Farmacevtski vestnik STROKOVNO GLASILO SLOVENSKE FARMACIJE • PHARMACEUTICAL JOURNAL OF SLOVENIA Ø T. 5 • N O V E M B E R 2 0 0 8 • L E T N I K 5 9 Odgovorni urednik Borut Øtrukelj Œastni glavni urednik Aleø Krbavœiœ Glavna urednica Andrijana Tivadar Uredniøki odbor Tajda Gala Miharija Stanko Gobec Katja Gombaœ Aver Iztok Grabnar Janja Marc Franc Vreœer Izdajateljski svet Stane Srœiœ Simona Cencelj Boøtjan Debelak Mirjana Gaøperlin Lili Grosek Mirjam Hoœevar Koroøec Anamarija Zega Naslov uredniøtva / Adress of the Editorial Office: Slovensko farmacevtsko druøtvo, Dunajska 184a, 1000 Ljubljana, Telefon (01) 569 26 01 Transakcijski raœun pri Novi LB d.d. Ljubljana: 02010-0016686585. Izhaja øestkrat letno. Letna naroœnina je 70 EUR. Za tuje naroœnike 100 US$. Avtor fotografije na naslovnici, Maj Klemenœiœ Tiska: COLLEGIUM GRAPHICUM Naklada: 3.200 izvodov Farmacevtski vestnik (Pharmaceutical Journal of Slovenia) is published 6 times a year by the Slovenian Pharmaceutical Society, Subscription rate in inland 70 EUR other countries US$ 100. Farmacevtski vestnik is regulary abstracted in: BIOLOGICAL ABSTRACTS, CHEMICAL ABSTRACTS, PHARMACEUTICAL ABSTRACTS, MEDICAL & AROMATIC PLANTS ABSTRACTS AND INBASE / Excerpta Medica Letnik 2008 sofinancira Javna agencija za raziskovalno dejavnost RS. UVODNIK Izobraæevati ali raziskovati? To je veœna dilema vseh raziskovalcev, ki so soœasno tudi pedagoøki delavci na najviøjem, univerzitetnem nivoju. Æe sama postavitev prejønje povedi nakazuje na to, da morajo uœitelji in asistenti, na tako zahtevnem podroœju, kot je farmacevtska veda in znanost, intenzivno raziskovati, da lahko uspeøno izobraæujejo. Samo nekdo, ki je aktivno udeleæen v raziskovalnem delu, bo uspel razloæiti procese in mehanizme delovanja, sinteze, nastanka, tudi tistim, ki jim je izobraæevanje namenjeno. In tako se rezultati baziœne znanosti lahko izrazijo v aplikaciji, ali pa pridobijo izobraæevalno noto. Dolænost vseh nas pa je, da sprejemamo in podpremo znanja, ki jih na ta, najteæji, a najboljøi naœin neprestano pridobivajo raziskovalci. Ne glede na trenutno politiœno usmeritev sveta øe vedno velja Marxovo naœelo, da ne morejo vsi le trgovati, kupovati in preprodajati, nekdo mora tudi proizvajati. In znanje proizvajajo raziskovalci, brez katerih ne bi bilo niti izobraæevanja, torej prenosa znanja. Øtevilka Farmacevtskega vestnika, ki je pred vami, zrcali del trenutnega raziskovalnega dela na podroœju farmacije v Sloveniji. V œlanku o lesnih gobah dr. Janeø opisuje arzenal novih potencialnih antimikrobnih uœinkovin, ki jih carstvo gliv skriva in jih je potrebno »le« odkriti. Zanimiv je zgodovinski prispevek doc. dr. Obreze o uporabi anorganskih arzenovih spojin v terapiji, kakor tudi prispevek prof. dr. Sama Krefta o zdravilih v alternativni medicini. V zadnjih dveh letih je podiplomski øtudent Rade Injac objavil kopico vrhunskih raziskovalnih œlankov v uglednih svetovnih publikacijah o protektivnem delovanju fulereno-la, kar je tudi vsebina preglednega œlanka. Na koncu pa si sledijo trije œlanki s podroœja izboljøave sinteznih ali bioloøkih zdravilnih uœinkovin oziroma optimizacije prenosa na mesto delovanja, predvsem z uporabo bio- in nanotehnologije. Preberite, tudi tako boste del znanstvenoizobraæevalnega procesa, ki je pomemben za izpopolnjevanje znanja vsakega farmacevta. Prof. dr. Borut Øtrukelj farm vestn 2008; 59 237 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 238 Vsebina Pregledni znanstveni œlanki – Review scientific articles Damjan Janeš Odkrivanje novih protimikrobnih uœinkovin v lesnih glivah Discovery of new antimicrobial compounds in wood-colonising fungi 239 Aleš Obreza Zgodovina uporabe anorganskih arzenovih spojin v terapiji History of use of inorganic arsenic compounds in therapy 245 Samo Kreft Zdravila v alternativni medicini Medicinal products in alternative medicine 251 Rade Injac, Nina Kocevar, Borut Štrukelj Fulerenol C60(OH)24 kot potencialna uœinkovina Fullerenol C60(OH)24 as a potential drug 257 Alenka Zvonar, Mirjana Gašperlin, Julijana Kristl Samo(mikro)emulgirajoœi sistemi - alternativen pristop za izboljøanje bioloøke uporabnosti lipofilnih uœinkovin Self(micro)emulsifying systems - alternative approach for improving bioavailability of lipophilic drugs 263 Nina Kocevar, Samo Kreft Aciliranje peptidov in proteinov z derivati maøœobnih kislin Peptide and protein fatty acylation 269 Znanstveni raziskovalni œlanki - Scientific research articles Andrej Dolenc, Julijana Kristl Razvoj polielektrolitne nanoobloge na mikrodelcih uœinkovine Development of polyeleytrolyte nanocoating on drug microparticles 273 Zanimivosti iz stroke Novice iz sveta farmacije 278 Poroœilo s 63. svetovnega kongresa Liga Medicorum Homeopathica Internationalis (LMHI) v Belgiji 279 Osebne vesti V spomin 281 238 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 239 -^- Odkrivanje novih protimikrobnih uœinkovin v lesnih glivah Odkrivanje novih protimikrobnih uœinkovin v lesnih glivah Discovery of new antimicrobial compounds in wood-colonising fungi Damjan Janeš Povzetek: Œloveøtvo se v 21. stoletju sooœa z odpornostjo patogenih mikroorganizmov na nekoœ zelo uspeøne protimikrobne uœinkovine. Odporni sevi ogroæajo æivljenja bolnikov, øe posebej tistih z oslabljenim imunskim sistemom. Za uspeøno terapijo je nujen konstanten razvoj novih protimikrobnih uœinkovin, saj so dosedanje izkuønje pokazale, da so zaradi pojava vedno novih odpornih sevov tudi najnovejøe uœinkovine uspeøne v œasovno zelo omejenem obdobju. Zelo pomemben pristop k razvoju novih protimikrobnih uœinkovin je iskanje spojin vodnic z reøe-tanjem razliœnih organizmov. Glive so zaradi svojega raznolikega metabolizma zanimiv vir uœinkovin, vendar lesnih gliv kot virov protimikrobnih uœinkovin øe niso intenzivno sistemsko raziskovali. Œlanek podaja pregled dosedanjih øtudij protimikrobnega delovanja lesnih gliv. Kljuœne besede: protimikrobne uœinkovine, lesne glive, odpornost mikroorganizmov Abstract: In the 21st century mankind faces with the resistance of pathogenic microorganisms to recently successful antimicrobial compounds. Resistant strains endanger lives especially of patients with impaired immune system. There is constant need for development of new antimicrobial compounds because even the latest antimicrobial compounds are successful for a limited period of time. To combat that, different approaches are necessary, among them screening various organisms for antimicrobial activity is very important. Due to their diverse metabolic pathways, fungi are very interesting source of antimicrobial compounds, but wood-colonising fungi have not been extensively and systematically studied so far. This article reviews antimicrobial investigations of wood-colonising fungi. Keywords: antimicrobial compounds, wood-colonising fungi, microbial resistance 1 Kratka zgodovina protimikrobnih uœinkovin Narava je æe tisoœletja vir zdravilnih uœinkovin. Mnogo spojin, ki jih danes uporabljamo v terapevtske namene, so raziskovalci izolirali iz naravnih virov, pri tem pa so velikokrat sledili izkuønjam tradicionalne medicine. Æe stari Grki so uporabljali praprot (Aspidium sp.) kot antihelmintik, podobno kot Azteki metliko (Chenopodium sp.). Antiœni hindujci so zdravili gobavost s œolmugro (Hydnocarpus sp.). Stoletja so ljudje uporabljali razliœne plesni za zdravljenje okuæenih ran (1). Zgodovina racionalne kemoterapije se je zaœela leta 1906, ko je Ehrlich razvil in poimenoval kemoterapijo na osnovi opazovanj selektivne toksiœnosti anilinskih barvil za bakterije. Temu je sledilo odkritje antimalarikov pamakina in mepakrina in nato sulfonamidov. Domagkove sistematiœne øtudije sulfonamidov in njegovi dramatiœni uspehi pri zdravljenju sepse, pljuœnice in meningitisa so povzroœili revolucijo v znanosti in medicini (1). V prejønjem stoletju pa so najpomembnejøo vlogo pri odkrivanju novih zdravilnih uœinkovin odigrali mikroorganizmi, ki sintetizirajo antibiotike. Flemingovo odkritje penicilina v œopiœasti plesni - Penicillium notatum (Penicillium chrysogenum) leta 1929 in prva øirøa terapevtska uporaba omenjenega antibiotika v 40. letih prejønjega stoletja sta zaœela novo obdobje medicine, t.i. »zlato dobo antibiotikov«. Izjemen uspeh penicilina je sproæil intenzivno iskanje bioaktivnih uœinkovin v naravnih virih. Rezultati dolgoletnih raziskav gliv so danes spojine, ki sodijo med najpomembnejøe izdelke farmacevtske industrije: protibakterijske uœinkovine kot so penicilini iz Penicillium sp., cefalosporini iz Cephalosporium acremonium, aminoglikozidi, tetraciklini in poliketidi iz Streptomyces sp. ter antihelmintiki in uœinkovine proti parazitom, npr. ivermektini iz Streptomyces sp. (2). 2 Odpornost mikrobov proti protimikrobnim uœinkovinam Nedvomno so bili odkrivanje, razvoj in kliniœne øtudije novih protimikrobnih uœinkovin, ki so moœno zaznamovali medicino 20. stoletja, uspeøni koraki v boju z mikrobi, vendar se v 21. stoletju œloveøtvo sooœa z zelo veliko teæavo, z odpornostjo patogenih mikroorganizmov na nekoœ zelo uspeøne protimikrobne uœinkovine (3). Odpornost je neizogiben odgovor evolucije na uporabo protimikrobnih uœinkovin. Æe v prvih letih uporabe penicilina se je pojavil velik deleæ odpornih sevov Staphylococcus aureus. Temu so sledile tudi druge vrste bakterij, ki so zaradi uporabe novih in novih asist. dr. Damjan Janeø, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva cesta 7, SI-1000 Ljubljana farm vestn 2008; 59 239 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 240 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles antibiotikov razvile odpornost proti veœini le-teh. V zaœetku je farmacevtska industrija z velikim øtevilom novih antibiotikov øe lahko sledila pojavu odpornosti, v zadnjih dveh desetletjih pa so razvili zelo malo novih protimikrobnih uœinkovin. Med mikroorganizme, ki imajo izraæeno odpornost proti veœini antibiotikov ter povzroœajo resne okuæbe, uvrøœamo: na meticilin odporne seve Staphylococcus aureus (MRSA - Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), na vankomicin odporne seve enterokokov (VRE - Vanocomycin-resistant Enterococci), na penicilin odporne seve pnevmokokov ter po Gramu negativne bakterije, kot so Escherichia coli, Klebsiella in Enterobacter sp. in Pseudomonas aeruginosa (4). Odpornost se ne pojavlja samo pri bakterijah, temveœ tudi pri glivah, virusih in parazitih (5). Izbor uœinkovin proti parazitom ni dovolj velik, da bi lahko uspeøno zdravil protozojske, parazitske infekcije kot so malarija, leømanioza, tripanosomoza in filarioza, œeprav verjetno vsako leto terjajo veœ æivljenj kot katerakoli druga skupina infekcijskih bolezni (6). Za uspeøno zdravljenje je nujen konstanten razvoj novih protimikrobnih uœinkovin, saj so dosedanje izkuønje pokazale, da so zaradi pojava vedno novih odpornih sevov tudi najnovejøe uœinkovine uspeøne v œasovno zelo omejenem obdobju. Odpornost se slej kot prej razvije proti vsaki uœinkovini, zato moramo nujno uporabiti druge pristope, øe posebej pri zdravljenju infektivnih bolezni v bolniønicah (7). V zdravljenje lahko posegamo z uvajanjem novih analogov dosedanjih uœinkovin, z uporabo kombinacij razliœnih uœinkovin, z novimi pristopi k zdravljenju ter z uporabo novih spojin, ki imajo drugaœen mehanizem delovanja (8), predvsem pa je nujno, da omejimo pojavnost in øiritev odpornih sevov, da bomo lahko øe pravoœasno odkrili in razvili nove protimikrobne uœinkovine (9). 3 Preizkušanje protimikrobnih ucinkovin in vitro Posamezni bakterijski sevi so razliœno obœutljivi na protimikrobne uœinkovine, zato so takøni podatki zelo pomembni pri zdravljenju in iskanju novih protimikrobnih uœinkovin. Za preizkuøanje obœutljivosti danes najveœkrat uporabljamo disk-difuzijski, agar-dilucijski in bujon-dilucijski test. Disk-difuzijski test uporabljamo za kvalitativno ali semikvantitativno oceno obœutljivosti doloœenega bakterijskega seva na protimikrobne uœinkovine. Pri tej metodi merimo premer inhibicijskega obmoœja okol diska, prepojenega z raztopino uœinkovine, po inkubaciji na agarju, ki je premazan s suspenzijo izbranega bakterijskega seva. Za kvantitativno vrednotenje obœutljivosti uporabljamo agar-dilucijski ali bujon-dilucijski test. Pri tej metodi pripravimo serijo redœitev protimikrobne uœinkovine v agarju ali bujonu in po inkubacij opazujemo bakterijske kolonije na agarju ali zamotnitev tekoœega gojiøœa zaradi rasti bakterij. Najniæja koncentracija uœinkovine v agarju ali bujonu, ki prepreœi rast bakterij je minimalna inhibitorna koncentracija (MIK). Bujon-dilucijsko metodo je moæno tudi avtomatizirati, pri œemer motnost gojiøœa ovrednotimo denzitometriœno (10). Bujon-dilucijski test je moæno izvesti tudi v zelo majhnem volumnu (100 mL). Tako imenovani mikrodilucijski test je danes standardna referenœna metoda za preizkuøanje obœutljivosti aerobnih bakterij na protimikrobne uœinkovine. S to metodo lahko kvantitativno opredelimo in vitro uœinkovitost spojine na izbranem bakterijskem sevu (11). Metodo uporabljamo kot zanesljivo orodje za odkrivanje protimikrobnih uœinkovin z novim kemizmom in kar je zelo pomembno, test lahko prilagodimo za preizkuøanje ekstraktov (12). Druga zanimiva metoda za preizkuøanje protibakterijske uœinkovitosti spojin in ekstraktov je test z morsko, bioluminiscentno bakterijo Vibrio fischeri (Beijerinck) Lehm. & Neumann. Test temelji na pojavu, da vsako zaviranje celiœnega metabolizma zmanjøa tvorbo svetlobe, ki jo bakterija v normalnih pogojih emitira. Ta pojav lahko izkoristimo za kvalitativno in kvantitativno prouœevanje uœinkov razliœnih spojin. Metodo z bakterijo Vibrio fischeri sicer intenzivno uporabljajo za preizkuøanje toksiœnosti razliœnih spojin, saj so dokazali, da so celice teh bakterij dovzetne za toksiœne uœinke doloœenih spojin podobno kot sesalske celice. Povsem nova pa je uporaba Vibrio fischeri-bioluminiscentnega testa za reøetanje ekstraktov lesnih gliv s ciljem iskanja protibakterijskega delovanja (13). 4 Lesne glive Veœino gliv uvrøœamo v samostojno kraljestvo gliv (Fungi), ki poleg æivali (Animalia), rastlin (Plantae), protoktistov (Protoctista), kamor sodijo alge in evglenoidi ter prokariontov (Monomera ali Prokaryotae) tvorijo sistem petih kraljestev. Glive razvrøœamo v pet razredov, vendar pa so iz staliøœa lesnih gliv pomembne predvsem naslednji trije: • Ascomycotina (zaprtotrosnice), • Basidiomycotina (prostotrosnice) in • Deuteromycotina ali Fungi imperfecti (nepopolne glive). Leta 1983 so ocenili, da je bilo odkritih 64000 vrst gliv, v letu 1995 se je øtevilo poznanih vrst povzpelo na 72000. Letno odkrijejo pribliæno 700 novih vrst, verjetno pa je øtevilo poznanih vrst le majhen deleæ vseh vrst organizmov, saj so intenzivno prouœevali le maloøtevilne regije in æivljenjska okolja. Glede na to, da poznamo pribliæno 270000 vrst cvetnic, ocenjujejo, da utegne biti øtevilo vrst gliv okoli 1600000 (14, 15). Glive so na prvi pogled zelo podobne rastlinam, saj se ne gibljejo in œrpajo hranila iz okolja. Kljub svoji podobnosti z rastlinami pa se od njih v kljuœnih pogledih razlikujejo. Glive so evkariontski, heterotrofni, absorptivni organizmi, ki razvijejo difuzno, razvejano tubularno telo in se razmnoæujejo s pomoœjo spor. Za njih je znaœilno da: • so brez klorofila, • glavna skeletna snov celiœnih sten je hitin, • zalogo hrane predstavlja glikogen, • naœin prehranjevanja je heterotrofen (lizotrofija) in • se prehranjujejo na tri naœine (kot zajedavci, gniloæivke ali pa so simbionti) (14, 15). Glive so sestavljene iz prehranjevalnega in razmnoæevalnega dela. Prehranjevalni del sestavljajo neorganiziran splet nitk ali hif, ki pa tvorijo micelij ali podgobje. Celice hif izloœajo encime, s katerimi glive razkrajajo les, nato pa posrkajo vase produkte, ki jih potrebujejo za 240 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 241 Odkrivanje novih protimikrobnih uœinkovin v lesnih glivah rast in razmnoæevanje. Skozi podgobje glive œrpajo hrano in vodo ter se øirijo na øe neokuæen les. Na rast in razvoj gliv vplivajo vlaga, temperatura, svetloba, hrana, zrak in vrednost pH (16). Lesne glive povzroœajo v lesu øtevilne kemijske in fizikalne spremembe, ki se kaæejo v razkroju lesa (trohnenje), zaradi œesar les izgublja naravne lastnost. Okuæba lesa z glivami se najprej pokaæe v spremembi naravne barve lesa. Na osnovi doloœenih znaœilnih poøkodb lesa lahko doloœimo skupine gliv, ki te spremembe povzroœajo. Delimo jih na: • glive povzroœiteljice rjave ali destruktivne trohnobe, • glive povzroœiteljice bele ali korozivne trohnobe in piravosti, • glive mehke trohnobe, • modrivke in • glive plesni, povzroœiteljice povrøinskih sprememb barv. Glive, ki povzroœajo rjavo trohnobo, oznaœujemo za prave razkrojevalke lesa in spadajo v pododdelek Basidiomycotina. Pogosteje okuæijo les iglavcev kot listavcev, kjer razgrajujejo celulozo in hemicelulozo, medtem ko ostane lignin skoraj nerazkrojen. Les, zaradi preseæka oksidiranega lignina, postane rdeœkasto rjave do temno rjave barve. Glive, ki povzroœajo belo trohnobo, so sposobne razgradnje lignina. Zaradi tega les postaja vse svetlejøi in se zaœne vlaknasto cepiti. Na mikromorfoloøki in kemijski stopnji bi lahko loœili glive povzroœiteljice bele trohnobe ter glive povzroœiteljice tako imenovane »soœasne trohnobe«. Glive bele trohnobe razgradijo najprej lignin in hemicelulozo, medtem ko povzroœiteljice soœasne trohnobe hkrati v enakem obsegu razgradijo lignin, hemicelulozo in celulozo. Glive povzroœiteljice bele trohnobe pogosteje okuæijo les listavcev kot iglavcev. Glive, povzroœiteljice mehke trohnobe, sodijo v skupino zaprtotrosnic (Ascomycotin) in skupino nepopolnih gliv (Fungi imperfecti). Hranijo se predvsem s celulozo in hemicelulozo, lahko pa tudi z ligninom. Okuæba se pojavi, kadar zaradi razliœnih dejavnikov (previsoke vlaænosti, slabih zraœnih pogojev) okuæba bolj aktivnih in tekmovalnih gliv iz skupine Basidiomycotin ni mogoœa. Povrøina okuæenega lesa je mehka in izrazito temne barve (kadar je les moker). Pri suhem lesu se pojavijo podobne razpoke kot pri rjavi trohnobi, le da so bolj plitke; notranjost lesa ostane nepoøkodovana. Glive modrivke povzroœajo globinsko obarvanje beljave iglavcev (smreka, bor) in listavcev (topol, breza, lipa). Trosi gliv modrivk se razvijejo, le œe padejo direktno na beljavo ali œe jih doloœeni insekti (predvsem podlubniki) vnesejo v les. Modrivke se hranijo s økrobom, beljakovinami in sladkorji, zato ne vplivajo na mehanske lastnosti lesa. Plesni povzroœajo le povrøinsko obarvanje lesa v najrazliœnejøih barvah (œrna, modra, zelena, rdeœa, roænata in siva). Znaœilna je tudi oblika in globina obarvanih madeæev. Obarvanja, ki nastanejo zaradi plesni, so najveœkrat neenakomerno pikœasta, pegasta ali razporejena v madeæih. Le redko se zgodi, da bi bila obarvana celotna povrøina lesa. Plesni ne predstavljajo velike ekonomske økode, saj je les tudi po njihovi okuæbi øe vedno uporaben. Z bruøenjem ali skobljanjem lesa lahko madeæe delno ali v celoti odstranimo (16). 5 Dosedanje študije protimikrobnega delovanja Glive so zaradi svojega raznolikega metabolizma zanimiv vir protimikrobnih ucinkovin, vendar so lesne glive slabo raziskane. Edino sistemsko študijo, v kateri so preverjali protibakterijsko delovanje 72 vrst omenjenih gliv, so naredili z uporabo bioluminiscentne bakterije Vibrio fischeri (13). Rezultate omenjene študije so potrdili z referencnim mikrodilucijskim testom (17, 18). Pregled rezultatov dosedanjih študij protimikrobnega delovanja lesnih gliv podaja preglednica 1, strukturne formule izoliranih ucinkovin pa so na sliki 1 Med aktivnimi sekundarni metaboliti lesnih gliv so protibakterijske protivirusne in protiglivne ucinkovine z zelo raznovrstnimi strukturami in spektrom delovanja. Protibakterijsko delujoce spojine so: • seskviterpeni hirsutinska kislina in komplikatinska kislina ter koriolin • steroidne spojine lanostanoidni derivati iz vrste Fomitopsis pinicola, steroli iz vrste Ganoderma applanatum in favolon, neobicajni ergosteron s eis položajem obroca B in C: ganomicin A in B, hidrokinona s farnezilno stransko verigo: beauvericin, nenavadni ciklicni oligoamid/ester: merulinska kislina A, B in C poliketidnega izvora: • hlapni alkoholi, • aldehidi • ketoni in kisline iz vrste Pleurotus ostreatus: • cinabarin, • rdece obarvani fenoksazinon • poliacetilenske spojine iz vrste Serpula lacrymans: • rumeno obarvane fenolne spojine kserokominska in variegatinska kislina ter variegatorubin: • aromatski acetilenovi derivati frustulozin in frustulozinol, aromatska acetilenova derivata. Ucinkovin filtrata kulture, ekstraktov plodišca vrste Lentinula edodes (19) ter ekstraktov plodišca vrste Phellinus linteus (20) in Ganoderma lucidum še niso odkrili (21, 22). 6 Zakljuœek V danaønjem œasu, ko odporni mikroorganizmi ogroæajo zdravje œloveka, je iskanje novih virov in razvoj novih protimikrobnih uœinkovin izrednega pomena. Lesne glive so obetaven vir novih uœinkovin ali spojin vodnic, saj so æe dosedanje raziskave pokazale raznovrstnost in veliko protimikrobno uœinkovitost njihovih sekundarnih metabolitov. Nedvomno bodo rezultati sodobnih raziskav tudi øtevilne terapevtsko uporabne uœinkovine. farm vestn 2008; 59 241 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 242 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles Preglednica 1: Dosedanje øtudije protibakterijskega, protiglivnega in protivirusnega delovanja lesnih gliv. Table 1: Overview of studies of antibacterial, antifungal and antiviral activity of wood-colonising fungi. IME GLIVE UŒINKOVINA/FRAKCIJA EKSTRAKTA REFERENCA Protibakterijsko delovanje Coriolus consors koriolin 19 Favolaschia sp. favolon 19 Flammulina velutipes enokipodin A, B, C in D 23 Fomitopsis pinicola lanostanoidni derivati 19 Ganoderma applanatum steroli 19 Ganoderma lucidum lipofilni ekstrakti 21 Ganoderma lucidum vodni ekstrakt 22 Ganoderma pfeifferi ganomicin A in B 19 Hypoxylon carneum karneinska kislina A in B 24 Laetiporous sulphureus beauvericin 19 Lentinus edodes filtrat kulture 25 Lentinus edodes kloroformski, etilacetatni in vodni ekstrakti plodišca 26 Lentinus crinitus deoksihipnofilin in hipnofilin 19 Merulius tremellosus merulinska kislina A, B in C 19 Phellinus linteus metanolni ekstrakt plodišca in njegove frakcije 20 Pholiota adiposa metanolni ekstrakt plodišca 27 Pleurotellus hypnophilus pleurotelol in pleurotelinska kislina 19 Pleurotus ostreatus hlapne spojine: alkoholi, aldehidi, ketoni in kisline 28 Pleurotus sajor-caju 12 kDa ribonukleaza 29 Pycnoporus sanguineus cinabarin 19 Serpula himantoides himanimid A, B, C in D 30 Serpula lacrymans poliacetileni, kserokominska in variegatinska kislina, variegatorubin 30, 31, 32 Stereum complicatum hirsutinska in komplikatinska kislina 19 Stereum frustulosum frustulozin in frustulozinol 19 Trichaptum biforme biformin 19 Protiglivno delovanje Aleurodiscus mirabilis aleurodiskal 19 Bjerkandera adusta anisaldehid, 2-(4-metoksifenil)propan-1,2-diol 19 Filoboletus sp. strobilurin A, E in F1 in njihovi derivati 19 Flammulina velutipes enokipodin A, B, C in D 23 Gloeophyllum sepiarium oospolakton 19 Hypoxylon carneum karneinska kislina A in B 24 Ischnoderma benzoinum 1-hidroksi-2-nonin-3-on 19 Lentinus crinitus deoksihipnofilin in hipnofilin 19 Merulius tremellosus merulidal 19 Pholiota adiposa metanolni ekstrakt plodišca 27 Pleurotellus hypnophilus pleurotelol in pleurotelinska kislina 19 Pleurotus pulmonarius anisaldehid, 2-(4-metoksifenil)propan-1,2-diol 19 Pleurotus sajor-caju 12 kDa ribonukleaza 29 Serpula himantoides himanimid A, B, C in D 31 Trichaptum biforme biformin 19 Protivirusno delovanje Fomes fomentarius filtrat kulture 19 Fomitella supina vodni ekstrakt 19 Ganoderma applanatum vodni ekstrakt 19 Ganoderma lucidum ganoderiol F in ganodermanontriol 19 Ganoderma pfeifferi ganodermadiol, lucidadiol in aplanoksidinska kislina 19 Inonotus hispidus hispolon in hispidin 19 Inonotus obliquus vodotopni lignini 19 Phellinus rhabarbarinus vodni ekstrakt 19 Trametes cubensis vodni ekstrakt 19 Trametes versicolor polisaharidne frakcije 19 Trichaptum perrottotti vodni ekstrakt 19 242 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 243 -^t- Odkrivanje novih protimikrobnih uœinkovin v lesnih glivah „ XSSjV «\, WoHluriiiJV R, = H.R.-H ferin F, R] = RLR>=OCHji riihil urin F ^ Z-44-mrtcifeifniir.l-l.2-pr-cruniEol mfclpodin A K = H HKtipDdnC R "OH ffiokipthJiri B k= H ^.! ¦ - ¦ -. i._- ¦ ¦. --I E /\ ^irfc-mlernunrinirifJ L-JiTHriiMii A It = OH pincmirin B R = H XuP kr-"'ii,i I -hiJri'kM-2-iHTiiii-.l-iiii Link1 si *L ^iivi-k,i U^K a kisJmn A B, -II. R.-ll, R,-ll °f^YT7N^\ a Li Jam B R,= a K; = llH H, = 11 H i nirnibmtainliiioA K, = «HI. R, = H menili r*k.j k wli u B R,°H.R;i=OH nifniKnftkakfcsBimt' R:=H,R;=II Slika 1: Strukturne formule protibakterijskih, protiglivnih in protivirusnih uœinkovin iz lesnih gliv (19-32). Figure 1: Molecular structures of antibacterial, antifungal and antiviral compounds from wood-colonising fungi (19-32). LJtoLAihLpflofrin R=ll rn|'i...i.i..i k UM rJruratliJ R = CH,OII [*T~**h-t- Hr»— R-CDOH { ^A 'ill II.! II II II I.I i HO'Yf^V ¦inMiliii^kj kNiru kttmpifc.iliivtka Vfcilina ]Miluo:iJ leni i v vinic Srfjutia Im tyituuu FniJtukizin R >=CHO farm vestn 2008; 59 243 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 244 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles 7 Literatura 1. Farrington M. Chemotherapy of infections. In: Clinical Pharmacology, 9th ed. Bennett PN & Brown MJ, Churchill Livingstone, Edinburgh 2003: 201—213. 2. Cragg GM, Newman DJ. Natural Product Drug Discovery in the Next Millennium. Pharmaceutical Biology 2001; 39 (Suppl.): 8—17. 3. Thomson CJ, Power E, Ruebsamen-Waigmann H, Labischinski H. Antibacterial research and development in the 21st Century – an industry perspective of the challenges. Curr Opin Microbiol 2004; 7: 445–450. 4. French GL. Clinical impact and relevance of antibiotic resistance. Adv Drug Deliv Rev 2005; 57 (10): 1514—1527. 5. Levy SB. Antibiotic resistance—the problem intensifies. Adv Drug Deliv Rev 2005; 57 (10): 1446—1450. 6. Strobel GA. Endophytes as sources of bioactive products. Microbes Infect 2003; 5 (6): 535—544. 7. van der Waaij D, Nord CE. Development and persistence of multiresistance to antibiotics in bacteria; an analysis and a new approach to this urgent problem. Int J Antimicrob Agents 2000; 16 (3): 191—197. 8. Silver LL, Bostian KA. Discovery and Development of New Antibiotics: the Problem of Antibiotic Resistance. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37 (3): 377—383. 9. Andersson DI. Persistence of antibiotic resistant bacteria. Curr Opin Microbiol 2003; 6: 452–456. 10. Chambers HF. Antimicrobial Agents: General Considerations. In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. Hardman JG & Limbird LE (Eds.), McGraw-Hill, New York, NY, 2001: 1143— 1170. 11. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard M7-A6, 6th ed. 20 (2), NCCLS, Wayne, PA, 2003: 14—16. 12. Zgoda JR, Porter JR. A Convenient Microdilution Method for Screening Natural Products Against Bacteria and Fungi. Pharmaceutical Biology 2001; 39 (3): 221—225. 13. Berden Zrimec M, Zrimec A, Slanc P, Kac J, Kreft S. Screening for antibacterial activity in 72 species of wood-colonizing fungi by the Vibrio fisheri bioluminescence method. J Basic Microbiol 2004; 44 (5): 407—412. 14. Carlile MJ, Watkinson SC, Gooday GW. The Fungi as a Major Group of organisms. In: The Fungi, 2nd ed., Academic Press, San Diego, CA, 2001: 1—9. 15. Kendrick B. Kingdoms, Classification and Biodiversity. In: The Fifth Kingdom, 3rd ed., Focus publishing, Newburyport, MA, 2000: 1—8. 16. Podlesnik B. Uœinkovitost pripravkov na osnovi bora in etanolamina na lesne glive. Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniøka fakulteta, Oddelek za lesarstvo, 2007. 