78 1 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana 2 Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo, Večna pot 111, SI-1000 Ljubljana * Corresponding author: E-mail address: luka.biteznik@bf.uni-lj.si Citation: Biteznik, L., Dermastia, M., Trdan, S. (2023). Secondary metabolites of hemp (Cannabis sativa L.) and their role in defence against pests and pathogens. Acta Biologica Slovenica 66 (1) https://doi.org/10.14720/abs.66.1.12521 This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY SA) license Review Article Sekundarni metaboliti v navadni konoplji (Cannabis sativa L.) in njihova vloga pri obrambi rastline pred škodljivci in patogeni Luka Bitežnik 1,*, Marina Dermastia 2, Stanislav Trdan 1 Izvleček Navadna konoplja (Cannabis sativa L.) je razširjena rastlina z zapleteno fitokemijo in bogatim sekundarnim metabolizmom. Sekundarni metaboliti so snovi, katerih vloga je interakcija rastline z okoljem. Njihova sinteza je pogojena s prisotnostjo stresa in je energetsko zelo potratna. Rastline varujejo pred škodljivci in patogeni ter abiotskimi dejavniki. V konoplji so v največji meri prisotni kanabinodi, terpenodi in flavonoidi, skoncentrirani v socvetjih ženskih rastlin. Njihova ekološka vloga in delovanje ni povsem raziskano. Kanabinoidi Δ-9-trans-tetrahidrokanabinol (Δ9-THC), kanabidiolna kislina (CBDA) in drugi naj bi bili vpleteni v antioksidativne procese in obrambni sistem rastline, zaradi prostorsko izolirane sinteze in citotoksičnih stranskih produktov. Ob prisotnosti stresa pride do povečanja njihove vsebnosti in spremembe kemijskega profila. Stres aktivira stresne signalne molekule – jasmonsko kislino in njene derivate, ki vplivajo na sproščanje terpenodiov, ter poveča izražanje genov v fenilpropanoidni poti, ki je ključna za sintezo flavonoidov. Sekundarni metaboliti delujejo sinergično in v povezavi z mikrobiomom – endofitnimi bakterijami in glivami – negativno vplivajo na škodljive organizme ter varujejo rastlino. Ključne besede Cannabis sativa L, flavonoidi, kanabinoidi, navadna konoplja, terpenoidi, patogeni, škodljivci 79 Acta Biologica Slovenica, 2023, 66 (1) Secondary metabolites of hemp (Cannabis sativa L.) and their role in defence against pests and pathogens Abstract Hemp (Cannabis sativa L.) is a globally distributed plant with a complex phytochemistry. Secondary metabolism is extremely rich. Secondary metabolites are substances whose role is the interaction of the plant with the environment. Their synthesis depends on the presence of stress and is very energy-consuming. They protect plants from pests and pathogens, as well as from abiotic factors. Cannabinoids, terpenoids and flavonoids are the predominant substances concentrated in the inflorescences of female plants. Their ecological role and function are not yet fully understood. The cannabinoids Δ-9-trans-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC), cannabidiolic acid (CBDA), and others probably act as antioxidants, and based on their spatially isolated synthesis and cytotoxic by- products, they are thought to be involved in the plant’s defense system. Under stress, their content increases and the chemical profile changes. Stress activates stress signalling molecules - jasmonic acid and its derivatives, which affect the release of terpenoids, and increases the expression of genes in the phenylpropanoid pathway, which is crucial for the synthesis of flavonoids. Secondary metabolites act synergistically and in conjunction with the microbiome - endophytic bacteria and fungi - have a negative effect on harmful organisms and protect the plant. Keywords cannabinoids, Cannabis sativa L, hemp, flavonoids, pests, pathogens, terpenoids Uvod Navadna konoplja (Cannabis sativa L.) je zelo razširjena rastlina na naravnih rastiščih, ki ji ustrezajo. Izvirala naj bi iz območij centralne in jugovzhodne Azije, od koder se je razširila po vsem svetu (Schultes in sod. 1974). Konoplja je vsestransko uporabna v tekstilni industriji in gradbeništvu zaradi hitre rasti in visoke vsebnosti celuloze ter lesnih vlaken. Ker pa vsebuje veliko bioaktivnih snovi – ras- tlinskih sekundarnih metabolitov z biološkim učinkom v človeškem telesu, je že tisočletja del vzhodnjaških kultur in je vse bolj cenjena tudi v farmacevtski industriji in medicini (Andre in sod. 2016). Pripravke iz konoplje danes uporabljamo za lajšanje kroničnih in nevropatskih bolečin ter bolezenskih znakov, ki se pojavljajo pri obole- losti z rakom, multiplo sklerozo, Parkinsonovo, Crohnovo boleznijo, številnimi psihičnimi motnjami in drugimi boleznimi (Hill 2015). Pripravki so se izkazali za učinkovite tudi pri zmanjševanju slabosti in stimulaciji apetita v primeru obolelosti s HIV-om (Woolridge in sod. 2005). Sekundarni metaboliti rastlinam omogočajo interak- cije z okoljem in s tem pomagajo pri njihovem preživetju (Yazaki 2004). Vključeni so v obrambne mehanizme pred biotičnimi in abiotičnimi dejavniki, kot je UV-B sevanje, ter tudi v komuniciranje med samimi rastlinami (Schafer in Wink 2009). V splošnem velja, da so rastline z višjo vsebnostjo sekundarnih metabolitov odpornejše, vendar je proizvodnja teh snovi energetsko zelo potratna. To vpliva na rast in razvoj rastline, zato je povečana sinteza pogojena s prisotnostjo stresa. Rastline so razvile kom- pleksne obrambne sisteme, v katerih biotični ali abiotični stresni dejavniki sočasno vplivajo na številne signalne in odzivne poti. Obrambni sistemi omogočajo rastlini odkrivanje patogena in tudi sprožitev tarčne obrambe (Zaynab in sod. 2018). Kljub številnim raziskavam sekundarnih metabolitov konoplje in njihovih učinkov na ljudi, je podatkov o vlogi teh snovi v biotičnem stresu in dejanskem ekološkem pomenu dokazanega protimikrobnega delovanju sekund- arnih metabolitov iz konoplje zelo malo. V tem pregledu smo te skope informacije zbrali. Obrambni sistem konoplje Obrambni sistem konoplje vključuje fizično in kemijsko obrambo. Fizično rastlinske dele ščitijo trihomi; med njimi je največ žleznih. Žlezne votline žleznih trihomov (slika 1) 80 Acta Biologica Slovenica, 2023, 66 (1) so občutljive na dotik in se zlahka poškodujejo ter na listno površino izločijo sekundarne metabolite – kanabinoide in terpenoide. Te spojine oksidirajo in polimerizirajo v smolo, ki mehansko in kemijsko prepreči napad škodljivca (Potter 2009). Bogat terpenski profil in intenzivne arome delujejo repelentno