Jože Pižem1, Andrej Cör2
Kaspaze
Caspases
IZVLEČEK_
KLJUČNE BESEDE: kaspaze, apoptoza
Kaspaze so cisteinske proteaze, ki cepijo peptidno verigo za aminokislino aspartatom. V celicah so prisotne v neaktivni obliki (prokaspaze). Sodelujejo pri procesiranju citokinov in igrajo osrednjo vlogo pri uravnavanju apoptoze (programirane celične smrti). Kaspaze, ki sodelujejo pri apoptozi, delimo v aktivatorske (kaspazi 8 in 9) in efektorske (kaspazi 3 in 7). Apoptozo lahko sprožijo različni zunajcelični ali znotrajcelični signali. Zunajcelični signali delujejo preko receptorjev smrti in aktivirajo kaspazo 8, znotrajcelični (poškodba celice) pa povzročijo sproščanje citokroma C iz mitohondrijev, kar vodi v aktivacijo kaspaze 9. Aktivirani kaspazi 8 in/ali 9 sprožita kaskadno aktivacijo efektorskih kaspaz, te pa cepijo različne celične beljakovine - kaspazne substrate. Razgradnja celičnih beljakovin je odgovorna za značilne morfološke spremembe apoptotskih celic.
ABSTRACT
KEY WORDS: caspases, apoptosis	283
Caspases are cysteine proteases, which cleave their substrates following an aspartate residue. They are present as inactive precursors (pro-caspases) in cells. Caspases are involved in cytokine processing and apoptosis (programmed cell death) regulation. Apoptotic caspases are activator caspases (caspases 8 and 9) or effector caspases (caspases 3 and 7). Apoptosis can be initiated by either extracellular or intracellular pathways. Extracellular signals mediate apoptosis by death receptors, which activate caspase 8. Intracellular signals provoke changes in the permeability of the outer mitochondrial membrane which permits cytochrome C release from mitochondria. In the cytosol, cytochrome C allows activation of caspase 9. Activated caspases 8 and/or 9 induce cascade activation of effector caspases which cleave different target proteins. Demolition of target proteins plays an important role in morphological changes of apoptotic cells.
1	Jože Pižem, dr. med., Inštitut za histologijo in embriologijo, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Korytkova 2, 1105 Ljubljana.
2	Doc.dr. Andrej Cor, dr.med., Inštitut za histologijo in embriologijo, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Korytkova 2, 1105 Ljubljana.
UVOD
Značilnosti kaspaz
284
Število celic v tkivu uravnavata dva osnovna biološka procesa - celična delitev in celična smrt. Poznani sta dve obliki celične smrti -nekroza in apoptoza. Apoptozo kot obliko celične smrti je - glede na značilne spremembe celic - prvič opisal John Kerr (1). Apoptoza je zapleteno uravnavan biološki proces (2-4). Motnje v uravnavanju apoptoze lahko vodijo v presežek celic (tumorji) ali v prekomerno izgubo celic (nevrodegenerativne bolezni, ishemične poškodbe tkiv).
Apoptoza je v bistvu morfološki fenomen, saj apoptotske celice prepoznamo po značilnih morfoloških spremembah - po kon-denzaciji jedrnega kromatina in spremembi oblike celice (5). Danes je znano, da so za te spremembe odgovorne cisteinske proteaze, ki cepijo peptidno verigo za aminokislino aspartatom. Imenujemo jih kaspaze (angl. caspase -cysteine aspartyl-specificprotease).
Poznani sta dve skupini kaspaz - prva igra osrednjo vlogo v procesu apoptoze (apoptot-ske kaspaze), druga pa sodeluje pri vnetnem odgovoru organizma (vnetne kaspaze).
Namen prispevka je predstaviti osnovne biološke značilnosti kaspaz in predvsem njihovo vlogo v procesu apoptoze.
Kaspaze so prisotne v neaktivni obliki (pro-kaspaze) v praktično vseh živalskih celicah. Za njihovo aktivacijo je potrebna proteolitična cepitev na dveh mestih. Tako se od prokaspa-ze odcepi proveriga, iz preostalega dela pa nastaneta dve podenoti - velika in mala. Aktivna kaspaza je sestavljena iz dveh hete-rodimerov - dveh velikih in dveh malih podenot (slika 1) (6, 7).
