Hitosan in možna uporaba v medicini
Chitosan and its possible use in medicine
Andreja Erman
Inštitut za biologijo celice, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Lipičeva 2, SI-1000 Ljubljana
Korespondenca/ Correspondence:
doc. dr. andreja Erman, dipl. biol.
Inštitut za biologijo celice Medicinska fakulteta Univerze v ljubljani lipičeva 2, SI-1000 Ljubljana Tel: 01-543-7691
Ključne besede:
hitosan, bioadhezija, ciljani vnos učinkovin, dostavni sistem učinkovin
Key words:
chitosan, bioadhesion, drug targeting, drug delivery system
Citirajte kot/Cite as:
Zdrav Vestn 2011; 80: 489-498
Izvleček
Izhodišča: Iskanje novih farmacevtskih oblik zdravil, ki omogočajo ciljani vnos zdravilnih učinkovin v določena tkiva ali celice, je v velikem razmahu. Raziskave polimerov, med njimi tudi hitosana, so zaradi njihovih ugotovljenih fizikalnih in kemijskih lastnosti nakazale številne možnosti uporabe v farmaciji in tako tudi v medicini. Hitosan je naravni polimer, pridobljen z deacetilacijo hitina. Njegovi kationska narava in konformacija mu omogočata vezavo z anion-skimi zdravilnimi učinkovinami in bioadhezijo, s tem pa tudi njihovo kontrolirano in ciljano dostavo.
Zaključki: Hitosan se je v študijah in vitro izkazal kot uspešen, varen in nestrupen dostavni sistem učinkovin, prve potrditve pa se pojavljajo tudi že v raziskavah in vivo. To nakazuje možnosti uporabe hitosana pri zdravljenju nekaterih perečih zdravstvenih problemov, kot so npr. ateroskle-roza, alergije in razjede v prebavilih. Uspešna in varna uporaba hitosana pa se v prihodnosti kaže tudi na področju zdravljenja bakterijskih okužb, v tkivnem inženirstvu, imunoprofilaksi in v genskem zdravljenju.
Abstract
Background: Searching for new drug formulations, which enable drug targeting to specific tissues and cells, is in full swing. Various investigations of polymers including chitosan indicate a wide applicability in the pharmaceutical field and consequently also in medicine due to its established physicochemical properties. Chitosan is a natural polymer obtained by deacetylation of chitin. Cationic nature and conformation permit chitosan to react with anionic drugs and to be a promising bioadhesive material. All this gives chitosan a potential to be a controlled delivery system for drug targeting .
Conclusions: In in vitro investigations, chitosan has proved to be a succesful, safe and non-toxic drug delivery system. These results are confirmed also by recent in vivo investigations. This implies that chitosan has wide possibilities in the treatment of some urgent medical problems, such as atherosclerosis, allergies and gastric ulcers. Its succesful and safe applicability render chitosan potentially useful in the treatment of bacterial infections, in tissue engineering, im-munoprophylaxis and in gene therapy.
Prispelo: 12. maj 2010, Sprejeto: 26. nov. 2010
Uvod
Hitosan je naravni kationski polisaharid in linearni polimer oz. poliamin, sestavljen iz glukozamina in N-acetil glukozamina. Nastane z delno deacetilacijo hitina (Slika 1), katerega glavni vir so celične stene nekaterih gliv ter zunanje ogrodje žuželk in rakov. Hitosan predstavlja vrsto polimerov, ki se med seboj razlikujejo v molekulski masi (50 kDa-200 kDa), stopnji deacetila-cije (40-98 "/o) ter viskoznosti. Predvsem stopnja deacetilacije hitina določa hitosa-
nu osnovno fizikalno lastnost, tj. pozitiven naboj zaradi številnih protoniranih amino-skupin (-NH3+). Ta mu omogoča vezavo na anionske snovi in negativno nabite površine. Od stopnje deacetilacije je odvisna tudi njegova topnost. Hitosan je topen v kislih raztopinah, slabo topen v organskih topilih, vodi in v alkalnem okolju, njegove soli (glu-tamat, klorid) pa so dobro topne v vodi. V kislem okolju se poveča stopnja protonacije njegovih aminoskupin, kar poveča topnost hitosana.3'4 Zaradi svoje velike molekulske mase in linearne nerazvejane zgradbe hito-
Slika i: Kemijska zgradba hitina in hitosana.^
san omogoča povečanje viskoznosti snovi, ki so vezane nanj. Njegove verižne molekule so prožne, njihova konformacija je močno odvisna od ionske jakosti. Te lastnosti so nujne za t. i. mukoadhezijo, torej sposobnost pritrditve na sluz na površini sluznice.^'® Hi-tosan proizvajajo v različnih oblikah, kot so mikro- in nanokroglice, mikro- in nanodel-ci, nanovlakna, hidrogeli, membrane, mreže in filmi nanometrskih debelin.