17. Janeø D. Raziskave gliv kot virov novih protimikrobnih uœinkovin. Doktorska disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko biologijo, 2007. 18. Janeø D, Umek A, Kreft S. Evaluation of antibacterial activity of extracts of five species of wood-colonizing fungi. J Basic Microbiol 2006; 46 (3): 203—207. 19. Zjawiony JK. Biologically Active Compounds from Aphyllophorales (Polypore) Fungi. J Nat Prod 2004; 67: 300—310. 20. Hur J-M, Yang C-H, Han S-H, Lee S-H, You Y-O, Park J-C, Kim K-J. Antibacterial effect of Phellinus linteus against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Fitoterapia 2004; 75 (6): 603— 605. 21. Ofodile LN, Uma NU, Kokubun T, Grayer RJ, Ogundipe OT, Simmonds MS. Antimicrobial activity of some Ganoderma species from Nigeria. Phytother Res 2005; 19 (4): 310—313. 22. Yoon SY, Eo SK, Kim YS, Lee CK, Han SS. Antimicrobial activity of Ganoderma lucidum extract alone and in combination with some antibiotics. Arch Pharm Res 1994; 17 (6): 438—442. 23. Ishikawa NK, Fukushi Y, Yamaji K, Tahara S, Takahashi K (2001). Antimicrobial Cuparene-Type Sesquiterpenes, Enokipodins C and D, from a Mycelial Culture of Flammulina velutipes. J Nat Prod 64, 932—934. 24. Quang DN, Stadler M, Fournier J, Asakawa Y. Carneic Acids A and B, Chemotaxonomically significant Antimicrobial Agents from the Xylariaceous Ascomycete Hypoxylon carneum. J Nat Prod 2006; 69: 1198—1202. 25. Hatvani N. Antibacterial effect of the culture fluid of Lentinus edodes mycelium grown in submerged liquid culture. Int J Antimicrob Agents 2001; 17 (1): 71—74. 26. Hirasawa M, Shouji N, Neta T, Fukushima K, Takada K. Three kinds of antibacterial substances from Lentinus edodes (Berk.) Sing. (Shiitake, an edible mushroom). Int J Antimicrob Agents 1999; 11 (2): 151—157. 27. Dulger B. Antimicrobial activity of the macrofungus Pholiota adiposa. Fitoterapia 2004; 75 (3—4): 395—397. 28. Garcia MJ, Estarron-Espinosa M, Ogura T. Volatile Compounds Secreted by the Oyster Mushroom (Pleurotus osteratus) and Their Antibacterial Activities. J Agric Food Chem 1997; 45: 4049—4052. 29. Ngai PHK, Ng TB. A ribonuclease with antimicrobial, antimitogenic and antiproliferative activities from the edible mushroom Pleurotus sajor-caju. Peptides 2004; 25 (1): 11—17. 30. Aqueveque P, Anke T, Sterner O. The Himanimides, New Bioactive Compounds from Serpula himantoides (Fr.) Karst. Z Naturforsch 2002; 57c: 257—262. 31. Farrell IW, Keeping JW, Pellatt MG, Thaller V. Natural acetylenes. Part XLI. Polyacetylenes from fungal fruiting bodies. J Chem Soc Perk T 1 1973; 22: 2642—2643. 32. Hearn MTW, Jones ERH, Pellatt MG, Thaller V, Turner JL. Natural acetylenes. Part XLII. Novel C7, C8, C9, C10 polyacetylenes from fungal cultures. J Chem Soc Perk T 1 1973; 22: 2785—2788. 244 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 245 -^- Zgodovina uporabe anorganskih arzenovih spojin v terapiji Zgodovina uporabe anorganskih arzenovih spojin v terapiji History of use of inorganic arsenic compounds in therapy Aleš Obreza Povzetek: Anorganske arzenove spojine spremljajo œloveka od najstarejøih œasov. Nekoœ so predstavljale najpogosteje uporabljene strupe, po drugi strani pa so bile tisoœletja nepogreøljive v terapiji. Prve resnejøe øtudije segajo v œas grøko-rimske civilizacije, ko jih je Hipokrat priporoœil za zdravljenje rakavih obolenj. Zasledimo jih tudi v delih njegovih naslednikov Dioskorida, Plinija starejøega in Galena. Antiœno znanje se je ohranilo s pomoœjo Arabcev in se preko njih poœasi vrnilo v srednjeveøko Evropo. Paracelsus predstavlja zaœetek nove dobe v zdravljenju infekcijskih bolezni z uporabo arzenovih spojin, ki je v prejønjem stoletju privedla do odkritja neosalvarzana. Thomas Fowler je konec 18. stoletja reøil øe problem slabe vodotopnosti arzenovega(III) oksida in s tem sproæil zlato dobo arzenovih spojin, ki so jih dve stoletji uporabljali praktiœno za vse moæne indikacije. Po krajøem zatonu se z registracijo Trisenox-a zopet vraœajo na lekarniøke pulte. Kljuœne besede: arzen, zgodovina farmacije, terapija, Thomas Fowler Abstract: Inorganic arsenic compounds have been the companions of our species from the dawn of the history. They were the most commonly used poisons, but also indispensable in the therapy through millennia. First serious studies date to the Greco-Roman civilization, when Hippocrates suggested their use in the therapy of malignant diseases. They are also mentioned in the works of his successors Dioscoridus, Pliny the Elder and Galenus. The antique knowledge was collected and edited by Arabs and slowly returned to the medieval Europe. Paracelsus marked the beginning of a new era in the therapy of infectious diseases with arsenic compounds, a path that led to the discovery of neosalvarsan in the previous century. At the end of the 18th century Thomas Fowler successfully solved the problem of low water solubility of arsenic(III) oxide and triggered the golden age of arsenic compounds in the medicine. During next two centuries they were used for practically all indications. After short decline they returned to the pharmacies again due to the approval of Trisenox. Keywords: arsenic, history of pharmacy, therapy, Thomas Fowler 1 Uvod »Œe bi bil sprejet zakon, ki bi zdravnikom dovoljeval uporabo le dveh zdravil, bi izbral arzen in opij. Z njima lahko ozdravimo veœ bolezni, kot s katerima koli drugima zdraviloma v farmakopeji«, je leta 1883 v Luisiani, ZDA, zapisal dr. I. L. Crawcour (1). Citat kaæe na izjemen pomen, ki so ga imele arzenove spojine v terapiji tistega œasa, in je hkrati odsev njihove veœtisoœletne uporabe na najrazliœnejøih podroœjih. Z njimi so se poleg zdravnikov in lekarnarjev sreœevali tudi izdelovalci barvil, steklarskih izdelkov, alkimisti, zlatarji in seveda zastrupljevalci. Beli arzenik (Arsenicum album, arzenov(III) oksid, As2O3) je bil najpogosteje uporabljen in najbolj priljubljen strup vse do leta 1836, ko je bil vpeljan Marshov test, s katerim lahko dokaæemo sledove prisotnega arzena v truplu øe nekaj let po pokopu. Zgodbe o Locusti, ki je Neronu (54-68) pomagala, da se je znebil svojih nasprotnikov, spletke na dvoru renesanœnih Borgijcev in ostale zgodovinske drame predstavljajo øe dandanes zanimivo branje, vendar presegajo obseg tega œlanka (2). Prav tako bom v prispevku le na kratko predstavil mehanizme terapevtskega in toksiœnega delovanja arzenovih spojin. Rdeœa nit œlanka je zgodovinski pregled njihove uporabe v terapiji, ki se zanimivo ni konœala z uvedbo modernih zdravilnih uœinkovin v 20. stoletju. Leta 2000 je namreœ FDA izdala dovoljenje za promet zdravilu Trisenox, ki vsebuje kot uœinkovino arzenov(III) oksid, za zdravljenje akutne promielocitne levkemije v primerih, ko ostale uœinkovine niso uœinkovite. Dve leti kasneje so zdravilo registrirali tudi pri EMEA (3). Arzen je v naravi prisoten v veœ kot dvesto mineralih, v glavnem so to arzenati(V), arzenati(III), sulfidi, oksidi, nekaj pa je tudi arzenidov in elementnega arzena. Najpogostejøi je arzenopirit (FeAsS), ki je glavna ruda za pridobivanje arzena, poleg njega pa izkoriøœamo øe rumeni avripigment (As2S3), rdeœi realgar (As4S4) in beli arzenolit (As2O3). V zemeljski skorji je v povpreœju 5 ppm arzena, v povrøinskih sladkih vodah in morjih pa je vsebnost pribliæno tisoœkrat manjøa. Dnevni vnos znaøa pri odraslem œloveku 20-50 mg/dan, pri œemer veœino predstavljajo organoarzenove spojine, s pitno vodo pa vnesemo v organizem do 10 mg/dan arzena (4). Farmakoloøko delovanje anorganskih arzenovih spojin je v glavnem posledica interakcij trivalentnega arzena s sulfhidrilnimi skupinami raznih proteinov, vendar je tudi uporaba petvalentnega arzena nevarna, saj lahko v Aleš Obreza, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2008; 59 245 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 246 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles organizmu obliki prehajata ena v drugo. Zaradi nespecifiœnega delovanja lahko zastrupitev prizadene vse celice v organizmu, zato arzen øtejemo med protoplazemske strupe. Znaki akutne zastrupitve so bruhanje, diareja z izgubo vode in elektrolitov, krœi skeletne muskulature, odpoved ledvic, hipotenzija, øok in smrt. Pri kroniœni zastrupitvi pride do hiperpigmentacije koæe, keratoze, anoreksije, poøkodbe jeter, anemij in perifernih nevropatij. Arzenove spojine so tudi dokazano kancerogene (zlasti koæni rak) (3). 2 Obdobje do renesanse Najstarejøe zanesljive omembe anorganskih arzenovih spojin segajo v zaœetek 1. tisoœletja pred naøim øtetjem na indijski podcelini. Minerala avripigment in realgar sta omenjena v delu Suøruta-samhita, ki jo pripisujejo na pol legendarnemu indijskemu zdravilcu Suøruti (okrog 850 pr.n.ø.). Celotno delo sestavlja øest poglavij, kjer so predstavljeni temelji tradicionalne, na Ajurvedi in Atharvavedi temeljeœe indijske medicine. V petem poglavju, namenjenemu rastlinskim in mineralnim strupom, sta opisana oba arzenova minerala, ki ju uvrøœa med najbolj toksiœne minerale in priporoœa veliko previdnost pri uporabi. Toksiœnosti arzenovih spojin so se zavedali tudi Kitajci, vendar so avripigment, realgar in kasneje tudi arzenov(III) oksid uporabljali za zdravljenje psoriaze in raznih infekcij, ki se izraæajo tudi v spremembah na koæi (gobavost, sifilis). Pri tem so se ravnali po principu, da lahko doloœeno toksiœno substanco uporabijo za zdravljenje bolezni, povzroœenih z nekim drugim strupom. Dejanskih vzrokov infekcijskih bolezni stari Kitajci niso poznali, œeprav so prav oni æe pred dobrimi 2000 leti uporabljali doloœene postopke za prepreœitev øirjenja okuæb. Oblaœila, ki so jih nosili bolniki, so nekaj œasa pustili na prostem, nakar so vanje zavijali zdrave ljudi. Poleg tega so tudi kraste pacientov, obolelih za npr. œrnimi kozami, strli v prah, dodali malce avripigmenta in jih nato vpihnili v nosnice zdravih ljudi. Omenjena postopka lahko øtejemo za primitivni obliki vakcinacije. Sun Simiao je v 7. stoletju uporabljal arzenove spojine za zdravljenje malarije, kar je bilo skoraj tisoœ let pred Paracelzom. Kitajci so bili verjetno tudi prvi, ki so arzenove spojine uporabljali za devitalizacijo zob (5, 6). Arzenove spojine so verjetno uporabljali tudi prebivalci Mezopotamije in Egipta, vendar zapisov o tem do sedaj øe niso odkrili. Za evropski prostor so bistveno pomembnejøi antiœni avtorji, med katerimi je na prvem mestu potrebno omeniti Hipokrata (okrog 460-370 pr.n.ø.), oziroma avtorje zbirke pribliæno sedemdesetih del, ki jih uvrøœamo v Corpus Hippocraticum. V delu, ki je v glavnem posveœeno celjenju ran (7), sta prviœ uporabljena izraza karkinos in karkinoma, kakor so imenovali vidne spremembe tkiva, ki se øirijo v zdravo tkivo podobno kot rakove kleøœe. V prvo skupino so uvrstili øtevilne otekline in razjede, ki se same od sebe ne ozdravijo. V tem primeru ne gre vedno za karcinome, kot jih razumemo danes, saj so mednje priøteli tudi hemoroide. Med karkinoma lahko zasledimo tudi nekatera rakava obolenja, kot na primer rak na dojki, rak na maternici in koæni rak, vendar je natanœna identifikacija posameznih obolenj, ki jih je Hipokrat opisal, danes zelo teæavna. Arzenova minerala je v kombinacijami z drugimi zdravili rastlinskega in mineralnega izvora (teloh, brin, kaœnik, svinœeve in bakrove spojine) priporoœil za terapijo gnojnih ran in pri poœasi napredujoœih karkinoma. Asklepiades (okrog 125-40 pr.n.ø.) ju je uporabljal tudi za zdravljenje revmatiœnih obolenj (7, 8). Najobøirnejøi sintezi antiœnega znanja o zdravilih predstavljata deli Dioskorida (1.stoletje) »De Materia medica« (9) in Plinija starejøega (23-79) »Historia naturalis« (10). Dioskorid je bil prvi, ki je omenil hude boleœine v prebavnem traktu po peroralnem vnosu arzenovih spojin. Opisa za avripigment (Arsenikon pri Dioskuridu in Arrhenicum pri Pliniju) sta pri obeh avtorjih praktiœno identiœna, kar kaæe na dejstvo, da sta verjetno uporabljala isti starejøi vir, ki se do danes ni ohranil. Loœita tri vrste minerala, ki se med seboj razlikujejo po kvaliteti, kar je verjetno posledica razlik v œistoti. Najkvalitetnejøi avripigment iz okolice Dardanel naj bi imel jedke lastnosti in izrazito adstringentno delovanje. Zaradi tega sta priporoœala njegovo uporabo v mazilih za depilacijo (skupaj s kalcijevim hidroksidom) in za odstranjevanje raznih koænih izrastkov. Podoben opis in naœin uporabe zasledimo tudi pri Galenu (129-?), ki je bil stoletje kasneje osebni zdravnik cesarjev Marka Avrelija (161-180) in Komoda (180-192) (11). Realgar (sandaracha) je imel æe v tistih œasih zelo øiroko uporabo. Pomagal naj bi pri ugrizu steklih æivali, v kombinaciji z medom naj bi zmehœal grlo in prispeval k bolj œistemu in harmoniœnemu glasu, ob dodatku kadila naj bi bil odliœno zdravilo za astmatike, lajøal pa naj bi tudi kaøelj. Plinij ga je priporoœal tudi dermalno z vinom kot sredstvo proti pleøavosti in kot pomembno sestavino pripravkov za oko, morda zaradi takrat øe neznanega protimikrobnega delovanja (9, 10). Z zatonom antike so v Evropi nastopila stoletja, ko se je vse do ustanovitve salernitanske øole v 11. stoletju poœasi izgubljalo tudi grøko-rimsko vedenje o zdravilstvu. Za ohranjanje tradicije se lahko zahvalimo le Bizancu in kasneje Arabcem, ki so zavzeli vzhodne in juæne obale Mediterana ter prodrli globoko v Francijo. Alkimist Jabir ibn Hajjan (Geber; 8. stoletje), ki se je v glavnem ukvarjal s poskusi pretvorbe neplemenitih kovin v zlato in srebro (odkritje zlatotopke), je s sublimacijo avripigmenta z morsko soljo pripravil œisti arzenov(III) oksid, ki so ga v Evropi poimenovali Arsenicum album. Medtem ko se je Geber usmeril v glavnem v alkimijo, je bil al-Razi (Rhazes; okrog 865-925) vodja bolniønice v Bagdadu. Ohranil se je njegov predpis za pripravo kapljic za oœi z antiseptiœnim delovanjem, ki vsebujejo dram (1 dram ustreza 3.888 g) avripigmenta in po dva drama mire, æafrana in kadila, znanega pod imenom Olibanum. Sledil mu je Ali ibn Sina (Avicenna; 980-1036), ki so ga zaradi obøirnega dela Kanon medicine poimenovali tudi kralj zdravnikov. V 49. poglavju druge knjige omenja tri takrat znane anorganske arzenove spojine in jih poimenuje po barvi ali po njihovem nahajaliøœu: beli arzenik, kraljevski rumeni pigment in praøek iz rudnika (arab. rahj al ghar). Njihova uporaba je pri njem identiœna kot pri antiœnih avtorjih (12) in so jo preko pripadnikov salernitanske øole prenesli v evropski visoki srednji vek. Arzenove spojine v Evropi tistega œasa niso dosegle takøne priljubljenosti kot med Arabci, œeprav je v 15. stoletju Saladinus Asculanus uvrstil beli arzenik med snovi, ki naj bodo vedno na zalogo v lekarni. Medtem ko sta avripigment in realgar izgubila svoj pomen, se je uporaba arzenovega(III) oksida v kriminalne namene tako razøirila, da je postal poklic preskuøevalca hrane na srednjeveøkih in renesanœnih dvorih eden izmed najbolj iskanih in hkrati najbolj tveganih. Uporabo v farmaciji so v glavnem omejili na terapijo infekcijskih bolezni, razøirila pa se je zlasti po domnevnih uspehih Guy de Chauliaca v 14. stoletju. Osebni zdravnik avignonskih papeæev je 246 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 247 Zgodovina uporabe anorganskih arzenovih spojin v terapiji uporabljal beli arzenik v œasu epidemije bubonske kuge (1347-1350), vendar je bila za njegove uspehe verjetno zasluænejøa karantena, s katero so bili najviøji predstavniki cerkve loœeni od avignonskega meøœanstva, ki je zaradi epidemije moœno trpelo. Kljub temu se je novica o peroralni uporabi belega arzenika razøirila zlasti po danaønji Franciji in Italiji, ljudje pa so ga v œasu epidemij zaœeli nositi okrog vratu kot amulet. Uœinkovina svoje vloge v terapiji kuge ni opravila, vendar pa je dolgoroœno vendarle prispevala k zmanjøanju pogostosti in jakosti epidemij. Z arzenovimi spojinami so namreœ zastrupljali podgane, ki so znani prenaøalci pri bubonski kugi, in zmanjøali njihovo øtevilo. Omenjeni dejavnik je poleg napredka na podroœju higiene in veœje sploøne odpornosti evropskega prebivalstva bistveno vplival na to, da so odslej epidemije prizadele le bolj ali manj omejena podroœja stare celine, zmanjøala pa se je tudi smrtnost (11, 13). 3 Od renesanse do razsvetljenstva Preporod znanosti in umetnosti v Evropi ob koncu 15. in v 16. stoletju sovpada tudi z dobo velikih geografskih odkritij, ki so omogoœila stike z do tedaj neznanimi civilizacijami. Iz novih deæel so prihajale eksotiœne dobrine, med njimi tudi zdravilne rastline, ki so v naslednjih stoletjih pomembno vplivale na razvoj farmacije. Negativna plat odkritij pa je bil v prvi vrsti prenos bolezni, ki so zdesetkale domorodno prebivalstvo nove celine. Transport seveda ni bil zgolj enosmeren, saj se je v Evropi ravno v tem œasu pojavila bolezen, ki je zaznamovala sledeœa stoletja, sifilis. Veœina prebivalstva je verjela, da je nadloga boæja kazen zaradi nemoralnega æivljenja, to miøljenje pa je dodatno podkrepilo dejstvo, da so bili pripravki, ki so jih uporabljali v terapiji, neuœinkoviti. Z boleznijo se je ukvarjal tudi zaœetnik moderne farmacije in medicine, zdravnik, lekarnar in alkimist Phillip von Hohenheim, bolj znan kot Paracelsus (1493-1541). V nasprotju s tedaj veljavnimi naœeli je poleg zdravil rastlinskega izvora priporoœal tudi uporabo natanœno odmerjenih koliœin mineralnih snovi. V terapijo sifilisa je vpeljal æivosrebrove spojine in arzenov(III) oksid ter s tem postavil temelje zdravljenja infekcijskih bolezni do odkritja modernih kemoterapevtikov in antibiotikov. Arzenov(III) oksid, ki ga je natanœno prouœeval tudi z alkimistiœnega vidika, je priporoœal tudi pri zdravljenju vroœiœnih stanj, predvsem pri malariji, in za razne bolezni, za katere danes vemo, da jih povzroœajo protozoji (14). V naslednjih dveh stoletjih se je uporaba arzenovega(III) oksida razøirila in so ga predpisovali v najrazliœnejøe namene (antianemik, holagog, spazmolitik, sedativ, tonik…). Rosinus Lentilius (1657-1733), zdravnik Württemberøkega volilnega kneza, ga je priporoœal za zdravljenje malarije in mu je pripisoval boljøe lastnosti kot skorji kininovca. Kot slabost je poleg toksiœnosti omenil le relativno slabo topnost spojine v vodi, ki je bila problematiœna zlasti pri notranji uporabi. Z obema teæavama so se ukvarjali øtevilni zdravniki in lekarnarji tistega œasa. V zahodni Evropi je bilo ob koncu 18. stoletja v obtoku pribliæno øestdeset razliœnih pripravkov, v katerih so bile tudi razne arzenove spojine. Med farmacevtskimi oblikami so prevladovale pilule (Aikenove pilule, ki so jih uporabljali kot tonik) in vodne raztopine (de Valaginova mineralna raztopina, ki je vsebovala arzenov(III) oksid raztopljen v razredœeni klorovodikovi kislini) (1, 14). 4 Thomas Fowler in zlata doba anorganskih arzenovih spojin Teæave, povezane z vodotopnostjo, je uspeøno reøil zdravnik in lekarnar Thomas Fowler (1736-1801), ki je leta 1786 z uporabo kalijevega karbonata pripravil kalijev arzenat(III) in ga pod imenom Liquor mineralis priporoœil za zdravljenje intermitentne vroœice. Klasiœni pripravek je vseboval 1% vodno raztopino kalijevega arzenata(III), dodal pa mu je tudi tinkture sivke, vendar zgolj zato, da je bil pripravek podoben zdravilu. Znan je bil tudi kot Kali arsenicosum, Kali arseniatum, Liquor arsenicalis Fowleri in Liquor potass e arsenitis ter je opisan v Londonski farmakopeji iz leta 1809. Priporoœen reæim odmerjanja je bil 12 kapljic raztopine trikrat na dan, kar je v osmih dneh, kolikor naj bi trajala terapija, znaøalo pribliæno 110 mg arzenovega(III) oksida (15). Fowlerjeva raztopina je v nekaj letih zamenjala ostale pripravke in postala skorajda univerzalno zdravilo za vse bolezni. Predpisovali so jo za revmatiœna obolenja, astmo, epilepsijo, lajøanje histeriœnih napadov pri æenskah, dispepsijo, vodenico, infekcijske bolezni in rakave bolezni, œe naøtejem le najpogostejøe indikacije. Veœina zdravnikov tistega œasa se je kljub pogosto neuspeønemu zdravljenju trmasto oklepala arzenovih spojin in vztrajala pri predpisovanju Fowlerjeve raztopine v kombinacijah z najrazliœnejøimi zdravilnimi uœinkovinami in zlasti z rastlinskimi izvleœki. Od tod izvira tudi ime »terapevtska mula« za arzen, ki so ga pogosto uporabljali v tistem œasu. Med zagovorniki uporabe arzenovih spojin sta se v zaœetku 19. stoletja pojavili dve struji. Veœina je sledila Økotu G. N. Hillu, ki je priporoœal uporabo nizkih odmerkov Fowlerjeve raztopine (do 10 kapljic na dan) za zdravljenje øirokega spektra obolenj. Pri tem je bilo potrebno natanœno spremljati pojave prvih znakov zastrupitve. V primeru moœnejøih boleœin v prebavnem traktu, æeje in slabosti je zahteval takojønjo prekinitev terapije. V drugo skupino so sodili pristaøi tako imenovanega herojskega zdravljenja. Po njihovem mnenju je bilo zdravljenje po navodilih dr. Hilla podobno homeopatiji, ki se je v tistem œasu moœno razøirila v Evropi (16, 17) in jo je veœina zdravnikov ocenjevala kot mazaøtvo. Predlagali so uporabo bistveno viøjih odmerkov (50-150 kapljic na dan), terapija pa naj bi trajala od nekaj dni do nekaj tednov. Najbolj znan predstavnik te smeri je bil zagotovo zdravnik, raziskovalec Afrike in misijonar dr. David Livingstone (1813-1873), ki je pripravek uporabljal v terapiji spalne bolezni (18). 19. stoletje predstavlja tudi œas, ko so se pojavili tudi prvi dvomi o upraviœenosti zdravljenja z arzenovimi spojinami in prve resnejøe øtudije o zastrupitvah. Tako naj bi v petdesetih letih 19. stoletja med 262 bolniki, ki so jih v Edinburgu zdravili s Fowlerjevo raztopino, opazili 21 primerov koænega raka, pri kar 106 pacientih pa je priølo do hiperkeratoze (18, 19). S tem so se v omenjenem obdobju pojavili prvi znaki konca zlate dobe, vendar se je arzen le poœasi umikal iz uporabe. O tem zgovorno priœa citat na zaœetku prispevka. Priljubljenost nekaterih uœinkovin in pripravkov potrjuje tudi dejstvo, da so arzenov(III) oksid øe v letu 1911 priporoœali za zdravljenje astme, psoriaze in ekcemov, v raznih farmakopejah pa ga lahko v obliki Fowlerjeve raztopine zasledimo do konca 2. svetovne vojne (3, 16). Predpis za pripravo Fowlerjeve raztopine po Ph.J. II. je prof. Bohinc vkljuœil v svoje delo Galenska farmacija in v njem podrobno razloæil kemizem posameznih arzenovih spojin (20). Prof. Tomiå iz Zagreba pa je za arzenov(III) oksid, jodid in avripigment navedel tudi farm vestn 2008; 59 247 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 248 -^- Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles ustrezne odmerke (do 10 mg dnevno) in najpogostejøe farmacevtske oblike (zdravilno mazilo, pilule) (21). 5 Zakljuœek? Nagel razvoj organske kemije v drugi polovici 19. stoletja je privedel tudi do sinteze prvih organoarzenovih spojin. Natrijev kakodilat (1) in natrijev 4-aminofenilarzonat(V) (2) sta imela pribliæno dvajsetkrat manjøo toksiœnost kot arzenov(III) oksid, uporabljali pa ju zlasti za zdravljenje tripanosomiaze. Paul Erlich je nadaljeval z raziskavami in v letih pred 1. svetovno vojno se je na træiøœu pojavil salvarzan (3), uœinkovito sredstvo za terapijo sifilisa. Skupaj z vodotopnim analogom neosalvarzanom (4) so ga uporabljali do konca 40-ih let prejønjega stoletja, ko so arzenove spojine tudi v terapiji bakterijskih bolezni nadomestili antibiotiki in moderni kemoterapevtiki. Æe prej je postalo jasno, da za druge indikacije ne obstaja racionalna osnova. Arzenove spojine so ostale na obrobju in so jih øe nekaj œasa uporabljali za zdravljenje bolezni, povzroœenimi z evkariontskimi paraziti. V farmaciji je zadnjih petdeset let prevladovalo mnenje, da so zanimive le s historiœnega vidika. Ali se morda po registraciji arzenovega trioksida ponovno vraœajo? HjC Nil MHj* Cl" OH a wYY\ HO <*te, ~n N ^^ Aft >V ^«t ir - VY NN DH Slika 1: Strukture nekaterih organoarzenovih spojin. Figure 1: Structures of some organoarsenic compounds. 6 Dodatek Ob koncu zgodovinskega pregleda uporabe anorganskih arzenovih spojin lahko omenim øe zanimivost, ki ni neposredno povezana s farmacijo, vendar so o njej pogosto poroœali v œasopisnih œlankih (22). V naøi neposredni bliæini so v prejønjih stoletjih poznali primere tako imenovanih uæivalcev arzena. Kmetje v okolici Gradca na Øtajerskem so æe od 17. stoletja dalje svojim konjem v krmo dodajali arzenov(III) oksid, misleœ, da lahko na ta naœin izboljøajo njihove fiziœne sposobnosti. Poleg tega naj bi imeli ti konji svetlejøo in bolj bleøœeœo dlako, zato so se kupcem zdeli mlajøi in so na trgu dosegali viøje cene (23). Sœasoma so zaœeli arzenov(III) oksid in avripigment uæivati tudi kmetje, sprva v zelo nizkih odmerkih (nekaj mg), ki pa so jih postopoma zviøevali. Zabeleæeni so primeri, ko je prostovoljec pred zbranimi priœami na konferenci zdravnikov in naravoslovcev v Gradcu 1860 brez posledic zauæil 300 mg snovi, ki so jo predhodno analizirali z Marshevim testom. Omenjena koliœina bistveno presega LD50, testiranec pa naj bi jo zauæil v povpreœju osemkrat na mesec. Uæivalci arzenovih spojin so za svoje poœetje navedli veœ razlogov. Zauæita snov naj bi jih varovala pred nalezljivimi boleznimi, olajøala dihanje pri hujøih fiziœnih naporih (alpinizem), izboljøala naj bi prebavo, poveœala pogum in spolno moœ. Pojav sta preganjali tako cerkvena (zaradi praznoverja; uæivanje je bilo tesno povezano z luninim ciklom), kot posvetna sodna oblast zaradi øtevilnih kriminalnih dejanj, kjer so se povzroœitelji izgovarjali na uæivanje arzenovih spojin (22, 24, 25). Kmalu so se pojavili prvi dvomi o uæivanju arzenovih spojin, saj je bil pojav v nasprotju z znanjem na podroœju toksikologije. Veœina kritikov je sumila, da so kmetje uæivali neko relativno netoksiœno substanco (npr. cinkov oksid), vendar so analizni testi vedno potrdili prisotnost arzena v vzorcih. Moæno je tudi, da je bil v vzorcu dejansko prisoten arzen, vendar so bile njegove spojine razredœene z drugimi snovmi. Zadnja moænost je vzpostavitev tolerance, saj so veœkrat zabeleæili, da so imeli kroniœni uæivalci arzenovih spojin po prenehanju jemanja pogosto hude teæave zlasti v gastrointestinalnem traktu, pogosto se je hitra prekinitev jemanja konœala tudi s smrtjo (24, 25). Zanimivo je, da so beli arzenik uporabljale tudi dame na viktorijanskem dvoru, misleœ, da redna uporaba polepøa njihovo polt in obrazne poteze (24). 7 Literatura 1. Haller JS. Therapeutic mule: The use of arsenic in the nineteenth century Materia medica. Pharm Hist 1975; 17: 87-100. 2. Cilliers L, Retief FP. Poisons, poisoning and the drug trade in ancient Rome. Akroterion 2000; 45: 88-100. 3. Miller WH, Schipper HM, Lee JS, et al. Mechanisms of action of arsenic trioxide. Cancer Res 2002; 62: 3893-3903. 4. Mandal BK, Suzuki Kt. Arsenic round the world: a review. Talanta 2002; 56: 201-235. 5. Shen Z, Chen G, Ni J, et al. Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL): II. Clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsed patients. Blood 1997, 89, 3354-3360. 6. Evens AM, Tallman MS, Gartenhaus RB. The potential of arsenic trioxide in the treatment of malignant disease: past, present and future. Leukemia Res 2004, 28, 891-900. 7. Hippocrates. Peri Helkon (On ulcers). 1-17. 8. Weiss L. Early concepts of cancer. Cancer Metastasis Rev 2000, 19, 205-217. 9. Dioscorides P. De Materia medica. V, 121-122. 10. Plinius G. Historia naturalis (Natural history). XXXIV, 55-56. 11. Bechet PE. Arsenic. History of its use in dermatology. Arch Derm Syph 1931, 23, p. 110-117. 12. Avicenna. Canon medicinae. II, 49. 13. Konkola K. More than a coincidance? The arrival of arsenic and the dissapearance of plague in early modern Europe. J Hist Med Allied Sci 1992, 47, 186-209. 14. Lockhart WT, Atkinson JR. Administration of arsenic in syphilis. Can Med Assoc J 1919, 9, 129-135. 15. Antman KH. Introduction: The History of Arsenic Trioxide in Cancer Therapy. Oncologist 2001, 6, 1-2. 248 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 249 -^- Zgodovina uporabe anorganskih arzenovih spojin v terapiji 16. Scheindlin S. The duplicitous nature of inorganic arsenic. Mol Interv 2005, 2, 60-64. 