Vpliv polimorfizmov v genih za alfa in beta fibrinogen na raven fibrinogena v plazmi*
The influence of alpha and beta fibrinogen genes' polymorphisms on plasma fibrinogen level*
Lili Steblovnik**
Ključne besede fibrinogen - kri - genetika polimorfizem (genetika) polimerazna verižna reakcija
Izvleček. Zvišana koncentracija fibrinogena v plazmi je dejavnik tveganja za srčnožilne bolezni. Na koncentracijo fibrinogena v plazmi vplivajo poleg starosti, sladkorne bolezni, arterijske hipertenzije, kajenja in zvišane koncentracije holesterola v plazmi tudi genetski dejavniki. Raziskave o vplivu polimorfizmov TaqI, HaeIII in BclI v genih za fibrinogen na koncentracijo fibrinogena v plazmi so pokazale nasprotujoče si rezultate. Preveriti smo želeli hipotezo, da polimorfizmi TaqI, HaeIII in BclI v genih za fibrinogen vplivajo na koncentracijo fibrinogena v plazmi pri zdravih prebivalcih Slovenije. V presečno raziskavo smo vključili 143 zdravih prostovoljcev. V vzorcih krvne plazme smo s koagulacijsko metodo določili koncentracijo fibrinogena. Z metodo verižne polimerazne reakcije in s cepljenjem z restrikcijskimi encimi 7aqI, HaeIII in BclI smo v vzorcih izolirane DNA določili polimorfizme. Podatke smo statistično obdelali s Studentovim t-testom, analizo variance, testom hi-kvadrat in multiplo regresijo. Povprečna koncentracija fibrinogena v vzorcu je bila 2,78 g/l (95% interval zaupanja 2,65-2,92 g/l), pri kadilcih višja kot pri nekadilcih (statistično nepomembno; p = 0,40). Povezanosti polimorfizma 7aqI in koncentracije fibrinogena v plazmi nismo ugotovili. Na koncentracijo fibrinogena v plazmi sta pomembno vplivala polimorfizma HaeIII (p = 0,04) in BclI (p = 0,04) pri nekadilcih. Polimorfizem HaeIII je prispeval 5% variance fibrinogena (p=0,03). Pri kadilcih vpliv polimorfizmov HaeIII in BclI na koncentracijo fibrinogena ni bil statistično pomemben.
Key words
fibrinogen - blood - genetics polymorphism (genetics) polymerase chain reaction
Abstract. Elevated plasma fibrinogen concentration is a risk factor for cardiovascular diseases. In addition to several factors such as advanced age, diabetes mellitus, cardiovascular diseases, elevated plasma cholesterol and glucose, and smoking, also genetic factors have been shown to influence plasma fibrinogen level. Studies on influence of TaqI, Haelll and Bcll polymorphisms on plasma fibrinogen concentration have shown contradictory results. Therefore, the influence of 7aql, Haelll and Bcll polymorphisms on plasma fibrinogen concentration was investigated in healthy subjects from Slovenia. 143 healthy volunteers were included in the cross-sectional study. Fibrinogen values were determined with a clotting assay. Polymorphisms were detected by polymerase chain reaction and digestion with 7aql, Haelll and Bcll restriction enzymes. Statistical analysis was performed with Student's t-test, analysis of variance, chi-squared test and multiple regression analysis. ln all individuals mean plasma fibrinogen concentration was 2.78 g/l (95% confidence interval 2.65-2.92g/l), in smokers higher than in non-smokers (not significant; p = 0.40). Polymorphism 7aql was not associated with plasma fibrinogen level. There was a significant association between plasma fibrinogen concentration and Haelll (p=0.04) and Bcll (p=0.04) polymorphisms in the group of non-smokers. 5 % of the plasma fibrino-gen variance in non-smokers could be attributed to the Haelll polymorphism (p=0.03). ln smokers, there was no association between Haelll and Bcll polymorphisms and plasma fibrinogen level.
"Objavljeno delo je bilo nagrajeno s Prešernovo nagrado za študente v letu 1997.
**Lili Steblovnik, abs. med., Oddelek za medicinsko genetiko, Ginekološka klinika, Klinični center, 1525 Ljubljana.
Uvod
Fibrinogen je krvna beljakovina in ga poznamo predvsem kot dejavnik koagulacije. Trom-bin ga encimsko pretvarja v fibrin, glavno sestavino krvnih strdkov (1). Fibrinogen v visokih koncentracijah spodbuja zlepljanje trombocitov (2) in zaradi svojih reoloških lastnosti v veliki meri prispeva k viskoznosti krvi. V plazmi je običajno v koncentraciji od 2 do 3 g/l (3).
Prospektivne raziskave so pokazale, da je koncentracija fibrinogena v krvi, višja od 3,5 g/l, močan, neodvisen dejavnik tveganja za srčni infarkt in možgansko kap (4, 5). Fibrinogen ima pomembno vlogo tudi pri nastanku venskih tromboz (6). Zapleti srčnožilnih bolezni pa so pri bolnikih z višjimi koncentracijami fibrinogena pogostejši (7).
Na koncentracijo fibrinogena v plazmi vpliva več dejavnikov. Koncentracija se zviša kot odgovor na vnetje in poškodbo, ob uporabi hormonske kontracepcije, med nosečnostjo in po menopavzi, zvišuje pa se tudi s starostjo (8-11). Pri ljudeh s hiperlipidemijo (12-14), sladkorno boleznijo ali arterijsko hipertenzijo (15) opažamo višje koncentracije fibrinogena v plazmi kot pri zdravih ljudeh. Kajenje kot dejavnik okolja močno zvišuje koncentracijo fibrinogena (16). Zmerno uživanje alkoholnih pijač pa koncentracijo fibrinogena znižuje (9-11).
Koncentracija fibrinogena v plazmi je tudi genetsko določena (17). Vendar še ni popolnoma jasno, kako na koncentracijo fibrinogena v plazmi vplivajo razlike v strukturi genov za fibrinogen - polimorfizmi. Zapis za molekulo fibrinogena je v treh genih. V območju le-teh je opisanih nekaj polimorfizmov, ki bi zaradi svoje lege lahko pomembno vplivali na razlike v koncentraciji fibrinogena med posamezniki. Vendar so raziskave morebitnega vpliva pokazale nasprotujoče si rezultate. V raziskavah na prebivalcih Anglije in Švedske (18-20) so opisali pomembno višje koncentracije fibrinogena v plazmi pri ljudeh, ki so nosilci alelov tveganja v genih za fibrinogen. Aleli z večjim tveganjem naj bi bili alel T1 polimorfizma Taq\, alel A polimorfizma Hae\\\ in alel B2 polimorfizma Bcl. Povezave med koncentracijo fibrinogena v plazmi in naštetimi polimorfizmi v genih pa pri norveški in irski raziskavi niso mogli potrditi (21, 22).