Delovanje hitosana
Hitosan je kompatibilen s številnimi zdravilnimi učinkovinami in organskimi spojinami, kot so površinsko aktivne snovi, škrob in amonijeve soli. Multivalenti anioni z lahkoto prehajajo skozi hitosan, povzročijo prečne povezave med molekulami hitosana in nastanek gela ali precipitata.® Kationska narava hitosana omogoča tvorbo kompleksov z negativno nabitimi zdravilnimi učinkovinami, kar spremeni fizikal-no-kemijske značilnosti zdravila. Vse to je razlog, da so se študije hitosana v aplikativne namene farmacije in tudi sama uporaba hitosana izredno razmahnili v zadnjih letih. Mukoadhezivni polimeri, kot je hitosan, so vzbudili pozornost raziskovalcev, saj so zaradi svojih lastnosti zelo primerni kot snovi za nadzorovano sproščanje in ciljano dostavljanje zdravilnih učinkovin. To jim omogoča močan stik z absorpcijsko površino in
s tem podaljšani čas zadrževanja na mestu absorpcije. Številni pozitivni naboji na površini hitosana tvorijo namreč močne elek-trostatske vezi z negativnimi naboji sialične kisline v glikoproteinih in proteoglikanih, ki tvorijo sluz (mukus) na površini sluznic.^ Rezultati študij interakcij med hitosanom in umetnimi modeli biomembran so razkrili, da so elektrostatske sile z negativno nabitimi membranskimi fosfolipidi zelo pomembne za delovanje hitosana. Hitosan namreč s pomočjo vezave na alkilne verige fosfolipidov in negativno nabite fosfatne skupine prodre v plazmalemo, poveča red v fosfolipidni plasti, spremeni lokalno vrednost pH ter močno zmanjša elastičnost plazmaleme, vendar pa pri tem ne odstrani holesterola, kot je bila prvotna domneva.^®
Polimeri, kot je hitosan, so znani kot »biološka lepila«, ker omogočajo učinkovini, s katero so vezani, močno vezavo na tarčno tkivo, vendar brez sprožitve vnetnega odgovora. Vezava kompleksa iz hitosana kot mukoadhezivnega polimera in zdravilne učinkovine na sluz poveča koncentracijo učinkovine na mestu delovanja. To omogoči, da je večina vnesene količine učinkovine na voljo na specifičnih tarčnih mestih za doseganje želenega terapevtskega učinka. Uporaba polimerov, kot je hitosan, je torej izredno pomembna in zaželena, saj bistveno poveča lokalno učinkovitost zdravila.
Hitosan poveča prepustnost sluznic v organizmu in s tem pospeši absorpcijo nanj vezanih učinkovin, kar je ena od njegovih glavnih odlik. Merilo za povečano prepustnost sluznice je padec t. i. transepitelne električne upornosti (TEER). Raziskave na modelnih enoslojnih epitelih in vitro so pokazale, da hitosan učinkovito zniža tran-sepitelno električno upornost, ker povzroči premestitev proteinov tesnih stikov (ZO-i, okludin) s plazmaleme v notranjost celic. Pri tem sproži v celicah tudi prerazporeditev citoskeleta zlasti F-aktina, ki je povezan s proteini tesnih stikov. Dodatni vzrok za prekinitev tesnih stikov je zmožnost hitosa-na, da kot kationska makromolekula zamenja katione v tesnih stikih. Ugotovili so, da že majhne spremembe v relativnih koncentracijah specifičnih vrst ionov znotraj tesnega stika, ki je močno hidratiran in ki vsebuje
Slika 2: ModeL delovanja hitosana v primeru odstranitve p-laktoglobulina (BLG) iz fosfolipidnega sloja.^®
stalne negativne naboje, lahko zmanjšajo funkcionalnost tesnih stikov in tako povečajo njihovo prepustnost.15
Večina študij s hitosanom potrjuje njegovo netoksičnost ali nizko toksičnost. Ta lastnost hitosana je odvisna od njegove molekulske mase, čistosti, stopnje deacetilacije, odmerka in načina uporabe. Znano je, da je peroralna toksičnost hitosana nizka, tako je za miši ugotovljena LD50 (smrtni odmerek 50 %) večja od i6g/kg telesne mase.^® Obstajajo pa nekateri redki podatki o toksičnem delovanju hitosana v raziskavah in vitro, kjer je hitosan zmanjšal viabilnost celic.i7'i8 Neugodno delovanje hitosana na celice se je pokazalo tudi v študijah pospeševanja absorpcije skozi epitel sečnega mehurja. Hitosan namreč poveča prepustnost tega epitela tako, da povzroči luščenje njegovih površinskih celic in na ta način odstrani močno permeabilnostno pregrado med krvjo in urinom, ki je prisotna v normalnem sečnem mehurju.^^'^o Verjetno je razlog prav v epitelu, za katerega je znano, da se tudi na različne fizikalne in kemijske dejavnike^^ ter bakterijsko okužbo^^ odzove z luščenjem. Do sedaj namreč ni podatkov o tovrstnem delovanju hitosana na ostale sluznice organizma.
Možnosti uporabe farmacevtskih pripravkov iz hitosana
Hitosan se je zaradi svoje stisljivosti izkazal kot uporabno sredstvo za izdelavo tablet za peroralno uporabo, vendar pa so le te preveč prhke, če so iz samega hitosana.^^ Dodatek nekaterih snovi, kot so npr. natrijev alginat, natrijeva karboksimetil celuloza (CMC) in kristalina mikroceluloza (MCC) izboljšajo želene lastnosti tablet, ki so čim večja količina sproščene zdravilne učinkovine, čim večja adhezija ter čim manjše draženje sluznice. Tablete pripravljajo z direktnim stisnjenjem vseh sestavin, ki so nenevarne in brez dodanih škodljivih organskih topil. Postopek je enostaven, poceni in hiter. Vse to v prihodnosti nakazuje možnost izdelave in uporabe različnih farmacevtskih oblik s hi-tosanom, tako tablet za peroralno uporabo in tudi vaginalet ter svečk.^^'^^
Miyazaki in sodelavci so že pred leti v svoji študiji ugotovili, da hitosan pomembno vpliva na podaljšano sproščanje indome-tacina (v vodi netopna učinkovina) iz gra-nul hitosana.26 Čas sproščanja učinkovine iz zmesi z dvakrat večjo vsebnostjo hitosana se je podaljšal za 3- do 4-krat v primerjavi s
Slika 3: Endoskopsko vbrizganje hitosanskega hidrogeLa pod sluznico sečnice, kjer bo nastal vsadek.