Pri sesalcih je poznanih 14 različnih kaspaz. Glede na podobnosti v zgradbi jih delimo v dve veliki skupini - skupino ICE in skupino CED 3 (8). Prva je poimenovana po kaspazi 1, ki je bila prva izolirana kaspaza, in je interlevkin konvertirajoči encim (angl. interleukin-lp converting enzyme, ICE). V to skupino sodijo poleg kaspaze 1 še kaspaze 4, 5, 11 in 13. Sodelujejo pri procesiranju citokinov in jih zato imenujemo tudi vnetne kaspaze. Zdi se, da pri apoptozi ne igrajo pomembnejše vloge. V skupino CED 3 sodijo kaspaze, ki sodelujejo pri apoptozi. To so kaspaze 2, 3, 6, 7, 8, 9 in 10. Za kaspazi 12 in 14 je še premalo podatkov, ki bi omogočili uvrstitev v eno od skupin (9).
CED 3 je protein, ki je pri Caenorhabdi-tis elegans udeležen v uravnavanju celične smrti in je funkcionalno kaspaza. C. elegans
Slika 1. Zgradba prokaspaz in njihova aktivacija.
je majhen črv, pri katerem se med somatskim razvojem tvori natanko 1090 celic, od tega jih gre 131 vapoptozo. Ključna spoznanja o molekularnih mehanizmih celične smrti izhajajo prav iz genetskih raziskav na C. elegans. V primeru mutacije gena ced 3 se apoptoza ne pojavi in vseh 1090 celic preživi.
Kaspaze sodijo med zelo selektivne pro-teaze. Prepoznajo relativno kratko zaporedje štirih aminokislin, ki jih označujemo s P1 P2, P3 in P4 (P - za angl. position), pri čemer je P4 na N-koncu, P1 pa na C-koncu peptidne verige. Na P1 je vedno aspartat, na P2 različne aminokisline, na P3 najpogosteje glutamat, aminokislina na mestu P4 pa določa sub-stratno specifičnost različnih kaspaz (8). Glede na aminokislino na položaju P4 delimo kaspaze v tri skupine. V skupino I, ki ustreza skupini ICE, sodijo kaspaze z afiniteto do hidrofobnih aminokislin na P4. Kaspaze v skupini II imajo afiniteto do aspartata na P4, v skupini III pa do razvejanih aminokislin. Kaspaze skupine II in III sodelujejo pri apop-tozi in skupaj tvorijo skupino CED 3. Delitev kaspaz glede na zgradbo, substratno specifičnost in funkcijo je povzeta v tabeli 1.
AKTIVACIJA KASPAZ MED APOPTOZO
Pri proteolitični aktivaciji prokaspaz pride do cepitve za aspartatom v tetrapeptidnem zaporedju, ki je značilno za substrate kaspaz (glej zgoraj). To pomeni, da 1. prokaspazo lahko aktivira le kaspaza in 2. gre pri aktivaciji kaspaz za proteolitično kaskado (10). Iz tega sledi, da morajo vsaj nekatere kaspaze (pro-kaspaze) aktivirati same sebe. Kaspaze iz skupine III (kaspaze 6, 8, 9, 10) imajo afini-teto do tetrapeptidnega zaporedja, ki se nahaja na cepitvenih mestih prokaspaz iz sku-
pine II in III. Poleg tega je značilno, da imajo kaspaze iz skupine III tudi v neaktivni obliki (prokaspaze) relativno veliko proteolitično aktivnost. To opredeljuje pojem cimogenost, ki je razmerje med aktivnostjo aktivirane (kaspaze) in neaktivirane proteaze (prokaspaze). Cimogenost kaspaze 9 je 10, kaspaze 8 pa 100. Cimogenost kaspaz iz skupine II je nekaj 10-krat višja (11). Značilnost kaspaz iz skupine III je tudi dolga proveriga, ki sodeluje pri vezavi prokaspaze na druge proteine, ki delujejo kot alosterični modulatorji in povečajo proteolitično aktivnost prokaspaze. Nizka cimogenost, dolga proveriga in afiniteta do lastnega tetrapeptidnega zaporedja daje kaspazam iz skupine III sposobnost samoak-tivacije. V nasprotju s kaspazami iz skupine III imajo kaspaze iz skupine II visoko cimogenost ter kratko proverigo in niso sposobne samoak-tivacije, lahko pa jih aktivirajo kaspaze iz skupine III. Tako imenujemo kaspaze iz skupine III aktivatorske (iniciatorske) kaspaze -saj so sposobne samoaktivacije in aktivacije drugih kaspaz, kaspaze iz skupine II pa efek-torske (12).
