Genetske in klinične značilnosti bolnikov s fenilketonurijo v Sloveniji
Genetic and clinical characteristics of patients with phenylketonuria in Slovenia
Urh Grošelj,1 Mojca Žerjav Tanšek,2 katarina Trebušak Podkrajšek,3 Tadej Battelino4'5
1	Klinični oddelek za endokrinologijo, diabetes in presnovne bolezni, Pediatrična klinika, UKC Ljubljana, Bohoričeva 20,1000 Ljubljana; urh. groselj@kclj.si
2	Klinični oddelek za endokrinologijo, diabetes in presnovne bolezni, Pediatrična klinika, UKC Ljubljana, Bohoričeva 20, 1000 Ljubljana
3	Služba za specialno laboratorijsko diagnostiko, Pediatrična klinika, UKC Ljubljana, Bohoričeva 20, 1000 Ljubljana
4	Klinični oddelek za endokrinologijo, diabetes in presnovne bolezni, Pediatrična klinika, UKC Ljubljana, Bohoričeva 20, 1000 Ljubljana
5	Katedra za pediatrijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2,1000 Ljubljana
Korespondenca/ Correspondence:
prof. dr. Tadej Battelino, dr. med.; klinični oddelek za endokrinologijo, diabetes in presnovne bolezni, Pediatrična klinika, UkC ljubljana, Bohoričeva 20, 1000 ljubLjana; ; tadej. battelino@mf.uni-lj.si; tel: 01 522 9235
Izvleček
Fenilketonurija (PKU) je avtosomnorecesivno dedna bolezen zaradi nezadostne aktivnosti encima fenilalaninska hidroksilaza (PAH), ki kata-lizira pretvorbo fenilalanina (Phe) v tirozin, pri čemer kot kofaktor uporablja tetrahidrobiopte-rin (BH4). Pojavnost PKU v populacijah kavka-ške rase je okrog 1/10.000. Gen PAH se nahaja na 12. kromosomu in ga sestavlja 13 eksonov. Opisanih je nad 600 mutacij gena PAH, ki povzročajo različne stopnje pomanjkanja katalitske aktivnosti PAH. Zaradi tega je povišana vrednost Phe v krvi (hiperfenilalaninemija - HFA) povezana, če se ne zdravi, s poškodbo osrednjega živčevja, ki se kaže z duševno zaostalostjo. Klasifikacija PKU temelji na presnovnem fenotipu bolnika (glede na stopnjo HFA); razlikujemo tri podvrste PKU (klasična, zmerna in blaga) ter blago HFA, ki je ločena klinična entiteta.
Pojavnost klasične PKU v Sloveniji smo ocenili na približno 1/10.000, pogostost prenašalcev klasične PKU v splošni populaciji pa na 1/50. Kumulativna pojavnost vseh oblik PKU (klasična, zmerna, blaga PKU) je približno 1/6.000; pojavnost blage HFA pa približno 1/3.500. V preglednem članku smo zajeli tudi prej objavljene rezultate raziskav značilnosti slovenskih bolnikov s PKU, ki so bile na Kliničnem oddelku za endokrinologijo, diabetes in presnovne bolezni Pediatrične klinike Ljubljana opravljene v letih 2008-2012. Naša populacija bolnikov s PKU je po genetskih značilnostih primerljiva z opisanimi okoliškimi populacijami, vključuje pa pet novih, doslej neopisanih mutacij gena PAH.
Presejanje vseh novorojencev na PKU se v Sloveniji izvaja od leta 1979. Vzročnega zdravljenja PKU ne poznamo, potrebna pa je čimprejšnja uvedba dietnega zdravljenja z omejitvijo vnosa Phe; zdravljenje s BH4 pri odzivnih bolnikih poveča toleranco za Phe.
Abstract
Phenylketonuria (PKU), an autosomal recessive disease, is the most common inborn error of amino acid metabolism in Caucasians, affecting 1/10,000 individuals. PKU is caused by the deficiency of hepatic phenylalanine hydroxylase (PAH), which catalyzes the hydroxylation of phenylalanine (Phe) to tyrosine, using tetrahy-drobiopterin (BH4) as a cofactor. The PAH gene is located on the chromosome 12 and consists of 13 exons. Over 600 different mutations of the PAH gene have been identified to date, which result in a broad spectrum of PAH deficiency. The resulting elevation of Phe in the blood (hyper-phenilalaninemia - HPA) could cause mental retardation if left untreated. The classification of PKU is based on the metabolic phenotype of a patient (according to HPA level); discerned could be three subclasses of PKU (classic, moderate, mild) and mild HPA, which is a separate clinical entity.
The incidence of classical PKU in the Slovene population was estimated to be 1/10,000, corresponding to a carrier frequency of about 1/50. The cumulative incidence of all subtypes of PKU (classic, moderate, mild) is around 1/6,000; the incidence of mild HPA is around 1/3,500. The article also reviews the previously published studies on the genetic and phenotypic characteristics of Slovenian PKU patients, performed at the Department of Pediatric Endocrinology, Diabetes and Metabolism, University Children's Hospital Ljubljana, in years 2008-2012. The genetic characteristics of the Slovenian PKU population were concordant with other neighbouring populations; five novel mutations of PAH gene were detected in the population.
The mandatory neonatal PKU screening in Slovenia was implemented in 1979. The dietary therapy based on a restricted Phe intake should be introduced as soon as possible after birth; in
Ključne besede:
feniLketonurija, genotip, fenotip, pojavnost PKU, Slovenija
Key words:
phenylketonuria, genotype, phenotype, the PKU incidence, SLovenia
Citirajte kot/Cite as:
Zdrav Vestn 2013; 82: page 767-77
Prispelo: 4. mar. 2013, Sprejeto: 29. maj 2013
responders, BH4 treatment increases the dietary Phe tolerance.
