I-9 Strokovni prispevek/Professional article PREPOZNAVANJE ZNAČILNIH KROMOSOMSKIH PREUREDITEV Z REAGENČNIM KOMPLETOM mD X HemaVision PRI BOLNIKIH Z LEVKEMIJO DETECTION OF SPECIFIC CHROMOSOMAL REARRANGEMENT IN LEUKEMIA PATIENTS BY mDx HEMAVISION KIT Tadej Pajič, Elvira Ljutić, Peter Černelč Enota za diagnostiko, Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Njegoševa 4, 1525 Ljubljana, Slovenija Prispelo 2004-03-01, sprejeto 2004-03-23; ZDRAV VESTN 2004; 73: Suppl. I: 9–12 Ključne besede: levkemija; obratno prepisovanje; hkratna verižna reakcija s polimerazo; kromosomske preureditve; zdru- ženi geni Izvleček – Izhodišča. Reagenčni komplet mD x HemaVision je namenjen za kvalitativno ugotavljanje 28 različnih kro- mosomskih preureditev, značilnih za posamezne podvrste lev- kemij, z načinom obratnega prepisovanja, hkratne in vgne- zdene verižne reakcije s polimerazo. S to reakcijo lahko dolo- čimo prisotnost ali odsotnost specifičnih mRNK prepisov ozi- roma cDNK segmentov po obratnem prepisovanju združe- nih ali okvarjenih genov, ki nastanejo zaradi kromosomskih preureditev. Bolniki in metode. Uporabnost reagenčnega kompleta smo preverili v 26 vzorcih RNK bolnikov z akutno levkemijo in 7 s kronično mieloproliferativno boleznijo ter primerjali izsled- ke med reagenčnim kompletom mD x Hema Vision in usklaje- nim protokolom RT-PCR pri ugotavljanju značilnih prepisov mRNK t(9;22)(q34;q11), t(8;21)(q22;q22), inv16(p13;q22), t(15;17)(q21;q21) in t(4;11)(q21;q23). RNK smo pridobili iz enojedrnih celic kostnega mozga po gostotnem gradientnem centrifugiranju preko fikola in z upo- rabo reagenčnega kompleta High Pure RNA Isolation. Sinte- zo komplementarne DNK in verižno reakcijo s polimerazo smo izvedli, kot je opisano v protokolu reagenčnega kompleta ali mD x HemaVision v usklajenem protokolu RT-PCR. Pridel- ke PCR reakcij smo ocenjevali z agarozno gelsko elektrofore- zo, barvanjem gelov z etidijevim bromidom in detekcijo pod UV lučjo. Rezultati. Dobili smo 100-odstotno ujemanje izsledkov za pre- iskave, ki so skupne obema postopkoma. Značilen BCR-ABL mRNK prepis t(9;22)(q34;q11) smo dokazali pri bolniku z B- ALL, bolniku z bifenotipsko levkemijo in pri štirih bolnikih s KML. AML1-ETO mRNK prepis t(8;21)(q22;q22) smo ugotovi- li pri dveh bolnikih z AML. Pri enem bolniku z AML z nenor- malnimi eozinofilci v kostnem mozgu smo dokazali CBFβ / MYH 11 mRNK prepis inv16(p13;q22). MLL /AF4 mRNK pre- pis t(4;11))(q21;q23) smo ugotovili pri deklici z B-ALL in bol- niku z B-ALL po zdravljenju s citostatiki. Pri enem bolniku smo z reagenčnim kompletom mD x HemaVision ugotovili se- gment MLL /AF10 cDNK, značilen za t(10;11)(p12;q23). Key words: leukemia; reverse transcription; polymerase chain reaction; chromosomal rearrangement; fusion genes Abstract – Background. The mD x HemaVision kit is a qualitative multiplex and nested Reverse Transcription-Poly- merase Chain Reaction (RT-PCR) test designed to detect 28 different translocations or chromosomal rearrangement, found to be specific for particular subtypes of leukemia. The presence or absence of the specific mRNA transcripts or cDNA segments after the reverse transcription of the fusion or abnormal genes, appeared after chromosomal rearrange- ments, could be determined by the kit. Patients and methods. The usefulness of the kit was tested on