Molekularna genetika fibrinogena
Človeški fibrinogen je glikoprotein, sestavljen iz treh parov strukturno različnih polipep-tidnih verig - Aa, Bp in y. Vsaka polipeptidna veriga ima zapis v svojem genu (alfa, beta in gama gen), ti pa se nahajajo v okoli 50 kb veliki gruči, na dolgi ročici 4. kromosoma (23).
V območju genov za fibrinogen je znanih več polimorfizmov (slika 1) (24, 25). Nekateri naj bi vplivali na sintezo fibrinogena in s tem na njegovo koncentracijo v plazmi.
Polimorfizem Taq\ najdemo v območju gena za verigo Aa fibrinogena. Označuje ga ce-pilno mesto za encim 7aq\. Opisali so vpliv polimorfizma Taq\ na koncentracijo fibrinogena v plazmi (26), vendar vpliva v vseh raziskavah niso mogli potrditi (22).
Polimorfizem Hae\\\ se nahaja v promotorskem delu gena za verigo Bp fibrinogena. Je točkovna mutacija, zamenjava adenina za gvanin na mestu -445 od začetka gena beta. Določimo ga lahko z encimsko cepitvijo z encimom Hae\\\ (27). Sinteza verige Bp fibrinogena
G/T
Thr/Ala
Arg/Lys
KpnI / Sad
Hind\\\
HaelII
gama
alfa
beta
Slika 1. Shematičen prikaz polimorfizmov v območju alfa, beta in gama genov za fibrinogen. Polimorfizme označujejo cepilna mesta za restrikcijske encime (KpnI/SacI, TaqI, BclI, Hindlll in Haelll), zamenjave aminokislin (Thr/Ala, Arg/Lys), tetranukleotidno zaporedje in točkovna mutacija G/T (zamenjava gvanina za timin).
naj bi bila regulatorna stopnja pri sintezi celega fibrinogena, zato predpostavljamo, da ima polimorfizem vlogo pri določanju koncentracije fibrinogena v plazmi.
V območju gena beta je tudi polimorfizem BclI. Označuje ga cepilno mesto za encim Bcl. V raziskavi na prebivalcih Anglije (18) so ugotovili močan vpliv na koncentracijo fibrinogena v plazmi, česar pa pri Norvežanih niso mogli potrditi (22). Več alelov B2 so odkrili pri bolnikih v primerjavi s kontrolno skupino v raziskavi o periferni arterijski bolezni (28).
Namen naloge
Preveriti smo želeli hipotezo, da polimorfizmi Hae\\\ in Bcl (gen za verigo Bp fibrinogena) in Taq\ (gen za verigo Aa fibrinogena) pomembno vplivajo na koncentracijo fibrinogena v plazmi pri zdravih prebivalcih Slovenije.
Metode
Preiskovanci
V raziskavo smo zajeli 143 zdravih prostovoljcev iz Slovenije, ki si niso bili v sorodu. Preiskovanci so bili zdravstveni delavci, študentje medicine in njihovi znanci. Stari so bili od 20 do 60 let (povprečno 39,5 let). 61 preiskovancev je bilo moškega spola in 82 ženskega. V anamnezi niso imeli bolezni, za katere je znano, da vplivajo na koncentracijo fibrinogena v plazmi (sladkorna bolezen, srčnožilne bolezni). V zadnjem mesecu dni pred vključitvijo v raziskavo nihče od preiskovancev ni bil poškodovan in nihče ni jemal zdravil. V času odvzema krvi nobena od žensk ni bila noseča, nobena ni jemala hormonskih kontracepcijskih sredstev ali hormonskih nadomestnih zdravil. Ob vključitvi v raziskavo smo jim izmerili višino in telesno maso in izračunali indeks telesne mase (BM\) po enačbi BM\ = telesna masa (kg)/(telesna višina)2 (m2). Zabeležili smo tudi kadilske navade preiskovancev: 57 je bilo kadilcev, 78 nekadilcev in 8 bivših kadilcev. Bivše
kadilce smo uvrstili v skupino nekadilcev, ker so abstinirali tri mesece pred odvzemom
Prostovoljci so pisno privolili k sodelovanju. Raziskavo je odobrila Komisija za medicinsko etiko pri Ministrstvu za zdravstvo Republike Slovenije.
Odvzem krvi
Preiskovancem smo odvzeli kri med pol osmo in deveto uro zjutraj, potem ko so 20 minut počivali v sedečem položaju. Preiskovanci so bili tešči in vsaj 24 ur niso pili alkoholnih pijač. Kri smo odvzeli iz komolčne vene, s čim krajšim zažemom nadlahti.
Za biokemične preiskave smo odvzeli 10 ml krvi v epruveto brez dodatkov. Z 10-minut-nim centrifugiranjem vzorca pri sobni temperaturi smo pripravili serum. Krvne maščobe in krvni sladkor smo določili iz svežega seruma.
Za določitev fibrinogena smo odvzeli 9 ml krvi v ohlajeno, vakuumsko, silikonizirano, stekleno epruveto z dodatkom 0,13 mol/l natrijevega citrata. Do centrifugiranja smo epruvete s krvjo hranili v ledeni kopeli. Največ eno uro po odvzemu smo pripravili plazmo s centrifugiranjem citrirane krvi 30 minut pri 2000 x g in temperaturi 4°C. Plazmo smo odpi-petirali v manjše plastične epruvete in jo do laboratorijskega testiranja shranili pri -70°C.
Za izolacijo DNA smo odvzeli 5 ml krvi v vakuumsko epruveto s K3-EDTA (Becton Dickinson, Vacutainer System Europe). Vzorec smo z obračanjem epruvete dobro premešali z antikoagulantom in ga do obdelave shranili na -70°C.
