PREGLEDNI ČLANEK/REVIEW
Protitelesa proti protrombinu
Antiprothrombin antibodies
PoLona Žigon,1 ALeš Ambrožič,1 Borut Božič,1'2 Saša Čučnik1'2
1	Univerzitetni klinični center, Klinični oddelek za revmatologijo, Ljubljana, Slovenija
2	Univerza v Ljubljani, Fakulteta za Farmacijo, Ljubljana, Slovenija
Korespondenca/ Correspondence:
PoLona Žigon
m: poLona.zigon@guest.
arnes.si
Ključne besede:
antifosfoLipidna protitelesa; antifosfoLipidni sindrom; encimsko imunska metoda; kLinična uporabnost; od fosfatidiLserina odvisna protiteLesa proti protrombinu; protiteLesa proti protrombinu; tromboza
Key words:
antiphosphoLipid antibodies; antiphosphoLipid syndrome; anti-phosphatidyLserine prothrombin antibodies; antiprothrombin antibodies; cLinicaL utiLity; enzyme immunoassays; thrombosis
Izvleček
Pri bolnikih z antifosfolipidnim sindromom (APS) povzročajo patogena avtoprotitelesa, imenovana antifosfolipidna protitelesa, tromboze in zaplete v nosečnosti. Najpogostejši an-tigenski tarči antifosfolipidnih protiteles sta ßi-glikoprotein I (ßiGPI) in protrombin, vezana na fosfolipidno površino. V mednarodno sprejetih smernicah se za postavitev diagnoze APS narekuje prisotnost tromboze in/ali značilnih zapletov v nosečnosti ter hkratno trajno povišane vrednosti lupusnih antikoagulantov (LA), antikardiolipinskih protiteles (aCL) ali protiteles proti ßiGPI (anti-ßiGPI). Novejše težnje pri di-agnosticiranju APS predlagajo meritev več različnih skupin antifosfolipidnih protiteles, med njimi tudi protiteles proti protrombinu, katerih skupen izračun poda oceno tveganja za trombozo pri posamezniku z APS. Protitelesa proti pro-trombinu so pri bolnikih z APS pogosto prisotna in včasih tudi edina povišana. Metode za njihovo določitev se razlikujejo in so nestandardizirane. Veliko novejših študij je potrdilo, da ima metoda za določanje protiteles proti protrombinu s kompleksom protrombin/fosfatidilserin na trdnem nosilcu (aPS/PT ELISA) večjo diagnostično uporabnost v primerjavi z metodo, ki ima na trdnem nosilcu vezan samo protrombin. Naša raziskovalna skupina je razvila izvedbo aPS/PT ELISA z izboljšano analitsko občutljivostjo, ki omogoča določitev klinično pomembnih protiteles. Večji delež protiteles aPS/PT je imel aktivnost LA v primerjavi s protitelesi aCL in anti-ßiGPI. Izkazalo se je, da so aPS/PT pomembno povezana z
venskimi trombozami in predstavljajo med vsemi antifosfolipidnimi protitelesi najvišje tveganje za zaplete v nosečnosti.
Abstract
In patients with antiphospholipid syndrome (APS), the presence of a group of pathogenic au-toantibodies called antiphospholipid antibodies causes thrombosis and pregnancy complications. The most frequent antigenic target of antiphospholipid antibodies are phospholipid bound ßi-glycoprotein I (ßiGPI) and prothrombin. The international classification criteria for APS connect the occurrence of thrombosis and/or obstetric complications together with the persistence of lupus anticoagulant (LA), anti-cardiolipin antibodies (aCL) and antibodies against ßiGPI (anti-ßiGPI) with APS. Current trends for the diagnostic evaluation of APS patients propose the determination of multiple antiphospholipid antibodies, among them also anti-prothrombin antibodies, to obtain a common score for estimating the risk of thrombosis in APS patients. Antiprothrombin antibodies are common in APS patients and are sometimes the only an-tiphospholipid antibodies elevated. Methods for their determination differ and have not yet been standardized. Many novel studies confirmed that the method using phosphatidylserine/prothrom-bin (aPS/PT ELISA) as an antigen on solid phase had higher diagnostic accuracy compared to the method using prothrombin alone (aPT ELISA). Our research group developed an in-house aPS/ PT ELISA with increased analytical sensitivity,
Citirajte kot/Cite as:
Zdrav Vestn 2015; 84: 209-21
Prispelo: 6. mar. 2014, Sprejeto: 2. dec. 2014
which enables the determination of all clinically relevant antiprothrombin antibodies. aPS/PT exhibited the highest percentage of LA activity compared to aCL and anti-ßiGPI. aPS/PT antibodies measured by the in-house method were
associated with venous thrombosis and presented the strongest independent risk factor for the presence of obstetric complications among all tested antiphospholipid antibodies.
Uvod
Protitelesa proti protrombinu so avto-protitelesa, katerih prisotnost je značilna za nekatere imunske bolezni. Spadajo v hete-rogeno družino antifosfolipidnih protiteles, katerih poimenovanje združuje protitelesa proti fosfolipidom, kompleksom fosfolipi-dov s plazemskimi proteini in nekaterim plazemskim proteinom.i Kljub svojemu imenu večinoma niso usmerjena proti ani-onskim fosfolipidom, kot so sprva domnevali, ampak proti številnim proteinom, ki se vežejo na negativno nabite fosfolipide.^ Najpogostejši in najbolje proučevani anti-genski tarči antifosfolipidnih protiteles sta ßi-glikoprotein I (ßiGPI)^'^ in protrombin,^ ki sta oba vključena v proces hemostaze. Trajno povišana antifosfolipidna protitelesa najdemo v plazmi bolnikov z antifosfolipi-dnim sindromom (APS), pri katerem rušijo hemostatsko ravnotežje, lahko pa se pojavljajo tudi prehodno pri različnih infekcijskih boleznih (gobavost, leptospiroza, sifilis, tuberkoloza, hepatitis A in druge).
Antifosfolipidni sindrom
APS je z antifosfolipidnimi protitelesi posredovana trombofilija. Za to sistemsko avtoimunsko bolezen, prvič opisano leta 1983,6 so značilne tromboze različnih segmentov obtočil in/ali zapleti med nosečnostjo ter prisotnost antifosfolipidnih protiteles. APS je lahko pridružen drugi sistemsko vezivnotkivni bolezni, pri približno polovici bolnikov pa se pojavlja kot samostojna bolezen. Mednarodno sprejeta klasifikacijska merila natančno določajo pogoje za določitev diagnoze APS (Tabela 1) in zapovedujejo prisotnost vsaj enega kliničnega in vsaj enega laboratorijskega merila.^'® Poleg klasičnih se pri APS lahko pojavi vrsta kliničnih in laboratorijskih znakov , ki sicer niso vključeni v klasifikacijska diagnostična merila, so pa z APS, čeprav v manjši meri, povezani. Med slednjimi so tromobocitope-nija, livedo reticularis, prizadetost srčnih zaklopk in centralnega živčevja ter prisotnost
Tabela 1: kLasifikacij za diagnozo APS.'
7,8
Klinična merila	
Tromboze:	Ena aLi več dokumentiranih tromboz arterij, ven aLi malih žiL
(angiografija, Doppler UZ, CT, MRI, biopsija itd.).	
Zapleti v nosečnosti	Ena/več nepojasnjenih smrti morfološko normalnega ploda med 10. in 34. tednom nosečnosti.
Ena/več ekLampsij/prekLampsij pred 34. tednom nosečnosti.	
Trije nepojasnjeni spontani splavi pred 10. tednom nosečnosti.	
Laboratorijska merila	
Lupusni antikoaguLanti	Prisotni v plazmi dvakrat/večkrat v presledku vsaj 12 tednov.
AntikardioLipinska protitelesa	IgG in/aLi IgM prisotni v plazmi/serumu v srednjem aLi visokem titru (> 99. percentiL), dvakrat/večkrat v presledku vsaj 12 tednov.
