2 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija UDK 57.084:591.5:575.825:577.155.6:611.068:611.81:599.323.45(043.3) Jasmina Kerčmar, dr. vet. med. VPLIV SOCIALNEGA STRESA, SPOLNIH HORMONOV MED PUBERTETO IN PSIHOAKTIVNIH ZDRAVIL NA OBNAŠANJE ODRASLIH MIŠI Doktorska disertacija INFLUENCE OF SOCIAL STRESS, SEX HORMONES DURING PUBERTY AND PSYCHOACTIVE DRUGS ON THE BEHAVIOR OF ADULT MICE Doctoral dissertation Ljubljana, 2015 3 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Jasmina Kerčmar, Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto in psihoaktivnih zdravil na obnašanje odraslih miši Delo je bilo opravljeno na Centru za genomiko živali Veterinarske fakultete v Ljubljani Javni zagovor je bil opravljen: Mentor: prof. dr. Gregor Majdič Izjava o delu: Izjavljam, da je doktorska disertacija rezultat lastnega raziskovalnega dela, da so rezultati korektno navedeni in nisem kršila avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih. Člani strokovne komisije za oceno in zagovor: Predsednik: prof. dr. Martin Dobeic Članica: prof. dr. Nina Čebulj Kadunc Član: prof. dr. Marko Živin 4 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija IZVLEČEK Ključne besede: Vedenje živali; socialna osamitev – fiziologija; spolni hormoni; možgani – rast in razvoj; puberteta – fiziologija; materinstvo; očetovstvo; depresija – terapija z zdravili; fluoksetin – terapevtska raba; miši; samice; samci Obdobje pubertete/ mladostništva je čas tako spolnega kakor tudi kognitivnega, čustvenega in socialnega dozorevanja, kar je posledica povečanega izločanja in delovanja steroidnih spolnih hormonov iz spolnih žlez. Spolni hormoni med puberteto dokončno preoblikujejo delovanje kortikalnega in limbičnega dela centralnega živčnega sistema ter s tem vplivajo na razvoj sposobnosti izražanja različnih spektrov obnašanj v odraslem obdobju. Socialna osamitev in drugi stresni dejavniki med tem razvojno občutljivim obdobjem lahko trajno prizadenejo dozorevanje možganov, njihovo nevroendokrino odzivnost ter pustijo dolgotrajne spremembe v obnašanju. V doktorski disertaciji smo proučevali socialno prepoznavanje, žensko spolno ter starševsko obnašanje miši, ki smo jih pred nastopom pubertete trajno socialno osamili, trajno nastanili v socialne skupine ali začasno osamili le med puberteto in jih ponovno skupinsko nastanili. Mišim smo odstranili moda in jajčnike pred puberteto ali po njej ter jim v odraslem obdobju dovajali estradiol. Preverili smo tudi učinkovanje zdravila proti depresiji fluoksetina na depresivnemu in anksioznemu podobno obnašanje pri mišjih samcih in samicah, nastanjenih v skupinah. Socialna osamitev med puberteto je zmanjšala sposobnost socialnega učenja ter nepovrnljivo prizadela sposobnost socialnega prepoznavanja predvsem pri samicah. Osamitveni stres med puberteto je tudi nepovrnljivo poslabšal izražanje spolne sprejemljivosti pri samicah ter trajno spremenil izražanje estrogenskega receptorja α (ERα) v anteroventralnem delu periventrikularnega jedra (AVPV) in v ventromedialnem jedru hipotalamusa (VMH). Odsotnost spolnih hormonov med puberteto, še posebej estradiola pri samicah, je nepovrnljivo poslabšala sposobnost izražanja starševskega obnašanja, usmerjenega k mladičem. Dolgotrajno prejemanje fluoksetina je pri obeh spolih enako močno zmanjšalo izražanje obnašanja, podobnega depresivnemu, vendar ni imelo učinka na obnašanje, podobno anksioznemu. Samice so bile bolj anksiozne v primerjavi s samci. Naše ugotovitve dokazujejo, da imajo socialna osamitev in spolni hormoni med puberteto močan in trajen učinek tako na možgane kot posledično na sposobnost izražanja različnih spektrov obnašanj v odraslem obdobju. 5 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija ABSTRACT Keywords: Behavior, animal; social isolation – physiology; gonadal steroid hormones; brain – growth and development; puberty – physiology; maternal behavior; paternal behavior; depression – drug therapy; fluoxetine – therapeutic use; mice; female; male Puberty/ adolescence is the period during which an individual attains reproductive as well as cognitive, emotional and social maturation due to the elevated secretion and action of gonadal steroid hormones secreted by gonads. These steroid hormones direct proper development of cortical and limbic circuits in the brain and program a variety of adult behaviors. Social isolation and other stressful events during this vulnerable period can have profound consequences on different behaviors due to alterations in developing brain and their neuroendocrine responses. Present studies explored social recognition, female sexual and parental behavior in mice of both sexes that were individually housed or housed in social groups during and after puberty, and mice that were individually housed during puberty only, followed by housing in social groups. Mice were gonadectomized either before or after puberty and received estradiol in adulthood. Furthermore, the influence of chronic fluoxetine treatment on depressive and anxiety like behavior in socially housed, gonadally intact male and female mice was also investigated. Social isolation during puberty impaired social recognition as well as irrecoverably affected the ability of social recognition in females only. Social isolation stress during puberty irrecoverably reduced receptive sexual behavior in females and permanently altered the expression of estrogen receptor α (ERα) in the anteroventral periventricular nucleus (AVPV) and in the ventromedial nucleus of the hypothalamus (VMH). The absence of sex hormones during puberty, especially the lack of estradiol in females, irreversibly reduced the ability of pup-directed parental behaviors. Chronic fluoxetine treatment equally reduced the expression of depressive like behavior in both sexes of mice, but fluoxetine had no effect on anxiety like behavior. These results suggest that social isolation and sex hormones during puberty have profound and long-lasting influences on brain development and subsequently on the ability to express different behaviors in adult life. 6 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija KAZALO VSEBINE 1 UVOD ............................................................................................................... 10 1.1 Namen dela in hipoteze......................................................................................................................10 2 PREGLED LITERATURE ............................................................................... 12 2.1 Puberteta in/ ali mladostništvo ..........................................................................................................12 2.1.1 Puberteta in spolni hormoni............................................................................................................12 2.1.1.1 Aktivacijski in organizacijski učinek spolnih hormonov ............................................................13 2.1.1.2 Spolni hormoni med puberteto in vpliv na obnašanje v odraslem obdobju ..............................13 2.1.1.3 Spolni hormoni med puberteto ter oksitocin in vazopresin v odraslem obdobju ......................14 2.1.2 Puberteta in stres ...........................................................................................................................15 2.1.2.1 Dozorevanje hipotalamo-hipofizno-nadledvične (HPA) osi ......................................................16 2.1.2.2 Socialna osamitev med puberteto in vpliv na obnašanje v odraslem obdobju ..........................17 2.1.2.3 Socialna osamitev med puberteto ter oksitocin in vazopresin v odraslem obdobju ..................18 2.2 Socialno prepoznavanje .....................................................................................................................19 2.2.1 Socialno prepoznavanje in spolni hormoni med puberteto ..............................................................20 2.2.2 Socialno prepoznavanje in socialna osamitev med puberteto ..........................................................21 2.2.3 Socialno prepoznavanje ter oksitocin in vazopresin .........................................................................21 2.3 Žensko spolno obnašanje ...................................................................................................................22 2.3.1 Žensko spolno obnašanje in spolni hormoni med puberteto ............................................................23 2.3.2 Žensko spolno obnašanje in socialna osamitev med puberteto ........................................................23 2.3.3 Žensko spolno obnašanje ter oksitocin in vazopresin .......................................................................24 2.4 Starševsko obnašanje .........................................................................................................................25 2.4.1 Starševsko obnašanje in spolni hormoni med puberteto..................................................................25 2.4.2 Starševsko obnašanje in socialna osamitev med puberteto .............................................................26 2.4.3 Starševsko obnašanje ter oksitocin in vazopresin ............................................................................27 2.5 Depresivne in anksiozne motnje ter razlike med spoloma ..................................................................27 2.5.1 Zdravljenje depresivnih in anksioznih motenj ter razlike med spoloma ............................................28 2.5.2 Živalski modeli depresivnih in anksioznih motenj ter razlike med spoloma .......................................29 3 OBJAVLJENI ZNANSTVENI ČLANKI ........................................................... 31 3.1 Adolescent social isolation changes social recognition in adult mice ..................................................31 3.2 Social isolation during puberty affects social behavior in adult mice ..................................................38 3.3 Social isolation during puberty affects female sexual behavior in mice ..............................................43 3.4 Gonadectomy prior to puberty decreases normal parental behavior in adult mice ............................53 7 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3.5 Sex-specific behavioral effects of fluoxetine treatment in animal models of depression and anxiety 62 4 RAZPRAVA ..................................................................................................... 75 5 ZAKLJUČKI...................................................................................................... 81 6 POVZETEK ...................................................................................................... 82 7 SUMMARY ....................................................................................................... 84 8 ZAHVALE......................................................................................................... 86 9 LITERATURA ................................................................................................. 87 8 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija SEZNAM OKRAJŠAV 5- HTT Prenašalec 5-hidroksitriptamina/ Prenašalec serotonina 5- HT 5-hidroksitriptamin/ Serotonin ACTH Adrenokortikotropni hormon/ Kortikotropin AVP Arginin vazopresin/ Vazopresin AVPV Anteroventralni del periventrikularnega jedra BNST Spodnje jedro končne proge CoA Kortikalni del mandlja CRH Sproščevalni hormon kortikotropina/ Kortikoliberin EB Estradiol benzoat EPM Dvignjeni labirint v obliki križa ( Elevated plus maze) ERα, ERβ Estrogenski receptor α, Estrogenski receptor β FSH Folikle stimulirajoči hormon FST Test prisilnega plavanja ( Forced swim test) GnRH Sproščevalni hormon gonadotropinov/ Gonadoliberin HPA Hipotalamo-hipofizno-nadledvična os ( Hypothalamic-pituitary-adrenal axis) HPG Hipotalamo-hipofizno-gonadna os ( Hypothalamic-pituitary-gonadal axis) LH Luteinizirajoči hormon LQ Količnik lordoze ( Lordosis quotient) LS Stranski septum MAOI Zaviralci oksidaz monoaminov ( Monoamine oxidase inhibitors) MeA Medialni del mandlja MPOA Medialni del predoptičnega področja mRNK Informacijska RNK OF Test odprtega polja ( Open field) OT Oksitocin OTR Oksotocinski receptor POA Predoptično področje PVN Paraventrikularno jedro hipotalamusa 9 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija SON Supraoptično jedro SSRI Selektivni zaviralci ponovnega privzema serotonina ( Selective serotonin reuptake inhibitors) TCA Triciklični antidepresivi V1aR Vazopresinski receptor 1a VMH Ventromedialno jedro hipotalamusa 10 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 1 UVOD Ljudje in živali smo socialna bitja, ki živimo v manjših ali večjih socialnih združbah, kar nam omogoča, da razvijemo normalno vrstno specifično obnašanje, ki je v določeni skupnosti pričakovano, zaželeno in sprejemljivo. Ena od osnovnih veščin socialnega obnašanja je socialno prepoznavanje, ki predstavlja osnovo za socialno življenje v socialni združbi. Obstanek socialne združbe kot tudi obstoj same vrste pa je v veliki meri odvisen predvsem od uspešnega razmnoževanja in oskrbe ter preživetja mladičev. Puberteta je obdobje, v katerem posameznik dozoreva tako fizično kot psihično, kar je posledica povečanega izločanja steroidnih spolnih hormonov iz spolnih žlez. V času pubertete namreč poteka še zadnje preoblikovanje in reorganizacija možganov, ki sta odvisni od delovanja spolnih hormonov, delno pa sta podvrženi vplivom različnih stresorjev, kar lahko privede do (dolgo)trajnih sprememb v možganih in posledično do sprememb obnašanja v odraslem obdobju. Različne razpoloženjske oziroma čustvene motnje so z nastopom pubertete pogosto spolno različne. Pojavnost depresivnih in anksioznih motenj je najmanj dvakrat pogostejša pri ženskah v primerjavi z moškimi. Pri zdravljenju se najpogosteje uporabljajo selektivni zaviralci ponovnega privzema serotonina (SSRI), med katerimi je bil fluoksetin kot prvi dostopen na tržišču. Kljub znanemu spolnemu dimorfizmu v farmakokinetiki in farmakodinamiki nekaterih antidepresivnih zdravil, terapija ostaja enaka pri obeh spolih. 1.1 NAMEN DELA IN HIPOTEZE Namen našega dela je bil ugotoviti, ali socialna osamitev in spolni hormoni med puberteto ter psihoaktivna zdravila, kot je fluoksetin, vplivajo na obnašanje odraslih samcev in samic miši. V prvem sklopu našega dela smo si zastavili vprašanje, ali socialna osamitev med puberteto vpliva na sposobnost socialnega prepoznavanja in ali izzove spremembe v oksitocinskem (OT) ter vazopresinskem (AVP) sistemu v končnih in vmesnih možganih. V ta namen smo miši obeh spolov pred puberteto (od 30. dneva starosti) trajno socialno osamili ali skupinsko nastanili po 3 miši na kletko. Da bi preverili možnost povrnitve morebitnih sprememb zaradi 11 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija osamitvenega stresa, smo dodatno skupino miši začasno osamili le med puberteto ter jih 60. dan starosti ponovno nastanili v socialne skupine. V drugem sklopu dela smo si zastavili vprašanje, ali socialna osamitev in odsotnost spolnih hormonov med puberteto vplivata na sposobnost izražanja starševskega obnašanja pri obeh spolih ter spolnega obnašanja pri samicah in ali pride do sprememb v izraženosti estrogenskega receptorja α (ERα) v končnih in vmesnih možganih. V ta namen smo miši obeh spolov pred puberteto (od 25. dneva starosti) trajno socialno osamili ali skupinsko nastanili po 3 miši na kletko ter dodatno skupino miši začasno osamili le med puberteto ter jih 60. dan starosti ponovno nastanili v socialne skupine. Mišim smo odstranili spolne žleze pred puberteto (25. dan) ali po njej (60. dan) ter jim v odraslem obdobju dovajali estradiol z namenom, da bi preverili možnost povrnitve morebitnih sprememb zaradi odsotnosti spolnih hormonov med puberteto. V tretjem sklopu dela smo si zastavili vprašanje, ali dolgotrajno prejemanje fluoksetina zmanjša obnašanje, podobno depresivnemu in anksioznemu, drugače pri samcih kot pri samicah. V ta namen smo miši obeh spolov po odstavitvi nastanili po 3 v kletko in po puberteti polovici mišim začeli dodajati fluoksetin v pitno vodo, druga polovica pa je prejemala vodo brez fluoksetina. Glede na zastavljene cilje smo postavili naslednje delovne hipoteze: Hipoteza 1: Socialna osamitev v mladosti vpliva na socialno prepoznavanje odraslih miši. Hipoteza 2: Zgodnja odstranitev spolnih žlez in socialna osamitev vplivata na starševsko in žensko spolno obnašanje odraslih miši. Hipoteza 3: Antidepresiv fluoksetin zmanjša depresivnemu in anksioznemu vedenju podobno obnašanje, različno pri samicah in samcih. 12 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 2 PREGLED LITERATURE 2.1 PUBERTETA IN/ ALI MLADOSTNIŠTVO Puberteta in mladostništvo (adolescenca) se pogosto uporabljata kot sopomenki, nanašajoči se na razvojni prehod iz otroštva v odraslost. Sisk in sod. so puberteto definirali kot obdobje, med katerim posameznik postane spolno zrel in sposoben razmnoževati se, kar je posledica povečanega izločanja steroidnih spolnih hormonov iz spolnih žlez, obdobje mladostništva pa poleg spolnega dozorevanja zajema še kognitivno, čustveno in socialno dozorevanje obnašanja, kar je posledica izrazitega preoblikovanja strukture in delovanja možganske skorje ter limbičnega dela možganov (pregledno v 1, 2). Pri miših lahko merimo tri pokazatelje pubertete pri samicah in enega pri samcih: odpiranje nožnice (v povprečju 28. dan), začetek poroženevanja nožnice (v povprečju 43. dan) in začetek spolnega ciklusa oziroma prisotnost nožničnega čepka po uspešni paritvi (najpozneje do 60. dneva) pri samicah (linija C57BL/6J) ter ločitev prepucija od penisa (v povprečju 30. dan) pri samcih (linija C57BL/6J) (3, 4). 2.1.1 Puberteta in spolni hormoni Hipotalamus predstavlja povezavo med živčnim in endokrinim sistemom (5). Dozorevanje hipotalamo-hipofizno-gonadne (HPG) osi med puberteto se začne z aktivacijo nevronov, ki izločajo sproščevalni hormon gonadotropinov (GnRH) (2). GnRH usmerja sintezo in sproščanje hipofiznih gonadotropinov, luteinizirajočega hormona (LH) in folikle stimulirajočega hormona (FSH), ki delujejo usklajeno in spodbujajo tvorbo tako spolnih hormonov kot tudi spolnih celic v spolnih žlezah (5, 6). Spolni hormoni spadajo med steroidne hormone, ki nastajajo iz holesterola in imajo za osnovo sterolno ali ciklo-pentano-perhidro-fenantrensko jedro (6). Pri samcih Leydigove celice v modih izločajo androgene hormone, kot sta testosteron in androsteron. Pri samicah celice ovojnice jajčnega folikla v jajčnikih izločajo estrogene hormone, kot so 17 β-estradiol, estron in estriol, celice rumenega telesa pa gestagene hormone, kot sta progesteron in pregnenolon (7). Spolni hormoni vplivajo tako na razvoj spolnih organov (rast semenskih kanalčkov, spermatogeneza ter razvoj akcesornih spolnih žlez pri samcih in razvoj maternične sluznice pri samicah) kot tudi na rast in razvoj celotnega telesa (spremembe v presnovi, sekundarni 13 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija spolni znaki) (5, 6) in ne nazadnje tudi na cel spekter obnašanj (socialno, materinsko, spolno) (8, 9, 10). 