Strokovni prispevek/Professional article GENETSKO TESTIRANJE ZA CISTIČNO FIBROZO PRI ODRASLIH BOLNIKIH GENETIC TESTING FOR CYSTIC FIBROSIS IN ADULT PATIENTS Marina Mencinger, Mira Šilar, Mitja Košnik, Peter Korošec Klinični oddelek za pljučne bolezni in alergijo, Bolnišnica Golnik, 4204 Golnik Prispelo 2005-07-04, sprejeto 2005-12-20; ZDRAV VESTN 2006; 75: 71-7 Ključne besede recesivno avtosomno dedovanje; gen cftr; mutacije; atipična cistična fibroza Izvleček Izhodišča Metode Rezultati Zaključki Cistična fibroza (CF) je avtosomna recesivna bolezen, povzročena z mutacijami v genu, ki kodira transmembranski regulatorprotein, imenovan CFTR. Prek 1300 mutacij, dokazanih v genu, prispeva h kompleksnosti klinične slike od klasične multiorganske bolezni, ki pogosto prizadene dihala, prebavila ter spolne organe, do monosimptomatskih fenotipov. Pilokarpinska iontoforeza, ki velja za standardni diagnostični test za CF, pogosto pri atipičnih oblikah CF nima diagnostične uporabnosti. Da bi pridobili dodatni diagnostični test za potrditev diagnoze CF ter s tem omogočili primerno medicinsko oskrbo bolnikov, smo genetsko testirali 16 odraslih, pri katerihje bil postavljen klinični sum na atipično obliko CF. Po posvetu smo testirali tudi starše bolnikov, pri katerih smo posumili na homozigotno obliko mutacije. Na osebno željo ter po posvetu smo testiranje izvedli tudi pri odrasli sorojenki bolnice z dvema mutacijama zaradi ugotavljanja statusaprenašalca. Uporabili smo alelno specifičnopolimerazno verižno reakcijo (PCR) za odkrivanje 29 najpogostejših mutacij v genu cftr. Diagnozo CF smo potrdili pri 3 preiskovancih, homozigotu za AF508, ter dveh sestavljenih heterozigotih z genotipom AF508/3849+10kbC>T in AF508/R1162X. V3 primerih smo ugotovili le eno mutacijo:I148T, 2789+5G>A ter AF508 v heterozigotni obliki. Genetsko testiranje za CF je dragocen diagnostični test pri atipičnih oblikah CF. Zaradi raznolike klinične slike CF je potrebno izključiti možne diferencialne diagnoze. Če je verjetnost CF pred testiranjem velika, bi pri bolnikih, pri katerih smo našli samo eno od 29 pričakovanih mutacij, ali nismo našli nobene, morali sekvencionirati celoten gen, da bi izključili redke mutacije alipolimorfizme, ki so lahko vpleteni vpatogenezo atipične CF. Avtor za dopisovanje / Correspondence author: Marina Mencinger, Bolnišnica Golnik, Klinični oddelek za pljučne bolezni in alergijo, Golnik 36, 4204 Golnik, tel.: 04/25 69 100, faks: 04/25 69 117 CF - cistična fibroza, CFTR - transmembranski regulator cistične fibroze (cistic fibrosis transmembrane regulator), HRCT - računalniška tomografija visoke ločljivosti (high resolution computer tomography), CBAVD - kongenitalna obojestranska odsotnost semenovoda (congenital bilateral absence of vas deferens), PCR - polimerazna verižna reakcija (polymerase chain reaction), DNK - deoksiribonukleinska kislina, CT - računalniška tomografija (computer tomography), ITT - indeks telesne mase (body mass index), VC - vitalna kapaciteta, FEV1 - forsirani ekspiratorni volumen v 1. sekundi, TZKD - trajno zdravljenje s kisikom na domu, ABPA - alergijska bronhopulmonalna aspergiloza, ATP - adenosin trifosfat Key words Abstract Background Methods Results Conclusions recessive autosomal inheritance; cftr gene; mutations; atypical cystic fibrosis Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by mutations in gene encoding cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR)protein. Over 1400 mutations found in the gene contribute to the complexity of the CF phenotypes rangingfrom a classic multiorgan disease commonly involving respiratory, gastrointestinal and reproductive tract to mild and monosymptomatic presentations. Pilocarpine iontophoresis is considered as standard diagnostic test for CF, but it often fails in atypical forms of CF. In order to provide an additional diagnostic test to assure the diagnosis and provide patients with a proper medical care, we performed