Biokemične preiskave
Koncentracijo glukoze v krvi smo določili z encimsko metodo, z reagenti proizvajalca Dialab (Dunaj, Avstrija). Glukoza v serumu se je ob dodatku heksokinaze in adenozin-5-tri-fosfata (ATP) pretvorila v glukoza-6-fosfat. Ta je nato dehidrogeniral z glukoza-6-fosfatno dehidrogenazo ob prisotnosti nikotinamid-adenin-dinukleotida (NAD). Ob tem se je spremenila absorbanca vzorca, ki smo jo merili pri 340 nm (29).
Celotni holesterol smo določali z encimsko metodo. Uporabili smo reagente proizvajalca Dialab (Dunaj, Avstrija). Holesterolne estre v vzorcih in standardu smo s holesterol-no esterazo hidrolizirali v prosti holesterol in maščobne kisline. Nato smo prosti holesterol oksidirali s holesterolno oksidazo. Nastali vodikov peroksid je v prisotnosti peroksida-ze in fenola oksidiral 4-aminofenazon v obarvano spojino, katere absorbanco smo merili pri 500 nm (30).
Določanje koncentracije fibrinogena v plazmi
Koncentracijo fibrinogena v vzorcih plazem smo določali z modificirano metodo po Claus-su (31) s tovarniško pripravljenimi reagenti (Multifibren U, Behring, Nemčija). Plazmo smo segreli na 37°C in jo koagulirali s presežkom trombina. Koagulacijski čas, ki smo ga merili, je bil odvisen od koncentracije fibrinogena v vzorcu.
Koagulacijski čas smo merili s koagulacijskim aparatom (Fibrintimer, Behring, Nemčija). Aparat smo umerili s kontrolnima plazmama z znanima koncentracijama fibrinogena
(Plazma P in N, Behring, Nemčija) in s štirimi standardi (koncentracije fibrinogena 1,1 g/l; 2,4 g/l; 3,5 g/l in 5,0 g/l; Behring, Nemčija).
Izolacija DNA iz krvi
DNA smo izolirali s tovarniško pripravljenimi reagenti (Wizard™ Genomic DNA Purification Kit, Promega, ZDA). Vzorcu krvi smo z dodajanjem reagentov razgradili celične in jedrne membrane ter ribonukleinske kisline. S precipitacijo smo odstranili beljakovine in z etanolom oborili DNA. DNA smo nato na zraku posušili in jo raztopili v tovarniško pripravljenem topilu.
Koncentracijo izolirane DNA smo določali s spektrofotometrom pri valovni dolžini svetlobe 260 nm. Upoštevali smo, da ekstinkcija A260= 1 ustreza koncentraciji DNA 50 ng/^l (32).
Določanje polimorfizmov
Polimorfizme v genih za fibrinogen smo določili z encimskim cepljenjem delov DNA, ki smo jih pred tem pomnožili z verižno polimerazno reakcijo.
Pomnoževanje delov DNA z verižno polimerazno reakcijo
Verižna polimerazna reakcija (PCR-polymerase chain reaction) je postopek, pri katerem s pomočjo spreminjanja temperatur in z encimom Taq polimerazo v ugodnih pogojih pomnožimo želeni del DNA med dvema začetnima oligonukleotidoma. Ugodne pogoje zagotavlja primerno razmerje vzorčne DNA, obeh začetnih oligonukleotidov, deok-sinukleotidtrifosfatov (dNTP) in magnezijevih ionov v pufru. Reakcija ima tri faze, ki se glede na količino želenega produkta večkrat ponovijo (običajno od 25- do 30-krat). V prvi fazi pri visoki temperaturi poteka denaturacija vzorčne DNA. V drugi fazi temperaturo znižamo, da se na željena mesta vzorčne DNA pripnejo začetni oligonukleotidi. Le-ti v tretji fazi predstavljajo osnovo za podaljševanje z encimom polimerazo. Tako iz majhne količine osnovne DNA dobimo 2n kopij želenega odseka (n je število ponovitev ciklov).
Verižna polimerazna reakcija je potekala v grelnem bloku (PTC-200, MJ Research, ZDA).
Za 25 |il reakcijske mešanice smo uporabili:
•	50 ng DNA,
•	2,5 |il 0,2 mM dNTP (dNTP mix, Gibco BRL, New York, ZDA),
•	1,25 |il 0,5 mM obeh začetnih oligonukleotidov (Gibco BRL, New York, ZDA),
•	0,75|il 1,5 mM MgCl2 (Gibco BRL, New York, ZDA),
•	2,5 |il 1 xPCR-pufra (Gibco BRL, New York, ZDA),
•	1 enoto Taq polimeraze (Gibco BRL, New York, ZDA) in
•	dopolnili do 25 |il z bidestilirano vodo.
Pomnoževali smo tri odseke DNA. Za vsakega smo uporabili drugačen protokol (tabela 1) in različna zaporedja začetnih oligonukleotidov (27). Za pomnoževanje dela DNA na a-verigi gena za fibrinogen smo uporabili naslednji zaporedji začetnih oligonukleotidov:
TaqI-R: 5'-AGC CGT GCC TAT CTT TG-3', TaqI-F: 5'-TGT CTC AGG TAC ATT TAG C-3'.
Zaporedja začetnih oligonukleotidov za pomnoževanje odsekov DNA na p-verigi gena za fibrinogen pa so bila:
Bcl-R: 5'-ACC TGG TTT CTC TGC CAC AAG-3', Sc/I-F: 5'-AAT AGT TCT CAT ACC ACA GTG T-3', Hae\\\-R: 5'-AAG AAT TTG GGA ATG CAA TCT CTG CTA CCT-3', HaeIII-F: 5'-CTC CTC ATT GTC GTT GAC ACC TTG GGA C-3'.
Tabela 1. Temperaturni protokoli verižne polimerazne reakcije za tri različne polimorfizme. ZD — začetna denaturacija, D — denaturacija, P — pripenjanje, PD — podaljševanje in KP — končno podaljševanje.
veriga a (TaqI)	veriga p (HaeIII)	veriga p (Bcl)
ZD	1 X	95°C	5min	1 X	95°C	7min	1 X	95°C	7min
D	36x	95°C	1 min	36x	95°C	1 min	37x	95°C	1 min
P		55°C	1 min		60°C	1 min		62°C	1 min
PD		72°C	1 min		72°C	1 min		72°C	1,5min
KP	1 X	72°C	2min	1 X	72°C	5min	1 X	72°C	5min
Cepljenje PCR-produktov s pomočjo restrikcijskih encimov
Za cepljenje z encimom Hae\\\ smo 18|il PCR-produkta dodali 2|il pufra (REACT®2, Gib-co BRL, New York, ZDA) in 10 enot encima Hae\\\ (Gibco BRL, New York, ZDA). Vzorce smo inkubirali čez noč pri 37°C.