2.1.1.1 Aktivacijski in organizacijski učinek spolnih hormonov Steroidni hormoni spolnih žlez vplivajo na razvoj kot tudi na delovanje možganov in posledično na obnašanje. Delovanje spolnih hormonov na živčni sistem delimo na aktivacijsko in organizacijsko (pregledno v 2, 11, 12, 13). Pri aktivacijskem delovanju spolni hormoni začasno (prehodno) spremenijo aktivnost tarčnih celic in s tem spodbudijo določeno obnašanje. Nasprotno pa je organizacijsko delovanje spolnih hormonov trajno (nepovrnljivo), saj se preoblikuje živčni sistem in posledično se spremeni tudi aktivacijsko delovanje (1). Spolni hormoni načeloma delujejo organizacijsko na živčni sistem v perinatalnem obdobju, medtem ko do aktivacijskih učinkov prihaja pozneje, v odraslem obdobju (pregledno v 14, 15, 16). Vedno več raziskav pa dokazuje, da imajo spolni hormoni organizacijske učinke na možgane tudi pozneje v življenju, med puberteto in morebiti celo v odraslem obdobju (11, 17, 18, 19, 20, 21). V možganih glodavcev so področja delovanja spolnih hormonov pogosto spolno različna, zaradi česar je posledično različno tudi obnašanje. Nekateri deli hipotalamusa, ki so spolno različni, so predoptično področje (POA), arkvatno jedro, spodnje jedro končne proge (BNST), ventromedialno jedro (VMH) in paraventrikularno jedro (PVN) (22). 2.1.1.2 Spolni hormoni med puberteto in vpliv na obnašanje v odraslem obdobju Moški spolni hormoni imajo organizacijske učinke na širok spekter za moški spol značilnih obnašanj. Raziskave pri samcih podgan, zlatega hrčka in puščavskih skakačev razkrivajo, da kastracija pred puberteto poslabša izražanje socialnega (agresivno obnašanje, označevanje ozemlja) in moškega spolnega obnašanja v primerjavi s samci s prisotnimi spolnimi žlezami med puberteto (pregledno v 21). Dolgotrajno dodajanje testosterona v odraslem obdobju pa ne odpravi posledic njegove odsotnosti med puberteto (23). Podobno velja tudi za samce miši, razen moškega spolnega obnašanja, ne glede na to, ali so bila moda odstranjena pred puberteto ali po njej (24). Tudi obnašanje, podobno anksioznemu, je podvrženo 14 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija organizacijskim učinkom testosterona, saj podganji samci, kastrirani pred puberteto, močneje izražajo obnašanje, podobno anksioznemu, kot pa samci, ki med puberteto še imajo moda (25). Ženski spolni hormoni imajo prav tako organizacijske učinke na širok spekter za ženski spol značilnih obnašanj (pregledno v 13), saj spodbujajo obnašanja, značilna za samice v odraslem obdobju. Po drugi strani pa raziskave o vplivu ženskih spolnih hormonov med puberteto pri samicah zlatega hrčka (pregledno v 21) in podgan (26) razkrivajo učinke slabenja ženskih (defeminizacija) in krepitve moških oblik (maskulinizacija) spolnega obnašanja. 2.1.1.3 Spolni hormoni med puberteto ter oksitocin in vazopresin v odraslem obdobju Oksitocin (OT) in vazopresin (AVP) sta nonapeptida, ki v glavnem nastajata v velikih živčnih celicah paraventrikularnega in supraoptičnega jedra (SON), v manjšem obsegu pa v majhnih parvocelularnih nevronih v paraventrikularnem jedru in spodnjem jedru končne proge, še manj pa v predoptičnem področju in mandlju (6, 27). Uravnavanje sistemov OT in AVP je močno podvrženo vplivu ženskih in moških spolnih hormonov (pregledno v 28). Raziskave o vplivu spolnih hormonov med puberteto na sistem OT (29, 30) ne kažejo sprememb v številu nevronov OT, le nastajanje in sproščanje hormona OT je z odraščanjem večje ter sorazmerno z večanjem količine spolnih hormonov. Povečano izražanje mRNK za OT v hipotalamusu sovpada s pričetkom pubertete in je pri samicah največje med pojatvijo, kar je povezano s povečanimi vrednostmi estrogenov (29, 31), pri samcih pa s povečanimi vrednostmi testosterona (30). Odstranitev jajčnikov pri samicah podgan pred pubertetio in po njej zmanjša izražanje mRNK za hormon OT v paraventrikularnem in supraoptičnem jedru, dodajanje estradiola (29, 30) in progesterona pa izražanje zopet poviša (32, 33, 34). Estrogeni ne spodbujajo samo prepisovanja hormona OT, ampak povečujejo tudi vrednosti hormona OT v krvni plazmi (35), jih znižujejo v hipofizi (31), povečujejo število oksitocinskih receptorjev (OTR) (36), spodbujajo sproščanje hormona OT iz nevritskega in dendritskega dela nevronov kot tudi povečujejo električno aktivnost nevronov OT (37). Testosteron ali kastracija pri odraščajočih (med puberteto) in odraslih samcih podgan imata podobne učinke na sistem OT kot estradiol ali odstranitev jajčnikov pri samicah (30, 38). 15 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Edina raziskava o vplivu spolnih hormonov med puberteto na sistem AVP ugotavlja, da imajo kastrirani samci podgan znižane vrednosti hormona AVP v krvni plazmi v primerjavi s kontrolnimi samci, nasprotno pa imajo samice z odstranjenimi jajčniki povišane vrednosti v primerjavi s kontrolnimi (39). Učinke odstranitve spolnih žlez pri samcih odpravi dodajanje testosterona, pri samicah pa dodajanje estradiola in progesterona (39). V odraslosti je učinek spolnih hormonov ravno obraten, in sicer kastracija zvišuje, dodajanje testosterona pa znižuje količino hormona AVP v krvni plazmi pri odraslih samcih podgan (40), medtem ko jo odstranitev jajčnikov pri odraslih samicah znižuje, dodajanje estrogenov pa zvišuje (35, 40). Samice imajo med pojatvijo višje vrednosti AVP v plazmi (40), samci pa načeloma višje vrednosti v primerjavi s samicami (39). Kastracija pri odraslih podganjih samcih zmanjša število imunoreaktivnih celic in izražanje mRNK za AVP v stranskem septumu (LS), spodnjem jedru končne proge, medialnem delu mandlja (MeA) in nekaterih drugih delih, medtem ko dodajanje testosterona (41) ali dihidrotestosterona skupaj z estradiolom lahko te spremembe prepreči (42). Pri odraslih samicah podgan nihanje vrednosti estradiola v posameznih fazah spolnega ciklusa nima vpliva na izražanje mRNK za AVP v supraoptičnem jedru (31), kot tudi nima vpliva na količino vazopresinskega receptorja v stranskem septumu (36), medtem ko imajo samice ob koncu brejosti in med laktacijo močnejše izražanje mRNK za AVP v supraoptičnem jedru (31). 2.1.2 Puberteta in stres V času pubertete potekata preoblikovanje in reorganizacija možganov, ki sta odvisna predvsem od delovanja spolnih hormonov (13). Vedno več pa je raziskav, ki ugotavljajo, da izpostavljenost različnim stresorjem v času pubertete lahko privede do (dolgo)trajnih sprememb v možganih in posledično v obnašanju v odraslem obdobju (pregledno v 43), morda prav zaradi medsebojnega delovanja med spolnimi hormoni in hormoni hipotalamo- hipofizno-nadledvične (HPA) osi (44, 45, 46). Stres lahko definiramo kot odziv organizma na različne zunanje ali notranje dejavnike ali stresorje, ki ogrožajo normalno delovanje in notranje ravnovesje organizma (47). Naloga odziva osi HPA na stresorje je povrniti fiziološko ravnovesje v organizmu in preprečiti prekomeren odziv obrambnih mehanizmov na stres, ki bi lahko privedli do poškodbe, bolezni ali smrti (48, 49). Dolgotrajen ali zelo intenziven stres je za organizem škodljiv (distres), 16 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija kratkotrajen in blag pa celo koristen (evstres) (50). Učinke stresa na organizem je v sredini dvajsetega stoletja prvi opisal Hans Selye z modelom splošnega prilagoditvenega sindroma (51). Organizem se odzove na stres z enakim vzorcem telesnih reakcij ne glede na vzrok stresa, pri dolgotrajnejši izpostavljenosti stresorju pa sledi odziv v treh fazah: alarm (boj ali beg), prilagoditev in izčrpanost (bolezen ali smrt). Pri odgovoru na stres sodelujeta dva glavna endokrina odziva, in sicer takojšnji živčni/ simpatični odziv (noradrenalin, adrenalin) pri akutnem stresu ter zapozneli endokrini/ glukokortikoidni odziv, značilen za dolgotrajnejši, kronični stres (52). Stresor sproži nastajanje in izločanje sproščevalnega hormona kortikotropina (CRH) in AVP v paraventrikularnem jedru. CRH in AVP se sprostita v hipofizni portalni žilni sistem, kjer izzoveta sproščanje adrenokortikotropnega hormona (ACTH) iz adenohipofize. ACTH spodbudi izločanje glukokortikoidov (kortizol pri ljudeh, kortikosteron pri glodavcih) v skorji nadledvične žleze (49, 53). Glukokortikoidi so pomembni posredniki v intermediarni presnovi, saj pospešujejo sproščanje energetskih rezerv ter s tem podprejo delovanje srčno- žilnega sistema, pospešijo izločanje vode iz organizma, imajo protivnetni učinek in zavirajo imunski odgovor. Vendar pa dolgotrajnejša izpostavljenost visokim vrednostim glukokortikoidov lahko poškoduje številne organske sisteme, vključno s centralnim živčnim sistemom (48, 49). Glukokortikoidni receptorji so izraženi v številnih celicah po celotnih možganih, vendar jih je največ v hipokampusu, paraventrikularnem jedru in čelnem delu možganske skorje (npr. 54, 55). 2.1.2.1 Dozorevanje hipotalamo-hipofizno-nadledvične (HPA) osi Za puberteto je značilno dokončno dozorevanje delovanja nevroendokrinega sistema in s tem trajne spremembe v številnih nevroendokrinih oseh, najbolj izrazite v osi HPG (pregledno v 1, 13). Manj izrazite, vendar zelo pomembne spremembe v puberteti so opazne tudi v osi HPA (pregledno v 44, 45, 56). Podganam pred puberteto in odraslim podganam, izpostavljenim akutnemu fizičnemu ali psihičnemu stresorju, se ravni hormonov ACTH in kortikosterona povečata primerljivo enako. Vendar pa stresni odziv s povrnitvijo stresnih hormonov na bazalno raven traja pri predpubertetnih samicah (57) in samcih (58) skoraj dvakrat dlje kot pri odraslih živalih, kar kaže na pomembnost obdobja pubertete tudi pri dozorevanju odziva (negativne povratne zanke) osi HPA in s tem zaščite organizma pred visokimi vrednostmi 17 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija glukokortikoidov (59, 60). Pri odraslih podganjih samcih se po stresnem dogodku beljakovina Fos (ki kaže aktivnost nevronov) izraža v številnih področjih možganov, medtem ko je pri samcih v času pubertete izraženost te beljakovine omejena večinoma na paraventrikularno jedro (61). Testosteron pri odraslih samcih krajša stresni odziv, medtem ko ga estradiol pri samicah daljša (62). Odrasli samci imajo nižje bazalne in stresne vrednosti CRH, ACTH in kortikosterona kot samice (63). Pri predpubertetnih samicah in samcih spolni hormoni nimajo bistvenega vpliva na stresni odziv (57, 58). 2.1.2.2 Socialna osamitev med puberteto in vpliv na obnašanje v odraslem obdobju V času pubertete potekajo v možganih še zadnje morfološke in funkcionalne spremembe, zato so možgani zelo ranljivi in občutljivi na delovanje stresorjev, kar se lahko odraža v spremembah obnašanja v odraslosti (npr. 44, 45, 46, 56, 60, 64). Za socialne živali, kot so miši (65), podgane (66) in prerijske voluharice (67), je lahko socialna osamitev zelo stresna. Pri podganah naj bi delovala pomirjujoče na samce in stresno na samice (68), medtem ko ima prenaseljenost ravno obraten učinek (merjenje kortikosterona v krvi) (69). Večina raziskav socialne osamitve obravnava predvsem samce, rezultati vedenjskih raziskav kažejo na večjo občutljivost samcev v primerjavi s samicami (pregledno v 70, 71). Socialna osamitev med puberteto pri miših lahko glede na objavljene raziskave zmanjša izražanje obnašanja, podobnega anksioznemu in depresivnemu, tako pri samicah (72) kot samcih (73), ne spremeni pa anksioznosti pri nobenem od spolov pri miših (74, 75) ali celo okrepi izražanje anksioznosti pri samcih (76, 77). Socialni osamitveni stres med puberteto pri podganah lahko okrepi izražanje anksioznemu in ne spremeni depresivnemu podobno obnašanje pri samcih (78, 79, 80), okrepi depresivnemu podobno obnašanje pri samicah (81) ter ne vpliva na anksioznost pri samicah (78, 80, 82). Pri samcih prerijskih voluharic socialna osamitev okrepi obnašanje, podobno anksioznemu (83). Dosedanje raziskave vpliva socialne osamitve tako podajajo zelo raznolike, včasih celo nasprotujoče si rezultate, kar je lahko posledica različnih pogojev reje, trajanja socialne osamitve in stresnega ravnanja, uporabe različnih linij živali, uporabe različnih vedenjskih testov, testiranja samic v različnih fazah spolnega ciklusa in mnogih drugih dejavnikov (npr. 84). 18 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Osamitev med puberteto pri miših lahko glede na dosedanje raziskave poveča spontano fizično aktivnost tako pri samicah (72) kot pri samcih (73), pri drugih raziskavah pa se lahko poveča aktivnost pri samcih, ne pa tudi pri samicah (74). Pri podganjih samcih in samicah socialni stres ne vpliva na spontano aktivnost (78), čeprav številne druge raziskave kažejo na povečano aktivnost zaradi socialne osamitve med puberteto (pregledno v 85). Osamljeni samci prerijskih voluharic imajo povečano spontano aktivnost (83). Socialna osamitev pri samcih nima večjega vpliva na agresivno obnašanje pri miših (86), je pa zaradi osamitve agresivnost okrepljena pri podganah (87, 88). Mišji samci, ki so osamljeni med puberteto, kažejo slabše predmetno prepoznavanje, vendar pa sposobnost učenja ni okrnjena (73), medtem ko sta pri samicah okrnjena tako spomin kot tudi učenje (72). Socialno prepoznavanje je mnogo slabše pri osamljenih samcih miši (76) in podgan (88) kot tudi pri samicah podgan (89). Za z razmnoževanjem povezana obnašanja je bilo opisano, da osamitev med puberteto ne vpliva na starševsko (90) niti na spolno obnašanje podganjih samic (91), da pa osamljeni podganji samci slabše izražajo moško spolno obnašanje kot samci, nastanjeni v družbi (92, 93, 94). 2.1.2.3 Socialna osamitev med puberteto ter oksitocin in vazopresin v odraslem obdobju Raziskave o vplivu socialne osamitve med puberteto na nevrohipofizne hormone razkrivajo, da imajo osamljeni samci prerijskih voluharic povečano izraženost mRNK za AVP in OT v paraventrikularnem jedru (83), po drugi strani pa imajo nespremenjeno število tako AVP- kot tudi OT-imunoreaktivnih nevronov v paraventrikularnem jedru in tudi nespremenjeno koncentracijo AVP in OT v krvni plazmi (95). Osamljene samice prerijskih voluharic pa kažejo zmanjšano število AVP-imunoreaktivnih nevronov v paraventrikularnem jedru, vendar pa nespremenjeno koncentracijo v plazmi. OT v paraventrikularnem jedru in plazmi pri samicah ni spremenjen (95). Osamljeni mišji samci imajo zmanjšano število AVP- imunoreaktivnih nevronov v paraventrikularnem jedru in posledično je sproščanje AVP iz paraventrikularnega jedra ob socialnem stiku manjše (76). Osamljeni samci podgan imajo v paraventrikularnem jedru nespremenjeno število OT-imunoreaktivnih nevronov (96) ter zmanjšano (89) ali celo nespremenjeno število AVP-imunoreaktivnih nevronov (96), samice pa zmanjšano število OT-imunoreaktivnih nevronov (89). 19 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Veliko več je znanega o vplivu socialne osamitve v odraslosti. Dolgotrajna socialna osamitev v odraslem obdobju pri samicah, ne pa tudi pri samcih prerijskih voluharic, poveča število nevronov, imunoreaktivnih na OT v paraventrikularnem jedru (97, 98) in posledično tudi koncentracijo OT v krvi (98, 99). Izraženost mRNK za OTR v celotnem hipotalamusu je zmanjšana tako pri osamljenih samcih kot pri osamljenih samicah prerijskih voluharic (99). Po drugi strani pa osamitev v odraslosti lahko pri samicah poveča koncentracijo AVP v krvni plazmi (97) ali celo nima vpliva nanjo, tako kot pri samcih prerijskih voluharic (99). Izraženost mRNK za vazopresinski receptor 1a (V1aR) v celotnem hipotalamusu ob socialni osamitvi ni bila spremenjena niti pri samcih niti pri samicah prerijskih voluharic (99). 2.2 SOCIALNO PREPOZNAVANJE Socialno prepoznavanje je sposobnost posameznika prepoznati, zapomniti si ter razlikovati znani osebek od neznanega. Pri glodavcih ima ključni pomen pri medsebojnem prepoznavanju voh (pregledno v 22). Glodavci raziskujejo/ ovohavajo nove osebke dlje časa kot znane osebke, kar kaže na sposobnost socialne prepoznave. Če prepoznajo že videne/ ovohavane osebke, jih z vsakim naslednjim srečanjem raziskujejo in ovohavajo krajši čas, kar imenujemo socialna habituacija ali prilagoditev (opisano v 100, 101). Beljakovina c-Fos, ki je pokazatelj trenutne aktivnosti nevronov, se ob socialnem prepoznavanju najmočneje izraža v vohalnih betičih, piriformni skorji, medialnem in kortikalnem delu mandlja (CoA), stranskem septumu ter v spodnjem jedru končne proge in v medialnem delu predoptičnega področja (MPOA) (pregledno v 102, 103). Vzpostavitev in vzdrževanje socialnih razmerij je zapleten proces, ki vključuje več ravni obdelave podatkov v možganih. Sistema OT in AVP spadata med ključne sisteme v možganih, ki uravnavajo socialno prepoznavanje (opisano v 101, 104). OT (predvsem v mandlju) je bolj pomemben pri samicah (105, 106), AVP (predvsem v stranskem septumu) pa pri samcih (27, 107). Vohalni dražljaj ob socialnem prepoznavanju vzdraži vohalne betiče, od koder potekajo živčna vlakna vse do medialnega dela mandlja, kjer se pod vplivom OT vzpostavlja socialni spomin. Živčna vlakna iz medialnega dela mandlja se nadaljujejo do spodnjega jedra končne proge ter iz medialnega dela mandlja in spodnjega jedra končne proge vse do stranskega septuma, kjer se pod vplivom AVP predelujejo socialni dražljaji. Stranski septum je povezan s hipokampusom, ki ima ključno vlogo pri učenju in 20 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija pomnjenju. Spodnje jedro končne proge in stranski septum sta povezana z medialnim delom predoptičnega področja, ki uravnava spolno obnašanje (opisano v 101). 