the 26 RNA samples of patients with acute leukemia and seven patients with chronic mieloproliferative diseases and by comparison of the results between mD x HemaVision kit and standardized RT-PCR protocol for the specific mRNA transcripts of the t(9;22)(q34;q11), t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q21;q21) and t(4;11)(q21;q23). The RNA samples we- re isolated from mononuclear cells of the bone marrow after Ficoll-Paque density gradient centrifugation and with a High Pure RNA isolation kit. The cDNA synthesis and Polymerase Chain Reaction were performed as described in mD x Hema- Visoin’s or standardized RT-PCR’s protocols. The PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis, by staining with etidium bromide and by visualization under UV light. Results. We obtained 100% concordance of the results by both methods. Specific BCR-ABL mRNA transcripts were found in four chronic myeloid leukemia patients, one in B acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) and one with bifenotipic leukemia (BAL) patient. AML1-ETO mRNA transcript of the t(8;21)(q22;q22) was identified in two patients with acute myeloid leukemia (AML). The CBFβ /MYH11 mRNA transcript specific for inv16(p13;q22) was obtained in AML patient with abnormal eozinofiles in bone marrow. MLL/AF4 mRNA transcript of the t(4;11)(q21;q23) was found in the girl with B-ALL and in patient with B-ALL after treatment. In patients with B-ALL we found MLL/AF10 cDNA segment specific for t(10;11)(p12;q23) by the mD x HemaVision kit. ZDRAV VESTN 2004; 73: I-9–12 I-10 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I Zaključki. Na osnovi skladnosti dobljenih rezultatov sklepa- mo, da je metoda primerna za molekularnogenetično prepo- znavanje levkemij, saj omogoča ugotovitev velikega števila specifičnih prepisov mRNK oz. segmentov cDNK pri kromo- somskih nepravilnostih hkrati. S tem pridobimo več informa- cij v krajšem času in tako znatno zmanjšamo stroške pre- iskav. Conclusions. On the basis of the concordance of the results it could be concluded that the method is suitable for the molecular genetic recognitions of leukemia. It offers the detection of many specific mRNA transcripts or cDNA segments of the chromosomal rearrangements simultane- ously. We can obtain more information in shorter time and therefore reduce the costs of the test. Uvod V zadnjih letih se je izkazalo, da raziskava kromosomov pri- speva k natančni diagnozi in oceni napovedi izida zdravljenja mieloičnih in limfatičnih novotvorb. Pri večini lahko odkrijemo v klonu malignih celic kromosomske nepravilnosti oz. preure- ditve. Pomen teh se kaže v razvrstitvi Svetovne zdravstvene organizacije za maligne novotvorbe krvotvornega sistema, ki obsega razvrstitev limfatičnih, mieloičnih in histiocitnih novo- tvorb ter novotvorb mastocitov. Posamezne bolezni so opre- deljene glede na morfološke, imunološke, genetične in klinič- ne značilnosti. Diagnostična vrednost posameznih značilnosti je različna pri različnih novotvorbah. Pri tem je treba razlikova- ti značilnosti, ki opredeljujejo posamezno bolezen, od značil- nosti, ki imajo napovedni pomen. Tako lahko nekatere gene- tične nenormalnosti opredeljujejo določeno bolezen, druge pa so napovedni dejavniki pri tej bolezni (1). Običajni način za ugotavljanje kromosomskih preureditev in za