Za cepljenje z Bc/\ smo 18 |il PCR produkta dodali 2 |il pufra (REACT®2, Gibco BRL, New York, ZDA) in 5 enot encima Bc/\ (Gibco BRL, New York, ZDA) in zmes 3 ure in-kubirali pri 50°C.
Za cepljenje s Taq\ smo 18PCR produkta dodali 2pufra (REACT®2, Gibco BRL, New York, ZDA), 2 |il govejega serumskega albumina (Acetylated BSA, Promega, ZDA) in 1-2 enoti encima Taq\ (Gibco BRL, New York, ZDA). Zmes smo inkubirali pri 65°C 1 uro in 30 minut.
Analiza produktov
Produktom verižne polimerazne reakcije in cepitve z encimi smo dodali po 3 |il barvila bromofenol modro in jih ločili z elekroforezo na 2% agaroznem gelu, ki je vseboval eti-dijev bromid.
Elektroforetska ločba je tekla 2 uri pri napetosti 60 V. Gel smo nato presvetlili na UV-trans-iluminatorju. V strukturo dvojnovijačne molekule DNA vrinjen etidijev bromid je ob pres-vetlitvi z UV-svetlobo fluoresciral. Velikost fragmentov smo določili s primerjanjem z ustreznim dolžinskim standardom (OX174 RF DNA/Hae\\\ Fragments, Gibco BRL, New York, ZDA). Gel smo fotografirali in s pomočjo elektronskega čitalca spravili v obliko računalniškega zapisa.
Statistične metode
Spremenljivke, ki so se razporejale normalno (BMI), smo izrazili z aritmeti~no sredino s 95% intervalom zaupanja. Razporeditev ostalih spremenljivk (koncentracije fibrino-gena, holesterola in glukoze v plazmi) smo normalizirali z logaritmiranjem, vrednosti pa prikazali kot antilogaritmirane aritmeti~ne sredine s 95% intervalom zaupanja.
Povezavo koncentracije fibrinogena z ostalimi spremenljivkami smo ocenili s Pearsonovim korelacijskim koeficientom. Razlike v spremenljivkah med skupinama kadilcev in nekadilcev smo analizirali s Studentovim t-testom. Z analizo variance smo prikazali razlike v koncentraciji fibrinogena med posameznimi genotipi. Vpliv presnovnih spremenljivk in genotipov na koncentracijo fibrinogena v plazmi pa smo vrednotili z modelom multiple regresije.
Frekvence alelov smo dolo~ili s {tetjem. S testom hi-kvadrat smo analizirali odstopanje {tevila opazovanih genotipov od pri~akovanega {tevila. Pri~akovano {tevilo smo izravnali s predpostavko, da so genotipi v Hardy-Weinbergovem ravnovesju.
Pri preizku{anju domnev smo kot statisti~no pomembno upo{tevali vrednost p, manj{o od 0,05. Statisti~no analizo smo naredili s pomo~jo ra~unalni{kega programa (Statisti-ca, ver. 4.5A, Stat Soft Inc. 1993, ZDA).
Rezultati
Osnovne značilnosti preiskovancev
Osnovne zna~ilnosti preiskovancev so prikazane v tabeli 2. Povpre~na vrednost fibrinogena v plazmi za vse preiskovance je bila 2,78 g/l. Koncentracija fibrinogena se je spreminjala s starostjo, z BMI ter s koncentracijama holesterola in glukoze (tabela 3). Med spoloma ni bilo statisti~no pomembnih razlik v koncentraciji fibrinogena (p = 0,37). Koncentracija fibrinogena je bila pri kadilcih vi{ja kot pri nekadilcih, vendar ne statisti~no pomembno. Dosedanje raziskave so pokazale pomemben vpliv kajenja na koncentracijo fibrinogena v plazmi, zato smo statisti~no obdelavo naredili posebej pri nekadilcih in kadilcih.
Tabela 2. Osnovne značilnosti preiskovancev (srednje vrednosti s 95% intervali zaupanja). N — število bolnikov, BMI — indeks telesne mase.
	Vsi	Nekadilci	Kadilci	p
	N = 143	N = 86	N = 57	
Fibrinogen (g/l)	2,78	2,73	2,86	0,40
	2,65-2,92	2,57-2,91	2,63-3,10	
Starost (leta)	39,5	41,7	36,1	<0,01
	37,7-41,3	39,4-44,2	33,5-38,7	
BMI (kg/m2)	25,2	25,5	24,5	0,10
	24,5-25,8	24,7-26,4	23,4-25,5	
Holesterol (mmol/l)	5,08	5,27	4,82	0,02
	4,89-5,28	5,02-5,53	4,54-5,13	
Glukoza (mmol/l)	4,99	5,18	4,72	<0,01
	4,87-5,10	5,01-5,34	4,57-4,86	
Tabela 3. Korelacijski koeficienti po Pearsonu za povezave med koncentracijo fibrinogena v plazmi in ostalimi spremenljivkami. N — število bolnikov, BMI — indeks telesne mase.
	Vsi	Nekadilci	Kadilci
	N = 143	N = 86	N = 57
Starost (leta)	0,22*	0,31*	0,17
BMI (kg/m2)	0,33*	0,41*	0,26
Holesterol (mmol/l)	0,25*	0,26*	0,29*
Glukoza (mmol/l)	0,28*	0,45*	0,10
* vrednosti so statisti~no zna~ilne (p <0,05) Analiza polimorfizmov Polimorfizem HaeIII
Pomnoževali smo 1301 baznih parov dolg del DNA, ki je poleg stalnega vključeval tudi spremenljivo cepilno mesto za encim Hae\\\. Gvanin na spremenljivem mestu (alel G) je povzročil dvakratno cepljenje dela DNA z encimom Hae\\\. Če je bil na spremenljivem mestu namesto gvanina adenin (alel A), je prišlo do cepitve le na stalnem cepil-nem mestu (slika 2). Glede na število in razporeditev fragmentov DNA, ki smo jih prikazali z elektroforetsko ločbo, smo določili genotipe (tabela 4). \zračunali smo, da se alel G pojavlja s frekvenco 0,74, alel A pa s frekvenco 0,26. Število posameznih genotipov smo primerjali z izračunanim pričakovanim številom in ugotovili popolno Hardy-Wein-bergovo ravnovesje (tabela 4).