2.2.1 Socialno prepoznavanje in spolni hormoni med puberteto Številne raziskave so pokazale pomembnost spolnih hormonov ter njihovih receptorjev v odraslem obdobju pri uravnavanju socialnega prepoznavanja (pregledno v 104), in sicer preko uravnavanja sistemov OT (estradiol) (pregledno v 108) in AVP (testosteron) (109). Zelo redke in zgolj posredne raziskave o nemoteni izpostavljenosti estradiolu v času pubertete kažejo na dobro socialno prepoznavanje pri odraslih samicah (npr. 110), medtem ko testosteron med puberteto pri samcih slabša socialno prepoznavanje v odraslosti (111). Pri odraslih samicah miši in podgan je socialno prepoznavanje boljše v proestrusu, ko je raven estrogenov in progesterona v plazmi visoka v primerjavi z ostalimi fazami spolnega ciklusa (112). Odstranitev jajčnikov pri odraslih miših in podganah oslabi socialno prepoznavanje, dodajanje estradiola pa ga ponovno izboljša tako pri samicah miši (113, 114) kot podgan (114). Mišje samice in samci z izbitim genom za ERα ali ERβ slabše izražajo socialno prepoznavanje kot miši z nespremenjenim genomom (108, 115). Socialno prepoznavanje pri samicah brez gena za oba estrogenska receptorja je podobno kot pri samicah brez gena za OT (108), kar dokazuje, da uravnavanje socialnega prepoznavanja pri samicah poteka preko uravnavanja sistema OT (pregledno v 108). Estradiol uravnava izražanje OT v paraventrikularnem jedru preko ERβ (116) ter izražanje OTR v medialnem delu mandlja preko ERα (117, 118). Odstranitev mod pri odraslih samcih izzove poslabšanje socialnega prepoznavanja, dodajanje testosterona pa ga ponovno izboljša. Če testiranje obnašanja opravimo kmalu po kastraciji ali pa ga izvajamo redno vsak drugi dan po kastraciji, se socialno prepoznavanje ne razlikuje bistveno od tistega pri intaktnih samcih (109). Antagonist za AVP enako uspešno oslabi socialno prepoznavanje tako pri intaktnih kot tudi pri kastriranih samcih, ki prejemajo testosteron, ne pa tudi pri kastriranih, ki testosterona ne prejemajo (109). Uravnavanje socialnega prepoznavanja pri samcih poteka s strani testosterona preko uravnavanja sistema AVP, kar ne preseneča, saj je AVP v spodnjem jedru končne proge, medialnem delu mandlja in stranskem septumu veliko bolje izražen pri samcih kot samicah (119). Število AVP- 21 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija imunoreaktivnih teles nevronov v spodnjem jedru končne proge in vlaken v stranskem septumu se močno zmanjša po kastraciji, dodajanje testosterona pa te učinke izniči (120). 2.2.2 Socialno prepoznavanje in socialna osamitev med puberteto Socialna osamitev med puberteto močno poslabša sposobnost razlikovanja znane od neznane živali kakor tudi sposobnost prepoznave že znane živali pri podganjih samcih (88) in samicah (89). Nesposobnost socialnega prepoznavanja socialno osamljenih živali sovpada z zmanjšanjem števila OT- pri podganjih samicah kakor tudi števila AVP-imunoreaktivnih nevronov v paraventrikularnem jedru pri samcih podgan (89) in miši (76). Socialna osamitev med puberteto pri samcih zmanjša sproščanje AVP iz paraventrikularnega jedra po socialni izpostavljenosti v primerjavi s skupinsko nastanjenimi mišjimi samci (76). Socialno osamljene mišje samice (brez spolnih žlez ali brez spolnih žlez, vendar z dodanim estradiolom) imajo slabšo socialno habituacijo kakor tudi slabšo, vendar vseeno prisotno sposobnost razlikovanja znane od neznane živali (113). Po drugi strani pa Gatewood in sodelavci (121) poročajo, da so socialno osamljeni mišji samci in samice (brez spolnih žlez z dodanim testosteronom) vseeno sposobni dobrega socialnega prepoznavanja kakor tudi močne socialne habituacije, brez razlik med spoloma. 2.2.3 Socialno prepoznavanje ter oksitocin in vazopresin Raziskave velikokrat kažejo na kontradiktornost delovanja OT glede na uporabljen odmerek, in sicer podkožno dajanje visokih odmerkov OT poslabša socialni spomin (122), medtem ko ga nižje doze OT izboljšajo (123). Dodajanje nižjih odmerkov OT v možganske kletke ali medialni del mandlja bistveno ne spremeni ali pa celo izboljša socialno prepoznavanje, medtem ko dodajanje antagonista OT oslabi socialno prepoznavanje tako pri samicah podgan (124) in miši (108) kot tudi pri samcih podgan (125) in miši (126). Mišje samice (108) in samci brez gena za OT (126) imajo slabše socialno prepoznavanje v primerjavi z mišmi z nespremenjenim genomom ali spremenjenim genomom in dodanim OT v možganske kletke ali v medialni del mandlja (102, 126). Tudi miši brez gena za OTR niso sposobne razločevati znane od neznane živali (127, 128). OT izboljša socialno prepoznavanje tudi, če ga dodajamo 22 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija v stranski septum (129), ventralni hipokampus (130) in v medialni del predoptičnega področja (131). Številne raziskave pri podganjih samcih so pokazale, da AVP, dodan v možganske kletke ali v stranski septum, izboljšuje socialno prepoznavanje, medtem ko ga AVP ali V1aR antagonisti slabijo (120, 132, 133, 134, 135, 136). Po eni strani AVP izboljša socialno prepoznavanje tudi pri samicah, po drugi strani pa AVP antagonist nima vpliva (135). AVP je torej pomembnejši pri samcih (pregledno v 120), saj je AVP v možganih veliko bolj izražen pri samcih kot pri samicah (pregledno v 117). Samci miši brez gena za V1aR imajo močno zmanjšano sposobnost socialnega prepoznavanja in tudi ne kažejo nobene prilagoditve že znani živali po večkratni izpostavljenosti (137), kar pa ponovno izražanje gena za V1aR v stranskem septumu izniči (107). Podobno zmanjšanje socialnega spomina kažejo tudi podganji samci po dodajanju antagonista V1aR v supraoptično jedro ali v stranski septum, ki prejema živčna vlakna iz supraoptičnega jedra in v katerem so močno prisotni V1aR (138), podobno pa je bilo opisano pri podganjih samcih linije Brattleboro, ki niso sposobni proizvajati AVP (139). Socialno prepoznavanje pri samcih je torej v veliki meri odvisno od zadostnega izražanja AVP in V1aR predvsem v stranskem septumu (pregledno v 104, 107). Tudi hipokampus ima pomembno vlogo pri socialnem spominu, saj dodajanje protiteles proti AVP neposredno v hipokampus poslabša socialno prepoznavanje pri podganjih samcih (130). 2.3 ŽENSKO SPOLNO OBNAŠANJE Žensko spolno obnašanje lahko na splošno opišemo kot zapleten nabor različnih obnašanj pri samici, ki so potrebna in zadostna, da pride do združitve ženske in moške spolne celice (10). Pri glodavcih razlikujemo dva osnovna elementa ženskega spolnega obnašanja: proceptivno obnašanje ali spolna razvnetost in receptivno obnašanje ali spolna sprejemljivost (140). Spolna razvnetost je skupek različnih obnašanj, ki so potrebna za začetek kot tudi nadaljevanje spolnega odnosa s samcem in zajemajo poskakovanje z izmeničnim približevanjem in oddaljevanjem od samca, ovohavanje samca in miganje z ušesi (22, 140). Spolna sprejemljivost je trenutno zavzetje telesne drže, ki omogoča nemoten spolni odnos s samcem in zajema usločenje hrbtenice (lordoza) z dvigom glave in medenice ter odklonom repa na stran. Spolna razvnetost in spolna sprejemljivost sta veliko izrazitejši pri podganah kot pri miših (10, 22, 140). Žensko spolno obnašanje v glavnem uravnavajo spolni hormoni 23 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija (estradiol in progesteron) in nevroni v mnogih področjih možganov, ki so občutljivi na delovanje spolnih hormonov (v glavnem na estradiol) (npr. 141, 142, 143). Beljakovina c-Fos, ki je pokazatelj trenutne aktivnosti nevronov, se ob spolnem obnašanju najmočneje izraža v medialnem delu predoptičnega področja, ventromedialnem jedru hipotalamusa in v medialnem delu mandlja (141). Estradiol z delovanjem preko estrogenskega receptorja α (ERα) v nevronih teh področij možganov uravnava izražanje spolne sprejemljivosti pri samicah (142). 2.3.1 Žensko spolno obnašanje in spolni hormoni med puberteto Zelo malo je znanega o vplivu ženskih spolnih hormonov med puberteto na spolno obnašanje pri samicah, in še to je omenjeno le v preglednih člankih (npr. 1, 13). Presenetljivo je, da ženski spolni hormoni med puberteto kažejo na nasprotujoči si, včasih celo nesmiselni učinek, kot sta slabše izražanje ženskih (defeminizacija) in celo spodbujanje moških (maskulinizacija) oblik spolnega obnašanja pri samicah. Prisotnost jajčnikov ali estradiola med puberteto pri samicah zlatega hrčka poslabša izražanje spolne sprejemljivosti ali lordoze v primerjavi s samicami z odstranjenimi jajčniki pred puberteto (pregledno v 21). Po drugi strani pa prisotnost jajčnikov ali estradiola med puberteto pri samicah podgan ne spremeni izražanja ženskega spolnega obnašanja, vendar pa hkrati spodbuja izražanje moških oblik spolnega obnašanja ob prisotnosti samice ter večje zanimanje za samice (26). 2.3.2 Žensko spolno obnašanje in socialna osamitev med puberteto Edina raziskava pri samicah o vplivu socialne osamitve med puberteto in po njej ugotavlja, da se socialno osamljene podganje samice ne razlikujejo od skupinsko nastanjenih v stopnji izražanja spolne sprejemljivosti (lordoza) (91). Po drugi strani pa pri istih samicah dodajanje testosterona v odraslem obdobju izzove moško spolno obnašanje (naskakovanje spolno sprejemljivih samic in potiskanje z medenico), ki je bolje izraženo pri socialno nastanjenih kot pa osamljenih, kar sovpada z ugotovitvami pri socialnih in osamljenih sorojencih moškega spola (91). 24 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Maloštevilne dosedanje raziskave pri samicah laboratorijskih glodavcev (144, 145, 146, 147) dokazujejo, da določene vrste stresorjev v obdobju pubertete lahko izzovejo trajne morfološke spremembe v možganih in posledično spremenijo nevroendokrini odgovor na estradiol in progesteron, kar se kaže kot zmanjšana stopnja izražanja ženskega spolnega obnašanja v odraslem obdobju. Stresorji, kot so transport živali od vzrejne/ dobaviteljske do uporabniške organizacije (144, 145) ter enkratno injiciran bakterijski endotoksin lipopolisaharid (144) zmanjšajo spolno sprejemljivost, medtem ko tridnevna skrajnostna prostorska omejitev (146), dvodnevna popolna odtegnitev hrane (146) ter tridnevni sestavljen stres (skrajnostna prostorska omejitev z močno osvetlitvijo in posledično povečano temperaturo prostora) (146) ne spremeni spolnega obnašanja pri odraslih mišjih samicah. Škodljivi učinki transporta in lipopolisaharida na spolno sprejemljivost pri miših so mnogo močnejši, če delujejo med puberteto (pri starosti 4, 5, 6 ali 8 tednov) kot pa v odraslosti (pri starosti 10 tednov) (144, 145, 146). 2.3.3 Žensko spolno obnašanje ter oksitocin in vazopresin Poleg estradiola in progesterona so za sprožitev spolne sprejemljivosti potrebni še številni drugi nevropeptidi in nevrotransmiterji, ki imajo pomembno vlogo pri spreminjanju izrazitosti, trajanja in pogostosti lordoze (148, 149). Nevropeptid OT nastaja v paraventrikularnem in supraoptičnem jedru, od koder se ob spolnem odnosu sprošča po živčnih vlaknih preko nevrohipofize v krvožilni sistem. Po drugi strani pa so vlakna nevronov iz paraventrikularnega jedra povezana z ventromedialnim jedrom hipotalamusa (150), v katerem so močno izraženi OTR in ki ima ključno vlogo pri izražanju spolne sprejemljivosti in razvnetosti pri samicah v pojatvi (151, 152). Povečane vrednosti estradiola med pojatvijo tako povečajo sproščanje OT iz paraventrikularnega jedra (153) ter posledično povečajo OT- imunoreaktivnost nevronov in vezavo na OTR v ventromedialnem jedru hipotalamusa (154, 155). Raziskave o učinkih nevropeptida AVP na žensko spolno obnašanje kažejo ravno nasprotne rezultate kot pri OT. AVP, apliciran v možgansko kletko pri podganah (156) ali v medialni del predoptičnega področja pri hrčicah (157), zavira tako spolno sprejemljivost kot tudi spolno razvnetost, nasprotno pa antagonist V1aR spodbudi obe obnašanji. AVP lahko celo zavira pozitivne učinke OT na izražanje ženskega spolnega obnašanja (158). 25 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 2.4 STARŠEVSKO OBNAŠANJE Rosenblatt je starševsko obnašanje na splošno opisal kot vsako obnašanje, ki je izraženo do lastnega potomstva (159). Bolj natančno pa ga lahko opišemo kot vrsto različnih aktivnosti, ki neposredno pripomorejo k boljšemu preživetju oplojene jajčne celice ali skotenih mladičev. Starševskemu obnašanju samic pravimo materinsko, samcev pa očetovsko obnašanje (9). Očetovsko obnašanje je med sesalci dokaj redko, vendar prisotno pri nekaterih mesojedih, prvakih in glodavcih (pregledno v 9), med slednjimi predvsem pri kalifornijski miši, zlatem hrčku, hišni miši ter prerijski voluharici. Pri glodavcih poznamo dva osnovna vzorca starševskega obnašanja: obnašanje, ki je usmerjeno k mladičem, in obnašanje, ki ni usmerjeno k mladičem (160). K mladičem usmerjeno obnašanje vključuje zadrževanje mladičev v gnezdu, negovanje, gretje pod telesom in druge dejavnosti, ki vključujejo telesni stik z mladiči. Obnašanje, ki ni usmerjeno k mladičem, pa zajema gradnjo gnezda, zaužitje posteljice in varovanje mladičev (pregledno v 161). Pri podganah in miših ob kotitvi pride do hitrega padca progesterona in hkrati dviga estradiola, prolaktina in laktogenih hormonov posteljice, kar spodbudi začetek materinskega obnašanja, za vzdrževanje obnašanja pa so dovolj že dražljaji mladičev (160, 162, 163). Pri odraslih samicah in samcih podgan lahko starševsko obnašanje izzovemo z večkratnih izpostavljanjem tujim mladičem oziroma z razvojem t.i. senzitizacije (opisano v 9, 164). V nasprotju s podganami lahko mišje samice in samci starševsko obnašanje izražajo že po prvi izpostavljenosti tujim mladičem (163, 165) in celo neodvisno od estrogenih hormonov (166). Samci tako podgan kot miši so načeloma bolj nagnjeni k detomoru in slabše izražajo starševsko obnašanje kot samice (165). Beljakovina c- Fos, ki je pokazatelj trenutne aktivnosti nevronov, se po materinskem obnašanju ob izpostavljenosti mladičem najmočneje izraža v medialnem delu predoptičnega področja in spodnjem jedru končne proge, manj v medialnem in kortikalnem delu mandlja, v stranskem septumu ter v nekaterih drugih delih možganov (167, 168). Estrogeni v medialnem delu predoptičnega področja in v spodnjem jedru končne proge spodbujajo materinsko obnašanje pri podganah (163, 168, 169, 170). 2.4.1 Starševsko obnašanje in spolni hormoni med puberteto Mlade podganje samice in samci pred puberteto hitro pristopijo k mladičem, jih nosijo v gnezdo, ližejo in stiskajo k telesu, kar se drastično zmanjša z nastopom pubertete in pokažejo 26 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija se razlike med spoloma (171). Pri podganjih samcih je najpogostejša ugotovitev, da odstranitev mod pred začetkom pubertete načeloma izboljša očetovsko obnašanje in zmanjša detomore (pregledno v 165, 172), po drugi strani pa odstranitev jajčnikov pri podganjih samicah pred puberteto in med njo lahko zmanjša (173) ali pa nima bistvenega učinka na materinsko obnašanje v odraslosti (174). Mnogo več je znanega o vplivih spolnih hormonov v odraslem obdobju. Odstranitev jajčnikov ter s tem ženskih spolnih hormonov pri neizkušenih odraslih samicah miši (175) in podgan (176) nima bistvenega vpliva na starševsko obnašanje, medtem ko pri mišjih samcih po nekaterih raziskavah odstranitev mod izboljša starševsko obnašanje (177), po nekaterih drugih pa pri samcih miši in podgan nima vpliva na starševsko obnašanje (121, 178, 179). Samice miši v glavnem hitreje pristopijo k mladičem, jih prenesejo v gnezdo in negujejo pod telesom ter so veliko manj nagnjene k detomoru kot samci (121), ne glede na prisotnost ali odsotnost jajčnikov v odraslosti (175) ali nadomeščanje estradiola po odstranitvi jajčnikov (177). Po drugi strani pa odstranitev mod ne glede na dodajanje ali nedodajanje estradiola pri odraslih mišjih samcih skrajša čas do začetka prenašanja mladičev v gnezdo ter spodbudi občutljivost do mladičev v primerjavi s samci z modi ali brez njih in ne glede na nadomeščanje testosterona (177). 2.4.2 Starševsko obnašanje in socialna osamitev med puberteto Socialna osamitev med puberteto nima vpliva na očetovsko obnašanje pri odraslih mišjih samcih (180), saj ne spremeni nagnjenosti k detomoru niti stopnje izražanja očetovskega obnašanja (prenašanje mladičev v gnezdo) v primerjavi s skupinsko nastanjenimi samci. Po drugi strani pa so socialno osamljeni samci po puberteti (od 60. dneva naprej) manj nagnjeni k detomoru in hkrati močneje izražajo očetovsko obnašanje (180). Socialno osamljene mišje samice med puberteto in po njej začnejo hitreje prenašati mladiče v gnezdo in jih prenesejo več v primerjavi z osamljenimi samci (121). Podobna razlika med spoloma se kaže tudi pri nastanitvi v skupine po 3 do 5 miši od odstavitve naprej (177). 27 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 2.4.3 Starševsko obnašanje ter oksitocin in vazopresin Ob koncu brejosti, ko močno pade raven progesterona in narastejo vrednosti estrogenov, se nevroni v medialnem delu predoptičnega področja močneje odzovejo na estrogene, kar spodbudi nevrone k tvorbi in sproščanju nevroaktivnih substanc (nevrotransmiterji, nevropeptidi), ki spodbudijo starševsko obnašanje (podrobno opisano v 163). Eden od teh nevropeptidov je OT (181), ki se iz paraventrikularnega jedra med drugim sprošča tudi do medialnega dela predoptičnega področja, v katerem je izraženo veliko OTR (182). Če pride do poškodb nevronov v paraventrikularnem jedru, se poslabša tudi izražanje starševskega obnašanja (183, 184). V primerjavi z OT se zdi, da je nevropeptid AVP manj pomemben pri uravnavanju starševskega obnašanja in zato tudi manj proučevan (185, 186), čeprav dodajanje AVP v možganske kletke ali v medialni del predoptičnega področja lahko pripomore k izboljšanju starševskega obnašanja pri podganah (pregledno v 187). OT, dodan v cerebrospinalno tekočino stranskih možganskih kletk, sproži popolno materinsko obnašanje pri podganjih samicah, poprej tretiranih z estradiolom (185) ali v fazi pojatve (186), medtem ko blokiranje OTR podaljša in oslabi začetek materinskega obnašanja. Podobno je pri ovcah (188). V primerjavi s podganami raziskave pri miših razkrivajo, da OT ni tako nujno potreben za popolno izražanje materinskega obnašanja (razen dojenja), saj se samice brez OT ne razlikujejo bistveno v obnašanju od samic brez te mutacije (189), medtem ko je OTR nujno potreben, saj mišje samice (po kotitvi ali nebreje) z izbitim genom za OTR okrnjeno izražajo materinsko obnašanje (127). Po drugi strani pa kastracija kot tudi dodajanje estradiola pri mišjih samcih primerljivo poveča število OT-imunoreaktivnih nevronov v paraventrikularnem jedru, kar sovpada z izboljšanjem starševskega obnašanja (prenašanje mladičev v gnezdo), ki je primerljivo z obnašanjem pri samicah (intaktnih, z odstranjenimi jajčniki ali z odstranjenimi jajčniki in dodanim estradiolom) (177). 