17. Obreza A. Kratka zgodovina homeopatije. V Marinko P: Strokovno posvetovanje ob predstavitvi prvega dopolnila k drugi izdaji Formulariuma Slovenicuma (FS 2.1), Ljubljana 2006, 43-48. 18. Berman A. The Heroic Approach in Nineteenth-Century Therapeutics. Bull Amer Soc Hosp Pharm 1954, 11, 320–327. 19. Haller JS. American medicine in transition. University of Illinois Press, 452 strani, Chicago, 1981, 90-98. 20. Bohinc P. Galenska farmacija (Farmacevtska tehnologija I). 2. izdaja, Zdruæenje øtudentov farmacije, Ljubljana, 1969, 486-488. 21. Tomiå D. Terapijske doze i oblici lijekova. Økolska knjiga, Zagreb, 1961, 44. 22. The Yew York Times: The arsenic eaters. 8. november 1854, 7; Arsenic-eaters. 16. oktober 1875, 4; Arsenic eaters. 26. julij 1885, 9; The arsenic eaters of Styria. 8. september 1889,7. 23. Janeø D, Drlja M. Tudi konji so jedli arzen, mar ne? Farm Vestn 2003, 54, 57. 24. Gontijo B. Arsenic - a historical review. An Bras Dermatol 2005, 80, 91-95. 25. Przygoda G, Feldmann J, Cullen WR. The arsenic eaters of Styria: a different picture of people who were chronically exposed to arsenic. Appl Organometal Chem 2001, 15, 457-462. farm vestn 2008; 59 249 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:31 AM Page 250 -^- Varcevanje za starost pri Kapitalski družbi Kdo pravi, da leta pobirajo davekl üh str, /STO^ o% v^u /i. dol^ -- mti-m 'fivm^h—— —^Nr Z lastnim varcevanjem za starost pri Kapitalski družbi dobite kar dvoje: aktivno starost z lepo rento in možnost uveljavljanja davcne olajšave! Individualne premije so za leto 2008 poleg olajšave za vzdrževane družinske clane sploh edina davcna olajšava* ki jo lahko uveljavljate. Kdo torej pravi, da se investiranje v starost ne splaca? KAPITALSKA DRUŽBA 080 2345 svw w.kapital ska -d ru zba, si FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 251 -^- Zdravila v alternativni medicini Medicinal products in alternative medicine Samo Kreft Povzetek: Alternativna medicina je v zadnjem œasu vse bolj priljubljena za zdravljenje, pa tudi vse bolj priljubljena tema pogovorov od kavarniøkega do akademskega nivoja. V lanskem letu je bil sprejet Zakon o zdravilstvu, ki je dejavnosti dal pravni okvir; prav tako v lanskem letu pa smo na Fakulteti za farmacijo zaœeli z izvajanjem izbirnega predmeta Zdravila v alternativni medicini, tako da smo s tem dejavnosti dali akademsko noto. V prispevku bom naredil kratek pregled celotnega podroœja in opozoril na nekaj manj znanih dejstev. Problematizirati æelim ostro mejo med alternativno in uradno medicino oz. prikazati, da je meja med njima øiroka, nejasna ter da je odvisna od œasa, geografske lege in kulture. Kljuœne besede: zdravilstvo, alternativna medicina, znanstveni dokaz, Abstract: Alternative medicine is becoming more and more popular in therapy, and also as a topic for academic discussions and small talk. Last year a Slovene legislation on alternative medicine was adopted which gave a legal framework to this activity, and the Faculty of pharmacy in Ljubljana introduced a new elective course on “Medicinal products in alternative medicine”, which gave an academic note. This article will give an overview on the area of alternative medicine, including some less known facts. The sharp border between the alternative medicine and official medicine will be questioned and many borderline examples will be presented. Key words: alternative medicine, complementary and alternative medicine, scientific evidence Definicije Alternativna medicina (zdravilstvo) je bila v osnutku zakona o zdravilstvu definirana kot dejavnost, ki jo opravljajo zdravilci za izboljøanje zdravja in kakovosti æivljenja uporabnika storitev, in ne temelji na spoznanjih medicinske vede (1). V konœni sprejeti verziji zakona so iz definicije œrtali »kakovost æivljenja« ter zadnji del stavka: »in ne temelji na spoznanjih medicinske vede« (2). Po definiciji v predlogu zakona je bila meja med medicino in zdravilstvom vsaj teoretiœno jasna in ostra: znanstvena dokazanost. Definicija iz konœne verzije zakona je precej manj jasna. Spraøujem se, ali ta zakon omogoœa, da se nek zdravnik proglasi za zdravilca in se øe naprej ukvarja z uradno medicino (sicer brez koncesije), s tem pa se izogne doloœbam Zakona o zdravniøki sluæbi. Znanstveno dokazanost kot mejo med medicino in zdravilstvom uporabljajo tudi drugi avtorji: • »Medicinske metode so tiste, katerih uœinek je znanstveno dokazan, ostalo je alternativna medicina« • Alternativna medicina ni bila znanstveno preverjena in njeni zagovorniki zanikajo potrebo po takønem testiranju« (3). • »Alternativna medicina so metode, ki se jih ne da testirati, ki odklanjajo testiranje ali veœkrat padejo na testih. Ko metodi dokaæemo uœinkovitost v ustrezno kontroliranih dvojno slepih øtudijah, metoda preneha biti alternativna« (Richard Dawkins (citat po ref. 4)). • »Bistveno za danaønjo medicino je, da temelji na rabi metod, ki so znanstveno preizkuøene ali pa vsaj izhajajo iz znanstveno preverljivih naœel in bioloøkih dejstev« (5). Œe pozorno beremo zgornje definicije, opazimo majhne a pomembne razlike. Razen prve, vse definicije vsebujejo neko mehœalno varovalko, ki omogoœa, da tudi v uradni medicini ni vse znanstveno dokazano. V praksi je »znanstvena« meja øe manj jasna, saj so interpretacije znanstvene dokazanosti razliœne. O tem veœ v naslednjem poglavju. Glede na definirano nedokazanost alternativne medicine je svojevrstni paradoks tudi naslov revije »Evidence-based Complementary and Alternative Medicine”, ki jo izdaja ugledna zaloæba Oxford Journals (6). V izogib teæavam z znanstveno dokazanostjo, nekateri mejo med zdravilstvom in medicino postavljajo bolj umetno, vendar bolj jasno: • »medicina je tisto, kar uœijo na medicinskih fakultetah v ZDA in Veliki Britaniji, vse ostalo je zdravilstvo"(7) • »nekonvencionalna terapija so tisti medicinski posegi ki jih ne pouœujejo na veœini medicinskih fakultet ali niso sploøno dostopna v bolniønicah v ZDA« (8, 9). Tudi ta definicija ima pomanjkljivosti, saj zapostavlja medicinske fakultete v drugih dræavah, pa tudi uœni program na vseh fakultetah ni enak. Po podatkih ankete med 125 medicinskimi fakultetami v ZDA, jih metode alternativne medicine pouœuje kar 64% (10). Med evropskimi Izr. prof. dr. Samo Kreft, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2008; 59 251 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 252 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles medicinskimi fakultetami jih te metode pouœuje 40 %, med drugimi evropskimi fakultetami s podroœja zdravstva pa 72 % (11). Ameriøki dræavni zdravstveni inøtitut (NIH) definira alternativno medicino z besedami: "Nepovezana skupina neortodoksnih postopkov. Te postopke pogosto utemeljujejo na naœin, ki ne ustreza obiœajnim biomedicinskim razlagam". Ameriøka National Library of Medicine pravi, da so to: "neortodoksni sistemi zdravljenja, ki nimajo zadovoljive znanstvene razlage za njihovo uœinkovitost". Ti definiciji sta manj jasni, saj ne povesta, kateri so ortodoksni postopki. Kaj je to znanstveni dokaz Odgovor na to vpraøanje se je skozi zgodovino spreminjal. Stari Grki so si za zgled znanstvenega dokazovanja vzeli matematiko. Dokaz je moral biti popolnoma nedvoumen logiœni sklep (za razliko od danaønje znanosti, ko hipotezo sprejmemo, œe obstaja manj kot 5 % verjetnost, da hipoteza ne dræi). Temelj, iz katerega so izpeljevali znanstveni dokaz so bile »sploøne resnice« (npr.: “vse teæke stvari padajo navzdol”, “vsi ljudje so umrljivi”). Eksperimentiranja in opazovanja niso cenili, ker je opazovanje nezanesljivo, eksperimentiranje pa je lahko zakrilo “notranjo naravo stvari”, ki je predmet raziskovanja. V podobnem duhu je øe René Descartes (1596-1650) gradil sistem znanja, ne da bi upoøteval zaznave, ker so te nezanesljive, in namesto tega prisegal samo na metodo dedukcije (»Mislim torej sem«). V svojem delu Meditationes de Prima Philosophia (1641) je zapisal: »Zakoni Narave, ki se s œasom in prostorom ne spreminjajo vladajo vsem sestavnim delom Narave. Ti zakoni so popolnoma racionalni in jih lahko izpeljemo z logiœnim sklepanjem s pomoœjo jezika matematike. Zato torej ni nobene potrebe, da bi te zakone eksperimentalno preverjali.« Renesanœni znanstveniki, ki so se sreœali s potrebo po eksperimentiranju, so se spopadali s teæavo nezanesljivosti in pristranosti eksperimentov in opazovanj na razliœne, z danaønjega staliøœa prav nenavadne naœine. Galileo Galilei (1564-1642) navaja, da je eksperiment s spuøœanjem kroglic ponovil veœstokrat in vedno se je eksperiment ujemal s teorijo (konkretnih meritev pa ne navaja). Nekateri drugi (npr. Blaise Pascal) so eksperimente izvajali pred uglednimi priœami; eksperiment je bil øe posebno zanesljiv, œe mu je prisostvoval æupan. Blaise Pascal (1623 – 1662) je prvi formuliral znanstveno metodo: Za dokaz znanstvene hipoteze ni dovolj, da se vsa opaæanja skladajo s hipotezo, obratno pa lahko ugotovimo njeno nepravilnost, œe je eno samo opaæanje v nasprotju z njo (pismo Estiennu Noelu, 1648). Pascal je bil tudi eden prvih, ki se je zavedal pomena neodvisne ponovitve eksperimenta. Pri eksperimentih s spreminjanjem zraœnega tlaka z viøino je iz Pariza pisal svojemu zetu v Auverigne in ga prosil, da je po njegovih navodilih ponovil eksperiment. Danes velja, da je znanstveni dokaz eksperiment ali opaæanje, ki je dokumentirano in opisano na tak naœin, da ga lahko drugi znanstveniki ponovijo. Œe se le da, mora biti opazovanje pri znanstvenem dokazu kvantificirano (izmerjeno, preøteto), in izvedeno na najmanj dveh skupinah, ki ju primerjamo (kontrolna skupina). Rezultati morajo biti statistiœno obdelani in verjetnost, da bi se skupini razlikovali le po nakljuœju, mora biti manj kot 5 %. Kaj je to znanstveni dokaz, je torej bolj ali manj jasno. Teæje pa je vpraøanje, koliko in kakøne znanstvene dokaze moramo pridobiti, da neko hipotezo privzamemo oz. zavrnemo. Tukaj znanost oz. stroke namesto enotnega odgovora ponuja mreæo razliœnih doktrin za potrjevanje razliœnih hipotez. Kako potrdimo hipotezo, da neka populacija rastlin predstavlja novo vrsto, ki do sedaj øe ni bila znana? Lahko bi uporabili bioloøko definicijo vrste in bi preverili ali se osebki nove vrste uspeøno plodijo z osebki do sedaj znanih vrst. Tak naœin preverjanja hipoteze pa je dolgotrajen in se v praksi redko uporablja. Kot dokaz zadoøœa opis, po katerih lastnostih se te rastline razlikujejo od najbolj podobnih do sedaj znanih vrst. Obstajajo pisana in nepisana pravila, ki doloœajo, kolikøne morajo biti te razlike in kako morajo biti dokumentirane. V primeru, da po pomoti potrdimo napaœno hipotezo, se to lahko brez økode popravi tudi œez 30 ali veœ let. V primeru potrjevanja varnosti zdravil prav tako obstaja vrsta pravil, ki doloœajo kakøne teste moramo izvesti, kako, v kakønih primerih in na koliko in katerih æivalih (akutna in kroniœna toksiœnost, kancerogenost in genotoksiœnost, in vitro, in vivo, na glodalcih in na ne-glodalcih…) (12). Pravila zagotavljajo kar najveœjo kakovost znanstvenega dokaza. Kljub vestno izvedenim vsem zahtevanim raziskavam, se øe vedno lahko zgodi, da potrdimo hipotezo o varnosti, ki ne dræi in se nevarnost zdravila za specifiœno populacijo lahko pokaæe øele pri redni uporabi (13). Standard za dokazovanje uœinkovitosti zdravil so prospektivne (vnaprej naœrtovane), dvojno slepe, s placebom kontrolirane, randomizirane kliniœne raziskave. Natanœno so na veœ kot 50 straneh te zahteve opisane v pravilih o Dobri kliniœni praksi (14). Zahteve so nekoliko razliœne za razliœna indikacijska podroœja (15). So dvojno slepe raziskave edini dokaz sodobne (z dokazi podprte) medicine? Odgovor na zgornje vpraøanje ni teæak: seveda ne. Na nekaterih podroœjih medicine, tovrstnih øtudij ni mogoœe izvesti ali pa je njihova izvedba zapletena in draga, in v takih primerih se medicina zadovolji z bistveno niæjo ravnijo dokazov. V kirurgiji na primer so le malo kateri posegi utemeljeni s prospektivnimi, randomiziranimi, dvojno slepimi raziskavami. Izvajanje placebo operacij je seveda etiœno sporno, ni pa nesprejemljivo (16). Ena prvih je bila opravljena æe leta 1929 (17). Pomanjkanje drugih tipov prospektivnih randomiziranih raziskav kirurøkih posegov (npr. primerjava dveh vrst posegov) je posledica visoke cene in odsotnosti zainteresiranega financerja. V odsotnosti viøje ravni dokazov, se z dokazi podprta medicina zadovolji z nerandomiziranimi ali celo retrospektivnimi øtudijami (18, 19). Prav tako so redke dvojno slepe, s placebom kontrolirane, randomiziane kliniœne øtudije uœinkovitosti fizioterapevtskih metod, nefarmakoloøkih psihiatriœnih metod, dietetike... Kljub temu nihœe ne zanika, da so vsa ta podroœja del sodobne medicine. 252 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 253 Zdravila v alternativni medicini Znanost in stroka sta za vsak primer posebej doloœili, kakøna vrsta dokaza je potrebna, pri œemer se upoøteva poleg znanstvenih kriterijev tudi moæne posledice napaœno potrjene hipoteze, tehniœna in finanœna izvedljivost ter etiœna naœela (ni sprejemljivo, da bi uœinkovitost zdravila proti raku v kliniœni raziskavi primerjali s placebom). Pojavi pa se vpraøanje, kdo naj doloœa zgoraj omenjene kriterije in kolikøno vlogo pri tem sme imeti denar? Tudi Evropska zakonodaja (20), predvideva veœ moænosti za dokazovanje uœinkovitosti zdravil: »Na sploøno se kliniœna preskuøanja izvajajo kot kontrolirana kliniœna preskuøanja in œe je mogoœe, kot randomizirana, vsak drug naœrt je treba utemeljiti«. Dopuøœa tudi izjemne primere: »vlagatelj lahko prikaæe, da ... obseænih informacij ni mogoœe predloæiti zaradi trenutnega stanja znanstvenih dognanj, ali bi bilo zbiranje tovrstnih informacij v nasprotju s sploøno sprejetimi naœeli medicinske etike«. Dodatna izjema so tradicionalna zdravila: »Dolga tradicija zdravila zmanjøa potrebo po kliniœnih øtudijah, œe je uœinkovitost zdravila verjetna na podlagi dolgoletne uporabe in izkuøenj«. Za homeopatska zdravila velja: »Dokaz o terapevtski uœinkovitosti se ne zahteva za homeopatska zdravila« (20). Moænih je torej veœ razliœnih dokazov, kar pa ne pomeni, da je primeren kar vsak dokaz. Veœkrat se je æe zgodilo, da so izvajalci in zagovorniki alternativne medicine pristali na znanstveno preverjanje svojih metod in si sami naredili program raziskav. Raziskave so bile ne prvi pogled povsem znanstvene, podrobnejøi pregled pa je pokazal, da gre za t.im. »kargo kult znanost«. Kargo kult znanost V antropologiji izraz »kargo kult« oznaœuje skupino verstev, ki so se pojavila na Pacifiøkih otokih po koncu druge svetovne vojne. Med vojno so vojaki na teh otokih postavili letalska oporiøœa in lokalnim prebivalcem, delili hrano, oblaœila in druge izdelke. Domaœini so si razlagali, da so ti izdelki (kargo) boæja darila. Bele ljudi so imeli za boæje posrednike. Po koncu vojne so vojaki odøli in daril za domaœine ni bilo veœ. Domaœini so sklepali, da morajo sedaj bogove sami nekako prepriœati, da bodo øe vedno poøiljali tovor. S tem namenom so oponaøali poœetje belih ljudi. Zgradili so letaliøœem podobne objekte, z nadzornimi stolpi in leseno imitacijo elektronske opreme. Pri verskem obredu so priæigali ognje ob „letaliøki stezi”, domaœin v nadzornem stolpu pa je z lesenimi „sluøalkami” na glavi, v lesen „mikrofon” izrekal molitve. S staliøœa domaœinov, je bil obred povsem enak, kot takrat, ko so ga izvajali belci, vendar letal z boæjimi darovi vseeno ni bilo. Pojem „kargo kult znanost” je leta 1974 uvedel nobelovec za fiziko Richard P. Feynman (21). Z njim je oznaœil raziskave, ki so na prvi pogled prav take, kot morajo biti znanstvene raziskave, pa vendarle njihovi rezultati nimajo znanstvene vrednosti. Za znanstvenike izgleda meja med »kargo kult znanostjo« in pravo znanostjo ponavadi dokaj jasna, kjub temu pa vœasih razlike ni prav enostavno formulirati. Razliœni izrazi Za dejavnost, o kateri je govora v tem œlanku, se uporablja veliko razliœnih izrazov z enakim ali podobnim pomenom. Najveœ se uporablja izraz alternativna medicina, ki se uporablja v dveh pomenih. V øirøem pomenu je to sinonim za zdravilstvo, kot ga definira predlog zakona, v oæjem pomenu pa je alternativna medicina del zdravilstva, ki se po temeljnih principih tako razlikuje od medicine, da se z medicino izkljuœuje. Pacient se ne more vzporedno zdraviti z medicinskimi metodami in z metodami alternativne medicine. Komplementarna medicina je drugi del zdravilstva, ki ga lahko kombiniramo oz. dopolnjujemo z medicinskimi metodami zdravljenja. Poslovenjena verzija tega izraza je dopolnilna medicina. Pri integrativni medicini gre povezovanje med zdravilstvom in medicino øe korak dlje. Zdravnik in zdravilec pri integrativni medicini sodelujeta, ali pa sta celo oba zajeta v isti osebi (npr. pri antropozofski medicini). Tabela 1: Pogostost rabe izrazov s katerimi poimenujemo zdravilstvoa Izraz Google – slovensko Google -angleøka razliœica izraza Nova beseda – Korpus slovenskega jezika zdravilstvo 18.200 b 173 alternativna medicina 304.000 15.400.000 50 komplementarna medicina 1.140 1.140.000 10 dopolnilna medicina 32 c 0 komplementarna in alternativna medicina 406 1.110.000 1 alternativna in komplementarna medicina 44 311.000 3 tradicionalna medicina 23.800 1.300.000 25 ljudska medicina 271 980.000 5 nekonvencionalna medicina 65 2.310 0 a Tabela je bila narejena z iskanjem po Korpusu slovenskega jezika (28) in spletnem iskalniku Google (29) na dan 14.6.2007. Uporabljeni angleøki izrazi so bili: alternative medicine, complementary medicine, complementary and alternative medicine, alternative and complementary medicine, traditional medicine, folk medicine, nonconventional medicine. Pomen posamezne rabe ni bil analiziran. b izraz zdravilstvo nima ustreznega dobesednega prevoda v angleøœino c angleøki izraz je enak kot pri komplementarni medicini farm vestn 2008; 59 253 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 254 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles Uporablja se tudi izraz komplementarna in alternativna medicina (complementary and alternative medicine (CAM)), s œemer se izognemo nejasnosti v zvezi z oæjim in øirøim pomenom izraza alternativna medicina. Nekoliko redkejøa je uporaba iste kombinacije v obratnem vrstnem redu, torej alternativna in komplementarna medicina. V uporabi je tudi izraz nekonvencionalna medicina (v dobesednem prevodu neustaljena, nedogovorjena) ter izraza ljudska medicina in tradicionalna medicina. Slednjega uporablja v nekaterih svojih dokumentih tudi WHO (22), presenetljivo pa ga nekateri uporabljajo v obratnem pomenu, torej kot sinonim za (uradno) medicino (23). Izraz zdravilstvo, za katerega se je odloœil tudi zakonodajalec, je lep kratek star slovenski izraz, ki pa ima prav zaradi dolgoletne rabe v slovenøœini tudi slabosti. Beseda se namreœ uporablja v veœ pomenih, med drugim tudi v pomenu (uradne) medicine (24, 25), ter v slabøalnem pomenu. Prednost tega izraza je, da ne vsebuje besede medicina. Medicina je namreœ veda (26), veda pa je dejavnost, ki si prizadeva metodiœno priti do sistematiœno izpeljanih, urejenih in dokazljivih spoznanj (27). Izraz alternativna medicina, bi bil lahko narobe razumljen, da gre za vrsto medicine. Glede terminologije je precej izviren Zakon o zdravstveni dejavnosti, ki v 59. œlenu uporablja izraz dopolnilne tradicionalne in alternativne oblike diagnostike, zdravljenja in rehabilitacije. Slabøalni izrazi za zdravilstvo so padarstvo, mazaøtvo, ranocelniøtvo in øarlatanstvo. Isti izrazi se uporabljajo tudi kot slabøalni izrazi za nekvalitetno izvedene storitve (uradne) medicine. Razdelitev zdravilstva Zdravilske metode lahko razdelimo glede na naœin s katerim skuøajo vplivati na œloveka. Tak naœin je uporabljen tudi v zakonu o zdravilstvu: • Bioloøko utemeljene metode, kjer se z uporabo æivil, zdravilnih zeliøœ, mikronutrientov prepreœujejo bolezni in zdravi. • Manipulativne metode, kjer se z premikanjem delov telesa prepreœujejo bolezni in zdravi. • Duhovno utemeljene metode, ki krepijo sposobnost duha, da vpliva na delovanje telesa. • Energetsko utemeljene metode so metode vplivanja z biopoljem in delovanjem na biopolje. Zgornja razdelitev temelji na naœinu s katerim med zdravljenjem zdravilec vpliva na telo. Metod, ki so namenjene samo diagnostiki (iridiologija, uporaba nihal) zato ne moremo uvrstiti v nobeno izmed zgoraj naøtetih skupin. Poleg zdravilskih metod, poznamo tudi zdravilske sisteme. Zdravilski sistem je organiziran sistem, ki zajema teoretiœne podlage, izobraæevanje, usposabljanje in izvajanje (npr. tradicionalna kitajska medicina, homeopatija, Ajurveda, naturopatija, Antropozofska medicina). Za farmacevte so najbolj zanimive bioloøko utemeljene metode, pri katerih v telo vnaøamo snovi. Te so npr: • apiterapija - zdravljenje s œebeljimi izdelki (medom, cvetnim prahom, propolisom, voskom, matiœnim mleœkom in œebeljim strupom) • aromaterapija - zdravljenje z vonjavami • cvetno zdravljenje (Bachove kapljice) - zdravljenje z razredœenimi izvleœki rastlin • gemoterapija - uporaba rastlinskih popkov • hrustanec morskega psa - uporaba tega zdravila z zdravljenje raka • kadila (moksa) - • koloidno srebro - • makrobiotika - • megavitaminska (ortomolekularna) terapija - zdravljenje z visokimi odmerki vitaminov • spagirija - uporaba zdruæenih izvleœkov rastlin pripravljenih po veœ postopkih • stradanje (post) - • urinoterapija - zdravljenje z urinom • zeliøœarstvo - uporaba zdravilnih rastlin, ki nimajo dokazane uœinkovitosti Bioloøko utemeljene metode so vkljuœene tudi v mnoge zdravilske sisteme: • ajurveda - tradicionalno indijsko zdravilstvo • antropozofska medicina - • holistiœna medicina - celostni princip zdravljenja • homeopatija - zdravljenje z moœno razredœenimi zdravili • kampo - tradicionalna japonska medicina • naturopatija - izkoriøcanje naravne sposobnosti zdravljenja • øamanizem - sibirska tradicionalna medicina • tradicionalna kitajska medicina - • unani - tradicionalna arabska medicina • Kneipova terapija Nevarnosti pri uporabi zdravilstva Nevarnosti pri uporabi zdravilstva so lahko direktne (strupenost) ali posredne (zamujena terapija). Direktna poøkodba zaradi zdravilskega postopka ali sredstva je lahko npr. poøkodba pri nestrokovni manipulaciji telesa ali zastrupitev z neustrezno izdelanim rastlinskim pripravkom. 254 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 255 Zdravila v alternativni medicini Znan je primer 100 æensk, ki so se v letih 1990 do 1992 zastrupile s Kitajskimi tradicionalnimi rastlinskimi pripravki, ki so vsebovali rastline z aristolohijsko kislino. Pri 70 izmed njih je priølo do popolne odpovedi ledvic (30). Kljub prepovedi rastlin z aristolohijsko kislino, je ta strupena snov øe vedno prisotna kar v 13 % izdelkov Tradicionalne kitajske medicine na evropskem træiøœu (31). Ti izdelki nimajo statusa zdravila in imajo temu primerno neurejen nadzor. Pogoste so tudi namerne ali nenamerne primesi teækih kovin v zdravilskih izdelkih. V nedavni raziskavi so poviøane vrednosti svinca, æivega srebra ali arzena naøli v 20 % ajurvedskih izdelkov (32). Trije izdelki od 70 so vsebovali veœ kot 2 % æivega srebra, kar jasno kaæe, da je bila ta snov namerno dodana. S takimi zdravili prihaja do hudih zastrupitev (33). V zdravilskih pripravkih so naøli celo citostatike (34). V zadnjem letu je priølo do veœjega øtevila poøkodb jeter pri ljudeh ki so uporabljali izdelke blagovne znamke Herbalife (35 - 38). Zaradi zdravljenja pri zdravilcu lahko bolnik odlaøa z obiskom pri zdravniku in s tem zamudi priloænost za pravoœasno medicinsko oskrbo. V tem œasu se lahko bolezen razvije do teæje obvladljive faze. Iz slovenskega prostora je znan primer zdravnice Darje Eržen (ZD Kranj), ki ji obtoænica oœita da je pacientu svetovala pred odhodom v Afriko homeopatske kapljice za zaøœito pred malarijo. Ko je æe obolel za malarijo, pa mu je dala nov homeopatski pripravek in vztrajala pri homeopatiji, œeprav se njegovo stanje ni izboljøalo. Obtoænica ji tako oœita, da je zaradi njenega ravnanja novembra 1996 umrl. Zdravnica je izgubila licenco, marca letos je bila obsojena na osem mesecev pogojne zaporne kazni s preizkusno dobo dveh let (prviœ je bila na enako kazen obsojena æe leta 2002, vendar se je na sodbo pritoæila). Drug znan primer je zdravilka Aiping Wang, ki je v dvorani kina Øiøka v Ljubljani zdravila z metodo shenqi. Leta 1992 so trije izmed njenih pacientov, zaradi njenih seans opustili inzulinsko terapijo sladkorne bolezni. Konœali v bolniønici, kjer so jih komaj reøili. Viøje sodiøœe jo je oprostilo obtoæbe treh kaznivih dejanj posebno hude telesne poøkodbe. Prednosti pri uporabi zdravilstva Fizioloøki in drugi direktni uœinki zdravilstva na telo po definiciji niso dokazani. Nedvomno pa imajo zdravilske metode placebo uœinek. Ta je prisoten, znan in dokazan tudi pri medicinskih metodah zdravljenja, vendar pa je lahko pri zdravilskih metodah øe posebno izrazit. Placebo uœinek je namreœ odvisen od bolnikove volje, samozavesti, vere in zaupanja. Vse to se obiœajno bolj izrazito razvije tekom zdravilskega postopka, pri katerem poteka bolj oseben dialog O tem, kako odnos do bolnika in protokol obravnave bolnika pri zdravilstvu oz. v konvencionalni medicini vpliva na potek zdravljenja, ne moremo ugotavljati s slepimi raziskavami. Lahko pa o tem sklepamo iz primerjav, kot so jo npr. naredili na Inøtitutu za uporabno epistemologijo in medicinsko metodologijo iz Freiburga, in je pokazala, da je imelo pri 1000 bolnikih z akutnimi respiratornimi in uøesnimi infekcijami antropozofsko zdravljenje boljøi izid, z manj zapleti, veœjim zadovoljstvom bolnika in ob manjøi uporabi antibiotikov kot konvencionalni pristop (39). Raziskava res ni bila ne slepa, ne randomizirana (bolniki so se sami odloœali med konvencionalnim in alternativnim zdravljenjem). Pogostost uporabe zdravilstva V ZDA uporablja zdravilstvo 36 % odraslih, œe pa k zdravilstvu øtejemo tudi molitev za zdravje, ga uporablja kar 62 % ljudi (40). Druga raziskava je pokazala, da v enem letu uporablja alternativno medicino 36 % Ameriœanov, vsaj enkrat v æivljenju pa 50 % (ta raziskava vkljuœevala tudi jogo, meditacijo, vse zdravilne rastline in celo Atkinsonovo dieto (41). Odstotek ljudi, ki v posameznem letu uporabi alternativno zdravljenje, so na Danskem ocenili na 10%, 33% na Finskem, 49% v Avstraliji in 15 % v Kanadi (42). Razlike med dræavami so deloma tudi posledica razliœnih definicij. V ZDA pri nekaterih statistikah med zdravilstvo uvrøœajo tudi prehranska dopolnila, med ta pa tudi sodobno fitoterapijo (znanstveno utemeljeno zdravljenje z zdravilnimi rastlinami). Zakljuœek Medicina uporablja za zdravljenje velik spekter metod, ki so vse znanstveno utemeljene, znanstveni dokazi pa so zelo razliœni, od najboljøih, do precej slabøih. Uœinek nekaterih metod (predvsem zdravil) je nedvoumno dokazan z veœ prospektivnimi, dvojno slepimi, s placebom kontroliranimi randomiziranimi kliniœnimi raziskavami; uœinek drugih metod pa je utemeljen le s teoretiœno fizioloøko razlago. Na spodnjem koncu te palete dokazov, se k medicini prilega (oz.se po kvaliteti dokazov z njo deloma prekriva) zdravilstvo. Tudi zdravilstvo je heterogena skupina metod, od takih, pri katerih se uœinek precej jasno nakazuje (vendar po neki subjektivni presoji dokazi øe niso dovolj moœni); preko takih, ki imajo uœinek dokazano enak (moœnemu) placebu; do takih, ki so dokazano økodljive, ali celo namerna prevara. Reference 1. Predlog zakona o zdravilstvu, http://www.mz.gov.si/fileadmin/mz.gov.si/pageuploads/aktualno/ javna_razprava/zakon_o_zdravilstvu/Zakon_o_ zdravilstvu _20.9.2006.pdf 2. Zakon o zdravilstvu, Uradni list RS 94/2007 z dne 16. 10. 2007 (http://www.uradni-list.si/1/ulonline.jsp?urlid= 200794&dhid=92007). 3. Angell M, Kassirer JP. Alternative medicine--the risks of untested and unregulated remedies. N Engl J Med. 1998; 339: 839-41. 