POTEK APOPTOZE
Potek apoptoze lahko delimo v štiri faze (9):
•	začetek: na celico vplivajo različni znotraj-in zunajcelični signali, ki lahko sprožijo apoptozo;
•	sproženje: v tej fazi postane proces apop-toze nepovraten;
•	pospešitev: pride do kaskadne aktivacije kaspaz;
•	razgradnja: efektorske kaspaze cepijo številne celične beljakovine, kar povzroči značilne morfološke spremembe celice.
285
Tabela 1. Delitev kaspaz glede na zgradbo, substratno specifičnost in funkcijo.
		Kaspaze	
podobnost v zgradbi	substratna specifičnost	kaspaza	funkcija
ICE	I	1, 4, 5, 11, 13	procesiranje citokinov
CED 3	II	2*, 3, 7	efektorske kaspaze
	III	6**, 8, 9, 10	aktivatorske kaspaze
* Kaspaza 2 je sposobna samoaktivacije.
** Kaspaza 6 ima lahko tudi funkcijo efektorske kaspaze.
286
Poznane so tri signalne poti, ki lahko sprožijo apoptozo: 1. ekstrinzična pot preko t. i. receptorjev smrti, 2. intrinzična pot in 3. sproščanje vsebine zrnc iz citototoksičnih limfocitov T in naravnih celic ubijalk (9,13).
Ekstrinzicna pot
Apoptozo lahko sproži vezava ligandov na receptorje smrti (angl. death receptors). To je skupina receptorjev znotraj družine receptorjev TNF (faktor tumorske nekroze, angl. tumour necrosis factor). Najbolj sta raziskana dva receptorja smrti - CD95/Fas/APO-1 in TNF-R1. Za receptorje smrti je značilno t. i. področje DD (angl. death domain) na citoplazmatskem delu receptorja. Po vezavi liganda na receptor se na področje DD veže adaptersko beljakovino. Na Fas in TNFR1 se lahko vežeta adapterski beljakovini FADD/MORT1 (angl. Fas-associating protein with death domain) ali TRADD (angl. TNF receptor associated protein with death domain). Adapterske beljakovine imajo dve vezavni mesti, s področjem DD se vežejo na DD receptorja, s področjem DED (angl. death efector domain) pa na istoimensko področje kaspaze 8, ki se nahaja na njeni proverigi (9). Način akti-vacije prokaspaze 8 poskuša razložiti t. i. »model približanja« (angl. induced proximity model) -povezava med adapterskimi beljakovinami in prokaspazo 8 omogoči, da se posamezne pro-kaspaze 8 približajo druga drugi, kar omogoči njihovo transaktivacijo (10).
Kaspaza 8 je torej ključna aktivatorska kaspaza, ki se aktivira po ekstrinzični poti. Na podoben način pride verjetno do aktivacije kaspaze 2, vendar pa je njena dejanska vloga nejasna, saj pri kaspaza 2-/- miših, potek apoptoze, sprožen s TNF a (faktor tumorske nekroze a, angl. tumour necrosis factor a), poteka normalno (14).
Z delovanjem na ekstrinzično pot pospešujejo apoptozo tudi nekateri kemoterapevtiki in citotoksični limfociti T. Slednji imajo na svoji površini ligand, ki se veže na receptor CD95 (15).