ProtiteLesa proti beta 2 gLikoproteinu I	IgG in/aLi IgM prisotni v plazmi/serumu (> 99. percentiL), dvakrat/večkrat v presledku vsaj 12 tednov.
Diagnozo gotovega APS lahko postavimo, če izpolnjuje bolnik vsaj enega od kliničnih ter vsaj enega od laboratorijskih meril.	
Slika i: Pretvorba protrombina v trombin.
antifosfolipidnih protiteles, katerih tarča so protrombin, protein C, protein S, aneksin V, fosfatidilserin in fosfatidiletanolamin.^
Metode, ki se trenutno uporabljajo za določanje antifosfolipidnih protiteles, lahko delimo v dve skupini: encimsko imunske , s katerimi določamo protitelesa proti kardio-lipinu (aCL), anti-ß2GPI in protitelesa proti protrombinu, ter testi koagulacije, s katerimi določamo lupusne antikoagulante (LA). Po mednarodno sprejetih merilih za klasifikacijo APS sodijo med laboratorijska merila LA, aCL in anti-ß2GPI, ki so določena v intervalu najmanj 12 tednov.^'®
Nedavno sta dve raziskovalni skupini^'^® predstavili svojevrsten matematični izračun za oceno tveganja tromboze pri bolnikih z APS (angl. antiphospholipid score oziroma global antiphospholipid syndrome score, GAPSS). To je nov pristop v diagnosticiranju APS, pri katerem bi za oceno tveganja tromboze upoštevali rezultate različnih antifosfolipidnih protiteles (LA, aCL, anti-ß2GPI in protitelesa proti protrombinu-izotipov IgG in IgM). Skupen izračun bi zdravnikom lahko pomagal pri odločitvi za uvedbo, ukinitev ali spremembo ustreznega zdravljenja.
Protrombin
Protrombin je od vitamina K odvisna beljakovina z enojno verigo. Gen protrombina je lociran na kromosomu 11, blizu centromere, in je dolg 21 000 baznih parov." Njegova
sinteza poteka v jetrih, znotraj hepatocitov, kjer pride tudi do sekundarne modifikacije proteina. V krvni obtok se sprosti kot gliko-protein s 579 amino kislinami in molekulsko maso 72 kDa.12'13 Normalna plazemska koncentracija je 100 mg/L z razpolovnim časom 2-4 dni.i4 Sestavljen je iz treh predelov: domena ''kringel'', domena Gla (bogata s karboksi-glutaminsko kislino) in katali-tična domena serinske proteaze. Posttran-slacijska modifikacija protrombina poteka na predelu Gla in je od vitamina K odvisna karboksilacija ostankov glutaminske kisline v Y-karboksi glutamatamske ostanke. Ob prisotnosti kalcijevih ionov se protrombin veže na negativno nabite fosfolipide s predelom Gla. Ta vezava je potrebna za pretvorbo protrombina v biološko aktiven a-trombin, medtem ko je domena kringel odgovorna za vezavo trombina na fibrin.
Protrombin, ali tudi faktor II, igra osrednjo vlogo v verižni reakciji strjevanja krvi. V krvi kroži kot proencim, ki ga v kaskadni reakciji koagulacije protrombinazni kompleks proteolitično aktivira v aktivno serin-sko proteazo a-trombin (Slika 1). Pri tem se sprosti velik peptid, fragment 1 + 2. Trombin ali faktor IIa je serinska proteaza, ki odcepi fibrinopeptida A in B od fibrinogena, pri tem nastane netopni fibrin, ki je končni proizvod strjevanja krvi.^^ Trombin ima v hemostazi številne funkcije: pretvori fibrinogen v fibrin, zaščiti fibrinske strdke pred fibrinolizo, aktivira trombocite, aktivira faktorje V, VIII
in XI (pozitivna povratna zanka), se veže na trombomodulin in preko poti proteina C inaktivira kofaktorje V in VIII (negativna povratna zanka).
Protitelesa proti protrombinu Zgodovina
Leta 1983 je Bajaj s sodelavci prvič predstavil dokaze o obstoju protiteles proti pro-trombinu pri dveh bolnikih z LA in hipo-protrombinemijo.16 Ta protitelesa so vezala protrombin, ne da bi preprečila njegovo aktiviranje v trombin. Avtorji so predpostavljali, da je hipoprotrombinemija posledica vezave protiteles na protrombin in hitrega odstranjevanja imunskih kompleksov iz obtoka. Leto dni kasneje so s protitočno imu-noelektroforezo potrdili obstoj kompleksov protrombin-antiprotrombin v plazmi bolnikov z LA, vendar brez hude hipoprotrombi-nemije.17 Fleck s sodelavci je te ugotovitve potrdil, ko je pokazal, da imajo protitelesa, ki vežejo protrombin, aktivnost LA in so prisotna pri 72 % bolnikov z aktivnostjo LA.18 V študiji, v kateri so proučevali bolnike z aCL in LA, so izpostavili vlogo protiteles proti protrombinu za aktivnost LA.^ Izmed 16 vzorcev bolnikov z LA je bilo pri 11 vzorcih mogoče zaznati vezavo na fosfolipi-dno površino le ob prisotnosti protrombina in kalcija. Kasneje so Oosting in sodelavci pokazali, da protitelesa z aktivnostjo LA zavirajo delovanje protrombinaznega kompleksa na površini endotelijskih celic in da frakcija IgG z aktivnostjo LA veže kompleks fosfolipid-protrombin.19 Antigenski tarči za večino protiteles, ki izražajo aktivnost LA, sta protrombin in/ali ß2GPI na fosfolipidih. Izmed 10 bolnikov z LA so izolirane frakcije IgG vsebovale protitelesa proti protrombinu v vsaj 9 primerih.20
Metode določanja protiteles proti protrombinu
Protitelesa proti protrombinu so prvič izmerili v začetku 90. let z dvojno imuno-difuzijo in s protitočno imunoelektrofore-zo.16-18,21 Pri obeh metodah protitelesa proti protrombinu tvorijo imunske komplekse s protrombinom v gelu, kar se kaže kot pre-
cipitacijska liniija. Vendar pa metodi ne podata kvantitativne ocene protiteles. V večini primerov je titer in/ali afiniteta protiteles proti protrombinu celo prenizka, da bi nastale jasne precipitacijske linije. Kljub temu so ta in vitro odkritja pokazala, da takšni kompleksi verjetno obstajajo tudi v plazmi in vivo. Protitelesa so v preteklosti določali tudi z drugimi tehnikami, ki pa temeljijo na oslabitvi encimske aktivnosti protrombina po vezavi s protitelesi.i®'^^ Pri teh tehnikah je potrebno prej izolirati protitelesa proti protrombinu in očistiti faktorje strjevanja krvi, kar naredi te metode neprimerne za rutinsko delo.
