Določanje lastnosti tripsina, imobiliziranega na površino membrane iz celuloznega acetata
properties Determination of Trypsin, Immobilized on the Surface of Celullosic Acetate Membrane
A. Kranjc1, Č. Stropnik, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Maribor
Prejem rokopisa - received: 1995-10-04; sprejem za objavo - accepted for publication: 1995-12-22
l/ prispevku je opisana metoda kovaientne imobilizacije tripsina na površino asimetrične porozne membrane iz celuloznega acetata. Določene so pretočne lastnosti in debeline membrane pred imobilizacijo encima in po njej, aktivnost tripsina v raztopini in lastnosti tripsina v območju pH od 2 do 12. Potek hidrolize površine membrane smo potrdili s primerjavo ATR spektrov pred hidrolizo in po njej. Aktivnost imobiliziranega tripsina smo določili z Anson-ovo metodo in jo primerjali z aktivnostjo tripsina v raztopini.
Ključne besede: imobilizacija, membrana, tripsin, aktivnost
In this paper the method for covalent immobilization of Trypsin on the surface of asymmetric porous membrane from cellulosic acetate is described. Flux properties and thickness of the membranes before and after immobilization have been determined. Activ/ty of the Trypsin in the solution and the properties of the Trypsin in pH range from 2 to 12 have been estimated. Hydrolysis of the surface of membrane has been confirmed by comparison the ATR spectrum before and after hydrolysis. The activity of immobilized Trypsin has been determined by using Anson procedure and it has been compared vvith the activity of Trypsin in the solution.
Key vvords: immobilization, membrane, Trypsin, activity
1 Uvod
Imobilizacija je lokalizacija molekul encima v procesu katalize. Poznana je vrsta imobilizacijskih metod1,2, med katerimi je kovalentna vezava eksperimentalno najzahtevnejša.
Imobilizacija tripsina na površino membrane iz celuloznega acetata (CA) poteka v več stopnjah3. Najprej membrano površinsko hidroliziramo z NaOH (slika l.a), pri tem nastajajo hidroksilne skupine celuloze, ki so sposobne reagirati
z aktivirajočim reagentom. Kot aktivirajoči reagent uporabimo triklortriazin (TCT). Nukleofilna aromatska substitucija hidroksilne skupine z enim klorovim atomom triazinskega obroča poteče v nekaj minutah pri sobni temperaturi (slika l.b). Zamenjava drugega klorovega atoma poteče le z močnejšimi nukleofili, kot je npr. -NH2 skupina proteinov (slika l.c).
2 Eksperimentalno delo
-CHjCOOHa o)

-hcl b)
T 11
N^N
-hcl c)
"rr
Slika 1: Imobilizacija tripsina na površino membrane iz CA:
a)	hidroliza površine membrane iz CA
b)	aktivacija površine membrane s TCT
c)	kovalentna imobilizacija encima
Figure 1: Immobilization of Trypsin on the surface of CA membrane:
a)	hydrolysis of the surface of CA membrane
b)	activation of the membrane surface by TCT
c)	covalent immobilization of the enzyme
' Andreja KRANJC. dipl.ini.kera.tehn. Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerza v Mariboru 2<XX) Maribor. Smetanova 17
Imobilizacija tripsina na površino celulozno acetatne membrane
Asimetrično porozno membrano iz celuloznega acetata (CA) smo pripravili z mokrim procesom fazne inverzije4 iz raztopine CA (14,8% CA, 63% acetona, 2,3% Mg(C104)2, 19,9% H2O). Debelina nanosa je bila 0,25 mm, kot netopilo smo uporabili deionizirano vodo pri sobni temperaturi.
Površino membrane smo 30 minut hidrolizirali z 0,1 M NaOH in jo spirali s 1000 ml deionizirane vode eno uro pri sobni temperaturi. Uspešnost hidrolize smo ugotovili s primerjavo ATR spektrov površine membrane pred hidrolizo in po njej (Perkin-Elmer, model 1600 FT-IR). Nato smo površino membrane kondicionirali s topili padajoče polarnosti; uporabili smo metanol (50 ml, 20 min), butanol (50 ml, 20 min) in benzen (50 ml, 20 min).
Za aktivacijo površine membrane smo uporabili 50 ml nasičene raztopine s-triklortriazina v benzenu. Aktivacija je po-
tekala eno uro pri sobni temperaturi, nato smo membrano ponovno spirali z deionizirano vodo (1000 ml, 120 min, T = 0°C).
Na površino membrane smo ob mešanju nalili 50 ml raztopine tripsina (0,118 g/ 250 ml) v 0,001 M HC1. Reakcijo imobilizacije smo vodili eno uro, nato smo membrano spirali z deionizirano vodo dve uri (1000 ml) in z 0,09% NaCl (6 x 1000 ml) šest dni.
Določitev pretokov in debelin membran
Pretočne lastnosti membrane brez imobiliziranega encima, membrane po hidrolizi z NaOH in membrane po imobilizaciji tripsina smo izmerili v ultrafiltracijski celici (Amicon) z volumnom 350 ml pri tlaku 2 bar.
Izmerili smo tudi debeline membrane po posameznih stopnjah reakcije z merilnikom nemagnetnih prevlek na fero-magnetnih podlagah (Seltron HD 1).
