Oznaka poročila: ARRS-RPROJ-ZP-2013/171 ZAKLJUČNO POROČILO RAZISKOVALNEGA PROJEKTA a. podatki o raziskovalnem projektu 1.Osnovni podatki o raziskovalnem projektu Šifra projekta L4-2404 Naslov projekta Cepiva nove generacije proti Helicobacter pylori Vodja projekta 6628 Roman Jerala Tip projekta L Aplikativni projekt Obseg raziskovalnih ur 8340 Cenovni razred C Trajanje projekta 05.2009 - 04.2012 Nosilna raziskovalna organizacija 104 Kemijski inštitut Raziskovalne organizacije -soizvajalke 311 Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino Raziskovalno področje po šifrantu ARRS 4 BIOTEHNIKA 4.06 Biotehnologija Družbenoekonomski cilj 07. Zdravje 2.Raziskovalno področje po šifrantu FOS1 Šifra 3.04 -Veda 3 Medicinske vede - Področje 3.04 Medicinska biotehnologija b. rezultati in dosežki raziskovalnega projekta 3.Povzetek raziskovalnega projekta2 SLO Helicobacter pylori lahko povzroči gastritis, želodčno razjedo in lahko vodi do raka želodca. Dolgotrajno zdravljenje z antibiotiki ne ščiti gostitelja pred ponovno okužbo. H. pylori je razvila izogibanje imunskemu odzivu s spreminjanjem aminokislinskega zaporedja flagelina, ki pri drugih bakterijah aktivira naravni imunski odziv. Flegele so bistvenega pomena za bakterijo H. pylori za učinkovito kolonizacijo dvanajstnika in želodca ljudi. TLR5, član Tollu-podobnih receptorjev prepoznava, flagelin večine bakterij, kot je Escherichia coli, vendar ne flagellina FlaA H. pylori. FlaA smo spremenili za učinkovito prepoznavanje TLR5 s tvorbo himernega flagelina, v katerem smo oba terminalna segmenti H. pylori flagelina nadomestili z ustreznimi segmenti flagelina FliC E. coli. Pri imunizaciji miši smo zaznali občutno povečan serumski IgG in IgA pri miših, cepljenih z himernim flagelinom v primerjavi z mišmi cepkjenimi s izvornim proteinom (FlaA) ali negativne kontrole. Titri protiteles so ostali visoki tudi 8 mesecev po zadnjem cepljenju. Protitelesa so prepoznala endogeni flagelin iz lizata H. pylori. Cepljenje z himernim flagelinom je omogočilo pomembno zaščito kolonizaciji s H. pylori. Pristop himernega flagelina lahko uporabimo za tvorbo učinkovitih cepiv , ki omogočajo aktiviranje naravnega in pridobljenega imunskega odziva in se lahko uporabljajo za izdelavo učinkovitih cepiv proti H. pylori ali drugih bakterij. ANG Helicobacter pylori infection can cause gastritis, peptic ulcer and can lead to gastric cancer. Lengthy antibiotic therapy does not protect the host against reinfection. H. pylori evolved to evade the recognition of the immune response by modifying several of its components whose orthologous proteins from other bacteria activate the innate immune response. Flagella are essential for the H. pylori effective colonization of human duodenum and stomach. TLR5, a member of the Toll-like receptor family, recognizes flagellin of most bacteria, such as Escherichia coli, but does not recognize the flagellin FlaA of H. pylori. We restored the ability of FlaA for the recognition by TLR5 by engineering a chimeric flagellin, in which both terminal segments of H. pylori flagellin were replaced by the corresponding segments from TLR5-activating E. coli flagellin. Recombinant chimeric flagellin folded correctly and was able to activate TLR5. Significantly increased serum IgG and IgA antibody responses were determined in mice vaccinated with chimeric flagellin in comparison to mice vaccinated with a control protein (FlaA) or negative control. Antibody titers remained high eve n8 months after the last immunization. Antibodies were able to bind native flagellin from H. pylori lysate. Vaccination with chimeric flagellin provided mice with significant protection against H. pylori. The approach of chimeric flagellin can therefore generate effective immunogens that enable activation of innate and adaptive immune response and can be used to construct efficient vaccines against H. pylori or other flagellated bacteria that evade TLR5 recognition. 4.Poročilo o realizaciji predloženega programa dela na raziskovalnem projektu3 Pripravili smo himerni flagelin, sestavljen iz N- ter C-končnega dela flagelina E.coli ter centralnega dela flagelina H.pylori. Omenjen flagelin je sposoben, za razliko od flagelina H.pylori aktivirati receptor TLR5. Cepivo smo preizkusili tudi v živalskem modelu, z nazalno prvo imunizacijo ter dvema poživljajočima odmerkoma aplicirana subkutano. Ugotovili smo, da himerni flagelin pomembno izboljša tvorbo protiteles. Najbolje rezultate smo dobili z uporabo himernega flagelina skupaj z aluminijevim adjuvansom, čeprav je imel sam himerni flagelin le nekoliko slabše delovanje. Tvorba IgG himernega flagelina pa je bila bistveno boljša od imunizacije s