2.5 DEPRESIVNE IN ANKSIOZNE MOTNJE TER RAZLIKE MED SPOLOMA Depresija je raznotera, večplastna razpoloženjska oziroma čustvena motnja, ki se izraža na duševni, vedenjski in fiziološki ravni (190). Depresivne motnje razvrščamo glede na stopnjo resnosti klinične slike in trajanja v 3 glavne skupine: veliko depresivno motnjo, distimijo in bipolarno motnjo (191). Za veliko (ali hudo) depresivno motnjo so značilni močno depresivno 28 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija razpoloženje, občutek neugodja ter nevrovegetativne in kognitivne spremembe, ki trajajo najmanj 2 tedna (190, 192). Distimija (ali prikrita depresija) zajema zmerno ali blago depresivno razpoloženje, ki traja vsaj 2 leti, prekinitve simptomov pa niso daljše od 2 mesecev. Bipolarna motnja (ali manična depresija) je razpoloženjska motnja, pri kateri se menjavata razpoloženjski stanji depresije in manije (191, 192, 193). Epidemiološke in klinične študije ugotavljajo razlike med spoloma z nastopom pubertete (194), kjer je obolevnost za depresijo pri ženskah najmanj dvakrat pogostejša kot pri moških (195, 196). Raziskave zadnjih let razkrivajo vpletenost številnih hormonskih sistemov pri razvoju motenj v razpoloženju, predvsem pa poudarjajo pomen motenj v osi HPA in HPG (191, 197) pri razvoju depresivnih bolezenskih znakov. Receptorji tako za glukokortikoidne kot spolne hormone so močno izraženi prav v področjih možganov (hipotalamus, osrednji mandelj, hipokampus, nekatera področja možganske skorje), vključenih v razvoj depresivnih motenj (192, 197). Anksiozne motnje so čustvene motnje, ki jih lahko natančneje opišemo in opredelimo glede na okoliščine, predmet ali misli, ki so izzvale strah, avtonomne, kognitivne in motorične značilnosti strahu ter glede na različne odzive v vedenju pri spopadanju s strahom (190). Odzivi anksioznosti se lahko razlikujejo v jakosti, pogostnosti, vztrajnosti, sprožilnih dejavnikih, resnosti in posledicah ter v številnih drugih značilnostih (198). Diagnostični in statistični priročnik duševnih motenj DMS-5® Ameriškega združenja psihiatrov podrobno opredeljuje več kot 12 različnih anksioznih motenj, ki jih uvršča v 5 glavnih skupin: fobije, panična motnja, obsesivno kompulzivna motnja, postravmatska stresna motnja in splošna anksiozna motnja (190). Epidemiološke in klinične študije ugotavljajo razlike med spoloma, saj je obolevnost za anksioznimi motnjami pri ženskah najmanj dvakrat pogostejša kot pri moških (195, 196). Anksiozne motnje se pogosto prepletajo z depresivnimi (199), saj se prepletata tudi njuna regulacijska sistema (200). 2.5.1 Zdravljenje depresivnih in anksioznih motenj ter razlike med spoloma Pri zdravljenju depresivnih motenj se uporabljajo različni antidepresivi, kot so SSRI, triciklični antidepresivi (TCA) in zaviralci oksidaz monoaminov (MAOI). Med njimi se najpogosteje uporabljajo in imajo tudi najmanj stranskih učinkov antidepresivi SSRI (199), ki jih pogosto predpisujejo tudi pri zdravljenju anksioznih motenj (201). Antidepresivi SSRI 29 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija zvišujejo koncentracijo živčnega prenašalca serotonina (5-HTT ali SERT) v sinapsah ter posledično zvišujejo zunajcelično koncentracijo serotonina (5-HT) (199, 202). Fluoksetin je bil prvi SSRI, ki je bil dostopen na tržišču (203, 204). Vedno več raziskav ugotavlja razlike med spoloma v farmakokinetiki in/ ali farmakodinamiki antidepresivnih zdravil, vendar zdravljenje ostaja še zmeraj enako pri obeh spolih (pregledno v 205). Raziskave so pokazale, da fiziološke razlike med spoloma in spolni hormoni lahko vplivajo na vsrkavanje, prerazporeditev, presnovo, farmakodinamiko in pojav stranskih učinkov mnogih zdravil (pregledno v 206), tudi fluoksetina (207, 208, 209). Ženske se bolje odzivajo na zdravljenje s fluoksetinom kot moški in k temu naj bi prispevali prav estrogeni hormoni (209), kar dokazujejo tudi raziskave pri podganjih samicah (v fazah proestrusa/ estrusa s povečanimi vrednostmi estradiola) (210) in samcih (211). 2.5.2 Živalski modeli depresivnih in anksioznih motenj ter razlike med spoloma Popoln živalski model za proučevanje različnih kliničnih stanj pri človeku mora izpolnjevati 3 merila: napovedno, pričakovano in temeljno vrednost (212), kar pa je pri modelih za depresivne in anksiozne motnje težko, saj določenih kliničnih znakov, značilnih za ljudi, ni mogoče izzvati in ocenjevati pri živalih (občutki krivde, samomorilne misli) (190). Pri proučevanju učinka antidepresivnih zdravil se pri modelnih organizmih najpogosteje uporabljajo 3 testi obnašanja, ki pri laboratorijskih živalih delujejo kot nenaden in kratkotrajen stresor: test prisilnega plavanja (FST) (213, 214, 215), dvignjen labirint v obliki križa (EPM) (212, 216, 217) in test odprtega polja (OF) (212, 218). Pri FST se ocenjuje stanje negibnosti živali v brezizhodnem položaju, kar kaže na stanje, podobno obupanosti in vdanosti v usodo (219). Pri testih EPM in OF se ocenjuje izogibanje dvignjenim, odprtim in svetlim predelom labirinta, kar kaže na stanje, podobno bojazljivosti in prestrašenosti (216, 217). Pri testu OF pa se dodatno preverja še sposobnost gibanja oziroma motivacija za gibanje testirane živali (220). Dosedanje raziskave delovanja fluoksetina in razlik med spoloma pri testih FST, EPM in OF pri miših in podganah so dale zelo raznolike, včasih celo nasprotujoče si rezultate, najverjetneje prav zaradi uporabe različnih živalskih vrst, linij živali, stresnega ravnanja, testiranja samic v različnih fazah spolnega ciklusa, uporabe različnih odmerkov, načina in 30 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija časa dajanja fluoksetina ter mnogih drugih dejavnikov (pregledno v 84). Kljub tej raznolikosti se lahko izpostavi nekaj skupnih točk. Dolgotrajnejše dajanje fluoksetina kaže na enotnejše učinke kot kratkotrajno ali enkratno dajanje, kar kaže na potrebo po daljšem prilagoditvenem obdobju na povečane vrednosti 5-HT (192). Samice v proestrusu ali estrusu so načeloma manj depresivne (221, 222) in manj anksiozne (223, 224, 225) v primerjavi s samci in samicami v medestrusu ali diestrusu, medtem ko v gibalnih aktivnostih med spoloma ni bistvenih razlik (220, 223). Samice v proestrusu ali estrusu so v glavnem bolj odzivne na antidepresivno delovanje fluoksetina (220, 222) in se nanj odzivajo z obnašanjem, podobnim anksioznemu, (225) v primerjavi s samci in samicami v medestrusu in diestrusu. Fluoksetin zmanjša spontanost po gibanju pri mišjih samcih (226, 227, 228) in samicah (228, 229), pri podganah pa nima vpliva (220, 230). 31 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3 OBJAVLJENI ZNANSTVENI ČLANKI 3.1 ADOLESCENT SOCIAL ISOLATION CHANGES SOCIAL RECOGNITION IN ADULT MICE SOCIALNA OSAMITEV V MLADOSTI SPREMENI SOCIALNO PREPOZNAVANJE PRI ODRASLIH MIŠIH Kercmar J1, Büdefeld T1, Grgurevic N1, Tobet SA2, Majdic G1, 3 1 Center za genomiko živali, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 Department of Biomedical Sciences, Colorado State University, Fort Collins, Colorado, US 3 Inštitut za fiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija Objavljeno v: Behavioural Brain Research 2011; 216(2): 647–51. 32 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Izvleček Socialna osamitev močno vpliva na številna obnašanja odraslih glodavcev, vendar je malo znanega o učinkih osamitvenega stresa pri socialnem obnašanju. Pri naši raziskavi smo proučevali socialno prepoznavanje pri mišjih samcih in samicah, ki smo jih trajno socialno osamili vse od starosti 30 dni in jih testirali okrog 80. dneva starosti ali jih začasno osamili od 30. do 60. dneva starosti in jih nato od 60. dneva do testiranja pri 80 dnevih starosti ponovno skupinsko nastanili. Miši obeh osamljenih skupin smo primerjali s kontrolno skupino miši, ki je bila nastanjena v socialnih skupinah med celotno raziskavo. Izvedli smo standardni test socialnega prepoznavanja, kjer smo kot stimulusne živali uporabili odrasle mišje samice z odstranjenimi jajčniki. Pri testnih živalih smo beležili in ocenjevali čas ovohavanja stimulusne miši. Stimulusno samico smo dodajali testnim živalim v domačo kletko osemkrat po 1 minuto vsakih 9 minut, devetič pa uporabili novo, neznano stimulusno samico. Kontrolne skupinsko nastanjene miši obeh spolov so izražale močan vzorec socialnega učenja in sposobnost prepoznavanja znane od neznane živali, medtem ko trajno socialno osamljene miši niso kazale nobenega socialnega prepoznavanja. Tudi začasna osamitev miši od 30. do 60. dneva starosti je zmanjšala sposobnost socialnega učenja v primerjavi s skupinsko nastanitvijo ter prizadela socialno prepoznavanje predvsem pri samicah. Naše ugotovitve kažejo, da ima socialna osamitev močan vpliv na socialno obnašanje miši, saj že začasna osamitev lahko privede do trajnih sprememb pri obnašanju. 33 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 34 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 35 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 36 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 37 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 38 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3.2 SOCIAL ISOLATION DURING PUBERTY AFFECTS SOCIAL BEHAVIOR IN ADULT MICE SOCIALNA OSAMITEV MED PUBERTETO PRIZADENE SOCIALNO OBNAŠANJE ODRASLIH MIŠI Kerčmar J1, Majdič G1, 2 1 Center za genomiko živali, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Gerbičeva 60, 1000 Ljubljana, Slovenija 2 Inštitut za fiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Slomškov trg 15, 2000 Maribor, Slovenija Objavljeno v: Slovenian Veterinary Research 2010; 47(4): 159–62. 39 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Izvleček Zgodnja socialna osamitev, ki povzroča spremembe tako v strukturi možganov kot tudi v izražanju genov, ima lahko pomemben vpliv na različna socialna obnašanja. Vpliv osamitve pri miših na socialno prepoznavanje ali izražanje vazopresina (AVP) in oksitocina (OT) pa še ni bil raziskan. Proučevali smo socialno prepoznavanje miši obeh spolov, ki so bile nastanjene individualno vse od starosti 30 dni do testiranja pri starosti 80 dni, individualno nastanjene od 30. do 60. dneva in nato od 60. dneva ponovno skupinsko nastanjene, in miši iz kontrolne skupine, ki so bile ves čas raziskave nastanjene skupinsko. S standardnim testom socialnega prepoznavanja smo ugotavljali sposobnost testnih miši, da ločijo znano miš od neznane. Skupinsko nastanjene miši so kazale neokrnjen, močan socialni spomin, medtem ko ga miši, nastanjene individualno, niso. Zanimivo je, da so individualno nastanjene miši za določeno časovno obdobje (od 30. do 60. dneva) kazale slabši socialni spomin, kar pomeni, da ima lahko tudi osamitev za določen čas trajne posledice pri socialnem obnašanju, še posebej pri samicah. Z imunohistokemijsko metodo smo ugotavljali izražanje vazopresina in oksitocina v možganih in ugotovili spolno razliko v izražanju vazopresina v stranskem septumu (LS). Samci so imeli namreč več vazopresina v živčnih vlaknih kot samice. V izražanju tako vazopresina kot oksitocina glede na način nastanitve nismo našli razlik. 40 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 41 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 42 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 43 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3.3 SOCIAL ISOLATION DURING PUBERTY AFFECTS FEMALE SEXUAL BEHAVIOR IN MICE SOCIALNA OSAMITEV MED PUBERTETO VPLIVA NA ŽENSKO SPOLNO OBNAŠANJE ODRASLIH MIŠI Kercmar J1, Tobet SA2, Majdic G1, 3 1 Center za genomiko živali, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 Department of Biomedical Sciences, Colorado State University, Fort Collins, Colorado, US 3 Inštitut za fiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija Objavljeno v: Frontiers in Behavioral Neuroscience 2014; 8: 337. 44 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Izvleček Izpostavljenost stresnim dogodkom med puberteto lahko vodi do dolgotrajnih sprememb pri obnašanju v odraslem obdobju. To sovpada s preoblikovanjem in reorganizacijo možganov med puberteto, ki sta pogojena z aktivnostjo spolnih hormonov. Za socialne živali, kot so miši, predstavlja socialna osamitev stresno izkušnjo, vendar pa je malo znanega o vplivu takšne stresne izkušnje med puberteto na spolno obnašanje v odraslem obdobju. Proučevali smo spolno obnašanje mišjih samic, ki smo jim odstranili spolne žleze ter jim dovajali estradiol in progesteron. Miši smo trajno socialno osamili vse od starosti 25 dni in jih testirali okrog 95. dneva starosti ali jih začasno osamili od 25. do 60. dneva starosti in jih nato od 60. dneva ponovno skupinsko nastanili. Miši obeh osamljenih skupin smo primerjali s kontrolno skupino samic, ki je bila nastanjena v socialnih skupinah med celotno raziskavo. Pri testnih samicah smo beležili in ocenjevali spolno sprejemljivost, pri spolno izkušenih stimulusnih samcih pa posamezne aktivnosti moškega spolnega obnašanja. Kontrolne skupinsko nastanjene samice so spolno sprejemljivost izražale močneje kot pa obe skupini socialno osamljenih samic. Socialne samice so namreč imele višji količnik lordoze (LQ) in so pogosteje zavzele držo močne usločenosti hrbtenice, ki je pogojena s spolno sprejemljivostjo, v primerjavi z osamljenimi mišmi. Nastanitveni dejavnik pri samicah ni imel vpliva na spolno obnašanje pri stimulusnih samcih, iz česar lahko sklepamo, da socialna osamitev ni prizadela spolne privlačnosti samic. Skupinsko nastanjene samice so imele manj živčnih celic v anteroventralnem delu periventrikularnega jedra (AVPV) in v ventromedialnem jedru hipotalamusa (VMH), ki v primerjavi z obema socialno osamljenima skupinama izražajo estrogenski receptor (ER) α. Naše ugotovitve dokazujejo, da socialna osamitev mišjih samic med puberteto vpliva na žensko spolno obnašanje, saj ga niti ponovna socialna nastanitev v odraslem obdobju ni uspela povrniti na raven obnašanja, ki so ga izražale skupinsko nastanjene samice. 45 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 46 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 47 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 48 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 49 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 50 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 51 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 52 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 53 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3.4 GONADECTOMY PRIOR TO PUBERTY DECREASES NORMAL PARENTAL BEHAVIOR IN ADULT MICE ODSTRANITEV SPOLNIH ŽLEZ PRED PUBERTETO POSLABŠA STARŠEVSKO OBNAŠANJE ODRASLIH MIŠI Kercmar J1, Snoj T2, Tobet SA3, Majdic G1, 4 1 Center za genomiko živali, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 Inštitut za fiziologijo, farmakologijo in toksikologijo, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 3 Department of Biomedical Sciences, Colorado State University, Fort Collins, Colorado, US 4 Inštitut za fiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija Objavljeno v: Hormones and Behavior 2014; 66(4): 667–73. 54 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Izvleček Steroidni hormoni iz spolnih žlez vplivajo tako na razvoj kot tudi na izražanje številnih obnašanj, vključno s starševskim obnašanjem. Razvoj sposobnosti izražanja številnih obnašanj se odvija pod vplivom spolnih hormonov, ki se začne s spolno diferenciacijo in se nadaljuje v puberteto. Čas odstranitve spolnih žlez ima zato lahko pomemben in dolgotrajen vpliv na organizacijo in aktivacijo določenih delov živčnega sistema, ki so pomembni pri uravnavanju izražanja različnih vrst obnašanja. Naša raziskava je proučevala pomembnost nemotenega delovanja spolnih žlez med puberteto/ adolescenco na sposobnost izražanja starševskega obnašanja miši v odraslem obdobju. Samcem in samicam miši divjega tipa smo odstranili moda in jajčnike bodisi pred puberteto (starost 25 dni) ali po njej (starost 60 dni) ter jih v odraslem obdobju testirali za starševsko obnašanje brez dodanega in z dodanim estradiol benzoatom. Dodatnim skupinam miši smo odstranili moda in jajčnike pri starosti 25 dni ter jim med puberteto (do starosti 60 dni) dodajali testosteron (samci) oziroma estradiol (samice). Samice s prisotnimi ali z odstranjenimi jajčniki med puberteto ter tretiranimi z estradiolom med puberteto so močneje izražale starševsko obnašanje, usmerjeno k mladičem, v primerjavi z mišmi brez spolnih žlez med puberteto, ne glede na dodajanje estradiola v odraslem obdobju. Mišji samci in samice, ki so prejemali estradiol v odraslosti, so močneje izražali starševsko obnašanje, ki ni usmerjeno k mladičem (gradnja gnezda), kot pa pred prejemanjem estradiola, ne glede na čas odstranitve mod oziroma jajčnikov. Samice smo dodatno testirali še za žensko spolno obnašanje z namenom, da bi ugotovili morebitne spremembe v občutljivosti odziva na spolne hormone glede na dolžino časa brez jajčnikov. Med samicami z odstranjenimi jajčniki pred puberteto ali po njej v spolnem obnašanju ni bilo statistično značilnih razlik, kar pa popolnoma ne izključuje možnosti, da starševsko obnašanje ni bolj občutljivo na daljšo časovno odsotnost spolnih hormonov. Izsledki kažejo na slabše starševsko obnašanje do mladičev najverjetneje zaradi odsotnosti spolnih žlez in s tem odsotnosti spolnih steroidnih hormonov med puberteto/ mladostništvom. 55 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 56 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 57 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 58 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 59 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 60 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 61 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 62 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 3.5 SEX-SPECIFIC BEHAVIORAL EFFECTS OF FLUOXETINE TREATMENT IN ANIMAL MODELS OF DEPRESSION AND ANXIETY RAZLIKE MED SPOLOMA V DELOVANJU ZDRAVILA FLUOKSETIN PRI ŽIVALSKIH MODELIH ZDRAVLJENJA DEPRESIVNIH IN ANKSIOZNIH MOTENJ Kerčmar J1, Majdič G1, 2 1 Center za genomiko živali, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Gerbičeva 60, 1000 Ljubljana, Slovenija 2 Inštitut za fiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Slomškov trg 15, 2000 Maribor, Slovenija Objavljeno v: Slovenian Veterinary Research 2014; 51(4): 189–200. 63 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija Izvleček Bolezenski znaki in uspešnost zdravljenja z različnimi zdravili se pri številnih duševnih boleznih med spoloma močno razlikujejo. Depresivne in anksiozne motnje se 2- do 3-krat pogosteje pojavljajo pri ženskah kot pri moških, vseeno pa se večina predkliničnih raziskav in preizkušanj novih zdravil opravi samo pri samcih poskusnih živali. Več raziskav je nakazalo, da je odziv žensk in ženskih živali na selektivne zaviralce prevzema serotonina (SSRI) boljši kot pri moških, kar kaže, da spolni hormoni vplivajo na odzivnost organizma na tovrstna zdravila. Uvedba prvega zdravila iz skupine SSRI, in sicer prozaca v osemdesetih letih prejšnjega stoletja, je bil pomemben napredek pri zdravljenju motenj depresivnosti od odkritja zaviralcev monoaminskih oksidaz in tricikličnih zdravil proti depresiji trideset let prej. Fluoksetin je danes v široki uporabi za zdravljenje depresivnih motenj, pa tudi za zdravljenje motenj anksioznosti. Poskusne živali predstavljajo dober model za proučevanje vpliva zdravil proti depresivnim in anksioznim motnjam in tudi za proučevanje spolnih razlik v delovanju tovrstnih zdravil. V preglednem članku smo predstavili različne živalske modele za proučevanje motenj depresivnosti in anksioznosti, in sicer test prisilnega plavanja, test dvignjenega labirinta in test odprtega polja. Poleg tega je predstavljen vpliv fluoksetina na obnašanje živali v teh testih s poudarkom na razlikah med spoloma. Številne raziskave v preteklosti so pokazale, da so laboratorijski glodavci primeren model za proučevanje tovrstnih motenj, v prihodnosti pa bo treba večji poudarek nameniti raziskavam razlik med spoloma pri nastanku tovrstnih obolenj in pri njihovem zdravljenju. 