1301 bp 958 bp
■<- 575 bp
383 bp 343 bp
PCR AG AA GG
Slika 2. Elektroforetska ločba produktov cepitve pri polimorfizmu Haelll. PCR — nerazgrajen, 1301 baznih parov dolg fragment PCR-produkta; AG, AA in GG — genotipi polimorfizma Haelll, ki jih označujejo produkti cepitve različnih dolžin; bp — bazni pari.
Tabela 4. Primerjava opazovanega števila genotipov pri preiskovancih s pričakovanim številom genotipov po Hardy-Weinbergovem ravnovesju. X2 = 0,28; ni statistično značilno. N — število bolnikov.
Genotip	Opazovano		Pričakovano
	N	delež	N delež
GG	79	0,55	78,3 0,55
AG	53	0,37	55 0,38
AA	11	0,08	9,6 0,07
Polimorfizem Bcl\
Za določitev polimorfizma Bcll smo pomnoževali 2500 baznih parov dolg del DNA in ga nato cepili z encimom Bcll. Alel B2 je vključeval cepilno mesto, alel B1 pa ne (slika 3). Frekvenca alela B1 je bila 0,78, alela B2 pa 0,22. Po primerjavi zastopanosti genotipov v vzorcu s pričakovanim številom smo ugotovili popolno Hardy-Weinbergovo ravnovesje (tabela 5).
2500 bp
1400 bp 1100 bp
B1B2 B1B1 B2B2 PCR
Slika 3. Elektroforetska ločba produktov cepitve pri polimorfizmu Bcll. 0X — dolžinski standard 0X174; B1B2, B1B1 in B2B2 — genotipi polimorfizma Bcll, ki jih označujejo produkti cepitve različnih dolžin; PCR — nerazgrajen produkt PCR; bp — bazni pari.
Tabela 5. Primerjava opazovanega števila genotipov pri preiskovancih s pričakovanim številom genotipov po Hardy-Weinbergovem ravnovesju. X2 = 2,06; ni statistično značilno. N — število bolnikov.
Genotip	Opazovano		Pričakovano
	N	delež	N delež
B1B1	87	0,62	85,2 0,61
B1B2	43	0,31	48,0 0,34
B2B2	10	0,07	6,8 0,05
Polimorfizem Taq
V območju alfa gena za fibrinogen smo določali polimorfizem Taq\. Z verižno polime-razno reakcijo smo pomnoževali 900 baznih parov dolg del DNA in ga nato cepili z encimom Taq\ (slika 4). Alel T1 je bil s frekvenco 0,73 pogostejši, pri njem do cepitve ni prišlo. Alel T2, ki se je pojavljal s frekvenco 0,27, pa je označevalo cepilno mesto za encim Taq\. S primerjavo števila genotipov iz vzorca s pričakovanim številom smo potrdili Hardy-Weinbergovo ravnovesje (tabela 6).
900 bp 800 bp
PCR T1T1 T1T2 T1T2
Slika 4. Elektroforetska ločba produktov cepitve pri polimorfizmu TaqI. PCR — produkt PCR; T1T1 in T1T2-genotipa polimorfizma TaqI, kiju označujejo produkti cepitve različnih dolžin (100 baznih parov dolg produkt pri genotipu T1T2 ni prikazan); bp — bazni pari. Genotip T2T2 označujeta produkta cepitve dolžin 800 in 100 baznih parov (ni prikazano).
Tabela 6. Primerjava opazovanega števila genotipov pri preiskovancih s pričakovanim številom genotipov po Hardy-Weinbergovem ravnovesju. X2 = 0,28; ni statistično značilno. N — število bolnikov.
Genotip	Opazovano	Pričakovano
N	delež	N	delež
T1T1	80	0,56	76,2	0,54
T1T2	49	0,34	56,3	0,39
T2T2	14	0,10	10,4	0,07
Povezava med polimorfizmi in koncentracijo fibrinogena v plazmi Polimorfizem Haeiii
Koncentracija fibrinogena se med genotipskimi skupinami vseh preiskovancev skupaj ni pomembno razlikovala (tabela 7). Tudi v skupini kadilcev pomembnih razlik ni bilo. Pokazale
pa so se pri nekadilcih. Heterozigoti so imeli statistično pomembno višjo koncentracijo fibrinogena. Zaradi majhnega števila homozigotov AA in domnevne povezave alela A z višjimi koncentracijami fibrinogena (26) smo skupini heterozigotov in homozigotov AA združili v skupino z vsaj enim alelom A.
Tabela 7. Genotipske skupine polimorfizma HaeIII s srednjimi vrednostmi fibrinogena (g/l) s 95% intervalom zaupanja. N — število bolnikov.
	GG	GA	AA	p
Vsi	2,69 2,51-2,88 N = 79	2,94 2,71-3,18 N = 53	2,75 2,32-3,28 N=11	0,20
Kadilci	2,87 2,51-3,28 N = 28	2,80 2,49-3,16 N = 24	3,01 2,05-4,41 N=5	0,89
Nekadilci	2,60 2,40-2,80 N = 51	3,05 2,73-3,40 N = 29	2,56 2,06-3,18 N=6	0,04
Ugotovili smo, da je koncentracija fibrinogena pri nekadilcih v skupini z vsaj enim alelom A statistično pomembno višja kot v skupini homozigotov za alel G (p = 0,03). Kadilci so imeli višjo povprečno koncentracijo fibrinogena kot nekadilci, vendar med posameznimi genotipi v skupini kadilcev ni bilo opaznih razlik (slika 5).
Polimorfizem BcH
Pri vseh preiskovancih skupaj statistično pomembnih razlik v koncentraciji fibrinogena med genotipskimi skupinami ni bilo. Vendar pa so bile pomembne razlike v skupini nekadilcev. Statistično pomembno višjo povprečno vrednost fibrinogena so imeli heterozigoti (slika 6). V skupini kadilcev smo opazili najvišjo povprečno vrednost fibrinogena pri homozigotih za alel B2, ki pa ni bila statistično pomembna.
Polimorfizem 7aql
Skupina homozigotov za alel T2 pri vseh preiskovancih (pa tudi posebej pri kadilcih in nekadilcih) je imela nižjo koncentracijo fibrinogena v plazmi kot ostale genotipske skupine, vendar razlike niso bile statistično pomembne (slika 7).