V zadnjih nekaj letih je več raziskovalnih skupin razvilo različne encimsko-imunske metode na trdnem nosilcu (ELISA), ki so do danes daleč najbolj uporabljane tehnike določanja protiteles proti protrombinu. Omogočajo hitro določitev koncentracije in izotipa protiteles. Arvieux s sodelavci je prvi določil protitelesa proti protrombinu z ELISA, pri kateri je protrombin kot antigen nanesen na mikrotitrske plošče z visoko afi-niteto vezave.23 Na ta način so določali protitelesa, usmerjena proti samemu protrom-binu, ki jih danes poimenujemo s kratico aPT. Pri tem je zanimivo, da način predstavitve protrombina na trdnem nosilcu močno vpliva na njegovo prepoznavo s strani protiteles proti protrombinu.24 Protitelesa proti protrombinu se vežejo na protrombin, ki je ali imobiliziran na ustrezni anionski površini, kot so Y-obsevane ali visoko vezavne po-lovinilkloridne (PVC) mikrotitrske plošče, ali pa je izpostavljen imobiliziranim ani-onskim fosfolipidom. Nasprotno pa se pro-trombin na navadne polistirenske mikrotitr-ske plošče z nizko afiniteto vezave ne veže.^^ V tem pogledu je reaktivnost protiteles proti protrombinu v ELISA močno podobna reaktivnosti nizko avidnih anti-ß2GPI. Slednja prepoznajo ß2GPI le, kadar je le-ta vezan na anionsko površino, medtem ko je vezava na ß2GPI v tekoči fazi minimalna.^^-^^
Kasneje so Matsuuda in sodobniki pokazali, da se lahko protitelesa proti protrombi-nu ob prisotnosti ionov Ca^^ določijo tudi z ELISA, pri kateri je protrombin vezan na fosfatidilserin.28 Slednja so danes poimenovana od fosfatidilserina odvisna protitelesa
proti protrombinu (aPS/PT). ELISA z vezanim kompleksom protrombin-fosfatidilse-rin (aPS/PT ELISA) je omogočila učinkovitejšo določitev protiteles proti protrombinu v primerjavi z ELISA, s čimer so določali aPT (aPT ELISA).^® Ta pojav je mogoče razložiti na več načinov:
1.	Protrombin, vezan na fosfatidilserin, ni omejen v svojem lateralnem gibanju, za razliko od protrombina, vezanega na visoko vezavne mikrotitrske plošče. To omogoča kopičenje in pravilno usmeri -tev protrombina, s tem pa nastanejo boljši pogoji za vezavo protiteles.
2.	Na fosfatidilserin se lahko s pomočjo Ca2+ ujamejo tudi krožeči deli membran s pritrjenimi kompleksi protrombina in protiteles, ki so lahko prisotni v nekaterih primerih.
3.	Protitelesa morebiti reagirajo z neoepito-pi, ki se pojavijo na protrombinu šele, ko se ta veže na fosfatidilserin.
Nezanemarljivo pa je tudi dejstvo, da aPS/PT ELISA bolje posnema samo in vivo vezavo protrombina in protiteles. Prav tako pomembno je odkritje Atsumija s sodelavci, ki so pokazali, da so aPS/PT močneje kot aPT povezana z aktivnostjo LA.^® Ta skupina v svoji študiji ni našla korelacije med ravnmi aPS/PT in aPT pri bolnikih z APS. Zato meni, da se z aPS/PT ELISA določajo vsaj deloma epitopsko različna protitelesa v primerjavi z aPT ELISA. Kasneje smo v Laboratoriju za imunologijo revmatizma Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana (UKC Ljubljana) modificirali prvo opisano metodo aPS/PT ELISA in s tem povečali njeno analitsko občutljivost.^^ Nova izvedba hišne metode aPS/PT ELISA je omogočila zaznavo obeh domnevno različnih populacij protiteles in s tem določitev vseh klinično pomembnih protiteles proti protrombinu z eno metodo.
Hematološke lastnosti
Po eni izmed teorij naj bi protitelesa proti protrombinu povzročila podaljšano strjevanje krvi in vitro z zaviranjem aktivacije protrombina v trombin.^^ Vendar je to malo verjetno, kajti takšen mehanizem ne more
razložiti nevtralizacije aktivnosti LA ob dodatku višje koncentracije fosfolipidov. Leta 2001 je Simmelink s sodelavci pokazal, da je dodatek afinitetno očiščenih protiteles proti protrombinu plazmi zdravega človeka sprožil aktivnost LA, ki jo je bilo mogoče nevtralizirati z dodatkom prebitka fosfolipida.^^ Pokazali so tudi, da so kompleksi protrom-bin s protitelesi proti protrombinu zavirali tako protrombinazni kot tenazni kompleks. Torej protitelesa proti protrombinu morebiti povečajo afiniteto protrombina za negativno nabite fosfolipide in tako tekmujejo s faktorji strjevanja krvi za dostopno katalitično fos-folipidno površino.^^ Ta mehanizem pojasni tudi, zakaj dodatek fosfolipidov izniči aktivnost LA, ki jo povzročijo protitelesa proti protrombinu. Nekateri raziskovalci so poročali o obstoju dveh tipov krožečih protiteles proti protrombinu, ki jih lahko ločimo na osnovi njihovih učinkov v koagulacijskih sistemih. Prva so funkcionalna, ki povzročajo aktivnost LA, druga pa so nefunkcionalna, ki ne prispevajo k aktivnosti LA. Razlike v učinkih so verjetno posledica epi-topske specifičnosti različnih protiteles proti protrombinu. Protitelesa proti protrombinu lahko nastanejo tudi pri imunizaciji s plaz-minogenom in slednja najverjetneje pripadajo nefunkcionalni skupini.^® Po vezavi protrombina na fosfolipide se razkrijejo ne-oepitopi. Protitelesa proti tem epitopom naj bi bila funkcionalna v nasprotju s protitelesi, ki prepoznajo protrombin neodvisno od njegove vezave na fosfolipide.
Imunološke lastnosti in epitopsko mapiranje
Z različnimi metodami določamo domnevno različne populacije protiteles proti protrombinu, kar je verjetno posledica pre-poznave različnih epitopov na protrombinu. Kateri so specifični epitopi na protrombi-nu, ki jih protitelesa prepoznajo, še ni znano, vendar pa se ve, da protitelesa ne vežejo protrombina, če je la-ta v raztopini. Po eni izmed razlag protitelesa reagirajo z neoe-pitopi, ki se pojavijo šele, ko se protrombin pritrdi na anionske fosfolipide. Wu in Lentz sta pokazala, da se protrombin konformacij-sko spremeni po vezavi na fosfatidilserin.^^
Kasneje je Galli s sodelavci ugotovila, da je protrombin v ELISA prepoznan učinkoviteje, če je vezan na fosfatidilserin. Predlagala je, da je v teh pogojih antigen bolj nakopičen in pravilno usmerjen, kar omogoči optimalne pogoje za vezavo protiteles.^® Poročali so tudi o bivalentni vezavi protiteles proti pro-trombinu na kovalentno povezane dimere in multimere protrombina na površini mi-krotitrske plošče.^®'^® Navzkrižno povezani dimeri in multimeri olajšajo vezavo nizko afinitetnih protiteles. Ta odkritja nakazujejo, da so protitelesa proti protrombinu najverjetneje nizko afinitetne narave in ne protitelesa proti neoepitopom.24 Temu nasprotuje odkritje Bajaja in sodelavcev, ki so v serumih bolnikov z LA izmerili visoko afinitetna protitelesa proti protrombinu z afiniteto vezave Kd 10-10-10-9.21 Tudi kasnejša merjenja avi-dnosti protiteles proti protrombinu s kao-tropno ELISA so potrdila obstoj tako visoko kot nizko avidnih protiteles.^® V eni izmed študij so pokazali, da je interakcija med mo-novalentnimi fragmenti Fab, pripravljenimi iz IgG frakcije bolnika z LA, in protrombi-nom zanemarljiva.4i Iz kinetičnih merjenj asociacije in disociacije je bilo razvidno, da pride do bivalentne vezave med protrombi-nom in protitelesi na lipidni membrani. Na osnovi omenjenih odkritij lahko povzamemo, da se protrombin na fosfolipidni površini ob prisotnosti Ca^^ kovalento poveže (dimerizira), ob tem se pojavijo neoepitopi, šele nato pa je omogočena vezava protiteles proti protrombinu.