64 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 65 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 66 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 67 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 68 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 69 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 70 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 71 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 72 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 73 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 74 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 75 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 4 RAZPRAVA Puberteta oziroma mladostništvo je obdobje, ki zajema ne samo spolno dozorevanje osebka, ampak tudi kognitivno, čustveno in socialno dozorevanje obnašanja (1, 12). Izpostavljenost različnim stresnim dejavnikom v mladosti lahko vodi do dolgotrajnih sprememb v obnašanju v odraslem obdobju, kar lahko sovpada s spremembami v preoblikovanju in reorganizaciji možganov s strani spolnih (1) in/ ali stresnih hormonov (45). Miši in podgane so socialne živali, ki v naravnem okolju živijo v večjih socialnih skupinah z urejeno družbeno lestvico (65, 231), zato lahko socialna osamitev predstavlja močan stresni dejavnik. Za socialne živali je značilna visoka stopnja socialnih stikov in medsebojnih odnosov, kar jim omogoča razvoj socialnih veščin, ki so nujno potrebne za vzpostavitev in vzdrževanje socialne skupine in ne nazadnje za obstoj same živalske vrste. Ena od osnovnih veščin socialnega obnašanja je socialno prepoznavanje, ki predstavlja osnovo za socialno življenje (opisano v 106). Sistema OT in AVP sta eden od ključnih sistemov, ki uravnavata različna socialna obnašanja, vključno s socialnim prepoznavanjem (pregledno v 101, 104, 232), medtem ko je sistem OT pomemben predvsem pri uravnavanju z razmnoževanjem povezanih obnašanj (150, 151, 152, 182, 183). V okviru doktorskega dela smo dokazali, da trajna socialna osamitev med puberteto in po njej popolnoma onesposobi odrasle miši obeh spolov socialnega učenja ter socialnega prepoznavanja, kar se sklada z opažanji drugih avtorjev pri samcih miši (76) in podgan (88, 89) ter pri podganjih samicah (89). Tanaka in sod. so ugotovili, da socialna osamitev med puberteto pri podganah zmanjša število OT-imunoreaktivnih nevronov v paraventrikularnem jedru pri samicah in AVP-imunoreaktivnih nevronov pri samcih (89), kar sovpada s splošno znanim dognanjem, da ima OT večji pomen pri uravnavanju obnašanja pri samicah (105), AVP pa pri samcih (27). Nasprotno je pri nadaljnjih raziskavah v našem laboratoriju bilo ugotovljeno (neobjavljeni podatki), da socialna osamitev pri miših obeh spolov nima vpliva niti na OT (koncentracija v krvni plazmi, število OT-imunoreaktivnih nevronov v paraventrikularnem jedru) niti na sistem AVP (AVP-imunoreaktivnost v živčnih vlaknih v stranskem septumu, izražanje gena za V1aR v hipotalamusu ter epigenetske spremembe v promotorskem območju tega gena), kar je v skladu z rezultati podobnih raziskav pri prerijskih voluharicah (95, 99). Vrednotenje sproščanja OT in AVP iz paraventrikularnega jedra bi morda dalo bolj jasno sliko vpliva socialnega stresa med puberteto (76). Pri naši raziskavi 76 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija smo pokazali, da so socialno nastanjeni mišji samci sposobni boljšega socialnega učenja in prepoznavanja v primerjavi s socialnimi samicami, kar se sklada s predhodnimi ugotovitvami pri podganah (233, 234). Pri mišjih samcih smo potrdili že znano dejstvo, da imajo samci večjo izraženost AVP v živčnih vlaknih v stranskem septumu v primerjavi s samicami (117), s čimer bi lahko razložili ugotovljeno spolno razliko pri socialnem prepoznavanju. Nadalje smo preverili možnost povrnitve sposobnosti socialnega prepoznavanja pri osamljenih miših obeh spolov s ponovno socialno nastanitvijo v odraslem obdobju. Dokazali smo, da je sposobnost socialnega učenja pri začasno osamljenih samicah med puberteto primerljiva, pri samcih pa delno zmanjšana, glede na kontrolne socialno nastanjene miši, medtem ko se je sposobnost socialnega prepoznavanja povrnila le pri samcih. Slednje bi lahko razložili s predhodnimi dognanji pri podganah, kjer so socialno osamitev ocenili kot bolj stresno za samice (višje vrednosti kortikosterona) v primerjavi s samci (69, 80). Obstoj socialne združbe kot tudi obstoj živalske in ne nazadnje tudi človeške vrste je v veliki meri odvisen od uspešnosti razmnoževanja njenih članov. Ker je vpliv socialne osamitve in drugih stresnih dejavnikov med puberteto na spolno obnašanje v veliki meri že raziskan pri samcih laboratorijskih glodavcev (pregledno v 70), ki v glavnem privede do poslabšanja moškega spolnega obnašanja (91, 92, 93, 94), smo se v doktorski disertaciji osredotočili predvsem na spolno obnašanje samic. Pri naši raziskavi smo tako preverili in dokazali, da socialna osamitev med puberteto in po njej poslabša sposobnost izražanja ženskega spolnega obnašanja pri mišjih samicah, kar je v nasprotju s starejšo raziskavo pri podganjih samicah, pri katerih osamitveni stresor ni imel vpliva na sposobnost izražanja spolnega obnašanja (91). Že predhodne raziskave vpliva različnih kratkotrajnih stresorjev med puberteto (prevoz ali enkratno injiciranje endotoksina lipopolisaharida) pri mišjih samicah pa so pokazale močno prizadetost izražanja spolne sprejemljivosti v odraslosti (145, 146), iz česar bi lahko sklepali, da so mišji samice bolj občutljive na socialno osamitev kot podgane. V nasprotju s spolno sprejemljivostjo spolna privlačnost samic s socialno osamitvijo ni bila spremenjena. Podobno kot pri socialnem prepoznavanju ponovna socialna nastanitev v odraslem obdobju ni povrnila spolne sprejemljivosti osamljenih samic do ravni obnašanja, ocenjenega pri socialno nastanjenih mišjih samicah. Ugotovili smo, da socialna osamitev med puberteto sovpada s povečanjem števila nevronov v ventromedialnem jedru hipotalamusa in anteroventralnem delu 77 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija periventrikularnega jedra, ki izražajo ERα. To se močno razhaja z rezultati predhodnih raziskav pri mišjih samicah (enkratni stresor prevoza in injiciranja lipopolisaharida) (144) in pri samicah prerijskih voluharic (stresor osamitve) (147), pri čemer poročajo o zmanjšanem ali nespremenjenem izražanju ERα v omenjenih področjih možganov. Do razlik med raziskavami bi lahko prišlo zaradi uporabe različnih vrst stresorjev, trajanja stresa, živalske vrste, linije miši in mnogih drugih dejavnikov (opisano v 45). Kratkotrajno delovanje stresorja pri raziskavi Ismaila in sod. bi lahko hitro zavrlo os HPG, nakar bi sledilo povečanje vrednosti estradiola in posledično zmanjšano izražanje ERα (144). Medtem ko bi lahko dolgotrajno delovanje stresorja pri naši raziskavi zaviralo delovanje osi HPG ter držalo vrednosti estradiola dlje časa na nižjem nivoju (pregledno v 235), bi kot protiutež lahko sledilo povečano izražanje ERα. Spolni hormoni v odraslosti so nujno potrebni za spodbujanje izražanja ženskega spolnega obnašanja pri samicah, saj povečane vrednosti estradiola ob prisotnosti ali neprisotnosti progesterona izzovejo refleks lordoze (opisano v 148). Številne raziskave kažejo na pomembnost spolnih hormonov med puberteto za razvoj številnih obnašanj v odraslem obdobju, med drugim tudi spolnega obnašanja (pregledno v 1, 19). Raziskave pri samcih hrčka in podgan dokazujejo, da je prisotnost mod in s tem tudi testosterona med puberteto nujno potrebna za normalno izražanje moškega spolnega obnašanja odraslih samcev (opisano v 19, 21, 23). Pri naši raziskavi smo ugotovili, da odstranitev jajčnikov pred puberteto, ne glede na vrsto nastanitve, ne vpliva na izražanje spolne sprejemljivosti in spolne privlačnosti miši v odraslem obdobju v primerjavi z odstranitvijo jajčnikov po puberteti, kar se sklada s predhodnimi ugotovitvami pri samicah podgan (26). Iz tega lahko sklepamo, da obdobje pubertete nima bistvenega pomena pri dozorevanju sposobnosti izražanja spolnega obnašanja samic podgan in miši, kot jo ima pri njihovih samcih. Raziskava Söderstena in sod. pri podganjih samicah izpostavlja obdobje prehoda v puberteto med 15. in 20. dnevom starosti kot ključno pri dozorevanju odziva na estradiol in sposobnost izražanja spolne sprejemljivosti (236). Z evolucijskega vidika je edino zagotovilo za uspešno razmnoževanje uspešno potomstvo, ki je sposobno preživeti in ustvarjati novo potomstvo. Da bi se osamosvojili, dosegli spolno zrelost in se razmnoževali, potrebujejo mladiči mnogih živalskih vrst nego enega ali obeh staršev (9, 164). V sklopu doktorske naloge smo preverili vpliv osamitvenega stresa še pri 78 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija starševskem obnašanju in ugotovili, da socialna osamitev med puberteto ne vpliva na sposobnost izražanja materinskega in očetovskega obnašanja miši, kar se sklada s predhodnimi opažanji pri samcih miši (180) ter pri samicah podgan (90). Pri podganah in miših se obnašanje in naklonjenost do mladičev z nastopom pubertete močno spremenita in pokažejo se razlike med spoloma (pregledno v 165). Dosedanje raziskave starševskega obnašanja pri miših in podganah obravnavajo vpliv spolnih hormonov predvsem v odraslem obdobju (npr. 121, 166, 175, 176, 177, 237, 238), v okviru doktorske disertacije pa smo preverili pomen spolnih hormonov med puberteto na razvoj sposobnosti izražanja starševskega obnašanja pri odraslih miših obeh spolov. Ugotovili smo, da mišji samci in samice brez spolnih žlez med puberteto slabše izražajo k mladičem usmerjeno starševsko obnašanje v primerjavi z mišmi, ki smo jim odstranili spolne žleze v odraslem obdobju, saj potrebujejo dlje časa za dvig in prenos prvega mladiča v gnezdo, prenesejo manj mladičev in jih tudi manj časa negujejo pod telesom, kar se v veliki meri sklada s podobnimi ugotovitvami pri samicah podgan (173). Dodajanje oziroma nadomeščanje estradiola med puberteto pri samicah z odstranjenimi jajčniki, ne pa tudi testosterona pri samcih z odstranjenimi modi, je pri samicah uspelo povrniti večino k mladičem usmerjenih aktivnosti do ravni, primerljive obnašanju miši s prisotnimi spolnimi žlezami med puberteto. Iz tega lahko sklepamo, da je prisotnost spolnih hormonov med puberteto, še posebej estradiola, pomembna za razvoj sposobnosti izražanja starševskega obnašanja v odraslem obdobju pri miših. Predhodne raziskave starševskega obnašanja pri laboratorijskih glodavcih poročajo o močnejšem in doslednejšem izražanju starševskega obnašanja pri samicah v primerjavi s samci (pregledno v 165). Tudi pri naši raziskavi smo našli razlike med spoloma, vendar le pri nekaterih aktivnostih, usmerjenih k mladičem, ko so samice hitreje dvignile in prenesle prvega mladiča v gnezdo v primerjavi s samci, kar je skladno s predhodnimi ugotovitvami pri miših (121). Nadalje smo preverili možnost izboljšanja sposobnosti izražanja starševskega obnašanja z dodajanjem estradiola v odraslem obdobju, saj številne raziskave ugotavljajo, da estradiol spodbuja materinsko obnašanje tako pri odraslih mišjih (163, 181, 237) kot tudi podganjih samicah (163, 168, 239, 240). Ugotovili smo, da prejemanje estradiola v odraslem obdobju pri mišjih samcih in samicah (ne glede na čas odstranitve spolnih žlez) ne vpliva na aktivnost prenašanja mladičev v gnezdo, kar se ujema z nedavno raziskavo pri samicah miši (177). Po drugi strani pa je estradiol v odraslosti izboljšal aktivnosti, ki se nanašajo na gradnjo gnezda (aktivnost, ki ni usmerjena k mladičem). Iz tega lahko sklepamo, da estradiol v odraslem 79 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija obdobju v glavnem izboljša starševsko obnašanje, ki ni usmerjeno k mladičem, medtem ko za začetek in vzdrževanje izražanja obnašanja, usmerjenega k mladičem, ni nujno potreben. Ugotovitve, da estradiol ugodno vpliva na aktivnosti v zvezi z gradnjo gnezda, bi lahko povezali z vzdrževanjem telesne temperature, saj estrogeni hormoni znižujejo telesno temperaturo na telesnih štrlinah pri miših (241) in podganah (242), zaradi česar bi morda miši pod vplivom estradiola bolj intenzivno gradile gnezda, v katerih bi lažje ohranjale svojo telesno temperaturo. Puberteta je torej razvojno ranljivo obdobje, ki je med drugim znano tudi po večji obolevnosti in dovzetnosti za številne psihološke motnje, vključno z depresijo in anksioznostjo, ki sta pod vplivom delovanja spolnih hormonov (predvsem estradiola in/ ali progesterona) kot tudi različnih stresnih dejavnikov v tem obdobju (pregledno v 46, 56, 197). Epidemiološke in klinične študije ugotavljajo razlike med spoloma vse od začetka pubertete (194), ko je obolevnost za depresijo in/ ali anksioznostjo pri ženskah najmanj dvakrat pogostejša kot pri moških (195, 196). Kljub znanim razlikam med spoloma v farmakokinetiki in farmakodinamiki antidepresivnih zdravil (pregledno v 205, 206), tudi SSRI antidepresiva fluoksetina (207, 208, 209), zdravljenje pri ženskah in moških ostaja enako. Ker glavnina raziskav delovanja antidepresivov pri živalskih modelih (podgane, miši) obravnava predvsem samce (npr. 214, 226, 227, 243), smo v zadnjem sklopu doktorske naloge preverili delovanje dolgotrajnega prejemanja fluoksetina na depresivnemu in anksioznemu podobno obnašanje tako pri samcih kot pri samicah miši linije C57BL/6J, ki je v zadnjih letih najpogosteje uporabljena linija miši pri raziskavah (244). Fluoksetin je v naši raziskavi zmanjšal izražanje depresivnemu podobnega obnašanja tako pri samcih kot pri samicah, brez razlik med spoloma, kar se le delno sklada s podatki iz literature za podgane. Lifschytz in sod. so poročali o antidepresivnem učinku fluoksetina le pri samcih (245), vendar pa novejše raziskave pri podganah kažejo podoben antidepresivni učinek fluoksetina pri obeh spolih (220, 222). Vzrok za razhajanja rezultatov bi lahko bil v hormonalnem nihanju pri samicah. Medtem ko Lifschytz in sod. (245) niso preverjali faze spolnega ciklusa, sta novejši raziskavi (220, 222) testirali samice le v fazi estrusa, kjer bi lahko že povečane vrednosti estradiola izboljšale razpoloženje pri samicah (221, 222). Ker smo v naši raziskavi samice miši testirali v fazi diestrusa, lahko sklepamo, da je k zmanjšanemu izražanju depresivnega obnašanja prispeval fluoksetin. Mišji samci in samice v estrusu bi morda lahko bili dober 80 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija živalski model za proučevanje depresije, saj se tudi ženske v plodnih letih bolje odzivajo na fluoksetin v primerjavi z moškimi (207) ali z ženskami v menopavzi (209). Nadalje smo ugotovili, da fluoksetin nima vpliva na izražanje obnašanja, podobnega anksioznemu niti pri samcih niti pri samicah, kar je v skladu s predhodno raziskavo pri testu EPM pri samcih miši (226) in podgan (225, 246, 247), vendar v nasprotju z raziskavami pri testu OF pri miših obeh spolov (226, 227, 229) ter pri samicah podgan (225), kjer je fluoksetin deloval anksiogeno. Vzrok za razhajanja rezultatov pri miših bi lahko bil v zaporedju izvajanja testiranj. Medtem ko je test OF pri nekaterih raziskavah (226, 227, 229) bil uporabljen kot prvi, je v naši raziskavi sledil testu EPM. Pokazali smo, da so mišje samice v diestrusu (ne glede na prejemanje fluoksetina) bolj anksiozne kot samci, kar je potrdila že predhodna raziskava pri isti liniji miši (223). Mišji samci in samice v diestrusu bi lahko bili dober živalski model za proučevanje anksioznosti, vendar pa fluoksetin pri njih ne prispeva k izboljšanju razpoloženja, kot se dogaja pri ljudeh, kjer se ženske slabše odzivajo na fluoksetin kot moški (248). Pri naših raziskavah smo torej ugotovili, da imajo socialna osamitev in spolni hormoni med puberteto lahko močan in trajen učinek tako na razvoj možganov kot na sposobnost izražanja nekaterih spektrov obnašanj v odraslem obdobju. Ugotovitve naših raziskav prispevajo k boljšemu razumevanju neobhodnega pomena odraščanja v socialni združbi in spolnih hormonov med razvojno občutljivim obdobjem pubertete, ki narekujeta tako fizično kot psihično dozorevanje osebka. Motnje pri izločanju in delovanju spolnih hormonov kot tudi različni stresni dejavniki v času pubertete lahko trajno in nepovrnljivo privedejo do nevrokemičnih in nevrofizioloških sprememb v možganih in posledično spremenijo obnašanje v odraslem obdobju, kar lahko ogroža obstanek socialne združbe kot tudi obstoj same vrste. Spoznanja naših raziskav predstavljajo smernice za bolj premišljeno načrtovanje ter tolmačenje rezultatov znanstvenih poskusov pri živalskih modelih, naše ugotovitve pa predstavljajo smernice za nadaljnje raziskave pri ljudeh. 81 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 5 ZAKLJUČKI 1. Socialna osamitev med puberteto zmanjša sposobnost socialnega učenja in nepovrnljivo okrni sposobnost socialnega prepoznavanja predvsem pri mišjih samicah. K boljšemu socialnemu prepoznavanju pri samcih bi lahko prispevala večja izraženost AVP v stranskem septumu. Zato hipotezo 1, da socialna osamitev v mladosti vpliva na socialno prepoznavanje odraslih miši, lahko potrdimo. 2. Socialna osamitev med puberteto nepovrnljivo okrni sposobnost izražanja spolne sprejemljivosti in trajno spremeni izražanje ERα v anteroventralnem delu periventrikularnega jedra in v ventromedialnem jedru hipotalamusa, vendar pa spolni hormoni med puberteto nimajo bistvenega pomena pri razvoju sposobnosti spolnega obnašanja pri samicah. Zato del hipoteze 2, da zgodnja odstranitev spolnih žlez in socialna osamitev vplivata na žensko spolno obnašanje odraslih miši, lahko delno potrdimo. 3. Odsotnost spolnih hormonov med puberteto, še posebej estradiola, nepovrnljivo okrni sposobnost izražanja starševskega obnašanja, usmerjenega k mladičem, vendar pa osamitveni stres med puberteto nima bistvenega vpliva na sposobnost izražanja starševskega obnašanja pri samcih in samicah. Zato del hipoteze 2, da zgodnja odstranitev spolnih žlez in socialna osamitev vplivata na starševsko obnašanje odraslih miši, lahko delno potrdimo. 4. Dokazali smo, da dolgotrajno prejemanje antidepresiva fluoksetina pri miših zmanjša izražanje depresivnemu podobnega obnašanja, vendar ne vpliva na izražanje anksioznemu podobnega obnašanja. Učinki fluoksetina pri samicah so primerljivi z učinki pri samcih. Zato hipotezo 3, da antidepresiv fluoksetin zmanjša depresivnemu in anksioznemu vedenju podobno obnašanje, različno pri samicah in samcih, lahko zavrnemo. 