takrat običajno komercialno kapsulo, pri kateri so po zaužitju zaznali visok, a le kratkotrajen vrh koncentracije učinkovine v plazmi. Podoben vpliv hitosana je dokazala tudi skupina Sawayanagija in sodelavcev za zdravilo propranolol HCl, ki je topno v vodi.^^
Poskusi so pokazali na možnost uporabe hitosana kot sredstva za ciljani vnos zdravila v črevo, kar bi lahko povečalo učinkovitost nekaterih zdravil. Zdravljenje kolitisa pri podganah z neposrednim vnosom 5-amino salicilne kisline (5-ASA) v kapsulah s hi-tosanom v črevo se je dejansko izkazalo za bolj učinkovito v primerjavi z zdravljenjem z ostalimi standardnimi oblikami zdravil.^® Številne študije hitosana so bile usmerjene tudi v iskanje možnosti uporabe hitosana za vnašanje proteinov ali proteinskih zdravil. Za bolnika je najbolj enostavno in udobno jemanje skozi usta, vendar pa je znano, da je absorpcija peptidnih učinkovin v prebavilih izredno slaba. Zelo spodbudni so bili zato rezultati raziskave in vivo Lueßna in sodelavcev s peptidnim zdravilom buse-relinom.29 Pri podganah so z 1,5-odstotnim (w/v) hitosanom-HCl za petdesetkrat povečali biološko uporabnost (delež zdravilne učinkovine, ki pride v sistemski krvni obtok in je na voljo na mestu delovanja) busereli-na, vnešenega neposredno v dvanajstnik, v primerjavi s kontrolnimi živalmi, ki so dobivale le buserelin. Tudi rezultati številnih kasnejših raziskav so dokazali, da hitosan poveča absorpcijo peptidov v sluznico z razklenitvijo tesnih stikov.^^'^^ Hitosan se je
izkazal tudi kot sredstvo za povečanje obsega absorpcije peptidnih zdravil skozi nosno sluznico, ki je sicer slabo prepustna za pep-tide. Tako se je na primer hitosan v obliki gela izkazal kot učinkovito sredstvo za vnos inzulina skozi nosno sluznico, kar so potrdile tudi raziskave in vivo.^^
Možnosti uporabe hitosana v medicini
Hitosan je biokompatibilen, bioadhezi-ven, biorazgradljiv in nizko toksičen polimer, ki je zaradi teh svojih lastnosti obetavno sredstvo za povečevanje permeabilnosti sluznic ter biološke uporabnosti vanj vgrajenih učinkovin.33'34 Vse to omogoča številne možnosti uporabe hitosana tudi v medicini.
Najnovejše študije Pavinatta in sodelavcev dokazujejo, da je za delovanje hitosana poleg njegovih funkcionalnih amino skupin ključnega pomena tudi njegova specifična konformacija, ki je odvisna od ionske jakosti raztopine.35 Oboje skupaj omogoča hitosa-nu še dodatno delovanje, in sicer odstranjevanje proteinov iz modelne membrane, kar so že dokazali za npr. ß-laktoglobulin.^® Ta protein je eden od močnih alergenov, ki ga najdemo v kravjem mleku. Če bi ga s hito-sanom odstranili, bi lahko znatno zmanjšali alergenost kravjega mleka, kar v prihodnosti nakazuje pomembne možnosti za odstranjevanje tudi drugih alergenov in s tem pomoč pri zaščiti ljudi pred alergijami (Slika 2).
Rezultati številnih raziskav na živalih in ljudeh so potrdili, da hitosan po peroralnem vnosu v telo v črevesu veže nase maščobe, poveča njihovo izločanje z blatom iz organizma ter tako zmanjša absorpcijo maščob v kri. Hitosan naj bi tako kljub uživanju s holesterolom bogate hrane bistveno zmanjšal dvig količine holesterola v serumu poskusnih živali.^^'^® Te spodbudne ugotovitve so zato napeljale znanstvenike, da raziščejo možnost uporabe hitosana za preprečevanje nastanka aterosklerotičnih plakov. Raziskave Omroda in sodelavcev na miših so potrdile, da hitosan zavira razvoj ateroskleroze pri živalih s hiperholesterolemijo.^^ Primerjava hitosana z drugimi snovmi, ki se upora-bljejo za zniževanje ravni holesterola v krvi in s tem za zdravljenje hiperholesterolemi-
Slika 4: GLavne sestavine kostnega nadomestka na osnovi hitosana.