Seznam okrajšav
BH4 - tetrahidrobiopterin HFA - hiperfenilalaninemija IQ - inteligenčni kvocient PAH - fenilalaninska hidroksilaza PAHdb - okr. angl. The Human PAH Mutation Knowledgebase Phe - fenilalanin PKU - fenilketonurija Tyr - tirozin
ZDA - Združene države Amerike
1 Uvod
Fenilketonurija (PKU; MIM# 261600) je avtosomnorecesivno dedna bolezen, ki je posledica prirojene motnje v presnovi aminokisline fenilalanin (Phe). PKU povzroči mutacija gena za encim Phe hidroksilazo (PAH). To vodi v pomanjkanje aktivnosti encima PAH, ki katalizira pretvorbo Phe v tirozin (Tyr), pri čemer kot kofaktor uporablja tetrahidrobiopterin (BH4). Zato se povišajo vrednosti Phe v krvi. Hiperfenila-laninemija (HFA) je glavna presnovna pojavnost PKU.1-3 Vrednosti Phe v krvi, ki so vsaj 5-krat večje od zgornje meje normalnega območja, so povezane z napredujočo poškodbo osrednjega živčevja. Najpomembnejša dolgoročna klinična posledica nezdra-vljene PKU je huda duševna zaostalost.4 V državah s presejanjem novorojencev je zaradi zgodnjega zdravljenja PKU duševna zaostalost izjemno redka.2 Glede na stopnjo HFA ločimo tri podvrste PKU (klasična, zmerna in blaga) ter blago HFA, ki je sicer ločena klinična entiteta, jo pa vključujemo v PKU v širšem smislu/" Vzročnega zdravljenja PKU ne poznamo. Bolnikom se čim prej po rojstvu predpiše dietno zdravljenje z omejitvijo vnosa Phe.5
PKU ima posebno mesto med prirojenimi boleznimi presnove. Bila je prva, pri kateri je bil pojasnjen vzrok duševne zaostalosti (Folling, 1934),6 prva, pri kateri je bilo uvedeno učinkovito (dietno) zdravljenje (Bickel, 1953),7 in prva, pri kateri je bilo
uvedeno presejanje novorojencev. V letu 2013 beležimo 50-letnico prve uvedbe pre-sejanja v posameznih zveznih državah ZDA (Guthrie, 1963).8 Pri nas je večina otrok s PKU, rojenih do 70. let prejšnjega stoletja, še razvila hudo duševno zaostalost.9 Presejanje vseh novorojencev na PKU se na celotnem območju Slovenije izvaja od leta 1979.10 Do leta 1992 je presejanje potekalo s pomočjo Guthriejevega testa, nato pa s fluorometrič-no metodo.n'i2
Vse slovenske bolnike s PKU spremljamo na Pediatrični kliniki v Ljubljani. V nacionalnem registru PKU je trenutno zajetih okrog 120 družin s PKU, ob tem pa še prek 150 bolnikov z blago HFA; slednji večinoma ne potrebujejo dietnega zdravljenja in spremljanja. Pri slovenski populaciji bolnikov s PKU je bilo genetsko ozadje raziskano šele v zadnjih letih."-!6
2 Epidemiologija
Pojavnost PKU se zelo razlikuje med različnimi predeli sveta. V večini evropskih držav je pojavnost klasične PKU okrog 1/10.000 živorojenih otrok, kar ustreza pogostosti prenašalcev bolezni v splošni populaciji, ki je okrog 1/50.i7'" Višja pojavnost klasične PKU je na splošno značilna za bolj konsangvine populacije. Najvišja je v Turčiji in na Severnem Irskem, kjer znaša okrog 1/4.000.19,20 Najnižja pojavnost klasične PKU v Evropi pa je na Finskem, 1/100.000.21 V ZDA je pojavnost klasične PKU okrog 1/15.000.5 Za Azijo in Južno Ameriko je značilna nekoliko nižja pojavnost klasične PKU, okrog 1/15.000-200.000,22-25 v podsaharski Afriki pa naj bi bila PKU glede na ocene še precej redkejša.i'2'5
Pojavnost klasične PKU v Sloveniji je približno 1/10.000. Izračun temelji na podatku, da se je med letoma 2001 in 2010 v Sloveniji rodilo 193.188 otrok, med njimi jih je 19 razvilo klasično PKU. Kumulativna pojavnost vseh oblik PKU (klasična, zmerna,
Tabela 1: Primerjava pojavnosti prenašaLstva za klasično feniLketonurijo, bLage hiperfeniLaLaninemije, vseh vrst feniLketonurije skupaj in klasične feniLketonurije posebej, v SLoveniji v Letih 2001—2010. (Podatek o števiLu živorojenih otrok smo dobiLi na spLetni strani Statističnega urada RepubLike SLovenije, http://www.stat.si).
Vrsta	Pojavnost3
Prenašalec klasične PKU	1/50
Blaga HFA	1/3.500
Vse oblike PKU (blaga, zmerna, klasična)	1/6.000
Klasična PKU	1/10.000
PKU - fenilketonurija; HFA - hiperfenilalaninemija. aPojavnosti bLage HFA in PKU smo izračunali kot razmerje med skupnim številom novoodkritih bolnikov s posamezno vrsto bolezni in številom vseh živorojenih otrok v Sloveniji v obdobju od 1.1.2001 do 31.12.2010. Pojavnost prenašalcev smo izračunali s pomočjo Hardy-Weinbergovega načela, z izpeljavo enačbe p2 + 2 pq + 2 q2 = 1 (p - pojavnost homozigotov za nemutirane alele; q - pojavnost homozigotov za vse mutacije PKU kumulativno (ustreza pojavnosti klasične PKU); pq - pojavnost heterozigotov za klasično PKU (ustreza pojavnosti prenašalcev PKU)). Pri izračunu smo izhajali iz pojavnosti klasične PKU v Sloveniji 1/10.000.
blaga PKU) v istem obdobju je približno 1/6.000; pojavnost blage HFA pa približno 1/3.500 (Tabela 1).13
V skladu s Hardy-Weinbergovim načelom smo izračunali, da je pri nas v splošni populaciji heterozigotov za vse mutacije, ki povzročajo klasično PKU 2,0 % (Tabela 1)."
3 Genetske značilnosti
Gen PAH se nahaja na dolgem kraku 12. kromosoma (12q23.2). Sestavljen je iz 13 ek-sonov, dolgih od 57 (ekson 9) do 892 baznih parov (bp) (ekson 13). Povprečna dolžina eksonov znaša 170 bp, intronov pa 6.390 bp. V bazi podatkov PAHdb (okr. angl. The Human PAH Mutation Knowledgebase) je opisanih nad 600 mutacij gena PAH, ki povzročajo različne stopnje pomanjkanja katalitske aktivnosti encima PAH in s tem različne fe-notipske značilnosti bolnikov s PKU.26 Doslej je bilo na genu PAH opisanih tudi okrog 30 velikih delecij, ki v večini populacij predstavljajo manj kot 3 % vseh mutacij/7^ Opisi novonastalih mutacij v genu PAH so zelo redki (skupaj 4 drugačnosmiselne mutacije ter 1 velika delecija več genov), verjetno tudi na račun pomanjkljivega izvajanja genetskih analiz pri starših bolnikov.26