Študije protrombinskih fragmentov so pokazale, da se epitop za vezavo protiteles najverjetneje nahaja na konservativnih regijah, ki so homologne z drugimi od vitamina K odvisnimi proteini, protitelesa pa so najverjetneje poliklonske narave.^^ Frakcije IgG, izolirane iz bolnikov z LA, so se vezale tako na cel protrombin kot tudi na pretrom-bin in na fragment i (Slika i).^^ Nobeno od izoliranih protiteles ni reagiralo z imobilizi-ranim trombinom. Dominantni epitopi so precej verjetno umeščeni blizu vezavnega mesta za fosfolipide, čeprav so lahko zelo heterogeno razporejeni. Drugi so proučevali epitope na protrombinu z uporabo rekom-binantnih protrombinskih fragmentov. Pokazali so, da je 61,5 %% protiteles prepoznalo
fragment 1 in 38,4 %% pretrombin (fragment 2 + a-trombin).44 Domene Kringel so ho-mologne z drugimi od vitamina K odvisnimi proteini. Možno je, da protitelesa proti protrombinu prepoznajo epitop na teh domenah, kar potrjuje navzkrižna reaktivnosti protiteles proti protrombinu s plazminoge-nom.45
Velik delež protiteles proti protrombi-nu je specifičen za humani protrombin^ in samo majhen delež le-teh reagira tudi z govejim protrombinom.46 Večinoma najdemo pri bolnikih z APS le protitelesa proti humanemu protrombinu. Pri nekaterih bolnikih so našli v plazmi samo protitelesa proti govejemu protrombinu, vendar je bila klinična slika teh bolnikov nejasna.^^
Klinični pomen
Več retrospektivnih in presečnih študij, ki jih je prvič povzela Galli s sodelavci,^^ pred kratkim pa še Sciasca s sodelavci,^® je proučevalo klinični pomen protiteles proti protrombinu, določenih z ELISA. Različni laboratoriji po svetu izvajajo svoje različice hišnih metod ELISA ali uporabljajo komercialno dostopne analizne komplete za določanje protiteles proti protrombinu. Vendar so mednarodne študije, s katerimi so poskušali standardizirati in poenotiti te metode, zelo redke in do danes niso dale pričakovanih rezultatov.49 Razlike v postopkih in uporabljenih reagentih ter dejstvo, da ni na voljo mednarodnih standardov, so glavni razlogi za velike razlike med objavljenimi študijami. Primerjalne študije dveh načinov določanja protiteles proti protrombinu, aPT ELISA ali aPS/PT ELISA, so pokazale, da se rezultati obeh izvedb le delno prekrivajo, kar pomeni, da so nekateri bolniki pozitivni v samo eni od obeh izvedb.^®-^^ Rezultati tako aPT ELISA kot tudi aPS/PT ELISA domnevno ne pripadajo isti populaciji protiteles, čeprav so oboji klinično povezani z APS. Mnogi so zato ocenili, da je z vidika kliničnega pomena nujno upoštevati rezultate obeh izvedb. V zadnjem sistematskem pregledu študij, ki so proučevale aPT (38 študij) ali aPS/PT (10 študij), so povzeti rezultati več kot 7000 bolnikov in kontrol.48 Oba tipa protiteles proti protrombinu predstavljata povečano tvega-
Slika 2: Patogeni mehanizmi delovanja protiteles proti protrombinu. aPS/ PT, od fosfatidilserina odvisna protitelesa proti protrombinu; fcyr, receptor za Fc predel protiteles Igg; ICAM, znotrajcelična adhezijska molekula; LPS, lipoplisaharid; MAPK, z mitogenom aktivirana proteinska kinaza; nfkP, transkripcijski jedrni faktor; PAI-1, inhibitor plazminogen aktivatorja; SAA, serumski amiloid A; TF, tkivni faktor; TnFa, tumor nekrotizirajoči faktor alpha; VCAM: adhezijska molekula vaskularne celice;
nje za tromboze. Vendar pregledni članek pokaže, da aPS/PT predstavljajo večjo nevarnost za arterijske in/ali venske tromboze v primerjavi z aPT (OR 5,1; 95 %% CI 4,2-6,3 in OR 1,8, 95 %% CI 1,4-2,8). Avtorji zaključujejo, da bi rutinsko merjenje aPS/PT, ne pa tudi aPT, omogočilo boljšo določitev trom-botičnega tveganja pri bolnikih s sistemskimi avtoimunskimi boleznimi, prav tako pa potrjujejo nesporno potrebo po nadaljnjem raziskovanju v smeri vključitve teh protiteles v laboratorijska merila APS.
Rezultati v Laboratoriju za Imunologijo revmatizma UKC Ljubljana razvite hišne metode aPS/PT ELISA so pokazali, da aPS/ PT predstavljajo povečano tveganje za venske tromboze (OR 3,5 95 »/o CI 1,7-7,0) in manj za arterijske tromboze (OR 1,9, 95 % CI o,9-4,1).53 Zelo pomembno je bilo odkritje, da so protitelesa proti protrombinu v primerjavi z drugimi raziskovanimi protitelesi predstavljala največje tveganje za zaplete v nosečnosti (OR 9,3 95 / CI 3,5-24,6). aPS/ PT so bila tudi edina antifosfolipidna protitelesa, katerih vrednosti so bile značilno povišane pri bolnicah z zapleti v zgodnji nosečnosti pred 12. tednom nosečnost.^^ Samo povezavo med protitelesi proti protrombinu in zapleti v nosečnosti je proučevalo precej manj študij v primerjavi s študijami o pri-
sotnosti teh protiteles pri trombozah. Približno polovica študij povezave protiteles proti protrombinu z nosečnostnimi zapleti ni uspela potrditi.^^'^^-^^ Nasprotno pa sta Akimoto in Bertolaccini s sodelavci pokazala močno in specifično povezavo med različnimi tipi protiteles proti protrombinu in spontanimi splavi.®"'®! Klinično povezavo med protitelesi in zapleti v nosečnosti sta kasneje potrdili še dve študiji,®^'®^ vendar pa, nobena od omenjenih študij ni našla povezave med zapleti v zgodnji nosečnosti pred 12. tednom nosečnosti in prisotnostjo protiteles proti protrombinu. Najnovejša odkritja Laboratorija za Imunologijo rev-matizma UKC Ljubljana so pokazala, da so aPS/PT povezana s ponavljajočimi se zgodnjimi ali poznimi splavi neodvisno od drugih antifosfolipidnih protiteles, zato avtorji povzemamo, da njihovo določanje izboljša diagnostično obravnavo bolnic z zapleti v nosečnosti, značilnimi za APS.^^'^^
Zaradi vedno več dokazov o klinični uporabnosti protiteles proti protrombinu in težnje po njihovi vključitvi med laboratorijska merila za klasifikacijo APS smo se raziskovalci združili tudi v multicentrično študijo, katere namen je določiti uporabnost aPS/PT v diagnostiki APS. Prvi izsledki so pokazali, da določanje aPS/PT lahko poma-
ga pri diagnosticiranju APS.®^ V Laboratoriju za imunologijo revmatizma smo se tako odločili, da med rutinske preiskave uvedemo preiskavo za aPS/PT s hišno izvedbo aPS/PT ELISA.
Patogena vloga
Vedno več je dokazov, da igrajo protitelesa proti protrombinu pomembno vlogo v trombotičnem stanju, značilnem za APS. Prisotnost protiteles proti protrombinu vodi v trombotično stanje preko prepletanja različnih mehanizmov delovanja in različnih patoloških učinkov na endotelijske celice, monocite, trombocite, aktivacije komple-menta ter neposrednega vpliva na hemosta-zo (Slika 2).34'42,65-69 Upoštevaje analogije med imunološkim vidikom in kliničnim učinkom aCL ali anti-ß2GPI ter protitelesi proti protrombinu je zelo verjetno, da se an-tifosfolipidna protitelesa podobno vpletajo v patofiziologijo APS. Nastanek antifosfo-lipidnih protiteles se povezuje z različnimi dejavniki, kot so gensko ozadje, napake imunskega sistema, hormonski ter okoljski vplivi (infekcije, cepiva, stres, zdravila, tumor). V zadnjem času se je izoblikovala t. i. ''hipoteza dveh sprožilcev'', ki poskusi razložiti, zakaj do tromboz pride le občasno kljub trajno povišanim ravnem antifosfolipidnih protiteles.68-70 Na osnovi te teorije obstoječa antifosfolipidna protitelesa predstavljajo prvi sprožilec, ki vzpostavi primarno trom-bofilno stanje. Do strdkov pa pride šele ob sekundarnem dražljaju, ki ga predstavlja prisotnost drugih molekul, npr. lipopolisahari-dov (LPS) ali proteinov akutne faze, kot sta SAA in TNFa, ki se pojavljajo ob okužbah.