a genetic testing on 16 adults suspected to have atypical form of CF. Following counselling, parents of patients with possible homozygote variant of mutations were tested. On a personal request testing was also performed in an adult sibling of a patient with two known mutations to investigate possible carrier hood. The allele specific polymerase chain reaction method (PCR) was used to detect 29 most common mutations in the cftr gene. The diagnosis was proved in 3 individuals, a homozygote for AF508, and two compound heterozygotes AF508/R1162X and AF508/3849+10kbC>T. In three cases only one mutation was found: I148T, 2789+5G>A and AF508 in a heterozygote form. The genetic testing for CF is a valuable diagnostic tool in atypical forms of CF. Exclusion of possible differential diagnosis is warranted because of a variable CF phenotype. In cases where only one or no mutation was detected a necessity of whole gene sequencing is indicated to exclude rare mutations and polymorphisms that could be implicated in the pathogenesis of atypical CF. Uvod Cistična fibroza (CF) ali mukoviscidoza je kot klinična entiteta poznana že več kot 60 let (1). Prelomni kamen v diagnostiki CF je povzročila opazka, da ima koža obolelih otrok okus po slanem (2). Odkritje gena za CF l. 1989, poimenovanega cftr (cystic fibrosis transmembrane regulator), je razširilo diagnostične možnosti ter hkrati pomembno prispevalo k razumevanju patofiziologije te multiorganske avtosomno re-cesivne bolezni (3-5). Gen za CF kodira od c-AMP odvisni membranski protein CFTR, ki preko membrane celic eksokrinih žlez prevaja ione Cl ter pomembno vpliva tudi na delovanje drugih kanalov, ki urejajo prevajanje Na ter ionov HCO3 (6-9). Cftr se izraža na epi-telnih celicah dihal ter prebavil, trebušne slinavke, žolčnika, rodil, ledvic, žlez slinavk ter znojnic. V večini primerov je postavitev diagnoze CF klinična. Glavni vzrok obolevanja in umrljivosti je bolezen pljuč. Prisotni so lahko tudi simptomi in znaki bolezni prebavil, jeter in spolnih organov. Pri približno 15% bolnikov se postavi diagnoza CF šele po 10. letu starosti (10). Pri atipični CF je običajno funkcionalna okvara CFTR manjša oziroma je delež funkcionalnega proteina večji. Klinični simptomi in znaki pri atipični obliki CF so milejši, navadno se pojavijo šele v odrasli dobi in lahko zajemajo en sam organ (11). Primera sta neplodnost pri moškem kot posledica azoospermije (congenital bilateral absence of vas de-ferens-CBAVD) ali kronični pankreatitis, ki je lahko edini klinični znak pri atipični CF (12-14). K široki paleti klinične slike prispevajo poleg heterogenosti mutacij tudi polimorfizmi v genu cftr ter modificira-joči geni (15-17). Pri CF je genotip tesno povezan s fenotipom v primeru bolezni trebušne slinavke ali spolnih organov, medtem ko je povezava med genotipom ter fenotipom pri bolezni pljuč precej bolj ohlapna (18). Napoved izida bolezni glede na genotip zato ni enostavna. V pomoč so dosedanji opisi fenotipov določenega genotipa ter razvrstitev mutacij v enega od šestih muta-cijskih razredov, ki napovedujejo stopnjo funkcionalne okvare proteina. Mutacijska razreda 4 in 5 npr. napovedujeta normalno delovanje trebušne slinavke (19). Pogostost heterozigotov za cftr v populaciji kavkaške rase je dokaj visoka, saj nosi mutacijo na enem od ale-lov za cftr vsak petindvajseti, oboli pa približno 1/ 5000 novorojenih (20). Če upoštevamo te podatke, se v Sloveniji rodijo vsako leto 3 do 4 otroci s CF. Ob predpostavki, da znaša njihova povprečna življenjska doba okoli 20 let, je v skupini med 60 in 80 bolnikov (10). Daljše preživetje je rezultat zgodnejšega odkrivanja bolezni, boljše zdravstvene oskrbe ter rednega spremljanja bolnikov s strani multidisciplinarne skupine (22). Centri za CF, ki delujejo po svetu, dokazano prispevajo k daljšemu preživetju in boljši kakovosti življenja bolnikov s CF (23). Leta 1998 je bil z namenom postavitve enotnih pravil pri obravnavi