flagelinom FlaA H.pylori z ali brez aluminijevega adjuvansa. Pomembna ugotovitev je bila, da prestavlja variabilni del flagelina (domena D2 in D3), ki je bila v himernem flagelinu iz FlaA, dominantni epitop. Tako so protitelesa proti himernemu flagelinu prepoznavala tudi rekombinanten FlaA pa tudi flagelin v lizatu bakterij H.pylori, kar pomeni, da je cepivo primerno za prepoznavanje infekcije s H.pylori. Analizirali smo tudi razlike v tvorbi različnih podrazredov IgG, iz česar lahko sklepamo na usmerjenost adaptivnega odziva organizma. Odkrili smo, da himerni flagelin z dodanim aluminijevim adjuvansom sproži pretežno Th1 odziv, medtem ko je odziv drugih imunizacij pretežno usmerjen v Th2. Članek je poslan v recenzijo. Aktivacija naravnega imunskega odziva s himernim flagelinom preko receptorja TLR5 je centralni del projekta. Zato smo raziskali molekulski mehanizem prepoznavanja flagelina. S točkovnimi mutacijami smo določili vpliv aminokislin okrog AK D277 ektodomeni TLR5 za aktivacijo s flagelinom. Testirali smo aktivacijo receptorja s skrajšanim flagelinom, ter varianto s skrajšanima N- ter C-končno domeno, ki tvorita vijačnici s katerima flagelin interagira z drugimi monomeri v tvorbi flagel. Pripravili smo himerni receptor, ki je bil sestavljen iz skrajšanega flagelina (brez D2 in D3 domene) povezanega z receptorjem TLR5. Ta himerni receptor je imel konstitutivno aktivnost, po drugi strani pa je dodatek TLR5 povzročil inhibicijo, medtem ko je dodatek receptorja ter flagelina povečal aktivacijo. Iz tega lahko sklepamo na stehiometrijo vezave flagelina na receptor 2:2, kar pomeni, da se dimer flagelina veže na dve molekuli receptorja, kar sproži vezavo adapterja MyD88 ter celično aktivacijo. Pripravili smo molekulski model aktivacije, ki se pomembno razlikuje od modela, ki je bil predlagan na osnovi kristalne strukture kompleksa fragmenta ektodomene ribjega TLR5 ter skrajšanega flagelina (Yoon in sod. Science Februar 2012). Naš model lahko namreč tudi razloži zakaj flagelin H.pylori ni sposoben aktivacije TLR5 za razliko od flagelina E.coli ali S.typhimurium. Na osnovi našega modela bomo pripravili tudi dodatne variante flagelina, za katere prvi rezultati kažejo, da bodo še močneje aktivirale TLR5, kar nameravamo zaščititi s patentno prijavo. Konstitutivno aktivnost TLR smo uporabili tudi pri receptorju TLR4, ki aktivira tudi TRIF signalizacijo, ki vodi v tvorbo interferonov tipa I. Pokazali smo, da je TLR4 konstitutivno aktiven če njegovo ektodomeno zamenjamo z drugim proteinom, kot je npr. giraza B ali fluorescenčni protein. Ta lastnost je potencialno zelo zanimiva za uporabo za imunizacijo, saj lahko namesto ektodomene dodamo proteinski antigen, kot je npr. tumorski antigen. Tako lahko podobno kot pri himernem flagelinu vzporedno aktiviramo naravno ter pridobljeno imunost. Prvi testi za uporabo za tumorsko imunoterapijo opravljeni v sodelovanju z Onološkim inštitutom so bili obetavni, predvsem za terapijo sarkoma in melanoma. V predlogu projekta smo načrtovali pripravo dodatnih antigenov H.pylori. Izbrali smo ureazo B, ki je virulentni dejavnik H.pylori, ki ji omogoča preživetje v ekstremno kislem okolju zaradi izločanja amonijevih ionov iz uree. Imunogenost tega antigena smo izboljšali z dodatkom polilevcinskega repa (20 levcinskih preostankov), s pomočjo katerega smo nameravali izboljšati vnos ter aktivacijo naravnega imunskega odziva. Hipoteza te modifikacije je bila, da polilevcinski repo povzroči tvorbo proteinskih micel, kjer se polilevcinski repi združijo v hidrofobno sredico. Omenjena modifikacija bi morala tudi izboljšati porazdelitev proteinskega antigena v lipidnih adjuvanskih kot je MF59. Dodatek polilevcinskega repa je, kot smo načrtovali, povzročil oligomerizacijo ureaze B. Z uporabo gelske filtracije smo opazili tvorbo homogenih agregatov velikosti nad 700 kDa, kar pomeni, da je v vsakem agregatu več kot 10 molekula modificirane ureaze B. Z uporabo mikroskopa na atomsko silo smo ugotovili, da modificirana ureaza B tvori homogene agregate velikosti okrog 100 nm, za razliko od same ureaze B, ki meri okrog 10 nm. Analizirali smo vnos fluorescenčno označenih proteinov (Alexa Fluor 633) v makrofage ter opazili izboljšan vnos agregatov ureaze B. V zadnjih letih so poročali, da delci velikosti od nekaj 100 nm do mikrometrov aktivirajo NLRP3 inflamasom, ki vodi v aktivacijo kaspaze 1 ter v procesiranje prointerlevkina 1 v aktiven IL-1. Ta aktivacija igra pomembno vlogo pri delovanju aluminijeva hidroksida, ki je eno izmed redkih doslej opisanih registriranih adjuvansov za uporabo na ljudeh. Delovanje agregiranih proteinov kot aktivatorjev inflamasoma smo testirali na agregatih prionskega