Protrombin je vključen v kaskadno reakcijo strjevanja krvi in tako, prisoten v plazmi ter na celični površini endotelijskih celic, dostopen krožečim protitelesom. Možnih je več učinkov, ki jih povzročijo v plazmi krožeča protitelesa proti protrombinu.
1. Interakcija z endoteLnimi ceLIcami, monociti in trombociti
Protitelesa proti protrombinu, ki prepoznajo kompleks protrombina in anionskih fosfolipidov na membrani endotelnih celic ali monocitov, aktivirajo celice, ki nato spro-
stijo prokoagulantne snovi. Ko so endotelne celice izpostavljene protitelesom, aktivirajo signalno pot p38 z mitogenom aktivirane proteinske kinaze (p38 MAPK) in izločajo trombofilne molekule, predvsem tkivni faktor in adhezijske molekule.^^-^^ Po eni od teorij se protitelesa proti protrombinu lahko vežejo tudi na trombocite in povzročijo trombocitopenijo, čeprav so pri bolnikih z antifosfolipidnimi protitelesi odkrili tudi specifična protitelesa proti glikoproteinom trombocitov.75
2.	Neposreden vpLiv na hemostazo
Protitelesa proti protrombinu zavirajo s trombinom posredovano sproščanje prosta-ciklina iz endotelnih celic in s tem vplivajo na aktiviranje proteina C.i Protitelesa proti protrombinu tudi dokazano povečajo afini-teto protrombina za negativno nabite fosfo-lipide.44 Raziskave so pokazale, da tako mišja monoklonska protitelesa proti protrombinu kot tudi izolirane frakcije IgG z aktivnostjo LA povečajo vezavo protrombina na fosfoli-pidne vezikle.^® Tako kompleksi protrombina in protiteles proti protrombinu tekmujejo z drugimi faktorji strjevanja krvi za razpoložljivo fosfolipidno površino. Posledica tega je podaljšan čas strjevanja, ki ga lahko izničimo z dodatkom fosfolipidov. Ta pojav in vitro bi prenesen v okolje in vivo pomenil, da membrane z vezanimi kompleksi protrom-bina in protiteles zmanjšajo koncentracijo dostopnega protrombina in/ali fosfolipidnih površin za optimalno sestavljanje protrom-binaznega kompleksa.^^ Tej teoriji nasprotuje dejstvo, da je tvorba trombina pri bolnikih z LA ali z antifosfolipidnimi protitelesi po-večana.78'79 Monoklonska protitelesa proti protrombinu in frakcije IgG so vplivala na prečiščene komponente protrombinaznega kompleksa in povečala tvorba trombina.^®
3.	Aktiviranje komplementa
Sistem komplementa so v zadnjih raziskavah povezali z nastankom tromboz pri bolnikih z APS. Študije na miših so pokazale, da so živali brez komponent komplementa C3 in C5 po dajanju antifosfolipidnih protiteles razvile izrazito manjše strdke v primerjavi z zdravimi.80 Aktiviranje komplementa je sprožilo ekspresijo tkivnega faktorja na nevtrofilcih in zato spremenila čas strjeva-
nja krvi.8i Nedavno pa so tudi objavili, da so ravni komponent komplementa pri bolnikih s primarnim APS nižji v primerjavi z zdra-
vimi.82
4.	Vpletanje v mehanizme fibrinoLIze
Protitelesa proti protrombinu navzkrižno reagirajo s plazminogenom, vendar imata obe skupini protiteles različne funkcionalne lastnosti.36 Še vedno je vprašljivo, ali so protitelesa proti plazminogenu sploh povezana s trombozami. V eni od študij so bila protitelesa proti protrombinu in plazminogenu pogosta pri bolnikih s SLE, vendar pa ni bilo dokazane nobene korelacije med njimi.®^ Protitelesa proti protrombinu so bila značilno povezana s trombozami, protitelesa proti plazminogenu pa ne. Večina kliničnih študij je enotnih, da protitelesa proti protrombinu in proti plazminogenu niso povezana.®^'®^
5.	Drugi dejavniki
K razvoju tromboz pa verjetno prispevajo tudi drugi prirojeni ali pridobljeni dejavniki, kot so mutacija protrombinskega gena, prisotnost faktorja V Leiden, hiperhomo-cisteinemija, povečana raven protrombina, faktorja VIII in von Willenbrandtovega faktorja v plazmi ter zmanjšana aktivnost pro-teina C in proteina S.^^
Enako kot trombotični zapleti so tudi zapleti v nosečnosti pri APS posledica prepletanja po eni strani prej navedenih mehanizmov, po drugi pa neposrednega vpliva protiteles na posteljico. Histološka odkritja so pokazala, da protitelesa proti protrom-binu povzročijo tromboze malega žilja na posteljici.85 Trofoblast posteljice je glavni organ, pri katerem je fosfatidilserin v veliki meri izpostavljen na zunanji plasti celične membrane. Med embrionalno in placentno diferenciacijo pride do porušenja membranske lipidne asimetrije in izpostavitve fosfa-tidilserina na zunanji membrani.®® Protitelesa proti protrombinu bi lahko navzkrižno povezala protrombin na celični površini in tako sprožila aktiviranje komplementa in motila znotraj celično signalizacijo.®® Prav tako so opazili povečano število apoptoz celic velikank na ekto placentni coni z izpostavljenim fosfatidilserinom, kar lahko vodi v nepravilen razvoj placente in/ali zarodka.®^ Po drugi stani pa so pri miših opazili, da igra
protrombin pomembno vlogo v razvoju zarodka in da odsotnost protrombina vodi v embrionalno smrt.®® Zelo verjetno je tudi, da protitelesa proti protrombinu, kot druga aPL, porušijo zaščitni antikoagulantni aneksinski plašč na površini trofoblastov in en-dotelijskih celic.®®
Zdravljenje
V prvi vrsti je zdravljenje usmerjeno v preprečevanje tromboz z uporabo acetilsa-licilne kisline, varfarina ter heparina nizke molekularne mase kot najpogostejša učinkovita zamenjava varfarina. Za zdravljenje pri nosečnicah se uporabljajo nizki odmerki acetilsalicilne kisline (50-100 mg) v kombinaciji z nefrakcioniranim heparinom ali heparinom nizke molekulske mase. Če zdravljenje ni dovolj učinkovito, se uporabljajo tudi hidroksiklorokin, nizki odmerki prednizolona, zdravljenje z intravenskimi imunoglobulini, plazmafereza in imunoad-sorpcija.90-92 Nosečnice, ki so ustrezno zdravljene, imajo zelo dobre obete za uspešno nosečnost.93
Zaključki
Protitelesa proti protrombinu so pogosto prisotna pri bolnikih z APS. Številne študije so pokazale, da je določanje protiteles proti protrombinu, predvsem aPS/PT, klinično uporabno. Nekateri bolniki s kliničnimi znaki APS imajo med vsemi merjenimi antifos-folipidnimi protitelesi povišane samo vrednosti aPS/PT. Prav tako se številni strinjajo, da merjenje več različnih antifosfolipidnih protiteles natančneje ovrednoti tveganje za tromboze pri bolnikih z APS. Z novimi spoznanji bodo v prihodnje vedno bolj težili k vključitvi aPS/PT med laboratorijske kriterije APS, saj aPS/PT pomembno prispevajo predvsem k diferencialni diagnostiki oziroma k bolj natančni opredelitvi bolnic z zapleti v nosečnosti, zlasti v prvem trimesečju.