je, kot je npr. holestiramin, je pokazala, da ima hitosan podobni učinek na zniževanje maščob kot holestiramin.^® Vendar pa je histološka preiskava črevesa po zdravljenju s holestiraminom pokazala znatno zade-belitev sluznice debelega črevesa, medtem ko v primeru jemanja hitosana raziskovalci niso opazili škodljivih vplivov na črevesno sluznico. V nasprotju s temi raziskavami pa so nekatere študije pokazale, da jemanje hitosana brez hkratne dietne prehrane z zmanjšano vsebnostjo maščob ne povzroči znižanja telesne mase niti ne vpliva na fe-kalno izločanje maščob^i'^^ oz. da ima lahko dolgotrajno uživanje hitosana celo negativne posledice za zdravje ljudi. Hitosan lahko namreč v črevesju poleg maščob veže nase tudi v maščobah topne vitamine in minerale, kar lahko vpliva na njihovo absorpcijo v telesu in posledično pomanjkanje, npr. vitamina E. Poleg tega lahko hitosan vpliva tudi na metabolizem kalcija, ker pospeši njegovo izločanje z urinom. Dolgotrajna uporaba hi-tosana kot prehranskega dodatka lahko celo poruši normalno črevesno floro in omogoči razrast odpornih patogenih bakterij. Vse te ugotovitve kažejo na dejstvo, da je potrebna določena previdnost pri dolgotrajnem jemanju visokih odmerkov hitosana.^^
Hitosan se je pokazal tudi kot potencialno pomožno sredstvo pri zdravljenju ledvične odpovedi. V raziskavi na 40 bolnikih z odpovedjo ledvic in hemodializnim zdravljenjem ter jemanjem hitosana (1350 mg dvakrat dnevno) so opazili znatno znižanje ravni sečnine in kreatinina v serumu bolni-kov.44
Hitosan je zmanjšal razjede v želodčni sluznici albino podgan, sprožene z nestero-idnimi, protivnetnimi snovmi kot sta npr. oksifenbutazon in glafenin. V kislem okolju želodca se je hitosan raztopil, nabreknil in s tem deloval blažilno in zaščitno na želodčno sluznico ter tako zmanjšal ulcerogeno delovanje obeh učinkovin.45'46 Edinstvena sposobnost nabrekanja in tvorbe gela v kislem okolju nakazuje učinkovito uporabo hitosa-na pri zaščiti sluznice prebavil kot tudi pri nadzorovanem in podaljšanem sproščanju zdravilnih učinkovin v prebavilih. Hitosan je šibka baza z vrednostjo približno 6,5, zato je netopen v nevtralnem in bazičnem okolju, kot je debelo črevo ali kolon, kjer je pri normalnem človeku vrednost pH med 6,4 in 7,5. Za preprečitev te ovire in za pospešitev ab-sorbcije v teh delih organizma zato preizkušajo različne derivate hitosana, zlasti N-tri-metil hitosan, katerega topnost je učinkovito povečana s trimetilizacijo aminoskupin hi-tosana.47'48 Tako se lahko kemijsko modificirani hitosan uporabi za dostavo zdravilnih učinovin v številne dele človeškega telesa z različnimi lokalnimi vrednostmi pH.
Hitosan v obliki hidrogela preizkušajo tudi pri zdravljenju inkontinence, ki je posledica stresa in prizadene številne ženske ter tudi nekatere moške, zlasti po prosta-tektomiji. To motnjo odvajanja urina bi se lahko rešilo s pomočjo vbrizganja hitosan-skega hidrogela pod sluznico sečnice, kjer bi se zaradi precipitacije tvoril mehanski vsadek, ki bi bil primerno elastičen (Slika 3). V ta namen so preizkusili gel iz hitosana, ki omogoča vbrizganje in hiter nastanek vsadka in situ. Prvi rezultati študije na prašičih so zelo spodbudni, saj je histološki pregled devet mesecev po endoskopskem vbrizganju pokazal, da so se vsadki zelo dobro vključili v tkivo brez poškodb sluznice in brez vnetnega odziva.49'50
Veliko število raziskav je usmerjenih v proučevanje uporabe hitosana tudi v tkivnem inženirstvu, zlasti za izdelavo zobnih in kostnih nadomestkov ter za tridimenzionalna porozna ogrodja za zdravljenje poškodb in hitrejšo obnovo kostnega tkiva na mestu poškodbe dolgih kosti. Vgraditev nanodel-cev hidroksiapatita ali kalcijevega fosfata v ogrodje hitosana izboljša mehanske lastnosti
Slika 5: Shematski prikaz delovanja obLiža iz hitosana. V okroglem polju je povečani izsek, ki prikazuje pozitivne naboje hitosana in nanj vezane negativno nabite eritocite.
nadomestkov, vsaditev živih celic (osteobla-stov ali zarodnih celic) pa pospeši celjenje in obnovo kostnega tkiva. Hitosan tako po eni strani nudi mehansko oporo nadomestkom ali poškodovanemu delu tkiva. Obenem pa lahko služi tudi kot dostavni sistem za različne učinkovine, kot so npr. rastni dejavniki (Slika 4). Z vezavo v hitosanski hidrogel namreč preprečimo prehitro difuzijo iz nadomestka in mesta vbrizganja, ohranimo pa njihovo bioaktivnost, kar je nujno za pospešeno rast in obnovo kostnega tkiva.^^'^^
V vedno več študijah ugotavljajo tudi možnost uporabe hitosana za zdravljenje rakavih bolezni. Strokovnjaki skušajo povečati ciljano uničevanje rakavih celic ter se izogniti visokim odmerkom zdravil, ki so sicer učinkovita, vendar povzročajo številne neželene učinke. Rezultati raziskav in vitro so zelo spodbudni. Učinkovine, vgrajene v hi-tosansko ogrodje, imajo namreč po eni strani veliko sposobnost vezave na hitosan, po drugi strani pa se iz tega polimera sproščajo v okolico počasi in s tem podaljšajo čas zadrževanja in delovanja učinkovine v primerjavi z nevezano učinkovino.^^ Obenem pa v laboratorijih že preizkušajo nove možnosti ciljanega uničevanja rakavih celic s pomočjo vezave specifičnih molekul na nanodelce hitosana z učinkovino, kar omogoči vezavo na ustrezne specifične receptorje, prekomerno izražene na površini rakavih celic. Skupina Sahuja in sodelavcev je tako med prvimi izvedla raziskavo, v kateri so na površino na-nodelcev iz hitosana, ki so obdajali v vodi netopno učinkovino paklitaksel, kovalentno
vezali folno kislino (FA). Na ta način so dosegli ciljano vezavo hitosanskih nanodelcev kot nosilcev učinkovine na folatne receptor-je na površini rakavih celic.^^
Učinkovito delovanje hitosana so zasledili tudi pri zdravljenju kožnih ran. Okamo-to in sodelavci so s hitosanom in hitinom zdravili odprte rane pri psih ter pri njih ugotovili bistveno hitrejše celjenje kot pri kontrolnih živalih.55 Prav tako znanstveniki v poskusih in vitro in in vivo proučujejo uporabo hitosanskih hidrogelov za pospešeno celjenje kožnih opeklin.^® V novejšem času se na trgu že pojavljajo obliži z oblogo iz hitosana (Slika 5), ki izkoriščajo že dokazano antibakterijsko delovanje kot tudi pozitiven naboj hitosana, ki privlači negativno nabite eritrocite. To zelo hitro zatesni rano, ustavi krvavitev in pospeši celjenje.