Intrinzicna pot
Poškodba celice zaradi sevanja, delovanja citotoksičnih snovi, odsotnosti dejavnikov preživetja in drugih škodljivih vplivov lahko sproži apoptozo. Čeprav so natančni meha-
nizmi, kako številni škodljivi vplivi sprožijo apotozo, nepoznani, se zdi, da večina signalnih poti poteka preko mitohondrijev (9).
Citotoksični limfociti T in naravne celice ubijalke
Poleg že omenjene sposobnosti vezave na receptor CD95 in s tem aktivacije kaspaze 8 lahko citotoksični limfociti T in naravne celice ubijalke sprožijo apoptozo tako, da sprostijo vsebino svojih zrnc na površino celice (angl. »the kiss of death«). V zrncih se nahajata perforin in grancim B (serinska proteaza). Perforin naredi pore v celični membrani, te pa omogočijo vstop grancima B v celico. Grancim B cepi prokaspaze in jih s tem neposredno aktivira. In vitro lahko aktivira večino kaspaz, in vivo pa se zdi, da aktivira predvsem kaspazo 3 (9).
Sproženje apoptoze
V fazi sproženja apoptoze pride do ključnih biokemičnih sprememb v mitohondrijih, glavna značilnost pa je povečanje prepustnosti zunanje mitohondrijske membrane in sproščanje citokroma C ter drugih proteinov, ki se normalno nahajajo v medmembranskem prostoru, iz mitohondrija (9). Te spremembe lahko sprožijo 1. signali, ki izvirajo iz celice in so neodvisni od kaspaz (intrinzična pot), ali 2. signali preko receptorjev smrti ali grancima B, ki so odvisni od kaspaz. Spremembe v mitohondri-jih so verjetno ključne za celično smrt in niso le njen naključni spremljevalec (16).
Mehanizem sproščanja citokroma C iz mitohondrija je kompleksen in še ni v celoti poznan. Med apoptozo mitohondriji nabreknejo in kontinuiteta zunanje mitohondrijske membrane se prekine, vendar se to pojavi pozno v procesu apoptoze. Do sproščanja citokroma C pride pred nabrekanjem, kar kaže na to, da je v ozadju zapletenejši mehanizem. Verjetno se citokrom C sprošča skozi pore v zunanji mitohondrijski membrani, ki jih tvorita protei-na Bak in Bax iz družine Bcl-2. Za tvorbo por je potrebna oligomerizacija teh dveh beljakovin. Le-to pospešuje beljakovina cBid. Beljakovina cBid je C-terminalni del beljakovine Bid, ki se nahaja prosto v citosolu in prav tako kot Bak in Bax pripada družini Bcl-2. Beljakovina cBid se sprosti po delovanju aktivirane kaspaze 8.
Na ta način je ekstrinzicna pot aktivacije apop-toze povezana z intrinzično (9, 16) (slika 2).
Citokrom C se v citosolu veže na beljakovino Apaf-1 (angl. apoptosis-activating factor 1) in ga s tem aktivira. Aktivirane beljakovine Apaf-1 se povežejo s prokaspazo 9 v kompleks, ki ga imenujemo apoptosom. V apoptosomu pride do transaktivacije prokaspaze 9. Mehanizem je podoben kot pri transaktivaciji kaspaze 8. Aktivirana kaspaza 9 ostane v apoptosomu, saj je tako njena proteolitična aktivnost večja. Za aktivacijo kaspaze 9 je potrebna energija v obliki ATP/dATP (10, 16, 17).
Apoptosom torej sestavljajo citokrom C, Apaf-1 in kaspaza 9. Poleg teh beljakovin pa so lahko prisotne še pomožne beljakovine. Ena takih je beljakovina SMAC (angl. second mito-hondrial activator of caspases), ki se prav tako kot citokrom C sprosti iz mitohondrija, v apoptosomu pa zmanjša potrebo po ATP (16).