Določitev pH odvisnosti aktivnosti topnega tripsina
Za določitev aktivnosti topnega tripsina v odvisnosti od pH raztopine (Anson-ova metoda5) smo uporabili naravni substrat kazein. Tripsin razgrajuje kazein na produkte, ki so topni v triklorocetni kislini in absorbirajo svetlobo pri 280 nm.
Ig kazeina smo raztopili v 100 ml puferne raztopine in segrevali na vreli vodni kopeli 15 minut. Za vrednosti pH od 1,98 do 5,02 smo uporabili pufer Britton in Robinson, za vrednosti pH od 6 do 10 Clark-Lubs-ov in za pH 11 in 12 Kolthoff-ov pufer6. K 1 ml raztopine kazeina smo dodali 1 ml raztopine
4000 3500 3000 2500 2000
tripsina v 0,001 M HC1 (c = 0,225 mg/ml) in inkubirali 20 minut pri temperaturi 35°C. Reakcijo smo prekinili z dodatkom 3 ml 5% vodne raztopine triklorocetne kisline. Nastalo oborino nerazgrajenega kazeina smo po tridesetih minutah odstranili s centrifugiranjem (20 min, 1300 obratov/min). Bistri raztopini smo izmerili absorbanco pri 280 nm (Perkin-Elmer, model 552 UV-VIS).
Določitev aktivnosti topnega tripsina pri optimalni vrednosti pH
Za določitev aktivnosti topnega tripsina pri optimalni vrednosti pH smo uporabili Anson-ovo metodo5, opisano zgoraj, le da smo raztopino kazeina pripravili v fosfatnem pufru s pH = 7,6 in da smo k 1 ml raztopine kazeina dodali 1 ml raztopine tripsina različnih koncentracij.
Določitev aktivnosti imobiliziranega tripsina
Aktivnost imobiliziranega encima smo določili z delno modificirano Anson-ovo metodo. K 5 ml raztopine kazeina smo dodali 5 cm2 membrane z imobiliziranim tripsinom. Reakcija je tekla dva dni pri 35°C. Pred njeno prekinitvijo smo membrano z vezanim encimom odstranili iz reakcijske zmesi.
3 Rezultati in diskusija
Hidroliza površine membrane je prva stopnja imobilizacije tripsina, zato je pomembno, da poteče v zadostnem obsegu. Reakcijo smo potrdili s primerjavo ATR spektrov površine CA membrane pred hidrolizo in po njej, prikazanih na sliki 2.
Pojavljanje karakterističnega traku -OH skupine pri 3371.6 cm"1 je dokaz, da je hidroliza potekla.
Primerjava pretočnih lastnosti in debelin nemodificirane membrane, membrane po hidrolizi in membrane po imobilizaciji je podana v tabeli 1.
Tabela 1: Primerjava pretokov in debelin membran Table 1: Companson of the flux and thickness of the membranes
membrana	debelina (l/m2h)	debelina (p.m)
nemodificirana	28,9	78,8
po hidrolizi	100,0	53,0
po imobilizaciji	95,2	65,7
Slika 2: ATR spektri: a) nemodificirana membrana b) membrana po hidrolizi
Figure 2: ATR spectra: a) unmodified membrane b) membrane after hydrolysis
Hidroliza površine membrane z NaOH povzroči povečanje pretokov skozi membrano in njeno stanjšanje, saj NaOH delno raztaplja CA. Proces imobilizacije tripsina nima večjega vpliva na pretočne lastnosti in debelino membrane, zato lahko pretoke skozi membrano zmanjšamo s skrajšanjem časa hidrolize.
Rezultati določitve pH odvisnosti aktivnosti tripsina so prikazani na sliki 3.
Ugotovili smo, da leži pH optimum delovanja tripsina med 7 in 8, kar se ujema s podatki iz literature7. Pri optimalni vrednosti pH smo določili aktivnost tripsina v raztopini iz umeritvene krivulje, prikazane na sliki 4, z ekstrapolacijo vrednosti na začetno hitrost reakcije.
Iz slike 4 izračunamo, da 1 mg tripsina vsebuje 0,4 TUCas aktivnostnih enot.
Iz meritev aktivnosti imobiliziranega tripsina smo ugotovili, daje tripsin, imobiliziran na 5 cm2 površine membrane iz CA, enako aktiven kot 0,56 |im tripsina v raztopim.
A (280 nm)
A (280 nm)
60 100 160 200 260 300 360 C (ug tryp»ln«/ml)
Slika 3: Aktivnost tripsina v odvisnosti od pH Figure 3: Activity of the Trypsin as a function of pH
Slika 4: Umeritvena krivulja za določitev aktivnosti tripsina Figure 4: Calibration curve for activity determination of Trypsin
4 Literatura
'O. Zaborsky: Immobilized Enzymes, CTR Press, Inc., Boca Raton, Fla„ 1973
2R. A. Messing: Immobilized Enzvmes for Industrial Reactors, Aca-demic Press, New York, 1975 3G. Kay, E. M. Crook: Coupling of enzymes to cellulose using chloro-s-triazines, Nature, 216, 1967, 524
4	D. Podvršnik: Fazno inverzne membrane iz celuloznega acetata, Magistrsko delo, Ljubljana, 1991
5	H. U. Bergmeyer, K. Gawehn: Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie Weinhein, 1975, 1056
6	Laboratorijski priročnik, SKD, Ljubljana, 1967
7	P. D. Boyer, The Enzvmes, Academic Press, New York, 1970