proteina, kjer smo ugotovili da proteinski agregati, ne pa monomeri ali oligomeri aktivirajo NLRP3 inflamasom. Z uporabo makrofagov miši z izbitima genoma za NLRP3 ali adapter ASC smo pokazali potrebo po inflamasomu. Pokazali smo, da je za to aktivacijo potreben efluks kalija, vendar aktivacija s proteinskimi agregati ni odvisna od ATP, ki prav tako lahko aktivira NLRP3 inflamasom. S.Ocena stopnje realizacije programa dela na raziskovalnem projektu in zastavljenih raziskovalnih ciljev4 Izvajanje projekta je potekalo tako kot smo ga zastavili. Vzporedno so potekale raziskave osnivnega mehanizma prepoznavanja flagelina preko receptorja TLR5 ter načrtovanje sintetičnega cepiva, ki vključuje rezultate teh spoznanj za pripravo učinkovitega, potencialno uporabnega cepiva. Končni rezultat je bila piprava učinkovitega preventivnega cepiva proti H.pylori, kar smo pokazali na živalskem modelu, kjer smo bsitveno zmanjšali kolonizacijo želodca s H.pylori v miših, ki so bile imunizirane s himernim flagelinom. 6.Utemeljitev morebitnih sprememb programa raziskovalnega projekta oziroma sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine5 Ni bilo sprememb razem manjših sprememb pri sestavi projektne skupine zaradi sprememb zaposlitve. 7.Najpomembnejši znanstveni rezultati projektne skupine6 Znanstveni dosežek 1. COBISS ID 5023770 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Himerni flagelin kot cepivo, ki vsebuje adjuvantno delovanje za aktovacijo imunskega odziva proti okužbi z bakterijo Helicobacter pylori ANG Chimeric flagellin as the self-adjuvanting antigen for the activation of immune response against Helicobacter pylori Opis SLO Helicobacter pylori lahko povzroči gastritis, želodčno razjedo in lahko vodi do raka želodca. Zdravljenje z antibiotiki ne ščiti gostitelja pred ponovne okužbe. H. pylori se izogne aktivaciji imunskega odziva ker tvori flagelin, ki na aktivira receptorja TLR%. Flagelin je poglavitna sestavina bičkov, ki so pomembni za preživetje bakterij v želodcu. TLR5, član Tollu-podobnih receptorjev prepoznava flagellin večine bakterij, kot je Escherichia coli, vendar ne flagellina FlaA H. pylori. Sposobnost FlaA za aktivacijo TLR5 smo ustvarili z inženiringom himernega flagellina, v katerem smo oba končna segmenta H. pylori flagellina nadomestili z ustreznimi segmenti iz flagelina E.coli. Rekombinantni himerni flagelin se je pravilno zvil in je aktiviral TLR5. Zaznali smo občutno povečano tvorbo serumskih IgG in IgA protiteles pri miših, cepljenih z himernim flagelinom v primerjavi z mišmi cepljenimi s FlaA. Titri protiteles so ostali visoki še 8 mesecev po zadnjem cepljenju. Protitelesa so vezala flagellin iz lizata H. pylori. Cepljenje z himernim flagelinom iz miši je omogočil zaščito proti kolonizaciji H. pylori. Pristop z uporabo himernega flagelina lahko uporabimo za aktivacijo naravnega in pridobljenega imunskega odziva za izdelavo učinkovitih cepiv proti H. pylori ali drugim bakterijam, ki se izogibajo prepoznavanja s TLR5. Helicobacter pylori infection can cause gastritis, peptic ulcer and can lead to ANG gastric cancer. Lengthy antibiotic therapy does not protect the host against reinfection. H. pylori evolved to evade the recognition of the immune response by modifying several of its components whose orthologous proteins from other bacteria activate the innate immune response. Flagella are essential for the H. pylori effective colonization of human duodenum and stomach. TLR5, a member of the Toll-like receptor family, recognizes flagellin of most bacteria, such as Escherichia coli, but does not recognize the flagellin FlaA of H. pylori. We restored the ability of FlaA for the recognition by TLR5 by engineering a chimeric flagellin, in which both terminal segments of H. pylori flagellin were replaced by the corresponding segments from TLR5-activating E. coli flagellin. Recombinant chimeric flagellin folded correctly and was able to activate TLR5. Significantly increased serum IgG and IgA antibody responses were determined in mice vaccinated with chimeric flagellin in comparison to mice vaccinated with a control protein (FlaA) or negative control. Antibody titers remained high eve n8 months after the last immunization. Antibodies were able to bind native flagellin from H. pylori lysate. Vaccination with chimeric flagellin provided mice with significant protection against H. pylori. The approach of chimeric flagellin can therefore generate effective immunogens that enable activation of innate and adaptive immune response and can be used to construct efficient vaccines against H. pylori or other flagellated bacteria that evade TLR5 recognition. Objavljeno v Butterworth Scientific; Vaccine; 