Razumevanje genskih osnov in molekularnih mehanizmov bolezni omogoča možnost zdravljenja z vplivanjem na DNA oz. določene gene. V zadnjih letih so ugotovili, da se kationski polimeri lahko povežejo z DNA v komplekse in tako služijo kot nevi-rusni vektorji za prenos terapevtskih genov. Ta preprosta metoda samopovezovanja polimera in DNA in vitro v t. i. poliplekse na-nometrskih velikosti bi lahko v prihodnosti nudila številne možnosti pri zdravljenju nekaterih bolezni. Dosedanje raziskave kažejo na uspešno peroralno uporabo nano-delcev hitosan-DNA v imunoprofilaksi oz. pri zmanjševanju anafilaktičnega odgovora poskusnih živali na antigene arašidov. Roy in sodelavci so s pomočjo hitosana vnesli v črevesne celice plazmide z genom Arah2, ki kodira glavni alergen arašidov. Kljub pero-ralnemu dajanju je bila DNA v kompleksu s hitosanom zaščitena pred razgradnjo, v celicah pa hitosan ni oviral prepisovanja v alergene proteine. Ti so povzročili imuniza-cijo živali, pri katerih je po ponovnem stiku z alergenom arašidov nastopil znatno manjši preobčutljivostni oz. alergijski odziv, izražen v manjši prepustnosti žil ter v nižji ravni IgE in histamina v plazmi kot pri neimuni-ziranih živalih ali pri živalih, zdravljenih z »golo« DNA. Rezultati te raziskave dokazujejo, da je imunizacija s peroralnim vnosom nanokompleksov hitosan-DNA učinkovita pri zmanjševanju anafilaktičnega odgovora
Slika 6: SLika TEM bakterije E.coli na kontroLnem gojišču (A) in 4 ure po vezavi hitosana (B) (4000-kratna povečava).59
glodalcev.57 S tem pa se nakazujejo možnosti uporabe te metode pri preprečevanju oz. zdravljenju alergij na hrano pri ljudeh.
Eden najpomembnejših ugotovljenih in dokazanih učinkov hitosana je njegovo protibakterijsko in protiglivično delovanje. Tako so dokazali učinkovitost hitosana pri povzročiteljih Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Bacillus cereus in Klebsiella pneumoniae.^ Mehanizem delovanja hitosana na mikroorganizme najverjetneje sloni na povezavah med kationskimi skupinami hitosana in anioni na bakterijski steni, ki spremenijo prepustnost bakterijske stene, povzročijo poškodbe membrane in osmotsko neravnovesje celice, kar posledično vodi v izhajanje celične vsebine in smrt^® (Slika 6).
Skupina Chunga in sodelavcev je ugotovila, da je delovanje hitosana v neposredni povezavi z gostoto negativnega naboja na celični steni bakterij. Več ko je negativnih ionov na površini bakterij, večja je stopnja vezave hitosana. Ker je na po Gramu pozitivnih bakterijah njihova gostota bistveno manjša kot na po Gramu negativnih bakterijah, se na slednje veže več hitosana. To razloži dejstvo, da so po Gramu negativne bakterije bolj občutljive na hitosan kot po Gramu pozitivne bakterije.^® Rezultati laboratorijskih študij so že pokazali zelo obetavne možnosti uporabe hitosana kot zaščitnega sredstva pred pritrjanjem bakterije Streptococcus mutans na zobe®" ali kot učinkovitega sredstva proti patogenemu povzročitelju Escherichia coli (E.coli).^® Tako je bilo ugotovljeno, da zaščita pred bakterijami v ustni votlini in z njimi povezano zobno gnilobo ni samo rezultat bakte-ricidnega delovanja hitosana, saj pospešuje tudi obnovo mehkih obzobnih tkiv, kjer se
rade nabirajo bakterije, ter preprečuje škodljiv vpliv organskih kislin, zaradi katerih je zobna sklenina bolj občutljiva za delovanje bakterij. Vse to nakazuje smotrno uporabo hitosana v zobnih pastah, ustnih vodah in žvečilnih gumijih, kar bi zmanjšalo poselitev zob z bakterijami in s tem nastanek zobne gnilobe. Zaradi že dokazanega baktericidne-ga delovanja hitosana in vitro na E.coli pa bi bilo smiselno preizkusiti uporabo hitosana tudi in vivo z namenom odstranitve uropa-togene E.coli iz sečnega mehurja, ki je zlasti pri ženskah najpogostejši povzročitelj vnetja sečnega mehurja. Protibakterijsko delovanje hitosana skušajo znanstveniki še povečati z vezavo različnih kovinskih ionov, na primer srebra, ki je že dolgo znano po svojem baktericidnem delovanju.®!'