Literatura
1.	Roubey RA. Autoantibodies to phospholipid-bin-ding plasma proteins: a new view of lupus anticoagulants and other "antiphospholipid" autoantibodies. Blood. 1994; 84(9): 2854-67.
2.	Galli M, Comfurius P, Maassen C, Hemker HC, de Baets MH, van Breda-Vriesman PJ, et al. Anti-cardiolipin antibodies (ACA) directed not to car-diolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet. 1990; 335(8705): 1544-7.
3.	Matsuura E, Igarashi Y, Fujimoto M, Ichikawa K, Koike T. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. Lancet.
1990; 336(8708): 177-8.
4.	McNeil HP, Simpson RJ, Chesterman CN, Krilis SA. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid--binding inhibitor of coagulation: beta 2-glyco-protein I (apolipoprotein H). ProcNatlAcadSciU-SA. 1990; 87(11): 4120-4.
5.	Bevers EM, Galli M, Barbui T, Comfurius P, Zwa-al RF. Lupus anticoagulant IgG's (LA) are not directed to phospholipids only, but to a complex of lipid-bound human prothrombin. ThrombHae-most. 1991; 66(6): 629-32.
6.	Hughes GR.Thrombosis,abortion,cerebral disease, and the lupus anticoagulant. BrMedJ(ClinResEd). 1983; 287(6399): 1088-9.
7.	Miyakis S, Lockshin MD, Atsumi T, Branch DW, Brey RL, Cervera R, et al. International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS). JThrombHaemost. 2006; 4(2): 295-306.
8.	Wilson WA, Gharavi AE, Koike T, Lockshin MD, Branch DW, Piette JC, et al. International consensus statement on preliminary classification criteria for definite antiphospholipid syndrome: report of an international workshop. Arthritis Rheum. 1999; 42(7): 1309-11.
9.	Otomo K, Atsumi T, Amengual O, Fujieda Y, Kato M, Oku K, et al. Efficacy of the antiphospholipid score for the diagnosis of antiphospholipid syndrome and its predictive value for thrombotic events. Arthritis and rheumatism. 2012; 64(2): 504-12.
10.	Sciascia S, Sanna G, Murru V, Roccatello D, Kha-mashta MA, Bertolaccini ML. GAPSS: the Global Anti-Phospholipid Syndrome Score. Rheumatology (Oxford). 2013; 52(8): 1397-403.
11.	Degen SJ, Davie EW. Nucleotide sequence of the gene for human prothrombin. Biochemistry. 1987; 26(19): 6165-77.
12.	Kisiel W, Hanahan DJ. Purification and characterization of human Factor II. Biochimica et biophysi-ca acta. 1973; 304(1): 103-13.
13.	Magnusson S, Sottrup-Jensen L, Claeys H, Zajdel M, Petersen TE. Proceedings: Complete primary structure of prothrombin. Partial primary structures of plasminogen and hirudin. Thrombosis et diathesis haemorrhagica. 1975; 34(2): 562-3.
14.	Shapiro SS, Martinez J. Human prothrombin metabolism in normal man and in hypocoagulable subjects. The Journal of clinical investigation.
1969; 48(7): 1292-8.
15.	Mann KG, Nesheim ME, Church WR, Haley P, Krishnaswamy S. Surface-dependent reactions of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Blood. 1990; 76(1): 1-16.
16.	Bajaj SP, Rapaport SI, Barclay S, Herbst KD. Acquired hypoprothrombinemia due to non-neutralizing antibodies to prothrombin: mechanism and management. Blood. 1985; 65(6): 1538-43.
17.	Edson JR, Vogt JM, Hasegawa DK. Abnormal prothrombin crossed-immunoelectrophoresis in patients with lupus inhibitors. Blood. 1984; 64(4): 807-16.
18.	Fleck RA, Rapaport SI, Rao LV. Anti-prothrombin antibodies and the lupus anticoagulant. Blood. 1988; 72(2): 512-9.
19.	Oosting JD, Derksen RH, Bobbink IW, Hackeng TM, Bouma BN, De Groot PG. Antiphospholipid antibodies directed against a combination of pho-spholipids with prothrombin, protein C, or protein S: an explanation for their pathogenic mechanism? Blood. 1993; 81(10): 2618-25.
20.	Permpikul P, Rao LV, Rapaport SI. Functional and binding studies of the roles of prothrombin and beta 2-glycoprotein I in the expression of lupus anticoagulant activity. Blood. 1994; 83(10): 2878-92.
21.	Bajaj SP, Rapaport SI, Fierer DS, Herbst KD, Schwartz DB. A mechanism for the hypoprothrom-binemia of the acquired hypoprothrombinemia--lupus anticoagulant syndrome. Blood. 1983; 61(4): 684-92.
22.	Galli M, Bevers EM, Comfurius P, Barbui T, Zwa-al RF. Effect of antiphospholipid antibodies on procoagulant activity of activated platelets and platelet-derived microvesicles. BrJHaematol. 1993; 83(3): 466-72.
23.	Arvieux J, Darnige L, Caron C, Reber G, Bensa JC, Colomb MG. Development of an ELISA for autoantibodies to prothrombin showing their prevalence in patients with lupus anticoagulants. ThrombHaemost. 1995; 74(4): 1120-5.
24.	Galli M, Barbui T. Antiprothrombin antibodies: detection and clinical significance in the antipho-spholipid syndrome. Blood. 1999; 93(7): 2149-57.
25.	Matsuura E, Igarashi Y, Yasuda T, Triplett DA, Koike T. Anticardiolipin antibodies recognize beta 2-glycoprotein I structure altered by interacting with an oxygen modified solid phase surface. JE-xpMed. 1994; 179(2): 457-62.
26.	Pengo V, Biasiolo A, Fior MG. Autoimmune antiphospholipid antibodies are directed against a cryptic epitope expressed when beta 2-glycopro-tein I is bound to a suitable surface. ThrombHae-most. 1995; 73(1): 29-34.
27.	Cucnik S, Kveder T, Rozman B, Bozic B. Binding of high-avidity anti-beta2-glycoprotein I antibodies. Rheumatology (Oxford). 2004; 43(11): 1353-6.
28.	Matsuda J, Saitoh N, Gotoh M, Kawasugi K, Go-hchi K, Tsukamoto M. Phosphatidyl serine-de-pendent antiprothrombin antibody is exclusive to patients with lupus anticoagulant. BrJRheumatol.
1996; 35(6): 589-91.
29.	Galli M, Beretta G, Daldossi M, Bevers EM, Barbui T. Different anticoagulant and immunological properties of anti-prothrombin antibodies in pa-
tients with antiphospholipid antibodies. Thromb-Haemost. 1997; 77(3): 486-91.
30.	Atsumi T, leko M, Bertolaccini ML, Ichikawa K, Tsutsumi A, Matsuura E, et al. Association of autoantibodies against the phosphatidylserine--prothrombin complex with manifestations of the antiphospholipid syndrome and with the presence of lupus anticoagulant. Arthritis Rheum. 2000;
43(9): 1982-93.
31.	Zigon P, Ambrozic A, Cucnik S, Kveder T, Rozman B, Bozic B. Modified phosphatidylserine-depen-dent antiprothrombin ELISA enables identification of patients negative for other antiphospholipid antibodies and also detects low avidity antibodies. Clin Chem Lab Med. 2011; 49(9): 1573.
32.	Pierangeli SS, Goldsmith GH, Branch DW, Harris EN. Antiphospholipid antibody: functional specificity for inhibition of prothrombin activation by the prothrombinase complex. BrJHaematol. 1997;
97(4): 768-74.