ugotavljanje kakovosti remisije bolnikov po zdravljenju je citogenetska preiskava metafaz v celicah kostnega mozga (1). Dopolnjuje jo način fluorescenčne hibridizacije (FISH) in situ, ki je občutljivejši, omogoča oceno celic v interfazi in zaznavo sprememb na kromosomu oziroma v genu, ki jih z običajno citogenetsko preiskavo ne ugotovimo. Najobčutljivejša med vsemi je verižna reakcija s polimerazo (angl. Polymerase Cha- in Reaction – PCR), ki omogoča hitro in specifično pomnože- vanje segmenta genomske ali komplementarne DNK in vitro s termostabilno polimerazo DNK v pufru, ki ima ustrezen pH, koncentracijo oligonukleotidov, deoksinukleotid trifosfatov in soli. Z njo lahko zaznamo eno maligno celico z značilno kro- mosomsko nepravilnostjo med 105 do 106 normalnimi celi- cami. Ugotavljanje strukturnih kromosomskih nepravilnosti, translokacij, delecij in inverzij oziroma iz njih nastalih združe- nih ali okvarjenih genov z verižno reakcijo s polimerazo teme- lji na oblikovanju oligokonukleotidov, ki so komplementarni zaporedju DNK poleg prelomnega mesta kromosoma. Mesta se od bolnika do bolnika razlikujejo, vendar so združena zno- traj določene regije ali regij. Pri levkemijah so regije v genu lahko široke tudi nekaj 10 kilobaznih parov, tako da ni mogoče uporabiti PCR na osnovi genomske DNK. Zato pri večini lev- kemij uporabimo himerično specifično informacijsko RNK (messenger RNA, mRNA). To prepišemo v komplementarno DNK z uporabo naključnih ali specifičnih oligonukleotidov in encimov – reverznih transkriptaz. Komplementarna DNK je osnova za verižno reakcijo s polimerazo (angl. RT-PCR Rever- se Transcriptase and Polymerase Chain Reaction). Specifič- nost in občutljivost reakcije PCR lahko povečamo z vgnezde- nim PCR (angl. nested PCR). Pridelek PCR iz prve reakcije pomnožimo v drugi reakciji z oligonukleotidi, ki se prilegajo znotraj prvega pridelka PCR (2 in reference v njej). Pomemb- na oblika PCR je hkratni PCR (angl. multiplex PCR). Ta način omogoča, da lahko v eni reakciji s pomočjo več parov oligonu- kleotidov ugotavljamo več iskanih cDNK segmentov, značil- nih za posamezne kromosomske nepravilnosti (3). Obe obliki sta združeni v reagenčnem kompletu mD x Hema- Vision, ki je namenjen za kvalitativno ugotavljanje 28 različnih kromosomskih preureditev (Razpr. 1), značilnih za posame- zne podvrste levkemij, z načinom obratnega prepisovanja, hkratne in vgnezdene PCR. Razdeljen je v preiskovalni in iz- ključitveni preskus. Z izključitvenim preskusom določimo kro- mosomsko nepravilnost (3). Uporabnost reagenčnega kompleta mD x HemaVision smo se odločili preveriti v 26 vzorcih RNK bolnikov z akutno levkemi- jo in 7 s kronično mieloproliferativno boleznijo ter s primerja- vo izsledkov med reagenčnim kompletom mD x Hema Vision (3) in usklajenim protokolom RT-PCR (2) pri ugotavljanju zna- čilnih mRNK prepisov t(9;22)(q34;q11), t(8;21)(q22;q22), inv16(p13;q22), t(15;17)(q21;q21) in t(4;11)(q21;q23). Pre- iskave usklajenega protokola RT-PCR so bile že uvedene v Enoti za diagnostiko Kliničnega oddeleka za hematologijo Kli- ničnega centra Ljubljana. Protokol je bil preizkušen v različnih laboratorijih, ki so sodelovali pri njegovi pripravi in usklajeva- nju. Namenjen je ugotavljanju in spremljanju najpogostejših kromosomskih nepravilnosti, ki se pojavljajo pri akutnih lev- kemijah (2). Preiskovanci in načini dela Preiskovanci V raziskavo smo vključili 32 vzorcev bolnikov s Kliničnega od- delka za hematologijo Interne klinike Kliničnega centra Ljublja- na in enega iz Službe za onkologijo in hematologijo Pediatrične klinike Kliničnega centra Ljubljana. Izmed 33 preiskovanih oseb je bilo osemnajst vzorcev bolnikov z akutno mieloblastno levke- mijo (AML), šest z akutno B-limfoblastno levkemijo (B-ALL), enem z akutno T-limfoblastno levkemijo (T-ALL), enem z bifenotipsko levkemijo (BAL), štiri s kronično mieloično levkemijo (KML), tri s sumom na kronično mieloproliferativno bolezen. 32 bolnikom smo ugotavljali kromosomske preureditve ob pojavu bolezni, enemu po zdravljenju s citostatiki. Od preiskovanih oseb je bilo 19 moških, 13 žensk in ena deklica. Mediana starosti moških je bila 51 let, razpon od 18 do 91 let. Mediana starosti žensk je bila 49 let, razpon od 36 do 70 let. Deklica je bila stara 5 let. Diagnoza bolezni je temeljila na značilnih kliničnih znakih, citološkem pre- gledu razmaza krvi in punktata kostnega mozga ter določitvi imunoloških označevalcev. Načini dela Priprava vzorcev kostnega mozga in osamitev RNK RNK smo pridobili iz vzorcev kostnega mozga. Odvzeli smo 1–2 mL kostnega mozga v epruveto Vacuntainer z EDTA anti- koagulantom in 2 ml puferirane fiziološke raztopine. Enojedr- ne celice smo pridobili z gostotnim gradientnim centrifugira- njem preko fikola. Postopek osamitve RNK molekule smo iz- vedli iz 5x106 celic s kolonami in po protokolu reagenčnega kompleta High Pure RNK Isolation (ROCHE, Nemčija). Kolo- ne so izdelane in oblikovane izključno za osamitev celotne molekule RNK, po načinu adsorpcije na steklenih vlaknih (5). Sinteza komplementarne DNK Obratno prepisovanje 1 mg RNK smo izvedli po protokolu paketa mD x HemaVision (BIO RAD, Velika Britanija) (3) in po usklajenem RT-PCR protokolu (2). Reakcije so potekale v na- pravi znamke Perkin-Elmer GeneAmp 9600 (Applied Bio- system, ZDA). I-11 Verižna reakcija s polimerazo (PCR), gelska elektroforeza in ocena velikosti PCR pridelkov Priprava, izvedba in pogoji prve in druge verižne reakcije s polimerazo preiskovalnega in izključitvenega preskusa so bili takšni, kot so opisani v protokolu paketa mD x HemaVision (BIO RAD, Velika Britanija) (5). Pri preiskovalnem preskusu smo izvedli osem vzporednih prvih verižnih reakcij s polime- razo (PCR) in nato, zaradi večje občutljivosti reakcije, naredili še osem vzporednih drugih reakcij. Vsaka reakcija pokriva različne skupine kromosomskih nepravilnosti. Prisotnost spe- cifičnega madeža po agarozni gelski elektroforezi v eni izmed osmih reakcij je pomenila pozitiven izsledek in je določil, kate- ro od osmih skupin reakcij PCR izključitvenega preskusa bo- mo izvajali naprej. Vsaka skupina reakcij PCR izključitvenega preskusa omogoča pomnožitev natančno določenih cDNK se- gmentov kromosomskih preureditev. Po agarozni gelski elek- troforezi smo ocenili velikost drugega pridelka PCR pozitivne reakcije in sklepali na določen mRNK prepis, značilen za trans- lokacijo. Velikost PCR pridelkov za določene kromosomske nepravilnosti je znana (2). Priprava, izvedba in pogoji prve in druge verižne reakcije s polimerazo usklajenega protokola RT-PCR so bili takšni, kot so opisani v navodilu postopka (2). Kontrolni PCR ugotavljanja kakovosti cDNK smo izvedli v ločeni reakciji po protokolu, opisanem v (6). Reakcije so potekale v napravi Perkin-Elmer GeneAmp 9600 (Applied Biosystem, ZDA). Za oceno velikosti PCR pridelkov smo pripravili 1,5-odstotni agarozni gel v 0,5XTris-borat-EDTA (TBE) pufru. V gel smo dodali etidijev bromid, ki nam omogoča zaznavo pridelkov PCR pod ultravijolično (UV) lučjo. 