4. Wikipedia: Complementary and alternative medicine: http://en.wikipedia.org/wiki/Complementary_and_alternative_ medicine 5. Trontelj J. Staliøœe Dræavne komisije za medicinsko etiko o zdravilstvu. ISIS 1998; øt.4; http://www.mf.uni-lj.si/isis/ isis98-04/html/zakomisijo23.html 6. http://ecam.oxfordjournals.org/ 7. Merriam-Webster online: http://www.m-w.com/dictionary/ alternative+medicine, vpogled 16 April 2007 8. Eisenberg DM, Kessler RC, Foster C, Norlock FE, Calkins DR, Delbanco TL. Unconventional medicine in the United States. Prevalence, costs, and patterns of use. N Engl J Med. 1993; 328: 246-52. 9. Eisenberg DM, Kessler RC, Van Rompay MI, Kaptchuk TJ, Wilkey SA, Appel S, Davis RB. Perceptions about complemen- farm vestn 2008; 59 255 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 256 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles tary therapies relative to conventional therapies among adults who use both: results from a national survey. Ann Intern Med. 2001;135: 344-51. 10. Wetzel MS, Eisenberg DM, Kaptchuk TJ. Courses involving complementary and alternative medicine at US medical schools. JAMA. 1998; 280(9): 784-7. 11. Barberis L, de Toni E, Schiavone M, Zicca A, Ghio R. Unconventional medicine teaching at the Universities of the European Union. J Altern Complement Med. 2001; 7: 337-343. 12. ICH. Safety topics; http://www.ich.org/cache/compo/ 276-254-1.html 13. EMEA: European Medicines Agency recommends withdrawal of marketing authorisations for cough medicines containing clobuti-nol; Doc. Ref. EMEA/480863/2007; London, 18 October 2007. 14. ICH. Guideline For Good Clinical Practice; http://www.ich.org/LOB/media/MEDIA482.pdf 15. EMEA: Note For Guidance On Cllnical Investigation of Medicinal products In The Treatmentof Depression; CPMP/EWP/518/97, Rev. 1; London, 25 April 2002. 16. Hung M. Placebo Surgery Gains Wider Acceptance. N Engl J Med. 2001; 344:710-719. 17. Cobb LA, Thomas GI, Dillard DH, et al: An evaluation of internal mammary artery ligation by a double-blind technic. N Engl J Med 1959; 260: 1115. 18. Transfeldt EE, Mehbod AA. Evidence-based medicine analysis of isthmic spondylolisthesis treatment including reduction versus fusion in situ for high-grade slips. Spine. 2007; 32(19 Suppl): S126-129. 19. Mulpuri K, Perdios A, Reilly CW. Evidence-based medicine analysis of all pedicle screw constructs in adolescent idiopathic scoliosis. Spine. 2007; 32(19 Suppl): S109-114. 20. DIREKTIVA 2001/83/ES EVROPSKEGA PARLAMENTA IN SVETA z dne 6. novembra 2001 o zakoniku Skupnosti o zdravilih za uporabo v humani medicini z amandmaji. 21. Dolenc S. Kargo kult znanost, Kvarkadabra; http://www.kvarkadabra.net/article.php/Kargo-kult-znanost 22. General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional Medicine; WHO Geneva 2000. 23. Horvat M. Nemedicinsko zdravilstvo. ISIS 1997; øt. 10 24. Slovar slovenskega knjiænega jezika: zdravilstvo, DZS 25. Erjavec F. Æivalske podobe. poved 588 v sobesedilu. 26. Slovar slovenskega knjiænega jezika: medicina, DZS 27. Slovar slovenskega knjiænega jezika: veda, DZS 28. Inøtitut za slovenski jezik Frana Ramovøa ZRC SAZU, Laboratorij za korpus slovenskega jezika, http://bos.zrc-sazu.si/s_beseda.html 29. Spletni iskalnik Google, http://www.google.si/ 30. FDA. Letter to Health Professionals Regarding Safety Concerns Related to the Use of Botanical Products Containing Aristolochic Acid; http://www.cfsan.fda.gov/~dms/ds-botl3.html 31. Martena MJ, van der Wielen JC, van de Laak LF, Konings EJ, de Groot HN, Rietjens IM. Enforcement of the ban on aristolochic acids in Chinese traditional herbal preparations on the Dutch market. Anal Bioanal Chem. 2007; 389: 263-275. 32. Saper RB, Kales SN, Paquin J, Burns MJ, Eisenberg DM, Davis RB, Phillips RS. Heavy metal content of ayurvedic herbal medicine products. JAMA. 2004 Dec 15; 292(23):2868-73. 33. Garnier R, Poupon J. Lead poisoning from traditional Indian medicines. Presse Med. 2006; 35(7-8): 1177-80. 34. Au AM, Ko R, Boo FO, Hsu R, Perez G,Yang Z. Screening methods for drugs and heavy metals in Chinese patent medicines. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2000; 65: 112–119. 35. Schoepfer AM, Engel A, Fattinger K, Marbet UA, Criblez D, Reichen J, Zimmermann A, Oneta CM. Herbal does not mean innocuous: ten cases of severe hepatotoxicity associated with dietary supplements from Herbalife products. J Hepatol. 2007; 47: 521-526. 36. Stickel F. Slimming at all costs: Herbalife-induced liver injury. J Hepatol. 2007; 47: 444-446. 37. Elinav E, Pinsker G, Safadi R, Pappo O, Bromberg M, Anis E, Keinan-Boker L, Broide E, Ackerman Z, Kaluski DN, Lev B, Shouval D. Association between consumption of Herbalife nutritional supplements and acute hepatotoxicity. J Hepatol. 2007; 47: 514-520. 38. Duque JM, Ferreiro J, Salgueiro E, Manso G. Hepatotoxicity associated with the consumption of herbal slimming products. Med Clin (Barc). 2007; 128(6): 238-239. 39. Hamre HJ, Fischer M, Heger M, Riley D, Haidvogl M, Baars E, Bristol E, Evans M, Schwarz R, Kiene H. Anthroposophic vs. conventional therapy of acute respiratory and ear infections: a prospective outcomes study. Wien Klin Wochenschr. 2005; 117: 256-68. 40. The Merck Manual online. Complementary and Alternative Medicine (CAM)-Introduction, vpogled 8 junij 2007 41. Barnes, P. M.; Powell-Griner, E.; McFann, K.; Nahin, R. L. Complementary and Alternative Medicine Use Among Adults: United States, 2002, National Center for Health Statistics; http://nccam.nih.gov/news/report.pdf 42. Eisenberg et al . UPORABA ALTERNATIVNE MEDICINE V ZDA JAMA 1998; 280: 1569-1575. 256 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 257 -^- Zdravila v alternativni medicini Fulerenol C60(OH)24 kot potencialna uœinkovina Fullerenol C60(OH)24 as a potential drug Rade Injac, Nina Kocevar, Borut Štrukelj Povzetek: Fulereni predstavljajo relativno novo skupino spojin, za katere je znaœilna sferiœna prostorska ureditev, zgrajeni pa so izkljuœno iz ogljikovih atomov. Od njihovega odkritja leta 1985 intenzivno raziskujejo fizikalne in kemijske lastnosti ter bioloøko uporabnost fulerenov in njihovih derivatov. V in vitro in in vivo modelih so se kot potencialni antioksidanti v bioloøkih sistemih pokazali polihidroksilirani fulerenovi derivati, C60-fulerenoli (C60(OH)n, n = 2-28). V œlanku predstavljamo pregled do sedaj objavljenih raziskav o bioloøki aktivnosti fulerenov s posebnim poudarkom na najbolj prouœenem fulerenolu C60(OH)24. Kljuœne besede: fulereni, fulerenoli, antioksidanti Abstract: Fullerenes are a relatively new group of compounds and represent a class of sphere-shaped molecules made exclusively of carbon atoms. Since their discovery in 1985, many aspects of both fullerene and its analogues have been intensively studied to reveal their physical and chemical reactivity, as well as potential use in biological systems. Both in vitro and in vivo studies have shown that polyhydroxylated fullerene derivatives, fullerenols (C60(OH)n, n = 2-28), can be potential antioxidative agents in biological systems. The article represents a review of published investigations of fullerenes’ biological activities with special emphasis on the most examined fullerenol C60(OH)24. Keywords: fullerene, fullerenols, antioxidants 1 Uvod Fulereni ali klastiœne oblike ogljika so novoodkrita, tretja alotropska modifikacija ogljika. Ime so dobili po arhitektu Buckminsterju Fullerju, ki je pri projektiranju Geodezijskega doma v Montrealu v konstrukcijo kupole ameriøkega paviljona EXPO 1967 vklopil heksagonske in pentagonske strukture (slika 1). Leta 1996 so Robert F. Curl, Harold W. Kroto in Richard E. Smalley prejeli Nobelovo nagrado s podroœja kemije za odkritje in reøitev strukture najbolj znanega predstavnika fulerenov, molekule C60 (1). Vsak fuleren je sestavljen iz 2×(10+M) ogljikovih atomov (M = 0) s konstantnim øtevilom 12 pentagonov. Fuleren C60 ali [5,6]-fuleren-60-Ih ima simetrijo prisekanega ikozaedra z osjo simetrije pete vrste (7). Fuleren C60 je v nasprotju z diamantom in grafitom kemijsko zelo reaktiven (2, 3). Z modifikacijo fulerena C60 so dobili øtevilne vodotopne bioloøko aktivne molekule, med katerimi so se kot najbolj zanimivi v in vitro in in vivo raziskavah pokazali polihidroksilirani fulerenovi derivati, C60-fulerenoli (C60(OH)n, n = 2-28). V dosedanjih raziskavah na kemijskih in bioloøkih modelnih sistemih so pokazali izredno visoko antioksidativno aktivnost (4-6). Zgradbi fulerena C60 in fulerenola C60(OH)24 sta prikazani na sliki 2. Slika 1: Arhitekt Buckminster Fuller, v ozadju kupola za ameriøki paviljon EXPO 1967 v Montrealu Figure 1: Architect Buckminster Fuller and his construction of American pavilion EXPO 1967 in Montreal Rade Injac, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana Nina Koœevar, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana Prof. dr. Borut Øtrukelj, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2008; 59 257 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 258 -^t- Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles Slika 2: Zgradbi fulerena C60 (a) in fulerenola C60(OH)24 (b) Figure 2: Structures of fullerene C60 (a) and fullerenol C60(OH)24 (b) 2 Sinteza fulerenola C60(OH)24 Fulerenol C60(OH)24 sintetiziramo po originalnem postopku (8): C60Br24 + 24NaOH H20 C60(OH)2 + 24 NaBr Œeprav postopek ni preveœ zahteven, je pridobivanje produkta s stopnjo œistote nad 95 odstotkov zelo teæavno. Sinteza poteka v naslednjih korakih: 150 mg C60Br24 zmeøamo s 5 mL 0,1 M raztopine NaOH. Ob sprotnem zniæevanju pH z dodajanjem 0,1 M HCl do pH 4,5 meøamo raztopino 30 minut pri sobni temperaturi. Raztopino nato uparimo do suhega pod zniæanim tlakom pri 40 °C. Reakcijsko zmes spiramo trikrat s 25 mL metanola in dvakrat s 25 mL vodne raztopine etanola (1 : 1; v/v). Na koncu speremo fulerenol s 50 mL preœiøœene vode in nato suøimo pri 50 °C (8). 3 Lastnosti fulerenola C60(OH)24 Fulerenol C60(OH)24 je rjava, amorfna, higroskopna praøkasta spojina. V vodi je zmerno topen (do 10 mg/mL). Stabilen je pri dnevni svetlobi in sobni temperaturi. S kovinskimi ioni tvori rjavo oborino. V kislem je stabilen, v alkalnem pa je prisoten v ionizirani obliki, C60(OH)24-n (ONa)n. Vodna raztopina je rjave barve in ne daje znaœilnih vrhov v UV/VIS spektru. Krivulja termostabilnosti kaæe, da je spojina zelo odporna na visoke temperature (po 24 urah pri 150 °C veœ kot 80 odstotkov spojine ostane nespremenjene). Toœk taliøœa, vreliøœa, vnetljivosti in sublimacije øe niso doloœili, prav tako ne eksplozivnosti in gostote spojine. Obstojeœi podatki o toksiœnih uœinkih obsegajo draæeœe delovanje na oœesno in nosno sluznico, v nekaterih primerih tudi na koæo. Fulerenol C60(OH)24 je zelo lahko vnetljiva spojina, ki reagira z oksidanti, halogeni in kislinami Hidroksilne skupine v molekuli fulerenola C60(OH)24 imajo znaœaj terciarnih alkoholnih skupin (4, 8, 9). Shranjevati ga moramo stran od izvorov kuhinjskega plina, ognja in spojin, ki izkazujejo fizikalno-kemijsko inkopatibilnost (8, 9). Na trgu so trenutno dostopn polihidroksilirani derivati fulerena C60(OH)n z razliœnim deleæem C60(OH)24. Proizvajalci so Nano-C (ZDA), Alfa Aesar (Nemœija) in Mer Corporation (ZDA). 4 Biološko aktivni derivati fulerena Œeprav so agregati fulerena C60 pokazali izjemno toksiœnost v poskusih na œloveøkih celicah, je toksiœnost polihidroksiliranih derivatov izrazito manjøa. Toksiœnost je posledica nastanka superoksidnih radikalov in poslediœne poøkodbe celiœne membrane (9). Kot je prikazano v sistemu reakcij na sliki 3, je nastanek kisikovih radikalov posledica fotoekscitacije molekule C60 (10, 11, 12) Primarno nastaneta singletni kisik in superoksidni anion, ki povzroœita nastanek vodikovega peroksida in hidroperoksilnega radikala. Singletni kisik (1O2) je visokoreaktivna elektrofilna neradikalska molekula in selektivni oksidant. Zaradi velike reaktivnosti ga v atmosferi praktiœno ni, nastaja pa v nekaterih kemijskih reakcijah in fotokemiœno iz tripletnega kisika (3O2). V zelo kratkem œasu (10-6 s) reagira z veœino organskih spojin, ki so v celici: s spojinami, ki imajo z elektroni bogate dvojne vezi in tudi z lahko oksidirajoœimi funkcionalnimi skupinami, kot so v sulfidih (R-S-R), fenolih in anilinih (13). 1O2 povzroœa fragmentacijo verige DNK in ga lahko uporabljamo za oksidativno uniœenje bakterij (11). Onesnaæeni fulerenski derivati imajo citotoksiœni uœinek, predvsem kadar œas tripletnega stanja traja veœ kot 100 µs, kar povzroœi fragmentacijo DNK in poøkodbe celiœne membrane (14). hu singlet triplet radikal anion — HOO 20, 2H+ J30D_ HA Slika 3: Fotoekscitacija molekul C60 (a) in C60(OH)24 (b) ter nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti; SOD – superokisd dismutaza (10, 11, 12) Figure 3: Fotoexcitation of C60 (a) and C60(OH)24 (b) molecules and formation of reactive oxygen species; SOD – superoxide dismutase (10, 11, 12) 258 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 259 -^- Fulerenol C60(OH)24 kot potencialna uœinkovina Ko se fuleren veæe na molekulo DNK v pufrski raztopini, nastanejo agregati. Na podlagi tega lahko domnevamo, da bi z uvedbo ustreznih funkcionalnih skupin v molekulo fulerena dobili strukture, ki bi lahko vplivale na DNK znotraj celice, kar nakazuje na potencialno uporabo derivatov v genskem zdravljenju (15). Pri vezavi polarnih skupin (-OH, -NH2, -NHR, -COOH, -OCCOR, -NHCOR itd.) na molekulo fulerena dobimo derivate, ki so v vodi bolj topni kot lipofilna molekula C60 (8). Fulerenoli, polihidroksilirani derivati fulerena (C60(OH)n), so se pokazali kot odliœne spojine za odstranjevanje radikalov. Antioksidativno aktivnost fulerenola C60(OH)24 so potrdili na kemijskem modelnem sistemu. Predpostavljeni mehanizmi delovanja vkljuœujejo inaktivacijo hidroksilnega (OH•) in superoksidnega radikala (O2•-) ter duøikovega oksida (NO•) (16, 17). C3-karboksifulereni (tris in bis derivati; slika 4) imajo antioksidativno vlogo v dopaminergiœnih delih moæganov, kjer pride v patoloøkih razmerah do nastanka oksidativnega stresa zaradi poveœane koncentracije ionov æeleza. S tem se odpirajo moænosti za uporabo vodotopnih derivatov fulerena v zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni, kot sta Parkinsonova in Alzheimerjeva bolezen. Potrdili so, da lahko z injiciranjem C3-karboksifulerena zmanjøamo poøkodbe, ki nastanejo na dopaminskih receptorjih po vnosu æeleza v intrastrialni del bazalnih ganglijev. Visok deleæ ionov æeleza v bazalnih ganglijih je vzrok za oksidativne poøkodbe pri Parkinsonovi bolezni (19). Slika 4: Zgradba karboksifulerena s parnimi karboksilnimi skupinami na povrøini C60. Izomera prikazujeta C3 in D3 simetrijo (18). Figure 4: Structure of carboxyfullerene with the paired carboxyl groups on the C60 sphere. The two isomers shown are in C3 and D3 symmetry. C3-karboksifulereni imajo zaøœitne uœinke na periferne krvne mononuklearne celice. Z delnim vgrajevanjem v membrano mitohondrijev lahko prepreœijo celiœno smrt, ki naj bi bila posledica vpliva 2-deoksi-D-riboze, dejavnika tumorske nekroze TNF-a in cikloheksimida (20). Inhibitorni vpliv fulerenovega derivata dimalonske kisline na relaksacijo aorte poskusnega kunca, ki je posledica vazodilatornega uœinka duøikovega oksida, lahko pojasnimo z nastajanjem superoksida in poslediœno nevtralizacijo duøikovega oksida s superoksidnim anionom. Ob prisotnosti encima superoksid- dizmutaze je ta uœinek prikrit. Enak uœinek so opisali pri derivatih monomalonske kisline (21). Poleg tega so C3-karboskifulereni dobri blokatorji virusne replikacije vplivajo pa tudi na vzdræevanje ionske homeostaze v celicah (22, 23). Mehanizem antioksidativnega uœinka fulerenola temelji na katalitiœnem vplivu v zakljuœni stopnji radikalskih reakcij oziroma na radikalsko-adicijskih reakcijah hidroksilnega radikala na dvojne vezi fulerenola, pri œemer nastanejo derivati C60(OH)n (n > 24). 5 Biološka aktivnost C6Q(OH)24 V molekuli fulerenola C60(OH)24 so najbolj reaktivne dvojne vezi, ki povezujejo posamezne pentagonske strukture. Reaktivni radikali, ki so prisotni v bioloøkem sistemu, se po vnosu fulerenola veæejo na njegovo povrøino, vendar ta vezava ni kovalentna (8). Interakcija med hidroksilnim radikalom in fulerenolom temelji na radikalski adiciji hidroksilnega radikala (OH•)2n na olefinske dvojne vezi fulerenolovega ogrodja do proizvoda C60(OH)24 + (OH•)2n (n = 1-12). Drugi moæni mehanizem je, da fulerenol odda svoj vodik radikalu OH•, pri tem pa nastane stabilni radikal C60(OH)23O• (24). Natrijev nitroprusid je donor duøikovega oksida (NO), ki ga fulerenol C60(OH)24 zelo uspeøno lovi. Raztopina natrijevega nitroprusida odpuøœa NO pod vplivom vidne svetlobe pri sobni temperaturi ali v temi pri temperaturi 34 °C, kar je podobno razmeram v bioloøkem sistemu. Uœinkovitost fulerenola kot lovilca NO lahko sledimo preko nitritov, ki nastanejo z oksidacijo NO. Redukcija nitrita v raztopinah je odvisna od odmerka C60(OH)24 (25) Na miøjem gladkomiøiœnem tkivu so naredili primerjalno analizo antioksidativnih uœinkov fulerenola in vitamina C. Fulerenol je na dveh celiœnih linijah izkazoval veœjo uœinkovitost kot vitamin C (26). Na miøih so doloœili tudi akutno toksiœnost fulerenola po intraperitonealnem vnosu, in sicer znaøa LD50 1,2 g/kg (27). V in vitro raziskavah s œloveøkimi in z æivalskimi celicami razliœnih linij (eritrolevkemije, Burkitovega limfoma, adenokarcinoma dojk, fibroblasta pri miøih, nefrona hrœka) so ugotovili antiproliferativno aktivnost fulerenola C60(OH)24. Molekula fulerenola v nanomolskih koncentracijah v prvih 48 urah inhibira rast vseh naøtetih tumorskih celiœnih linij, razen linije Burkitovega limfoma. Inhibicija te vrste je zelo nizka. Inhibicija rasti je reverzibilna, saj so celice po 48 urah rasti v mediju primerljive s kontrolnimi vzorci (28). Æelezo iz sistema Fe2+/askorbat spodbudi lipidno peroksidacijo v spermatozoidih sesalcev in pri tem poøkoduje nanasiœene maøœobne kisline v membrani, kar povzroœi nastanek oksidativnega stresa v epididimisu in testisih ter nastanek neplodnosti. Indijska strokovna skupina Murugana in sodelavcev je prva potrdila, da fulerenol C60(OH)n (predvsem C60(OH)18) prepreœuje z æelezom induciran oksidativni stres. V raziskavah so uporabljali spermo koze (in vitro), kar je prvi znanstevni podatek o vplivu fulerenola na reproduktivna tkiva (29). V raziskavi na celicah œloveøke eritrolevkemije K-562, obdelanih s fulerenolom C60(OH)24 so prouœevali sposobnost sinteze DNK, mitotsko aktivnost in celiœni cikel. Sintezno in mitotsko fazo celiœenega cikla so ocenili na podlagi mitotskega in proliferacijskega indeksa. farm vestn 2008; 59 259 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 260 -^- Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles Preglednica 1 Tkivo Dnevi po obsevanju Aplikacija (mg/kg i.p.) Brez DVDVDV F (100) A (300) Tanko œrevo 7 28 331111 552142 Vranica 7 28 331122 553254 Jetra 7 28 332211 553423 Ledvice 7 28 332211 453322 Srce 7 28 331100 442311 Pljuœa 7 28 321122 542243 Preglednica 1: Vpliv fulerenola (F) in amifostina (A) na degenerativne (D) in vaskularne (V) poøkodbe tkiva pri podganah, izpostavljenih rentgenskemu sevanju (7 Gy). Degenerativne spremembe: 0 ni poøkodbe; 1 posamezne celice z granulami v citoplazmi, normalno jedro, rahlo poveœane; 2 >50 % celic z redkimi vakuolami v citoplazmi in nukleoplazmi; 3 vse celice s øtevilnimi vakuolami v citoplazmi in nukleoplazmi, piknotiœno jedro; 4 plazmaliza in karioliza, infiltracija polimorfonuklearnih celic, fagocitoza mrtvih celic; 5 aktivacija in proliferacija fibroblastov, nastanek vezivnega tkiva. Vaskularne spremembe: 0 ni poøkodbe, 1 blaga dilatacija, ni sprememb v æilni steni; 2 izrazita dilatacija, staza, hiperemija, edem; 3 transmuralno pretrganje do 50 % æil, kopiœenje polimorfonuklearnih celic; 4 popolna izguba bazalne membrane in endotelija pri >50 % æil; 5 huda krvavitev. Table 1: Influence of fullerenol (F) and amifostine (A) on tissue damage score for degenerative (D) and vascular (V) changes in X-irradiated rats (7 Gy). Degenerative changes: 0 no damage; 1 single cells with small cytoplasmatic granules, normal nucleus, slightly enlarged; 2 >50% cells with mild vacuolisation of cytoplasm and nucleoplasm; 3 All cells with pronounced vacoulisation of cytoplasm and nucleoplasm, pycnotic nucleus; 4 plasmalysis and caryolysis, infiltration of polymorphonuclear cells, phagocytosis of dead cells; 5 activation and proliferation of fibroblasts, production of connective tissue. Vascular changes: 0 no damage; 1 mild dilatation, no changes in blood vessel wall; 2 strong vasodilatation, stasis, hyperaemia, oedema; 3 transmural rupture of up to 50% of blood vessels, accumulation of polymorphonuclear cells; 4 complete loss of the basal membrane and endothelium of >50% blood vessels; 5 strong haemorrhage. Mitotski indeks celic, obdelanih s fulerenolom, je manjøi kot pri kontrolnih celicah. Ta rezultat potrjuje prejønje hipoteze, da C60(OH)24 inhibira nastanek delitvenega vretena in mikrotubulov, in sicer ne glede na œas inkubacije celic s fulerenolom. Mitotski indeks (MI) ocenjujemo na osnovi razmerja: MI = [øtevilo celic v mitozi] / [skupno øtevilo celic] Molekula C60(OH)24 torej spreminja celiœni cikel celic K-562, saj vpliva na sintezno in mitotsko fazo cikla. C60(OH)24 ima veœjo citostatiœno kot pa citotoksiœno aktivnost na celiœni liniji humane eritrolevkemije K-562, kar potrjuje tudi visoka stopnja preæivelih celic, ki so bile obdelane s fulerenolom (30). Fulerenol v in vitro razmerah na œloveøkih limfocitih periferne krvi ni pokazal genotoksiœnosti v razponu koncentracij od 1 do 103 mg/mL (31). V preliminarnih in vivo raziskavah na miøih je pokazal zadovoljivo radioprotekcijo v odmerku 100 mg/kg, danem intraperitonealno 30 minut pred obsevanjem (31). Opravljena je bila tudi raziskava na podganah, v kateri so primerjali uœinkovitost radioprotekcije fulerenola (100 mg/kg) z uœinkovitostjo klasiœnega radioprotektiva amifostina (300 mg/kg), ki so ju injicirali intraperitonealno 30 minut pred obsevanjem (32). Rezultate histopatoloøke analize tkiv razliœnih organov (pljuœ, srca, jeter, ledvic, tankega œrevesa in vranice) prikazuje preglednica 1. 6 Fulerenol C60(OH)24 kot potencialni kardioprotektiv pri zdravljenju malignih neoplazem z doksorubicinom Doksorubicin je antraciklinski antibiotik z zelo øiroko uporabo v onkologiji, saj izkazuje øirok spekter protitumorske aktivnosti. Najpomembnejøe indikacije za njegovo uporabo so limfomi, akutne levkemije in solidni tumorji, kot so karcinom dojke, drobnoceliœni pljuœni karcinom, karcinomi seœnega mehurja, øœitnice in æelodca, sarkomi mehkih tkiv in osteogeni sarkomi, nevroblastomi in Wilmsov tumor (33). Vendar pa njegovo uœinkovitost omejujejo mielosupresija in okvare gastrointestinalnega trakta, zlasti pa kardiotoksiœnost. Ta je odvisna od odmerka in je kumulativna, pojavi pa se lahko v akutni, 260 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 261 -^- Fulerenol C60(OH)24 kot potencialna uœinkovina subakutni ali kroniœni obliki (34, 35). Kardiotoksiœnost doksorubicina je ireverzibilna in rezistentna na zdravljenje. Zmanjøanje odmerka doksorubicina izboljøa prenaøanje zdravila, vendar pa znaœilno zmanjøa njegovo protitumorsko aktivnost. Zaradi tega bi odkritje uœinkovitega in dobro prenosljivega kardioprotektiva pomenilo pomemben premik v zdravljenju onkoloøkih bolnikov, pri katerih je indicirana uporaba doksorubicina. Na podlagi znanih kardioprotektivnih lastnosti fulerenola v in vitro sistemih potekajo intenzivne predkliniœne raziskave, s katerimi poskuøamo ugotoviti, ali ima fulerenol potencial pri zaøœiti pred kardiotoksiœnostjo doksorubicina, ali je ta uœinek odvisen od odmerka in ali bolniki sam fulerenol v uporabljenih odmerkih dobro prenaøajo. Poleg tega prouœevanje antioksidativnih mehanizamov fulerenola in vivo prispeva k boljøemu poznavanju njegovega farmakoloøkega profila, o œemer zaenkrat obstaja zelo malo znanstvenih podatkov. Objavljeni rezultati kaæejo vpliv samega fulerenola C60(OH)24 in fulerenola, injiciranega 30 minut pred doksorubicinom (8 mg/kg; i.v.), na utrip in tkivo miokarda pri zdravih podganah Wistar (obeh spolov, mase 180-250 g). V poskusu so bile æivali razdeljene v øest skupin: kontrolno, obdelano z doksorubicinom (I), obdelano s fulerenolom (50 mg/kg) in z doksorubicinom (II), obdelano s fulerenolom (100 mg/kg) in z doksurubicinom (III), obdelano s fulerenolom (200 mg/kg) in z doksurubicinom (IV) ter obdelano samo s fulerenolom (100 mg/kg) (V) (36). Kot prikazujejo rezultati na sliki 5, doksorubicin po sedmih dneh izrazito poveœa œas do nastanka refleksne bradikardije. Te toksiœne spremembe na miokardu pa se znaœilno zmanjøajo po injiciranju fulerenola C60(OH)24. Slika 5: Vpliv fulerenola na z doksorubicinom inducirane spremembe v kardiovaskularnem refleksu med infuzijo adrenalina pri podganah Figure 5: Influence of fullerenol on doxorubicin-induced changes in cardiovascular reflex during adrenalin infusion in rats Kardioprotektivne lastnosti fulerenola smo prouœevali tudi v raziskavi na Sprague-Dawleyevih podganah z malignimi neoplazmami, kjer smo doloœali uœinke na aktivnost serumskih encimov (kreatin-kinaze, laktat-dehidrogenaze a-hidroksibutirat-dehidrogenaze), pokazatelje oksidativnega stresa v srcu (malondialdehida, glutationa, glutation disulfida, glutation-peroksidaze, superoksid-dizmutaze, katalaze, glutation-reduktaze in celotni antioksidativni status) ter patohistoloøke spremembe srœnega tkiva (37). Doksorubicin je tudi v tem primeru povzroœil moœne oksidativne poøkodbe tkiva, ki so se izrazile v znaœilno poviøanih vrednostih encimov. Po intraperitonealnem vnosu fulerenola, injiciranega 30 minut pred doksorubicinom, pa so vrednosti ostale primerljive s kontrolno skupino. 7 Sklep Fulerenoli so v kemijskih in bioloøkih modelnih sistemih v dosedanjih raziskavah pokazali izredno visoko antioksidativno aktivnost. Preventivna uporaba fulerenola C60(OH)24 bi lahko pomembno zmanjøala kardiotoksiœne in hepatotoksiœne uœinke doksorubicina pri zdravljenju malignih tumorjev. Poleg tega se kaæe potencialna uporaba fulerenola in drugih derivatov fulerena tudi na podroœju nevrodegenerativnih bolezni (Parkinsonove in Alzheimerjeve) in bolezni na reproduktivnih tkivih, obetavne pa so tudi njegove citostatiœne in radioprotektivne lastnosti. 8 Literatura 1. Kroto H, Health J, O’Brien S et al. C60: Buckminsterfullerene. Nature 1985; 318: 162-163. 2. Hirsch A. The Chemistry of the Fullerenes. New York: Wiley; 1993. 3. Dresselhaus MS, Dresselhaus G, Eklund PC. Science of Fullerenes and Carbon Nanotubes. San Diego: Academic Press; 1996: 292-325. 4. Chaing LY, Lu FJ, Lin JT. Free radical scavenging activity of water soluble fullerenols. J Chem Soc Chem Commun 1995; 24 (12): 1283-1284. 5. Dugan LL, Gabrielsen JK, Yu SP et al. Buckminsterfullerenol Free Radical Scavengers reduse Exitotoxic and Apoptotic Death of Cultured Cortical Neurons. Neurobiol Dis 1996; 3 (2): 129-135. 6. Tagmatarchis N, Shinohara H. Fullerenes in Medicanal Chemistry and their Biological Applications. Mini-Rev Med Chem 2001; 1 (4): 339-348. 7. Kroto HW, Alaff W, Balm SP. C60: Buckminsterfullerene. Chem Rev 1991; 91 (6): 1213-1235. 8. Djordjeviå A. Biological Active Derivatives of fullerene C60, Zaduæbina Andrejeviå, Beograd, 2002. 9. Sayes CM, Fortner DJ, Guo W et al. The differential cytotoxicity of water-soluble fullerenes. Nano Lett 2004; 4 (10): 1881-1887. 10. Foote CS. . Top Curr Chem 1997; 169: 347-363. 11. Pickering KD, Wiesner MR. Fullerol-Sensitized Production of ROS in Aqueous Solution. Environ Sci Technol 2005; 39 (5): 1359-1365. 12. Lee J, Fortner JD, Hughes JB et al. Photochemical production of reactive oxygen species by C60 in the aqueous phase during UV irradiation. Environ Sci Technol 2007; 41 (7): 2529-2535. 