transgenic stem cells. nature. 2017;551(7680):327-32. 36. hovnanian a. Systemic protein therapy for recessive dystrophic epidermolysis bullosa: how far are we from clinical translation? J invest Dermatol. 2013;133(7):1719-21. 37. Woodley Dt , Wang X, amir M, hwang b, r emington J, hou Y, et al. intravenously injected recombinant hu- man type vii collagen homes to skin wounds and restores skin integrity of dystrophic epidermolysis bul- losa. J invest Dermatol. 2013;133(7):1910-3. 38. Wang X, Ghasri P , amir M, hwang b, hou Y, khalili M, et al. t opical application of recombinant type vii collagen incorporates into the dermal-epidermal junction and promotes wound closure. Mol ther. 2013;21(7):1335-44. 39. White Je. Minocycline for dystrophic epidermolysis bullosa. lancet. 1989;1(8644):966. 40. Golub lM, Wolff M, l ee hM, Mcnamara tF, ramamurthy nS, Zambon J, et al. Further evidence that tetra- cyclines inhibit collagenase activity in human crevicular fluid and from other mammalian sources. J Perio- dontal r es. 1985;20(1):12-23. 41. del-río e. Prevention of blisters in dystrophic recessive epidermolysis bullosa with cyclosporine. J am acad Dermatol. 1993;29(6):1038-9. 42. Gubinelli e, angelo C, Pacifico v. a case of dystrophic epidermolysis bullosa improved with etanercept for concomitant psoriatic arthritis. am J Clin Dermatol. 2010;11:53-4. 43. Fritsch a, l oeckermann S, kern JS, braun a, bösl Mr, bley ta, et al. a hypomorphic mouse model of dystrop- hic epidermolysis bullosa reveals mechanisms of disease and response to fibroblast therapy. J Clin invest. 2008;118(5):1669-79. 44. t amai k, Yamazaki t , Chino t , ishii M, otsuru S, kikuchi Y, et al. PDGFralpha-positive cells in bone marrow are mobilized by high mobility group box 1 (hMGb1) to regenerate injured epithelia. Proc natl acad Sci USa. 2011;108(16):6609-14. 45. liovic M, ozir M, Zavec ab, Peternel S, komel r, Zupancic t . inclusion bodies as potential vehicles for recombinant protein delivery into epithelial cells. Microb Cell Fact. 2012;11(1):67. 46. Zavec ab, ota a, Zupancic t , komel r, Ulrih nP, liovic M. archaeosomes can efficiently deliver different types of cargo into epithelial cells grown in vitro. J biotechnol. 2014;192 Pt a:130-5. 47. Zemljič Jokhadar Š, klančnik U, Grundner M, Švelc kebe t , vrhovec hartman S, liović M, et al. GPMv s in variable physiological conditions: could they be used for therapy delivery? bMC biophys. 2018;11(1):1. 48. Zupancic t , Sersa G, t örmä h, lane eb, herrmann h, komel r, et al. keratin gene mutations influence the ke - ratinocyte response to Dna damage and cytokine induced apoptosis. arch Dermatol r es. 2017;309(7):587- 93. 49. kolundzic n, khurana P , hobbs C, r ogar M, r opret S, t örmä h, et al. induced pluripotent stem cell (iPSC) line from an epidermolysis bullosa simplex patient heterozygous for keratin 5 e475G mutation and with the Dowling Meara phenotype. Stem Cell r es (amst). 2019;37:101424.