5 µl pufra za nanašanje z barvilom (Gel Loading Buffer; Abgene, Velika Britanija) smo previdno zmešali z 10 µl vzorca in vzorce nanesli v gel. Za oceno velikosti DNK smo v gel nanesli tudi 2 µl DNK označe- valca velikosti (Superladder-Low; od 100 do 1000 bp; Abgene, Velika Britanija). Elektroforeza je potekala v 0,5XTBE pufru pri napetosti 80 V dve uri. Rezultate smo prikazali z UV lučjo sistema BIO RAD Gel Doc 1000, ki omogoča prenos slike s pomočjo kamere CCD v računalniški program. Izsledki Z načinom obratnega prepisovanja in verižne reakcije s poli- merazo (RT-PCR) reagenčnega kompleta (BIO RAD) mD x He- ma Vision smo ocenili osemnajst vzorcev bolnikov z akutno mieloblastno levkemijo (AML), šest z akutno B-limfoblastno levkemijo (B-ALL), enim z akutno T-limfoblastno levkemijo (T- ALL), enim z bifenotipsko levkemijo (BAL), štirim s kronično mieloično levkemijo (KML), tremi s sumom na kronično mi- eloproliferativno bolezen. Vzporedno smo po usklajenem pro- tokolu RT-PCR ugotavljali specifične kromosomske nepravil- nosti, ki so bile že določane v Enoti za diagnostiko Kliničnega oddeleka za hematologijo Kliničnega centra Ljubljana. Pri bol- Razpr. 1. Prikaz 28 kromosomskih preureditev, ki jih lahko ugotovimo z uporabo reagenčnega kompleta mD x HemaVision (BIO RAD). Table 1. The table shows 28 chromosomal rearrangements that could be detected by mD x HemaVision kit (BIO RAD). Kromosomske Vpleteni Kromosomske Sodelujoči nepravilnosti geni Bolezen nepravilnosti geni Bolezen t(x;11) (q13;q23) MLL1(11q23) AML in ALL, MDS, tAL t(8;21) (q22;q22) AML1(21q22) AML (10%;AML M2 40%, AFX1(x;q13) (Preureditve MLL gena MGT8(8q22) pogosta pri otroški AML); na 11q23) 9% tAML in t-MDS t(6;11) (q27;q23) MLL1(11q23) t(15;17) (q21;q22) PML(15q22) APL (98%;9% tAML in t-MDS) AF6(6q27) RARα (17q21) t(11;17) (q23;q21) MLL1(11q23) t(5;17) (q35;q21) NPM(5q35) APL (redka) AF-17(17q21) RARα (17q21) t(11;19) (q23;p13.1) MLL1(11q23) t(11;17) (q23;q21) PLZF(11q23) APL (< 1%) ELL(19p13.1) RARα (17q21) t(9;11) (q22;q23) MLL1(11q23) inv(16) (p13;q22) CBFβ(16 q22) AML(5–10%;20% M4;100% M4eo; AF9(9q22) MYH11 (16p13) redko M2.M5, KML v BP z M4eo tipom, MDS) t(10;11) (p12;q23) MLL1(11q23) t(16;21) (p11;q22) TLS(16p11) AML (redka) AF10(10p12) ERG(21q22) t(1;11) (q21;q23) MLL1(11q23) t(9;9) SET(9q34) AML AF1q(1q21) CAN(9q34) t(1;11) (p32;q23) MLL1(11q23) t(6;9) (p23;q34) DEK(6p23) AML in MDS (1%) AF-1p(1p32) CAN(9q34) t(4;11) (q21;q23) MLL1(11q23) t(1;19) (q23;p13) E2A(19p13) B-ALL (5%) AF4(4q21) PBX1(1q23) t(11;19) (q23;p13.3) MLL1(11q23) t(17;19) (q22;p13) E2A(19p13) B-ALL (1%) ENL(19p13.3) HLF(17q22) t(3;21)(q26;q22) AML1(21q22) KML v BP mieloične vrste t(12;21) (p13;q22) TEL(12p13) B-ALL (otroška 15–35%, odrasli MDS1 (3q26) (1%), AML (> 1%) in tMDS AML1(21q22) redko) t(3;21) (q26;q22) AML1(21q22) TAL1(40kb deletion) SIL1(1p34) T-ALL (10–30%) EVI1(3q26)/MDS1(3q26) TAL1(1p34) t(3;21) (q26;q22) AML1(21q22) t(9;22) (q34;q11) BCR(22q11) KML (večina), ALL (20%odraslih; EAP (3q26) ABL(9q34) 