bolnikov s CF sprejet dogovor o diagnostičnih merilih za postavitev diagnoze CF. Diagnoza temelji na enem ali več značilnih kliničnih znakov, pozitivni družinski anamnezi ali pozitivnem testu določanja vrednosti serumskega imunoreaktivnega tri- psina pri novorojenčkih in laboratorijskih izvidih, ki dokazujejo disfunkcijo CFTR proteina ali najmanj 2 mutaciji v genu cftr (24). Določanje koncentracije imunoreaktivnega tripsina se izvaja v nekaterih državah pri vseh novorojenih, vendar daje sorazmerno visok odstotek lažno pozitivnih ter lažno negativnih rezultatov. Za dokaz disfunkcije CFTR proteina se izvaja preiskava merjenja razlike nosnega potenciala, ki temelji na detekciji motnje sekrecije klorida v nosnih epitelnih celicah (25). Zaradi težavnosti postopka se izvaja le v posameznih visoko specializiranih centrih večinoma v raziskovalne namene. Zlati standard med diagnostičnimi testi ob sumu na CF je še vedno pilokarpinska iontofore-za, s katero merimo količino Na in Cl ionov v znoju. Pri atipičnih oblikah CF pa je izvid pilokarpinske ion-toforeze pogosto normalen ali mejen. Genetsko testiranje je omogočilo, da postavimo diagnozo CF pri vse več bolnikih z atipičnim fenotipom ter jim tako omogočimo primerno medicinsko vodenje. Predlagane so bile evropske smernice za kakovostno genetsko testiranje CF (26). Dokazovanje do sedaj ugotovljenih 1364 mutacij je zaradi dolžine gena cftr, ki znaša približno 250 kb, težavno (www. genet.sickkids.on.ca/cftr). Večina laboratorijev za CF izvaja genetsko testiranje za najpogostejše mutacije, le posamezni večji centri opravljajo testiranje celotnega gena cftr vključno s promotorjem. Najpogostejša mutacija, AF508, predstavlja 62,7% vseh mutacij v cftr v slovenski populaciji. Kljub majhni populaciji pa je heterogenost mutacij v cftr v našem prostoru dokaj visoka (27). Odkritih je bilo 18 različnih mutacij, od tega 3 nove ter 8 redkih mutacij glede na pogostost pojavljanja v Evropi (27). Namen naše raziskave je bil izvesti genetsko testiranje za 29 mutacij pri odraslih, kjer smo na podlagi kliničnih simptomov ali znakov v dihalih in prebavilih ter težav s plodnostjo posumili na atipično obliko CF (Razpr. 1). V študijo smo vključili tudi odrasle bolnike z negativnim izvidom pilokarpinske iontofore-ze, ki so jih že vodili s klinično diagnozo CF na Pediatrični kliniki. Hkrati smo želeli opisati fenotip pri opredeljenih genotipih. Materiali in metode Vsi testirani, v določenih primerih tudi družinski člani, so bili prej povabljeni na pogovor glede genetskega testiranja. Genetsko testiranje za 29 mutacij v genu cftr smo opravili pri 16 bolnikih, pri katerih smo na osnovi kliničnih simptomov ali znakov predvsem v dihalih (ponavljajoče se okužbe, najdba bronhiektazij, osamitev specifičnih patogenov v izpljunku, izvidi pljučne funkcije), nosne polipoze, simptomov in znakov v prebavilih, indeksa telesne teže ter težav s plodnostjo posumili na atipično obliko CF (Razpr. 1). Zaradi suma na homozigotno mutacijo pri dveh preiskovancih smo testiranje opravili tudi pri njunih starših ter na željo asimptomatske odrasle sorojenke zaradi morebitnega statusa prenašalca mutacij. Najmlajša bolnica je imela 18 let, najstarejša pa 73 let. DNK smo osamili iz celotne EDTA krvi z mini kitom QIAamp DNK (Qiagen, Hilden, Nemčija). Analizo smo izvedli z multipleks PCR ARMS (Amplification Refractory Mutation System) sistemom (28) z imenom Elu-cigene CF 29 (Tepnel Diagnostics, Oxfordshire, Velika Britanija). Ugotavljali smo naslednje mutacije: D1152H, 1717-1G>A, G542X, W1282X, N1303K, AF508 (hetero- in homozigot), 3849+10kbC>T, 621+1G>T, R553X, G551D, R117H, R1162X, R334W, A455E, 2183AA>G, 3659delC, 1078delT, AI507, R347P, S1251N, E60X, 3120+1G>A, 2789+5G>A, 1898+1G>A, 711+1G>T, G85E, 2184delA, I148T in R560T. Rezultati Pri treh bolnikih od 16 smo našli mutacije na obeh alelih, in sicer pri enem AF508 v homozigotni obliki ter pri dveh testiranih kombinacijo AF508 z dvema