Glede na bazo PAHdb je večina mutacij gena PAH drugačnosmiselnih (63 %). Po pogostosti jim sledijo: manjše delecije (13 %),
mutacije, ki vplivajo na pripajanje eksonov (angl. splicing) (11 %), tihe mutacije (7 %), nesmiselne mutacije (5 0%), velike delecije in duplikacije (do 3 %), manjše insercije (1 %).26 Nekatere mutacije povzročijo popolno izgubo aktivnosti encima PAH, pri večini ostalih pa ima ta od 1-70 %o0 encimske aktivnosti in vitro glede na pričakovano. Popolno izgubo encimske aktivnosti povzročajo: nesmiselne mutacije; mutacije, ki spremenijo bralni okvir (angl. frameshift); velike delecije in duplikacije; mutacije, ki vplivajo na pripa-janje; nekatere drugačnosmiselne mutacije. Mutacije, ki delno ohranijo aktivnost encima PAH, so večinoma drugačnosmiselne/6
V 1-2 %0o povzročajo HFA mutacije genov za encime, ki sodelujejo v tvorbi ali regeneraciji BH4, kofaktorja encima PAH. Te povzročajo t. i. maligno PKU, ki jo je treba izključiti pri vseh novo odkritih bolnikih s HFA.32
Za vsako populacijo in geografsko regijo je značilen specifičen nabor mutacij, pri čemer se ta v populacijah kavkaške (bele) rase močno razlikuje od nabora pri aziat-skih populacijah; vse ostale populacije se zelo razlikujejo od afriških populacij, ki se zelo razlikujejo tudi med seboj/3 Genetske značilnosti različnih populacij PKU po svetu so dokaz za izvor in ekspanzijo vseh človeških populacij iz Afrike/4 S pregledno raziskavo nabora mutacij v opisanih evropskih populacijah je bilo opredeljenih 29 mutacij, ki imajo v vsaj dveh populacijah relativno pogostost nad 3 %. Za severno Evropo je značilna mutacija c.1315+1G>A; za severozahodno Evropo mutacija p.R4o8W-H1; za Skandinavijo mutacija p.Y414C; za vzhodno Evropo mutacija p.R4o8W-H2; za južno in jugovzhodno Evropo ter Malo Azijo mutacija c.1o66-11G>A; za Iberski polotok, zahodno Evropo in Irsko pa mutacija p.I65T/5 V večini opisanih populacij se pojavlja manjše število (1 do 5) za posamezno populacijo značilnih mutacij ter večje število redkih (relativna pogostost pod 3 %) in posamičnih mutacij; manj kot 10 najpogostejših mutacij skoraj v vseh opisanih populacijah je nad 75 % vseh mutacij.26'35 Okrog 75 % bolnikov s PKU je sestavljenih heterozigotov, kar vpliva tudi na heterogenost presnovnih fe-notipov teh bolnikov/6 Blažje oblike HFA so
povezane z drugim naborom mutacij gena PAH, kot jih imajo težje oblike.26
V Sloveniji smo pri 107 družinah bolnikov s PKU (85 % slovenske populacije) našli mutacije na 209 alelih (stopnja de-tekcije 97,7 %). Našli smo nabor 36 različnih mutacij: 20 drugačnosmiselnih mutacij (80 % vseh alelov), osem mutacij, povezanih s pripajanjem (13 %), eno nesmiselno mutacijo (0,5 %), štiri manjše delecije s spremembo bralnega okvirja (6 %), eno manjšo insercijo s spremembo bralnega okvirja (0,5 %) in dve veliki deleciji (2 %). Našli smo pet novih, doslej neopisanih mutacij: p.V45A, p.L62P, p.Ri57S, c.43_44insAG in c.56_59+idelACAGG. Našli smo tudi dve veliki deleciji: EX5del955 in EX3del4765.13~16 Najpogostejša je bila mutacija p.R408W v eksonu 12, ki je predstavljala 29 % vseh in je zelo pogosta tudi v drugih slovanskih populacijah in tudi v nekaterih sosednjih neslovanskih populacijah (Tabela 2)^42 Mutacija p.R408W ima pri vzhodnoevropskih populacijah oz. slovanskih populacijah najverjetneje drug izvor kot tista pri severno- in zahodnoevropskih populacijah (npr. Irska).37 Slovenska populacija bolnikov s PKU je tudi glede na nabor ostalih pogostih mutacij dobro primerljiva s sosednjimi populacijami (primerjave sicer niso povsem
zanesljive zaradi slabe reprezentativnosti večine sosednjih populacij; Tabela 2). 13-16,37-42 Ugotovili smo nabor 64 različnih genotipov, od tega sedem najpogostejših, ki smo jih našli pri več kot tretjini vseh družin. V trinajstih družinah (13 % populacije) so bile mutacije prisotne v homozigotni obliki: 10 družin za mutacijo p.R408W, dve za p.Ri58Q in ena za p.E390G.13-16
4 Fenotipske značilnosti in njihova povezava z genotipom
Vpliv mutacij gena PAH je mogoče ugotavljati na treh fenotipskih ravneh, značilnih za PKU:1-3
•	na ravni zgradbe in delovanja encima PAH (proksimalni nivo);
•	na ravni presnovnega fenotipa, ki se izraža v obliki homeostaze Phe, ki je opisana kot vrednost Phe v krvi v odvisnosti od vnosa Phe s hrano (vmesna raven) (na ravni presnovnega fenotipa temelji klinična klasifikacija PKU in blage HFA);
•	na ravni kliničnega fenotipa, ki je opisan kot stopnja kognitivnega razvoja in ocena delovanja osrednjega živčevja, npr. s pomočjo inteligenčnega količnika (IQ) (distalna raven).
Tabela 2: Primerjava nabora najpogostejših mutacij gena PAH v slovenski populaciji s sosednjimi in/aLi sorodnimi populacijami (mutacije so predstavljene v obliki deležev (v %) glede na vse alele prisotne v posamezni populaciji).
■	Mutacija	Slovenija9 (N=107)	Avstrijab (N=147)	SV Italija0 (N=18)	J Nemčijad (N=226)	Hrvaška6 (N=127)	Madžarskaf (N=35)	Srbija9 (N=34)
1	p.R408W	29 %	23 %	11 %	23 %	36 %	49 %	18 %
2	p.R158Q	9 %	4 %	8 %	5 %	6 %	7 %	4 %
3	p.A403V	7 %	2 %	8 %	8 %	?	?	?
4	p.P281L	7 %	3 %	11 %	4 %	8 %	?	9 %
5	p.E390G	7 %	3 %	?	2 %	7 %	?	7 %
6	p.R261Q	4 %	7 %	6 %	3 %	6 %	?	6 %
7	c.1315+1G>A	3 %	12 %	17 %	10 %	1 %	4 %	4 %
8	p.F55>Lfs	3 %	2 %	0 %	2 %	0 %	?	0 %
9	p.L48S	2 %	2 %	11 %	1 %	10 %	?	21 %
10	c.1066-11G>A	2 %	4 %	3 %	3 %	3 %	3 %	2 %
SV - severovzhodna; J - južna; ? - mutacija (morda) ni bila ugotavljana.
aGroselj et al 2012;14 bSterl et al. 2012;42 cZaffanello et al. 2005,38 dAulehla-Scholz et al. 2003;41 eKaracic et al. 2007;39 fEisensmith et al. 1992f gStojiljkovic et al. 200640
Slika 1: Strukturni modeL monomera PAH z označenimi tremi domenami: regulacijsko (v modri; aminokisLinski ostanki 1-142), kataLitsko (v rumeni; 143-410) in tetramerizacijsko (v rdeči; 411-452).