na številne škodljivce (Pate 1994). V kombinaciji s sekundarnimi metaboliti, kot dodatna mehanska prepreka škodljivcem delujejo na listni površini prisotni posebni trihomi – cistolitni laski (slika 1 B) (Glatt- stein in Gorski 2001). Cistolitni laski so mikroskopsko majhni, močno silificirani kristali kalcijevega karbonata, ki ovirajo mobilnost manjšim herbivorom, večjim pa poško- dujejo ustni aparat (Levin 1973). Fitokemija konoplje je zelo zapletena in zajema več kot 480 spojin (ElSohly in Slade 2005) iz različnih kemičnih skupin. Nekatere spojine so primarni metaboliti, vendar je večina sekundarnih. Med slednjimi so najpogostejši kanabi- noidi, terpenoidi, flavonoidi, stilbenoidi, lignani in alkaloidi. Njihova koncentracija v rastlinskem tkivu je pogojena z delom rastline, starostjo rastline, sorto, okoljskimi dejavniki in agrotehničnimi ukrepi (Keller in sod. 2001). Prevladujoči sekundarni metaboliti v navadni konoplji in njihova interakcija z okoljem Kanabioidi Kanabinoidi so skupina terpenofenolnih spojin, sestavljeni iz 21 ogljikovih atomov in so v rastlini prisotni v obliki kar- boksilne kisline. V rodu Cannabis so najpogosteje zasto- pana skupina sekundarnih metabolitov (Głodowska 2016), saj jih več kot 100 različnih. Med njimi je najbolj raziskan Δ-9-trans-tetrahidrokanabinol (Δ9-THC). Pri sesalcih Slika 1. Vrste žleznih in nežleznih trihomov na rastlinah konoplje. (A) Enocelični nežlezni trihom; (B) cistolitni laski; (C) »glavasti sedeči« (angl. capitate-sessile) trihom (D) »pecljati glavasti« (angl. capitate-stalked) trihom; (E) »preprost čebulni« (angl. simple bulbous) trihom; (F) »kompleksen čebulasti« (angl. complex bulbous) trihom (Andre in sod. 2016). Figure 1. Types of glandular and non-glandular trichomes on cannabis plants. (A) Unicellular non-glandular trichome; (B) cystolitic hairs; (C) “capitate-sessile” trichome (D) “capitate-stalked” trichome; (E) “simple bulbous” trichome; (F) “complex bulbous” trichome (Andre et al. 2016). 81 Acta Biologica Slovenica, 2023, 66 (1) Δ9-THC ob zaužitju povzroča psihoaktivne učinke, zato je v večini držav po svetu prepovedan (Whiting in sod. 2015). Najpogosteje prisotni kanabinoidi oziroma fitokanabinoidi v rastlini so tetrahidrokanabinolna kislina (THCA), kana- bidiolna kislina (CBDA), kanabigerolna kislina (CBGA), kanabinolna kislina (CBNA), kanabikromeska kislina (CBCA) in kanabikiklolna kislina (CBLA) (Jin in sod. 2020). Vsi kanabinoidi imajo pomembno vlogo pri obrambi rastline pred škodljivci, patogeni in abiotičnimi dejavniki (McPartland in sod. 2000; Pate 1994). V rastlini so kanabinoidi nakopičeni predvsem v žleznih votlinah trihomov (slika 1. C-F) na ženskih socvetjih (Whiting in sod. 2015; Tanney in sod. 2021). Vsebnost kanabinoidov v socvetjih konoplje je odvisna od genetske osnove rastline, mineralne prehrane, osvetlitve, relativne zračne vlage in časa vzorčenja (Keller 2001). Njihova vsebnost in razmerja se močno spreminjajo glede na rastlinsko tkivo in se razlikujejo tudi na podlagi geografskega porekla rastline (Hemphill in sod. 1980). V neoprašenih ženskih socvetjih dosegajo vsebnosti do 21 % suhe mase socvetja, medtem ko je vsebnost v listih lahko le 0,3 % (Richins in sod. 2018). Rastline iz severnih območji imajo višje vsebnosti Δ9-THC in CBD, kar lahko pojasnimo z ostrejšimi podnebnimi razmerami (Leizer in sod. 2000). Poleg tega je vsebnost Δ9-THC v primerjavi s CBD višja pri rastlinah, ki rastejo bližje ekvatorju, zato naj bi Δ9-THC med drugim rastlino ščitil pred UV žarki. Δ9-THC je viskozna hidrofobna in nizko hlapna snov, ki v povezavi z drugimi kanabinoidi in terpeni tvori voskom podobne snovi. Te imajo številne funkcije, med katerimi je tudi omejitev transpiracije in izgube vode v suhih rastnih razmerah (Pate 1994). Okoljski dejavniki povzročajo v rastlini oksidativen stres, ki ga uravnavajo antioksidanti in njihovi encimi. Pri varovanju celic pred reaktivnimi kisikovimi spojinami so najpomembnejši tokoferoli, fenoli, superoksid dismutaza, askorbat peroksidaza in katalaza. Reaktivne kisikove spojine vplivajo na biokemijo kanabinoidov, zato pred- videvamo, da so kanabinoidi vpleteni v antioksidativne procese. Prosti radikali in hidroksilirani intermediati sodelujejo pri oksidaciji nevtralne in kislinske oblike Δ9-THC v nevtralno in kislinsko obliko CBN ali Δ8-THC (Flores-Sanchez in Verpoorte 2008). Specifično mesto skladiščenja kanabinoidov v žleznih trihomih na površini rastline kaže še na drugo vlogo v rastlini, kar so potrdili Sirikantaramas in sodelavci leta 2005. Stranski produkt THCA-sintaze in oksidacije CBGA je vodikov peroksid, ki nastaja v velikih količinah. THCA in vodikov peroksid sta za rastlinske celice toksična, zato se THCA-sintaza izloča iz sekretornih celic v žlezne votline. Prostorsko izolirana biosinteza prepreči poškodbo celic. V žleznih trihomih poteka sinteza tudi drugih kanabinoidov, kot na primer izomer CBDA in CBCA, kar bi lahko pomenilo vključenost kanabinoidov v obrambnem mehanizmu rastline (Taura in sod. 1996). Terpenoidi Terpenoidi so spojine, ki vključujejo terpene in njihove oksigenirane derivate. Terpeni imajo skupaj z drugimi sekundarnimi metaboliti pomembno vlogo v obrambnem sistemu rastline pred škodljivci in patogeni (Gershenzon in Dudareva 2007). Terpenoide nekaterih rastlinskih vrst danes uporabljamo kot insekticide, med najbolj poznanimi so azadirahtin in piretrini. Konoplja sintetizira več kot 140 terpenoidov, med katerimi so v največji meri zastopani terpeni (McPartland in Sheikh 2018). Od pris- otnosti terpenov je odvisna aroma in intenzivnost vonja rastline. Vsebnost terpenov v rastlinskem tkivu je odvisna od genetske osnove, okoljskih dejavnikov in razvojne stopnje rastline (Brenneisen 2007). Ob poškodbi rastlinskega tkiva in sprožitvi sinteze ras- tlinske signalne molekule v primeru prisotnosti stresnih dejavnikov – jasmonske kisline in njenih derivatov (Ruan in sod. 2019), se iz rastline začno sproščati hlapne spojine. To so večinoma terpenoidi in nekatere snovi nastale po šikimski sintezni poti. Za povečano tvorbo terpenoidov sta odgovorni dve sintezni poti – pot mevalonske kisline in pot metil-eritriol-4-fosfata (slika 2) (Bartram in sod. 2006). Izražanje genov za pot mevalonske kisline in pot metil-eritriol-4-fosfata je zelo nadzorovano, saj obe poti predstavljata pomemben člen v biosintezi izoprenoidov, osnovnih gradbenih enot terpenoidov (Vranová