33.	Simmelink MJ, Horbach DA, Derksen RH, Meijers JC, Bevers EM, Willems GM, et al. Complexes of anti-prothrombin antibodies and prothrombin cause lupus anticoagulant activity by competing with the binding of clotting factors for catalytic phospholipid surfaces. BrJHaematol. 2001; 113(3): 621-9.
34.	Amengual O, Atsumi T, Koike T. Specificities, properties, and clinical significance of antiprothrom-bin antibodies. Arthritis Rheum. 2003; 48(4): 886-95.
35.	Horbach DA, van OE, Derksen RH, De Groot PG. The contribution of anti-prothrombin-antibodies to lupus anticoagulant activity—discrimination between functional and non-functional anti--prothrombin-antibodies. ThrombHaemost. 1998;
79(4): 790-5.
36.	Puurunen M, Palosuo T, Lassila R, Anttila M, Va-arala O. Immunologic and hematologic properties of antibodies to prothrombin and plasminogen in a mouse model. Lupus. 2001; 10(2): 108-15.
37.	Wu JR, Lentz BR. Phospholipid-specific confor-mational changes in human prothrombin upon binding to procoagulant acidic lipid membranes. ThrombHaemost. 1994; 71(5): 596-604.
38.	Cakir B, Rivadeneira AC, Hayes PM, Ortel TL, Petri M, Roubey RA. Anti-prothrombin autoantibodies: detection and characterization. Lupus. 1998; 7(2):S219-S.
39.	Field SL, Chesterman CN, Dai YP, Hogg PJ. Lupus antibody bivalency is required to enhance prothrombin binding to phospholipid. J Immunol. 2001; 166(10): 6118-25.
40.	Zigon P, Cucnik S, Ambrozic A, Sodin Semrl S, Kveder T, Bozic B. Antibodies to phosphatidylse-rine/prothrombin complex as an additional diagnostic marker of APS? Lupus. 2012; 21(7): 790-2.
41.	Willems GM, Janssen MP, Comfurius P, Galli M, Zwaal RF, Bevers EM. Kinetics of prothrombin--mediated binding of lupus anticoagulant antibodies to phosphatidylserine-containing pho-spholipid membranes: an ellipsometric study. Biochemistry. 2002; 41(48): 14357-63.
42.	Galli M. Anti-Prothrombin Antibodies. In: Asher-son RA, Cervera R, Piette JC, Shoenfeld Y, editors. The Antiphospholipid Syndrome II: Elsevier; 2002. p. 59-70.
43.	Rao LV, Hoang AD, Rapaport SI. Mechanism and effects of the binding of lupus anticoagulant IgG and prothrombin to surface phospholipid. Blood. 1996; 88(11): 4173-82.
44.	Akimoto T, Akama T, Kono I, Sumida T. Relationship between clinical features and binding domains of anti-prothrombin autoantibodies in patients with systemic lupus erythematosus and antiphospholipid syndrome. Lupus. 1999; 8(9): 761-6.
45.	Pengo V, Biasiolo A, Brocco T, Tonetto S, Ruffat-ti A. Autoantibodies to phospholipid-binding plasma proteins in patients with thrombosis and phospholipid-reactive antibodies. Thrombosis and haemostasis. 1996; 75(5): 721-4.
46.	Rao LV, Hoang AD, Rapaport SI. Differences in the interactions of lupus anticoagulant IgG with human prothrombin and bovine prothrombin. ThrombHaemost. 1995; 73(4): 668-74.
47.	De Groot PG, Horbach DA, Simmelink MJ, van OE, Derksen RH. Anti-prothrombin antibodies and their relation with thrombosis and lupus anticoagulant. Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S32-S6.
48.	Sciascia S, Sanna G, Murru V, Roccatello D, Kha-mashta MA, Bertolaccini ML. Anti-prothrombin (aPT) and anti-phosphatidylserine/prothrombin (aPS/PT) antibodies and the risk of thrombosis in the antiphospholipid syndrome. A systematic review. Thrombosis and haemostasis. 2013; 111(2).
49.	Tincani A, Morozzi G, Afeltra A, Alessandri C, Allegri F, Bistoni O, et al. Antiprothrombin antibodies: a comparative analysis of homemade and commercial methods. A collaborative study by the Forum Interdisciplinare per la Ricerca nelle Ma-lattie Autoimmuni (FIRMA). ClinExpRheumatol. 2007; 25(2): 268-74.
50.	Bardin N, Alessi MC, Dignat-George F, Vague IJ, Sampol J, Harle JR, et al. Does the anti-prothrom-bin antibodies measurement provide additional information in patients with thrombosis? Immu-nobiology. 2007; 212(7): 557-65.
51.	Nojima J, Iwatani Y, Suehisa E, Kuratsune H, Ka-nakura Y. The presence of anti-phosphatidylseri-ne/prothrombin antibodies as risk factor for both arterial and venous thrombosis in patients with systemic lupus erythematosus. Haematologica. 2006; 91(5): 699-702.
52.	Tsutsumi A, Hayashi T, Chino Y, Mamura M, Goto D, Matsumoto I, et al. Significance of anti-prothrombin antibodies in patients with systemic lupus erythematosus: clinical evaluation of the antiprothrombin assay and the antiphosphatidyl-serine/prothrombin assay, and comparison with other antiphospholipid antibody assays. ModRhe-umatol. 2006; 16(3): 158-64.
53.	Zigon P, Cucnik S, Ambrozic A, Kveder T, Semrl SS, Rozman B, et al. Detection of Antiphospha-tidylserine/Prothrombin Antibodies and Their Potential Diagnostic Value. Clinical and Developmental Immunology. 2013; 2013: 8.
54.	Žigon P. Vezava antiprotrombinskih protiteles v in vitro in ex vivo modelih ter njihova klinična uporabnost pri bolnikih z avtoimunskimi boleznimi. = Antiprothrombin antibody binding using in vitro and ex vivo models indicates their clinical relevance for autoimmune patients. [doctoral dissertations]: Univerza v Ljubljani; 2014.
55.	Zigon P, Perdan Pirkmajer K, Tomsic M, Kveder T, Bozic B, Sodin Semrl S, et al. Anti-Phosphatidylse-rine/Prothrombin Antibodies Are Associated with Adverse Pregnancy Outcomes. Journal of Immunology Research. Article ID 975704, in press.
56.	Forastiero RR, Martinuzzo ME, Cerrato GS, Kordich LC, Carreras LO. Relationship of anti beta2--glycoprotein I and anti prothrombin antibodies to thrombosis and pregnancy loss in patients with antiphospholipid antibodies. ThrombHaemost. 1997; 78(3): 1008-14.
57.	Sater MS, Finan RR, Abu-Hijleh FM, Abu-Hijleh TM, Almawi WY. Anti-phosphatidylserine, anti--cardiolipin, anti-beta2 glycoprotein I and anti--prothrombin antibodies in recurrent miscarriage at 8-12 gestational weeks. European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology. 2012; 163(2): 170-4.
58.	Sugiura-Ogasawara M, Atsumi T, Ozaki Y, Koike T, Suzumori K. Phosphatidylserine-dependent an-tiprothrombin antibodies are not useful markers for high-risk women with recurrent miscarriages. FertilSteril. 2004; 82(5): 1440-2.
59.	Tsutsumi A, Atsumi T, Yamada H, Hirayama KE, Ichikawa K, Fujimoto S, et al. Anti-phosphatidyl-serine/prothrombin antibodies are not frequently found in patients with unexplained recurrent miscarriages. AmJ ReprodImmunol. 2001; 46(3):
242-4.
60.	Akimoto T, Akama T, Saitoh M, Kono I, Sumida T. Antiprothrombin autoantibodies in severe preeclampsia and abortion. The American journal of medicine. 2001; 110(3): 188-91.
61.	Bertolaccini ML, Atsumi T, Koike T, Hughes GR, Khamashta MA. Antiprothrombin antibodies detected in two different assay systems. Prevalence and clinical significance in systemic lupus erythe-matosus. ThrombHaemost. 2005; 93(2): 289-97.