82 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 6 POVZETEK Puberteta/ mladostništvo je obdobje, med katerim posameznik spolno dozoreva in postane sposoben razmnoževati se, dozoreva pa tudi vedenjsko, kar je posledica povečanega izločanja in delovanja steroidnih spolnih hormonov. Ti med puberteto dokončno preoblikujejo delovanje kortikalnega in limbičnega dela možganov, kar vpliva na razvoj sposobnosti izražanja različnih spektrov obnašanj v odraslem obdobju. Različni stresni dejavniki lahko v tem razvojno občutljivem obdobju trajno prizadenejo dozorevanje možganov, njihovo nevroendokrino odzivnost in vodijo do dolgotrajnih sprememb pri socialnem obnašanju ter pri z razmnoževanjem in s čustvovanjem povezanih obnašanjih. Namen naših raziskav je bil ugotoviti pomen socialne osamitve in spolnih hormonov med puberteto ter delovanje psihoaktivnih zdravil, kot je fluoksetin, na obnašanje odraslih mišjih samcev in samic. V prvem sklopu našega dela smo preverili, ali socialna osamitev med puberteto vpliva na sposobnost socialnega prepoznavanja in ali privede do sprememb v sistemih OT in AVP v končnih in vmesnih možganih. V drugem sklopu dela smo ugotavljali pomen socialne osamitve in vpliva odsotnosti spolnih hormonov med puberteto na sposobnost izražanja starševskega obnašanja pri obeh spolih ter spolnega obnašanja pri samicah. Zanimalo nas je tudi, ali omenjena dejavnika privedeta do sprememb v izraženosti ERα v končnih in vmesnih možganih. V zadnjem sklopu doktorske naloge smo preverili, ali dolgotrajno prejemanje fluoksetina zmanjša obnašanje, podobno depresivnemu in anksioznemu, različno pri samcih in samicah. Dokazali smo, da socialna osamitev med puberteto zmanjša sposobnost socialnega učenja in nepovrnljivo prizadene sposobnost socialnega prepoznavanja predvsem pri samicah. Socialna osamitev nima vpliva niti na sistem OT niti na sistem AVP, v nadaljnjih raziskavah pa bi bilo potrebno preveriti dinamiko sproščanja OT in AVP iz paraventrikularnega jedra, kar lahko vpliva na delovanje možganov in na obnašanje. Socialno nastanjeni samci so bolje izražali sposobnost socialnega učenja in socialnega prepoznavanja v primerjavi s socialno nastanjenimi samicami, kar bi lahko razložili z ugotovitvijo, da imajo samci večjo izraženost AVP v živčnih vlaknih v stranskem septumu kot pa samice. Socialna osamitev med puberteto ni vplivala na sposobnost izražanja materinskega in očetovskega obnašanja pri miših. Ugotovili pa smo, da osamitveni stres med puberteto 83 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija nepovrnljivo poslabša izražanje spolne sprejemljivosti pri samicah, vendar ne vpliva na njihovo spolno privlačnost, trajno pa spremeni izraženost ERα v anteroventralnem delu periventrikularnega jedra in ventromedialnem jedru hipotalamusa. Ugotovljeno povečanje izraženosti ERα bi lahko razložili s tem, da so ga izzvale nižje vrednosti estradiola med puberteto kot posledica zavrtja delovanja osi HPG zaradi povišane ravni stresnih hormonov. Ženski spolni hormoni v odraslem obdobju so sicer nujno potrebni, da izzovejo izražanje spolnega obnašanja pri samicah, vendar pa glede na naše rezultate njihova odsotnost med puberteto nima bistvenega vpliva na razvoj sposobnosti izražanja spolne sprejemljivosti in spolne privlačnosti v odraslem obdobju. Ugotovili pa smo, da odsotnost spolnih hormonov med puberteto, še posebej estradiola pri samicah, nepovrnljivo poslabša sposobnost izražanja starševskega obnašanja, usmerjenega k mladičem. Očetovsko obnašanje pri samcih se ni bistveno razlikovalo od materinskega pri samicah, le da so bile samice hitrejše pri prenašanju mladičev v gnezdo v primerjavi s samci. Nadomeščanje estradiola v odraslem obdobju ni imelo vpliva na aktivnosti prenašanja mladičev v gnezdo, je pa izboljšalo aktivnosti gradnje gnezda pri samcih in samicah, kar bi morda lahko razložili z vpletenostjo estrogenih hormonov v mehanizme uravnavanja telesne temperature. V zadnjem delu doktorske naloge smo ugotovili, da dolgotrajno prejemanje fluoksetina pri obeh spolih primerljivo zmanjša izražanje obnašanja, podobnega depresivnemu, vendar nima vpliva na anksioznemu podobno obnašanje. Samice so pričakovano močneje izražale anksioznemu podobno obnašanje v primerjavi s samci, nismo pa ugotovili razlik med spoloma v delovanju fluoksetina. Naši rezultati dokazujejo, da imajo socialna osamitev in spolni hormoni med puberteto močan in trajen učinek tako na razvoj možganov kot na sposobnost izražanja nekaterih spektrov obnašanj v odraslem obdobju. 84 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 7 SUMMARY Puberty/ adolescence is the period during which an individual attains reproductive as well as behavioral maturation through the elevated secretion and action of gonadal steroid hormones. Steroid hormones during puberty direct proper development of cortical and limbic circuits in the brain and program a variety of adult behaviors. Stressful events during this vulnerable period can have profound consequences on different behaviors, like social, reproductive and emotional behaviors, due to alterations in developing brain and their neuroendocrine responses. The purpose of our studies was to determine the influence of social isolation stress and sex steroid hormones during puberty and the action of psychoactive drugs such as fluoxetine on the behavior of adult male and female mice. In the first part of the study we explored whether social isolation during puberty affects the ability of social recognition and leads to changes in the OT and AVP system in the forebrain and midbrain. In the second part of the study we explored whether social isolation stress and lack of sex steroid hormones during puberty affects the ability to express parental behavior in both sexes and the ability to express receptive sexual behavior in females. Furthermore, we checked whether these two factors may lead to changes in the expression of ERα in the forebrain and midbrain. In the last part of the study we explored whether the chronic fluoxetine treatment differently reduced the expression of depressive and anxiety like behavior in male and female mice. Social isolation during puberty impairs social learning as well as irrecoverably affects the ability of social recognition in females only. Isolation stress did not affect the OT nor the AVP system, although the dynamics of the release of OT and AVP in the paraventricular nucleus was not studied and this could also cause behavioral disturbances. Socially housed males exhibited stronger pattern of social recognition than socially housed females, what could possibly be explained by higher expression of AVP in nerve fibers of the lateral septum in males than in females. Social isolation during puberty did not affect the ability of expression of maternal and paternal behavior in mice. However, social isolation stress during puberty irrecoverably reduced the receptive sexual behavior in adult females, but did not affect their sexual attractiveness. Furthermore, social isolation stress permanently altered the expression of ERα 85 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija in the anteroventral periventricular nucleus and ventromedial nucleus of the hypothalamus. The greater expression of ERα in socially isolated females could be explained by the lower levels of estradiol during puberty as a result of the suppression of HPG axis activity due to the higher levels of stress hormones. Female sex hormones in adulthood are necessary to elicit the expression of sexual behavior in females, but according to our results, their absence during puberty does not have a significant impact on the development of the ability to express receptive behavior and sexual attractiveness in adulthood. However, the absence of sex hormones during puberty, especially the lack of estradiol in females, irreversibly reduced the amount of pup-directed parental behaviors. Estradiol replacement in the adulthood had no effect on the pup retrieval into the nest, but improved the nest building activities in males and females, what might be connected with the involvement of estrogens in the thermoregulation. Studies with chronic fluoxetine treatment revealed that such treatment reduces the expression of depressive like behavior in mice of both sexes, and fluoxetine has no effect on anxiety-like behavior in mice. As expected, anxiety like behavior was more prominent in females than in males, but there was no sex difference in the effect of fluoxetine. Our results suggest that social isolation and sex hormones during puberty have profound and long-lasting influences on brain development and subsequently on the ability to express different behaviors in adult life. 86 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 8 ZAHVALE Zahvaljujem se Javni agenciji za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS) za financiranje. Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Gregorju Majdiču za vso pomoč, predloge, podporo in korektnost pri raziskavah in nastajanju moje naloge. Zahvaljujem se predsedniku in članoma komisije, prof. dr. Martinu Dobeicu, prof. dr. Nini Čebulj Kadunc in prof. dr. Marku Živinu, za oceno doktorske disertacije ter za vse pripombe in napotke, ki so moje delo izboljšali. Zahvaljujem se prof. dr. Stuartu Tobetu z Univerze v Koloradu v Združenih državah Amerike za pomoč in predloge pri raziskavah in nastajanju znanstvenih člankov. Hvala sodelavcem na Centru za genomiko živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani in prijateljem ter znancem, ki so kakor koli pripomogli k pričujočemu delu. Zahvaljujem se Inštitutu za fiziologijo, farmakologijo in toksikologijo Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani za opravljene meritve hormonov v krvni plazmi. Zahvaljujem se mag. Brigiti Grecs Smole za pregled literature in dr. Viktorju Majdiču za lektoriranje doktorske disertacije. Nenazadnje se zahvaljujem svoji družini za vso podporo pri mojem delu in odločitvah. 87 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 9 LITERATURA 1. Sisk CL, Zehr JL. Pubertal hormones organize the adolescent brain and behavior. Front Neuroendocrinol 2005; 26(3/4): 163–74. 2. Sisk CL, Foster DL. The neural basis of puberty and adolescence. Nat Neurosci 2004; 7(10): 1040–7. 3. Nelson JF, Karelus K, Felicio LS, Johnson TE. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biol Reprod 1990; 42(4): 649–55. 4. Spearow JL. Characterization of genetic differences in hormone-induced ovulation rate in mice. J Reprod Fertil 1988; 82(2): 799–806. 5. Berne RM, Levy MN. Principles of physiology. 2nd ed. Saint Louis: Mosby, 1996: 585–659. 6. Hill RW, Wyse GA, Anderson M. Animal physiology. 2nd ed. Sunderland: Sinauer Associates, 2008: 391–424. 7. Nelson RJ. An introduction to behavioral endocrinology. 3rd ed. Sunderland: Sinauer Associates, 2005: 89–98. 8. Nelson RJ. An introduction to behavioral endocrinology. 3rd ed. Sunderland: Sinauer Associates, 2005: 455–98. 9. Nelson RJ. An introduction to behavioral endocrinology. 3rd ed. Sunderland: Sinauer Associates, 2005: 387–431. 10. Nelson RJ. An introduction to behavioral endocrinology. 3rd ed. Sunderland: Sinauer Associates, 2005: 319–51. 11. Schulz KM, Zehr JL, Salas-Ramirez KY, Sisk CL. Testosterone programs adult social behavior before and during, but not after, adolescence. Endocrinology 2009; 150(8): 3690–8. 12. Arnold AP, Breedlove SM. Organizational and activational effects of sex steroids on brain and behavior: a reanalysis. Horm Behav 1985; 19(4): 469–98. 13. Schulz KM, Molenda-Figueira HA, Sisk CL. Back to the future: the organizational- activational hypothesis adapted to puberty and adolescence. Horm Behav 2009; 55(5): 597–604. 14. Arnold AP. The organizational-activational hypothesis as the foundation for a unified theory of sexual differentiation of all mammalian tissues. Horm Behav 2009; 55(5): 570–8. 88 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 15. Majdic G, Tobet S. Cooperation of sex chromosomal genes and endocrine influences for hypothalamic sexual differentiation. Front Neuroendocrinol 2011; 32(2): 137–45. 16. McCarthy MM, Arnold AP. Reframing sexual differentiation of the brain. Nat Neurosci 2011; 14(6): 677–83. 17. Ahmed EI, Zehr JL, Schulz KM, Lorenz BH, DonCarlos LL, Sisk CL. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat Neurosci 2008; 11(9): 995–7. 18. De Lorme KC, Schulz KM, Salas-Ramirez KY, Sisk CL. Pubertal testosterone organizes regional volume and neuronal number within the medial amygdala of adult male Syrian hamsters. Brain Res 2012; 1460: 33–40. 19. Romeo RD. Puberty: a period of both organizational and activational effects of steroid hormones on neurobehavioural development. J Neuroendocrinol 2003; 15(12): 1185– 92. 20. Romeo RD, Diedrich SL, Sisk CL. Effects of gonadal steroids during pubertal development on androgen and estrogen receptor-alpha immunoreactivity in the hypothalamus and amygdala. J Neurobiol 2000; 44(3): 361–8. 21. Schulz KM, Sisk CL. Pubertal hormones, the adolescent brain, and the maturation of social behaviors: lessons from the Syrian hamster. Mol Cell Endocrinol 2006; 254/255: 120–6. 22. Crawley JN. What's wrong with my mouse?: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. 2nd ed. Hoboken, New Jersey: Wiley, 2007: 110–205. 23. Schulz KM, Richardson HN, Zehr JL, Osetek AJ, Menard TA, Sisk CL. Gonadal hormones masculinize and defeminize reproductive behaviors during puberty in the male Syrian hamster. Horm Behav 2004; 45(4): 242–9. 24. Shrenker P, Maxson SC, Ginsburg BE. The role of postnatal testosterone in the development of sexually dimorphic behaviors in DBA/1Bg mice. Physiol Behav 1985; 35(5): 757–62. 25. Brand T, Slob AK. Peripubertal castration of male rats, adult open field ambulation and partner preference behavior. Behav Brain Res 1988; 30(2): 111–7. 26. de Jonge FH, Muntjewerff JW, Louwerse AL, van de Poll NE. Sexual behavior and sexual orientation of the female rat after hormonal treatment during various stages of development. Horm Behav 1988; 22(1): 100–15. 89 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 27. Caldwell HK, Lee HJ, Macbeth AH, Young WS 3rd. Vasopressin: behavioral roles of an "original" neuropeptide. Prog Neurobiol 2008; 84(1): 1–24. 28. Dhakar MB, Stevenson EL, Caldwell HK. Oxytocin, vasopressin and their interplay with gonadal steroids. In: Choleris E, Pfaff DW, Kavaliers M, eds. Oxytocin, vasopressin and related peptides in the regulation of behavior. Cambridge: Cambridge University Press, 2013: 3–26. 29. Miller FD, Ozimek G, Milner RJ, Bloom FE. Regulation of neuronal oxytocin mRNA by ovarian steroids in the mature and developing hypothalamus. Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86(7): 2468–72. 30. Chibbar R, Toma JG, Mitchell BF, Miller FD. Regulation of neural oxytocin gene expression by gonadal steroids in pubertal rats. Mol Endocrinol 1990; 4(12): 2030–8. 31. Van Tol HH, Bolwerk EL, Liu B, Burbach JP. Oxytocin and vasopressin gene expression in the hypothalamo-neurohypophyseal system of the rat during the estrous cycle, pregnancy, and lactation. Endocrinology 1988; 122(3): 945–51. 32. Amico JA, Crowley RS, Insel TR, Thomas A, O'Keefe JA. Effect of gonadal steroids upon hypothalamic oxytocin expression. Adv Exp Med Biol 1995; 395: 23–35. 33. Blyth BJ, Hollingshead DJ, Amico JA. Time course of induction of oxytocin messenger ribonucleic acid levels in the hypothalamic paraventricular nucleus of ovariectomized rats following gonadal steroid administration. Life Sci 1997; 60(26): 2427–33. 34. Crowley RS, Insel TR, O'Keefe JA, Kim NB, Amico JA. Increased accumulation of oxytocin messenger ribonucleic acid in the hypothalamus of the female rat: induction by long term estradiol and progesterone administration and subsequent progesterone withdrawal. Endocrinology 1995; 136(1): 224–31. 35. Yamaguchi K, Akaishi T, Negoro H. Effect of estrogen treatment on plasma oxytocin and vasopressin in ovariectomized rats. Endocrinol Jpn 1979; 26(2): 197–205. 36. de Kloet ER, Voorhuis DA, Boschma Y, Elands J. Estradiol modulates density of putative 'oxytocin receptors' in discrete rat brain regions. Neuroendocrinology 1986; 44(4): 415–21. 37. Akaishi T, Sakuma Y. Estrogen excites oxytocinergic, but not vasopressinergic cells in the paraventricular nucleus of female rat hypothalamus. Brain Res 1985; 335(2): 302–5. 90 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 38. Johnson AE, Coirini H, McEwen BS, Insel TR. Testosterone modulates oxytocin binding in the hypothalamus of castrated male rats. Neuroendocrinology 1989; 50(2): 199–203. 39. Crofton JT, Baer PG, Share L, Brooks DP. Vasopressin release in male and female rats: effects of gonadectomy and treatment with gonadal steroid hormones. Endocrinology 1985; 117(3): 1195–200. 40. Skowsky WR, Swan L, Smith P. Effects of sex steroid hormones on arginine vasopressin in intact and castrated male and female rats. Endocrinology 1979; 104(1): 105–8. 41. DeVries GJ, Buijs RM, Van Leeuwen FW, Caffé AR, Swaab DF. The vasopressinergic innervation of the brain in normal and castrated rats. J Comp Neurol 1985; 233(2): 236– 54. 42. de Vries GJ, Duetz W, Buijs RM, van Heerikhuize J, Vreeburg JT. Effects of androgens and estrogens on the vasopressin and oxytocin innervation of the adult rat brain. Brain Res 1986; 399(2): 296–302. 43. Curley JP, Jensen CL, Mashoodh R, Champagne FA. Social influences on neurobiology and behavior: epigenetic effects during development. Psychoneuroendocrinology 2011; 36(3): 352–71. 44. McCormick CM, Mathews IZ. HPA function in adolescence: role of sex hormones in its regulation and the enduring consequences of exposure to stressors. Pharmacol Biochem Behav 2007; 86(2): 220–33. 45. McCormick CM, Mathews IZ, Thomas C, Waters P. Investigations of HPA function and the enduring consequences of stressors in adolescence in animal models. Brain Cogn 2010; 72(1): 73–85. 46. Blaustein JD, Ismail N. Enduring influence of pubertal stressors on behavioral response to hormones in female mice. Horm Behav 2013; 64(2): 390–8. 47. Nelson RJ. An introduction to behavioral endocrinology. 3rd ed. Sunderland: Sinauer Associates, 2005: 669–89. 48. Munck A, Guyre PM, Holbrook NJ. Physiological functions of glucocorticoids in stress and their relation to pharmacological actions. Endocr Rev 1984; 5(1): 25–44. 49. McEwen BS. The neurobiology of stress: from serendipity to clinical relevance. Brain Res 2000; 886(1/2): 172–89. 91 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 50. Selye H. Stress and distress. Compr Ther 1975; 1(8): 9–13. 