Rezultati multiple regresije
Koncentracija fibrinogena se je pri preiskovancih povezovala s starostjo, z BMI ter s koncentracijama holesterola in glukoze. Zato smo z modelom multiple regresije ocenili prispevek posameznih spremenljivk k variabilnosti fibrinogena. Kot odvisno spremenljivko smo vnesli koncentracijo fibrinogena, kot neodvisne pa tiste, ki so se pomembno povezovale s fibrinogenom v modelu linearne regresije (tabela 3).
4.4
3.8 3,3
2.9
2.5 2,2 1,9
1.6 0'
4.4
3.8 3,3
2.9
2.5 2,2 1,9
1.6 0
VSi (p = 0,12)
GG
AG in AA
m standardni odklon l l standardna napaka — srednja vrednost
Genotip
NEKAD!LC! (p = 0,03)
GG
AG in AA
"T" standardni odklon l l standardna napaka srednja vrednost
Genotip
4.4
3.8 3,3
2.9
2.5 2,2 1,9
1.6 0~L
GG
AG in AA
□Z standardni odklon □ standardna napaka srednja vrednost
Slika
Genotip
5. Koncentracija fibrinogena v plazmi pri različnih genotipih polimorfizma HaeIII.
3.8 3,3
2.9
2.5 2,2 1,9
1.6 0"L
VSI (p = 0,28)
3=
B1B1
B1B2 Genotip
B2B2
m standardni odklon □ standardna napaka — srednja vrednost
4.4
3.8 3,3
2.9
2.5 2,2 1,9
1.6 0~L
NEKADILCI (p = 0,04)
B1B1
B1B2 Genotip
B2B2
m standardni odklon □ standardna napaka srednja vrednost
1,9 1
0
B1B1
B2B2
standardni odklon □ standardna napaka srednja vrednost
B1B2 Genotip
Slika 6. Koncentracija fibrinogena v plazmi pri različnih genotipih polimorfizma BclI.
4.4
3.8 3,3
2.9
2.5 2,2 1,9
1.6 CfL
VSI (p = 0,27)
T1T1
T1T2 Genotip
T2T2
m standardni odklon □ standardna napaka srednja vrednost
4.4
3.8 3,3
2.9
2.5 2,2 1,9
1.6 0~i
NEKADILCI (p = 0,40)
T1T1
T1T2 Genotip
T2T2
m standardni odklon □ standardna napaka srednja vrednost
a n
e
o
g
.2, 'o
a
n o K
T1T1
T2T2
ZC standardni odklon nn standardna napaka srednja vrednost
T1T2 Genotip
Slika 7. Koncentracija fibrinogena v plazmi pri različnih genotipih polimorfizma TaqI.
V	modelu multiple regresije so vse spremenljivke (starost, BM\, koncentraciji holesterola in glukoze, polimorfizmi Hae\\\, Bcl\ in Taq\) skupaj razložile 15% variance fibrino-gena, od tega jih 11 % razloži samo BM\ (p = 0,01). Polimorfizmi pri vseh preiskovancih skupaj niso vplivali na varianco fibrinogena.
V	skupini nekadilcev so neodvisne spremenljivke (starost, BM\, koncentraciji holesterola in glukoze, polimorfizmi Hae\\\, Bcl in Taq\) razložile kar 30% variance, od tega 24% BM\, starost in presnovne spremenljivke. Polimorfizem Hae\\\ je v skupini nekadilcev razložil 5% variance fibrinogena (p = 0,03), polimorfizma Bcl in Taq\ skupaj pa 3% variance (p = 0,20).
Pri kadilcih je bila s koncentracijo fibrinogena povezana le koncentracija holesterola, ki je razložila 8% variance fibrinogena.
Razpravljanje
Frekvence genotipov pri 143 preiskovancih so bile v Hardy-Weinbergovem ravnovesju. Niso se pomembno razlikovale od frekvenc pri prebivalcih drugih držav (18-22).
Pri vseh preiskovancih skupaj nismo ugotovili pomembne povezave med koncentracijo fibrinogena v plazmi in polimorfizmi Hae\\\, Bcl in 7aq\. Vendar pa je bila naša skupina preiskovancev sestavljena iz dveh podskupin: kadilcev in nekadilcev, ki sta se razlikovali v koncentraciji fibrinogena. Ugotovili smo, da je bila povprečna koncentracija fibrinogena v plazmi pri kadilcih višja kot pri nekadilcih. Kljub temu da razlika ni bila statistično pomembna, smo zaradi znanega vpliva kajenja (16) predpostavljali, da je kajenje vplivalo na koncentracijo fibrinogena v plazmi. Verjetno je izločanje fibrinogena iz hepatocitov zaradi aktivacije vnetnih mehanizmov, ki jo povzroči kajenje, pri kadilcih bolj stimulirano kot pri nekadilcih (33). Zdi se, da ta regulatorni mehanizem prevlada nad drugimi mehanizmi regulacije koncentracije fibrinogena. V prid tej domnevi so tudi naši rezultati, ki so pokazali, da so bile povezave med koncentracijo fibrinogena v plazmi in starostjo, BM\ ter koncentracijo glukoze pri kadilcih šibkejše kot pri nekadilcih (tabela 2). Zato smo se odločili obravnavati vpliv polimorfizmov ločeno za obe podskupini preiskovancev. \zkazalo se je, da smo vpliv polimorfizmov lahko dokazali le pri nekadilcih, medtem ko pri kadilcih povezave med polimorfizmi in fibrinogenom niso bile pomembne.
Ugotovili smo, da je pri nekadilcih od vseh treh polimorfizmov na koncentracijo fibrinogena v plazmi najbolj vplival polimorfizem Hae\\\. Poleg pomembnega vpliva starosti, BM\ in presnovnih spremenljivk, ki so skupaj razložile 24% variance, je polimorfizem Hae\\\ razložil 5% variance fibrinogena. Podobne rezultate so prav tako pri nekadilcih dobili z raziskavo na prebivalcih Anglije (26). V raziskavi na \rskem (21) pa polimorfizem Hae\\\ ni bil povezan z variacijami fibrinogena v populaciji.