Na ravni mitohondrija in tvorbe apoptoso-ma uravnavajo apoptozo beljakovine iz družine Bcl-2. Danes je poznanih okrog 20 beljakovin iz te družine. Nekatere apoptozo pospešujejo
(Bak, Bax Bid), druge pa jo zavirajo (Bcl-2, Bcl-XL). Natančni mehanizmi njihovega delovanja niso poznani, možni mehanizmi pa so: 1. tvorba por v zunanji mitohondrijski membrani, 2. vezava na beljakovine, ki uravnavajo homeostazo v mitohondrijih, 3. vezava na adap-terske beljakovine in s tem uravnavanje aktivacije kaspaz in 4. vezava na druge beljakovine iz družine Bcl-2 (tvorba heterodimerov) in s tem uravnavanje njihove pro- ali antiapoptotične aktivnosti (13). Pri C. elegans se analog beljakovine Bcl-2 (CED 9) veže na analog beljakovine Apaf-1 (CED 4) in s tem prepreči aktivacijo kaspaze (CED 3). Vendar se pri sesalcih Bcl-2 verjetno ne veže na Apaf-1, tako da njen natančen mehanizem zaviranja apoptoze ni poznan. Pri sesalcih se na Apaf-1 verjetno veže Bcl-XL in s tem prepreči tvorbo apoptosoma (10,12, 16).
Iz mitohondrija se v citoplazmo sprošča tudi beljakovina AIF (angl. apoptosis-inducing factor). Potuje v jedro in neodvisno od kaspaz lahko cepi DNA na dolge fragmente in povzroči kondenzacijo kromatina, vendar njen dejanski pomen ni poznan (9, 18).
POŠKODBA CELICE

/ \ ^-^AIF
1 I
g citokrom C
a Apaf-1	>optosom • o
	1 1 1 1
prokaspaza 9

kaspaza 9
TARCNI PROTEINI
	receptor		celična
■	smrti		h membrana
			1 FADD
L			prokaspaza 8
I
kaspaza 8
I
czn
n—i
□z
n i
efektorska prokaspaza
/
efektorska kaspaza
287
Slika 2. Intnnzitia in ekstrinzitta aktivacijo kaspaz.
288
Pospešitev apoptoze
Potem ko je prišlo po ekstrinzični poti do akti-vacije kaspaze 8 ali po intrinzični do aktivacije kaspaze 9 (aktivatorskih kaspaz), so ustvarjeni pogoji za hitro kaskadno aktivacijo preostalih (efektorskih) kaspaz. Kaspazna kaskada je prikazana na sliki 3 (9). Čeprav lahko pride do aktivacije številnih kaspaz, igra osrednjo vlogo kaspaza 3. Ta lahko aktivira druge kas-paze, hkrati pa je glavna efektorska kaspaza. Kaspaza 7 se po biokemičnih lastnostih ne razlikuje bistveno od kaspaze 3, vendar in vivo ne cepi substratov, ki jih cepi in vitro. Zdi se, da je to posledica različne razporeditve v celici (dostopnosti substratov) (14).
V fazi kaspazne kaskade je potek celične smrti že nepovraten. Aktivacija efektorskih kaspaz je odgovorna za značilne morfološke spremembe apoptotske celice. Če s kaspazni-mi inhibitorji preprečimo delovanje kaspaz in je prišlo do sproženja apoptoze, kaže celica morfološke znake nekroze (nabrekanje celice, razgradnja celičnih organelov, sproščanje zno-trajcelične vsebine v izvencelični prostor, pojav vnetne reakcije), ne pa značilnih znakov apoptoze. Zdi se, da aktivacija kaspaz
odloča o tem, ali bo umirajoča celica kazala znake apoptoze ali nekroze (9, 15, 19). V celicah, v katerih ni kaspaze 3 (kaspaza 3-/-), lahko različni dražljaji sprožijo apoptozo, vendar pa le-ta poteka z zapoznelimi morfološkimi spremembami ali brez njih (17).
Razgradnja tarcnih beljakovin in morfološke spremembe apoptotske celice
Aktivirane (efektorske) kaspaze cepijo številne celične beljakovine, kar povzroči spremembe vapoptotski celici: 1. porušenje homeostaze, 2. ustavitev celičnega ciklusa, 3. inaktivacijo zaviralcev apoptoze, 4. strukturne spremembe in 5. označitev apoptotske celice (spremembo antigenov na površini celice). Poznanih je okrog 70 tarčnih beljakovin - kaspaznih substratov (8). Mednje sodijo beljakovine, ki sodelujejo v celičnem signaliziranju, beljakovine citoskeleta in jedrnega matriksa, zaviralci endonukleaz in drugi. Med najbolje poznanimi in - zdi se, najpomembnejšimi tarčnimi beljakovinami - so: ICAD (angl. inhibitor of cas-pase-activated deoxyribonuclease), lamini, fodrin a, gelsolin, aktin in drugi.