2012; Vol. 30, issue 40; str. 5856-5863; Impact Factor: 3.766;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 2.978; A': 1; WoS: NI, QA; Avtorji / Authors: Mori Jerneja, Vranac Tanja, Smrekar Boštjan, Černilec Maja, Čurin-Šerbec Vladka, Horvat Simon, Ihan Alojz, Benčina Mojca, Jerala Roman Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 2. COBISS ID 4652570 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Ektodomena TLR4 prepreči konstitutivno aktivacijo receptorja ANG Ectodomain of the toll-like receptor 4 prevents constitutive receptor activation Opis SLO Ugotovili smo, da je doslej neznana funkcija ektodomene TLR4 da prepreči konstitutivno aktivnost receptorja. Zamenjava ektodomene z monomernimi proteini, kot je fluorescenčni protein je povzročila močno konstitutivno aktivacijo. Ugotovili smo kateri del ektodomene je minimalno potreben za inhibicijo aktivacje. Opisan način aktivacije je potencialno uporaben za cepivo, ki bi kombinirali aktivacijo naravne in pridobljene imunosti. ANG Toll-like receptor 4 (TLR4) is involved in activation of innate immune response in a large number of different diseases. Despite numerous studies, the role of separate domains of TLR4 in the regulation of receptor activation is poorly understood. Replacement of the TLR4 ectodomain with LPS-binding proteins MD-2 or CD14 resulted in a robust ligand-independent constitutive activation, comparable to the maximal stimulation of the receptor with LPS. The same effect was achieved by the replacement of the ectodomain with a monomeric fluorescent protein or a 24 kDa gyrase B fragment. This demonstratesan intrinsic dimerization propensity of the transmembrane and cytoplasmic domains of TLR4 and reveals a previously unknown function of the ectodomain in inhibiting spontaneous receptor dimerization. Constitutive activation was abolished by the replacement of ectodomain by a bulkier protein ovalbumin. N-terminal deletion variants of TLR4 revealed that the smallest segment of the ectodomain that already prevents constitutive activitycomprises only 90 residues (542 to 631) out of the total 608 residues.We conclude that TLR4 represents a receptor with low threshold of activation, which can be rapidly activated by the release of inhibition exerted by its ectodomain. This is important for the sensitivity of TLR4 to activation by different agonists. TLR4 ectodomain has multiple roles in enabling ligand regulated activation, providing proper localization, while serving as an inhibitor to prevent spontaneous, ligand-independent dimerization. Objavljeno v American Society of Biological Chemists.; The Journal of biological chemistry; 2011; Vol. 286, no. 26; str. 23334-23344; Impact Factor: 4.773;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 3.739; A': 1; WoS: CQ; Avtorji / Authors: Panter Gabriela, Jerala Roman Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek S.Najpomembnejši družbeno-ekonomski rezultati projektne skupine7 Družbeno-ekonomski dosežek 1. COBISS ID 5010970 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Cepiva, ki kombinirajo aktivacijo naravne in pridobljene imunosti s pomočjo himrnega flagelina ANG Vaccine combining activation of innate and adaptive immune response by chimeric flagellin Opis SLO Predstavitev rezultatov projekta na delavnici na Japonskem. ANG Presentation of the results of the project in a workshop in Japan. Šifra B.03 Referat na mednarodni znanstveni konferenci Objavljeno v Chiba University; New horizon in immune regulation; 2012; str. 69; Avtorji / Authors: Mori Jerneja, Vranac Tanja, Smrekar Boštjan, Černilec Maja, Čurin-Šerbec Vladka, Horvat Simon, Ihan Alojz, Benčina Mojca, Jerala Roman Tipologija 1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci 2. COBISS ID 2952584 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Aktivacija naravnega in pridobljenega imunskega odziva s himernim flagelinom ANG Activation of innate and adaptive immune response by chimeric flagellin Opis SLO Predstavitev rezultatov projekta na znanstveni konferenci. ANG Presentation of project results at the scientific conference. Šifra B.04 Vabljeno predavanje Objavljeno v Zavod za zdravstveno varstvo; Abstract book; 2011; Str. 222; Avtorji / Authors: Mori Jerneja, Vranac Tanja, Smrekar Boštjan, Černilec Maja, Čurin-Šerbec Vladka, Horvat Simon, Ihan Alojz, Benčina Mojca, Jerala Roman Tipologija 1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci 3. COBISS ID 4587802 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Priprava in izolacija himernega flagelina za aktivacijo naravnega imunskega odziva. ANG Preparing and isolation of chimeric flagellin for activation of immune response