25% otroških), AML (3% odrasli, 1% otroška) t(3;5) (q25.1;q34) NPM(5q34) AML, MDS in KML v BP t(12;22) (p13;q11) TEL(12p13) MPS, AML, atipična KML (redka) MLF1(3q25.1) MN1(22q11) t(9;12) (q34;p13) TEL(12p13) Redko – KML, ALL in AML t(5;12) (q33;p13) TEL(12p13) KEL, KMMoL z eozinofilijo, ABL(9q34) PDGFRb(5q33) MDS/MPS (redka) AML, akutna mieloična levkemija; ALL, akutna limfatična levkemija linije B ali T; KEL, kronična eozinofilna levkemija in hipereozinofilni sindrom; KML, kronična mieloična levkemija; KMMoL, kronična mielomonocitna levkemija, MDS, mielodisplastični sindrom; MPS, mieloprolifertivna bolezen; BP, blastna preobrazba, tAML, tMDS, tAL; AML, mielodisplastični sindrom in akutna levkemija zaradi predhodnega zdravljenja. Podatki so povzeti iz (4). PAJIČ T, LJUTIĆ E, ČERNELČ P. PREPOZNAVANJE ZNAČILNIH KROMOSOMSKIH PREUREDITEV Z REAGENČNIM KOMPLETOM mDX HemaVision I-12 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I nikih z akutno levkemijo smo izvedli preiskave za ugotavljanje mRNK oziroma cDNK segmentov, značilnih za t(9;22) (q34;q11), t(8;21)(q22;q22), inv16(p13;q22), t(15;17) (q21;q21) in t(4;11)(q21;q23). Dobili smo 100-odstotno uje- manje izsledkov za preiskave, ki so skupne obema postopko- ma. Značilen BCR-ABL mRNK prepis t(9;22)(q34;q11) smo dokazali pri bolniku z B-ALL, bolniku z BAL in pri štirih bolnikih s KML. AML1-ETO mRNK prepis t(8;21)(q22;q22) smo ugoto- vili pri dveh bolnikih z AML. Pri enem bolniku z AML z nenor- malnimi eozinofilci v kostnem mozgu smo dokazali prepis CBFβ /MYH 11 mRNK inv16(p13;q22). MLL /AF4 mRNK pre- pis t(4;11))(q21;q23) smo ugotovili pri deklici z B-ALL in bolni- ku z B-ALL po zdravljenju s citostatiki. Pri bolniku z B-ALL smo z uporabo reagenčnega kompleta mD x HemaVision ugotovili MLL /AF10 mRNK prepis značilen za t(10;11)(p12;q23). Pri drugih nismo ugotovili značilnih kromosomskih preureditev, ki jih s preiskavami lahko zaznamo. Razpravljanje Uspešno smo vpeljali način obratnega prepisovanja in hkrat- ne verižne reakcije s polimerazo kompleta mD x HemaVision (3) na vzorcih bolnikov in izvedli sočasne preiskave po uskla- jenem protoklou RT-PCR (2). Za skupine bolezni, pri katerih je kromosomska nepravilnost prisotna v velikem odstotku, in je za bolezen značilna, smo dobili pričakovane izsledke pre- iskav (glej Izsledke). Po podatkih iz literature (1) je pri več kot 95% bolnikov s KML prisoten BCR-ABL mRNK prepis t(9;22) (q34;q11). V 98% je PML-RARα mRNK prepis t(15;17) (q21;q21) značilna za akutno promielocitno levkemijo, podvr- sto AML. Pri večini bolnikov je pri podvrsti AML z eozinofilijo značilnen prepis CBFβ /MYH 11 mRNK inv16 (p13;q22) (1). Zato smo tem bolnikom po usklajenem protokolu RT- PCR izvedli le preiskavo, značilno za bolezen. Dobili smo 100-odstotno ujemanje rezultatov preiskav, ki so skupne obema postopkoma. Pri treh bolnikih z akut- no levkemijo smo ugotovili preureditev gena MLL. Ta se pojavlja pri AML, B-ALL, mielodisplastičnih sindro- mih, včasih pri T-ALL in pri sekundarnih levkemijah. Pri AML sodi preureditev v podskupino AML s ponav- ljajočimi se kromosomskimi nepravilnostmi in s slabo prognozo. Pri ALL ne predstavlja posebnih bolezen- skih entitet, ampak večinoma pomeni slabo napoved (4). Uporaba kompleta je enostavna in omogoča ugotav- ljanje značilnih cDNK segmentov kromosomskih ne- pravilnosti sočasno. Pri