in sod. 2013). Izoprenoidi geranil difosfat (GPP), fernesil difosfat (FPP) in geranilgeranil difosfat (GGPP) so začetne molekule tudi za številne sekundarne metabolite, vključno s kanabinoidi (Bergman in sod. 2019). Terpene klasificiramo na podlagi števila ponavljajočih se izoprenskih enot, sestavljenih iz petih ogljikovih atomov. V socvetjih, koreninah in listih rastlin konoplje je največ monoterpenov in seskviterpenov. Prevladujoči hlapni terpeni v ženskih socvetjih so monoterpeni, med katerimi so najpogostejši D-limonen, β-mircen, α- in β-pinen, terpinolen ter linalol (Fischedick in sod. 2010). Hlapne terpene lahko z uporabo parne destilacije skoncentriramo 82 Acta Biologica Slovenica, 2023, 66 (1) poziciji flavonoidnega skeleta (Verdan in sod. 2011). Posledica abiotičnega stresa je velikokrat povečana sinteza flavonoidov. Flavon luteolin ima na primer varov- alno vlogo pred UV-B sevanjem (Ferreyra in sod. 2012). Posebni flavonoidi, ki jih najdemo v rastlinah konoplje so kanaflavini A, B in C. Kanaflavin A so določili tudi v Mimulus bigelovii, rastlini iz družine Phrymaceae, medtem ko sta preostala dva znana izključno v navadni konoplji (Bautista in sod. 2021). Sinteza kanaflavinov je tako kot pri večini sekund- arnih metabolitov pogojena s stresnimi razmerami, kar so potrdili v raziskavi leta 2020. Z večanjem nadmorske višine se povečuje vsebnost kanaflavina A, B in C (Giupponi in sod. 2020). Sinteza flavonoidov se poveča tudi pri biotskem stresu, saj sprožena obramba pred patogenom poveča izražanje genov v fenilpropanoidni poti. Ob napadu patogena se zmanjša sinteza antocianov in poveča izražanje genov, odgovornih za sintezo flavonov in izoflavonov. Predvidevajo, da zaradi nasprotno delujo- čega uravnavanja sinteze, izoflavoni prevzamejo vlogo antocianov in delujejo kot antioksidativne in protimikrobne spojine (Samac in Graham 2007). Slika 2. Pot mevalonske kisline (MVA) in pot metil-eritriol-4-fosfata (MEP). 3-hidroksi-3- metilglutaril koencim A reduktaza (HMGR), dimetilalil difosfat (DMAPP), izopentenil difosfat (IPP), fernesil difosfat (FPP), D, L-gliceraldehid (DLG), gliceraldehid 3-fosfat (GA-3P), 1-deoksi- D-ksiluloza 5-fosfat (DXP), 1-deoksi-D-ksiluloza 5-fosfat sintaza (DXS), 1-deoksi-D-ksiluloza 5-fosfat reduktoizomeraza (DXR), 2-C-metil- d-eritritol-4-fosfat MEP, geranilgeranil difosfat (GGPP), geranil difosfat (GPP) in geranilgeranil difosfat sintaza (GGPPS) (Yang in sod. 2012). Figure 2. The mevalonic acid (MVA) pathway and the methyl-erythritol-4-phosphate (MEP) pathway. 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR), dimethylallyl diphosphate (DMAPP), isopentenyl diphosphate (IPP), farnesyl diphosphate (FPP), D, L-glyceraldehyde (DLG), glyceraldehyde 3-phosphate (GA-3P), 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate (DXP), 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR), 2-C-methyl-d- erythritol-4-phosphate MEP, geranylgeranyl diphosphate (GGPP), geranyl diphosphate (GPP), and geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPPS) (Yang et al. 2012). v eterično olje (Beek in Joulain 2017). Izmed vseh monoter- penov, pinen, mircen in limonen predstavljajo približno 85 % vseh hlapnih terpenov, ki jih zaznamo v bližini rastline, vendar skupno prispevajo manj kot 10 % k celokupni vseb- nosti eteričnega olja v rastlinskem tkivu konoplje (Hood in sod. 1973). Konoplja z visoko vsebnostjo Δ9-THC ima tri do šest krat višjo vsebnost limonena in pinena v primerjavi z industrijsko konopljo (Mediavilla in Steinemann 1997). Flavonoidi V konoplji so določili že več kot 20 flavonoidov, od katerih večina pripada flavon- (apigenin in luteolin) in flavonol- (kaempferol in kvartecin) aglikonom in glikoz- idom (Flores-Sanchez in Verpoorte 2008). Biološka funkcija flavonoidov je povezana z njihovo potencialno citotoksičnostjo in sposobnostjo interakcije z encimi. Nekateri delujejo kot stabilizatorji prostih radikalov, na primer reaktivnih kisikovih spojin, lahko pa tudi kot kelatorji kovin, pri čemer v Fentonovi reakciji nastajajo reaktivne kisikove spojine (Williams in sod. 2004). Sposobnost keliranja kovin daje OH skupina na tretji 83 Acta Biologica Slovenica, 2023, 66 (1) Pomembni škodljivci in patogeni navadne konoplje Leta 1976 sta Small in Cronquist izoblikovala uradno nomenklaturo za konopljo in jo uvrstila v družino kono- pljevk (Cannabaceae). Razvrstitev v podvrste temelji na vsebnosti sekundarnega metabolita Δ9-THC, vendar so med podvrstami tudi znatne razlike v prisotnosti drugih sekundarnih metabolitov. Poznavanje lastnosti gos- titeljske rastline in njene kemijske sestave je ključnega pomena za uspešno prepoznavanje patogenov in ško- dljivcev. Kanabinoid Δ9-THC in terpenoida humulen ter kariofilen imajo insekticidno delovanje, medtem ko imajo metil-ketoni repelentno delovanje na listne herbivore (Mediavilla in Steinemann 1997). Variabilnost vsebnosti sekundarnih metabolitov je zelo velika, zato je zaradi sočasne evolucije patogenov in ško- dljivcev ter gostiteljske rastline prišlo do speciacije. Škodl- jivi organizmi napadajo le izbrane rastline (McPartland in sod. 2000). Speciacija škodljivih organizmov je prisotna med podvrstami konoplje, vendar ni dokazov, s katerimi mehanizmi se ti organizmi izogibajo rastlinski obrambi. McPartland (1992) je identificiral številne patogene, ki okužujejo konopljo. Skupno naj bi bila konoplja gostitel- jska rastlina okrog 100 različnim patogenom in številnim škodljivcem, kot so insekti in pajkovci. Novejše raziskave se osredotočajo na patogene na posušenih ženskih socvetjih (Thompson in sod. 2017). Škodljivci konoplje Navadna pršica (Tetranychus urticae) in karminasta pršica (Tetranychus cinnabarinus), iz skupine pršic prelk sta izraziti termofilni vrsti ter zato pogosta škodljivca pri gojenju konoplje v zavarovanih prostorih (McPartland in sod. 2000). Optimalne razmere za razvoj škodljivcev so v času cvetenja rastlin konoplje, zato takrat povzročajo največ škode. Prehranjujejo se na spodnji strani listov, prebadajo posamezne celice in povzročajo izgubljanje klorofila ter zmanjšanje neto fotosinteze rastline. Poškodbe opazimo kot bele ali rumene pike na zgornji strani listov (Park in Lee 2002). Problematična je tudi pršica Aculops cannabicola. Je monofag, ki napada liste, listne peclje, meristeme in socvetja ženskih in moških rastlin. Povzroča zvijanje in nekroze listov, ter zmanjšuje produkcijo