13. Halliwell B, Gutteridge JMC. The chemistry of free radicals and related „reactive species“. In: Free radicals in Biology and Medicine, 3. izdaja, Oxford University Press: Oxford 1999, 36-104. 14. Irie K, Nakamura Y, Ohigashi H et al. Photocytotoxicity of water-soluble fullerene derivatives. Biosci Biotec Bioch 1996; 60 (8): 1359-1361. farm vestn 2008; 59 261 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 262 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles 15. Culver KW, Blaese RM. Gene therapy for adenosine deaminase deficiency and malignant solid tumors. In: Wolff JA. Gene Therapeutics, Birkhäuser: Boston 1994, 263-280. 16. Mirkov S, Djordjevic A, Andric N et al. Nitric oxide-scavenging activity of polihydroxilated fullerenol, C60(OH)24. Nitric Oxide-Biol Ch 2004; 11 (2): 201-207. 17. Djordjevic A, Canadanovic-Brunet J, Vojinovic-Miloradov M et al. Antioxidant properties and hypothetical radical mechanism of fullerol C60(OH)24. Oxi Comm 2005; 27 (1): 213-218. 18. Fumelli C, Marconi A, Salvioli S et. al. Carboxyfullerenes protect human keratinocytes from ultraviolet-B-induced apoptosis. J Invest Dermatol 2000; 115 (5): 835-841. 19. Lin AM, Chyi BY, Wang SD et al. Carboxyfullerene prevents iron-induced oxidative stress in rat brain. J Neurochem 1999; 72 (4): 1634-1640. 20. Monti D, Moretti L, Salvioli S et al. C60 Carboxyfullerene Exerts a Protective Activity against Oxydative Stress-Induced Apoptosis in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Biochem Biophys Research Comm 2000; 277 (3): 711-717. 21. Sato M, Matsuo K, Kiriya H et al. Inhibitory effects of of fullerene derivative, dimalonic acid C60, in nitric oxide-induced relaxation of rabbit aorta. Eur J Pharm 1997; 327 (2-3): 175-181. 22. Kostelnikova RA, Kostelnikov IA, Bogdanov GN et al. Membranotropic properties of the water soluble amino acid and peptide derivatives of fullerene C60. FEBS Lett 1996; 389 (2): 111-114. 23. Friedman SH, DeCamp DL, Sijbesma RP et al. Inhibition of HIVp by fullerene derivatives: Model building studies and experimental verification. J Am Chem Soc 1993; 115 (15): 6506-6509. 24. Djordjevic A, Bogdanovic G, Dobric S. Fullerenes in Biomedicine. J BUON 2006; 11 (4): 391-404. 25. Mirkov S. Magistrska teza. Medicinska fakulteta. Novi Sad 2001. 26. Lu LH, Lee YT, Chen CW et al. The possible mechanisms of the antiproliferative effect of fullerenol, polyhydroxylated C60, on vascular smooth muscle cells. Brit J Pharmacol 1998; 123 (6): 1097-1102. 27. Ueng TH, Kang JJ, Wang HW et al. Suppression of microsomal cytochrome P450-dependent monooxygenases and mitochondrial oxidative phosphorylation by fullerenol, a polyhydroxylated fullerene C60. Toxicol Lett 1997; 19 (1): 29-37. 28. Bogdanoviå G, Vojinoviå-Miloradov M, Kojiå V et al. World Congress of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences ’99, 59th International Congress of FIP, Barcelona, Spain 1999. Abstract book P-081, 55. 29. Murugan MA, Gangadharan B, Mathur PP. Antioxidative effect of fullerenol on goat epididymal spermatozoa. Asian J Androl 2002; 4 (2): 149-152. 30. Jakimov D, Bogdanoviå G, Baltiå M et al. Water-soluble fullerene C60(OH)24 modulates growth and proliferation of K562 human erythroleukemia cell line. Advances in Simulation, Systems Theory and Systems Engineering, Skiatos, Greece, 2002. Abstract and manuscript book pp. 117-122. 31. Trajkoviå S, Dobriå S, Djordjeviå A et al. Radioprotective efficiency of fullerenol in irradiation mice. Mater Sci Forum 2005; 494: 549-553. 32. Trajkoviå S, Dobriå S, Jaœeviå V et al. Tissue-protective effects of fullerenol C60(OH)24 and amifostine in irradiated rats. Colloids Surf B Biointerfaces 2007; 58 (1): 39-43. 33. De Vita TV, Hellman JRS, Rosenberg AS. Cancer principles and practice of oncology, Philadelphia: Lippincott-Raven 1997: 375-512. 34. Abraham R, Basser RL, Green MD. A risk-benefit assessment of antracycline antibiotics in antineoplastics therapy. Drug Saf 1996; 15 (6): 406-429. 35. Hoeckman K, Van der Vijgh WJF, Vermorker JB. Clinical and predclinical modulation of chemotherapy-induced toxicity in patients with cancer. Drugs 1999; 50: 133-156. 36. Djordjeviå-Miliå V, Djordjeviå A, Dobriå S et al. Influence of fullerenol C60(OH)24 on doxorubicin induced cardiotoxicity in rats. Mater Sci Forum 2006; 518: 525-529. 37. Injac R, Perøe , Boskovic M et al. Cardioprotective Effects of Fullerenol C60OH24 on a Single Dose Doxorubicin-induced Cardiotoxicity in Rats With Malignant Neoplasm. Technol Cancer Res Treat 2008; 7 (1): 15-26. 262 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 263 -^- Fulerenol C60(OH)24 kot potencialna uœinkovina Samo(mikro)emulgirajoœi sistemi -alter nativen pristop za izboljøanje bioloøke uporabnosti lipofilnih uœinkovin Self(micro)emulsifying systems - alternative approach for improving bioavailability of lipophilic drugs Alenka Zvonar, Mirjana Gašperlin, Julijana Kristl Povzetek: Po novejøih ocenah je skoraj 40 % potencialnih novih uœinkovin izloœenih iz nadaljnjega razvoja zaradi slabih biofarmacevtskih lastnosti. Pri reøevanju tega problema se posluæujemo tudi mikro- in nanotehnologije ter vgradnje teh uœinkovin v lipidne nosilne sisteme z namenom izboljøanja njihove vodotopnosti. V zadnjih letih tudi zaradi enostavne proizvodnje veliko pozornosti posveœamo samo(mikro)emulgirajoœim sistemom (S(M)ES), ki so po definiciji izotropne zmesi lipidov, povrøinsko aktivne snovi (PAS), enega ali veœ hidrofilnih topil ali koemulgatorjev in uœinkovine, ki v stiku z vodnim medijem ob rahlem meøanju hitro in spontano tvorijo (mikro)emulzije tipa O/V. Ker je proces samoemulgiranja specifiœen za toœno doloœene kombinacije in razmerje med lipidom in PAS ter koncentracijo PAS, je mogoœe docela izkoristiti prednosti S(M)ES le ob premiøljenem izboru posameznih sestavin sistema ter poznavanju njihovega vpliva na njegove biofarmacevtske lastnosti. V tem œlanku so predstavljene posamezne sestavine S(M)ES, njegova usoda po peroralnem vnosu ter moæni vplivi dostavnega sistema na absorpcijo vgrajenih uœinkovin. Kljuœne besede: Samo(mikro)emulgirajoœi sistemi, mikroemulzije, bioloøka uporabnost, lipofilne uœinkovine Abstract: According to recent estimates, nearly 40 % of new active pharmaceutical substances are rejected from research and development due to poor biopharmaceutical properties. A novel approach to encounter this problem are micro- and nanotechnology, together with incorporation of this substances in lipid based drug delivery systems to improve the solubility of those drugs. Due to ease of production there has been an increased interest in self(micro)emulsifying systems (S(M)ES) in recent years. According to the definition they are isotropic mixtures of oil, a surfactant, and possibly one or more hydrophilic solvents or co-surfactants, which form fine oil-in-water (micro)emulsions spontaneously when exposed to aqueous media under gentle agitation. The self-emulsification process is specific to the oil/surfactant pair, the surfactant concentration and oil/surfactant ratio, thus the advantages of S(M)ES could only be taken entirely if its components are selected thoughtfuly and their influence on biopharmaceutical properties of the system is taken into concern. The present article rewievs the composition of S(M)ES, its behaviour after oral application and the possible influence on the absorption of incorporated drugs. Key words: Self-(micro)emulsifying systems, microemulsions, bioavailability, lipophilic drugs. 1 Uvod Razvoj uœinkovitih peroralnih farmacevtskih oblik je kljuœen za træen uspeh novih zdravilnih uœinkovin, saj je predvsem pri kroniœnih obolenjih peroralno zdravljenje øe vedno najbolj priljubljeno. Farmacevtska industrija se v zadnjih letih sooœa z odkritjem novih slabo vodotopnih zdravilnih uœinkovin z dobro permeabilnostjo, ki jih po biofarmacevtskem klasifikacijskem sistemu uvrøœamo med uœinkovine razreda II [1]. Vnos slednjih v obliki klasiœnih trdnih farmacevtskih oblik je pogosto povezan z nizko in/ali visoko variabilno bioloøko uporabnostjo (BU), ki jo reøujejo na razliœne naœine. Topnost uœinkovine v prebavnem traktu lahko poveœamo z njeno kemijsko in fizikalno spremembo ali razvojem ustrezne farmacevtske oblike. Œe se osredotoœimo na slednjo, je eden izmed pristopov za peroralno uporabo slabo vodotopnih uœinkovin priprava uœinkovine v raztopljeni obliki ter polnjenje v kapsule. S tem se izognemo fazi raztapljanja uœinkovin v prebavnem traktu, ki v veliki meri prispeva k neustrezni BU uœinkovin razreda II. Ob tem se moramo zavedati, da lahko pride po dispergiranju v prebavnem traktu predvsem pri uporabi hidrofilnih topil tudi do obarjanja predhodno raztopljenih uœinkovin. Iskanje vedno boljøih reøitev je vodilo do lipidnih nosilnih sistemov, pri katerih je verjetnost obarjanja manjøa, saj uœinkovine z ustreznim porazdelitvenim koeficientom veœinoma ostanejo raztopljene v lipidnih kapljicah tudi po dispergiranju sistema v vodnem mediju prebavnega trakta [2]. BU nekaterih uœinkovin lahko torej izboljøamo z vgradnjo le- Alenka Zvonar, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana prof. dr. Mirjana Gaøperlin, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2008; 59 263 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 264 -^- Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles teh v lipidne nosilne sisteme, med katere uvrøœamo tudi klasiœne makro-, mikro- in nanoemulzije . V prednosti so zlasti slednje, saj so termodinamsko stabilne, izkazujejo dobre solubilizacijske sposobnosti in pospeøujejo absorpcijo øtevilnih uœinkovin [3]. Ker pa vsebujejo vodo, je njihovo polnjenje v æelatinske ali druge hidrofilne kapsule teæavno oz. nemogoœe. Temu problemu se lahko izognemo z brezvodnimi S(M)ES, za katere je znaœilno, da tvorijo (mikro)emulzijo pri fizioloøkih pogojih in situ æe pod vplivom peristaltiœnega gibanja æelodca in œrevesja [4]. 2 Samo(mikro)emulgirajoœi sistemi Zanimanje za lipidne dostavne sisteme se je moœno poveœalo po komercialnem uspehu zdravil Sandimmune NeoralTM®–a (ciklosporin A), Fortovase®-a (sakvinavir), Norvir®-a (ritonavir) in Agenerase®-a (amprenavir). Veliko pozornosti namenjajo S(M)ES, ki so po definiciji izotropne zmesi lipidov, PAS, enega ali veœ hidrofilnih topil ali koemulgatorjev in uœinkovine, ki v stiku z vodnim medijem ob rahlem meøanju hitro in spontano tvorijo (mikro)emulzije tipa O/V [1]. Medtem ko nastanejo iz samoemulgirajoœih sistemov po redœenju emulzije z velikostjo kapljic med 100 in 300 nm, je velikost kapljic mikroemulzij, ki nastanejo iz SMES, manjøa od 100 oz 50 nm, porazdelitev njihove velikosti pa ozka [5]. V S(M)ES vgrajena uœinkovina po vnosu hitro zapusti æelodec in se v obliki drobnih kapljic porazdeli po prebavnem traktu. Uœinkovina je v nastali emulziji raztopljena, zato se izognemo procesu raztapljanja, katerega hitrost je omejujoœi dejavnik za absorpcijo uœinkovin razreda 2 [6]. S(M)ES naj bi imeli kar nekaj prednosti pred lipidnimi raztopinami. Na primeru ciklosporina so ugotovili, da daje sistem s PAS enakomernejøo ter ponovljivejøo BU [7]. Z vgradnjo v S(M)ES so izboljøali BU tudi L-365-260, WIN 54954, Ro 15-0778, ontazolasta, halofantrina, danazola, simvastatina, karvediola, itrakonazola, paklitaksela in silimarina [8-13]. 2.1. Sestava S(M)ES Proces samo(mikro)emulgiranja je specifiœen za toœno doloœene kombinacije in razmerje med lipidi in PAS ter koncentracijo PAS, zato imajo le sistemi s toœno doloœeno vsebnostjo osnovnih sestavin zadovoljiv samo(mikro)emulgirajoœi uœinek [5]. Naœrtovanje mikroemulzij oz. S(M)ES tako zajema izbor ustrezne kombinacije oljne in vodne faze, ki se morata zadovoljivo meøati z zmesjo PAS in pomoæne PAS. Zaradi œim boljøe fizioloøke sprejemljivosti je zaæeljeno, da je koncentracija PAS v sistemu œim niæja. Pri izbiri ustrezne PAS je zato bistvenega pomembna njena sposobnost, da æe pri œim niæjih koncentracijah ustrezno zniæa medfazno napetost in tako omogoœi nastanek mikroemulzije. Za doloœitev optimalnega razmerje med posameznimi komponentami sistema in sistematiœni øtudij nastalih mikroemulzij je potrebno izdelati fazni diagram, iz katerega je razvidno obmoœje njihovega nastanka. Za izbor optimalnega sistema je prav tako pomembno, da æe v fazi predformulacijskih raziskav pridobimo øirok nabor podatkov o fizikalno-kemijskih in biofarmacevtskih lastnostih uœinkovine. Pri naœrtovanju ustreznega lipidnega dostavnega sistema za izbrano uœinkovino si pomagamo tudi z biofarmacevtskim klasifikacijskim sistemom (preglednica 1) [1, 4]. Slika 1: Shematski prikaz usode S(M)ES po peroralnem vnosu in moæni vplivi sistema na absorpcijo vgrajenih uœinkovin (povzeto po [17]). Figure 1: Shematic presentation of S(M)ES behavior after oral application and possible influence of the system on the absorption of incorporated drugs (adapted from [17]). 2.1.1 Lipidi Lipidi predstavljajo eno izmed najpomembnejøih sestavin S(M)ES. Za izdelavo slednjih so primerni razliœno nasiœeni trigliceridi z dolgimi in srednje dolgimi verigami. Zaradi ustreznih sposobnosti raztapljanja in samo(mikro)emulgiranja najpogosteje posegamo po polsinteznih lipidih. Zelo primerni so trigliceridi s srednje dolgimi verigami (sdv- Preglednica 1: Potencialni mikroemulzijski sistemi za peroralen vnos uœinkovin z ozirom na topnost in permabilnost. Table 1: Potential microemulsion systems for oral drug delivery based on aqueous solubility and membrane permeability considerations. Topnost v vodi Permeabilnost membrane Primeren mikroemulzijski sistem Priœakovane prednosti pri dostavi uœinkovin Visoka Visoka V/O Stabilizacija in zaøœita pred kemijsko in encimsko hidrolizo Visoka Nizka V/O Stabilizacija in zaøœita pred kemijsko in encimsko hidrolizo, poveœana bioloøka uporabnost Nizka Visoka S(M)ES, O/V Izboljøana topnost in raztapljanje, poveœana bioloøka uporabnost Nizka Nizka S(M)ES, O/V Izboljøana topnost in raztapljanje, poveœana bioloøka uporabnost poveœana hitrost in/ali obseg absorpcije / b increased rate and/or extent of absorption 264 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 265 Samo(mikro)emulgirajoci sistemi - alternativen pristop za izboljšanje biološke ... TG), ki jih pridobivajo iz kokosovega olja. Slednji so s strani FDA sprejeti kot varni in so primerni za pripravo mikroemulzij z razliœno sestavo, zaradi vsebnosti mono-, di- in tri-gliceridov pa izboljøajo tudi absorpcijo vgrajene uœinkovine. Po literaturnih podatkih se sdv-TG pogosteje uporabljajo kot trigliceridi z dolgimi verigami (dv-TG), saj imajo v sploønem boljøo sposobnost raztapljanja in samoemulgiranja, njihova kemijska œistost in odsotnost dvojnih vezi pa omogoœata tudi boljøo kemiœno stabilnost njih samih in tudi vgrajenih uœinkovin [8]. Vendar ne smemo posploøevati, saj na izbor lipida pomembno vpliva tudi æelena pot absorpcije vgrajene uœinkovine (v limfni oz. v portalni krvni obtok), ki je prav tako odvisna od molekulske mase lipida. Kot smo æe omenili, se v novejøih S(M)ES uporabljajo predvsem novi polsintezni derivati sdv-TG, ki jih lahko opiøemo kot amfifilne spojine z lastnostmi PAS. Primer le-teh so poliglikolizirani gliceridi, ki jih pridobivamo z delnim preestenjem (alkoholizo) rastlinskih olj s polietilen glikolom ali zaestrenjem maøœobnih kislin s polietilen glikolom in glicerolom. Na træiøœu jih najdemo pod zaøœitenimi imeni Gelucire®, Labrafil® in drugi. V literaturi pogosto zasledimo tudi dodatek tokoferola, tokotrienolov ter njihovih derivatov [2]. 2.1.2. Povrøinsko aktivne snovi Za uporabo v mikroemulzijskih sistemih mora izbrana PAS moœno zniæati medfazno napetost, obogoœati gibljivost emulgatorskega filma na medfazni povrøini ter imeti ustrezno HLB vrednost. Za izdelavo S(M)ES priporoœajo predvsem neionske PAS z relativno visokimi HLB vrednostmi. Obiœajno uporabljajo glikolizirane etoksilirane gliceride ter polisorbate (predvsem polioksietilen-(20)-sorbitanmonooleat). Odloœujoœi dejavnik pri izbiri PAS je varnost, zato imajo prednost naravni emulgatorji, katerih sposobnost samoemulgiranja je sicer omejena, a veljajo za varnejøe kot sintezni. Zaradi neodvisnosti od pH vrednosti in ionske moœi ter predvsem zaradi manjøe toksiœnosti so primernejøe neionske PAS, œeprav lahko tudi slednje povzroœijo zmerne reverzibilne spremembe v permeabilnosti œrevesne stene. Za izdelavo uœinkovitih S(M)ES je potrebna optimalna zmes emulgatorjev z nizkimi in visokimi HLB vrednostmi v koncentraciji med 30 in 60 %. Zaradi zmanjøanja draæenje prebavnega trakta pa je pomembno, da izberemo œim niæje øe ustrezne koncentracije. Pri izbiri PAS moramo upoøtevati tudi morebitno toksiœnost razpadnih produktov. Vsebnost PAS z relativno visoko HLB vrednostjo vpliva na proces samo(mikro)emulgiranja, saj omogoœa hiter nastanek (mikro)emulzije tipa o/v in dobro porazdelitev le-te po prebavnemu traktu. PAS poveœajo tudi topnost hidrofobnih uœinkovin in tako vplivajo na uœinkovitost absorpcije, saj prepreœujejo obarjanje uœinkovine v lumnu GIT ter podaljøajo œas, ko je uœinkovina v raztopljenem stanju [5, 2]. 2.1.3. Sotopila Z namenom, da bi poveœali topnost uœinkovine in hidrofilnega emulgatorja v lipidni podlagi dodajamo v S(M)ES sotopila. Primerna topila za peroralen vnos so npr. etanol, propilen glikol in polietilen glikol. Ker uporaba slednjih poveœa zahtevnost proizvodnega procesa in zaradi morebitnih teæav povezanih s porazdeljevanjem sotopil iz S(M)ES v ovojnino, razvijajo sisteme brez alkoholov in drugih hlapnih topil. V nekaterih mikroemulzijskih sistemih imajo sotopila tudi vlogo koemulgatorja [5, 3]. 2.1.4. S(M)ES in uœinkovina Uœinkovitost vgradnje uœinkovin v S(M)ES je obiœajno specifiœna za doloœen sistem in je odvisna od relativne topnosti uœinkovine v posameznih komponentah sistema ter njene fizikalno-kemijske kompatibilnosti s sistemom. Za laæjo predstavo o tem, v kakønih koliœinah lahko vgrajujemo uœinkovine v omenjene sisteme, naj navedemo primer, da so v formulacijo s S(M)ES vgradili 10 % celecoxiba, medtem ko je bila najveœja doseæena topnost v lipidu le 0,7 % [14]. Prisotna uœinkovina v veœini primerov vpliva na proces samoemulgiranja, saj se spremeni optimalno razmerje med sestavinami S(M)ES. Do spremembe v uœinkovitosti S(M)ES lahko pride zaradi tvorbe kompleksov med molekulami uœinkovine in nekaterimi komponentami sistema ter penetracije uœinkovine v monosloj PAS na medfazi. V razvoju optimalnega S(M)ES je potrebno æe v predformulacijskih raziskavah doloœiti topnost uœinkovin v posameznih komponentah, ter izdelati fazne diagrame za posamezne sisteme. Iz slednjih je moœ odœitati obmoœje nastanka (mikro)emulzije in morebiten vpliv uœinkovine na le-tega [5, 3]. 2.2. Mehanizem samo(mikro)emulgiranja Samo(mikro)emulgiranje je spontan proces, med katerim iz S(M)ES v stiku z vodnim medijem nastane (mikro)emulzija tipa o/v. Natanœen mehanizem samo(mikro)emulgiranja zaenkrat øe ni popolnoma poznan. Predlagana je razlaga, po kateri samo(mikro)emulgiranje poteœe, kadar je sprememba entropije zaradi dispergiranja veœja od energije, ki je potrebna za poveœanje povrøine ob dispergiranju. Prosta energija je v tem primeru negativna oz. zelo nizko pozitivna, zato (mikro)emulzija nastane spontano oz. æe ob rahlem meøanju [2, 5]. V procesu samo(mikro)emulgiranja imata velik pomen zelo nizka medfazna napetost olje/voda in prekinitev medfaze, ki je posledica penetracije vode v oljno fazo oz. sotopila iz S(M)ES v vodno fazo. Po mnenju Wacherly-ja in sodelavcev se po dodatku meøanice olje/neionski emulgator v vodo vzpostavi medfaza med oljem in kontinuirano vodno fazo. V nadaljevanju molekule vode prehajajo skozi medfazo v oljno fazo, kjer jih PAS solublizirajo znotraj micelov. Ko je v bliæini medfaze doseæena maksimalna solubilizacijska kapaciteta, vodi nadaljnje prehajanje vode do nastanka dispergiranih tekoœih kristalov. Postopoma celotno medfazo predstavlja plast tekoœih kristalov, kar olajøa in pospeøi nadaljnje prehajanje vode skozi medfazo. V kombinaciji z rahlim meøanjem slednje vodi do poruøenja medfaze in tvorbe oljnih kapljic, ki jih obdaja plast tekoœih kristalov. Po literaturnih virih naj bi bila zahtevnost emulgiranja povezana ravno z zmoænostjo penetracije vodne faze v razliœne strukture tekoœnih kristalov oz. gele, ki se tvorijo na povrøini kapljic (mikro)emulzije. Le-ti naj bi bili tudi vzrok za veliko fizikalno stabilnost nastale (mikro)emulzije [6, 15, 16]. 3 Vpliv S(M)ES na poveœanje peroralne absorpcije Uœinkovina, vgrajena v S(M)ES, je pri prehodu skozi GIT ves œas raztopljena v drobnih oljnih kapljicah ali pa se nahaja v meøanih micelih. Absorpcija je odvisna od veœ dejavnikov, predvsem od vrste lipidov in razmerja med njimi ter emulgatorjem, koncentracije emulgatorja ter velikosti in naboja kapljic. Usoda S(M)ES po peroralnem vnosu in moæni vplivi sistema na absorpcijo vgrajenih uœinkovin so shematsko prikazani na sliki 1 [2]. 3.2. Vpliv lipidov Vpliv lipidov na BU peroralno vnesenih uœinkovin je posledica veœ zapletenih mehanizmov, ki lahko spremenijo biofarmacevtske farm vestn 2008; 59 265 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 266 -^- Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles lastnosti uœinkovin, kot so hitrost raztapljanja, topnost v prebavnih sokovih, zaøœita uœinkovin pred kemijsko in encimsko razgradnjo ter tvorba lipoproteinov, ki pospeøujejo limfatiœni transport moœno lipofilnih uœinkovin (slika 2). Profil absorpcije in porazdeljevanje med limfo in krvjo sta odvisna od dolæine verig maøœobnih kislin v trigliceridih, stopnje njihove nasiœenosti ter koliœine vnesenega lipida. Kratko- in srednje dolgo veriæne maøœobne kisline (z manj kot 12 C atomi) se tako preko portalnega krvnega obtoka transportirajo direktno v centralni krvni obtok ter se le v nizkem obsegu vgradijo v hilomikrone. V procesu absorpcije dolgo veriænih MK in monogliceridov pa v intestinalnih celicah najprej poteœe preestrenje do trigliceridov in vgraditev v hilomikrone, ki nato vstopijo v limfni obtok in od tam preko prsne mezgovnice v sistemski krvni obtok. Z izbiro ustrezne lipidne podlage lahko torej vplivamo na obseg absorpcije vgrajene uœinkovine tako v limfni obtok (s stimulacijo nastanka lipoproteinov) kot v portalni krvni obtok; tako soœasno vplivamo tudi na obseg metabolizma prvega prehoda, saj intestinalni limfni obtok obide jetra [18]. Slika 2: Moæni vplivi lipidov in lipidnih podlag na absorpcijo uœinkovin. Lipidi lahko vplivajo na absorpcijo uœinkovin na tri naœine: (a) poveœajo solubilizacijo uœinkovine v œrevesu z vplivom na sestavo in lastnosti npr. veziklov, meøanih micelov in micelov; (b) interagirajo s prenaøalnimi in metabolnimi procesi na nivoju enterocitov, kar lahko spremeni privzem uœinkovine, efluks ter nastanek in porazdelje-vanje metabolitov znotraj enterocita; (c) spremenijo pot transporta uœinkovine v sistemski krvni obtok (portalna vena/limfni obtok), (povzeto po [18]). Figure 2: Potential effect of lipids and lipidic excipients on drug absorption. Lipids can affect drug absorption in three ways: (a) by enhancing drug (D) solubilization in the intestinal milieu through alterations to the composition and character of, vesicles, mixed micelles and micelles; (b) by interacting with enterocyte-based transport and metabolic processes, thereby potentially changing drug uptake, efflux, disposition and the formation of metabolites (M) within the enterocyte; (c) by altering the pathway (portal vein versus intestinal lymphatic system) of drug transport to the systemic circulation (adapted from [18]). O vplivu vrste lipidne podlage na BU uœinkovine odloœa narava le-te [8]. Na primeru halofantrina [19] in danazola [20] so ugotovili, da SMES z dv-TG (dv-SMES) izraziteje izboljøa BU uœinkovine kot SMES s sdv-TG (sdv-SMES). Avtorji so zato sklepali, da je kapaciteta solubilizacije nekaterih lipofilnih uœinkovin v sdv-TG niæja kot v dv-TG Ker pa v omenjenih øtudijah niso primerjali S(M)ES z enakim razmerjem med lipidom, PAS in pomoæno PAS, je direktna primerjava vpraøljiva. V novejøi raziskavi so M. Grove in sodelavci pri prouœevanju vpliva lipidne podlage na BU seokalcitola pri podganah zato primerjali sistema, ki sta se razlikovala le po vrsti lipida, in doloœili pribliæno enako BU tako pri vgradnji uœinkovine v sdv-SMES kot v dv-SMES [8]. Na osnovi omenjenih raziskav lahko sklepamo, da je predvsem od lastnosti uœinkovine odvisno ali bo izboljøanje njene BU veœje v primeru vgradnje v formulacijo s sdv-TG ali dv-TG. Nekega sploønega zakljuœka o odvisnosti BU vgrajenih uœinkovin od vrste ipidne podlage v formulaciji zato ni mogoœe potegniti. 3.3. Vpliv površinsko aktivnih snovi PAS v S(M)ES lahko izboljøajo BU vgrajenih uœinkovin po veœ mehanizmih: (1) poveœanje topnosti uœinkovin, (2) poveœanje permeabilnosti skozi epitelij prebavnega trakta, (3) vpliv na tesne stike ter (4) inhibicija P-gp in/ali CytP450 [21]. PAS poveœajo permeabilnost uœinkovin z delovanjem na lipidni dvosloj epitelijskih celic, ki skupaj z nemeøajoœim vodnim slojem predstavlja oviro za difuzijo uœinkovin. PAS se porazdelijo v lipidni dvosloj celiœnih membran in poruøijo njegovo urejenost ter tako poveœajo permeabilnost uœinkovin. Z amfifilno naravo PAS sta povezani tudi poveœana topnost in hitrosti raztapljanja vgrajenih uœinkovin. PAS lahko tudi reverzibilno odprejo tesne stike [22, 23] Slika 3: Vpliv inhibicije P-glikoproteina (P-gp) na absorpcijo uœinkovin. (a) P-gp œrpa spojine iz celice skozi apikalno membrano v intestinalni lumen in tako zavira absorpcijo substratov P-gp. Pod vplivom P-gp se skozi apikalno membrano eliminirajo tudi njegovi substrati, ki vstopijo v celico skozi bazolateralno membrano (iz plazme). (b) Uœinek inhibicije Pgp na obseg absorpcije substratov P-gp. Figure 3: Influence of P-glycoprotein (P-gp) inbition on the absorption of drugs. (a) P-gp actively transports its substrates from the cell interior throuht the apical membrane back into the intestinal lumen and limits their absorption. Also substrates entering the cell through the basolateral membrane (from plasma)undergoes P-gp mediated efflux. (b) Increased absorption of P-gp substrates due to P-gp mediated efflux inhibition. 266 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 267 Samo(mikro)emulgirajoci sistemi - alternativen pristop za izboljšanje biološke ... Preglednica 2: Inhibitorji P-gp: lipidi in polimeri Table2: P-gp inhibitors: lipids and polymers A) Lipidi / povrøinsko aktivne snovi Estri glicerola in PEG z oktanojsko (C8) in dekanojsko kislino (C10): Cremophor, Solutol HS-15, Labrasol, Softigen 767, Aconnon E Estri saharoze: saharoza monolavrat Polisorbati: Tween 80, Tween 20 Estri s tokoferolom: -tokoferil-PEG-1000-sukcinat (TPGS) B) Polimeri Blok kopolomeri Pluronic (poloxamer-i): poli-(etilenoksid)/poli-(propilenoksid) blok kopolimeri Amfifilni diblok kopolimeri: Metoksipolietilen glikol-block-polikaprolakton (MePEG-b-PCL) Z uporabo S(M)ES tako poskuøajo izboljøati zelo slabo BU paklitaksela, enega izmed najmoœnejøih kemoterapevtikov, ki je zelo lipofilen in netopen v veœini farmacevtsko sprejemljivih sestavin, soœasno pa je tudi substrat za P-gp in citokrom P450. Paklitaksel je na træiøœu prisoten le v obliki farmacevtskih oblik za i.v. vnos, zato potekajo obseæne raziskave o moænosti peroralnega vnosa. Spodbudne rezultate so dosegli s soœasnim vnosom S(M)ES z inhibitorji P-gp (TPGS in Cremophor® / a-tokoferol) in ciklosporina, ki je tudi moœan inhibtor Pgp. Œe je bil pri omenjenih raziskavah ugoden rezultat odvisen od soœasnega vnosa ciklosporina, pa slednje ne velja v naslednjem primeru, kjer so podganam soœasno vnesli Cremophor-etanolno raztopino 14C-paklitaksela ter TPGS. Avtorji omenjene raziskave ne vedo, ali je vzrok za izboljøanje BU poveœana topnost uœinkovine ali kak drug mehanizem, zato so potrebne øe nadaljnje raziskave [13, 25, 26]. Z vgradnjo v S(M)ES in poslediœno poveœanjem topnosti so uspeøno poveœali BU Ciklosporina A, ki je na træiøœu prisoten pod zaøœitenim imenom Sandimmun Neoral® [5]. Vendar je priporoœljivo, da smo pri izbiri in uporabi PAS previdni, saj lahko v literaturi zasledimo tudi primere, ko se je BU vgrajene uœinkovine zniæala zaradi prevelika koncentracije PAS [5]. Slednje se je potrdilo tudi v primeru danazola, kjer je poviøanje koncentracije PAS (Cremophor® EL) in sotopila na raœun oljne faze najverjetneje zmanjøalo solubilizacijsko kapaciteto sistema v prebavnem traktu in poslediœno tudi BU danazola. Moæen vzrok za slabo solubilizacijsko kapaciteto Cremophor® EL-a bi lahko bila hidroliza le-tega v prisotnosti pankreatiœne lipaze; slednje je predmet raziskav, ki øe potekajo [24]. Rezultati slednjih bi lahko pomembno doprinesli k poznavanju mehanizma interakcij neionskih PAS s prebavnimi produkti lipidov (meøani miceli) in morebitnega vpliva prebave s pankreatiœno lipazo na njihovo solubilizacijsko kapaciteto, o katerih je zaenkrat znanega øe malo. 3.4 Vpliv PAS na inhibicijo P-glikoproteina Vzroka za nizko BU peroralno vnesenih slabo topnih uœinkovin sta predvsem slaba vodotopnost ter s P-glikoproteini (P-gp) posredovan efluks uœinkovin [5]. BU uœinkovin, ki so substrati za P-gp, je moæno izboljøati tako, da v formulacijo vkljuœimo tudi inhibitor P-gp oz. le-tega vnesemo soœasno z zdravilom (slika 3). Zaæeleno je, da se kot inhibitorji P-gp uporabljajo farmakoloøko neaktivne spojine; to so lahko pomoæne snovi, ki so sploøno priznane kot varne ter drugi dodatki (npr. hrana). Nekaj inhibitorjev P-gp je navedenih v preglednici 2 [25]. 