®^'®^ Tovrstni derivati hitosana imajo izreden potencial za zdravljenje kroničnega cistitisa, še zlasti v primeru odpornosti na antibiotike. Možni metodi odstranjevanja E.coli iz sečnega mehurja s pomočjo hitosana bi lahko bili intra-vezikalno vbrizganje hitosana ob hkratnem peroralnem jemanju antibiotika ali pa intra-vezikalno vbrizganje hitosana, na katerega je vezan antibiotik. Prednosti teh metod bi bile po eni strani, da hitosan veže nase bakterije, ki se nahajajo v svetlini mehurja in na površini epitela, po drugi strani pa hitosan dokazano povzroča luščenje epitelnih celic, ki lahko vsebujejo velike količine znotrajce-ličnih parazitskih bakterij.i®'®^ Na ta način bi torej iz mehurja lahko odstranili tudi tiste bakterije, ki so znotraj evkariontskih celic zaščitene pred delovanjem antibiotikov. Odstranitev epitelnih celic sečnega mehurja tudi v večjem obsegu ni sporna, saj ima ta epitel izredno regenerativno sposobnost in se obnovi že v nekaj urah ali celo prej, odvisno od obsega poškodbe.®^
Zaključek
Hitin, ki je po količini drugi najbolj zastopani polisaharid v naravi, je slabo topen, zato ima prednost njegov deacetilirani derivat hitosan. Zaradi svojih strukturnih in kemijskih lastnosti velja hitosan za biokom-patibilni, bioadhezivni in biorazgradljivi polimer, ki bi ga lahko uporabili na mnogih področjih biomedicine. S svojim dokazanim antimikrobnim delovanjem se je njegova uporabnost in pomembnost v zadnjih letih še povečala. Večina dokazov njegovega delovanja je sicer še vedno na ravni bazičnih raziskav. Vendar pa številne študije na živalih potrjujejo njegovo učinkovito in varno uporabo tudi in vivo ter tako že spodbujajo klinično preizkušanje zdravil s hitosanom za uporabo pri ljudeh.
Literatura
1.	Bodek KH. Potentiometric method for determination of the degree of acetylation of chitosan. In: Karnicki ZS, Pajak AW, Breziski MM, Bylowsky PJ, eds. Chitin world. Bremerhaven: Wirtschaftsverlag; 1994. p.456-61.
2.	Illum R. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient. Pharm Res 1998; 15: 1326-31.
3.	Knapczyk J, Krowcynscki L, Krzek J, Brzeski M, Nurnberg E, Schenk D, et al. Requirements of chitosan for pharmaceutical and biomedical applications. In: Skjak-Braek G, Anthonsen T, Sanford P, eds. Chitin and chitosan-Sources, Chemistry, Biochemistry, Physical Properties and Applications. London: Elsevier; 1989. p.757-64.
4.	Sanford PA. Chitosan nad aliginate: new forms of commercial interest. Am Chem Soc Div Polym Chem 1990; 31: 628.
5.	Peppas NA, Bury PA. Surface interfacial and molecular aspects of polymer bioadhesion on soft tissues. J Control Rel 1985; 2: 257-75.
6.	Robinson JR, Mlynek GM. Bioadhesive and phase-change polymers for ocular drug delivery. Adv Drug Del Rev 1995; 16: 45-50.
7.	Rabea EI, Badawy MET, Stevens CV, Smagghe G, Steurbaut W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecu-les 2003; 4: 1457-65.
8.	Skaugrud O. Chitosan-New biopolymer for cosmetics and drugs. Drug Cosmetic Ind 1991; 148:
24-9.
9.	Lueßen HL, Lehr CM, Rentel CO, Noach ABJ, de Boer AG, Verhoef JC, et al. Bioadhesive polymers for the peroral delivery of peptide drugs. J Control Rel 1994; 29: 329-38.
10.	Pavinatto FJ, Pacholatti CP, Montanha EA, Caseli L, Silva HS, Miranda PB, et al. Cholesterol mediates chitosan activity on phospholipid monolayers and Langmuir-Blodgett films. Langmuir 2009; 25: 10051-61.
11.	Ranaldi G, Marigliano I, Vespignani I, Perozzi G, Sambuy Y. The effect of chitosan and other polyca-tions on tight junction permeability in the human intestinal Caco-2 cell line. Nutr Biochem 2002; 13:
157-67.
12.	Smith J, Wood E, Dornish M. Effect of chitosan on epithelial cell tight junctions. Pharm Res 2004;
21: 43-9.
13.	Artursson P, Lindmark T, Davis SS, Illum L. Effect of chitosan on the permeability of monolayers of intestinal epithelial cells (Caco-2). Pharm Res 1994; 11: 1358-61.
14.	Vllasaliu D, Exposito-Harris R, Heras A, Casettari L, Garnett M, Illum L, Stolnik S. Tight junction modulation by chitosan nanoparticles: Comparison with chitosan solution. Int J Pharm 2010; 400:
184-93.