Ugotovili smo tudi statistično pomembno višjo povprečno koncentracijo fibrinogena pri nekadilcih, heterozigotnih za polimorfizem Bcl. Vendar pa homozigoti za alel B2 niso imeli višjih koncentracij fibrinogena, kot bi pričakovali, če je alel B2 dejansko povezan z višjo koncentracijo fibrinogena. Število homozigotov B2 v naši študiji je bilo namreč bistveno manjše kot število homozigotov B1 in heterozigotov in tudi premajhno
za potrditev te predpostavke (tabela 5). Zato na podlagi naše študije ne moremo nedvomno trditi, da je pri prebivalcih Slovenije alel B2 povezan z višjo koncentracijo fibri-nogena v plazmi. Potrebna bi bila raziskava večjega obsega, ki bi ugotovila, ali lahko v naši študiji ugotovljeno statistično pomembno razliko v koncentracijah fibrinogena pri genotipskih skupinah polimorfizma BclI pripišemo alelu B2. To so ugotovili v raziskavi na prebivalcih Anglije, kjer je bila prisotnost alela B2 povezana z višjimi koncentracijami fibinogena v plazmi (18). Njihovi rezultati so pokazali, da je ta polimorfizem prispeval 15% variance koncentracije fibrinogena. V nasprotju z omenjeno raziskavo v raziskavi na monozigotnih dvojčkih z Norveške niso ugotovili povezave med Bcl in koncentracijo fibrinogena (22), vendar pa preiskovancev niso ločili glede na kadilske navade. Zato je možno, da je kajenje zabrisalo vpliv polimorfizma.
Pri tretjem, polimorfizmu TaqI, statistično pomembnega vpliva polimorfizma na fibrinogen nismo ugotovili niti pri kadilcih niti pri nekadilcih. Naši rezultati so tako skladni z rezultati angleške (26) in norveške (22) raziskave. Kljub odsotnosti povezave med tem polimorfizom in fibrinogenom v zgoraj navedenih raziskavah smo ta polimorfizem proučevali zaradi opisanega vpliva polimorfizma TaqI v povezavi s polimorfizmom HaeIII (26). V tej raziskavi so ugotovili, da imajo preiskovanci iz Anglije z genotipom T1T1/AA višjo koncentracijo fibrinogena kot sonarodnjaki z ostalimi genotipi. Vendar v naši raziskavi polimorfizem TaqI tudi v kombinaciji s polimorfizmom HaeIII ni vplival na koncentracijo fibrinogena (rezultati niso prikazani).
Mehanizmi vpliva polimorfizmov v genih za fibrinogen na koncentracijo fibrinogena še niso pojasnjeni. Predlaganih je več hipotez. Polimorfizem sam je lahko funkcionalna sprememba, ki vpliva na afiniteto jedrne beljakovine in s tem na uravnavanje prepisa gena (19). Tak mehanizem je najbolj verjeten za polimorfizem HaeIII, ki se nahaja v promo-torskem delu gena beta. Ker sinteza Bp-verige fibrinogena uravnava sintezo cele molekule fibrinogena (34), j e vpliv tega polimorfizma na koncentracijo fibrinogena v plazmi razumljiv. Rezultati naše študije tak mehanizem dopuščajo.
Genetski polimorfizem je lahko tudi sprememba, ki nima funkcionalnega vpliva. Glede na rezultate naše in drugih raziskav (22, 26) je takšen polimorfizem TaqI v genu za fibrinogen Aa.
Genetski polimorfizem je lahko vzrok sinteze stukturno spremenjene verige fibrinogena. Zaradi takega polimorfizma lahko nastane fibrinogen, ki ima take lastnosti, da povečuje aterogeni potencial in s tem razvoj srčnožilnih bolezni. Pri tem pa koncentracija fibrinogena v plazmi ni nujno povišana. Na ta način razlagajo vpliv polimorfizma BclI na razvoj srčnožilnih bolezni v nekaterih študijah, kjer so ugotovili pomembno pogostejše pojavljanje alela B2 pri bolnikih s temi boleznimi (28). Polimorfizem Bcl, ki pri prebivalcih Slovenije verjetno prispeva k razlikam v koncentraciji fibrinogena, bi lahko bil vzrok tudi za sintezo strukturno drugačnega fibrinogena. Zanimiva bi bila raziskava pojavljanja alelov polimorfizma Bcl pri bolnikih s srčnožilnimi boleznimi v primerjavi z zdravimi, ki bi razložila vlogo polimorfizma BclI kot dejavnika tveganja za srčnožilne bolezni.
Na razvoj srčnožilnih bolezni vplivajo negenetski (kajenje, debelost, zvišani koncentraciji holesterola in glukoze v serumu) in genetski dejavniki. Oboji so povezani in možno
je, da s spreminjanjem negenetskih dejavnikov tveganja vplivamo na izražanje genetskih dejavnikov. Polimorfizmi genov za fibrinogen, kot eden izmed genetskih dejavnikov, predstavljajo kamenček v mozaiku patofiziologije srčnožilnih bolezni. Tako naša študija predstavlja osnovo za raziskave o vlogi genetskih dejavnikov pri razvoju srčnožilnih bolezni pri prebivalcih Slovenije.
Zaključki
Ugotovili smo, da polimorfizma HaeIII in BclI v genu za verigo Bp fibrinogena pomembno vplivata na koncentracijo fibrinogena v plazmi zdravih prebivalcev Slovenije, ki ne kadijo. Polimorfizem TaqI v genu za verigo Aa fibrinogena na koncentracijo fibrinogena v plazmi zdravih prebivalcev Slovenije ne vpliva.
Zahvala
Dr. Mojci Stegnar in dr. Borutu Peterlinu, ki sta kot mentorja krmarila moj čoln po divjih vodah raziskovanja, hvala za nasvete in pomoč.
Vsem, ki so življenje Laboratorija za molekularno genetiko, hvala za nepozabno leto. Osebju Laboratorija kliničnega oddelka za angiologijo lepa hvala za pomoč.
Literatura
1.	Henschen A, McDonagh J. Fibrinogen, fibrin and factor XIII. In: Zwaal RFA, Hemker HC, eds. Blood coagulation. Amsterdam: Elsevier, 1986: 171-239.
2.	Meade TW, Vickers MW, Thopson SG, et al. Epidemiological characteristics of platelet aggregability. BMJ 1985; 290: 428-32.