4 Trdne farmacevtske oblike s S(M)ES Zaradi tekoœega agregatnega stanja so S(M)ES najveœkrat v obliki tekoœih farmacevtskih oblik (FO) ali pa jih polnijo v æelatinske kapsule. Z vgradnjo S(M)ES v trdno farmacevtsko obliko dobimo sistem, ki zdruæuje prednosti lipidnih dostavnih sistemov in trdnih farmacevtskih oblik, hkrati pa se izognemo nekaterim pomanjkljivostim tekoœih. Ker je polnjenje v mehke æelatinske kapsule povezano z visokim stroøki proizvodnje, iøœejo nove pristope za vnos S(M)ES v obliki trdnih farmacevtskih oblik. S(M)ES so tako æe uspeøno vgradili v pelete, mikrokapsule s takojønjim sproøœanjem ter tablete in pelete z nadzorovanim sproøœanjem [27-30]. 5 Sklep Iz literature je razvidno, da S(M)ES omogoœajo statistiœno zanesljivo izboljøanje BU slabo vodotopnih in/ali permeabilnih uœinkovin, zato se kar samo postavlja vpraøanje, zakaj so kljub oœitnim prednostim in velikemu interesu na træiøœu le 4 izdelki s S(M)ES? Vzroki za neizkoriøœenost potenciala omenjenega tehnoloøkega pristopa niso popolnoma jasni, verjetno pa je slednje odsev pomanjkanja hitrih analiznih metod in omejenega poznavanja parametrov, ki vplivajo na obnaøanje teh formulacij in vivo, ter malo literaturnih podatkov o øtudijah na ljudeh. Na zapostavljenost S(M)ES pomembno vplivata tudi visoka vsebnost PAS v teh sistemih ter dejstvo, da po redœenju z vodo nastanejo stabilne mikroemulzije le pri doloœenem deleæu vode. Prihodnost S(M)ES je zato verjetno odvisna od pravilne izbire varnih pomoænih snovi, ki bi zagotavljale zadostno solubilizacijo uœinkovine æe pri nizki vsebnosti PAS in sotopil in bi hkrati inhibirale P-gp. Izbrane sestavine morajo zagotoviti nastanek koloidne disperzije med redœenjem S(M)ES v lumnu prebavnega trakta in prepreœiti obarjanje vgrajene uœinkovine. In kakøne so posledice, œe se uœinkovina kljub vsemu obori? Po mnenju nekaterih raziskovalcev, ki so prouœevali absorpcijo uœinkovin iz mikroemulzij, je slednja tudi po prekomernem redœenju mikroemulzij boljøa, kot po vnosu trdnih farmacevtskih oblik, saj se vgrajena uœinkovina v teh pogojih obori v obliki zelo drobnih delcev [31]. Ali slednje velja tudi za S(M)ES ostaja zaenkrat øe predmet raziskav. Dejstvo pa je, da so se S(M)ES æe veœkrat izkazali farm vestn 2008; 59 267 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 268 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles kot primerni nosilni sistemi za lipofilne uœinkovine in predstavljajo obetajoœo alternativo za peroralen vnos le-teh. 6 Literatura 1. G.L. Amidon, V.P. Lennernas, A. Shah. Theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: The correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm. Res. 1995; 12: 413-420. 2. C.W. Pouton. Lipid formulations for oral administration of drugs: non-emulsifying, self-emulsifying and 'self-microemulsifying' drug delivery systems. Eur J Pharm Sci 2000; 11, Suppl. 2: S93-S98. 3. P. Spiclin, M. Homar, A. Zupancic-Valant, M. Gasperlin. Sodium ascorbyl phosphate in topical microemulsions. Int J. Pharm 2003; 256: 65–73. 4. P.P. Constantinides. Lipid microemulsions for improving drug dissolution and oral absorption: physical and biopharmaceutical aspects. Pharm Res 1995; 12: 1561-72. 5. G.R. Neslihan, S. Benita. Self-emulsifying drug delivery systems (SEDDS) for improved oral delivery of lipophilic drugs. Biomedicine & Pharmacotherapy 2004; 58: 173-182. 6. C.W. Pouton. Formulation of self-emulsifying drug delivery systems. Adv Drug Delivery Rev 1997; 25: 47-58. 7. E.A. Mueller, J.M. Kovarik, J.B. van Bree et al. Influence of fat-rich meal on the pharmacokinetics of a new oral formulations of cyclosporine in a crossover comparison with the market formulation. Pharm Res 1994; 11: 151-155. 8. M. Grove, A. Müllertz, J.L. Nielsen et al. Bioavailability of seocalcitol II: development and characterisation of self-microemulsifying drug delivery systems (SMEDDS) for oral administration containing medium and long chain triglycerides. Eur J Pharm Sci 2006; 28: 233-242. 9. L. Wei, P. Sun, S. Nie et al. Preparation and evaluation of SEDDS and SMEDDS containing carvediol. Drug Dev Ind Pharm 2005; 31: 785, 794. 10. J.Y. Hong, J.K. Kim, J.S. Park et al. A new self-emulsifying formulation of itraconazole with improved dissolution and oral absorption. J Controlled Release 2006; 110: 332-338. 11. B.K. Kang, J.S. Lee, S.K. Chon et al. Development of self-microemulsifying drug delivery systems (SMEDDS) for oral bioavailability enhancement of simvastatin in beagle dogs. Int J Pharm 2004; 274: 65-73. 12. J.S. Woo, T.S. Kim, J.H. Park et al. Formulation and biopharmaceutical evaluation of silymarin using SMEDDS. Arch Pharm Res 2007; 30 (1): 82-89. 13. S. Yang, R.N. Gursoy, G. Lambert et al. Enhanced oral absorption of paclitaxel in a novel self-microemulsifying drug delivery system with or without concomitant use of P-glycoprotein inhibitors. Pharm Res 2004; 21 (2): 261-270. 14. N. Subramanian, S. Ray, S.K. Ghosal et al. Formulation design of self-microemulsifying drug delivery systems for improved oral bioavailability of celecoxib. Biol Pharm Bull 2004; 27 (12): 1993— 1999. 15. M.J. Rang, C.A. Miller. Spontaneous emulsification of oils containing hydrocarbons, non-ionic surfactant, and oleyl alcohol. J Colloids Interface Sci 1999; 209: 179-92. 16. C. Raffournier, P. Saulnier, F. Boury et al. Oil/water "hand-bag like structures": how interfacial rheology can help to understand their formation? J Drug Del Sci Tech 2005; 15(1): 3-9. 17. J.S. Garrigue. Les systemes autoemulsionnants pour l`administration orale de principes actifs lipophiles: influence de la formulation sur les aspects biopharmaceutiques. These Faculte de pharamacie de Chatenay-Malabry, de l`Universite de Paris de XI 2002. 18. C.J.H. Porter, N.L. Trevaskis, W.N. Charman. Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nature reviews/Drug discovery 2007; 6: 231-248. 19. S.M. Khoo, A.J. Humberstone, C.J. Porter. Formulation design and bioavailability assessment of lipidic self-emulsifying formulations of halofantrine. Int J Pharm 1998; 167: 155-164. 20. C.J.H. Porter, A.M. Kaukonen, B.J. Boyd et al. Susceptibility to lipase-mediated digestion reduces the oral bioavailability of danazol after administration as a medium-chain lipid-based microemulsion formulation. Pharm Res 2004; 21 (8): 1405-1412. 21. T.R. Kommuru, B. Gurley, M.A. Khan et al. Self-emulsifying drug delivery systems (SEDDS) of coenzyme Q10: formulation development and bioavailability assessment. Int J Pharm 2001; 212: 233-246. 22. W. Wu, Y. Wang, L. Que. Enhanced bioavailability of silimarin by self-microemulsifying drug delivery system. Eur J Pharm Biopharm 2006; 63: 288-294. 23. A. Spernath, A. Aserin. Microemulsions as carriers for drugs and nutraceuticals. Adv Colloid Interface Sci 2006; 128–130: 47–64. 24. J.F. Cuiné, W.N. Charman, C.W. Pouton. Increasing the proportional content of surfactant (Cremophor ER) relative to lipid in self-emulsifying lipid-based formulations of danazol reduces oral bioavailability in beagle dogs. Pharm Res 2007; 24 (4): 748-757. 25. P.P. Constantinides, K.M. Wasan. Lipid formulation strategies for enhancing intestinal transport and absorption of P-glycoprotein (P-gp) substrate drugs: in vitro/in vivo case studies. J Pharm Sci 2007; 96 (2): 235-248. 26. P. Gao, B.D. Rush, W.P. Pfund et al. Development of supersaturable SEDDS (S-SEDDS) formulation of paclitaxel with improved oral bioavailability. J Pharm Sci 2003; 92: 2395-407. 27. C. Tuleu, M. Newton, J. Rose et al. Comparative bioavailability study in dogs of a self-emulsifying formulation of progesterone presented in a pellet and liquid form compared with an aqueous suspension of progesterone. J Pharm Sci 2004; 93 (6): 1495-1502. 28. M. Homar, D. Øuligoj, M. Gaøperlin. Preparation of microcapsules with self-microemulsifying core by a vibrating nozzle method. J Microencapsulation 2007; 24 (1): 72 – 81. 29. S. Nazzal, M.A. Khan. Controlled drug release of a self-emulsifying formulation from a tablet dosage form: stability assessment and optimization of some processing parameters. Int J Pharm 2006; 315: 110-121. 30. M. Serratoni, M. Newton, A. Booth et al. Controlled drug release from pellets containing water-insoluble drugs dissolved in a self-emulsifying system. Eur J Pharm Biopharm 2007; 65: 94-98. 31. Rosoff, Specialized Pharmaceutical Emulsions, In: Pharmaceutical Dosage Forms, Disperse Systems, vol. 1, Lieberman et al. eds., Marcel Dekker, Inc., New York, 1988, pp. 245-283, 1988. 268 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 269 -^- Aciliranje peptidov in proteinov z derivati maøœobnih kislin Aciliranje peptidov in proteinov z derivati maøœobnih kislin Peptide and protein fatty acylation Nina Koœevar, Samo Kreft Povzetek: Poveœanje lipofilnosti hidrofilnih peptidov in proteinov z metodami aciliranja predstavlja enega od osnovnih pristopov za izboljøanje prehoda bioloøkih membran in s tem poveœanje bioloøke uporabnosti. V reakciji aciliranja z derivati maøœobnih kislin na reaktivne aminokislinske skupine peptidov in proteinov kovalentno veæemo lipofilne verige derivatov maøœobnih kislin. Œlanek podaja pregled kemijskih metod aciliranja, na kratko pa je predstavljen tudi pomen aciliranih peptidov in proteinov, tako z bioloøkega kot s farmakoloøkega vidika. Kljuœne besede: aciliranje, peptidi, prepustnost membrane, proteini Abstract: Fatty acylation represents one of the basic methods for increasing membrane permeability of hydrophilic peptides and proteins for the increase of their bioavailability. In the fatty acylation reaction, lipophilic chains of the fatty acid derivatives are covalently attached to reactive aminoacid residues of peptides and proteins. The article represents a review of chemical fatty acylation methods. Additionally, the importance of fatty acylated peptides and proteins is discussed in its biological as well as pharmacological aspect. Key words: fatty acylation, membrane permeability, peptides, proteins 1 Uvod Peptidi in proteini so bioloøke makromolekule, ki so bistvenega pomena za usklajeno potekanje biokemijskih procesov v œloveøkem organizmu. Sprememba v njihovi funkciji ali poruøenje njihovega fizioloøkega ravnovesja sta lahko vzroka za øtevilne patoloøke procese in bolezni. Po drugi strani so peptidi in proteini tudi skupina bioloøko aktivnih spojin, ki predstavljajo velik potencial kot zdravilne uœinkovine. Njihova terapevtska uporaba je danes øe moœno omejena (vnaøamo jih predvsem parenteralno) zaradi neobstojnosti pri razliœnih fizioloøkih pH-jih, hitre encimske razgradnje in kratkega razpolovnega œasa, potencialne imunogenosti ter slabega prehajanja bioloøkih membran kot posledice hidrofilnosti (1). Pomembnejøi pristopi za izboljøanje prehajanja membran in s tem poveœanje bioloøke uporabnosti temeljijo na: • podaljøanju œasa zadræevanja na mestu absorpcije z mukoadhezivnimi farmacevtskimi oblikami, • poveœanju prepustnosti s pospeøevalci absorpcije, z iontoforezo ali vkljuœevanjem peptidov in proteinov v liposome ali nanodelce in • poveœanju lipofilnosti s kemijskimi modifikacijami peptidov in proteinov (2). Prva spoznanja o lipidno-proteinskih konjugatih segajo v leto 1951, ko sta raziskovalca Folch in Lees v moæganskem tkivu odkrila do takrat neznane spojine in jih poimenovala proteolipidi (3). Znanstveno delo na tem podroœju je dobilo v naslednjih desetletjih intenzivne razseænosti, pri œemer je moœno napredovalo tudi znanje o aciliranju peptidov in proteinov z maøœobnimi kislinami. Gre za biokemijski proces, znaœilen za vse evkariontske celice, ki se odvija kot kotranslacijska ali posttranslacijska sprememba (4). Ker je maøœobnokislinska veriga na peptid oziroma protein vezana preko amidne, estrske ali tioestrske vezi, poznamo tri vrste aciliranja – N-aciliranje, O-aciliranje, ki je najmanj pogosto, in S-aciliranje (5) (slika 1). Med reakcije N-aciliranja uvrøœamo N-miristoiliranje, ki pomeni kovalentno vezavo 14 ogljikovih atomov dolge nasiœene miristinske verige na N-konœni glicin (6) ali e-amino skupino lizina (7), ter N-palmitoiliranje, ki pomeni kovalentno vezavo 16 ogljikovih atomov dolge nasiœene palmitinske verige na N-konœni glicin (6) ali aminsko skupino N-konœnega cisteina (8). S-aciliranje najpogosteje pomeni S-palmitoiliranje, zato v literaturi izraza navadno kar enaœijo. Gre za reverzibilno (proces je dinamiœen, saj in vivo poteka tudi encimsko deaciliranje) kovalentno povezavo med palmitinsko verigo in tiolno skupino cisteina (6). O-aciliranje sreœamo le v redkih primerih, poteœe pa na serinski skupini (9, 10). 2 Aciliranje peptidov in proteinov Eden izmed pristopov, ki jih uporabljamo za kemijsko modificiranje peptidov in proteinov, so metode aciliranja z reaktivnimi derivati maøœobnih kislin. Gre za reakcije, s katerimi na reaktivne aminokislinske skupine peptidov in proteinov kovalentno pripnemo Nina Koœevar, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana Izr. prof. dr. Samo Kreft, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2008; 59 269 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 270 -^- Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles lipofilne verige derivatov maøœobnih kislin. Tako modificirani peptidi in proteini imajo zaradi poveœane lipofilnosti izrazito izboljøane transportne lastnosti, hkrati pa v veliki meri ohranijo svojo aktivnost (11-14). Kot so pokazale raziskave z acilirano ribonukleazo A, lahko zadostuje æe ena sama palmitinska (11) oziroma stearinska (15) veriga, da izrazito poveœamo prehod krvno-moæganske pregrade. Potencialna mesta aciliranja so s povrøine molekule peptida oziroma proteina izstopajoœe reaktivne aminokislinske skupine – aminska, hidroksilna in tiolna. Po reakciji tako nastanejo amidna, estrska in tioestrska vez (slika 1), od katerih je prva najstabilnejøa. V sploønem je zato najbolj zaæelen potek reakcije v smeri selektivnega nastanka N-aciliranega produkta. Derivati maøœobnih kislin, s katerimi najpogosteje izvajamo reakcije aciliranja, so lipofilni kislinski kloridi in hidrofilnejøi N-hidroksi -sukcinimidni estri maøœobnih kislin (slika 2). Maøœobne kisline naj bi imele od 8 do 18 ogljikovih atomov dolge verige (oktanojska, dekanojska, lavrinska, miristinska, palmitinska in stearinska kislina) pri œemer v sploønem velja, da imajo boljøe transportne lastnosti proteini, modificirani z daljøimi maøœobnimi verigami O R-^Cl Protein A. N H .. Protein a) iV-aciliranje Protein. Protein b) O-aciliranje Protein Af-miristoiliranj e JV-palmitoiliranje c) S-palmitoiliranje O Protein. Slika 1: Vrste aciliranja in vrste kemijskih vezi, ki nastanejo v reakciji: (a) N-aciliranje z miristinsko in s palmitinsko verigo in amidna vez, (b) O-aciliranje s palmitoleinsko (cis-9-heksadecenojsko) verigo in estrska vez ter (c) S-palmitoiliranje s palmitinsko verigo in tioestrska vez. Figure 1: Types of fatty acylation and types of chemical bonds formed in the reaction: (a) N-acylation with myristic and palmitic chain and amide bond, (b) O-acylation with palmitoleic (cis-9-hexadecenoic acid) and ester bond, and (c) S-palmitoylation with palmitic chain and thioester bond. b R-O-N Slika 2: Shematski prikaz reakcije aciliranja s kislinskim kloridom (a) in z N-hidroksisukcinimidnim estrom maøœobne kisline (b), ki poteœe na aminski skupini proteina. Figure 2: Schematic representation of fatty acylation reaction using fatty acyl chloride (a) and N-hydroxysuccinimide ester of a fatty acid (b), which utilizes the protein’s amino group. Prva posebnost reakcij aciliranja izvira iz fizikalne narave peptidov oziroma proteinov ter reagentov za aciliranje. Te spojine namreœ v istem mediju – vodnem, ki raztaplja peptid oziroma protein, ter organskem, ki raztaplja reagent za aciliranje – niso topne. V reakcijski zmesi moramo zato zagotoviti øe prisotnost tretjega dejavnika, kot je na primer povrøinsko aktivna snov. Tej teæavi se lahko izognemo z uporabo vodotopnih derivatov N-hidroksisukcinimidnih estrov maøœobnih kislin, vendar pa moramo le-te pripraviti sami, saj komercialno niso dostopni, poleg tega pa je njihova uporaba vezana na specifiœne lastnosti peptida oziroma proteina, kot je na primer prisotnost tiolne skupine (12). Drugo pomembno omejitev predstavlja dejstvo, da peptidov in proteinov ne smemo neposredno izpostavljati veœini organskih topil, saj lahko zaradi denaturiranja izgubijo svojo bioloøko aktivnost (2). V sploønem sta se tako izoblikovala dva naœina izvedbe reakcij aciliranja z derivati maøœobnih kislin: aciliranje v organskem in aciliranje v vodnem mediju. 2.1 Aciliranje v organskem mediju Prvo metodo so razvili za O- in S-palmitoiliranje peptidov (4). Temelji na relativno preprosti reakcijski shemi, po kateri reagent za aciliranje (kislinski klorid) dodamo neposredno organskemu topilu (trifluoroocetni kislini), v katerem je raztopljen peptid. Zaradi kislega medija ne pride do reakcije na aminskih skupinah, ki so popolnoma protonirane; taka reakcija lahko poteœe øele po nekaj urah do dnevih. Metoda je primerna za aciliranje manjøih hidrofobnih peptidov. Drugi pristop je zasnovan na reakciji, ki poteka v kompleksnejøem reverzno micelarnem sistemu. V organskem topilu (na primer 2,2,4-trimetilpentanu) s pomoœjo povrøinsko aktivne snovi (Aerosol OT) dispergiramo baziœno raztopino peptida oziroma proteina (16). Pri 270 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 271 -^- Aciliranje peptidov in proteinov z derivati maøœobnih kislin tem nastanejo reverzni miceli, v katerih vodno notranjost so vgrajeni peptidi oziroma proteini. Reagent za aciliranje (kislinski klorid), ki ga nato dodamo zunanji organski fazi, kontrolirano prehaja monosloj povrøinsko aktivne snovi in vstopa v reakcijo z aminskimi skupinami na peptidu oziroma proteinu. Metoda je øe posebej uporabna, kadar æelimo prepreœiti agregacijo posameznih molekul peptida oziroma proteina, do katere lahko v veœjem obsegu pride v vodnih raztopinah, in pa kadar v procesu aciliranja nastanejo moœno lipofilni produkti. 2.2 Aciliranje v vodnem mediju Te metode so z vidika neobstojnosti hidrofilnih peptidov in proteinov v relativno agresivnih organskih topilih za izvajanje aciliranja najprimernejøe. Prvi pristop predstavlja aciliranje z N-hidroksisukcinimidnimi estri maøœobnih kislin. Reakcija obsega dve stopnji – v prvi pripravimo N-hidroksisukcinimidni ester, v drugi pa izvedemo reakcijo s peptidom ali proteinom. Tako najprej reagirata maøœobna kislina (na primer palmitinska kislina) in N-hidroksisukcinimid, pri œemer moramo uporabiti tudi aktivator dicikloheksilkarbodiimid (slika 3). Nastali aktivni ester (N-hidroksisukcinimidni ester palmitinske kisline) nato dodamo pufrni raztopini peptida ali proteina (17). Razvili so tudi nekaj zanimivih modifikacij te metode, od katerih uspeøno uporabljajo aciliranje s popolnoma vodotopnim derivatom palmitinske kisline. Pri tej reakciji pride do nastanka reverzibilne disulfidne vezi med tiolno skupino na proteinu in reagentom za aciliranje (palmitoilnim derivatom L-cisteinil-2-piridildisulfida) (12). Druga metoda vkljuœuje pripravo micelarne disperzije reagenta za aciliranje. V prvi stopnji baziœni pufrni raztopini povrøinsko aktivne snovi (na primer natrijevega holata) dodamo lipofilni reagent za aciliranje (kislinski klorid). Po sonificiranju nastane micelarna disperzija reagenta za aciliranje, ki jo dodamo raztopini peptida oziroma proteina (18). Reagent za aciliranje je torej ujet v micelih homogeno porazdeljene notranje faze in enakomerno prehaja do peptida oziroma proteina. Preprosto modifikacijo te metode predstavlja aciliranje z in situ pripravljeno disperzijo palmitoilklorida v vodni raztopini acetonitrila (19). Reakcijo izvedemo tako, da kislinski klorid raztopimo v 100-odstotnem acetonitrilu in ga dodamo baziœni pufrni raztopini proteina, pri œemer vsebuje konœna reakcijska zmes do 30 odstotkov acetonitrila v vodi. Pri tej koncentraciji acetonitrila veœina proteinov øe ne denaturira. Palmitoilklorid je v taki raztopini ravno dovolj topen za uspeøen potek reakcije, preostanek, ki se obori, pa na koncu odstranimo s centrifugiranjem (19). Kemijske reakcije aciliranja so v sploønem slabo selektivne, saj lahko reagent za aciliranje reagira z razliœnimi reaktivnimi aminokislinskimi skupinami hkrati (z aminsko, s hidroksilno in tiolno), poleg tega pa lahko dobimo tudi zmes monoaciliranih, diaciliranih, triaciliranih molekul itd. Ker ima æeleni bioloøki uœinek pogosto le ena vrsta molekul, je izjemnega pomena, da razvijemo dobre analizne metode za karakterizacijo nastalih heterogenih produktov, kot sta na primer tekoœinska kromatografija in masna spektroskopija. 3 Pomen aciliranja Aciliranje proteinov z maøœobnimi kislinami izrazito poveœa njihove lipofilne lastnosti ter poslediœno spremeni tudi njihovo fizioloøko vlogo. Acilirani proteini opravljajo v organizmu øtevilne in zelo raznolike naloge. Izmed najbolj raziskanih lahko izpostavimo vezavo oziroma interakcije s celiœnimi membranami, razmeøœanje do celiœnih organelov in drugih struktur znotraj celice, signaliziranje ter vpliv na interakcije z drugimi proteini (20, 21). Z vidika terapevtske uporabe moramo kot prvo pomembno znaœilnost aciliranih peptidov in proteinov izpostaviti izboljøanje prehodnosti bioloøkih membran zaradi poveœane lipofilnosti (11, 12, 17, 19, 22). V raziskavah so dobro prouœili tudi vplive na farmakokinetiœne lastnosti. Dokazali so, da lahko z aciliranjem podaljøamo razpolovni œas hemoglobina (23) in inzulina (24), saj pride do poveœane vezave na albumin. Œeprav z aciliranjem povzroœimo strukturne spremembe peptidnih in proteinskih molekul, pa s tem ne poveœamo njihove imunogenosti. Celo nasprotno – dokazali so, da lahko z aciliranjem imunogenost zniæamo in tako znaœilno zmanjøamo nastanek protiteles (25). To je pravzaprav razumljivo, saj so maøœobne kisline v organizmu normalno prisotne in jih imunski sistem ne prepozna kot R-COOH + HO-N DCC O R-O-N O + DCS mašcobna kislina JV-hidroksisukcinimid iV-hidroksisukcinimidni ester mašcobne kisline Slika 3: Shematski prikaz priprave N-hidroksisukcinimidnega estra maøœobne kisline. V reakciji po aktivaciji z dicikloheksilkarbodiimidom (DCC) reagirata maøœobna kislina in N-hidroksisukcinimid. Nastaneta N-hidroksisukcinimidni ester maøœobne kisline in dicikloseœnina (DCS), ki jo odfiltriramo. Figure 3: Schematic representation of preparation of N-hydroxysuccinimide ester of a fatty acid. In the reaction, a fatty acid and N-hydroxysuccinimide react after activation with dicyclohexylcarbodiimide (DCC). N-hydroxysuccinimide ester of the fatty acid and dicyclohexylurea (DCS), which is filtered out, are formed. farm vestn 2008; 59 271 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 272 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles tujke. Najbolj znan acilirani protein, ki ga uporabljamo v terapevtske namene, je inzulin detemir. Na njegovo lizinsko skupino je vezana 14 ogljikovih atomov dolga veriga miristinske kisline. Posledica te spremembe je zdruæevanje molekul v heksamerne in diheksamerne strukture na mestu injiciranja (podkoæno), kar upoœasni absorpcijo v krvni obtok, poleg tega pa pride tudi do znaœilno poveœane vezave na albumin (tako tkivni kot plazemski). Omenjeni uœinki se odrazijo v podaljøanem in bolj enakomernem plazemskem profilu (26). 4 Sklep Aciliranje peptidov in proteinov z derivati maøœobnih kislin je obetavna kemijska metoda, s katero lahko moœno izboljøamo njihove farmakoloøke lastnosti. Œeprav je ta pristop relativno enostaven s sinteznega vidika, pa ne moremo mimo dejstva, da so reakcije v sploønem slabo selektivne in zato vodijo do nastanka heterogenih produktov. To nakazuje pomen natanœne karakterizacije oziroma uporabe kompleksnih analiznih metod, ki so zelo zahtevne. Vendar pa omenjena problematika predstavlja drugo plat zgodbe, ki presega okvire tega œlanka. 5 Literatura 1. Frokjaer S, Otzen DE. Protein drug stability: a formulation challenge. Nat Rev Drug Discov 2005; 4: 298–306. 2. Øegula M, Vreœer F. Nove farmacevtske oblike za peroralno dostavo peptidov in proteinov. Farm Vestn 2003; 54: 25–35. 3. Folch J, Lees M. Proteolipides, a new type of tissue lipoproteins; their isolation from brain. J Biol Chem 1951; 191: 807–817. 4. Yousefi-Salakdeh E, Johansson J, Strömberg R. A method for Sand O- palmitoylation of peptides: synthesis of pulmonary surfactant protein-C models. Biochem J 1999; 343: 557–562. 5. Sachon E, Nielsen PF, Jensen ON. Characterization of N-palmitoylated human growth hormone by in situ liquid-liquid extraction and MALDI tandem mass spectrometry. J Mass Spectrom 2007; 42: 724–734. 6. Linder ME, Deschenes RJ. New insights into the mechanisms of protein palmitoylation. Biochemistry 2003; 42: 4311–4320. 7. Stevenson FT, Bursten SL, Locksley RM, Lovett DH. Myristyl acylation of the tumor necrosis factor alpha precursor on specific lysine residues. J Exp Med 1992; 176: 1053–1062. 8. Pepinsky RB, Zeng C, Wen D et al. Identification of a palmitic acid-modified form of human Sonic hedgehog. J Biol Chem 1998; 273: 14037–14045. 9. Kojima M, Hosoda H, Date Y et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature 1999; 402: 656–660. 10. Takada R, Satomi Y, Kurata T et al. Monounsaturated fatty acid modification of Wnt protein: its role in Wnt secretion. Dev Cell 2006; 11: 791–801. 11. Chopineau J, Robert S, Fénart L e tal. Monoacylation of ribonuclease A enables its transport across an in vitro model of the blood-brain barrier. J Control Release 1998; 56: 231–237. 12. Ekrami HM, Kennedy AR, Shen W-C. Water-soluble fatty acid derivatives as acylating agents for reversible lipidization of polypeptides. FEBS Lett 1995; 371: 283–286. 13. Kabanov AV, Levashov AV, Alakhov VY et al. Fatty acylation of proteins for translocation across cell membranes. Biomed Sci 1990; 1: 33–36. 14. Martins MBF, Jorge JCS, Cruz MEM. Acylation of L-asparaginase with total retention of enzymatic activity. Biochimie 1990; 72: 671–675. 15. Chopineau J, Robert S, Fénart L et al. Physicochemical characterization and in vitro interaction with brain capillary endothelial cells of artificially monoacylated ribonucleases A. Lett Pept Sci 1997; 4:313–321. 16. Robert S, Domurado D, Thomas D et al. Fatty acid acylation of RNAse A using reversed micelles as microreactors. Biochem Biophys Res Commun 1993; 196: 447–454. 