62.	Marozio L, Curti A, Botta G, Canuto EM, Salton L, Tavella AM, et al. Anti-prothrombin antibodies are associated with adverse pregnancy outcome. Am J Reprod Immunol. 2011; 66(5): 404-9.
63.	Vlagea A, Gil A, Cuesta MV, Arribas F, Diez J, La-villa P, et al. Antiphosphatidylserine/prothrom-bin antibodies (aPS/PT) as potential markers of antiphospholipid syndrome. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 2013; 19(3): 289-96.
64.	Amengual O, Forastiero R, Sugiura-Ogasawara M, Oku K, Otomo K, Alves J, et al. International multi-centre study to evaluate the clinical significance of phosphatidylserine-dependent antiprothrom-bin antibodies for the diagnosis of antiphospholipid syndrome. EULAR: Ann Rheum Dis 2014.
65.	Abou-Nassar K, Carrier M, Ramsay T, Rodger MA. The association between antiphospholipid antibodies and placenta mediated complications: a systematic review and meta-analysis. Thrombosis research. 2011; 128(1): 77-85.
66.	Giannakopoulos B, Krilis SA. The pathogenesis of the antiphospholipid syndrome. The New England journal of medicine. 2013; 368(11): 1033-44.
67.	Mehdi AA, Uthman I, Khamashta M. Antipho-spholipid syndrome: pathogenesis and a window of treatment opportunities in the future. Europe-
an journal of clinical investigation. 2010; 40(5):
451-64.
68.	Meroni PL, Borghi MO, Raschi E, Tedesco F. Pathogenesis of antiphospholipid syndrome: understanding the antibodies. Nature reviews Rheumatology. 2011; 7(6): 330-9.
69.	Oku K, Amengual O, Atsumi T. Pathophysiology of thrombosis and pregnancy morbidity in the antiphospholipid syndrome. European journal of clinical investigation. 2012; 42(10): 1126-35.
70.	Fischetti F, Durigutto P, Pellis V, Debeus A, Macor P, Bulla R, et al. Thrombus formation induced by antibodies to beta2-glycoprotein I is complement dependent and requires a priming factor. Blood. 2005; 106(7): 2340-6.
71.	Arnout J. The pathogenesis of the antiphospholi-pid syndrome: a hypothesis based on parallelisms with heparin-induced thrombocytopenia. Throm-bHaemost. 1996; 75(4): 536-41.
72.	Bohgaki M, Atsumi T, Yamashita Y, Yasuda S, Sakai Y, Furusaki A, et al. The p3 8 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway mediates induction of the tissue factor gene in monocytes stimulated with human monoclonal anti-beta2Glycoprotein I antibodies. IntImmunol. 2004; 16(11): 1633-41.
73.	Lopez-Pedrera C, Buendia P, Cuadrado MJ, Si-endones E, Aguirre MA, Barbarroja N, et al. An-tiphospholipid antibodies from patients with the antiphospholipid syndrome induce monocyte tissue factor expression through the simultaneous activation of NF-kappaB/Rel proteins via the p38 mitogen-activated protein kinase pathway, and of the MEK-1/ERK pathway. Arthritis and rheumatism. 2006; 54(1): 301-11.
74.	Vega-Ostertag M, Casper K, Swerlick R, Ferrara D, Harris EN, Pierangeli SS. Involvement of p38 MAPK in the up-regulation of tissue factor on endothelial cells by antiphospholipid antibodies. Arthritis and rheumatism. 2005; 52(5): 1545-54.
75.	Galli M, Daldossi M, Barbui T. Anti-glycoprotein Ib/IX and IIb/IIIa antibodies in patients with antiphospholipid antibodies. ThrombHaemost. 1994;
71(5): 571-5.
76.	Field SL, Hogg PJ, Daly EB, Dai YP, Murray B, Owens D, et al. Lupus anticoagulants form immune complexes with prothrombin and phospholipid that can augment thrombin production in flow. Blood. 1999; 94(10): 3421-31.
77.	Roubey RA. Immunology of the antiphospholipid antibody syndrome. Arthritis Rheum. 1996; 39(9):
1444-54.
78.	Ferro D, Quintarelli C, Valesini G, Violi F. Lupus anticoagulant and increased thrombin generation in patients with systemic lupus erythematosus. Blood. 1994; 83(1): 304.
79.	Musial J, Swadzba J, Jankowski M, Grzywacz M, Bazan-Socha S, Szczeklik A. Thrombin generation measured ex vivo following microvascular injury is increased in SLE patients with antiphospholi-pid-protein antibodies. ThrombHaemost. 1997;
78(4): 1173-7.
80.	Pierangeli SS, Girardi G, Vega-Ostertag M, Liu X, Espinola RG, Salmon J. Requirement of activation of complement C3 and C5 for antiphospholipid antibody-mediated thrombophilia. Arthritis and rheumatism. 2005; 52(7): 2120-4.
81.	Romay-Penabad Z, Liu XX, Montiel-Manzano G, Papalardo De Martinez E, Pierangeli SS. C5a receptor-deficient mice are protected from throm-bophilia and endothelial cell activation induced by some antiphospholipid antibodies. Annals of the New York Academy of Sciences. 2007; 1108: 554-66.
82.	Oku K, Atsumi T, Bohgaki M, Amengual O, Kata-oka H, Horita T, et al. Complement activation in patients with primary antiphospholipid syndrome. Annals of the rheumatic diseases. 2009; 68(6): 1030-5.
83.	Simmelink MJ, De Groot PG, Derksen RH. A study on associations between antiprothrombin antibodies, antiplasminogen antibodies and thrombosis. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 2003; 1(4): 735-9.
84.	Bu C, Li Z, Zhang C, Gao L, Cai G. IgG antibodies to plasminogen and their relationship to IgG anti--beta(2)-glycoprotein 1 antibodies and thrombosis. Clinical rheumatology. 2008; 27(2): 171-8.
85.	Kujovich JL. Thrombophilia and thrombotic problems in renal transplant patients. Transplantation. 2004; 77(7): 959-64.
86.	Blank M, Shoenfeld Y. Antiphospholipid antibody-mediated reproductive failure in antiphospho-lipid syndrome. Clinical reviews in allergy & immunology. 2010; 38(2-3): 141-7.
87.	Matalon ST, Shoenfeld Y, Blank M, Yacobi S, von Landenberg P, Ornoy A. Antiphosphatidylserine
antibodies affect rat yolk sacs in culture: a mechanism for fetal loss in antiphospholipid syndrome. Am J Reprod Immunol. 2004; 51(2): 144-51.
88.	Sun WY, Witte DP, Degen JL, Colbert MC, Burkart MC, Holmback K, et al. Prothrombin deficiency results in embryonic and neonatal lethality in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1998;
95(13): 7597-602.
89.	Rand JH, Wu XX, Quinn AS, Taatjes DJ. The annexin A5-mediated pathogenic mechanism in the antiphospholipid syndrome: role in pregnancy losses and thrombosis. Lupus. 2010; 19(4): 460-9.
90.	Cervera R, Asherson RA. Diagnostic Criteria in Autoimmune Diseases. In: Shoenfeld Y, Cervera R, Gershwin ME, editors. Antiphospholipid syndrome. Totowa: Humana Press; 2008. p. 9-14.
91.	Alijotas-Reig J. Treatment of refractory obstetric antiphospholipid syndrome: the state of the art and new trends in the therapeutic management. Lupus. 2013; 22(1): 6-17.
92.	Yang P, Kruh JN, Foster CS. Antiphospholipid antibody syndrome. Current opinion in ophthalmology. 2012; 23(6): 528-32.
93.	Bramham K, Hunt BJ, Germain S, Calatayud I, Khamashta M, Bewley S, et al. Pregnancy outcome in different clinical phenotypes of antiphospholi-pid syndrome. Lupus. 2010; 19(1): 58-64.