3.	Barthels M, Poliwoda H. Gerinnungsanalysen. Stuttgart: Thieme, 1993: 239.
4.	Meade TW. Fibrinogen in ishaemic heart disease. Eur Heart J1995; 16: Suppl A: 31-5.
5.	Qizilbash N. Fibrinogen and cerebrovascular disease. Eur Heart J1995; 16: Suppl A: 42-6.
6.	Koster T, Rosendaal FR, Reitsma PH, van der Velden PA, Briet E, Vandenbroucke JP. Factor VII and fibrinogen levels as risk factors for venous thrombosis. Thromb Haemost 1994; 71: 6: 719-22.
7.	Ernst E. The role of fibrinogen as cardiovascular risk factor. Atherosclerosis 1993; 100: 1-12.
8.	Fey GH, Fuller GM. Regulation of acute phase gene expression by inflammatory mediators. Mol Biol Med 1987; 4: 323-8.
9.	Meade TW, Chakrabarti R, Haines AP, North WRS, Stirling Y. Characteristics affecting fibrinolytic activity and plasma fibrinogen concentrations. BMJ 1979; i: 153-6.
10.	Folsom AR, Wu KK, Davis CE, Conlan MG, Sorlie PD, Szklo M. Population correlates of plasma fibrinogen and factor VII, putative cardiovascular risk factors. Atherosclerosis 1991; 91: 191-205.
11.	Krobot K, Hense HW, Cremer P, Eberle E, Keil U. Determinants of plasma fibrinogen: relation to body weight, waist-to-hip ratio, smoking, alchohol, age and sex: results from the Second MONICA Augsburg Survey 1989-90. Arterioscler Thromb 1992; 12: 780-8.
12.	Palareti G. Fibrinogen measurement in various clinical conditions: a comparison of five differnt methods. In: Ernst E, Koenig W, Lowe GDO, Meade TW, eds. Fibrinogen, a »new« cardiovascular risk factor. Oxford: Blackwell, 1992: 64-7.
13.	DiMinno G, Silver MJ, Cerbone AM, Rainone A, Postiglione A, Mancini M. Increased fibrinogen binding to platelets from patients with familial hyperholesterolemia. Arteriosclerosis 1986; 6: 203.
14.	Elkeles RS, Chakrabarti R, Vickers M, Stirling Y, Meade TW. Effect of treatment of hyperlipidemia in haemostatic variables. BMJ 1980; 281: 973.
15.	Lee AJ, Smith WSC, Lowe GDO, Tunstall-Pedoe H. Plasma fibrinogen and coronary risk factors: The scottish hearth health study. J Clin Epidemiol 1990; 43: 913-9.
16.	Wilkes HC, Kelleher C, Meade TW. Smoking and plasma fibrinogen. Lancet 1988; 1: 307.
17.	Hamsten A, Iselius L, de Faire U, Blomback M. Genetic and cultural inheritance of plasma fibrinogen concentration. Lancet 1987; 2: 988.
18.	Humphries SE, Cook M, Dubowitz M, Stirling Y, Meade TW. Role of genetic variation at the fibrinogen locus in determination of plasma fibrinogen concentrations. Lancet 1987; i: 1452-5.
19.	Thomas AE, Green FR, Kelleher CH, et al. Variation in the promotor region of the P-fibrinogen gene is associated with plasma fibrinogen levels in smokers and non-smokers. Thromb Haemostas 1991; 65: 487-90.
20.	Green F, Hamsten A, Blomback M, Humphries S. The role of P-fibrinogen genotype in determining plasma fibrinogen levels in young survivors of myocardial infarction and healthy controls from Sweden. Thromb Haemost 1993; 70: 915-20.
21.	Connor JM, Fowkes FGR, Wood J, Smith FB, Donnan PT, Lowe GDO. Genetic variation at fibrinogen gene loci and plasma fibrinogen levels. J Med Genet 1992; 29: 480-2.
22.	Berg K, Kierluf P. DNA polymorphisms at fibrinogen loci and plasma fibrinogen concentration. Clin Genet 1989; 36: 229-35.
23.	Kant JA, Forance AJ Jr, Saxe D, Simon MI, McBride OW, Crabtree GR. Evolution and organisation of the fibrinogen gene locus on chromosome 4: gene duplication accompanied by transposition and inversion. Proc Natl Acad Sci U SA 1985; 82: 2344-8.
24.	Humphries SE, Imam AM, Robbins TP, et al. The identification of a DNA polymorphism of the a-fi-brinogen gene, and the regional assignment of the human fibrionogen genes to 4q26-qter. Hum Genet 1984; 88: 148-53.
25.	Green F, Humphries S. Genetic determinants of arterial thrombosis. Baillieres Clin Haematol 1994; 7: 3: 675-81.
26.	Thomas AE, Green FR, Lamlum H, Humphries HE. The association of combined a and P fibrinogen genotype on plasma fibrinogen levels in smokers and non-smokers. J Med Genet 1995; 32: 585-9.
27.	Thomas A, Lamlum H, Humphries S, Green F. Linkage disequilibrium across the fibrinogen locus as shown by five genetic polymorphisms, G/A-455 (HaeIII), C/T-148 (Hindlll/AluI), T/G+1689 (AvaII) and Bcll (P fibrinogen) and TaqI (a fibrinogen), and their detection by PCR. Hum Mutat 1994; 3: 79-81.
28.	Fowkes FGR, Connor JM, Smith FB, Wood J, Donnan PT, Lowe GDO. Fibrinogen genotype and risk of peripheral atherosclerosis. Lancet 1992; 339: 693-6.
29.	Bondar RJL, Mead DC. Evaluation of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc mesente-roides in the hexokinaze method for determining glucose in serum. Clin Chem 1974; 20: 586-90.
30.	Allain CC, Poon LS, Chan GSG. Enzymatic determination of total serum cholesterol. Clin Chem 1970; 20: 470-5.
31.	Clauss A. Gerinnungsphysiologische Schnellmetode zur Bestimmung des Fibrinogens. Acta Haemat 1957; 17: 237-46.
32.	Sambrook J, Fritsch T, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: E. 5.
33.	Holt PG. Immune and inflammatory function in cigarette smokers. Thorax 1987; 42: 241.
34.	Roy SN, Mukhopadyay G, Redman CM. Regulation of fibrinogen assembly. Transfection of HepG2 cells with BP cDNA specifically enhances synthesis of the three component chains of fibrinogen. J Biol Chem 1990; 265: 6389-93.
Prispelo 1.6.1998