različnima mutacijama. Ta dva primera sta sestavljena heterozigota z genotipoma AF508/R1162X ter AF508/3849+10kbC>T. Pri treh bolnikih smo našli eno mutacijo, in sicer I148T, 2789+5G>A ter AF508, v heterozigotni obliki. Pri bolnikih z I148T ter 2789+5G>A smo testirali tudi starše. Mutacijo I148T smo dokazali le pri očetu preiskovanke (Sl. 1). Mutacijo 2789+5G>A smo ugotovili pri materi preiskovanke, medtem ko smo pri njenem očetu dokazali AF508 v heterozigotni obliki. Pri odrasli sorojenki bolnice z dvema mutacijama nismo našli mutacij. Pri 10 bolnikih mutacij nismo našli. Markervelikosti Size marker Sl. 1. Gel elektroforeza PCR produktov. S puščico so označeni produkti PCR, ki predstavljajo opisano mutacijo ter normalen alel. Označen je označevalec velikosti, zgornji ter spodnji kontrolni produkti PCR. Figure 1. Gel electrophoresis of the PCR products. PCR products, that represent bands corresponding to the described mutation, and a PCR band representing normal allele are indicated with arrows. Size marker, large and small control PCR bands are indicated. Razpr. 1. Vključitvena merila za testiranje ter rezultati genetskega testiranja za CF. PI -pilokapinska iontoforeza, B - bronhiektazije, RI - respiratorni infekti, patogeni-patogeni v sputumu, NP - nosna polipoza, ITT - indeks telesne teže, eks. in end. IP - eksokrina in endokrina insuficienca trebušne slinavke, PA - Pseudomonas aeruginosa, SA - Staphylococcus aureus, AF - Aspergillus fumigatus, SP - Streptococcus pneumoniae, HI - Haemophillus influenzae, KO - Klebsiella ozaenae, ? - ni poznano. Table 1. Inclusion criteria for genetic testing and the results of genetic testing for CF. PI - sweat chloride test, B - bronhiectasis, RI - respiratory infections, pathogens - pathogens in sputum, NP -nasal polyposis, ITT- body mass index, eks. and end. IP - exocrine and endocrine pancreatic insufficiency, PA - Pseudomonas aeruginosa, SA - Staphylococcus aureus, AF - Aspergillus fumigatus, SP - Streptococcus pneu- moniae, HI - Haemophillus influenzae, KO - Klebsiella ozaenae, ? - not known. Št. Leto rojstva Spol PI RI B Patogeni Respiratorni volumen NP Gastrointestinalni znaki ITT Neplodnost Mutacije No. Year of birth Gender PI RI B Pathogens Respiratory volume NP Gastrointestinal signs ITT Infertility Mutation 1 1968 Ž F neznano unknown da yes da yes PA FEV1 85%, VC 100% da yes eks. IP, jetrna steatoza eks. IP, liver steatosis znižan reduced ? AF508 homozigot 2 1981 Ž F neg. da yes da yes PA FEV1 29%, VC 58% da eks. in end. IP, steatoza jeter eks and end. IP, liver steatosis znižan reduced ? AF508 heterozigot / R1162X 3 1980 Ž F neg. da yes da yes PA FEV1 49%, VC 67% da yes ne no primeren adequate ? AF508 heterozigot, 3849+10kbC>T 4 1978 M M neg. da yes da yes SA FEV1 36%, VC 65% ne no jetrna steatoza, eks. in end. IP liver steatosis, eks. and end. IP znižan reduced ? AF508 heterozigot 5 1955 Ž F neg. da yes da yes PA FEV1 21%, VC 31% da yes akutni holecistitis acute holecystitis primeren adequate da yes I148T 6 1987 Ž F neg. da yes da yes AF ni opravila not done ne no ne no znižan reduced ? 2789+5G>A 7 1951 M M neg. da yes da yes PA, HI FEV1 1150, VC 39% ne no ne no znižan reduced ne no neg 8 1962 M M ni opravil not done da yes da yes KO, SP FEV1 58%, VC 50% da yes ne no primeren adequate da yes neg 9 1980 Ž F neg. da yes da yes HI FEV1 37%, VC 49% ne no ne no znižan reduced ? neg 10 1954 Ž F neg. da yes da yes PA FEV1 95%, VC 81% ne no ne no primeren adequate ne no neg 11 1971 Ž F mejen borderline da yes da yes brez no FEV1 99%, VC 90% ne no Mb. Crohn, žolčni kamni Mb. Crohn, gallblader stones primeren adequate ? neg 12 1932 Ž F ni opravila not done da yes da yes HI, PA FEV1 42%, VC 50% ne no steatoza jeter liver steatosis primeren adequate ne no neg 13 1957 Ž F ni opravila not done da yes ne no brez no FEV1 76%, VC 83% ne no ne no primeren adequate ne no neg 14 1964 Ž F ni opravila not done da yes ne no PA FEV1 94%, VC 106% ne no ne no