smolnih snovi pri konoplji (Petanović in sod. 2007). Konoplja je priljubljena gostiteljska rastlina tudi ušem. Večinoma jo napadajo siva breskova uš (Myzlis persicae), konopljina uš (Phorodon cannabis) in črna fižolova uš (Aphrid fabae). Prehranjujejo se s floemskim sokom, le redke sesajo ksilem. Zadržujejo se na spodnji strani listov in povzročajo venenje in rume- nenje ter so prenašalci številnih gliv, bakterij in virusov (Kennedy in sod. 1959; Prado in Tjallingii 1994). Izločajo eksudat, medeno roso, s katero se prehranjujejo mravlje in glive sajavosti, ki povzročajo sekundarne poškodbe na rastlinah (McPartland in sod. 2000). Uši na konoplji so toplo in vlago ljube, previsoke temperature povzročajo pritlikavost osebkov, zmanjšujejo plodnost in skrajšujejo njihovo življenje. So pogostejši škodljivec pri pridelavi na prostem (Chi in Su 2006). V nadzorovanih prostorih in ras- tlinjakih je zelo pogost škodljivec rastlinjakov ščitkar (Tri- aleurodes vaporariorum). Bolezenska znamenja napada in poškodbe so podobne ušem, rastline izgubljajo vigor, listi venijo in rumenijo. Ob močnejšem napadu rastline propadejo (McPartland in sod. 2000). Rastlinjakov ščitkar ravno tako izloča medeno roso, s katero privabi glive saja- vosti, ki posledično zmanjšujejo neto fotosintezo rastline (Hall 1982; Byrne in Miller 1990). Optimalne razmere za razmnoževanje so pri 24 °C in visoki relativni zračni vlagi, ko samice ležejo sto in več jajčec na spodnjo stran listov (Gamarra in sod. 2020). Poleg rastlinjakovega ščitkarja sta zelo problematična še tobakov resar (Thrips tabaci) in cvetlični resar (Frankliniella occidentalis). Cvetlični resar je škodljivec zunaj rastočih rastlin, medtem ko se tobakov resar pojavlja pri pridelavi rastlin konoplje v zavarovanih prostorih (McCune in sod. 2021). Resarji sesajo celični sok na spodnji strani listov, zato so prve poškodbe težko vidne. Ob močnejšem napadu na listih najdemo njihove izločke, vidne kot majhne črne pike. Izleže se do osem generacij letno, vendar je število močno odvisno od temperature (Van Rijn in sod. 1995, McPartland in sod. 2000). Patogeni konoplje Najpogostejši patogen, ki napada rastline konoplje je siva plesen, ki jo povzroča gliva Botrytis cinerea. Njen razvoj pospešuje visoka relativna zračna vlaga, zato na obde- lovalnih površinah v deževnih mesecih povzroča velike izpade pridelka (Van der Werf in sod. 1995). Do okužbe koreninskega sistema pride v vseh razvojnih stopnjah rastline, socvetja pa gliva kolonizira ob poznem cvetenju ali po spravilu pridelka socvetij. Okužba lahko izbruhne v sušilnicah ali med skladiščenjem in s tem zmanjšuje 84 Acta Biologica Slovenica, 2023, 66 (1) kakovost in uporabnost socvetij (Punja in sod. 2019). Pogosti patogen rastočih rastlin je pepelovka, ki jo povz- ročata glivi Podosphaera macularis (prej Sphaerotheca macularis) in Leveillula taurica. Napadata mlade rastline na katerih se bolezenska znamenja pokažejo nekaj tednov po okužbi. Okužba je omejena na liste in se širi v suhih rastnih razmerah, ob nizki stopnji osvetlitve in slabem kroženju zraka. Konidiji uspešno kalijo pri relativni zračni vlagi 0 – 100 %. Ob močnem napadu je okužba za rastlino usodna (Nour 1958; McPartland in sod. 2000). Vpliv sekundarnih metabolitov konoplje na škodljivce in patogene Prevladujoči terpeni v eteričnem olju konoplje – α-pinen, β-mircen, ocimen, terpinolen in trans-kariofilen delujejo insekticidno na navadno pršico (T. urticae) in uš Aula- corthum solani (Górski in sod. 2016). Pri rastlinah, ki so bile izpostavljene napadu navadne pršice se je povišala vsebnost vseh analiziranih terpenov, razen α-pinena. Vsebnost terpenov se je povišala tudi v socvetjih rastlin, ki so bile pred cvetenjem obdelane z akaricidom, kar naj bi nakazovalo pomembnost interakcije s škodljivcem (Kostanda in Khatib 2021). Čeprav je v konoplji veliko terpena β-kariofilena, njegovega insekticidnega delo- vanja na konopljo še niso proučili. Kljub temu sklepajo, da naj bi deloval podobno (Kostanda in Khatib 2021) kot proti komarju ščitarju (Aedes aegypti), žitnemu kutarju (Rhyzo- pertha dominica), riževemu žužku (Sitophilus oryzae) in riževemu mokarju (Tribolium castaneum) (Satyal in Setzer 2014). Za enkrat tudi ni znano, če na konopljo deluje kot atraktant moških osebkov navadne pršice in posledično večjo dovzetnosti konoplje na napad pršice, prisoten seskviterpen alkohol farnesol (Nuutinen 2018), kot je to pri rastlini iz iste družine – hmelju (Regev in Cone 1975). Po izpostavitvi konoplje navadni pršici se je v listih in socvetjih povečala vsebnost kanabinoidov CBG za 29 %, CBC za 41 % in Δ9-THC za 52 %, medtem ko je bila vsebnost CBCA višja pri kontrolnih rastlinah, ki niso bile izpostavljene škodljivcu. Zaradi sinteze hlapnih snovi z insekticidnim delovan- jem, ima konoplja dobre sosedske odnose z drugimi rast- linskimi vrstami. Rastline konoplje v bližini bombažnih polj naj bi zmanjševale pojavnost škodljivca listov bombaža Alabama argillacea, kot vmesni posevek v pridelavi zelenjadnic zmanjšuje prisotnost kapusovega belina (Pieris brassicae), rastline krompirja ščiti pred koloradskim hroščem (Leptinotarsa decemlineata) in zmanjšuje pojavnost poškodb Delia coarctata na posevkih pšenice (McPartland 2000). Že leta 1952 so se začele raziskave o potencialnem protimikrobnem delovanju bioaktivnih snovi konoplje. Danes vemo, da na kanabinoidno biosintezno pot v konoplji dokazano vpliva prisotnost bakterijskih in glivnih patogenov. Številni kanabinoidi delujejo celo na odporne seve bakterij (Gorelick in Bernstein 2017). Eterično olje konoplje deluje močno protimikrobno proti Gram-pozitivnima bakterijama Bacillus cereus in Staphylococcus aureus; Gram-negativnim bakterijama Pseudomonas aeruginosa in Escherichia coli ter glivam Candida albicans in Aspergillus niger (Satyal in sod. 2012). Nissen in sodelavci so leta 2010 izvedli raziskavo protimikrobnega delovanja konopljinega ekstrakta v razmerah in vitro. Izmed treh izbranih sort konoplje se je za najučinkovitejšega proti Gram-pozitivnima bakterijama Clostridium spp. in Enterococcus spp. ter Gram-negativn- ima bakterijama Pseudomonas spp. in Pectobacterium spp., ter kvasovkam pokazal ekstrakt sorte Futura. Razlog za širok spekter delovanja ekstrakta te sorte je najverjet- neje višja vsebnost terpena terpinolena. Nekateri terpeni imajo v povezavi s kanabinoidi siner- gistični učinek, zato poleg lastnega