Slika 3. Kaspazna kaskada (* Aktivotorske kaspaze, ki jih lahko vdoločenih okoliščinah aktivirajo efektorske kaspaze.)
Celično smrt lahko definiramo kot poru-šenje metabolične koordinacije, ki je preseglo točko povratnosti (angl. point of no return). V poteku apoptoze se to zgodi že pred akti-vacijo efektorskih kaspaz, v fazi sproženja, ko pride do ključnih biokemičnih sprememb v mitohondrijih, zato pride do večine morfoloških sprememb v celici že po njeni smrti. Njihova glavna vloga je verjetno v učinkovitem in za tkivo neškodljivem odstranjevanju mrtvih celic (18, 20).
Znano je, da je za mnoge morfološke spremembe med apoptozo odgovorna kaspa-za 3, saj v celicah, ki ne izražajo kaspaze 3 (kaspaza 3-/-), ne pride do fragmentacije DNA, kondenzacije kromatina in brstenja citoplazme. Postavlja se vprašanje, ali kaspaza 3 neposredno cepi tarčne beljakovine, ki so odgovorne za morfološke spremembe, ali je učinek posreden, preko aktivacije drugih kaspaz. V celicah z odsotnostjo kaspaz 6 in 7 (kaspaza 6-/- in 7-/-) cepitev ključnih tarčnih beljakovin ni motena, kar pomeni, da kaspa-za 3 le-te cepi neposredno (4).
Morfološke spremembe jedra so za apop-tozo značilne in izrazite. Pride do kondenzacije jedrnega kromatina, jedro se skrči in končno razpade na fragmente (5, 21). Vendar so za sámo apoptozo te spremembe malo pomembne ali nepomembne (18). Spremembe celičnega jedra so posledica delovanja kaspaz na jedrne beljakovine. Do aktivacije kaspaz pride v citosolu, vendar kaspaza 3 po aktivaciji potuje v jedro in zdi se, da igra ključno vlogo pri cepitvi jedrnih beljakovin. Pomembna je cepitev beljakovine ICAD in laminov.
Beljakovina ICAD je zaviralec endonukleaze CAD (angl. caspase-activated deoxyribonuclea-se). Kaspaza 3 cepi ICAD, s tem pa postane CAD aktivna in cepi jedrno DNA. V celicah brez CAD (CAD-/-) ne pride do fragmentacije jedrne DNA (14).
Lamini so jedrne beljakovine, ki se nahajajo ob jedrni ovojnici. Njihova cepitev je potrebna za skrčenje jedra in njegovo frag-mentacijo. V primeru, ko so v jedru prisotne v mutirani necepljivi obliki, ne pride do značilnih morfoloških sprememb jedra ali pa so vsaj močno zapoznele (13, 18).
Sprememba oblike je ena glavnih značilnosti apoptotske celice. Celica se skrči, loči od ostalih celic v tkivu, pojavijo se izbokline cito-
plazme (brstenje). Končno celica razpade na apoptotska telesca (5). Osnova za to so spremembe citoskeleta. Kaspaze cepijo številne beljakovine, ki gradijo citoskelet ali sodelujejo pri njegovi ureditvi (aktin, gelsolin, fodrin in različne kinaze), vendar so natančni mehanizmi, kako cepitev teh beljakovin vpliva na spremembo citoskeleta, še slabo poznani (18).
Značilnost apoptoze je premik fosfatidil-serina iz notranje na zunajo stran plazmaleme (dvosloja). Za to je odgovorna kaspaza 9 ali od nje odvisna kaspaza, vendar ne kaspazi 3 in 6. Tarčne beljakovine niso poznane (14).