Pri nezdravljenih bolnikih s PKU je bil v več raziskavah dokazan obstoj povezave med genotipom PAH ter presnovnim feno-tipom; med presnovnim fenotipom in kliničnim (kognitivnim) fenotipom; ter med genotipom PAH in kliničnim (kognitivnim) fenotipom.1-3'36'43'44 Na kompleksnost povezave med genotipom in vsemi tremi fenotip-skimi ravnmi dodatno vplivajo predvsem: visoka stopnja heterogenosti mutacij gena PAH, vpliv velikega števila drugih genov na presnovno homeostazo Phe, izjemna kompleksnost značilnosti razvoja in delovanja osrednjega živčevja ter krvno-možganske pregrade.3'45-50 Pri zdravljenih bolnikih s PKU pa na povezavo genotipa s presnovnim in kliničnim fenotipom ključno vpliva čim hitrejša uvedba ustreznega dietnega zdravljenja čim prej po rojstvu, ki prepreči razvoj pričakovanega kliničnega (kognitivnega) fe-notipa. Hitra uvedba dietnega zdravljenja lahko zabriše tudi povezavo genotipa s presnovnim fenotipom, ker do uvedbe dietnega zdravljenja vrednost fenilalanina v krvi še ni dosegla najvišje vrednosti, zato presnovni fenotip lahko še ni polno izražen.1-3'36
4.1 Fenilalaninska hidroksilaza
Gen PAH se izraža v jetrih in ledvicah kot monomer iz 452 aminokislin, ki ima tri domene: na N-koncu regulatorno (aminoki-slinski ostanki 1-142), katalitsko (143-410), na C-koncu pa tetramerizacijsko (411-452) (Slika 1).5i Monomeri se sestavijo v funkcionalen encim PAH, ki se nahaja v pH-od-visnem ravnotežju med dimerno in tetra-merno obliko. Poznan je strukturni model celotne dolžine encima PAH v tetramerni obliki, na podlagi katerega je mogoče napovedati predviden vpliv nekaterih drugač-nosmiselnih mutacij na delovanje encima PAH.49'50
Drugačnosmiselne mutacije gena PAH najpogosteje povzročijo napačno zvitje (angl. misfolding) monomerov encima PAH, kar vodi v njihovo nestabilnost in/ali moteno oligomerizacijo ter zato v kopičenje in hitrejšo proteolitsko razgradnjo/2 Mutacije ne vplivajo samo na primarno proteinsko strukturo monomerov encima PAH, pač pa tudi na terciarno strukturo monomerov in kvartatno strukturo funkcionalnega protei-na.53 Zaradi hitrejše proteolitske razgradnje
napačno zvitih monomerov encima PAH je v celicah v povprečju prisotna manjša količina tega encima, kar je tudi glavni mehanizem pomanjkanja njegove aktivnosti.54 Le manjši del drugačnosmiselnih mutacij vpliva na kinetske lastnosti encima PAH, ne da bi znižale njegove količine v celici.55
4.2 Presnovni fenotip
Encim PAH katalizira pretvorbo Phe v Tyr, ki poteka v citosolu ledvičnih in jeter-nih celic in je glavna determinanta presnove Phe v telesu.3'51'52 Pomanjkanje aktivnosti encima PAH se zaradi heterogenosti mutacij gena PAH kaže s širokim spektrom presnovnih fenotipov. Klasifikacija blage HFA in PKU temelji na podlagi presnovnega fe-notipa, ki je opredeljen s pomočjo vrednosti Phe v krvi (v ^mol/L).^ Predlagane so bile tri ali štiri različne podskupine PKU, ki temelje na dveh merilih. Prvo je najvišja vrednost Phe v krvi ob postavitvi diagnoze ali nasploh, pomožno pa je količina Phe v prehrani (v mg ali mg/kg), pri kateri vrednost Phe v krvi še ostaja v ciljnem območju (pod 360 ^mol/L) (Tabela 3).i-3'56 Normalno območje vrednosti Phe v krvi znaša 50-120 ^mol/L. Presnovni fenotip pri bolnikih z največjimi izmerjenimi vrednostmi Phe v krvi med 120-600 ^mol/L je opredeljen kot blaga HFA, pri vrednostih Phe med 600900 ^mol/L kot blaga PKU, pri vrednostih Phe med 900-1200 ^mol/L kot zmerna PKU in pri vrednostih Phe nad 1200 ^mol/L kot
klasična PKU (Tabela 3)/^^ Meja med blago HFA in PKU temelji na pomanjkanju dokazov, da bi pri vrednostih Phe v krvi pod 600 ^mol/L pri nezdravljenih bolnikih prišlo do razvoja značilnega kliničnega (kognitivnega) fenotipa.4 Nekatere klasifikacije ne razlikujejo med zmerno in blago PKU, zato so sestavljene le iz treh podskupin.36'57 Kot PKU v najožjem smislu je mišljena klasična PKU. Pri heterozigotih za PKU je vrednost Phe v krvi v normalnem območju/8
Presnovni fenotip bolnika s PKU je med vsemi možnimi vplivi v največji meri določen s specifičnim genotipom PAH. Pri sestavljenih heterozigotih, ki so hkrati funkcionalni hemizigoti, presnovni fenotip določa preostala aktivnosti encima PAH ene od mutacij gena PAH. Pri dveh mutacijah gena PAH, ki imata podobno pričakovano preostalo encimsko aktivnost, ali pa sta homozi-gotni, ima bolnik lahko blažji presnovni fe-notip od pričakovanega glede na posamezno mutacijo.36'57 Napoved presnovnega fenoti-pa na podlagi genotipa PAH je klinično pomembna ne samo za načrtovanje ustreznega dietnega režima pri novo odkritih bolnikih s PKU, ampak tudi za ugotavljanje njihove odzivnosti na zdravljenje s BH4.59'6° Več raziskav, v katerih so ugotavljali značilnosti povezave med genotipom in presnovnim fe-notipom pri bolnikih s PKU, je v večini primerov pokazalo dobro ujemanje genotipov PAH s presnovnimi fenotipi bolnikov.36'57>6i
Tabela 3: MeriLa za ugotavljanje presnovnega fenotipa pri bolnikih s PKU aLi bLago HFA.
Presnovni fenotip	Phe v krvi fomol/L)a	Vnos Phe (mg/dan)b	Vnos Phe/TT (mg/kg/ dan)c
Normalen	50-120	750-2500 (gs)	35-50 (gs)
BLaga HFA	120-600	600-2500 (gs)	35-50 (gs)
Blaga PKU	600-900	400-600	25-35
Zmerna PKU	900-1200	350-400	20-25
Klasična PKU	> 1200	250-350	< 20
Phe - fenilalanin; HFA - hiperfenilalaninemija; PKU - fenilketonurija.
aNajvišja vrednost Phe pred uvedbo diete ali kasneje ob normalni dieti ali ob obremenitvi s Phe. bVnos Phe je največja količina Phe v hrani, pri kateri vrednost Phe v krvi še ostaja v ciljnem območju (pod 360 /jmol/L); vnos Phe v normalni dieti - prilagojeno po The Dietary Reference Intakes, National Academy of Sciences, Washington, DC, 2002); vnos Phe pri dietnem zdravljenju PKU - glede na reference št. 2, 69, 70; gs - glede na starost otroka. cPri 5 letih starosti; TT - telesna teža.