51. Selye H. Stress and the general adaptation syndrome. Br Med J 1950; 1(4667): 1383– 92. 52. Stratakis CA, Chrousos GP. Neuroendocrinology and pathophysiology of the stress system. Ann N Y Acad Sci 1995; 771: 1–18. 53. Herman JP, Figueiredo H, Mueller NK, et al. Central mechanisms of stress integration: hierarchical circuitry controlling hypothalamo-pituitary-adrenocortical responsiveness. Front Neuroendocrinol 2003; 24(3): 151–80. 54. Agnati LF, Fuxe K, Yu ZY, et al. Morphometrical analysis of the distribution of corticotrophin releasing factor, glucocorticoid receptor and phenylethanolamine-N- methyltransferase immunoreactive structures in the paraventricular hypothalamic nucleus of the rat. Neurosci Lett 1985; 54(2/3): 147–52. 55. Morimoto M, Morita N, Ozawa H, Yokoyama K, Kawata M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neurosci Res 1996; 26(3): 235– 69. 56. Romeo RD. Adolescence: a central event in shaping stress reactivity. Dev Psychobiol 2010; 52(3): 244–53. 57. Romeo RD, Lee SJ, McEwen BS. Differential stress reactivity in intact and ovariectomized prepubertal and adult female rats. Neuroendocrinology 2004; 80(6): 387–93. 58. Romeo RD, Lee SJ, Chhua N, McPherson CR, McEwen BS. Testosterone cannot activate an adult-like stress response in prepubertal male rats. Neuroendocrinology 2004; 79(5): 125–32. 59. Girotti M, Pace TW, Gaylord RI, Rubin BA, Herman JP, Spencer RL. Habituation to repeated restraint stress is associated with lack of stress-induced c-fos expression in primary sensory processing areas of the rat brain. Neuroscience 2006; 138(4): 1067–81. 60. Romeo RD, Bellani R, Karatsoreos IN, et al. Stress history and pubertal development interact to shape hypothalamic-pituitary-adrenal axis plasticity. Endocrinology 2006; 147(4): 1664–74. 61. Kellogg CK, Awatramani GB, Piekut DT. Adolescent development alters stressor- induced Fos immunoreactivity in rat brain. Neuroscience 1998; 83(3): 681–9. 92 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 62. McCormick CM, Linkroum W, Sallinen BJ, Miller NW. Peripheral and central sex steroids have differential effects on the HPA axis of male and female rats. Stress 2002; 5(4): 235–47. 63. Chisari A, Carino M, Perone M, Gaillard RC, Spinedi E. Sex and strain variability in the rat hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis function. J Endocrinol Invest 1995; 18(1): 25–33. 64. Romeo RD. Pubertal maturation and programming of hypothalamic-pituitary-adrenal reactivity. Front Neuroendocrinol 2010; 31(2): 232–40. 65. Dixon AK. The social behaviour of mice and its sensory control. In: Hedrich HJ, Bullock G, eds. The laboratory mouse. 1st ed. London, San Diego: Elsevier Academic press, 2004: 287–300. 66. Koolhaas JM. The laboratory rat. In: Hubrecht R, Kirkwood J, eds. The UFAW handbook on the care and management of laboratory and other research animals. 8th ed. Wheathampstead: Universities federation for animal welfare, 2010: 311–27. 67. McGraw LA, Young LJ. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends Neurosci 2010; 33(2): 103–9. 68. Haller J, Fuchs E, Halász J, Makara GB. Defeat is a major stressor in males while social instability is stressful mainly in females: Towards the development of a social stress model in female rats. Brain Res Bull 1999; 50(1): 33–9. 69. Brown KJ, Grunberg NE. Effects of housing on male and female rats: crowding stresses male but calm females. Physiol Behav 1995; 58(6): 1085–9. 70. Blanchard RJ, McKittrick CR, Blanchard DC. Animal models of social stress: effects on behavior and brain neurochemical systems. Physiol Behav 2001; 73(3): 261–71. 71. Fone KC, Porkess MV. Behavioural and neurochemical effects of post-weaning social isolation in rodents-relevance to developmental neuropsychiatric disorders. Neurosci Biobehav Rev 2008; 32(6): 1087–102. 72. Kulesskaya N, Rauvala H, Voikar V. Evaluation of social and physical enrichment in modulation of behavioural phenotype in C57BL/6J female mice. PLoS One 2011; 6(9): e24755 (5 str.). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3169619/pdf/pone.0024755.pdf (17. sept. 2014) 93 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 73. Voikar V, Polus A, Vasar E, Rauvala H. Long-term individual housing in C57BL/6J and DBA/2 mice: assessment of behavioral consequences. Genes Brain Behav 2005; 4(4): 240–52. 74. Pietropaolo S, Singer P, Feldon J, Yee BK. The postweaning social isolation in C57BL/6 mice: preferential vulnerability in the male sex. Psychopharmacology (Berl) 2008; 197(4): 613–28. 75. Arndt SS, Laarakker MC, van Lith HA, et al. Individual housing of mice-impact on behaviour and stress responses. Physiol Behav 2009; 97(3/4): 385–93. 76. Wang Y, Deng S, Fu Q, Liu X. Post-weaning social isolation regulates social exposure- induced vasopressin release in the paraventricular nucleus. Neuro Asia 2013; 18(3): 293–301. 77. Naert A, Callaerts-Vegh Z, D'Hooge R. Nocturnal hyperactivity, increased social novelty preference and delayed extinction of fear responses in post-weaning socially isolated mice. Brain Res Bull 2011; 85(6): 354–62. 78. Weiss IC, Pryce CR, Jongen-Rêlo AL, Nanz-Bahr NI, Feldon J. Effect of social isolation on stress-related behavioural and neuroendocrine state in the rat. Behav Brain Res 2004; 152(2): 279–95. 79. Maslova LN, Bulygina VV, Amstislavskaya TG. Prolonged social isolation and social instability in adolescence in rats: immediate and long-term physiological and behavioral effects. Neurosci Behav Physiol 2010; 40(9): 955–63. 80. Weintraub A, Singaravelu J, Bhatnagar S. Enduring and sex-specific effects of adolescent social isolation in rats on adult stress reactivity. Brain Res 2010; 1343: 83– 92. 81. Jahng JW, Yoo SB, Ryu V, Lee JH. Hyperphagia and depression-like behavior by adolescence social isolation in female rats. Int J Dev Neurosci 2012; 30(1): 47–53. 82. Lukkes JL, Engelman GH, Zelin NS, Hale MW, Lowry CA. Post-weaning social isolation of female rats, anxiety-related behavior, and serotonergic systems. Brain Res 2012; 1443: 1–17. 83. Pan Y, Liu Y, Young KA, Zhang Z, Wang Z. Post-weaning social isolation alters anxiety-related behavior and neurochemical gene expression in the brain of male prairie voles. Neurosci Lett 2009; 454(1): 67–71. 94 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 84. Bogdanova OV, Kanekar S, D'Anci KE, Renshaw PF. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiol Behav 2013; 118: 227–39. 85. Lapiz MD, Fulford A, Muchimapura S, Mason R, Parker T, Marsden CA. Influence of postweaning social isolation in the rat on brain development, conditioned behavior, and neurotransmission. Neurosci Behav Physiol 2003; 33(1): 13–29. 86. Bibancos T, Jardim DL, Aneas I, Chiavegatto S. Social isolation and expression of serotonergic neurotransmission-related genes in several brain areas of male mice. Genes Brain Behav 2007; 6(6): 529–39. 87. Wongwitdecha N, Marsden CA. Social isolation increases aggressive behaviour and alters the effects of diazepam in the rat social interaction test. Behav Brain Res 1996; 75(1/2): 27–32. 88. Zhao X, Sun L, Jia H, et al. Isolation rearing induces social and emotional function abnormalities and alters glutamate and neurodevelopment-related gene expression in rats. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2009; 33(7): 1173–7. 89. Tanaka K, Osako Y, Yuri K. Juvenile social experience regulates central neuropeptides relevant to emotional and social behaviors. Neuroscience 2010; 166(4): 1036–42. 90. Genaro G, Schmidek WR. The influence of handling and isolation postweaning on open field, exploratory and maternal behavior of female rats. Physiol Behav 2002; 75(5): 681–8. 91. Duffy JA, Hendricks SE. Influences of social isolation during development on sexual behavior of the rat. Anim Learn Behav 1973; 1(3): 223–7. 92. Spevak AM, Quadagno DM, Knoeppel D. The effects of isolation on sexual and social behavior in the rat. Behav Biol 1973; 8(1): 63–73. 93. Amstislavskaya TG, Bulygina VV, Tikhonova MA, Maslova LN. Social isolation during peri-adolescence or adulthood: effects on sexual motivation, testosterone and corticosterone response under conditions of sexual arousal in male rats. Chin J Physiol 2013; 56(1): 36–43. 94. Cooke BM, Chowanadisai W, Breedlove SM. Post-weaning social isolation of male rats reduces the volume of the medial amygdala and leads to deficits in adult sexual behavior. Behav Brain Res 2000; 117(1/2): 107–13. 95 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 95. Ruscio MG, Sweeny T, Hazelton J, Suppatkul P, Sue Carter C. Social environment regulates corticotropin releasing factor, corticosterone and vasopressin in juvenile prairie voles. Horm Behav 2007; 51(1): 54–61. 96. Sánchez MM, Aguado F, Sánchez-Toscano F, Saphier D. Neuroendocrine and immunocytochemical demonstrations of decreased hypothalamo-pituitary-adrenal axis responsiveness to restraint stress after long-term social isolation. Endocrinology 1998; 139(2): 579–87. 97. Grippo AJ, Cushing BS, Carter CS. Depression-like behavior and stressor-induced neuroendocrine activation in female prairie voles exposed to chronic social isolation. Psychosom Med 2007; 69(2): 149–57. 98. Grippo AJ, Gerena D, Huang J, et al. Social isolation induces behavioral and neuroendocrine disturbances relevant to depression in female and male prairie voles. Psychoneuroendocrinology 2007; 32(8/10): 966–80. 99. Pournajafi-Nazarloo H, Kenkel W, Mohsenpour SR, et al. Exposure to chronic isolation modulates receptors mRNAs for oxytocin and vasopressin in the hypothalamus and heart. Peptides 2013; 43: 20–6. 100. Winslow JT. Mouse social recognition and preference. Curr Protoc Neurosci 2003; Chapter 8: Unit 8. 16. 101. Bielsky IF, Young LJ. Oxytocin, vasopressin, and social recognition in mammals. Peptides 2004; 25(9): 1565–74. 102. Ferguson JN, Aldag JM, Insel TR, Young LJ. Oxytocin in the medial amygdala is essential for social recognition in the mouse. J Neurosci 2001; 21(20): 8278–85. 103. Richter K, Wolf G, Engelmann M. Social recognition memory requires two stages of protein synthesis in mice. Learn Mem 2005; 12(4): 407–13. 104. Choleris E, Clipperton-Allen AE, Phan A, Kavaliers M. Neuroendocrinology of social information processing in rats and mice. Front Neuroendocrinol 2009; 30(4): 442–59. 105. Neumann ID. Brain oxytocin: a key regulator of emotional and social behaviours in both females and males. J Neuroendocrinol 2008; 20(6): 858–65. 106. Lim MM, Young LJ. Neurobiology of the social brain. Lessons from animal models about social relationships. In: Beach SRH, Wamboldt MZ, Kaslow NJ, et al., eds. Relational processes and DSM-V: neuroscience, assessment, prevention, and treatment. Arlington: American Psychiatric Publishing, 2006: 21–38. 96 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 107. Bielsky IF, Hu SB, Ren X, Terwilliger EF, Young LJ. The V1a vasopressin receptor is necessary and sufficient for normal social recognition: a gene replacement study. Neuron 2005; 47(4): 503–13. 108. Choleris E, Gustafsson JA, Korach KS, Muglia LJ, Pfaff DW, Ogawa S. An estrogen- dependent four-gene micronet regulating social recognition: a study with oxytocin and estrogen receptor-alpha and -beta knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100(10): 6192–7. 109. Bluthe RM, Schoenen J, Dantzer R. Androgen-dependent vasopressinergic neurons are involved in social recognition in rats. Brain Res 1990; 519(1/2): 150–7. 110. Ismail N, Blaustein JD. Pubertal immune challenge blocks the ability of estradiol to enhance performance on cognitive tasks in adult female mice. Psychoneuroendocrinology 2013; 38(7): 1170–7. 111. Pierman S, Sica M, Allieri F, Viglietti-Panzica C, Panzica GC, Bakker J. Activational effects of estradiol and dihydrotestosterone on social recognition and the arginine- vasopressin immunoreactive system in male mice lacking a functional aromatase gene. Horm Behav 2008; 54(1): 98–106. 112. Sánchez-Andrade G, James BM, Kendrick KM. Neural encoding of olfactory recognition memory. J Reprod Dev 2005; 51(5): 547–58. 113. Tang AC, Nakazawa M, Romeo RD, Reeb BC, Sisti H, McEwen BS. Effects of long- term estrogen replacement on social investigation and social memory in ovariectomized C57BL/6 mice. Horm Behav 2005; 47(3): 350–7. 114. Hlinak Z. Social recognition in ovariectomized and estradiol-treated female rats. Horm Behav 1993; 27(2): 159–66. 115. Imwalle DB, Scordalakes EM, Rissman EF. Estrogen receptor alpha influences socially motivated behaviors. Horm Behav 2002; 42(4): 484–91. 116. Patisaul HB, Scordalakes EM, Young LJ, Rissman EF. Oxytocin, but not oxytocin receptor, is rRegulated by oestrogen receptor beta in the female mouse hypothalamus. J Neuroendocrinol 2003; 15(8): 787–93. 117. de Vries GJ. Sex differences in vasopressin and oxytocin innervation of the brain. Prog Brain Res 2008; 170: 17–27. 97 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 118. Choleris E, Little SR, Mong JA, Puram SV, Langer R, Pfaff DW. Microparticle-based delivery of oxytocin receptor antisense DNA in the medial amygdala blocks social recognition in female mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104(11): 4670–5. 119. de Vries GJ, Buijs RM, Sluiter AA. Gonadal hormone actions on the morphology of the vasopressinergic innervation of the adult rat brain. Brain Res 1984; 298(1): 141–5. 120. Dantzer R. Vasopressin, gonadal steroids and social recognition. Prog Brain Res 1998; 119: 409–14. 121. Gatewood JD, Wills A, Shetty S, et al. Sex chromosome complement and gonadal sex influence aggressive and parental behaviors in mice. J Neurosci 2006; 26(8): 2335–42. 122. Popik P, Vetulani J. Opposite action of oxytocin and its peptide antagonists on social memory in rats. Neuropeptides 1991; 18(1): 23–7. 123. Popik P, Vetulani J, van Ree JM. Low doses of oxytocin facilitate social recognition in rats. Psychopharmacology (Berl) 1992; 106(1): 71–4. 124. Engelmann M, Ebner K, Wotjak CT, Landgraf R. Endogenous oxytocin is involved in short-term olfactory memory in female rats. Behav Brain Res 1998; 90(1): 89–94. 125. Benelli A, Bertolini A, Poggioli R, Menozzi B, Basaglia R, Arletti R. Polymodal dose- response curve for oxytocin in the social recognition test. Neuropeptides 1995; 28(4): 251–5. 126. Ferguson JN, Young LJ, Hearn EF, Matzuk MM, Insel TR, Winslow JT. Social amnesia in mice lacking the oxytocin gene. Nat Genet 2000; 25(3): 284–8. 127. Takayanagi Y, Yoshida M, Bielsky IF, et al. Pervasive social deficits, but normal parturition, in oxytocin receptor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102(44): 16096–101. 128. Lee HJ, Caldwell HK, Macbeth AH, Tolu SG, Young WS 3rd. A conditional knockout mouse line of the oxytocin receptor. Endocrinology 2008; 149(7): 3256–63. 129. Popik P, Vos PE, Van Ree JM. Neurohypophyseal hormone receptors in the septum are implicated in social recognition in the rat. Behav Pharmacol 1992; 3(4): 351–8. 130. van Wimersma Greidanus TB, Maigret C. The role of limbic vasopressin and oxytocin in social recognition. Brain Res 1996; 713 (1/2): 153–9. 131. Popik P, van Ree JM. Oxytocin but not vasopressin facilitates social recognition following injection into the medial preoptic area of the rat brain. Eur Neuropsychopharmacol 1991; 1(4): 555–60. 98 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 132. Dantzer R, Bluthe RM, Koob GF, Le Moal M. Modulation of social memory in male rats by neurohypophyseal peptides. Psychopharmacology (Berl) 1987; 91(3): 363–8. 133. Le Moal M, Dantzer R, Michaud B, Koob GF. Centrally injected arginine vasopressin (AVP) facilitates social memory in rats. Neurosci Lett 1987; 77(3): 353–9. 134. Bluthe RM, Gheusi G, Dantzer R. Gonadal steroids influence the involvement of arginine vasopressin in social recognition in mice. Psychoneuroendocrinology 1993; 18(4): 323–35. 135. Bluthe RM, Dantzer R. Social recognition does not involve vasopressinergic neurotransmission in female rats. Brain Res 1990; 535(2): 301–4. 136. Everts HG, Koolhaas JM. Lateral septal vasopressin in rats: role in social and object recognition? Brain Res 1997; 760(1/2): 1–7. 137. Bielsky IF, Hu SB, Szegda KL, Westphal H, Young LJ. Profound impairment in social recognition and reduction in anxiety-like behavior in vasopressin V1a receptor knockout mice. Neuropsychopharmacology 2004; 29(3): 483–93. 138. Engelmann M, Ludwig M, Landgraft R. Simultaneous monitoring of intracerebral release and behavior: endogenous vasopressin improves social recognition. J Neuroendocrinol 1994; 6(4): 391–5. 139. Engelmann M, Landgraf R. Microdialysis administration of vasopressin into the septum improves social recognition in Brattleboro rats. Physiol Behav 1994; 55(1): 145–9. 140. Niel L, Monks DA. Mouse sex: sexual differentiation and sexual behavior in Mus musculus. In: Crusio WE, Sluyter F, Gerlai RT, Pietropaolo S, eds. Behavioral genetics of the mouse: genetics of behavioral phenotypes. Vol. 1. Cambridge, New York: Cambridge University Press, 2013: 218–29. Cambridge handbooks in behavioral genetics. 141. Flanagan-Cato LM, McEwen BS. Pattern of Fos and Jun expression in the female rat forebrain after sexual behavior. Brain Res 1995; 673(1): 53–60. 142. Rissman EF, Wersinger SR, Fugger HN, Foster TC. Sex with knockout models: behavioral studies of estrogen receptor alpha. Brain Res 1999; 835(1): 80–90. 143. Musatov S, Chen W, Pfaff DW, Kaplitt MG, Ogawa S. RNAi-mediated silencing of estrogen receptor {alpha} in the ventromedial nucleus of hypothalamus abolishes female sexual behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(27): 10456–60. 99 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 144. Ismail N, Garas P, Blaustein JD. Long-term effects of pubertal stressors on female sexual receptivity and estrogen receptor-alpha expression in CD-1 female mice. Horm Behav 2011; 59(4): 565–71. 145. Laroche J, Gasbarro L, Herman JP, Blaustein JD. Reduced behavioral response to gonadal hormones in mice shipped during the peripubertal/adolescent period. Endocrinology 2009; 150(5): 2351–8. 146. Laroche J, Gasbarro L, Herman JP, Blaustein JD. Enduring influences of peripubertal/adolescent stressors on behavioral response to estradiol and progesterone in adult female mice. Endocrinology 2009; 150(8): 3717–25. 147. Ruscio MG, Sweeny TD, Gomez A, Parker K, Carter CS. Social environment alters central distribution of estrogen receptor alpha in juvenile prairie voles. Physiol Behav 2009; 98(3): 296–301. 148. Pak TR, Handa RJ. Steroid hormone receptors and sex differences in behavior. In: Becker JB, Berkley KJ, Geary N, Hampson E, Herman JP, Young EA, eds. Sex differences in the brain: from genes to behavior. New York: Oxford University Press, 2008: 109–38. 