17. Foldvari M, Attah-Poku S, Hu J et al. Palmitoyl derivatives of interferon alpha: potential for cutaneous delivery. J Pharm Sci 1998; 87:1203–1208. 18. Martins MBF, Jorge JCS, Cruz MEM. Acylation of L-asparaginase with total retention of enzymatic activity. Biochimie 1990;72: 671–675. 19. Kocevar N, Obermajer N, Strukelj B et al. Improved acylation method enables efficient delivery of functional palmitoylated cystatin into epithelial cells. Chem Biol Drug Des 2007; 69: 124–131. 20. Resh MD. Trafficking and signaling by fatty-acylated and prenylated proteins. Nat Chem Biol 2006; 2: 584–590. 21. Nadolski MJ, Linder ME. Protein lipidation. FEBS J 2007; 274: 5202–5210. 22. Slepnev VI, Phalente L, Labrousse H et al. Fatty acid acylated peroxidase as a model for the study of interactions of hydrophobically-modified proteins with mammalian cells. Bioconjug Chem 1995; 6: 608–615. 23. Fowler SA, Andracki M, Hurst G et al. Prolongation of the intravascular retention of hemoglobin modified with a long-chain fatty acid derivative. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 1994; 22: 27–42. 24. Kurtzhals P, Havelund S, Jonassen I et al. Effect of fatty acids and selected drugs on the albumin binding of a long-acting, acylated insulin analogue. J Pharm Sci 1997; 86: 1365–1368. 25. Shi Q, Domurado M, Domurado D. Effect of protein chemical hydrophobization on antiglucose oxidase immunoglobulin production in mouse. Pharmacol Toxicol 1995; 76: 278–285. 26. Havelund S, Plum A, Ribel U et al. The mechanism of protraction of insulin detemir, a long-acting, acylated analog of human insulin. Pharm Res 2004; 21: 1498–1504. 272 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 273 -^- Razvoj polielektrolitne nanoobloge na mikrodelcih uœinkovine Razvoj polielektrolitne nanoobloge na mikrodelcih uœinkovine Development of polyeleytrolyte nanocoating on drug microparticles Andrej Dolenc, Julijana Kristl Povzetek: Nanooblaganje omogoœa izdelavo obloge z debelino od nekaj deset do nekaj sto nanometrov. Nanooblogo na mikrodelcih ibuprofena smo izdelali z metodo nanoplastenja (plast na plast nanooblaganje), ki temelji na izmeniœni elektrostatski adsorpciji nasprotno nabitih polielektrolitov. Deset- do tridesetplastno nanooblogo smo izdelali z zaporedno izmeniœno adsorpcijo hitosana in alginata. Z merjenjem zeta potenciala delcev smo potrdili nanos posamezne polimerne plasti, obstoj izredno tanke plastne obloge pa po konœanem postopku øe s posnetki optiœnega in vrstiœnega elektronskega mikroskopa. Takøne polielektrolitne obloge lahko uporabimo za spreminjanje povrøinskih lastnosti snovi, kot so izboljøan stik povrøine z bioloøkim materialom, biokompatibilnost ter kontrolirano raztapljanje. Kljuœne besede: ultratanka obloga, metoda nanoplastenja (plast na plast), nanooblaganje, polielektrolit, hitosan, alginat Abstract: Nanolayering can be used to produce a coating with thickness in a range of few tens to hundreds nanometers. Ibuprofen microparticles were used as cores for ultrathin coating produced using a layer-by-layer nanoassembly technique based on electrostatic adsorption of oppositely charged polyelectrolytes. 10- to 30-layered nanocoatings were made by alternating adsorption of chitosan and alginate. Each addition of the oppositely charged polyelectrolyte layer was confirmed by measuring its zeta potential. Optical and scanning electron microscopy were used to ascertain the presence of polyelectrolyte nanocoating. Such coatings can be used to change surface properties to give, for example, better contact with biologic material, higher biocompatibility and controlled dissolution. Key words: ultrathin film, layer-by-layer nanoassembly, nanocoating, polyelectrolyte, chitosan, alginate 1 Uvod Biokompatibilni polimeri imajo veliko vlogo v sodobnem oblikovanju zdravil in øtevilnih medicinskih pripomoœkov. Dobro desetletje jih uporabljajo tudi za izdelavo nanooblog, ki so najmanj 1000-krat tanjøe kot æe dolgo znane filmske obloge. Novejøa metoda za izdelavo nanooblog je nanoplastenje (plast na plast nanooblaganje), ki temelji na zaporedni adsorpciji nasprotno nabitih polimerov na doloœeno nabito povrøino. Metodo je leta 1991 uvedel Decher s sodelavci (1). Vsak korak vodi do tvorbe nove plasti in inverzije naboja. Rezultat je obloga, sestavljena iz veœ plasti, stabiliziranih z moœnimi elektrostatskimi vezmi (slika 1). Debelino obloge lahko s tovrstnim oblaganjem kontroliramo v obmoœju nekaj nanometrov (2-6). Za tvorbo nanoobloge so najprimernejøi polielektroliti, ki se elektrostatsko veæejo na oblaganec. Prvi sloj se veæe neposredno na njegovo povrøino, zato mora le-ta imeti doloœen naboj. Pri oblagancu z manjøo sposobnostjo tvorjenja elektrostatskih interakcij se pri prvih nanosih ojaœa povrøinska funkcionalnost. Na povrøino se veæe plast polielektrolita, ki ima veœ skupin za vezavo naslednje plasti (2-5). Nanooblaganje izvedemo tako, da povrøino oblaganca izmeniœno izpostavljamo raztopinam nasprotno nabitih polielektrolitov (slika 1). Koncentracija polielektrolitov v raztopinah obiœajno znaøa nekaj mg/ml in je velikokrat precej veœja, kot je potrebna za samo oblaganje, vendar s takøno doseæemo hitrejøe prekritje celotne povrøine. Po doloœenem œasu, ki je potreben, da se na povrøino veæe polielektrolitni sloj (obiœajno 10 do 30 min), oblaganec dva- ali trikrat speremo s preœiøœeno vodo, da odstranimo nevezane ter øibko vezane polielektrolitne molekule, ki bi bile moteœe ob dodatku nasprotno nabitega polielektrolita. Oœiøœeno povrøino nato izpostavimo raztopini nasprotno nabitega polielektrolita ter jo po preteku inkubacije ravno tako speremo s preœiøœeno vodo. Cikel ponavljamo tako dolgo, da dobimo oblogo z æelenim øtevilom polielektrolitnih plasti na povrøini, ki jo oblagamo (7, 8, 9). V dobrem desetletju po uvedbi te metode so za oblaganje uporabljali veœ razliœnih snovi. Najveœ raziskav so opravili s polistirensulfonatom, polialilamin kloridom, poliakrilno kislino, polidimetildialilamonijevim kloridom ter polietileniminom. Materiali za farmacevtske namene asist. Andrej Dolenc, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2008; 59 273 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 274 -^- Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles morajo biti biokompatibilni, poleg tega pa je zaæeleno, da so tudi biorazgradljivi. Med primerne polimere za oblaganje uvrøœamo kationske in anionske polielektrolite. Primeri kationskih so: hitosan, æelatina in poli-D-lizin, anionskih pa: karboksimetilceluloza, dekstran sulfat in alginat (2, 5). Obstaja pa tudi moænost uporabe drugih naravnih polimerov z nabojem (npr. ksantan) (10), ter polimerov, ki jih uporabljajo za izdelavo t. i. inteligentnih hidrogelov (za pH, temperaturo, glukozo ali proteine obœutljivi polimeri) (11). Spojine naravnega izvora imajo prednost pred sinteznimi zaradi lahke dostopnosti, nizke cene in relativno majhne toksiœnosti. Poleg tega jih lahko na razliœne naœine modificiramo, da dobimo æelene lastnosti (12). Slika 1: Shematski prikaz nanoplastenja s polielekroliti. Povrøino za oblaganje izmeniœno izpostavljamo raztopinam polianionov (1) in polikationov (3), vmes pa spiramo s preœiøœeno vodo (2, 4) (prirejeno po 7) Figure 1: Schematic illustration of layer-by-layer nanocoating with polyelectolytes. The substrate to be coated is dipped alternately in solutions of polymers with negative (1) and positive charges (3) with intermediate washing cycles (2, 4) (edited from 7). Nanoobloga prispeva h konœni prostornini in masi oblaganca obiœajno le minimalno, medtem ko zaradi spremenjenih povrøinskih lastnosti lahko moœno vpliva na obnaøanje v organizmu (28). Sprva so oblagali predvsem veœje in ravne povrøine, sœasoma pa so tovrstno oblaganje razøirili tudi na povrøine drugaœnih oblik. Z enakomerno in stabilno oblogo so obloæili vsadke, delce uœinkovine, celice ipd. Razvoj odpira øtevilne moænosti za oblikovanje obloge z zelo specifiœnimi lastnostmi, kar øiri obmoœje njihove uporabnosti. Vsadke so najpogosteje oblagali, da bi izboljøali njihovo biokompatibilnost, saj so pogosto izdelani iz snovi s sicer ustreznimi mehanskimi lastnostmi (trdnostjo, elastiœnostjo ipd.), toda telo jih lahko zavrne zaradi neprimernih povrøinskih lastnosti. Tako so obloæili vsadke iz titana (13, 14, 15), silikona (2) ali polietilentereftalata (16, 17, 18, 19) in znotrajæilne æiœne opornice (16, 20, 21). Raziskujejo tudi nanooblaganje kostnih vsadkov z oblogo, v katero so vkljuœili veœ uœinkovin (protivnetne in protiboleœinske uœinkovine, antibiotike ter rastne faktorje), ki se sproøœajo v doloœenem œasovnem zaporedju in tako omogoœajo, da telo najbolj optimalno sprejme vsadek. S to metodo je mogoœe izdelati tudi prazne mikrokapsule z debelino ovojnice v nanometrskem obmoœju in jih napolniti z razliœnimi zdravilnimi uœinkovinami ter tako zagotoviti zaøœito vsebine in njeno prirejeno sproøœanje (6). Na ta naœin so izdelali bioadhezivne oblike za oko s ciprofloksacinom. Delce Ca-fosfata ter eritrocite so uporabili kot jedra, na katera so nanesli 10-plastno nanooblogo, sestavljeno iz polialilamin klorida ter alginata. Nato so obloæene delce inkubirali v 10 % raztopini ciprofloksacin klorida in pod doloœenimi pogoji odstranili jedra. Ugotovili so, da se je uœinkovina v zadostni meri zadræala v polielektrolitni oblogi oz. mikrokapsuli. Nato so z in vivo poskusi na zajcih dokazali, da bi jih lahko uporabili kot varen in uœinkovit sistem s podaljøanim sproøœanjem za dostavo uœinkovine na oko (22). V drugem primeru so na jedra Zn-oksida nanesli nanooblogo, za katero so poleg anionskih polielektrolitov (dekstran sulfata, polistirensulfata) kot kationsko plast uporabili pozitivno nabit aminoglikozidni antibiotik tobraminsulfat. Tudi v tem primeru so odstranili jedra in ugotovili, da bi tudi ta sistem lahko uporabili za kontrolirano dostavo uœinkovine na oko (23). Izjemno tanke polielektrolitne nanoobloge na delcih farmacevtskih uœinkovin je mogoœe uporabiti podobno kot klasiœne obloge za uravnavanje sproøœanja, zaøœito uœinkovine, ciljno dostavo ipd. S polielektrolitno veœplastno oblogo so tako dosegli zadræano sproøœanje mikrodelcev fluoresceina, ibuprofena ter furosemida. Ravnanje z uœinkovinami v obliki delcev mikrometrskih velikosti je dokaj enostavno, saj jih lahko spiramo na filtru ali enostavno loœimo od disperznega medija s centrifugiranjem (2-6, 8, 22). V primerjavi s tradicionalnimi metodami za oblaganje uœinkovin, ima metoda nanoplastenja s polielektroliti naslednje prednosti: - debelino obloge in premer mikro- oziroma nanokapsule je mogoœe izdelati z natanœnostjo nekaj nanometrov; - obloga je lahko sestavljena iz veœ razliœnih snovi, vanjo pa lahko vkljuœimo tudi polimere, lipide, encime, DNK, nanodelce idr.; - obloæiti je mogoœe delce s premerom, primernim za intravensko dajanje; - s pripenjanjem specifiœnih ligandov lahko doseæemo ciljno dostavljanje obloæenih delcev; - za oblaganje uporabimo zelo malo pomoænih snovi (3, 13, 20, 24, 25). Namen naøega raziskovalnega dela je bil pridobiti izkuønje o metodi nanoplastenja (plast na plast nanooblaganja) ter po tej metodi obloæiti mikrodelce ibuprofena s polielektrolitoma hitosanom in alginatom. Proces nanoplastenja smo nadzorovali z merjenjem naboja delcev, nastanek obloge pa smo dokazali tudi s posnetki optiœnega ter vrstiœnega elektronskega mikroskopa. 2 Materiali in metode 2.1 Materiali Ibuprofen (Sigma–Aldrich Chemie, Deisenhofen, Nemœija) je bel kristaliniœen praøek ali v obliki brezbarvnih kristalov. V vodi je praktiœno netopen, dobro topen pa je v acetonu, metanolu in metilen kloridu. Topi se tudi v razredœenih raztopinah alkalijskih hidroksidov in 274 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 275 -^- Razvoj polielektrolitne nanoobloge na mikrodelcih uœinkovine karbonatov. Topnost ibuprofena v vodi je 56 mg/l, v 0,1 M HCl pa pribliæno 36 mg/l. Ibuprofen spada v razred nesteroidnih protivnetnih uœinkovin, po klasifikaciji BCS pa ga uvrøœamo v razred II, kamor spadajo uœinkovine s slabo topnostjo in dobro permeabilnostjo (26). Za izdelavo obloge smo uporabili natrijev alginat (Sigma, Nemœija) ter hitosan (Fluka Chemie GmbH), oba nizke viskoznosti. Hitosan je polisaharid, sestavljen iz kopolimerov glukozamina in N-acetilglukozamina, in ga pridobivajo z deacetiliranjem hitina. Je kationski poliamin z veliko gostoto naboja pri pH manj kot 6,5. Stopnja deacetilacije hitosana je veœja od 80 %. Pristotnost øtevilnih amino skupin omogoœa, da se elektrostatsko poveæe z anionskimi skupinami (27). Alginska kislina je linearen polimer, sestavljen iz dveh uronskih kislin: a-L-guluronske (G) in b-D-manuronske kisline (M). Alginati monovalentnih kationov (Na+, K+, NH4+) so topni v vodi in v njej tvorijo viskozno koloidno raztopino s psevdoplastiœnimi lastnostmi (28). 2.2 Postopek nanooblaganja delcev ibuprofena Nanooblaganje smo izvedli tako, da smo 1 g delcev ibuprofena suspendirali v 40 ml raztopine polielektrolitov s koncentracijo 2 mg/ml, in sicer hitosan v 0,3 % ocetni kislini, alginat pa v preœiøœeni vodi. Nanooblaganje smo zaradi negativnega naboja delcev zaœeli z raztopino hitosana. Suspenzijo smo rahlo stresali 15 minut, da so se polielektrolitne molekule elektrostatsko vezale na povrøino delcev. Nato smo delce od disperznega medija loœili s 5-minutnim centrifugiranjem pri 4000 obratih/min. Disperzni medij nad usedlino smo previdno odstranili ter delce dvakrat redispergirali v preœiøœeni vodi, da smo lahko odstranili nevezane ter øibko vezane polielektrolitne molekule. Po dvakratnem spiranju delcev s preœiøœeno vodo smo jih redispergirali v raztopini polielektrolita z nabojem, nasprotnim od naboja zadnje plasti. Za vsak nanos plasti polielektrolita smo delce redispergirali v sveæe pripravljeni raztopini, saj smo tako zagotovili zadostno koncentracijo polielektrolita. Postopek smo ponavljali toliko œasa, da smo dobili nanooblogo sestavljeno iz æelenega øtevila plasti. 2.3 Vrednotenje nanooblaganja delcev ibuprofena Naboj delcev ibuprofena smo doloœili z aparatom Zetasizer 3000 (Malvern Instruments, Worcestershire, UK). Naboj smo vedno doloœili po dvakratnem spiranju delcev s preœiøœeno vodo, da nevezane oz. øibko vezane polielektrolitne molekule ne bi motile meritev. Nanoobloge na povrøini delcev ibuprofena smo doloœili tudi s posnetki optiœnega mikroskopa (Olympus BX 50F4; Olympus optical Co. ltd, Tokyo, Japonska) in vrstiœnega elektronskega mikroskopa (SEM Supra 35 VP, Carl Zeiss, Nemœija). Pred analizo z optiœnim mikroskopom smo delce omoœili z vodo in jih pokrili s krovnim steklom. Na æeleni poveœavi smo na stik krovnega in objektnega stekla dodali kapljico 1 M raztopine natrijevega hidroksida, ki je difundiral pod krovno stekelce in povzroœil raztapljanje delcev ibuprofena. Delce, ki se v alkalnem mediju raztapljajo, smo posneli pred in med raztapljanjem ter po raztopitvi, ne da bi premikali vidno polje. 3 Rezultati in razprava Delce ibuprofena smo obloæili z deset- do tridesetplastno polielektrolitno nanooblogo (HIT/ALG). Ker molekulska struktura ibuprofena vsebuje karboksilno skupino, je bila povrøina delcev v medijih, v katerih smo izvajali oblaganje, negativno nabita. Tako smo za tvorbo prve plasti nanoobloge uporabili hitosan, ki je pozitivno nabit. Za tvorbo druge plasti smo uporabili alginat, za tretjo zopet hitosan, za œetrto alginat ter tako izmeniœno nadaljevali do æelenega øtevila plasti. Pogoj za uspeøno oblaganje je tudi lastnost, da se delci v medijih z raztopljenimi polielektroliti ne raztapljajo. Naboj neobloæenih delcev ibuprofena je bil -34 mV. Naboj po nanosu prve plasti hitosana je bil 69 mV, po nanosu druge plasti (alginata) pa -24 mV (slika2). Naboj na povrøini je sovpadal z nabojem zadnjega uporabljenega polielektrolita (pozitiven je bil, œe je bila zadnja plast hitosanska, oz. negativen, œe je bila alginatna), zato smo zeta potencial doloœili le po nanosu prvih osem plasti polielektrolitov (slika 2). Slika 2: Zeta potencial obloæenih mikrodelcev ibuprofena s hitosanom (1, 3, 5 in 7) oziroma alginatom (2, 4, 6 in 8) kot zadnjo plastjo polielektrolitne obloge Figure 2: Zeta potential of nanocoated ibuprofen microparticles with chitosan (1, 3, 5 and 7) and alginate (2, 4, 6 and 8) as outstanding polyelectrolyte layers. Naboj na povrøini je bil najveœji po nanosu prve plasti hitosana. Ker je bil naboj neobloæenih delcev ibuprofena dokaj majhen (-34 mV) se je verjetno le manjøi deleæ naboja prve plasti hitosanskih molekul porabil za nevtralizacijo naboja na povrøini, preostali del pa izrazil kot pozitiven naboj na povrøini. Ob vezavi plasti alginatnih molekul se je del naboja porabila za nevtralizacijo naboja hitosanske plasti, zato povrøina alginatne plasti ni bila tako negativno nabita. Po nanosu zaœetnih plasti pa so postala nihanja v naboju bolj enakomerna. Dobljeni rezultati kaæejo podoben trend, kot so jih objavili raziskovalci v literaturi, seveda pa so absolutne vrednosti naboja odvisne od uporabljenih materialov. Na posnetkih obloæenih delcev ibuprofena z optiœnim mikroskopom nismo opazili razlik na povrøini delcev, saj je obloga zelo tanka, poveœava pa sorazmerno majhna za ugotavljanje povrøinskih razlik (slika 3a). Po dodatku 1 M natrijevega hidroksida na rob krovnega stekla so se mikrodelci ibuprofena zaœeli raztapljati, ostala pa je polielektrolitna obloga (slika 3b, 3c). NaOH smo uporabili, ker je ibuprofen dobro topen v alkalnem, slabo pa v vodi oz. v kislem farm vestn 2008; 59 275 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 276 -^- Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles mediju. Æe med samim raztapljanjem jeder (slika 3b), predvsem po njihovi popolni raztopitvi, smo opazili ovojnice oziroma obloge okrog mikrodelcev ibuprofena, ki so ostale vidne tudi po raztopitvi jedra in so zadræale obliko mikrodelcev (slika 3c). V nekaterih primerih smo opazili skrœenje obloge. Potrdili smo, da je obloga stabilna in se ne raztaplja niti v baziœnem mediju. Obloga je ravno tako stabilna v kislem kot nevtralnem mediju, saj smo v obeh izvajali oblaganje. Posnetki neobloæenih in obloæenih delcev ibuprofena z vrstiœnim elektronskim mikroskopom (SEM) so prikazani na sliki 4(a-c). Debeline obloge iz SEM posnetkov je teæko natanœno doloœiti, vidno pa je, da je obloga res izjemno tanka. Iz posnetkov smo ocenili, da je tridesetplastna nanobloga debela 100-200 nm, kar je v skladu z literaturnimi podatki, kjer avtorji navajajo, da je debelina ene plasti 2 do 6 nm, odvisna pa je od uporabljenih polimerov (3, 15, 21, 22). Na posnetkih obloæenih delcev smo opazili luknjasto povrøino (slika 4b, 4c). Sklepamo, da pred SEM slikanjem povrøina ni bila poøkodovana, saj se je øtevilo poøkodb veœalo med daljøim opazovanjem vzorca s SEM mikroskopom. Oœitno tako tanke obloge ne prenesejo dolgotrajnejøe izpostavljenosti elektronom v tovrstnem mikroskopu. Opazili smo, da je poøkodb pri 10-plastni oblogi veœ (slika 4b) ter se pojavljajo hitreje kot pri 30-plastni (slika 4c), kar je ravno tako posledica tanjøe obloge. 4 Sklep Nanoplastenje (plast na plast nanooblaganje) s polielektroliti je metoda, s katero lahko izdelamo zelo tanko oblogo na povrøinah razliœnih velikosti in oblik. Za izdelavo obloge sta potrebni dve polimerni spojini z nasprotnim nabojem, ki se izmeniœno veæeta na povrøino, ki jo oblagamo. Postopek nanooblaganja lahko spremljamo z vmesnim doloœanjem zeta potenciala na povrøini delcev, po konœanem oblaganju pa s posnetki optiœnega in vrstiœnega Slika 3 (a-c): Posnetki obloæenih delcev ibuprofena z 20-plastno polielektrolitno oblogo z optiœnim mikroskopom. Na sliki a vidimo delce ibuprofena z 20-plastno nanooblogo pred zaœetkom raztapljanja v 1 M NaOH. Slika b prikazuje æe delno raztopljene delce, kjer so æe vidne tudi polielektrolitne obloge, na sliki c pa so delci ibuprofena æe popolnoma raztopljeni in je vidna samo øe polielektrolitna obloga, ki je ohranila obliko in velikost delcev. Merilo na posnetku predstavlja 20 mm. Figure 3 (a-c): Optical microscope images of ibuprofen particles with 20 polyelectrolyte layers. a Ibuprofen before dissolution in 1 M sodium hydroxide solution. b Partially dissolved particles with a visible residue of polyelectrolyte coating. c Ibuprofen particles totally dissolved leaving only the polyelectrolyte multilayer. The polyelectrolyte multilayer kept the size and the shape of the particles. Size bar represents 20 mm. Slika 4 (a-c): SEM posnetki neobloæenih delcev ibuprofena (a) ter delcev, obloæenih z 10 ((HIT/ALG)5) (b) oziroma 30 plastmi polielektrolitov ((HIT/ALG)15) (c). Merilo predstavlja 20 mm (a, b) oz. 2 m (c). Figure 4 (a-c): SEM images of (a) uncoated ibuprofen particles, (b) particles coated with 10 polyelectrolyte layers ((HIT/ALG)5), or (c) 30 polyelectrolyte layers ((HIT/ALG)15) (c). Size bars represent 20 mm (a, b) and 2 m (c). 276 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 277 Razvoj polielektrolitne nanoobloge na mikrodelcih uœinkovine elektronskega mikroskopa doloœimo obliko, debelino, homogenost in stabilnost. Nanooblaganje mikrodelcev ali veœjih povrøin ni posebno zahteven postopek. Zahtevnejøe je oblaganje nanodelcev, predvsem zaradi njihovega loœevanja od disperznega medija in stabilnosti tovrstnih sistemov. Oblaganje nanodelcev za parenteralno dajanje zaradi poveœanja biokompatibilnosti ter za ciljano dostavo uœinkovine pa pomeni poseben izziv za raziskovanje v prihodnosti. 5 Literatura 1. Decher G, Hong JD. Buildup of ultrathin multilayer films by a self-assembly process: I. consecutive adsorption of anionic and cationic bipolar amphiphiles. Makromol Chem, Macromol Symp, 1991; 46: 321-327. 2. Ai H, Meng H, Ichinose I in sod. Biocopatibility of layer-by-layer self-assembled nanofilm on silicone rubber for neurons. J Neurosci Meth, 2003; 128: 1-8. 3. Ai H, Jones SA, de Villiers MM in sod. Nano – encapsulation of furosemide microcrystals for controlled drug delivery. J Contr Rel, 2003; 86: 59-68. 4. Qiu X, Leporatti S, Donath E in sod. Studies on the drug release properties of polysaccharide multilayers encapsulated ibuprofen microparticles. Langmuir, 2001; 17; 5375-5380. 5. Antipov AA, Sukhorukov GB, Donath E in sod. Sustained release properties of polyelectrolyte multilayer capsules. J Phys Chem B, 2001; 105: 2281-2284. 6. Homar M, Kristl J. Nanooblaganje – moænosti in prednosti. V: Nanotehnologija v farmaciji. Ljubljana: Slovensko farmacevtsko druøtvo, 2004; p. 65-79. 7. Decher G. Fuzzy nanoassemlies: Toward layered polymeric multicomposites. Science, 1997; 277: 1232-1237. 8. Moya S, Donath E, Sukhorukov GB in sod. Lipid coating on polyelectrolyte surface modified colloidal partices and polyelectrolite capsules. Macromolecules, 2000; 33: 4538-4544. 9. Zahr AS, de Villiers M, Pishko MV. Encapsulation of drug nanoparticles in self-assembled macromolecular nanoshells. Langmuir, 2005; 21: 403-410. 10. Baumgartner S, Pavli M, Kristl J. Effect of calcium ions on the gelling and drug release characteristics of xanthan matrix tablets. Eur J Pharm Biopharm, 2008; 69 (2): 698-707. 11. Abramoviå Z, Kristl J. Inteligentni hidrogeli za dostavo zdravilnih uœinkovin. Farm Vestn, 2004; 55: 555-563. 12. Bhardwaj TR, Kanwar M, Lal R in sod. Natural gums and modified natural gums as sustained – release carriers. Drug Dev Ind Pharm, 2000; 26 (10): 1025-1038. 13. van den Beucken JJJP, Vos MRJ, Thune PC in sod. Fabrication, characterization and biological assessment of multilayered DNA-coatings for biomaterial purposes. Biomaterials, 2006; 27: 691-701. 14. Cai K, Rechtenbach A, Hao J in sod. Polysaccharide-protein surface modification of titanium via a layer-by-layer technique: characterization and cell behaviour aspects. Biomaterials, 2005; 26: 5960-71. 15. Schultz P, Vautier D, Richert L in sod. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, -MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials, 2005; 26: 2621-30. 16. Dolenc A, Homar M, Gaøperlin M, Kristl J. Z nanooblaganjem do izboljøanja biokompatibilnosti vsadkov. Med Razgl, 2006; 45: 411-420. 17. Fu J, Ji J, Yuan W in sod. Construction o anti-adhesive and antibacterial multilayer films via layer-by-layer assembly of heparin and chitosan. Biomaterials, 2005; 26: 6684-6692. 18. Boura C, Menu P, Payan E in sod. Endothelial cells grown on thin polyelectrolyte multilayered films: an evaluation of a new versatile surface modification. Biomaterials, 2003; 24: 3521-30. 19. Liu Y, He T, Gao C. Surface modification of poly(ethylene terephthalate) via hydrolysis and layer-by-layer assembly of chitosan and chondroitin sulfate to construct cytocompatible layer for human endothelial cells. Colloids Surf B Biointerfaces, 2005; 46: 117-26. 20. Thierry B, Winnik F M, Merhi Y in sod. Bioactive coatings of endovascular stents based on polyelectrolyte multilayers. Biomacromol, 2003; 4: 1564-1571. 21. Yang SY, Seo JY. Cellular interactions on nano-structured polyelectrolyte multilayers. Colloids and Surfaces A: Physicochem Eng Aspects, 2008; 313-314: 526-529. 22. Bhadra D, Gupta G, Bhadra S in sod. Multicomposite ultrathin capsules for sustained ocular delivery of ciprofloksacin hydrochloride. J Pharm Pharmaceut Sci, 2004; 7(2): 241-251. 23. Khopade AJ, Arulsudar N, Khopade SA in sod. Ultrathin antibiotic walled microcapsules. Biomacromolecules, 2005; 6: 229-234. 24. Haidar ZS, Hamdy RC, Tabrizian M. Protein release kinetics for core–shell hybrid nanoparticles based on the layer-by-layer assembly of alginate and chitosan on liposomes. Biomaterials, 2008; Vol 29: 1207-1215. 25. Liu L, Chen Z, Yang S in sod. A novel inhibition biosensor constructed by layer-by-layer technique based on biospecific affinity for the determination of sulfide. Sensors and Actuators B, 2008; 129: 218-224. 26. Kocbek P, Baumgartner S, Kristl J. Preparation and evaluation of nanosuspensions for enhancing the dissolution of poorly soluble drugs. Int J Pharm, 2006; 312: 179-186. 27. Kristl J, Ømid-Korbar J, Øtruc E in sod. Hydrocolloids and gels of chitosan as drug carriers. Int J Pharm, 1993; 99: 13-19. 