V raziskavi slovenske populacije bolnikov s PKU je bil presnovni fenotip opredeljen kot klasična PKU pri 54,2 % družinah, kot zmerna in blaga PKU pri 26,1 %o družinah ter kot blaga HFA pri 19,6 %o družinah (pri slednjih gre za bolnike, ki potrebujejo dietno zdravljenje, ostali bolniki z blago HFA pa niso bili vključeni v raziskavo). Pri večini družin se je presnovni fenotip ujemal z genotipsko napovedanim. Pri 32 genotipih (od 64) je šlo za funkcionalne hemizigote, kar je omogočilo funkcijsko napoved za 16 mutacij (od 36), med njimi tudi za vseh pet novih mutacij.14-16
4.3 Klinični fenotip
Nezdravljena PKU vodi v napredujočo nevrološko okvaro, ki se kaže kot huda duševna zaostalost. Temu so pridruženi še različni drugi simptomi in znaki: mikroce-falija, nizka rast, ekscemasti izpuščaj, hipo-pigmentacija, epilepsija, avtizem in različni psihiatrični simptomi.2^2 V razvitih državah s presejanjem novorojencev na PKU je polno izraženi klinični fenotip mogoče najti skoraj izključno pri bolnikih, rojenih pred začetkom presejanja. Dietno zdravljenje PKU z uravnoteženim prehranskim vnosom in z ustreznim nadzorom vrednosti Phe v krvi je namreč učinkovito pri preprečevanju težjih okvar osrednjega živčevja in drugih značilnosti klinično izražene PKU. Raziskave kažejo, da je nevrološki izid pri bolnikih s PKU tesno povezan s starostjo ob začetku zdravljenja in kasnejšo presnovno urejeno-stjo.63 Pri bolnikih z uvedenim zdravljenjem v neonatalnem obdobju je bil za vsakih 100 ^mol/L višjo povprečno vrednostjo vseh dotedanjih meritev Phe v krvi, njihov IQ nižji za 1,9-4,1 točke.64 Poleg nižjega inteligenčnega količnika je bil v več raziskavah dokazan vpliv slabše presnovne urejenosti PKU na večjo pogostost motenj izvršnih sposobnosti (načrtovanje, reševanje problemov, predelava podatkov, pozornost) in pojavnost različnih duševnih težav. Tudi bolniki z dietnim zdravljenjem uvedenim takoj po rojstvu in z dobro presnovno urejenostjo imajo v povprečju izmerjeno slabšo kognitivno sposobnost kot njihovi zdravi sorojen-ci ali zdravi vrstniki^5^7
Raziskava nevropsiholoških značilnosti slovenskih bolnikov s PKU doslej še ni bila opravljena.
5 Zdravljenje fenilketonurije
Vzročnega zdravljenja PKU ne poznamo, obstajajo pa načini zdravljenja, ki preprečujejo razvoj kliničnega (kognitivnega) fenotipa PKU. Najpomembnejše je dietno zdravljenje z nadzorovanim znižanim vnosom Phe.68 Zadnje desetletje se uveljavlja še zdravljenje s BH4, na katerega se odziva velika večina bolnikov z blago HFA, vendar pa manj kot 10 %o vseh bolnikov s klasično PKU.69 Razvijajo tudi nekatere nove načine zdravljenja PKU, ki pa se še ne uporabljajo v klinični praksi. To sta encimsko in gensko zdravljenje, medtem ko je dietno zdravljenje z dolgoverižnimi nevtralnimi aminokislinami z omejeno učinkovitostjo in se uporablja predvsem pri odraslih bolnikih/0^3
5.1 Dieta
Uvedba dietnega zdravljenja PKU velja za prvo uspešno zdravljenje prirojene bolezni presnove in s tem za veliko prelomnico, ki je kmalu sprožila tudi razvoj presejalnega programa za PKU.i'7'8 Odtlej se je zvrstilo veliko dokazov, da uvedba ustreznega dietnega zdravljenja čim prej po rojstvu omogoča normalen ali vsaj skoraj normalen razvoj otroka in mladostnika s PKU.2 Dietno zdravljenje temelji na strogo načrtovani omejitvi prehranskega vnosa naravnih beljakovin in s tem Phe, obenem pa z zagotavljanjem zadostnega vnosa vseh ostalih aminokislin z uživanjem pripravka aminokislinske mešanice brez vsebnosti Phe. Primeren kalorični vnos zagotavljajo naravna živila z nizko vsebnostjo Phe (npr. določeno sadje in zelenjava) ter posebna dietna nizkobeljakovinska živila, pri katerih se industrijsko zmanjša vsebnost beljakovin (npr. nizkobeljakovinski kruh).2 Glede na novejše smernice naj bi bilo dietno zdravljenje PKU dolgoročno, celo doživljenjsko, saj tudi povišane vrednosti Phe v odrasli negativno vplivajo na izvršne sposobnosti, lahko povzročajo različno, večinoma bolj subtilno nevrološko simptomatiko, višjo raven oksidativnega stresa idr/4'75 Pri
nas je pri bolnikih s PKU v odrasli dobi priporočeno vzdrževanje vrednosti Phe v krvi pod 700 ^mol/L. Še zlasti pa je pomembno dosledno dietno zdravljenje otrok in mladostnikov v obdobju rasti in razvoja (pri nas so priporočene vrednosti Phe pod 360 ^mol/L) ter nosečnic s PKU (pri nas so priporočene vrednosti Phe pod 260 ^mol/L).2'12 Pogost problem je slabo sodelovanje bolnikov pri zdravljenju, saj predvsem pri adolescentih in odraslih bolnikih dietno zdravljenje terja precejšnjo prilagoditev načina življenja, pa tudi redno uživanje pripravka z aminoki-slinsko mešanico je zaradi slabega okusa nepriljubljeno in moteče v vsakdanjem ritmu dnevnih obveznosti.76
5.2 Tetrahidrobiopterin
Po tem ko so Kure s sod. leta 1999 dokazali, da zdravljenje s BH4 pri nekaterih bolnikih s PKU ali blago HFA znižuje vrednosti Phe v krvi, se je to zdravljenje v naslednjih nekaj letih uveljavilo v klinični praksi^ V več raziskavah je bilo dokazano, da kontinuirano zdravljenje s BH4 pri odzivnih bolnikih poveča toleranco za Phe, zmanjša ali odpravi potrebo po aminokislinskih pre-hranskih preparatih brez vsebnosti Phe ali celo omogoči opustitev dietnega zdravljenja PKU.78'79 Na zdravljenje s BH4 so odzivni bolniki z mutacijami gena PAH, ki ohranjajo vsaj delno aktivnost encima PAH/0^0 Kot molekularni mehanizem odzivnosti na zdravljenje s BH4 je kot kaže najbolj pomembna stabilizacija encima PAH v tetramerni obliki s preprečevanjem napačnega zvijanja mo-nomerov, njihove agregacije in proteolitske razgradnje in inaktivirajo s toploto.60'8i Ni pa še povsem znana povezava med genotipom PAH in odzivnostjo na BH4; lahko pa jo z veliko gotovostjo napovemo pri bolniki s kombinacijo dveh mutacij, od katerih nobena ne omogoča aktivnosti encimske PAH (odzivnosti se ne pričakuje) ali vsaj eno mutacijo, ki je značilna za blago HFA (odzivnost je pričakovana).73'82 Bolniki, ki so na podlagi genotipa opredeljeni kot potencialno odzivni, ali pa potencialne odzivnosti pri njih ni mogoče napovedati, morajo biti glede na priporočila pred uvedbo zdravljenja obremenitveno testirani s BH4. Protokol
testiranja predvideva nekajdnevno uživanje diete z normalno vsebnostjo beljakovin (npr. 2 g/kg teže) ter nato peroralni odmerek BH4 (20 mg/kg teže). Kot merilo odzivnosti se v večini centrov upošteva padec vrednosti Phe za vsaj 30 % glede na izhodiščno vrednost po 24 h.83
Pri nas smo kot potencialno odzivne na zdravljenje s BH4 opredelili 38 družin (35,5 % vseh) s 26 različnimi genotipi (40,6 % vseh). Doslej smo obremenitveno testirali 36 bolnikov, od katerih jih je bilo 18 odzivnih. Pri 12 smo doslej že uvedli zdravljenje s tetrahi-drobiopterinom (Kuvan®)."'^
5.3 Maternalni PKU sindrom
V primeru povišanih vrednosti Phe med nosečnostjo lahko pride do razvoja mater-nalnega sindroma PKU pri otroku, ker so visoke vrednosti Phe v krvi teratogene. Zato je potrebno skrbno in natančno vodenje bolezni v obdobju nosečnosti; nosečnice s PKU opravljajo redne tedenske ambulantne kontrolne preglede, priporočene vrednosti Phe pa so pod 260 ^mol/L.2'i2 Pri otrocih nosečnic z nezdravljeno zmerno in klasično PKU se v skoraj vseh primerih razvije maternalni sindrom PKU. Zanj je značilna mikrocefali-ja, huda duševna zaostalost otroka, pogosto pa tudi prirojeno bolezen srca, zastoj rasti ploda in razvoj dizmorfnih znakov.84 Doslej je bilo po naših podatkih nosečnicam s PKU, ki se vodijo na Pediatrični kliniki, rojenih 13 otrok, pri 11 od teh ni bilo znakov za maternalni sindrom PKU.