Opis SLO Predstavitev rezultatov projekta na poletni šoli EFIS, prva nagrada za poster. ANG Presentation of project results at the EFIS summer school, first award for the poster. Šifra B.03 Referat na mednarodni znanstveni konferenci Objavljeno v s. n.]; ENII EFIS/EJI 5th Immunology summer school, Capo Caccia, Sardinia, May 9-16, 2010; 2010; Str. 129; Avtorji / Authors: Mori Jerneja, Jerala Roman, Ivičak Karolina, Benčina Mojca, Pirher Nina, Avbelj Monika, Horvat Simon, Čeh Eva, Kočar Vid, Smole Anže, Lonzaric Jan, Lasič Ana, Kolar Katja Tipologija 1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci 4. COBISS ID 4381466 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Himerni flagelini za cepiva ANG Chimeric flagellin for vaccines Opis SLO Patent ANG Patent on the preparation and application of formulations for a vaccine against H.pylori. Šifra F.06 Razvoj novega izdelka Objavljeno v Urad Republike Slovenije za intelektualno lastnino; 2010; 55, 12 str.; Avtorji / Authors: Jerala Roman, Pirher Nina, Ivičak Karolina, Avbelj Monika, Benčina Mojca, Horvat Simon, Čeh Eva, Kočar Vid, Kolar Katja, Lonzaric Jan, Lasič Ana, Mori Jerneja, Smole Anže Tipologija 2.24 Patent 5. COBISS ID 4577562 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Molekulski mehanizem aktivacije Tollu-podobnih receptorjev pri okužbah in kroničnem vnetju ANG Molecular mechanism of activation of Toll-like receptors in infection and chronic inflammation Opis SLO Vabljeno predavanje na Letnem kongresu Avstrijskega društva za alergologijo in umunologijo. ANG Invited lecture at Annual meeting of the Austrian society for allergology and immunology (ÖGAI) Šifra B.04 Vabljeno predavanje Objavljeno v 2010; Avtorji / Authors: Jerala Roman Tipologija 3.15 Prispevek na konferenci brez natisa 9.Drugi pomembni rezultati projetne skupine8 Poleg že objavljenih rezultatov smo raziskali tudi način aktivacije citosolnih receptorjev s flagelinom. Ugotovili smo, da flagelin H. pylori ne aktivira citosolnih NLR receptorjev NAIP5 in NLRC4, kar doslej še ni bilo znano. Zato je naše cepivo učikovito tudi kot aktivator inflamasoma, ki vodi k povečanem procesiranju zlasti IL-1beta. S pripravo himernih in točkovnih mutant FlaA bomo identificirali aminokisline, ki so odgovorne za pepoznavanje citosolnega flagelina. Omenjene rezultate bomo pripravili za objavo. Rezultati raziska molekulskega mehanizma aktivacije TLR5 s flagelinom so zaključeni in rokopos bo v marcu poslan v recenzijo. Raziskava, ki je osnova priprave novega tipa cepiv je prejela Krkino nagrado za študente te več nagrad na mednarodnih znanstvenih konferencah (najboljši poster). lO.Pomen raziskovalnih rezultatov projektne skupine9 10.1.Pomen za razvoj znanosti10 SLO Okužba z bakterijo H. pylori prizadene velik delež populacije pomembno vpliva na njeno zdravje. Danes še ne poznamo učinkovitega cepiva proti tej bakteriji, čeprav bi to lahko pomenilo pomembno orožje proti boleznim povezanim z okužbo. V projektu bomo uporabili številne pomembne dosežke molekularne imunologije, hkrati pa v njem testiramo nove koncepte, ki bodo pripomogli k razumevanju delovanja imunskega sistema. Predložene raziskave bodo odgovorile na pomembna vprašanja na področjih znanosti o življenju še posebej v medicinsko pomembnih procesih. Spoznanja na področju molekulskega mehanizma aktivacije TLR so pomembna za razumevanje delovanja sistema prirojene imunosti. Predvidevamo, da bomo uspeli pojasniti molekulski mehanizem signalizacije preko TLR5. ANG Infection with the bacterium H. pylori affects a large proportion of the population have a significant effect on her health. Today there is no known effective vaccine against this bacterium, although this could represent an important weapon against diseases associated with infection. The project will use a number of important achievements of molecular immunology, while it tested new ideas that will contribute to the understanding of the immune system. The proposed research will answer important questions in the fields of life sciences especially in medically important processes. Knowledge about the molecular mechanism of TLR activation are important for understanding the functioning of innate immunity. We anticipate that we will be able to explain the molecular mechanism of signaling through TLR5. 