repelentnega delo- vanja na škodljivce, povečajo tudi insekticidno delovanje kanabinoidov (Russo 2011). Konopljini sekundarnim metaboliti, tako terpenoidi kot kanabinoidi, imajo tudi protiglivne lastnosti. Izolata THC in CBD preprečita kalitev glive Phomopsis ganjae (McPart- land 1984). Kanabinoida CBC (Turner in Elsohly 1981) in CBG (Elsohly in sod. 1982) ter terpenoidi in fenoli linalol, citronelol, geraniol, eugenol (Kurita in sod. 1981) limonen, evkaliptol, β-myrcene, α- in β-pinen delujejo tako proti bakterijam kot proti glivam (De Groot 1972). Ekstrakt listov konoplje inhibira rast in razvoj glive Aspergillus niger in s tem prepreči nastanek črne plesni, ki je pogosto prisotna bolezen na sadju in zelenjavi (Wasim in sod. 1995). V celičnih kulturah konoplje, suspenzija micelija dveh najpogostejših patogenih gliv, Pythium aphanidermantum in B. cinerea, pospeši biosintezne poti in poviša vsebnosti triptofana, fumarata, aspartata in glutamina (Flores-San- chez in sod. 2009). Ob okužbi z glivo B. cinerea se poveča izražanje 85 Acta Biologica Slovenica, 2023, 66 (1) genov vpletenih v signalno pot salicilne kisline, jasmonske kisline in etilena (Balthazar in sod. 2020). V večini primerov rastlinski obrambni mehanizem proti nekrotrofnim organizmom deluje po signalni poti jasmonska kislina/ etilen (Thomma in sod. 2001). Ob okužbi mladih listov konoplje z glivo B. cinerea, se poveča izražanje encima fenilalanin amonijak liaze (slika 3.), označevalca v signalni poti jasmonska kislina/etilen, ki katalizira začetno reakcijo biosinteze fenilpropanoidov. Fenilpropanoidi so začetniki za kompleksne sekundarne metabolite, kot so na primer pigmenti ali protimikrobni fitoaleksini (Balthazar in sod. 2020). Jasmonska kislina je pomembna za sintezo fla- vonoidov in alkaloidov (Hayat in sod. 2010) ter vpliva na vsebnost terpenoidov in kanabinoidov v rastlinah konoplje (Salari in Mansori in sod. 2013). Salicilna kislina je povezana s sistemsko pridobljeno odpornostjo, v kateri se povečuje tudi sinteza sekundarnih metabolitov (Hayat in sod. 2010), vendar njena vloga v obrambi konoplje pred B. cinerea ni povsem jasna (AbuQamar in sod. 2006). Eksogena sali- cilna kislina povečuje ekspresijo gena za THC-sintazo, kar potrjuje njeno vlogo v stimulaciji biosinteznih poti sekund- arnih metabolitov (Jalali in sod. 2019). Predvidevajo, da določene sorte konoplje, okužene s B. cinerea lahko pridobijo sistemsko odpornost (Balthazar in sod. 2020). Vse bolj je jasen pomen mikrobioma in z njim tudi endofitnih bakterij in endofitnih gliv pri rastlinah, vključno s konopljo (Kusari in sod. 2013; Kusari in sod. 2014; Taghi- nasab in Jabaji 2020). Predvidevajo, da so endofiti antago- nisti številnih patogenov, med njimi konopljini endofiti tudi antagonisti glivnih rodov Trichothecium in Botrytis (Kusari in sod. 2013; Kusari in sod. 2014). Ob prisotnosti endofitov se poveča izražanje genov vpletenih v biosintezni poti mevalonske kisline in metil-eritriol-4-fosfata (slika 2), kar naj bi bilo ključno pri zvišanju odpornosti rastline proti stresu (Mishra in sod. 2018). Endofitne bakterije pogosto izločajo sekundarne metabolite, ki so podobni gostiteljski rastlini, kar še dodatno poveča tolerantnost konoplje proti stresnim dejavnikom (Kusari in sod. 2013). Bacillus megaterium B4, Brevibacillus borstelensis B8, Bacillus sp. B11, in Bacillus sp. B3 povzročajo motnje komunikacijskih signalov (angl. ‘quorum quenching’) med celicami bakterij, kar prepreči razvoj odpornosti proti gostiteljskim in/ali endofitnim sekundarnim metabolitom (Taghinasab in Jabaji 2020). V celičnih kulturah navadne konoplje, tobaka BY-2 in ameriške koruzne sovke (Spodoptera frugiperda) delujejo kanabinoidi citotoksično in inducirajo celično apoptozo (Sirikantaramas in sod. 2005). Slika 3. Biosintezna pot fenilpropanoidov (Thomas in ElSohly, 2016). Figure 3. Biosynthetic pathway of phenylpropanoids (Thomas and ElSohly, 2016). 86 Acta Biologica Slovenica, 2023, 66 (1) Sklepi Sekundarni metabolizem konoplje je kompleksen sistem, v katerem je še veliko neznank. Številne snovi med seboj sodelujejo in imajo sinergičen učinek pri obrambi rastline pred škodljivci in patogeni. Čeprav ekološka vloga konopljinih kanabinoidov, terpenoidov in flavonoidov še ni povsem razkrita, je jasno, da kanabinoidi in flavonoidi varujejo rastline pred abiotičnim stresom v največji meri pred UV sevanjem, medtem ko kanabinoidi in terpenoidi delujejo repelentno, insekticino in protimikrobno. Več študij potrjuje insekticidno in antimikrobno delovanje kanabinoidov THC in CBD. Povečana sinteza THC in CBD se v rastlinah konoplje pojavlja ob napadu in po napadu škodljivca. THC in CBD s številnimi terpeni učinkujeta sinergično. Ko rastlino napade škodljivec ali jo okuži patogen, se aktivirajo signalne poti, ki delujejo na encim fenilalanin amonijak liaza ali na poti mevalonske kisline in metil-er- itriol-4-fosfata. Fenilalanin amonijak liaza katalizira začetno reakcijo fenilpropanoidov, ki so ključni za sintezo fenolnih snovi, medtem ko sta sintezni poti mevalonske kisline in metil-eritriol-4-fosfata odgovorni za sintezno kanabinoidov in terpenoidov. Glive in bakterije dokazano sprožijo kanabinoidne in terpenske biosintezne poti. To potrjuje vlogo kanabinoidov in terpenov v interakciji rastline z biotskimi dejavniki. Na rastlinski površini in v rastlini so prisotni številni glivni in bakterijski endofiti, ki sodelujejo pri rastlinski obrambi. V največji meri so prisotni Chaetomium globosum, Eupenicillium rubidurum in Penicillium sumatrense (Kusari in sod. 2014). Delujejo neposredno antagonistično s patog- enovimi sekundarnimi metaboliti ali posredno z izločanjem sekundarnih metabolitov, toksičnih za patogena. Endofiti lahko spodbujajo rastlinski sekundarni metabolizem ali celo omejujejo razvoj škodljivega organizma v prid rastlini. Zaradi pomanjkanja raziskav ekološkega pomena sekundarnih metabolitov pri navadni konoplji, ta pomen ni povsem jasen. Kljub temu vemo, da imajo številne snovi v konoplji varovalno vlogo pred škodljivimi organizmi in da je stres osnova za povečano sintezo sekundarnih metabolitov. Z načrtovanim in pravilnim izvajanjem stresa in ohranjanjem zdravega rastlinskega mikrobioma lahko s tehnologijo pridelave povečamo tvorbo obrambnih snovi in s tem izboljšamo odpornost konoplje proti patogenom in škodljivcem. Viri AbuQamar, S., Chen, X., Dhawan, R., Bluhm, B., Salmeron, J., Lam, S. (2006). Expression profiling and mutant analysis reveals complex regulatory networks involved in Arabidopsis response to Botrytis infection. The Plant Journal, 48, 28–44. https://doi.org/10.1111/j.1365-313x.2006.02849.x Andre, C.M., Hausman, J.F., Guerriero, G. (2016). Cannabis sativa: the plant of the thousand and one molecules. Frontiers in Plant Science, 7(19), 17 str. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00019 Balthazar, C., Novinscak, A., Joly, D.L., Filion, M. (2020). Expression of putative defense responses in cannabis primed by Pseudomonas and/or Bacillus strains and infected by botrytis cinerea. Frontiers in Plant Science, 11. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.572112 Bartram, S., Jux, A., Gleixner, G., Boland, W. (2006). Dynamic pathway allocation in early terpenoid biosynthesis of stress-induced lima bean leaves. Phytochemistry, 67(15), 1661-1672. https://doi:10.1016/j.phytochem.2006.02.004 Bautista, J.L., Yu, S., Tian, L. (2021). Flavonoids in Cannabis sativa: Biosynthesis, Bioactivities, and Biotechnology. ACS Omega 6(8), 5119-5123. https://doi. org/10.1021/acsomega.1c00318 Beek, T.A. in Joulain, D. (2017). The essential oil of patchouli, Pogostemon cablin: A review. Flavour and Fragrance Journal 33(1), 6-51. https://doi. org/10.1002/ffj.3418 Bergman, M.E., Davis, B., Phillips, M.A. (2019). Medically useful plant terpenoids: Biosynthesis, occurrence, and mechanism of action. Molecules 24, 3961. https://doi.org/10.3390/molecules24213961 Brenneisen, R. (2007). “Chemistry and analysis of phytocannabinoids and other cannabis constituents,” in Marijuana and the Cannabinoids Forensic Science and Medicine, ed. M. ElSohly (New York, NY: Humana Press), 17–49 https://doi.org/10.1007/978-1-59259-947-9_2 Byrne, D.N., Miller, W.B. (1990). Carbohydrate and amino acid composition of phloem sap and honeydew produced by Bemisia tabaci. Journal of Insect Physiology 36, 433–439. https://doi.org/10.1016/0022-1910(90)90061-J Chi, H., Su, H.Y. (2006). Age-stage, two-sex life tables of Aphidius gifuensis (Ashmead) (Hymenoptera: Braconidae) and its host Myzus persicae (Sulzer) (Homoptera: Aphididae) with mathematical proof of the relationship between female fecundity and the net reproductive rate. Environmental Entomology 35, 10–21. https://doi.org/10.1603/0046-225X-35.1.10 87 Acta Biologica Slovenica, 2023, 66 (1) De Groot, R.C. (1972). Growth of wood-inhabiting fungi in saturated atmospheres of monoterpenoids. Mycologia, 64(4), 863–870. https://doi.org/10.1080/ 00275514.1972.12019336 Elsohly, H.N., Turner, C.E., Clark, A.M., Elsohly, M.A. (1982). Synthesis and antimicrobial activities of certain cannabichromene and cannabigerol related compounds. Journal of Pharmaceutical Sciences, 71(12), 1319-1323. https://doi.org/10.1002/jps.2600711204. ElSohly, M.A, Slade, D. (2005). Chemical constituents of marijuana: the complex mixture of natural cannabinoids. Life Sciences 78(5), 539-48. https://doi. org/78:539–54810.1016/j.lfs.2005.09.011 Ferreyra, M.L.F., Rius, S.P., Casati, P. (2012). Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science 3, 222. https://doi.org/10.3389/fpls.2012.00222 Fischedick, J.T., Hazekamp, A., Erkelens, T., Choi, Y.H., Verpoorte, R. (2010). Metabolic fingerprinting of Cannabis sativa L., cannabinoids and terpenoids for chemotaxonomic and drug standardization purposes. Phytochemistry 71, 2058–2073. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2010.10.001 Flores-Sanchez, I.J., Pec, J., Fei, J., Choi, Y.H., Dusek, J., Verpoorte, R. (2009). Elicitation studies in cell suspension cultures of Cannabis sativa L. Biotechnology 143(2), 157–168. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2009.05.006 Flores-Sanchez, I.J., Verpoorte, R. (2008). Secondary metabolism in Cannabis. Phytochemistry Review 7, 615–639. https://doi.org/10.1007/s11101-008- 9094-4 Gamarra, H., Sporleder, M., Carhuapoma, P., Kroschel, J., Kreuze, J. (2020). A temperature-dependent phenology model for the greenhouse whitefly Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera: Aleyrodidae). Virus Research 289, 198107. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2020.198107 Gershenzon, J., Dudareva, N., (2007). The function of terpene natural products in the natural world. Nature Chemical Biology 3, 408–414. https://doi. org/10.1038/nchembio.2007.5 Giupponi, L., Leoni, V., Pavlovic, R. Giorgi, A. (2020). Influence of Altitude on Phytochemical Composition of Hemp Inflorescence: A Metabolomic Approach. Molecules, 25(6), 1381. https://doi.org/10.3390/molecules25061381 Glattstein, B., Gorski, A. (2001). Marijuana identification: A test for calcium in cystolityhic hairs. Microscopy Today, 9(4), 16. https://doi.org/10.1017/ S155192950005728X Głodowska, M. (2016). Cannabis sativa L. and its antimicrobial properties – A review. Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce – Agronomia i ochrona roślin Gorelick, J., Bernstein, N. (2017). Cannabis sativa L. Springer International Publishing. Chandra S. et al. (eds.), - Botany and Biotechnology, 439-456. https:// doi.org/10.1007/978-3-319-54564-6_21 Górski, R., Sobieralski, K., Siwulski, M. (2016). The effect of hemp essential oil on mortality Aulacorthum solani Kalt. and Tetranychus urticae Koch.. Ecological Chemistry and Engineering, 23(3), 505-511. https://doi.org/10.1515/eces-2016-0037 Hall, R.A. (1982). Control of whitefly, Trialeurodes vaporariorum and cotton aphid, Aphis gossypii in glasshouses by two isolates of the fungus, Verticillium lecanii. Annals of Applied Biology 101(1), 1–11. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.1982.tb00794.x Hayat, Q., Hayat, S., Irfan, M., Ahmad, A. (2010). Effect of exogenous salicylic acid under changing environment: A review. Environmental and Experimental Botany 68, 14–25. https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2009.08.005 Hemphill, J.T., Paul, J.M. (2004). Cannabinoid content of individual plant organs from different geographical strains of Cannabis sativa L. Journal of Natural Products 43. https://doi.org/10.1021/np50007a009 Hill, K.P. (2015). Medical marijuana for treatment of chronic pain and other medical and psychiatric problems: A clinical review. The Journal of the American Medical Association 313, 2474–2483. https://doi.org/10.1001/jama.2015.6199 Hood, L.V.S., Dames M.E., Barry, G.T., (1973). Headspace volatiles of marijuana. Nature 24, 402-403. Jalali, S., Salami, S.A., Sharifi, M., Sohrabi, S. (2019). Signaling compounds elicit expression of key genes in cannabinoid pathway and related metabolites in cannabis. Industrial Crops and Products 133, 105-110. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2019.03.004 Jin, D., Dai, K, Xie, Z., Chen J. 2020. Secondary Metabolites Profiled in Cannabis Inflorescences, Leaves, Stem Barks, and Roots for Medicinal Purposes. Scientific Reports 10, 3309 https://doi.org/10.1038/s41598-020-60172-6 1 Keller, A., Leupin, M., Mediavilla, V., Wintermantel, E. (2001). Influence of the growth stage of industrial hemp on chemical and physical properties of the fibres. Industrial Crops and Products 13, 35–48. https://doi.org/10.1016/S0926-6690(00)00051-0 Kennedy, J. S., Booth, C. O., Kershaw, W. J. S. (1959). Host finding by aphids in the field: Aphis fabae scop. (Gynoparae) and Brevicoryne brassicae L.; with a re-appraisal of the role of host-finding behaviour in virus spread. Annals of Applied Biology, 47(3), 424–444. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.1959. tb07277.x Kostanda, E., Khatib, S. (2022). Biotic stress caused by Tetranychus urticae mites elevates the quantity of secondary metabolites, cannabinoids and terpenes, in Cannabis sativa L., Industrial Crops and Products 176, 114331. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2021.114331 Kurita, N., Miyaji, M., Kurane, R., Takahara, Y. (1981). Antifungal activity of components of essential oils. Agricultural and Biological Chemistry, 45(4), 945- 952, https://doi.org/10.1080/00021369.1981.10864635 Kusari, P., Kusari, S., Lamshöft, M., Sezgin, S., Spiteller, M., Kayser, O. (2014). Quorum quenching is an antivirulence strategy employed by endophytic bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology 98(16), 7173–7183. https://doi.org/10.1007/s00253-014-5807-3 Kusari, P., Kusari, S., Spiteller, M., Kayser, O. (2013) Endophytic fungi harbored in Cannabis sativa L.: diversity and potential as biocontrol agents against host plant-specific phytopathogens. Fungal Diversity 60, 137. https://doi.org/10.1007/s13225-012-0216-3 88 Acta Biologica Slovenica, 2023, 66 (1) Leizer, C., Ribnicky, D., Poulev, A. (2000). The composition of hemp seed oil and its potential as an important source of nutrition. Journal of Nutraceuticals, functional & medical foods, 2(4), 35- 53. https://doi.org/10.1300/J133v02n04_04 Levin, D. A. (1973). The role of trichomes in plant defense. Quarterly Review Biology 48, 3-15. McCune, F., Morphy, C., Eaves, J., Fournier, V. (2021). Onion thrips, Thrips tabaci (Thysanoptera: Thripidae), reduces yields in indoor-grown cannabis. Phytoprotection, 101(1), 14–20 https://doi.org/10.7202/1076365ar McPartland, J. (1984). Pathogenicity of Phomopsis ganjae on Cannabis sativa and the fungistatic effect of cannabinoids produced by the host. Mycopathologia 87(3), 149–153. https://doi.org/10.1007/BF00436900 McPartland, J. M. 1992. A review of Cannabis diseases. Journal of the International Hemp Association 3, 19–23. McPartland, J. M., Clarke, R. C., Watson, D. P. (2000). Hemp Diseases and Pests Management and Biological Control. University of Vermont, Vermont, USA. Chapter: 4 25-93 https://doi.org/10.1079/9780851994543.0000 McPartland, J., Sheikh, Z. (2018). A review of Cannabis sativa-based insecticides, miticides, and repellents. Journal of Entomology and Zoology Studies 6(6), 1288-1299. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2010.10.001 Mediavilla, V. Steinemann, S. (1997). Essential oil of Cannabis sativa strains. Journal of the International Hemp Association 4(2), 82-84. Mishra, A., Singh, S.P., Mahfooz, S., Bhattacharya, A., Mishra, N., Shirke, P.A., Nissen L., Zatta A., Stefanini I., Grandi, S., Sgorbati, B., Biavati, B., Monti A., (2010). Characterization and antimicrobial activity of essential oils of industrial hemp varieties (Cannabis sativa L.). Fitoterapia. 31;81(5):413-9. https://doi.org/10.1016/j.fitote.2009.11.010 Nour, M.A. (1958). Studies on Leveillula taurica (Lev.) Arn. and other powdery mildews. Transactions of the British Mycological Society, 41 (1), 17-38. https:// doi.org/10.1016/S0007-1536(58)80003-0 Nuutinen, T. (2018). Medicinal properties of terpenes found in Cannabis sativa and Humulus lupulus. European Journal of Medicinal Chemistry, 157, 198- 228. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2018.07.076 Park, Y.L., Lee, J.H. (2002). Leaf cell and tissue damage of cucumber caused by twospotted spider mite (Acari: Tetranychidae). Journal of Economic Entomology, 95(5), 952-7. https://doi.org/10.1093/jee/95.5.952 Pate, D. (1994). Chemical ecology of Cannabis. Journal of the International Hemp Association 2, 32-37. Petanović, R. Magud, B., Smiljanić, D., (2007). The Hemp Russet Mite Aculops cannabicola (Farkas, 1960) (Acari: eriophyoidea) Found on Cannabis sativa l. in Serbia. Supplement to the Description Archives of Biological Sciences, 59(1), 81-85. https://doi.org/10.2298/ABS0701081P Potter, D. The propagation, characterisation and optimisation of Cannabis sativa L. as a phytopharmaceutical. Doctoral thesis, King’s College, London, 2009. Prado, E., Tjallingii, W.F. (1994). Aphid activities during sieve element punctures. Entomologia Experimentalis et Applicata 72, 157–165. https://doi. org/10.1111/j.1570-7458.1994.tb01813.x Punja, Z.K., Collyer, D., Scott, C., Lung, S., Holmes, J., Sutton, D. (2019). Pathogens and molds affecting production and quality of Cannabis sativa L. Frontiers in Plant Science 10: 1120. https://doi.org/10.3389/fpls.2019.01120 Regev, S., Cone, W.W. (1975). Evidence of Farnesol as a Male Sex Attractant of the Twospotted Spider Mite, Tetranychus urticae Koch (Acarina: Tetranychidae). Environmental Entomology, 4(2), 307–311. https://doi.org/10.1093/ee/4.2.307 Richins, R.D., Rodriguez-Uribe, L., Lowe, K., Ferral, R., O’Connell, M.A. (2018). Accumulation of bioactive metabolites in cultivated medical Cannabis. PLOS ONE 13, 7. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0201119 Ruan, J., Zhou, Y., Zhou, M., Yan, J., Khurshid, M., Weng, W., Cheng, J., Zhang, K. (2019). Jasmonic Acid Signaling Pathway in Plants. International Journal of Molecular Sciences 20, 2479. https://doi.org/10.3390/ijms20102479 Russo, E.B. (2011). Taming THC: Potential cannabis synergy and phytocannabinoid terpenoid entourage effects. British Journal of Pharmacology 163, 1344–1364. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2011.01238.x Salari, F., Mansori, H. (2013). The effect of jasmonic acid on the terpenoid compounds in Cannabis sativa. Journal of Plant Process and Function 1(2), 51-60. https://doi.org/20.1001.1.23222727.1391.1.2.5.4 Samac, D.A., Graham, M.A. (2007). Recent advances in legume-microbe interactions: recognition, defense response, and symbiosis from a genomic perspective. Plant Physiol. 144, 582–587. https://doi.org/10.1104/pp.107.096503 Satyal, P., Woods, K.E., Dosoky, N.S., Neupane, S., Setzer, W.N. (2012). Biological activities and volatile constituents of Aegle marmelos (L.) Corrêa from Nepal. Journal of Medicinally Active Plants 1(3), 114-122. https://doi.org/10.7275/R5Q23X59 Schafer, H., Wink, M. (2009). Medicinally important secondary metabolites in recombinant microorganisms or plants: progress in alkaloid biosynthesis, Biotechnology Journal 4, 1684–1703. https://doi.org/10.1002/biot.200900229 Schultes, R.E., Klein W.M., Plowman T., Lockwood T.E. 1974. Cannabis: An example of taxonomic neglect. Botanical Museum Leaflets, 23(9), 337-367. Setzer, N., Satyal, P., (2014). Chemotyping and Determination of Antimicrobial, Insecticidal, and Cytotoxic Properties of Wild-Grown Cannabis sativa from Nepal. Journal of Medicinally Active Plants 3(1), 9-16. https://doi.org/10.7275/R58W3B8V Sirikantaramas, S., Taura, F., Tanaka, Y., Ishikawa Y., Morimoto, S., Shoyama, Y. (2005). Tetrahydrocannabinolic acid synthase, the enzyme controlling marijuana psychoactivity, is secreted into the storage cavity of the glandular trichomes. Plant and Cell Physiology 46, 1578–1582. https://doi.org/10.1093/ pcp/pci166 89 Acta Biologica Slovenica, 2023, 66 (1) Small, E., Cronquist, A. (1976). A practical and natural taxonomy for Cannabis. Taxon 25, 405-435. https://doi.org/10.2307/1220524 Taghinasab, M., Jabaji, S. (2020). Cannabis microbiome and the role of endophytes in modulating the production of secondary metabolites: An Overview. Microorganisms, 8, 355. https://doi.org/10.3390/microorganisms8030355 Tanney, C.A.S., Backer, R., Geitmann, A., Smith D.L. (2021). Cannabis glandular trichomes: A cellular metabolite factory. Frontiers in Plant Science 12, 721986. https://doi.org/10.3389/fpls.2021.721986 Taura, F., Morimoto, S. Shoyama, Y. (1996). Purification and characterization of cannabidiolic-acid synthase from Cannabis sativa L. Biochemical analysis of a novel enzyme that catalyzes the oxidocyclization of cannabigerolic acid to cannabidiolic acid. Journal of Biological Chemistry 271, 17411–17416. https:// doi.org/10.1074/jbc.271.29.17411 Thomas, B.F., ElSohly, M.A., 2016. Chapter 2 - Biosynthesis and Pharmacology of Phytocannabinoids and Related Chemical Constituents. In: Thomas, B.F., ElSohly M.A. (eds.): The Analytical Chemistry of Cannabis, Elsevier, pp. 27-41. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-804646-3.00002-3 Thomma, B.P., Penninckx, I.A., Cammue, B.P., Broekaert, W.F. (2001). The complexity of disease signaling in Arabidopsis. Current Opinion in Immunology 13, 63–68. https://doi.org/10.1016/s0952-7915(00)00183-7 Thompson, G.R., Tuscano, J.M., Dennis, M., Singapuri, A., Libertini, S., Gaudino, R. (2017). A microbiome assessment of medical marijuana. Clinical Microbiology and Infection 23(4), 269–270. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2016.12.001 Turner, C.E., Elsohly, M.A. (1981). Biological activity of cannabichromene, its homologs and isomers. The Journal of Clinical Pharmacology 21(S1), 283-291. https://doi.org/10.1002/j.1552-4604.1981.tb02606.x Van der Werf, H.M., Van Geel, W., Wijlhuizen, M. (1995). Agronomic research on hemp (Cannabis sativa L.) in the Netherlands, 1987-1993. Journal of the International Hemp Association 2, 14–17 Van Rijn, P.C.J., Mollema, C., Steenhuis-Broers, G.M. (1995). Comparative life history studies of Frankliniella occidentalis and Thrips tabaci (Thysanoptera: Thripidae) on cucumber. Bulletin of Entomological Research 85(2), 285 – 297, https://doi.org/10.1017/S0007485300034386 Verdan, A.M., Wang, H.C., García, C.R., Henry, W.P., Brumaghim, J.L. (2011). Iron binding of 3-hydroxychromone, 5-hydroxychromone, and sulfonated morin: implications for the antioxidant activity of flavonols with competing metal binding sites. Journal of Inorganic Biochemistry 105, 1314–1322. https:// doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2011.07.006 Vranová, E., Coman, D., Wilhelm, G. (2013). Network Analysis of the MVA and MEP Pathways for Isoprenoid Synthesis. Annual Review of Plant Biology, 64(1), 665–700. https://doi:10.1146/annurev-arplant-050312-120116 Wasim, K., Haq, I.U., Ashraf, M. (1995). Antimicrobial studies of the leaf of Cannabis sativa L., Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences 8, 22- 38. Whiting, P.F., Wolff, R.F., Deshpande, S., Di Nisio, M., Duffy, S., Hernandez, A.V., Keurentjes, J.C., Lang, S., Misso, K., Ryder, S., Schmidlkofer, S., Westwood, M., Kleijnen, J. (2015). Cannabinoids for medical use: A Systematic Review and Meta-analysis. The Journal of the American Medical Association 313(24), 2456–2473. https://doi.org/10.1001/jama.2015.6358 Williams, R J, Spencer, J. P.E, Rice-Evans C. (2004). Flavonoids: antioxidants or signalling molecules? Free Radical Biology and Medicine 36 (7), 838-849. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2004.01.001. Woolridge, E., Barton, S., Samuel, J., Osorio, J., Dougherty, A., Holdcroft, A. (2005). Cannabis use in HIV for pain and other medical symptoms. Journal of Pain and Symptom Management, 29(4), 358-67. https://doi.org/10.1016/j.jpainsymman.2004.07.011 Yang, D. Du, X., Liang, X., Han, R., Liang Z., Liu, Y., Liu, F., Zhao, J. (2012). Different roles of the mevalonate and methylerythritol phosphate pathways in cell growth and tanshinone production of Salvia miltiorrhiza hairy roots, Plos One 7 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0046797 Yazaki, K. 2004. Natural products and metabolites. V: Handbook of plant biotechnology. 1st ed. Christou P, Klee H. (ur.). Chichester, Wiley: 811–857 Zaynab, M., Fatima, M., Abbas, S., Sharif, Y., Umair, M., Zafar, M.H., Bahadar, K. (2018). Role of secondary metabolites in plant defense against pathogens, Microbial Pathogenesis 124, 198-202 https://doi.org/10.1016/j.micpath.2018.08.034