6 Zaključek
Obravnava bolnikov s PKU je ena od uspešnejših zgodb sodobne medicine, obenem pa tudi pomemben dokaz, da uspešno presejanje s pravočasno diagnozo in ustreznim zdravljenjem povsem spremeni potek bolezni. S tem je PKU model tudi za druge prirojene bolezni presnove. Možnost genoti-pizacije je ob poznavanju fenotipa omogočila dodatno razlago izvora mutacij in raznolikosti kliničnega poteka bolezni ter pomaga pri zdravljenju. Raziskovanje genotipskih in fenotipskih značilnosti slovenskih bolnikov dopolnjuje obširno mednarodno strokovno
znanje o PKU in zaokrožuje desetletja uspešnega presejanja novorojencev in zdravljenja slovenskih bolnikov s PKU.9-^
Literatura
1.	Scriver CR. The PAH gene, phenylketonuria, and a paradigm shift. Hum Mutat 2007; 28: 831-45.
2.	Blau N, van Spronsen FJ, Levy HL. Phenylketonuria. Lancet 2010; 376: 1417-27.
3.	Scriver CR, Waters PJ. Monogenic traits are not simple: lessons from phenylketonuria, Trends Genet 1999; 15: 267-72.
4.	Weglage J, Pietsch M, Feldmann R, Koch HG, Zschocke J, Hoffmann G, et al. Normal clinical outcome in untreated subjects with mild hyperphenylalaninemia. Pediatr Res 2001; 49:
532-6.
5.	National Institutes of Health Consensus Development Panel. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: phenylketonuria: screening and management. Pediatrics 2001; 108: 972-82.
6.	Fölling A. Über Ausscheidung von Phenylbrenztraubensäure in den Harn als Stoff wechselanomalie in Verbindung mit Inbicillität. Ztschr Physiol Chem 1934; 227: 169.
7.	Bickel H, Gerrard JW, Hickmans EM. Infl uence of phenylalanine intake on phenylketonuria. Lancet 1953; 2: 812-9.
8.	Guthrie R, Susi A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics 1963; 32: 338-43.
9.	Jeras J, Lužnik M. Oligophrenia phenylpyruvica. Zdrav Vestn 1956; 25: 460-3.
10.	Pintar L. Rezultati zgodnjega odkrivanja bolnikov s fenilketonurijo. Zdrav Vestn 1983; 559-62.
11.	Battelino T, Kržišnik C, Pavlin K. Early detection and follow up of children with phenylketonuria in Slovenia. Zdrav Vestn 1994; 63: 25-8.
12.	Žerjav Tanšek M. Fenilketonurija - zgodba o uspešnem zdravljenju presnovne bolezni. Slov Pe-diatr 2003; 10: 225-35.
13.	Grošelj U. Analiza gena za fenilalaninsko hidro-ksilazo in ugotavljanje povezave s fenotipom [doktorsko delo]. Ljubljana: Univerza v Ljubljani; 2012.
14.	Groselj U, Tansek MZ, Kovac J, Hovnik T, Pod-krajsek KT, Battelino T. Five novel mutations and two large deletions in a population analysis of the phenylalanine hydroxylase gene. Mol Genet Me-tab 2012; 106: 142-8.
15.	Tansek MZ, Groselj U, Murko S, Kobe H, Lampret BR, Battelino T. Assessment of tetrahydrobi-opterin (BH(4))-responsiveness and spontaneous phenylalanine reduction in a phenylalanine hy-droxylase deficiency population. Mol Genet Me-tab 2012; 107: 37-42.
16.	Groselj U, Tansek MZ, Podkrajsek KT, Battelino T. The IVS8-2A>G (c.913-2A>G) mutation and the PAH deficiency populations of Central Europe. J Inherit Metab Dis 2013; 36: 157.
Zahvala
Zahvala gre Jerneju Kovaču, univ. dipl. biokem., za pomoč pri izdelavi v članku predstavljenega strukturnega modela mo-nomera PAH.
17.	Loeber JG. Neonatal screening in Europe; the situation in 2004. J Inherit Metab Dis 2007; 30: 430-8.
18.	Mathias D, Bickel H. Follow-up study of 16 years neonatal screening for inborn errors of metabolism in West Germany. Eur J Pediatr 1986; 45: 310-2.
19.	Ozalp I, Coskun T, Tokatli A, Kalkanoglu HS, Dursun A, Tokol S et al. Newborn PKU screening in Turkey: at present and organization for future. Turk J Pediatr 2001; 43: 97-101.
20.	Zschocke J, Mallory JP, Eiken HG, Nevin NC. Phenylketonuria and the peoples of Northern Ireland. Hum Genet 1997; 100: 189-94.
21.	Guldberg P, Henriksen KF, Sipila I, Guttler F, de la Chapelle A. Phenylketonuria in a low incidence population: molecular characterisation of mutations in Finland. J Med Genet 1995; 32: 976-8.
22.	Zhan JY, Qin YF, Zhao ZY. Neonatal screening for congenital hypothyroidism and phenylketonuria in China. World J Pediatr 2009; 5: 136-9.