10.2.Pomen za razvoj Slovenij« SLO Učinkovito cepivo proti bakteriji Helicobacter pylori bi bilo lahko pomembno za izboljšanje zdravja, po drugi strani pa tudi za razvoj biotehnologije v Sloveniji. Projekt ima neposredni pomen za družbo preko doseganja visokega mednarodnega nivoja znanosti in izobraževanja visoko usposobljenih kadrov, ki so najboljša naložba za razvoj gospodarstva. Razvoj inventivnih metod predstavlja z ekonomskega stališča odlično izhodišče za poslovne pobude. Iz predhodnih raziskav s področja projekta smo že vložili dve patentni prijavi. Potencialno uporabne rezultate nameravamo zaščititi s patenti, kar omogoča bodisi prodajo licence bodisi ustanovitev podjetja, ki bi te rezultate poslovno izkoristilo. Projekt vpeljuje nekaj inovativnih metod in uporabo nove tehnologije. S strokovnimi predavanji bomo seznanili strokovno javnost. Inovativen pristop pri reševanju zastavljenega problema je osnova za inovacije, ki bodo ustrezno zaščitene in kot take na voljo za prenos v gospodarstvo. V projekt nameravamo vključiti mlade raziskovalce in dodiplomske študente in s tem prispevati k povečanju števila visoko izobraženega kadra s celovitim znanjem na področju naravoslovja. ANG Effective vaccines against the bacterium Helicobacter pylori could be important for improving health, on the other hand, for the development of biotechnology in Slovenia. The project has direct relevance to society through the achievement of high level international science and education of highly qualified staff, who are the best investment for economic development. From previous research on the project, we have already submitted two patent claims. Potentially useful results we intend to protect the patents, which allows the sale or licensing or formation of an enterprise that would take advantage of these results. The project introduces some innovative methods and new technologies. We will inform the public on our results. An innovative approach to solving the problem represents a base for innovations, which will be protected and as such available for the transfer into the economy. In the project we intend to include young researchers and graduate students, thereby contributing to an increase in the number of highly qualified and skilled personnel. ll.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite, katerega od navedenih ciljev ste si zastavili pri projektu, katere konkretne rezultate ste dosegli in v kakšni meri so doseženi rezultati uporabljeni Cilj F.01 Pridobitev novih praktičnih znanj, informacij in veščin Zastavljen cilj 0 DA O ne Zastavljen cilj O da 0 ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.11 Razvoj nove storitve Zastavljen cilj O da 0 ne Rezultat d Uporaba rezultatov 1 d F.12 Izboljšanje obstoječe storitve Zastavljen cilj o da 0 ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d F.13 Razvoj novih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj 0 DA O NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti d F.14 Izboljšanje obstoječih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj O da 0 ne Rezultat d Uporaba rezultatov 1 d F.15 Razvoj novega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj o da 0 ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d F.16 Izboljšanje obstoječega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj O da 0 ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.17 Prenos obstoječih tehnologij, znanj, metod in postopkov v prakso Zastavljen cilj 0 DA O ne Rezultat Dosežen d Uporaba rezultatov V celoti d F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference) Zastavljen cilj 0 da O ne Rezultat Dosežen d Rezultat d Uporaba rezultatov d F.28 Priprava/organizacija razstave Zastavljen cilj o da 0 ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d F.29 Prispevek k razvoju nacionalne kulturne identitete Zastavljen cilj o da 0 ne Rezultat I d Uporaba rezultatov F.30 Strokovna ocena stanja Zastavljen cilj o da 0 ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.31 Razvoj standardov Zastavljen cilj o da 0 ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d F.32 Mednarodni patent Zastavljen cilj o da 0 ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d F.33 Patent v Sloveniji Zastavljen cilj 0 DA O ne Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti 3 F.34 Svetovalna dejavnost Zastavljen cilj o da 0 ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.35 Drugo Zastavljen cilj o da 0 ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d Komentar 12.