tem vključuje pomnožitev spe- cifičnega cDNK segmenta, nastalega iz zaporedja RNK, ki je prisoten v vseh vzorcih (Sl. 1). Ta nam služi kot kontrola kakovosti vzorcev cDNK. Protokol usklaje- nega RT-PCR ne omogoča sočasnega pomnoževanja več iskanih cDNK segmentov v eni reakciji. Vse reak- cije ugotavljanja kromosomskih preureditev in kon- trolno pomnožitev izvedemo v ločenih reakcijah. Ta- ko bi za vsako kromosomsko preureditev morali na- rediti več reakcij, kar bi podražilo in podaljšalo prido- bitev izsledkov. Pri nekaterih podvrstah levkemij se kromosomske nepravilnosti pojavljajo v velikem od- stotku. Pri teh se lahko na temelju značilnih kliničnih znakov bolezni, na osnovi citološkega pregleda krv- nega razmaza in punktata kostnega mozga ter imuno- loških označevalcih, odločimo opraviti preiskavo po usklajenem protokolu RT-PCR. Zaključki Na osnovi skladnosti dobljenih rezultatov med reagenčnim kompletom mD x HemaVision in usklajenim protokolom RT- PCR sklepamo, da je preiskava z reagenčnim kompletom primerna za molekularno genetično prepoznavanje levkemij, ker omogoča ugotovitev velikega števila specifičnih prepisov mRNK pri kromosomskih nepravilnostih hkrati. Namenjena je za njihovo ugotavljanje ob pojavu bolezni in po zdravljenju s citostatiki, pri katerih lahko pride do pojava novih kromosom- skih nepravilnosti. Z njim pridobimo več informacij v krajšem času. Uporablja se lahko kot pomembna redna preiskava pri diagnostiki levkemij. Literatura 1. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW eds. World Health Organization Classification of tumours, pathology and genetics, tumours of haematopo- ietic and lymphoid tissues. Lyon: International Agency for Research on Cancer (IARC), 2001. 2. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concer- ted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 1999; 13: 1901–28. 3. Anon. mD x HemaVision Multiplex RT-PCR System for Typing/Subtyping of leukemia, Instruction manual. Milano, München, Paris: BIO-RAD Diagnostics Group, 2001. 4. http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Anomalies/Anomli- ste.html 5. Anon. High Pure RNA Isolation kit, Instruction manual. Mannheim: ROCHE Diagnostics, 2000. 6. Watzinger F, Lion T. Multiplex PCR for quality control of template RNA/cDNA in RT-PCR assays. Leukemia, 1998; 12: 1984–6. Sl. 1. Prikaz primera agarozne gelske elektroforeze za preiskovalni (A) in izključitveni (B) preskus reagenčnega kompleta mD x HemaVision za preiskovanca K.M. z inv16(p13;q22); A. Madež v vrstici 7 pri 270 bp pomeni pozitiven izsledek za skupino reakcij določenih kromosom- skih nepravilnosti. B. Madež v vrstici 3 pri 270 bp pomeni pozitiven izsledek za inv16(p13;q22), tip A mRNA prepis. Madeži pri 911 bp pomenijo uspešno pomnoženo interno kontrolo; M, označevalec DNA velikosti od 100 do 1000 bp. Figure 1. The example of the agarose gel electophoresis for screen (A) and split-out (B) tests of mD x HemaVision kit for K.M. patient with the inv16(p13;q22).; A. The band in the lane 7 (270 bp) is a positive result for a group of reactions of the certain chromosomal’s abnormalities. B. The band in the lane 3 (270 bp) is a positive result for mRNA trans- cript, type A of the inv16(p13;q22). Bands in 911 bp show a success- fully amplified internal control; M, DNA size ladder (from 100 to 1000 bp).