15.	Madara J. Loosening tight junctions. J Clin Invest 1989; 83: 1089-94.
16.	Arai K, Kinumaki T, Fujita T. Toxicity of chitosan. Bull Tokai Reg Fish Lab 1968; 43: 89-94.
17.	Huang M, Khor E, Lim LY. Uptake and cytotoxicity of chitosan molecules and nanoparticles: effects of molecular weight and degree of deacetylation. Pharm Res 2004; 21: 344-53.
18.	Florea BI, ttanou M, Junginger HE, Borchard G. Enhancement of bronchial octreotide absorption by chitosan and N-trimethyl chitosan shows linear in vitro/in vivo correlation. J Control Release 2006; 110: 353-61.
19.	Kos Kerec M, Bogataj M, Veranič P, Mrhar A. Permeability of pig urinary bladder wall: Time and Concentration dependent effect of chitosan. Biol Pharm Bull 2006; 29: 1685-91.
20.	Kos Kerec M, Bogataj M, Mrhar A. Heparin decreases permeability of pig urinary bladder wall preliminary enhanced by chitosan. Drug Drv Ind Pharm 2008; 34: 215-20.
21.	Jezernik K, Medalia O, Aronson M. A comparative study of the desquamation of urothelial cells during gestation and in adults mice folowing moderate stress or endotoxin treatment. Cell Biol Int 1995; 19: 887-93.
22.	Mulvey M, Lopez-Boado YS, Wilson CL, Roth R, Parks WC, Heuser J, Hultgren SJ. Induction and evasion of host defenses by type 1- pilliated uro-pathogenic Escherishia coli. Science 1998; 282:
1494-97.
23.	Knapczyk J. Excipient ability of chitosan for direct tableting. Int J Pharm 1993; 89: 1-7.
24.	Miyazaki S, Nakayama A, Oda M, Takada M, At-twood D. Chitosan and sodium alginate based bi-oadhesive tablets for intraoral drug delivery. Biol Pharm Bull 1994; 17: 745-7.
25.	El-Kamel A, Sokar M, Naggar V, Al Gamal S. Chi-tosan and sodium alginate-based bioadhesive vaginal tablets. AAPS Pharm SCI 2002; 4: 1-7.
26.	Miyazaki S, Yamaguchi H, Yokouchi C, Takada M, Hou WM. Sustained-release and intragastric-flo-ating granules of indomethacin using chitosan in rabbits. Chem Pharm Bull 1988; 36: 1623-5.
27.	Sawayanagi Y, Nambu N, Nagai T. Use of chitosan for sustained-release preparations of water-soluble drugs. Chem Pharm Bull 1982a; 30: 4464-7.
28.	Tozaki H, Fujita T, Odoriba T, Terabe A, Okabe S, Muranishi S, et al. Validation of a pharmacokinetic model of colon-specific drug delivery and the therapeutic effects of chitosan capsules containing 5-aminosalicylic acid on 2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid-induced ulcerative colitis in rats. J Pharm Pharmacol 1999a; 51: 1107-12.
29.	Lueßen HL, de Leeuw BJ, Langemeyer MWE, de Boer AG, Verhoef JC, Juninger HE. Mucoadhesi-ve polymers in peroral peptide drug delivery. VI. Carbomer and chitosan improve the intestinal absorption of the peptide drug buserelin in vivo. Pharm Res 1996; 13: 1668-72.
30.	Lueßen HL, Rentel CO, Kotze AF, Lehr CM, de Boer AG, Verhoef JC, et al. Mucoadhesive polymers in peroral peptide drug delivery. IV. Polycarbophil and chitosan are potent enhancers of peptide transport across intestinal mucosae in vitro. J Control Rel 1997; 45: 15-23.
31.	Bernkop-Schnurch A, Krajicek ME. Mucoadhesi-ve polymers as platforms for peroral peptide delivery and absorption: Synthesis and evaluation of different chitosan-EDTA conjugates. J Control Rel
1998; 50: 215-23.
32.	Varshosaz J, Sadrai H, Heidari A. Nasal delivery of insulin using bioadhesive chitosan gels. Drug Delivery 2006; 13: 31-8.
33.	Singla AK, Chawla M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects-an update. J Pharm Pharmacol 2001; 53: 1047-67.
34.	Kerec Kos M. Uporaba hitosana v farmaciji. Farm Vestn 2006; 57: 287-91.
35.	Pavinatto A, Pavinatto FJ, Barros-Timmons A. Electrostatic interactions are not sufficient to account for chitosan bioactivity. ACS Appl Mater Interfaces 2010; 27: 246-51.
36.	Caseli L, Pavinatto FJ; Nobre TM, Zaniquelli MED, Viitala T, Oliveira ON Jr. Chitosan as a removing agent of ß-lactoglobulin from membrane models. Langmuir 2008; 24: 4150-6.
37.	Sugano M, Watanabe S, Kishi A, Izume M, Ohta-kara A. Hypocholesterolemic action of chitosans with different viscosity in rats. Lipids 1988; 23: 187-91.
38.	Gallaher CM, Munion J, Hesslink R Jr, Wise J, Gallaher DD. Cholesterol reduction by glucomannan and chitosan is mediated by changes in cholesterol absorption and bile acid and fat excretion in rats. J Nutr 2000; 130: 2753-59.
39.	Ormrod DJ, Holmes CC, Miller TE. Dietary chi-tosan inhibits hypercholesterolemia and athero-genesis in the apolipoprotein E-defficient mouse model of atherosclerosis. Atherosclerosis 1998;
138: 329-34.
40.	Jennings CD, Boleyn K, Bridges SR, Wood PJ, Anderson JW. A comparison of the lipid-lowering and intestinal morphological effects of cholestyra-mine, chitosan, and oat gum in rats. Proc Soc Exp Biol 1988; 189: 13-20.