primeren adequate ne no neg 15 1965 Ž F ni opravila not done da yes da yes HI FEV1 47%, VC 63% da yes ne no primeren adequate ? neg 16 1985 Ž F neg. da yes da yes HI FEV1 110%, VC 84% ne no ne no primeren adequate ne no neg T (Sl. 1). Mutacija 3849+10kbC>T doslej v slovenski populaciji v literaturi še ni bila zabeležena, pogosto pa se pojavlja v Litvi, na Poljskem ter v Izraelu (30). Mutacija leži v intronu 19 ter ustvarja mesto za nepravilno izrezovanje eksona 19. Bolniki s to mutacijo imajo praviloma lažjo obliko bolezni, kar se ujema s sorazmerno blagimi simptomi pri naši bolnici, ki je bila prvič obravnavana v bolnišnici pri 16 letih (31). V ospredju je bolezen pljuč z zmernim upadom pljučne funkcije (FEV1 49%). Indeks telesne mase je primeren. Zaradi morebitnega statusa prenašalca smo testirali tudi sorojenko preiskovanke. Genetsko testiranje za CF se lahko izvede na željo odraslih sorojencev bolnikov z znanimi mutacijami v genu cftr ter njihovih partnerjih po genetskem svetovanju (26). Verjetnost CF pri otroku staršev, od katerih je eden prenašalec mutacije v cftr, drugi pa »ne«, je ob občutljivosti genetskega testa 80%, približno 1/100 (26). Če pa sta oba partnerja heterozigota, je verjetnost, da otrok podeduje mutirani gen cftr od obeh staršev, kar 1/4. Pri 23-letni bolnici s kliničnim sumom na CF ter z negativnim izvidom iontoforeze smo ugotovili dve različni mutaciji, in sicer AF508 v kombinaciji z R1162X. Mutacija R1162X je nesmiselna mutacija, kjer preide do zamenjave arginina s kodonom stop, kar povzroči skrajšanje proteina (32). Pri bolnici je bila prisotna eksokrina ter endokrina insuficienca trebušne slinavke, kar je v skladu z opažanjem, da R1162X v homozi-gotni obliki povzroča hudo insuficienco trebušne slinavke. V nasprotju s tem pa naj bi R1162X v homozi-gotni obliki povzročala le lažjo do zmerno bolezen pljuč (33). Bolnica je nekaj mesecev po testiranju umrla zaradi neobvladane okužbe v pljučih s posledično multiorgansko odpovedjo. Ker so bila pljuča pri bolnici hudo prizadeta (FEV1 29%), sklepamo, da je AF508 v kombinaciji z R1162X pomembna pri patogenet-skem razvoju dihal. Pri treh bolnikih smo našli mutacijo le na enem alelu ter s tem nakazali potrebo po nadaljnjih raziskavah za potrditev diagnoze CF. Ugotovitev AF508 v heterozigotni obliki pri 26-letnem bolniku z negativnim izvidom pilokarpinske iontofo-reze ne zadošča, čeprav je nujna potrditev diagnoze zaradi možne transplantacije pljuč. Transplantacija pljuč je uveljavljena terapevtska možnost pri bolnikih s hudo napredovalo stopnjo CF. Glede na statistične podatke »International Society for Heart and Lung Transplantation« znaša 3-letno preživetje bolnikov s CF po transplantaciji pljuč 66% (34). Pri 18-letni bolnici z bronhiektazijami, ki se je zadnje pol leta zdravila zaradi dolgotrajne okužbe dihal, smo ugotovili mutacijo 2789+5G>A. Mutacija povzroči napačno prevajanje proteina. Pogosto se pojavlja v južni Evropi, kjer so jo našli v nekaj primerih tudi v homozigotni obliki (35). Z namenom, da bi ugotovili morebitno homozigotno stanje mutacije, smo testirali tudi starše. Mutacijo 2789+5G>A smo našli pri materi, pri očetu pa AF508 v heterozigotni obliki. Glede na to, da sta starša brez simptomov, ni verjetno, da bi preiskovanka podedovala dodatno mutacijo, ki je z izvedenim testom tudi nismo našli. Verjetnost, da bolnica nosi mutacijo »de novo«, ki je s testom nismo našli, je prav tako minimalna. Izvid pilokarpinske ionto-foreze ni pokazal odstopanj od normale. Z dodatnimi preiskavami smo pri preiskovanki potrdili ABPA. Pri sorojencih, bratu in sestri, ki se vrsto let vodita na naši kliniki zaradi ponavljajočih se okužb dihal, hude funkcionalne prizadetosti dihal ter imata kronično re-spiracijsko insuficienco, smo ugotovili mutacijo I148T pri sestri ter njenem očetu, medtem ko pri bratu mutacij nismo našli (Sl. 2). Nenavadno je, da ima bolnik potomca, kajti CBAVD je opisana pri kar 95% moških s CF (36). Mutacija I148T, kjer pride do zamenjave izo-levcina s treoninom na mestu 148, je bila sprva opisana kot mutacija, ki povzroča v homozigotni obliki težjo klinično sliko (37). Kasnejša literatura navaja, da se I148T pojavlja pogosteje pri asimptomatskih družinskih članih kot pa pri bolnikih s CF, kar postavlja dvom o vlogi I148T kot mutacije (38). Nadalje je I148T pomemben pri patogenezi CF le v cis (spremembi na istem kromosomu) navezi s c3199del6 ali s c3395_3396insA (39, 40). Avtorji nedavne študije pa so dokazali, da c3199del6 ter c3395_3396insA nastopata kot mutaciji lahko tudi samostojno ter menijo, da je I148T verjetno le polimorfizem (41). Vloga I148T v genu cftr pri bolnici ostaja nepojasnjena. Pri 10 bolnikih nismo dokazali nobene od 29 testira-nih mutacij, kar pa diagnoze CF ne izključuje. Ob retrogradni analizi popisov teh bolnikov smo ugotovili, da sta 2 bolnika že imela dokazan deficit IgG oziroma IgA, kar pojasnjuje njuno klinično stanje (št. 9 in 15 v razpredelnici 1). Pri dveh bolnicah (št. 6 in 13 v razpredelnici 1) smo ugotovili ABPA, pri kateri so sicer opisali povečano število mutacij v genu cftr, vendar vloga teh mutacij pri patofiziologiji ABPA ni jasna (42, 43). Potrebno pa je vedeti, da je ABPA pogost zaplet CF (44). Ugotavljamo, da je bil glavni razlog za negativni rezultat genetskega testiranja raznolikost klinične slike pri CF ter zato večja verjetnost diferencialnih diagnoz. Dodatno pa bi negativni rezultat lahko pojasnili tudi z dejstvom, da so atipične oblike CF, ki jih odkrivamo v odrasli dobi, pogosteje povezane z redkimi mutacijami, ki morda niso zajete v panel 29 mutacij, za katere testiramo (11). Pri bolnikih s kliničnim sumom na CF, pri katerih mutacij nismo našli in pri katerih smo izključili možnost drugih diferencialnih diagnoz, kot so npr. imunodeficenca ali okvara ciliarnega aparata, je zato smiselno testiranje celotne sekvence gena, vključno s promotorjem (26). Glede na rezultate dosedanjih študij o pogostosti mutacij v genu cftr v slovenski populaciji in sosednjih državah je ocenjena občutljivost testa CF 29 med 80 in 85% (28, 30). Občutljivost testa je manjša pri atipičnih oblikah CF, ki so pogosteje vezane na redkejše mutacije, za katere pa ne testiramo (11). V naši študiji nismo zajeli 3 mutacij, ki so specifične za slovensko populacijo in predstavljajo po pogostnosti vsaka po 1% (27, 46-47). Glede na ta odstotek bi bilo smiselno, da jih v prihodnje uvrstimo v testni panel poleg ostalih 29 mutacij. Zaključki Genetsko testiranje je pomembna diagnostična pridobitev za postavitev diagnoze CF. Za testiranje se odločamo pri osebah z negativno ali mejno vrednostjo pilokarpinske iontoforeze, pri sumu na atipično CF, ki se pogosto pokaže šele pri odraslih s simptomatiko v dihalih in prebavilih ali s težavami pri plodnosti. Zaradi raznolike klinične slike CF je potrebno izključiti možne diferencialne diagnoze. Če je pred testiranjem verjetnost CF pri bolnikih, pri katerih smo našli samo eno ali nismo našli nobene od 29 testiranih mutacij, velika, bi morali sekvencionirati celoten gen za izključitev redkih mutacij ali polimorfizmov, ki so lahko vpleteni v patogenezo atipične CF. Literatura 1. Andersen D. Cystic fibrosis of the pancreas and its relation to celiac disease: a clinical and pathological study. Am J Dis Child 1938; 56: 344-9. 2. Sant'Agnese PD, Darling R, Perera G, Sheamias E. Abnormal electrolytic composition of sweat in cystic fibrosis of the pancreas: clinical signification and relationship to disease. Pediatrics 1953; 12: 549-63. 3. Rommens JM, Iannuzzi MC, Kerem B, Drumm ML, Melmer G, Dean M, et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science 1989; 245: 1059-65. 4. Riordan JR, Rommens JM, Kerem B, Alon N, Rozmahel R, Grzel-czak Z, et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science 1989; 245: 1066-73. 5. Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A, et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science 1989; 245: 1073-80. 