23.	Song F, Qu YJ, Zhang T, Jin YW, Wang H, Zheng XY. Phenylketonuria mutations in Northern China. Mol Genet Metab 2005; 86: 107-18.
24.	Pangkanon S, Charoensiriwatana W, Janejai N, Boonwanich W, Chaisomchit S. Detection of phenylketonuria by the newborn screening program in Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health 2009; 40: 525-9.
25.	Aoki K, Ohwada M, Kitagawa T. Long-term follow-up study of patients with phenylketonuria detected by the newborn screening programme in Japan. J Inherit Metab Dis 2007; 30: 608.
26.	Scriver CR, Hurtubise M, Konecki D, Phomma-rinh M, Prevost L, Erlandsen H et. al. PAHdb 2003: what a locus-specific knowledgebase can do. Hum Mutat 2003; 21: 333-44.
27.	Avigad S, Cohen BE, Bauer S, Schwartz G, Fryd-man M, Woo SL, et al. A single origin of phenyl-ketonuria in Yemenite Jews. Nature 1990; 344: 168-70.
28.	Cali F, Ruggeri G, Vinci M, Meli C, Carducci C, Leuzzi V, et al. Exon deletions of the phenylalanine hydroxylase gene in Italian hyperphenylalani-nemics. Exp Mol Med 2010; 42: 81-6.
29.	Kozak L, Hrabincova E, Kintr J, Horky O, Za-pletalova P, Blahakova I, et al. Identification and characterization of large deletions in the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene by MLPA: evidence for both homologous and non-homologous mechanisms of rearrangement. Mol Genet Metab 2006; 89: 300-9.
30.	Gable M, Williams M, Stephenson A, Okano Y, Ring S, Hurtubise M, et al. Comparative multiplex dosage analysis detects whole exon deletions at the phenylalanine hydroxylase locus. Hum Mutat 2003; 21: 379-86.
31.	Desviat LR, Pérez B, Ugarte M. Identification of exonic deletions in the PAH gene causing phenylketonuria by MLPA analysis. Clin Chim Acta 2006; 373:164-7.
32.	Thony B, Blau N. Mutations in the BH4-metabo-lizing genes GTP cyclohydroalse I, 6-pyruvoyl--tetrahydropterin synthase, sepiapterin reductase, carbinolamine-4a-dehydratase, and dihydropteri-dine reductase genes. Hum Mutat 2006; 27: 870-8.
33.	Nowacki PM, Byck S, Prevost L, Scriver CR. PAH Mutation Analysis Consortium Database: 1997. Prototype for relational locusspecific mutation databases. Nucleic Acids Res 1998; 26: 220-5.
34.	Barbujani G, Goldstein DB. Africans and Asian abroad: genetic diversity in Europe. Annu Rev Genomics Hum Genet 2004; 5: 119-50.
35.	Zschocke J. Phenylketonuria mutations in Europe. Hum Mutat 2003; 21: 345-56.
36.	Kayaalp E, Treacy E, Waters PJ, Byck S, Nowacki P, Scriver CR, et al. Human hydroxylase mutations and hyperphenylalaninemia phenotypes: a meta-nalysis of genotype-phenotype correlations. Am J Hum Genet 1997; 61: 1309-17.
37.	Eisensmith RC, Okano Y, Dasovich M, Wang T, Guttler F, Lou H, et al. Multiple Origins for Phenylketonuria in Europe. Am J Hum Genet
1992; 51: 1355-65.
38.	Zaffanello M, Zamboni G, Maselli M, Gandini A, Camilot M, Maffeis C et al. Genetic analysis carried out on blood-spots of phenylalanine hy-droxylase-deficient newborns detected by northeastern Italian neonatal screening. Genet Test 2005;
9: 133-7.
39.	Karacic I, Meili D, Sarnavka V, Heintz C, Thony B, Ramadza DP, et al. Genotype-predicted tetrahy-drobiopterin (BH4)-responsiveness and molecular genetics in Croatian patients with phenylala-nine hydroxylase (PAH) deficiency. Mol Genet Metab 2009; 97: 165-71.
40.	Stojiljkovic M, Jovanovic J, Djordjevic M, Grkovic S, Cvorkov Drazic M, Petrucev B, et al. Molecular and phenotypic characteristics of patients with phenylketonuria in Serbia and Montenegro. Clin Genet 2006; 70: 151-5.
41.	Aulehla-Scholz C, Heilbronner H. Mutational spectrum in German patients with phenylalani-ne hydroxylase deficiency. Hum Mutat 2003; 21:
399-400.
42.	Sterl E, Paul K, Paschke E, Zschocke J, Brun-ner-Krainz M, Windisch E, et al. Prevalence of tetrahydrobiopterine (BH4)-responsive alleles among Austrian patients with PAH deficiency: comprehensive results from molecular analysis in 147 patients. J Inherit Metab Dis 2013; 36: 7-13.
43.	Guttler F, Guldberg P, Henriksen KF. Mutation genotype of mentally retarded patients with phenyl-ketonuria. Dev Brain Dysfunct 1993; 6: 92-6.
44.	Scriver CR. Phenylketonuria—genotypes and phenotypes. N Engl J Med 1991; 324: 1280-1.
45.	Dipple KM, McCabe ERB. Modifier genes convert ''simple'' Mendelian disorders to complex traits. Mol Genet Metab 2000; 71: 43-50.
46.	Scriver CR. Why mutation analysis does not always predict clinical consequences: explanations in the era of genomics. J Pediatr 2002; 140: 502-6.
47.	Scriver CR. After the genome—the phenome? J Inher Metab Dis 2004; 27: 305-17.
48.	Weglage J, Moller HE, Wiedermann D, Cipcic--Schmidt S, Zschocke J, Ullrich K. In vivo NMR spectroscopy in patients with phenylketonuria. Clinical significance of interindividual differences in brain phenylalanine concentrations. J Inherit Metab Dis 1998; 21: 81-3.
49.	Erlandsen H, Stevens RC. The structural basis of phenylketonuria. Mol Genet Metab 1999; 68: 103-25.
50.	Jennings IG, Cotton RGH, Kobe B. Structural interpretation of mutations in phenylalanine hy-droxylase protein aids in identifying genotype--phenotype correlations in phenylketonuria. Eur J Hum Genet 2000; 8: 683-96.
51.	Lichter-Konecki U, Hipke CM, Konecki D. Human phenylalanine hydroxylase gene expression in kidney and other nonhepatic tissues. Mol Genet Metab 1999; 67: 308-16.
52.	Waters PJ. How PAH gene mutations cause hyperphenylalaninemia and why mechanism matters: insights from in vitro expression. Hum Mutat 2003; 21: 357-69.
53.	Gersting SW, Kemter KF, Staudigl M, Messing DD, Danecka MK, Lagler FB, et al. Loss of function in phenylketonuria is caused by impaired molecular motions and conformational instability. Am J Hum Genet 2008; 83: 5-17.