28. Rowe RC, Sheskey JP, Weller JP in sod. Handbook of pharmaceutical excipients, 4th edition, 2003: 16-18, 132-135. farm vestn 2008; 59 277 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 278 -^- Novice iz sveta farmacije Novice iz sveta farmacije dr. Andrijana Tivadar, dr. Petra Slane Može, Marjetka Smolej, dr. Bojan Doljak, prof. dr. Borut Štrukelj Ali nesteroidni antirevmatiki zmanjøajo tveganje za nastanek raka dojk? Bojan Doljak Glede na zakljuœke meta-analize 38 kliniœnih øtudij, v katerih je sodelovalo veœ kot pol tretji milijon bolnic, je odgovor na naslovno vpraøan-je pritrdilen. Najveœja tovrstna øtudija do sedaj je namreœ potrdila, da nesteroidni antirevmatiki signifikantno zmanjøajo tveganje za nastanek raka dojk. Nesteroidni antirevmatiki kot skupina tveganje zman-jøajo za 12 %, posebej pa sta izpostavljeni uœinkovini acetilsalicilna kislina (13 %) ter ibuprofen (21 %). Do sedaj ni bilo enotnega mnenja glede zaøœitnih uœinkov nesteroid-nih antirevmatikov. Znano je sicer, da nesteroidni antirevmatiki zman-jøajo tveganje za nastanek kolorektalnega raka, medtem ko so si podatki glede tveganja za nastanek raka dojk nasprotujoœi. Izsledki te meta-analize se sicer skladajo z izsledki nekaterih manjøih meta-anal-iz, vendar rezultati posameznih kliniœnih øtudij niso bili vedno konsistentni. Razlog tiœi verjetno v mehanizmu delovanja nesteroidnih anti-revmatikov, preko katerega delujejo zaøœitno pred rakom dojk, npr. razliœna izraæenost ciklooksigenaze 2 v nekaterih normalnih in rakavih tkivih. Pri tem je vsekakor pomembna tudi selektivnost nesteroidnih antirevmatikov, zlasti koksibov, ki jo izkazujejo do ciklooksigenaze 1 in ciklooksigenaze 2. Rezultati najnovejøe øtudije øe ne pomenijo, da bi za zmanjøevanje tveganja bilo priporoœljivo jemanje teh zdravil kot samostojne indikacije. Resni neæeleni uœinki, kot so krvavitve v gastrointestinalnem traktu, so dovolj velik razlog za to, da uporaba nesteroidnih antirevmatikov (samo) za preventivo raka dojk ni priporoœljiva. Pri bolnicah, ki jemljejo nesteroidne antirevmatike za lajøanje drugih teæav, pa je tveganje najverjetneje res manjøe. Vir: Journal of the National Cancer Institute, 7. oktober 2008. Vprašljiva ucinkovitost rimonabante. Borut Štrukelj Zdravilo z zdravilno uœinkovino rimonabant je registrirano v Evropski skupnosti od junija 2006. Rimonabant je antagonist kanabinoidnih receptorjev. Deluje tako, da blokira specifiœno vrsto receptorjev, in sicer kanabinoidne receptorje tipa 1. Ti receptorji se nahajajo v æivœnem sistemu in so del sistema, ki ga telo uporablja za nadzor vnosa hrane. Receptorji se nahajajo tudi v adipocitih. Zdravilo je izkazalo uœinkovitost pri zmanjøanju telesne mase pri bolnikih s œezmerno telesno maso, pri katerih obstajajo dodatni dejavniki tveganja, kot so diabetes tipa 2 ali dislipidemija. Neæeleni uœinki, ki so bili med øtudijami najpogosteje opaæeni, so bili navzeja in okuæbe zgornjih dihal. Zdravilo lahko poveœa tveganje za depresijo in pri majhnem øtevilu bolnikov povzroœi samomorilne misli. V obseæni kliniœni raziskavi, ki je zaobjemala œez 7000 bolnikov s prekomerno telesno maso, so ugotovili, da se po enoletnem jemanju rimonabanta v povpreœju telesna masa zmanjøa za 4,9 kg. Prvotno so sicer uœinkovi-no razvijali kot pomoœ proti odvajanju kajenja, a so bili rezultati klin-iœnih raziskav neznaœilni v primerjavi s placebo skupino, zato so nadaljevali raziskave v smeri razvoja uœinkovine za pomoœ pri zman-jøevanju prekomerne telesne mase. Po skrbnem pregledu spremljanja neæelenih uœinkov, ki jih povzroœa rimonabant, so ugotovili, da je pogostost psihiatriœnih teæav, ki vkljuœuje depresivna stanja, pri bolnikih, ki so jemali rimonabant, skoraj dvakrat veœja, kot pri kontrolni skupini. Na osnovi tega in glede na relativno majhno zmanjøanje telesne mase skozi daljøi œas, se je EMEA na oktobrski seji (20.–23. oktober 2008) odloœila predlagati previdnost pri predpisovanju. Bolniki, ki jemljejo rimonabant, naj se posvetujejo z zdravnikom ali farmacevtom, ki bo na osnovi rezultatov odloœil, ali z zdravljenjem nadaljevati ali ne. Vir: EMEA Latest Press Release/ 22.10.2008 278 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 279 -^- Novice iz sveta farmacije Poroœilo s 63. svetovnega kongresa Liga Medicorum Homeopathica Internationalis (LMHI) v Belgiji. Report from 63th Liga Medicorum Homeopathica Internationalis (LMHI) in Belgium Maruša Hribar 63. svetovni kongres (LMHI) je potekal v Oostendu v Belgiji med 20. in 24. majem 2008. Konferenca je zbrala na enem mestu strokovnjakinje in strokovnjake s podroœja medicine, farmacije in homeopatije. Letoønja tema je bila: »Homeopatija, z dokazi podkrepljene øtudije- veœ kot dvojno slepe øtudije!«. Kot je navedel v predgovoru predsednik kongresa Michel Van Wassenhoven je Belgija v preteklosti æe organizirala homeopatske kongrese (leta 1856, 1913, 1953 in leta 1972). Ta kongres je prejel prviœ podporo Nacionalnega fonda za znanstvene raziskave v Belgiji, prav tako je prviœ sprejeta uradna medicinska akreditacija za homeopatski kongres. Na kongresu so sodelovali znanstveniki in znanstvenice iz 40-ih dræav. Navajam nekaj izvleœkov posameznih predstavitev. Œeprav se Evropa geopolitiœno zdruæuje, je vseeno med dræavami œlanicami precejønja razlika kar zadeva homeopatijo in tudi sicer implementacijo komplementarnih oblik zdravljenja v dræavne in zasebne prakse zdravljenja. Pomemben predavatelj kongresa je bil vsekakor Ton Nikolai, predsednik Evropskega homeopatskega komiteja (ECH - European Homeopathy Comitee). Predstavil je najnovejøe podatke o razvoju in integraciji komplementarne medicine v evropske sisteme zdravljenja. Ta proces je dozorel za predstavitev politiœnim krogom, saj kar 65% prebivalk in prebivalcev v Evropi posega po razliœnih oblikah komplementarnega zdravljenja. Zato bo potrebno tudi nadaljnje financiranje raziskav uœinkov takønega zdravljenja ter ustrezna zakonska regulativa, ki upoøteva specifiœnost takønih procesov zdravljenja. Nikolai je posredoval tudi podatek, da se je v zadnjem letu 150.000 sploønih zdravnikov in zdravnic v EU odloœilo dopolniti naœin biomedicinskega zdravljenja z dodatno komple -mentarno metodo (najpogostejøe so akupunktura, homeopatija ter antropozofska medicina oziroma naturopatija). Ker gre za v praksi zdravljenja za dvosmerni odnos med tistim/tisto, ki zdravi in tistim/tisto, ki sprejema napotke, so odjemalci in odjemalke izrazili nezadovoljstvo z neuœinkovitostjo in toksiœnostjo nekaterih procesov konven -cionalnega zdravljenja, ter predvsem pomakanjem œasa za obravnavo pacientov kot celostnih osebnosti. Nikolai je poudaril, da komplementarni naœini zdravljenja vkljuœujejo iskanje optimalnega stanja œloveka na razliœnih nivojih (telesno, mentalno, emocionalno, socialno, duhovno) in ne le sanacijo doloœenega simptoma. S tem namenom so v EU pripravili program za odjemalce in odjemalke komplementarnih praks, ki bo potekal od 2008 do 2013. Ugledni homeopat Christian Boiron, ki je hkrati tudi ustanovitelj in predsednik Boironovih laboratorijev se je dotaknil podroœja same homeopatije, ki na slovenskih tleh nima stoletne tradicije kot na primer v Belgiji (z veœ kot 200 letno tradicijo v homeopatiji), Franciji, Angliji ali Nemœiji, ZDA, Argentini ali Indiji . Kajti v tem œasu so se po svetu razvili razliœni pristopi in naœini znotraj same homeopatije. Poudaril je kljuœen pomen nadaljnjih raziskav ne glede na razliœne øole homeopatije za temeljno razumevanje tega naœina zdravljenja pri strokovnih in sploønih javnostih. Kot je poudarila øe direktorica Boironovih laboratorijev Marie Bordet so moæni razliœni naœini raziskovanja homeopatije: temeljne raziskave, ki pomagajo razumeti in razlagati zakaj visoko-stopenjske razredœitve uœinkujejo; kliniœne raziskave, ki ugotavljajo terapevtske uœinke homeopatskih pripravkov ter farmako-epidemoloøke raziskave, ki prikazujejo vpliv na javno zdravstvo in vpliv homeopatskih zdravil na stroøke zdravljenja. Profesor Louis Rey je predstavil vpogled v fizikalne lastnosti ultra visokih razredœitev. Klasiœen oœitek znanosti je namreœ bil, da visoko stopenjske razredœitve niso uœinkovite. To vsekakor predstavlja izziv sodobni fiziki, ki je napredovala v svojih specifiœnih raziskovalnih metodah. Posebnost so namreœ molekule vode, ki v svoji tekoœi obliki tvorijo dimere, oligomere in celo najkompleksnejøe polimere zaradi zmoænosti gradnje vodikovih vezi. Torej voda v tekoœem stanju ni homogena tekoœina ampak dinamiœen skupek aktivnih oligomerov, polimerov in skupkov v konstantnem gibanju in v stalni odvisnosti od temperature, tlaka ter magnetnega in elektriœnega polja. Tako s postopkom izjemne razredœitve postane prav struktura tista, ki doloœa spojino. Nuklearna paramagnetiœna resonanca je prva tehniœna naprava, ki kaæe, da imajo ultra visoke razredœitve posebno strukturo, ki je specifiœna glede na izvorno substanco iz katere je bila pripravljena. Kalorimetrija in elektriœna konduktivnost sta te izsledke farm vestn 2008; 59 279 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 280 Novice iz sveta farmacije potrdila, kakor tudi nizko temperaturna termolumiscenca, ki je pokazala enake zakljuœke. Navajam prevod povzetka predavanja dr. Petra Fisher-ja, direktorja kliniœnega oddelka Kraljeve homeopatske bolnice v Londonu (Royal London Homoeopathic Hospital) in osebnega zdravnika britanske kraljice z naslovom »Raziskave v homeopatiji: Kdo jih potrebuje?«.Kajti v zadnjem œasu so se pojavljali pomisleki, da homeopatija odteguje sredstva za konvencionalna zdravljenja. Njegov namen je bil predvsem predstaviti znanstvene dokaze o homeopatiji in podati nadaljnja priporoœila v zvezi z raziskavami. Raziskava je namreœ metoda za odgovor na vpraøanja, seveda je odvisno kdo to vpraøanje zastavlja (zdravniki konvencionalne medicine, nekateri skeptiœni znanstveniki, plaœniki npr. zava -rovalnice..). Vsi øtirje obøirni pregledi randomiziranih kontroliranih raziskav (RKR) homeopatije kaæejo na ugotovitev, da se homeopatija verjetno razlikuje od placeba. Sistematiœni pregledi RKR s specifiœnim fokusom na podroœja medicine, ki so se pozitivno odzivala na homeopatijo v 10-ih primerih, neodloœno v 8ih in negativno v 5-ih. Prezentacija Shanga in sodelujoœih, objavljena v Lancet-u leta 2005 je vkljuœevala meta-analizo, vendar ni pomenila sistematiœnega pregleda. 134 RKR je bilo objavljenih v strokovni literaturi do konca leta 2007. V smislu statistiœno relevantnih raziskav, so bili pozitivni uœinki homeopatije potrjeni v 59 poizkusih (44% odstotkov vseh), negativni rezultati v 8 (6%), medtem, ko je bilo 67(50%) neodloœenih. Kliniœni dokazi potrjujejo uœinkovitost homeopatije v primeru alergij in vnetju zgornjih respiratornih poti, otroøke diareje, zdravljenju influence, migrene, osteoartritisa in drugih revmatskih obolenj, post-operativni ileus, sezonsko pogojenem alergiœnem rinitisu. Kontrolirane, nenakljuœne raziskave, stroøkovno uœinkovite in opazovalne øtudije univerzalno potrjujejo da veœina pacientov in pacientk poroœa o kliniœnem izboljøanju s terapijo homeopatskega zdravljenja. Kar nam sporoœa, da integracija homeopatskega zdravljenja v primarnem medicinskem zdravljenju ustvarja boljøe rezultate s pribliæno enakimi stroøki. Øtevilni pacienti in pacientke uporabljajo homeopatijo zaradi nezaæelenih uœinkov pri drugih zdravljenjih. Poglavitni dvom v homeopatiji je uporaba visokih razredœin, vkljuœujoœ ultra-molekularne razredœine. Avogadrova konstanta, øtevilo delcev (atomov ali molekul) v molu substance je v rangu 10 23. V homeopatski terminologiji 1023 pomeni 23 X oziroma razredœitev 12 C. Homeopatska zdravila, ki so razredœena nad 12 C teoretiœno ne vsebujejo materialne sledi izvorne substance. Z dokazi fizika potrjuje specifiœne strukturne modifikacije vode, ki je bila inducirana skozi homeopatski proces priprave, za katero je moæno, da shranjuje informacije. Homeopatija se pogosto uporablja, pa vendar so raziskave, kljub njeni opazni pozitivni uœinkovitosti, malo øtevilœne. Kaæe se tudi verjetna pozitivna uœinkovitost homeopatskih zdravil pri astmi, pred-menstrualnih teæavah, za sindrom hiperaktivnosti (ADHD), pri sindromu kroniœne utrujenosti, post-partum krvavitvah, sepsi, stomatitisu, in simptomih, ki se pojavijo pri zdravljenju radio in kemoterapije. Hkrati vas obveøœamo, da Homeopatska Sekcija pri Slovenskem farmacevtskem druøtvu v okviru mednarodnega izobraæevanja napoveduje prihod priznane strokovnjakinje s podroœja homeopatije Dr. Dominique Cado Leclercq, ki bo predavala v okviru francoskega centra za izobraæevanje in razvoj homeopatije (CEDH). Tema predavanja bo homeopatski pristop zdravljenja psihiœnih teæav. Predavanje bo potekalo na Fakulteti za farmacijo v Ljubljani, v soboto 22 novembra 2008. Veœ informacij: spletna stran Sekcije za homeopatijo ali e-poøta: marusa.hribar@email.si 280 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 281 -^- Osebne vesti V spomin Mag. STANISLAVI ŒERNE, roj. Odar, mag. farm. specialistka medicinske biokemije 29. 10. 1937 – 29. 5. 2008 Sredina novembra, kratek dan. V uri, ko se je neprijazno popolde zaœelo preveøati v veœer, je na prehodu za peøce mlad voznik zbil æensko, ki je ravnokar priøla z radovljiøke poøte. S hudimi poøkodbami glave so jo prepeljali v bolniønico na Jesenice. Suhi œasopisni zaznamek.... A izkazalo se je, da je bila ponesreœenka Stanka, »naøa magistra«, nekaterim soøolka in øtudijska kolegica, drugim poklicna sodelavka v zdravstvu, predstojnica pa prijateljica, æena in mati, vse s predanostjo in s sposobnostjo væivljati se v soœloveka! Zaœel se je njen boj za ozdravitev po hudih, zahrbtnih posledicah nesreœe. Kako smo bili veseli, ko se je po dobrem mesecu prebudila iz kome! Med leæanjem v bolniøki postelji, muœnem za njenega dejavnega duha, si je zelo æelela obiskov in se je z nami, ki smo prihajali k njej, rada pogovarjala. Obœudovali smo njeno potrpeæljivost in ljubeznivost. Nekaj œasa je zdravljenje napredovalo, nato se je zaœelo zapletati. Ona in mi pa smo øe vedno upali. Vendar nas je v trenutku, ko tega nismo priœakovali, spokojno zapustila. Od prvega junija tega leta poœiva ob svojem sinu na radovljiøkem pokopaliøœu. Magistrin rod ima korenine v Bohinju, grob pokojnih starøev je redno obiskovala v Bohinjski Bistrici. Sama je bila rojena na Jesenicah. Po gimnaziji v rodnem mestu je 1957 priœela øtudirati farmacijo, prva dva letnika na tedaj øe nepopolnem farmacevtskem oddelku Prirodoslovno - matematiœne fakultete v Ljubljani, v tretjem letniku je bila prisiljena nadaljevati øtudij na Farmacevtski fakulteti v Zagrebu. Proti koncu øtudija se je æe usmerila v medicinsko biokemijo. Po diplomi januarja 1963 v Zagrebu se je prvega februarja zaposlila kot vodja tedaj priroœnega laboratorija v Sploøni bolniønici Jesenice. Med vso svojo delovno dobo je v tej ustanovi vodila laboratorijsko dejavnost. Strokovni izpit je opravila v Ljubljani 1965. Dovoljeno ji je bilo zaœeti specializacijo iz medicinske biokemije v drugi generaciji specializantov. Po predavanjih, pripravljenih za to skupino, je 22. novembra 1972 opravila specialistiœni izpit. Poroœila se je 1966 in podarila æivljenje dvema sinovoma. Œez nekaj let je druæina pognala nove bivanjske korenine v Radovljici. Preden je magistra Stanka priøla v jeseniøko bolniønico, je laboratorij spadal pod interni oddelek; vodil in nadzoroval ga je predstojnik tega bolniøkega oddelka. Za laboratorij je bil na voljo samo en prostor. V njem so delale priuœene bolniœarke, posveœale so se le hematoloøkim in urinskim ter redkim biokemiœnim preiskavam. Veœino biokemiœnih doloœitev so naroœati v Ljubljani - v poslanem bioloøkem materialu. Z nastavitvijo magistre Stanke Odar se je stanje priœelo izboljøevati. Laboratorij je postal samostojna enota, in ko so œez œas pridobili øe dve sobi, so bili tudi delavci v njem manj utesnjeni. Prihajati so zaœeli øolani tehniki. Magistra je vestno bedela nad tem, da so analizne metode izboljøevali in vpeljevali nove; s pospeøenim uvajanjem biokemiœnih analiz so postajali vse manj odvisni od drugih laboratorijev. Okrog leta 1970 so se preimenovali v centralni laboratorij. Nato je bolniønica priœela zidati novo stavbo in v gradbene naœrte zajela tudi nov, moderen laboratorij s sodobnim, prostornim tlorisom. Preselitev iz dotedanjih nekaj prostorov v novozgrajeno laboratorijsko enoto 8. avgusta 1980 je olajøala delo ter omogoœila razvoj in strokovno øirjenje, æal pa ob preselitvi øe ni bilo denarja za sodobne aparature. Ob hitrem naraøœanju øtevila in vrst preiskav, ki mu s tedanjim veœinoma roœnim delom niso mogli veœ zadovoljivo slediti, je bilo treba priskrbeti polavtomatske in avtomatske biokemiœne in hematoloøke analizatorje. V bolniønici je bilo æelja vedno veœ kot moænosti, zato je bilo treba iskati sponzorje. V laboratoriju so zaœeli nakupovati potrebne sodobne analizatorje od leta 1985 naprej. Ob pestrem vsakdanu na delovnem mestu pa ob reøevanju teæav, ki so zahtevale veœ œasa in daljnoseænejøi pogled naprej, je magistra Œerne øe naøla œas, da je na srednji zdravstveni øoli na Jesenicah 10 let pouœevala mikrobiologijo (vse do leta 1982). Vpisala se je tudi na podiplomski øtudij iz medicinske biokemije. Magistrirala je na farmacevtski fakulteti v Ljubljani 22. oktobra 1991 s temo Primerjalna analiza nivojev kortizola in beta endorfina v serumu pred obremenitvijo in po obremenitvi œloveøkega organizma s psihofiziœnim stresom. Magistra je tudi nenehno skrbela za nove strokovne moœi, za poglabljanje znanja pri sodelavcih ter za njihovo napredovanje. Upokojila se je prvega avgusta 1994. Nato je pogumno zaœela postavljati na noge manjøi zasebni laboratorij; to je zdravstvena zakonodaja takrat æe dovoljevala. Naœrtovala je doloœevanja nekaterih encimov, hormonov, zdravil in drugih snovi v telesnih tekoœinah z imunokemijskimi tehnikami po postopku suhe kemije; za to potrebni analizator so imeli takrat le redki laboratoriji v Sloveniji. Magistra je z vztrajnostjo premagala birokratske ovire in priœela z zamiøljenimi preiskavami. Œez kratek œas je morala zaradi denacionalizacije izseliti laboratorij iz stavbe na Bledu; preselila ga je v Radovljico. Na koncu leta 1996 je v njeno æivljenje zasekala tragiœna smrt drugorojenca. Od takrat je æivela le za svojo druæino. Ena pomembnejøih stvari v poklicnem æivljenju magistre Œerne je bilo njeno dolgoletno œlanstvo v Slovenskem farmacevtskem druøtvu (SFD). Kmalu po prihodu v bolniønico na Jesenice je vstopila v sekcijo, t.j. kasnejøe Zdruæenje medicinskih biokemikov pri takratnem farmacevtskem druøtvu. Povezanost s kolegi iz iste stroke ji je pomenila moœno oporo. Iz predavanj uglednih medicinskih biokemikov na strokovnih sreœanjih so œrpali napotke, v pogovorih farm vestn 2008; 59 281 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 282 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles Osebne vesti pred in po teh sestankih so si izmenjevali izkuønje. Tako so laæje premagovali teæave in sprejemali odloœitve v stroki. Dvakrat zapored je bila magistra izvoljena v odbor sekcije medicinskih biokemikov farmacevtskega druøtva: v mandatu od maja 1977 do novembra 1979 kot œlanica (poverili so ji pisanje zapisnikov sej odbora in letnih obœnih zborov), nato do oktobra 1981 kot blagajniœarka Zdruæenja. Pred praznovanjem 20-letnice ustanovitve sekcije medicinskih biokemikov pri Farmacevtskem druøtvu Slovenije je leta 1981 sodelovala v odboru za proslavo tega jubileja. Od takrat øe maloøtevilnih specialistov medicinske biokemije na Gorenjskem je bila magistra proti koncu 1977 imenovana v prvi strokovni kolegij kliniœnih in biokemiœnih laboratorijev republike Slovenije. Œlanstvo v tem republiøkem telesu se ji je izteklo leta 1987. Naj dodamo øe spomin na nepozaben dan, ki smo ga kolegi preæiveli z magistro Stanko Œerne pred triindvajsetimi leti v jeseniøki bolniønici ter na prostem sredi lepot gorenjskih ravnin pod mogoœnim Stolom. Obujamo ga, da bi mlajøim kolegom odstrli tanœico, ki jo je œez osebnost pokojne kolegice spletel œas. Odbor Zdruæenja medicinskih biokemikov pri SFD je sklenil, da se bodo njegovi œlani iz vse Slovenije zbrali 19. junija 1985 na strokovnem sestanku zunaj Ljubljane - na Gorenjskem. Najveœ dela za odmevno sreœanje je kot gostiteljica domaœinka prevzela in opravila magistra Œerne sama, v bolniønici in zunaj nje. Odloœila se je, da bo poskrbela za dopolnitev in popestritev dneva: po strokovnih temah iz kliniœne biokemije naj bi se udeleæencem pribliæale tudi kulturnozgodovinske vrednote dela Gorenjske, kamor smo bili povabljeni. Tako smo dopoldne v jeseniøki bolniønici najprej delavno zasedali œlani æe omenjenega republiøkega strokovnega kolegija pod vodstvom prof. dr. Nika Jesenovca. Popoldne je v bolniøniœni dvorani stekel program za œlane Zdruæenja z osrednjim predavanjem prof. dr. Jane Lukaœ Bajalo; predstavila je svojo pred kratkim zagovarjano magistrsko nalogo. Po sestanku je sledila ne le izbrana pogostitev, ampak so nas povabili øe v Vrbo, kraj »svet'ga Marka«. V Preøernovi rojstni hiši so okoliški kulturni delavci imeli za nas poseben umetniški nastop. Pospremljeni smo bili tudi po poti kulturne dedišcine do osnovne šole v Zabreznici; dohod obrobljajo bronasti portreti zaslužnih mož s tega košcka Gorenjske - Prešerna, Copa, Finžgarja, Jalna in Antona Janše. Magistra Stanka je z vso zavzetostjo uredila, da smo se srecali tudi s pionirjema medicinske biokemije pri nas, z zakoncema Žemva. Magistra Marija in doktor Miha Žemva sta se, kot navadno v tem casu, mudila v svoji pocitniški hišici na Bledu skrenega povabila magistre Cerne na Jesenice in v Vrbo res nista mogla zavrniti; tako sta z obiskom veselo presenetila svoje nekdanje kolege in ucence ter s svojo pripovedjo dodala družabnemu delu novo vrednoto. Ta zgodnjepoletni dan nam je ostal v posebnem spominu. Potem ko smo resno opravili strokovne naloge, je gostiteljica s sodelavci nevsiljivo zaposlila naše misli in custva z nizanjem dogodkov in z zanimivostmi z drugih podrocij. S tem se je pritisk poklicnih dolžnosti na nas prijetno zrahljal, paleta zaznav se je bogatila, spet smo znali obcudovati pisane travnike okrog Vrbe, oci so radovedno raziskovale proti vrhovom gora, pocutili smo se prešerno. Mi, ki nam je življenje kot poseben dar naklonilo poklicno in prijateljsko povezanost z magistra Stanko Cerne, jo bomo zelo pogrešali. Slutiti je dala, da zbrano in brez posebnega napora združuje v sebi skrb za potrebne vsakdanje dobrine, intelektualne sposobnosti za strokovno delo, da zna najti uteho v naravi, da se plemeniti ob umetnosti, da spoštuje vse dobro, kar so dosegli rodovi pred nami Pri zadnjem slovesu od pokojnice smo zaman pricakovali omembo njene študijske in poklicne poti. Podpisani se zato posebej zahvaljujeva uredništvu Farmacevtskega vestnika, da nama je omogocilo popraviti ta dolg in vsaj v pisni obliki razgrniti prispevek magistre Cerne h klinicni biokemiji v jeseniški bolnišnici in širše. Misel in pero je vodil spomin na notranjo lepoto njene osebnosti, zato se ni cuditi, da sva se pri pisanju nehote zazrli nekoliko globlje. Ivica Avberšek-Lužnik, Marta Kramberger 282 farm vestn 2008; 59 FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 283 -^- Vljudno vabljeni na strokovno srecatije: Nevarnosti ponarejenih zdravil Kako jih prepoznati in se jim uspešno izogniti Lani so na mejah Evropske Unye zasegli 4,6 milijarde škatlic ponarejenih zdravil. Ponarejevalci zdravil vsako leto zaslužno vec kot 40 milijonov evrov. KTa Afriškem in Az^skem tržišcu je 60 odstotkov zdravil, ki so na vo^jo, ponarejenih. Svetovna zdravstvena organizacija opozaija, daje polovica zdravil, ki so dostopna na internetu, vprašljive kakovosti. V enem letu seje promet s ponarejenimi zdravili povecal za L_ Število ponaredkov vsako leto nevarno narašca, vzporedno a njimi tudi primeri zastrupitev, obolenj in celo smrti. Slovenski in tuji strokovnjaki bodo v Cetrtek, 27. novembra ob 18. uri, V hotelu Lev spregovorili o razsežnostih ponarejenih zdravil, regulatomih vidikih in najpogostejših primerih ponarejanja. Veselimo se vašega obiska! Univerza v Ljubljani Fakulteta za farmacijo trnovi fa] ^ |i ml i ~>T|i i ii milnilnu |T7TmTvi|i i i > iž/.proidr, Stanislav Gobec dekan Fakultete za farmacijo (JtJ r mM- Dorodrar\u&icrt magjarm. direktoncfa podružnice FV 5 2008 prelom.xp:FV 2 2007 prelom zadnji.xp 11/18/08 8:15 AM Page 284 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles Navodila avtorjem Strokovne œlanke in druge prispevke objavljamo v slovenskem, po dogovoru z uredniøtvom pa tudi v angleøkem jeziku. Vsi poslani rokopisi morajo biti jezikovno in slogovno neoporeœni. Uporabljena terminologija mora biti ustrezna, s posluhom za uveljavljanje ustreznih strokovnih izrazov v slovenskem jeziku. Navajanje zaøœitenih imen zdravil in drugih izdelkov ali imen proizvajalcev je nedopustno. Dovoljeno je le v poglavju Materiali in metode, izjemoma pa øe v primeru, œe se objavi popoln seznam vseh na træiøœu dostopnih izdelkov. Strokovni œlanki so recenzirani, kar pomeni, da bodo avtorji oddali najmanj dve verziji besedila: • prvo verzijo, ki jo uredniøtvo poølje najmanj dvema recenzentoma v strokovno oceno in • konœno verzijo. Med postopkom ugotavljanja primernosti prispevka za objavo v Farmacevtskem vestniku je zagotovljena tajnost. Prva verzija Predstavljajo jo: • trije, na papir natisnjeni izvodi prispevka, na katerih avtorji niso imenovani, slike in preglednice pa so vkljuœene v besedilo, ter • prispevek v elektronski obliki. Avtorji strokovnih œlankov priloæijo lastnoroœno podpisan spremni dopis z naslednjimi podatki: • naslov prispevka, • imena in priimki avtorjev z vsemi nazivi, • imena in naslovi inøtitucij, v katerih so zaposleni, • telefonska øtevila in elektronski naslov kontaktne osebe ter • izjavo, da prispevek øe ni bil objavljen ali poslan v objavo v drugo revijo, ter da se z vsebino strinjajo vsi soavtorji. V primeru ponatisa slik ali drugih elementov v prispevku mora avtor priloæiti dovoljenje zaloæbe, ki ima avtorske pravice. Rokopisi strokovnih œlankov lahko obsegajo najveœ 20.000 znakov, vkljuœno s presledki, obseg prispevkov za rubriko zanimivosti iz stroke in iz druøtvenega æivljenja je lahko najveœ 6.000 znakov (vkljuœno s presledki). Prispevki za rubriko osebne vesti ne smejo presegati 3.000 znakov (vkljuœno s presledki). Prispevke o osebnih vesteh objavlja uredniøtvo ob jubilejih, smrti ali za posebne doseæke v aktualnem obdobju. Uredniøtvo si pridræuje pravico, da po strokovni presoji objavi tudi daljøe prispevke. Vsebina naj bo sistematiœno strukturno urejena in razdeljena na poglavja. Izvirni raziskovalni œlanki naj imajo najmanj naslednja poglavja: • Uvod, • Materiali in metode, • Rezultati in razprava, • Povzetek v slovenskem in angleøkem jeziku (vsak po najveœ 150 besed) in najveœ 5 kljuœnih besed v slovenskem in angleøkem jeziku • poglavje Sklep • poglavje Literatura • Kazalo vsebine, takoj za povzetkom in kljuœnimi besedami. Besedilo (Times New Roman 12, razmik vrstice 1,5) naj bo obojestransko poravnano. Slike in preglednice morajo biti opremljene s pripadajoœim besedilom v slovenskem in angleøkem jeziku. Vsako trditev je potrebno potrditi z literaturnim virom, zaporedno øtevilko literaturnega vira pa navesti na koncu trditve, v oklepaju pred piko. Œe je referenc veœ, so øtevilke loœene z vejicami in presledki, npr. (1, 3, 8). Na koncu prispevka naj bo navedenih najveœ 30 literaturnih virov, po vrstnem redu, kot se pojavljajo v besedilu. Primer navajanja literature: 1. Obreza A. Vanadij v æivem organizmu in farmaciji. Farm Vestn 2003; 54: 713–718. 2. Danesh A, Chen X, Davies MC et al. The discrimination of drug polymorphic forms from single crystals using atomic force microscopy. 3. Pharm Res 2000; 17 (7): 887–890. 4. Doekler E. Cellulose derivatives. In: Peppas NA, Langer RS. Advances in polymer science 107; Biopolymers I. SpringerVerlag, 1993: 200–262. Konœna verzija Avtor stokovnega œlanka prejme po opravljenem recenzijskem postopku najmanj dve strokovni oceni in navodila glede sprejetja v objavo in potrebnih popravkov. Uredniøtvo priœakuje, da bo avtor pripombe recenzentov in uredniøtva upoøteval in najkasneje dva tedna po prejetju recenzij poslal popravljen prispevek v elektronski obliki ter eno natisnjeno verzijo besedila na naslov glavne urednice. Slike morajo biti shranjene v ustreznem slikovnem formatu (zaæeleno v jpg, bmp), tudi v natisnjeni verziji je potrebno slikovni material priloæiti loœeno od besedila, oøtevilœeno in oznaœeno s pripadajoœimi podnapisi. Fotografije morajo biti posnete z visoko loœljivostjo, najmanj 250 do 300 dpi, v enakih velikostih, kot jih avtor æeli objaviti oz. prilagojene obliki revije. Naslov prispevka (v slovenskem in angleøkem jeziku) in naslovi poglavij in podpoglavij naj bodo napisani krepko, vendar z malimi œrkami (kakor v stavku). V konœni verziji morajo biti pod naslovom prispevka v slovenskem in angleøkem jeziku napisana polna imena vseh avtorjev brez nazivov. Imena in priimke vseh avtorjev z nazivi, skupaj z imeni in naslovi ustanov, v katerih so zaposleni, je potrebno navesti loœeno na prvi strani. Elektronska in natisnjena verzija morata biti identiœni. Poøiljanje strokovnih prispevkov Prispevke v pisni in elektronski obliki avtorji poøljejo na naslov: dr. Andrijana Tivadar, mag. farm. glavna urednica Farmacevtskega vestnika Tacenska 133 A, 1000 Ljubljana e-poøta: andrijana.tivadar@telemach.net Korekture Krtaœne odtise prispevka je avtor dolæan natanœno pregledati in oznaœiti nujne popravke (tiskarske økrate), s katerimi ne sme posegati v vsebino prispevka. Korekture poølje avtor v treh delovnih dneh na zgoraj navedi naslov. Prvi avtor prejme tri izvode Farmacevtskega vestnika brezplaœno. Œlanki so objavljeni tudi na spletni strani: www.sfd.si v pdf obliki. 284 farm vestn 2008; 59