149. Becker RO, Lazzari VM, Menezes IC, et al. Sexual behavior and dendritic spine density of posterodorsal medial amygdala neurons in oxytocin knockout female mice. Behav Brain Res 2013; 256: 95–100. 150. Flanagan LM, Pfaus JG, Pfaff DW, McEwen BS. Induction of FOS immunoreactivity in oxytocin neurons after sexual activity in female rats. Neuroendocrinology 1993; 58(3): 352–8. 151. Arletti R, Bertolini A. Oxytocin stimulates lordosis behavior in female rats. Neuropeptides 1985; 6(3): 247–53. 152. Caldwell JD, Prange AJ, Jr., Pedersen CA. Oxytocin facilitates the sexual receptivity of estrogen-treated female rats. Neuropeptides 1986; 7(2): 175–89. 153. Nyuyki KD, Waldherr M, Baeuml S, Neumann ID. Yes, I am ready now: differential effects of paced versus unpaced mating on anxiety and central oxytocin release in female rats. PLoS One 2011; 6(8): e23599 (6 str.). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3156771/pdf/pone.0023599.pdf (1. okt. 2014) 100 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 154. Johnson AE. The regulation of oxytocin receptor binding in the ventromedial hypothalamic nucleus by gonadal steroids. Ann N Y Acad Sci 1992; 652: 357–73. 155. Johnson AE, Coirini H, Ball GF, McEwen BS. Anatomical localization of the effects of 17 beta-estradiol on oxytocin receptor binding in the ventromedial hypothalamic nucleus. Endocrinology 1989; 124(1): 207–11. 156. Södersten P, Henning M, Melin P, Ludin S. Vasopressin alters female sexual behaviour by acting on the brain independently of alterations in blood pressure. Nature 1983; 301(5901): 608–10. 157. Albers HE, Rawls S. Coordination of hamster lordosis and flank marking behavior: role of arginine vasopressin within the medial preoptic-anterior hypothalamus. Brain Res Bull 1989; 23(1/2): 105–9. 158. Pedersen CA, Boccia ML. Vasopressin interactions with oxytocin in the control of female sexual behavior. Neuroscience 2006; 139(3): 843–51. 159. Rosenblatt JS, Mayer AD, Siegel HI. Maternal behavior among the nonprimate mammals. In: Adler NT, Pfaff D, Goy RW, eds. Handbook of behavioral neurobiology: reproduction. Vol. 7. New York: Plenium, 1985: 229–98. 160. Bridges RS. Biochemical basis of parental behavior in the rat. In: Rosenblatt JS, Snowdon CT. Parental care: evolution, mechanisms, and adaptive significance. Vol. 25. Advances in the study of behavior. San Diego: Academic Press, 1996: 215–42. 161. Kuroda KO, Tachikawa K, Yoshida S, Tsuneoka Y, Numan M. Neuromolecular basis of parental behavior in laboratory mice and rats: with special emphasis on technical issues of using mouse genetics. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2011; 35(5): 1205–31. 162. McCormack JT, Greenwald GS. Progesterone and oestradiol-17beta concentrations in the peripheral plasma during pregnancy in the mouse. J Endocrinol 1974; 62(1): 101–7. 163. Rosenblatt JS. Hormonal bases of parenting in mammals. In: Bornstein MH, ed. Handbook of parenting. 2nd ed. Vol. 2. Biology and ecology of parenting. Mahwah, New Jersey: Lawrence Erlbaum Associates, 2002: 31–60. 164. Numan M, Insel TR. The neurobiology of parental behavior. New York: Springer- Verlag, 2003: 8–68. 165. Lonstein JS, De Vries GJ. Sex differences in the parental behavior of rodents. Neurosci Biobehav Rev 2000; 24(6): 669–86. 101 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 166. Stolzenberg DS, Rissman EF. Oestrogen-independent, experience-induced maternal behaviour in female mice. J Neuroendocrinol 2011; 23(4): 345–54. 167. Kalinichev M, Rosenblatt JS, Nakabeppu Y, Morrell JI. Induction of c-fos-like and fosB-like immunoreactivity reveals forebrain neuronal populations involved differentially in pup-mediated maternal behavior in juvenile and adult rats. J Comp Neurol 2000; 416(1): 45–78. 168. Sheehan T, Numan M. Estrogen, progesterone, and pregnancy termination alter neural activity in brain regions that control maternal behavior in rats. Neuroendocrinology 2002; 75(1): 12–23. 169. Fahrbach SE, Pfaff DW. Effect of preoptic region implants of dilute estradiol on the maternal behavior of ovariectomized, nulliparous rats. Horm Behav 1986; 20(3): 354– 63. 170. Ogawa S, Taylor JA, Lubahn DB, Korach KS, Pfaff DW. Reversal of sex roles in genetic female mice by disruption of estrogen receptor gene. Neuroendocrinology 1996; 64(6): 467–70. 171. Mayer AD, Freeman NC, Rosenblatt JS. Ontogeny of maternal behavior in the laboratory rat: factors underlying changes in responsiveness from 30 to 90 days. Dev Psychobiol 1979; 12(5): 425–39. 172. Rosenberg PA, Herrenkohl LR. Maternal behavior in male rats: critical times for the suppressive action of androgens. Physiol Behav 1976; 16(3): 293–7. 173. Mayer AD, Rosenblatt JS. Hormonal influences during the ontogeny of maternal behavior in female rats. J Comp Physiol Psychol 1979; 93(5): 879–98. 174. Stern JM. Pubertal decline in maternal responsiveness in Long-Evans rats: maturational influences. Physiol Behav 1987; 41(2): 93–8. 175. Ogawa S, Eng V, Taylor J, Lubahn DB, Korach KS, Pfaff DW. Roles of estrogen receptor-alpha gene expression in reproduction-related behaviors in female mice. Endocrinology 1998; 139(12): 5070–81. 176. Lonstein JS, Wagner CK, De Vries GJ. Comparison of the "nursing" and other parental behaviors of nulliparous and lactating female rats. Horm Behav 1999; 36(3): 242–51. 177. Okabe S, Kitano K, Nagasawa M, Mogi K, Kikusui T. Testosterone inhibits facilitating effects of parenting experience on parental behavior and the oxytocin neural system in mice. Physiol Behav 2013; 118: 159–64. 102 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 178. Ogawa S, Washburn TF, Taylor J, Lubahn DB, Korach KS, Pfaff DW. Modifications of testosterone-dependent behaviors by estrogen receptor-alpha gene disruption in male mice. Endocrinology 1998; 139(12): 5058–69. 179. Brown RE. Social and hormonal factors influencing infanticide and its suppression in adult male Long-Evans rats ( Rattus norvegicus). J Comp Psychol 1986; 100(2): 155–61. 180. Ghiraldi LL, Svare B. Postpubertal isolation decreases infanticide and elevates parental care in C57BL/6J male mice. Physiol Behav 1986; 36(1): 59–62. 181. McCarthy MM. Estrogen modulation of oxytocin and its relation to behavior. Adv Exp Med Biol 1995; 395: 235–45. 182. Yoshimura R, Kiyama H, Kimura T, et al. Localization of oxytocin receptor messenger ribonucleic acid in the rat brain. Endocrinology 1993; 133(3): 1239–46. 183. Insel TR, Harbaugh CR. Lesions of the hypothalamic paraventricular nucleus disrupt the initiation of maternal behavior. Physiol Behav 1989; 45(5): 1033–41. 184. Olazabal DE, Ferreira A. Maternal behavior in rats with kainic acid-induced lesions of the hypothalamic paraventricular nucleus. Physiol Behav 1997; 61(5): 779–84. 185. Pedersen CA, Ascher JA, Monroe YL, Prange AJ Jr. Oxytocin induces maternal behavior in virgin female rats. Science 1982; 216(4546): 648–50. 186. Pedersen CA, Prange AJ Jr. Induction of maternal behavior in virgin rats after intracerebroventricular administration of oxytocin. Proc Natl Acad Sci U S A 1979; 76(12): 6661–5. 187. Bosch OJ, Neumann ID. Both oxytocin and vasopressin are mediators of maternal care and aggression in rodents: from central release to sites of action. Horm Behav 2012; 61(3): 293–303. 188. Kendrick KM, Keverne EB, Baldwin BA. Intracerebroventricular oxytocin stimulates maternal behaviour in the sheep. Neuroendocrinology 1987; 46(1): 56–61. 189. Nishimori K, Young LJ, Guo Q, Wang Z, Insel TR, Matzuk MM. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93(21): 11699–704. 190. APA. Diagnostic and statistical manual of mental disorders: DSM-5. 5th ed. Washington: American Psychiatric Association, 2013. 191. Nelson RJ. An introduction to behavioral endocrinology. 3rd ed. Sunderland: Sinauer Associates, 2005: 787–92. 103 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 192. Marek G, Duman RS. Neural circuitry and signaling in depression. In: Kaplan GB, Hammer RP, eds. Brain circuitry and signaling in psychiatry: basic science and clinical implications. Washington: American Psychiatric Publishing, 2002: 153–78. 193. Pinsonneault J, Sadee W. Sex differences in pharmacogenomics as a tool to study CNS disorders. In: Becker JB, Berkley KJ, Geary N, Hampson E, Herman JP, Young EA, eds. Sex differences in the brain: from genes to behavior. New York: Oxford University Press, 2008: 82–5. 194. Angold A, Costello EJ, Erkanli A, Worthman CM. Pubertal changes in hormone levels and depression in girls. Psychol Med 1999; 29(5): 1043–53. 195. Alonso J, Angermeyer MC, Bernert S, et al. Prevalence of mental disorders in Europe: results from the European Study of the Epidemiology of Mental Disorders (ESEMeD) project. Acta Psychiatr Scand Suppl 2004; (420): 21–7. 196. Kessler RC, McGonagle KA, Zhao S, et al. Lifetime and 12-month prevalence of DSM- III-R psychiatric disorders in the United States. Results from the National comorbidity survey. Arch Gen Psychiatry 1994; 51(1): 8–19. 197. Goldstein JM, Holsen LM, Handa R, Tobet S. Sex differences in HPA and HPG axes dysregulation in major depressive disorder: the role of shared brain circuitry between hormones and mood. In: Pfaff DW, Christen Y, eds. Multiple origins of sex differences in brain: research and perspectives in endocrine interactions. Berlin, Heidelberg: Springer, 2013: 139–64. 198. Lieb R. Anxiety disorders: clinical presentation and epidemiology. In: Holsboer F, Ströhle A, eds. Anxiety and anxiolytic drugs: handbook of experimental pharmacology. Vol. 169. Berlin, Heidelberg: Springer, 2005: 405–32. 199. Nestler EJ, Hyman SE, Malenka RC. Molecular neuropharmacology: a foundation for clinical neuroscience. New York, Chicago, San Francisco: McGraw-Hill, 2001: 191– 354. 200. Gorman JM, Kent JM, Sullivan GM, Coplan JD. Neuroanatomical hypothesis of panic disorder, revised. Am J Psychiatry 2000; 157(4): 493–505. 201. Nash JR, Nutt DJ. Pharmacotherapy of anxiety. In: Holsboer F, Ströhle A, eds. Anxiety and anxiolytic drugs: handbook of experimental pharmacology. Vol. 169. Berlin, Heiderberg: Springer, 2005: 469–501. 104 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 202. Cooper JR, Bloom FE, Roth RH. The biochemical basis of neuropharmacology. 8th ed. New York: Oxford University Press, 2003: 271–400. 203. Wenthur CJ, Bennett MR, Lindsley CW. Classics in chemical neuroscience: fluoxetine (Prozac). ACS Chem Neurosci 2014; 5(1): 14–23. 204. Wong DT, Bymaster FP, Engleman EA. Prozac (fluoxetine, Lilly 110140), the first selective serotonin uptake inhibitor and an antidepressant drug: twenty years since its first publication. Life Sci 1995; 57(5): 411–41. 205. Bigos KL, Pollock BG, Stankevich BA, Bies RR. Sex differences in the pharmacokinetics and pharmacodynamics of antidepressants: an updated review. Gend Med 2009; 6(4): 522–43. 206. Spoletini I, Vitale C, Malorni W, Rosano GMC. Sex differences in drug effects: interaction with sex hormones in adult life. In: Regitz-Zagrosek V, ed. Sex and gender differences in pharmacology: handbook of experimental pharmacology. Vol. 214. Berlin, Heiderberg: Springer, 2012: 91–105. 207. Bano S, Akhter S, Afridi MI. Gender based response to fluoxetine hydrochloride medication in endogenous depression. J Coll Physicians Surg Pak 2004; 14(3): 161–5. 208. Martenyi F, Dossenbach M, Mraz K, Metcalfe S. Gender differences in the efficacy of fluoxetine and maprotiline in depressed patients: a double-blind trial of antidepressants with serotonergic or norepinephrinergic reuptake inhibition profile. Eur Neuropsychopharmacol 2001; 11(3): 227–32. 209. Schneider LS, Small GW, Hamilton SH, Bystritsky A, Nemeroff CB, Meyers BS. Estrogen replacement and response to fluoxetine in a multicenter geriatric depression trial. Fluoxetine Collaborative Study Group. Am J Geriatr Psychiatry 1997; 5(2): 97– 106. 210. Lebron-Milad K, Tsareva A, Ahmed N, Milad MR. Sex differences and estrous cycle in female rats interact with the effects of fluoxetine treatment on fear extinction. Behav Brain Res 2013; 253: 217–22. 211. Martínez-Mota L, Cruz-Martínez JJ, Márquez-Baltazar S, Fernández-Guasti A. Estrogens participate in the antidepressant-like effect of desipramine and fluoxetine in male rats. Pharmacol Biochem Behav 2008; 88(3): 332–40. 105 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 212. Ohl F. Animal models of anxiety. In: Holsboer F, Ströhle A, eds. Anxiety and anxiolytic drugs: handbook of experimental pharmacology. Vol. 169. Berlin, Heidelberg, New York: Springer, 2005: 36–69. 213. Porsolt RD, Le Pichon M, Jalfre M. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature 1977; 266(5604): 730–2. 214. Petit-Demouliere B, Chenu F, Bourin M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology (Berl) 2005; 177(3): 245–55. 215. Slattery DA, Cryan JF. Using the rat forced swim test to assess antidepressant-like activity in rodents. Nat Protoc 2012; 7(6): 1009–14. 216. Pellow S, Chopin P, File SE, Briley M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods 1985; 14(3): 149–67. 217. Lister RG. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse. Psychopharmacology (Berl) 1987; 92(2): 180–5. 218. Hall CS. Emotional behavior in the rat. III: The relationship between emotionality and ambulatory activity. J Comp Psychol 1936; 22(3): 345–52. 219. Castagne V, Moser P, Roux S, Porsolt RD. Rodent models of depression: forced swim and tail suspension behavioral despair tests in rats and mice. Curr Protoc Pharmacol 2010; Chapter 5: Unit 5. 8. 220. Ghorpade S, Tripathi R, Sonawane D, Manjrekar N. Evaluation of antidepressant activity of ropinirole coadministered with fluoxetine in acute and chronic behavioral models of depression in rats. J Basic Clin Physiol Pharmacol 2011; 22(4): 109–14. 221. Alonso SJ, Castellano MA, Afonso D, Rodriguez M. Sex differences in behavioral despair: relationships between behavioral despair and open field activity. Physiol Behav 1991; 49(1): 69–72. 222. Gómez ML, Martínez-Mota L, Estrada-Camarena E, Fernández-Guasti A. Influence of the brain sexual differentiation process on despair and antidepressant-like effect of fluoxetine in the rat forced swim test. Neuroscience 2014; 261: 11–22. 223. An XL, Zou JX, Wu RY, et al. Strain and sex differences in anxiety-like and social behaviors in C57BL/6J and BALB/cJ mice. Exp Anim 2011; 60(2): 111–23. 224. Johnston AL, File SE. Sex differences in animal tests of anxiety. Physiol Behav 1991; 49(2): 245–50. 106 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 225. Leuner B, Mendolia-Loffredo S, Shors TJ. Males and females respond differently to controllability and antidepressant treatment. Biol Psychiatry 2004; 56(12): 964–70. 226. Kobayashi K, Ikeda Y, Haneda E, Suzuki H. Chronic fluoxetine bidirectionally modulates potentiating effects of serotonin on the hippocampal mossy fiber synaptic transmission. J Neurosci 2008; 28(24): 6272–80. 227. Dulawa SC, Holick KA, Gundersen B, Hen R. Effects of chronic fluoxetine in animal models of anxiety and depression. Neuropsychopharmacology 2004; 29(7): 1321–30. 228. Brookshire BR, Jones SR. Direct and indirect 5-HT receptor agonists produce gender- specific effects on locomotor and vertical activities in C57 BL/6J mice. Pharmacol Biochem Behav 2009; 94(1): 194–203. 229. Marlatt MW, Lucassen PJ, van Praag H. Comparison of neurogenic effects of fluoxetine, duloxetine and running in mice. Brain Res 2010; 1341: 93–9. 230. Santos T, Baungratz MM, Haskel SP, et al. Behavioral interactions of simvastatin and fluoxetine in tests of anxiety and depression. Neuropsychiatr Dis Treat 2012; 8: 413–22. 231. Classen W. Behavior, Neurology and electrophysiology. In: Krinke GJ, ed. The handbook of experimental animals: the laboratory rat. London, San Diego: Academic Press, 2000: 419–36. 232. Storm EE, Tecott LH. Social circuits: peptidergic regulation of mammalian social behavior. Neuron 2005; 47(4): 483–6. 233. Markham JA, Juraska JM. Social recognition memory: influence of age, sex, and ovarian hormonal status. Physiol Behav 2007; 92(5): 881–8. 234. Reeb BC, Tang AC. Sex difference in temporal patterns of social interaction and its dependence upon neonatal novelty exposure. Behav Brain Res 2005; 158(2): 359–65. 235. Kalantaridou SN, Makrigiannakis A, Zoumakis E, Chrousos GP. Stress and the female reproductive system. J Reprod Immunol 2004; 62(1/2): 61–8. 236. Södersten P. Receptive behavior in developing female rats. Horm Behav 1975; 6(4): 307–17. 237. Koch M, Ehret G. Estradiol and parental experience, but not prolactin are necessary for ultrasound recognition and pup-retrieving in the mouse. Physiol Behav 1989; 45(4): 771–6. 107 J. Kerčmar: Vpliv socialnega stresa, spolnih hormonov med puberteto … na obnašanje odraslih miši. Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2015. Doktorska disertacija 238. Okabe S, Nagasawa M, Kihara T, et al. The effects of social experience and gonadal hormones on retrieving behavior of mice and their responses to pup ultrasonic vocalizations. Zoolog Sci 2010; 27(10): 790–5. 239. Siegel HI, Rosenblatt JS. Estrogen-induced maternal behavior in hysterectomized- overiectomized virgin rats. Physiol Behav 1975; 14(04): 465–71. 240. Siegel HI, Rosenblatt JS. Hormonal basis of hysterectomy-induced maternal behavior during pregnancy in the rat. Horm Behav 1975; 6(3): 211–22. 241. Opas EE, Gentile MA, Kimmel DB, Rodan GA, Schmidt A. Estrogenic control of thermoregulation in ERalphaKO and ERbetaKO mice. Maturitas 2006; 53(2): 210–6. 242. Opas EE, Rutledge SJ, Vogel RL, Rodan GA, Schmidt A. Rat tail skin temperature regulation by estrogen, phytoestrogens and tamoxifen. Maturitas 2004; 48(4): 463–71. 243. Haenisch B, Bönisch H. Depression and antidepressants: insights from knockout of dopamine, serotonin or noradrenaline re-uptake transporters. Pharmacol Ther 2011; 129(3): 352–68. 244. Crawley JN, Belknap JK, Collins A, et al. Behavioral phenotypes of inbred mouse strains: implications and recommendations for molecular studies. Psychopharmacology (Berl) 1997; 132(2): 107–24. 245. Lifschytz T, Shalom G, Lerer B, Newman ME. Sex-dependent effects of fluoxetine and triiodothyronine in the forced swim test in rats. Eur Neuropsychopharmacol 2006; 16(2): 115–21. 246. Griebel G, Cohen C, Perrault G, Sanger DJ. Behavioral effects of acute and chronic fluoxetine in Wistar-Kyoto rats. Physiol Behav 1999; 67(3): 315–20. 247. Silva RC, Brandão ML. Acute and chronic effects of gepirone and fluoxetine in rats tested in the elevated plus-maze: an ethological analysis. Pharmacol Biochem Behav 2000; 65(2): 209–16. 248. Simon NM, Zalta AK, Worthington JJ 3rd, et al. Preliminary support for gender differences in response to fluoxetine for generalized anxiety disorder. Depress Anxiety 2006; 23(6): 373–6.