41.	Pittler MH, Abbot NC, Harkness EF, Ernst E. Randomized, double-blind trial of chitosan for body weight reduction. Eur J Clin Nutr 1999; 53: 379-81.
42.	Guerciolini R, Radu-Radulescu L, Boldrin M, Dallas J, Moore R. Comparative evaluation of fecal fat excretion induced by orlistat and chitosan. Obes Res 2001; 9: 364-7.
43.	Koide SS. Chitin-chitosan: properties, benefits and risks. Nutr Res 1998; 18: 1091-101.
44.	Jing SB, Li L, Ji D, Takiguchi Y, Yamaguchi T. Effect of chitosan on renal functions in patients with chronic renal failure. J Pharm Pharmacol 1997; 49:
721-3.
45.	Meshali MM, el-Dien EZ, Omar SA, Luzzi LA. A new approach to encapsulating nonsteroidal anti-inflammatory drugs. IV. Effect of cellulose derivatives with different functional groups on the bioavailability and gastric ulcerogenic activity of acidic as well as basic nonsteroidal anti-inflammatory drugs. J Microencap 1989; 6: 355-60.
46.	Acikgoz M, Kas HS, Hascelik Z, Milli U, Hincal AA. Chitosan microspheres of diclofenac sodium. II. In vitro and in vivo evaluation. Pharmazie 1995;
50: 275-7.
47.	Kotze AF, ttanou MM, Luessen HL, de Boer AG, Verhoef JC, Junginger HE. Effect of the degree of quaternization of N-trimethyl chitosan chloride on the permeability of intestinal epithelial cells (Caco-2). Eur J Pharm Biopharm 1999; 47: 269-74.
48.	Kotze AF, Luessen HL, de Boer AG, Verhoef JC, Junginger HE. Chitosan for enhanced intestinal permeability: prospects for derivatives slouble in neutral and basic environments. Eur J Pharm Sci 1998; 7: 145-51.
49.	Jordan O, Doelker E, Defabiani N, Caviezel A, Ise-lin C. Novel injectable utrethral bulking agents for the treatment of urinary incontinence. J Mater Sci Mater Med 2004; 15: 519-22.
50.	Patois E, Osorio-da Cruz S, Tille JC, Walpoth B, Gurny R, Jordan O. Novel thermosensitive chito-san hydrogels: in vivo evaluation. J Biomed Mater Res A 2009; 91: 324-30.
51.	Swetha M, Sahithi K, Moorthi A, Srinivasan N, Ramasamy K, Selvamurugan N. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. Int J Biol Macromol 2010; 47: 1-4.
52.	Weir MD, Xu HH. Osteoblastic induction on calcium phosphate cement-chitosan constructs for bone tissue engineering. Biomed Mater Res A
2010; 94: 223-333.
53.	Arias JL, Lopez-Viota M, Gallardo V, Ruiz MA. Chitosan nanoparticles as a new delivery system for the chemotherapy agent tegafur. Drug Dev Ind Pharm 2010; 36: 744-50.
54.	Sahu SK, Maiti S, Maiti TK, Ghosh SK, Pramanik P. Hydrofobically modified carboxymethyl chitosan nanoparticles targeted delivery of paclitaxel. J Drug Target 2011; 19: 104-13.
55.	Okamoto Y, Shibazaki K, Minami S, Matsuhashi A, Tanioka S, Shigemasa Y. Evaluation of chitin and chitosan in open wound healing in dogs. J Vet Med Sci 1995; 57: 851-4.
56.	Sezer AD, Hatipoglu F, Cevher E, Ogurtan Z, Ba§ AL, Akbuga J. Chitosan film containing fucoidan as a wound dressing for dermal burn healing: preparation and in vitro/in vivo evaluation. AAPS Pharm Sci Tech 2007; 8: E1-8.
57.	Roy K, Mao HQ, Huang SK, Leong KW. Oral gene delivery with chitosan-DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allergy. Nat Med 1999; 5: 387-91.
58.	Tsai GJ, Su WH. Antibacterial activity of shrimp chitosan against Escherichia coli. J Food Prot
1999; 62: 239-43.
59.	Chung YC, Su YP, Chen CC, Jia G, Wang HI, Wu JCG, et al. Relationship between antibacterial activity of chitosan and surface characteristics of cell wall. Acta Pharmacol Sin 2004; 25: 932-6.
60.	Tarsi R, Muzzarelli RA, Guzman CA, Pruzzo C. Inhibition of Streptococcus mutans adsorption to hydroxyapatite by low-molecular-weight chito-sans. J Dent Res 1997; 76: 665-72.
61.	Sanpui P, Murugadoss A, Prasad PVD, Ghosh SS, Chattopahdyay A. The antibacterial properties of a novel chitosan-Ag-nanoparticle composite. Int J Food Microbiol 2008; 124: 142-6.
62.	Banerjee M, Mallick S, Paul A, Chattopadhyay A, Ghosh SS. Heightened reactive oxygen species generation in the antimicrobial activity of a three component iodinated chitosan-silver nanoparticle composite. Langmuir 2010; 26: 5901-8.
63.	Wei D, Sun W, Qian W, Ye Y, Ma X. The synthesis of chitosan-based silver nanoparticles and their antibacterial activity. Carbohydr Res 2009; 344:
2375-82.
64.	Veranič P, Erman A, Kerec-Kos M, Bogataj M, Mr-har A, Jezernik K. Rapid differentiation of superficial cells after chitosan-induced desquamation. Histochem Cell Biol 2009; 131: 129-39.