POMEN POSAMEZNIH KASPAZ
Za boljše poznavanje delovanja posameznih kaspaz in vivo so številni raziskovalni centri vzgojili miši, ki ne izražajo določene kaspaze. Celice brez obeh alelov za določeno kaspazo (homozigotno deficientne) označujemo kot kaspaza-/- celice.
Kaspaza 1-/- miši ne tvorijo zrelega inter-levkina-ip in interlevkina-18 in so odporne na septični šok, sprožen z lipopolisahari-dom. Pri teh miših ne najdemo pomembnih motenj v (embrionalnem) razvoju in uravnavanju apoptoze. Podoben fenotip imajo kaspaza 11-/- miši, pri katerih najdemo tudi moteno aktivacijo kaspaze 1, kar kaže na to, da kaspaza 11 sodeluje v sintezi interlevkinov preko aktivacije kaspaze 1 (17).
Kaspaza 3-/- miši umrejo nekaj tednov po rojstvu. Prisotne so motnje v razvoju osrednjega živčevja, ni pa očitnih razvojnih nepravilnosti v drugih tkivih. Apoptoza v nezrelih limfocitih B in T poteka nemoteno, to pa ne velja za zrele limfocite T in B. Vse to kaže, da ima kaspaza 3 ključno vlogo pri uravnavanju apoptoze v določenih, ne pa v vseh tkivih. V vseh apoptotskih celicah so odsotne značilne morfološke spremembe, ni pa moten premik fosfatidilserina na zunanjo stran plazmaleme. V kaspaza 3-/- celicah torej lahko pride do apoptoze, vendar ta poteka brez značilnih morfoloških sprememb (22).
Kaspaza 9-/- miši imajo hujše motnje v razvoju osrednjega živčevja kot kaspaza 3-/-miši. To kaže na to, da kaspaza 9 poleg kas-paze 3 aktivira še druge kaspaze. Kaspaza 9-/-timociti so odporni na apoptozo, ki jo sproži deksametazon ali sevanje (intrinzična pot),
289
290
medtem ko apoptoza, sprožena preko recep-torjev smrti, poteka normalno. Po izpostavitvi deksametazonu pride do sproščanja citokro-ma C iz mitohondrijev, ne pa do aktivacije kaspaz 3 in 7. Njuno aktivacijo pa lahko sprožijo signali preko receptorjev smrti (17).
Kaspaza 8-/- miši imajo motnje v razvoju srčne mišice in krvnih celic in se ne rodijo žive. Kaspaza 8-/- timociti so odporni na signale preko receptorjev smrti, normalno pa se odzovejo z apoptozo po izpostavitvi deksame-tazonu ali sevanju (14, 17).
URAVNAVANJE AKTIVNOSTI KASPAZ
V zrelih tkivih se večina kaspaz izraža konstitutivno z malo ali brez transkripcij skega uravnavanja. Tako je možno le uravnavanje na potranskripcijski ravni. Poznani sta dve skupini kaspaznih zaviralcev: 1. družina beljakovin IAP (angl. inhibitor of apoptosis protein) - gre za t. i. lažne substrate (psevdosubstrati), in 2. lažne kaspaze.
Beljakovine IAP se vežejo na aktivirane kaspaze in jih inhibirajo. Med najbolje poznanimi proteini IAP sta survivin in XIAP.
Survivin se redko izraža v normalnih celicah, prekomerno pa se izraža v velikem številu tumorjev. Izraža se v odvisnosti od celičnega ciklusa; največjo raven doseže v mitozi. Za razliko od ostalih proteinov IAP je značilno, da ga lahko fosforilira kinaza p53cdc2. Zamenja-
va treonina, ki je mesto fosforilacije, za alanin zmanjša sposobnost vezave survivina na kas-pazo 9 in s tem njegovo antiapoptotično delovanje (10, 16).
XIAP je močan zaviralec kaspaz 3, 7 in 9. Izraža se v številnih celicah, vendar se izražanje za razliko od survivina ne spreminja skozi celični ciklus (16).