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite potencialne vplive oziroma učinke vaših rezultatov na navedena področja Vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.01 Razvoj visokošolskega izobraževanja G.01.01. Razvoj dodiplomskega izobraževanja O O 0 o G.01.02. Razvoj podiplomskega izobraževanja o o o 0 G.01.03. Drugo: o o o o G.02 Gospodarski razvoj G.02.01 Razširitev ponudbe novih izdelkov/storitev na trgu o o 0 o G.02.02. Širitev obstoječih trgov o o 0 o G.02.03. Znižanje stroškov proizvodnje 0 o o o G.02.04. Zmanjšanje porabe materialov in energije 0 o o o G.02.05. Razširitev področja dejavnosti o o 0 o G.02.06. Večja konkurenčna sposobnost o o 0 o G.02.07. Večji delež izvoza 0 o o o G.02.08. Povečanje dobička 0 o o o G.02.09. Nova delovna mesta 0 o o o G.02.10. Dvig izobrazbene strukture zaposlenih o o o 0 G.02.11. Nov investicijski zagon 0 o o o G.02.12. Drugo: o o o o G.03 Tehnološki razvoj G.03.01. Tehnološka razširitev/posodobitev dejavnosti o o 0 o G.03.02. Tehnološko prestrukturiranje dejavnosti 0 o o o G.03.03. Uvajanje novih tehnologij o o 0 o G.03.04. Drugo: o o o o G.04 Družbeni razvoj G.04.01 Dvig kvalitete življenja o o 0 o G.04.02. Izboljšanje vodenja in upravljanja 0 o o o G.04.03. Izboljšanje delovanja administracije in javne uprave 0 o o o G.04.04. Razvoj socialnih dejavnosti 0 o o o G.04.05. Razvoj civilne družbe 0 o o o G.04.06. Drugo: o o o o G.05. Ohranjanje in razvoj nacionalne naravne in kulturne dediščine in 0 o o o identitete G.06. Varovanje okolja in trajnostni razvoj 0 o o o G.07 Razvoj družbene infrastrukture G.07.01. Informacijsko-komunikacijska infrastruktura 0 o o o G.07.02. Prometna infrastruktura 0 o o o G.07.03. Energetska infrastruktura 0 o o o G.07.04. Drugo: O o o o G.08. Varovanje zdravja in razvoj zdravstvenega varstva O o 0 o G.09. Drugo: o o o o Komentar 13.Pomen raziskovanja za sofinancerje12 Sofinancer 1. Naziv Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino Naslov Šlajmerjeva 6, Ljubljana Vrednost sofinanciranja za celotno obdobje trajanja projekta je znašala: 113.119 EUR Odstotek od utemeljenih stroškov projekta: 100 % Najpomembnejši rezultati raziskovanja za sofinancerja Šifra 1. Članek A.01 2. Pridobitev novih znanj in veščin F.01 3. Večja usposobljenost raziskovalno-razvojnega osebja F.03 4. Pridobitev novih znanstvenih spoznanj F.02 5. Komentar Ocena Raziskovalni projekt je bil pomemben zaradi pridobitve tehnološkega znanja za izdelavo cepiv ter za testiranje koncepta kombinacije adjuvansa in imunogena v isti molekuli, kar se je v projektu potrdilo kot uspešno, tako na ravni celičnega odiva kot tudi v in vivo eksperimentih s tvorbo protiteles in zaščito pred kolonizacijo želodca. Med izvajanjem projekta smo vpeljali več novih zahtevnih tehnik, ki jih bomo uporabili tudi pri naslednjih projektih ter pri izdelavi novih produktov. 14.Izjemni dosežek v letu 201213 14.1. Izjemni znanstveni dosežek Helicobacter pylori je bakterija, ki naseljuje želodec in dvanajstnik s čemer povzroča nastanek želodčne razjede pa tudi želodčnega raka. Danes še ne poznamo učinkovitega cepiva proti tej bakteriji, ki bi lahko preprečilo okužbo. H pylori se je v stotisočletjih sobivanja s človekom spremenila tako, da se izogiba prepoznavanju človeškega imunskega odziva. Medtem ko flagelin večine drugih bakterij sproži odziv preko receptorja TLR5 pa flagelin H.pylori ne povzroči aktivacije celic. Flagelin te bakterije smo naredili viden za človeški imunski odziv preko fuzije s fragmentom flagelina E.coli. Tako spremenjen himerni protein je aktiviral TLR5, tako kot flagelin E.coli in v miših povzročil nastanek protiteles, ki so prepoznavala flagelin H.pylori. Himerni flagelin je deloval kot adjuvans, ki aktivira naravni imunski odziv. Imunizacija miši s himernih flagelinom je pomembno zmanjšala kolonizacijo želodca s H.pylori. 14.2. Izjemni družbeno-ekonomski dosežek Patent Himerni flagelini za cepiva v katerem opusijemo pruipravo cepiva na osnovi himernega flagelina. Gre za nov pristop uporabe flagelina, ki je bil sicer že večkrat uporabljen za cepiva. V našem primeru smo flegelin uporabili tako kot adjuvant za aktivacijo TLR5 ter NAIP5 receptorjev naravne imunosti kot tudi kot imunogen, ker je flagelin H.pylori pomemben virulenčni dejavnik. c. izjave Podpisani izjavljam/o, da: • so vsi podatki, ki jih navajamo v poročilu, resnični in točni • se strinjamo z obdelavo podatkov v skladu z zakonodajo o varstvu osebnih podatkov za potrebe ocenjevanja ter obdelavo teh podatkov za evidence ARRS • so vsi podatki v obrazcu v elektronski obliki identični podatkom v obrazcu v pisni obliki • so z vsebino zaključnega poročila seznanjeni in se strinjajo vsi soizvajalci projekta Podpisi: zastopnik oz. pooblaščena oseba raziskovalne organizacije: in vodja raziskovalnega projekta: Kemijski inštitut Roman Jerala ZIG Kraj in datum: [Ljubljana 113.3.2013 Oznaka prijave: ARRS-RPROJ-ZP-2013/171 1 Opredelite raziskovalno področje po klasifikaciji FOS 2007 (Fields of Science). Prevajalna tabela med raziskovalnimi področji po klasifikaciji ARRS ter po klasifikaciji FoS 2007 (Fields of Science) s kategorijami WOS (Web of Science) kot podpodročji je dostopna na spletni strani agencije (http://www.arrs.gov.si/sl/gradivo/sifranti/preslik-vpp-fos-wos.asp). Nazaj 2 Napišite povzetek raziskovalnega projekta (največ 3.000 znakov v slovenskem in angleškem jeziku) Nazaj 3 Napišite kratko vsebinsko poročilo, kjer boste predstavili raziskovalno hipotezo in opis raziskovanja. Navedite ključne ugotovitve, znanstvena spoznanja, rezultate in učinke raziskovalnega projekta in njihovo uporabo ter sodelovanje s tujimi partnerji. Največ 12.000 znakov vključno s presledki (približno dve strani, velikost pisave 11). Nazaj 4 Realizacija raziskovalne hipoteze. Največ 3.000 znakov vključno s presledki (približno pol strani, velikost pisave 11) Nazaj 5 V primeru bistvenih odstopanj in sprememb od predvidenega programa raziskovalnega projekta, kot je bil zapisan v predlogu raziskovalnega projekta oziroma v primeru sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine v zadnjem letu izvajanja projekta, napišite obrazložitev. V primeru, da sprememb ni bilo, to navedite. Največ 6.000 znakov vključno s presledki (približno ena stran, velikost pisave 11). Nazaj 6 Navedite znanstvene dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Raziskovalni dosežek iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Nazaj 7 Navedite družbeno-ekonomske dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Družbeno-ekonomski rezultat iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Družbeno-ekonomski dosežek je po svoji strukturi drugačen kot znanstveni dosežek. Povzetek znanstvenega dosežka je praviloma povzetek bibliografske enote (članka, knjige), v kateri je dosežek objavljen. Povzetek družbeno-ekonomskega dosežka praviloma ni povzetek bibliografske enote, ki ta dosežek dokumentira, ker je dosežek sklop več rezultatov raziskovanja, ki je lahko dokumentiran v različnih bibliografskih enotah. COBISS ID zato ni enoznačen, izjemoma pa ga lahko tudi ni (npr. prehod mlajših sodelavcev v gospodarstvo na pomembnih raziskovalnih nalogah, ali ustanovitev podjetja kot rezultat projekta _ - v obeh primerih ni COBISS ID). Nazaj 8 Navedite rezultate raziskovalnega projekta iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) v primeru, da katerega od rezultatov ni mogoče navesti v točkah 7 in 8 (npr. ker se ga v sistemu COBISS ne vodi). Največ 2.000 znakov, vključno s presledki. Nazaj 9 Pomen raziskovalnih rezultatov za razvoj znanosti in za razvoj Slovenije bo objavljen na spletni strani: http://sicris.izum.si/ za posamezen projekt, ki je predmet poročanja Nazaj 10 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 11 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 12 Rubrike izpolnite / prepišite skladno z obrazcem "izjava sofinancerja" http://www.arrs.gov.si/sl/progproj/rproj/gradivo/, ki ga mora izpolniti sofinancer. Podpisan obrazec "Izjava sofinancerja" pridobi in hrani nosilna raziskovalna organizacija - izvajalka projekta. Nazaj 13 Navedite en izjemni znanstveni dosežek in/ali en izjemni družbeno-ekonomski dosežek raziskovalnega projekta v letu 2012 (največ 1000 znakov, vključno s presledki). Za dosežek pripravite diapozitiv, ki vsebuje sliko ali drugo slikovno gradivo v zvezi z izjemnim dosežkom (velikost pisave najmanj 16, približno pol strani) in opis izjemnega dosežka (velikost pisave 12, približno pol strani). Diapozitiv/-a priložite kot priponko/-i k temu poročilu. Vzorec diapozitiva je objavljen na spletni strani ARRS http://www.arrs.gov.si/sl/gradivo/, predstavitve dosežkov za pretekla leta pa so objavljena na spletni strani http://www.arrs.gov.si/sl/analize/dosez/. Nazaj Obrazec: ARRS-RPROJ-ZP/2013 v1.00 A0-CC-1F-FC-58-F6-D2-0C-D0-3A-89-47-BB-E7-82-53-9F-C9-1A-65 VEDA MEDICINA Področje: 3.01 Mikrobiologija in imunologija Dosežek: Priprava cepiva proti Helicobacter pylori na osnovi himernega proteina Mori in sod., Vaccine 2012 Helicobacter pylori je bakterija, ki naseljuje želodec in dvanajstnik s čemer povzroča nastanek želodčne razjede pa tudi želodčnega raka. Danes še ne poznamo učinkovitega cepiva proti tej bakteriji, ki bi lahko preprečilo okužbo. H pylori se je v stotisočletjih sobivanja s človekom spremenila tako, da se izogiba prepoznavanju človeškega imunskega odziva. Medtem ko flagelin večine drugih bakterij sproži odziv preko receptorja TLR5 pa flagelin H.pylori ne povzroči aktivacije celic. Flagelin te bakterije smo naredili viden za človeški imunski odziv preko fuzije s fragmentom flagelina E.coli. Tako spremenjen himerni protein je aktiviral TLR5, tako kot flagelin E.coli in v miših povzročil nastanek protiteles, ki so prepoznavala flagelin H.pylori. Himerni flagelin je deloval kot adjuvans, ki aktivira naravni imunski odziv. Imunizacija miši s himernih flagelinom je pomembno zmanjšala kolonizacijo želodca s H.pylori.