6. Reddy MM, Quinton PM. cAMP-independent phosphorylation activation of CFTR by G proteins in native human sweat duct. Am J Physiol Cell Physiol 2001; 280: C604-13. 7. Choi JY, Lee MG, Ko S, Muallem S. Cl(-)-dependent HCO3- transport by cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. JOP 2001; 2: 243-6. 8. Konig J, Schreiber R, Voelcker T, Mall M, Kunzelmann K. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) inhibits ENaC through an increase in the intracellular Cl-con-centration. EMBO Rep 2001; 2: 1047-51. 9. Kunzelmann K, Schreiber R, Boucherot A. Mechanisms of the inhibition of epithelial Na(+) channels by CFTR and purinergic stimulation. Kidney Int 2001; 60: 455-61. 10. Cystic Fibrosis Foundation. Patient Registry 2000 Annual Report. Bethesda: Cystic Fibrosis Foundation. 2001. 11. Gilljam M, Ellis L, Corey M, Zielenski J, Durie P, Tullis DE. Clinical manifestations of cystic fibrosis among patients with diagnosis in adulthood. Chest 2004; 126: 1215-24. 12. OckengaJ, Stuhrmann M, Ballmann M, Teich N, Keim V, Dork T, et al. Mutations of the cystic fibrosis gene, but not cationic try-psinogen gene, are associated with recurrent or chronic idiopathic pancreatitis. Am J Gastroenterol 2000; 95: 2061-7. 13. Gross V, Schoelmerich J, Denzel K, Gerok W. Relapsing pancreatitis as initial manifestation of cystic fibrosis in a young man without pulmonary disease. Int J Pancreatol 1989; 4: 221-8. 14. Chillon M, Casals T, Mercier B, Bassas L, Lissens W, Silber S, et al. Mutations in the cystic fibrosis gene in patients with congenital absence of the vas deferens. N Engl J Med 1995; 332: 1475-80. 15. Dork T, Wulbrand U, Richter T, Neumann T, Wolfes H, Wulf B, et al. Cystic fibrosis with three mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Hum Genet 1991; 87: 441-6. 16. Chu CS, Trapnell BC, Curristin S, Cutting GR, Crystal RG. Genetic basis of variable exon 9 skipping in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator mRNA. Nat Genet 1993; 3: 151-6. 17. Rozmahel R, Wilschanski M, Matin A, Plyte S, Oliver M, Auerbach W, et al. Modulation of disease severity in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator deficient mice by a secondary genetic factor. Nat Genet 1996; 12: 280-7. 18. Welsh MJ, Smith AE. Cystic fibrosis. Sci Am 1995; 273: 52-9. 19. Haardt M, Benharouga M, Lechardeur D, Kartner N, Lukacs GL. C-terminal truncations destabilize the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator without impairing its biogenesis. A novel class of mutation. J Biol Chem 1999; 274: 21873-7. 20. Dodge JA, Morison S, Lewis PA, Coles EC, Geddes D, Russell G, et al. Incidence, population, and survival of cystic fibrosis in the UK, 1968-95. UK Cystic Fibrosis Survey Management Committee. Arch Dis Child 1997; 77: 493-6. 21. Khoury MJ, McCabe LL, McCabe ER. Population screening in the age of genomic medicine. N Engl J Med 2003; 348: 50-8. 23. Mahadeva R, Webb K, Westerbeek RC, Carroll NR, Dodd ME, Bilton D, et al. Clinical outcome in relation to care in centres specialising in cystic fibrosis: cross sectional study. BMJ 1998; 316: 1771-5. 24. Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis a consensus statement. Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr 1998; 132: 589-95. 25. Middleton PG, Geddes DM, Alton EW. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. Eur Respir J 1994; 7: 2050-6. 26. Dequer E, Cuppens H, Dodge J, Estivill X, Goossens M, Pignatti PF, et al. The recommendations for qualitz improvement in genetic testing for cystic fibrosis European Concerted Action on Cystic Fibrosis. Eur J Hum Gen 2000; 8: S2-S24. 27. Vouk K, Strmecki L, Liovic M, Kopriva S, Micetic-Turk D, Komel R. Mutational analysis of 30 Slovenian cystic fibrosis patients compared to known Slovenian and European CF mutation spectra. Pflugers Arch 2000; 439: R63-5. 28. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, et al. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res 1989; 17: 2503-16. 29. Kerem E, Corey M, Kerem BS, Rommens J, Markiewicz D, Levi-son H, et al. The relation between genotype and phenotype in cystic fibrosis—analysis of the most common mutation (delta F508). N Engl J Med 1990; 323: 1517-22. 30. Estivill X, Bancells C, Ramos C. Geographic distribution and regional origin of 272 cystic fibrosis mutations in European populations. The Biomed CF Mutation Analysis Consortium. Hum Mutat 1997; 10: 135-54. 31. Dugueperoux I, De Braekeleer M. The CFTR 3849+10kbC->T and 2789+5G->A alleles are associated with a mild CF phenotype. Eur Respir J 2005; 25: 468-73. 32. Wong LJ, Wang J, Bowman CM. Two novel frame shift mutations of CFTR causing null alleles in a patient with a severe course of CF. Am J Med Genet 2001; 102: 389-90. 33. Gasparini P, Borgo G, Mastella G, Bonizzato A, Dognini M, Pi-gnatti PF. Nine cystic fibrosis patients homozygous for the CFTR nonsense mutation R1162X have mild or moderate lung disease. Med Genet 1992; 29: 558-62. 34. Taylor DO, Edwards LB, Boucek MM, Trulock EP, Deng MC, Keck BM, et al. Registry of the International Society for Heart and Lung. Transplantation: twenty-second official adult heart transplant report—2005. J Heart Lung Transplant 2005; 24: 945-55. 35. Kilinc MO, Ninis VN, Tolun A, Estvill X, Casals T, Savov A, et al. Genotype-phenotype correlation in three homozygotes for cystic fibrosis mutation 2183AA>G shows severe phenotype. J Med Genet 2000; 37: 307-9. 36. Dodge JA. Male infertility in cystic fibrosis. Lancet 1995; 346: 587. 37. Bozon D, Zielenski J, Rininsland F, Tsui LC. Identification of 4 new mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene: I148T, L1077P, Y1092X, 2183AA—>G. Hum Mutat 1994; 3: 330-2. 38. Strom CM, Huang D, Buller A, Redman J, Crossley B, Anderson B, et al. Cystic fibrosis screening using the College panel platform comparison and lessons learned from the first 20,000 samples. Genet Med 2002; 4: 289-96. 39. Monaghan KG, Highsmith WE, Amos J, Pratt VM, Roa B, Friez M, et al. Genotype-phenotype correlation and frequency of the 3199del6 cystic fibrosis mutation among I148T carriers: results from a collaborative study. Genet Med 2004; 6: 421-5. 40. Rohlfs EM, Zhou Z, Sugarman EA, Heim RA, Pace RG, Knowles MR, et al. The I148T CFTR allele occurs on multiple haplotypes a complex allele is associated with cystic fibrosis. Genet Med 2002; 4: 319-23. 41. Claustres M, Altieri JP, Guittard C, Templin C, Chevalier-Porst F, Des Georges M. Are p.Il48T, p.R74W and p.D1270N cystic fibrosis causing mutations? BMC Med Genet 2004; 5: 19. 42. Miller PW, Hamosh A, Macek M Jr, Greenberger PA, MacLean J, Walden SM, et al. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene mutations in allergic bronchopulmonary aspergillosis. Am J Hum Genet 1996; 59: 45-51. 43. Marchand E, Verellen-Dumoulin C, Mairesse M, Delaunois L, Brancaleone P, Rahier JF, et al. Frequency of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations and 5T alle-le in patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis. Chest 2001; 119: 762-7. 44. Mastella G, Rainisio M, Harms HK, Hodson ME, Koch C, Navarro J, et al. Allergic bronchopulmonary aspergillosis in cystic fibrosis. A European epidemiological study. Epidemiologic Registry of Cystic Fibrosis. Eur Respir J 2000; 16: 464-71. 45. Audrezet MP, Canki-Klain N, Mercier B, Bracar D, Verlingue C, Ferec C. Identification of three novel mutations (457 TAT—>G, D192G, Q685X) in the Slovenian CF patients. Hum Genet 1994; 93: 659-62. 46. Glavac D, Ravnik-Glavac M, Dean M. Identification of a rare cystic fibrosis mutation (S4X) in a Slovenian population. Hum Mol Genet 1993; 2: 315-6. 47. Ravnik-Glavac M, Glavac D, Komel R, Dean M. Single-stranded conformation polymorphism analysis of the CFTR gene in Slovenian cystic fibrosis patients detection of mutations and sequence variations. Hum Mutat 1993; 2: 286-92.