54.	Muntau AC, Gersting SW. Phenylketonuria as a model for protein misfolding diseases and for the development of next generation orphan drugs for patients with inborn errors of metabolism. J Inherit Metab Dis 2010; 33: 649-58.
55.	Knappskog PM, Eiken HG, Martinez A, Bruland O, Apold J, Flatmark T. A PKU mutation (D143G) associated with an apparent high residual enzyme activity: expression of a kinetic variant form of phenylalanine hydroxylase in three different systems. Hum Mutat 1996; 8: 236-46.
56.	Güttler F. Hyperphenylalaninemia diagnosis and classification of the various types of phenylalanie hydroxylase deficiency in childhood. Acta Pediat Scand 1980; 280: 1-80.
57.	Guldberg P, Rey F, Zschocke J, Romano V, François B, Michiels L, et al. A European multicenter study of phenylalanine hydroxylase deficiency: classification of 105 mutations and a general system for genotype-based prediction of metabolic phenotype. Am J Hum Genet 1998; 63: 71-9.
58.	Rosenblatt D, Scriver CR. Heterogeneity in genetic control of phenylalanine metabolism in man. Nature 1968; 218: 677-8.
59.	Guttler F, Guldberg P. Mutation analysis anticipates dietary requirements in phenylketonuria. Eur J Pediatr 2000; 159: 150-3.
60.	Blau N., Erlandsen H. The metabolic and molecular bases of tetrahydrobiopterin-responsive phenylalanine hydroxylase deficiency. Mol Genet Metab 2004; 82: 101-11.
61.	Desviat LR, Perez B, Gamez A, Sánchez A, García MJ, Martínez-Pardo M, et al. Genetic and phenotypic aspects of phenylalanine hydroxylase deficiency in Spain: molecular survey by regions. Eur J Hum Gen 1999; 7: 386-92.
62.	Mazur A, Jarochowicz S, Sykut-Cegielska J, Gra-dowska W, Kwolek A, Oltarzewski M. Evaluation of somatic development in adult patients with pre-
viously undiagnosed and/or untreated phenylketonuria. Med Princ Pract 2010; 19: 46-50.
63.	Smith I, Beasley MG, Ades AE. Intelligence and quality of dietary treatment in phenylketonuria. Arch Dis Child 1990; 65: 472-8.
64.	Waisbren SE, Noel K, Fahrbach K, Cella C, Frame D, Dorenbaum A, et al. Phenylalanine blood levels and clinical outcomes in phenylketonuria: a systematic literature review and meta-analysis. Mol Genet Metab 2007; 92: 63-70.
65.	Leuzzi V, Pansini M, Sechi E, Chiarotti F, Carducci C, Levi G, et al. Executive function impairment in early-treated PKU subjects with normal mental development. J Inherit Metab Dis 2004; 27: 115-25.
66.	Albrecht J, Garbade SF, Burgard P. Neuropsychological speed tests and blood phenylalanine levels in patients with phenylketonuria: a meta-analysis. Neurosci Biobehav Rev 2009; 33: 414-21.
67.	Weglage J, Funders B, Wilken B, Schubert D, Schmidt E, Burgard P, et al. Psychological and social findings in adolescents with phenylketonuria. Eur J Pediatr 1992; 151: 522-5.
68.	Blau N, Belanger-Quintana A, Demirkol M, Feil-let F, Giovannini M, MacDonald A, et al. Management of phenylketonuria in Europe: survey results from 19 countries. Mol Genet Metab 2010; 99: 109-15.
69.	Fiege B, Blau N. Assessment of tetrahydrobiopte-rin (BH4)-responsiveness in phenylketonuria. J Pediatr 2007; 150: 627-30.
70.	Matalon R, Michals-Matalon K, Bhatia G, Grecha-nina E, Novikov P, McDonald JD, et al. Large neutral amino acids in the treatment of phenylketonuria (PKU). J Inherit Metab Dis 2006; 29: 732-8.
71.	MacDonald MJ, D'Cunha GB. A modern view of phenylalanine ammonia lyase. Biochem Cell Biol 2007; 85: 273-82.
72.	Sarkissian CN, Gamez A. Phenylalanine ammonia lyase, enzyme substitution therapy for phenyl-ketonuria, where are we now? Mol Genet Metab 2005; 86: 22-6.
73.	Harding CO. Progress toward cell-directed therapy for phenylketonuria. Clin Genet 2008; 74:
97-104.
74.	Channon S, Goodman G, Zlotowitz S, Mockler C, Lee PJ. Effects of dietary management of phenyl-ketonuria on long-term cognitive outcome. Arch Dis Child 2007; 92: 213-8.
75.	Rocha JC, Martins MJ. Oxidative stress in Phenylketonuria: future directions. J Inherit Metab Dis 2012; 35: 381-98.
76.	Walter JH, White FJ, Hall SK, MacDonald A, Rylance G, Boneh A, et al. How practical are recommendations for dietary control in phenylketonuria? Lancet 2002; 360: 55-7.
77.	Kure S, Hou DC, Ohura T, Iwamoto H, Suzuki S, Sugiyama N, et al. Tetrahydrobiopterin-responsi-ve phenylalanine hydroxylase deficiency. J Pediatr 1999; 135: 375-8.
78.	Trefz FK, Burton BK, Longo N, Casanova MM, Gruskin DJ, Dorenbaum A, et al. Efficacy of sa-propterin dihydrochloride in increasing phenyla-lanine tolerance in children with phenylketonuria: a phase III, randomized, double-blind, placebo-controlled study. J Pediatr 2009; 154: 700-7.
79.	Burton BK, Grange DK, Milanowski A, Vockley G, Feillet F, Crombez EA, et al. The response of patients with phenylketonuria and elevated serum phenylalanine to treatment with oral sapropterin dihydrochloride (6R-tetrahydrobiopterin): a phase II, multicentre, open-label, screening study. J Inherit Metab Dis 2007; 30: 700-7.
80.	Zurflüh MR, Zschocke J, Lindner M, Feillet F, Chery C, Burlina A, et al. Molecular genetics of tetrahydrobiopterin responsive phenylalanine hy-droxylase deficiency. Hum Mutat 2008; 29: 167-75.
81.	Erlandsen H, Pey AL, Gamez A, Perez B, Desvi-at LR, Aguado C, et al. Correction of kinetic and stability defects by tetrahydrobiopterin in phenyl-ketonuria patients with certain phenylalanine hy-droxylase mutations. Proc Nat Acad Sci 2004; 101: 16903
82.	Trefz FK, Scheible D, Götz H, Frauendienst-Egger G. Significance of genotype in tetrahydrobiopte-rin-responsive phenylketonuria. J Inherit Metab Dis 2009; 32: 22-6.
83.	Blau N, Belanger-Quintana A, Demirkol M, Feillet F, Giovannini M, MacDonald A, et al. Optimizing the use of sapropterin (BH4) in the management of phenylketonuria. Mol Genet Metab 2009; 96: 158-63.
84.	Koch R, Hanley W, Levy H, Matalon K, Matalon R, Rouse B, et al. The maternal phenylketonuria international study: 1984-2002. Pediatrics 2003; 112: 1523-9.