Lažne kaspaze nastanejo v procesu alternativnega izrezovanja eksonov in so brez dela verige, ki je odgovorna za proteolitično aktivnost, imajo pa normalno proverigo, ki se veže na adapterske beljakovine (Apaf-1, FADD) in jih s tem blokira (9). Poznani sta kratki obliki kaspaz 9 in 2, ki delujeta kot lažni kaspazi in zavirata apoptozo (12, 17).
ZAKLJUČEK
Kaspaze igrajo osrednjo vlogo pri uravnavanju apoptoze. Odgovorne so za značilne morfološke spremembe apoptotskih celic ter učinkovito in neškodljivo odstranjevanje le-teh.
Poznavanje mehanizmov, ki uravnavajo apoptozo in aktivacijo kaspaz, omogoča razvoj specifičnih zdravil, ki pospešujejo (zdravljenje tumorjev) ali zavirajo apoptozo (preprečevanje nevrodegenerativnih bolezni in ishemičnih okvar različnih organov). Se zlasti veliko obeta ligand TRAIL (angl. TNF-re-lated apoptosis-inducing ligand), ki z vezavo na receptor smrti sproži apoptozo po ekstrinzični poti. Zdi se, da deluje selektivno na tumor-ske celice (15, 23).
LITERATURA
1.	Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basis biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26: 239-57.
2.	Jezernik K. Apoptoza. Med Razgl 1999; 38: 69-81.
3.	Aravind L, Dixit VM, Koonin EV. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. TIBS 1999; 24:47-53.
4.	O'Connor L, Huang DCS, O'Reilly LA, Strasser A. Apoptosis and cell division. Curr Opin Cell Biol 2000; 12:257-63.
5.	Cor A, Pajer Z. Apoptoza - programirana celicna smrt in tumorji. Zdrav Vestn 1994; 63: 521-4.
6.	Thornberry NA. Caspases: A decade of death research. Cell Death Differ 1999; 6:1023-6.
7.	Kumar S, Colussi PA. Prodomains - adaptors - oligomerisation: the pursuit of caspase activation in apoptosis. TIBS 1999; 24:1-4.
8.	Nicholson DW. Caspase structure, proteolitic substrates, and function during apoptotic cell death. Cell Death Differ 1999; 6:1028-42.
9.	Slee EA, Adrain C, Martin SJ. Serial killers: ordering caspase activation events in apoptosis. Cell Death Differ 1999; 6:1067-74.
10.	Reed JC. Mechanisms of apoptosis. Am J Pathol 2000; 157 (5): 1415-30.
11.	Stennicke HR, Salvesen GS. Catalytic properties of the caspases. Cell Death Differ 1999; 6:1054-9.
12.	Kumar S. Mechanisms mediating caspase activation in cell death. Cell Death Differ 1999; 6:1060-6.
13.	Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature 2000; 407: 770-6.
14.	Zheng TS, Hunot S, Kuida K, Flavell RA. Caspase knockouts: matters of life and death. Cell Death Differ 1999; 6:1043-53.
15.	Kolenko VM, Uzzo RG, Bukowski R, Finke JH. Caspase-dependent and -independent death pathways in cancer therapy. Apoptosis 2000; 5:17-20.
16.	Johnson DE. Programmed cell death regulation: basic mechanisms and therapeutic opportunities. Leukemia 2000; 14:1340-4.
17.	Wang J, Lenardo MJ. Roles of caspases in apoptosis, development, and cytokine maturation revealed by homozygous gene deficiencies. J Cell Science 2000; 113: 753-7.
18.	Hacker G. The morphology of the apoptosis. Cell Tissue Res 2000; 301: 5-17.
19.	Kitanaka C, Kuchino Y. Caspase-independent cell death with necrotic morphology. Cell Death Differ 1999; 6:508-15.
20.	Borner C, Monney L. Apoptosis without caspases: an inefficient molecular guillotine? Cell Death Differ 1999; 6:497-507.
21.	Stadelmann C, Lassmann H. Detection of apoptosis in tissue sections. Cell Tissue Res 2000; 301: 19-31.
22.	Porter AG, Janicke RU. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differ 1999; 6: 99-104.
23.	Nicholson DW. From bench to clinic with apoptosis-based therapeutic agents. Nature 2000; 407: 810-6.
Prispelo 23. 4. 2001.
291