i
i
“Olenik” — 2015/8/11 — 8:27 — page 88 — #1 i
i
i
i
i
i
MIKROSKOPIJA PRI BREWSTROVEM KOTU
LUCIJA ČOGA1, IRENA DREVENŠEK OLENIK1,2
1Fakulteta za matematiko in fiziko, Univerza v Ljubljani
2Institut Jožef Stefan
PACS: 42.15.Eq, 79.60.Dp
V članku so razloženi osnovni principi delovanja mikroskopije pri Brewstrovem kotu.
Nato sledi opis strukturne organizacije v tankih plasteh organskih molekul, ki plavajo
na vodni površini. Na koncu je podanih nekaj primerov posnetkov tovrstnih površinskih
plasti, dobljenih z opisano tehniko mikroskopiranja.
BREWSTER ANGLE MICROSCOPY
We present basic principles of operation of Brewster angle microscopy. We also de-
scribe structural organization in thin films of organic molecules floating on water surface.
In the last part we give some examples of images of this kind of surface structures obtained
by the presented optical microscopy technique.
Uvod
Svetovno leto svetlobe nas spodbuja k razmǐsljanju o pomenu, ki ga ima
svetloba ne le v našem vsakdanjem življenju, ampak tudi pri tehnološkem
razvoju človeštva. Za velik napredek znanja in tehnologije na področjih, kot
so biologija, medicina, farmacija, kemija in znanosti o materialih, ter tudi na
številnih področjih fizike je v veliki meri zaslužna tehnika optične mikrosko-
pije. Zaradi raznolikosti preiskovanih materialov se je optična mikroskopija
razvila v številne različice, ki omogočajo optimalno mikroskopiranje spe-
cifičnih vrst vzorcev. Ena od teh je fazna mikroskopija, ki je namenjena
opazovanju tankih vzorcev iz prozornih snovi, kot so posamične žive celice
ali biološka tkiva. Z običajnim presevnim mikroskopom pri tovrstnih vzorcih
namreč naletimo na težave, saj je intenziteta prepuščene svetlobe skozi njih
praktično neodvisna od debeline in lomnega količnika opazovanega območja.
To pomeni, da nekaterih podrobnosti v strukturi vzorca, kot so variacije go-
stote in postopne spremembe debeline, ne moremo dobro razločiti. V takih
primerih lahko kontrast slike znatno izbolǰsamo z metodami, ki zaznavajo
fazni zamik prepuščenega optičnega polja, kot sta fazno-kontrastna mikro-
skopija in diferenčno-interferenčna mikroskopija [1, 2]. Osnova delovanja
fazno občutljivih tehnik je interferenčno mešanje optičnih žarkov, ki gredo
skozi različna območja vzorca ali pa deloma skozi vzorec in deloma mimo
88 Obzornik mat. fiz. 62 (2015) 3
i
i
“Olenik” — 2015/8/11 — 8:27 — page 89 — #2 i
i
i
i
i
i
Mikroskopija pri Brewstrovem kotu
vzorca. Tipična debelina vzorcev pri faznem mikroskopiranju je na območju
od 1 do 50 µm.
Leta 1991 pa sta dve skupini raziskovalcev neodvisno razvili novo tehniko
za mikroskopiranje tankoplastnih struktur, s katero je mogoče opazovati
tudi vzorce prozornih snovi z debelino, manǰso od 1 nm. To je mikroskopija
pri Brewstrovem kotu, ki jo običajno označujemo z angleško kratico BAM
(Brewster Angle Microscopy) [3, 4]. Tehnika BAM je najbolj primerna
za opazovanje tankih površinskih nanosov na ravni podlagi iz homogenega
materiala, kot je na primer tanka plast nafte na površini vode. Zato so se
z razvojem BAM močno razmahnile zlasti raziskave spontane organizacije
različnih vrst organskih molekul na vodni površini.
Osnove delovanja mikroskopije pri Brewstrovem kotu
Tehnika BAM je osnovana na pojavu, da pri vpadu svetlobe na mejo dveh
snovi pri Brewstrovem kotu αB dobimo svetlobo, ki je linearno polarizirana v
smeri pravokotno na vpadno ravnino. Tej polarizaciji rečemo transverzalno
električna (TE), polarizaciji, ki je pravokotna nanjo, pa transverzalno ma-
gnetna (TM) polarizacija (slika 1 levo). Opisani fenomen lahko razložimo
preko načina, kako se električni dipoli atomov v bližini meje dveh snovi
odzivajo na TM polarizirano svetlobo. Znano je, da električni dipoli ne od-
dajajo nobenega sevanja v smeri svojega nihanja. Pri vpadu svetlobe pri
Brewstrovem kotu pa postane smer nihanja svetlobe v snovi 2 (tj. smer ni-
hanja električnih dipolov) vzporedna s smerjo odbite svetlobe in posledično
ni odboja za TM polarizacijo. Iz slike 1 je razvidno, da sta pri tem lomljeni
in odbiti žarek med seboj pravokotna (α + β = 90◦, kot β označuje nagib
lomljenega žarka glede na vpadno pravokotnico). Iz tega lahko z uporabo
lomnega zakona, n1 sinα = n2 sinβ, dobimo zvezo za Brewstrov kot αB
αB = arctg(n2/n1), (1)
pri čemer sta n1 in n2 lomna količnika snovi nad mejno ploskvijo in pod
njo. Pri vpadu svetlobe iz zraka na površino vode (n1 = 1,00, n2 = 1,33) se
polarizirani odboj zgodi pri αB = 53,1
◦. V realnosti lomni količnik na mejni
ploskvi ne preskoči diskretno iz ene vrednosti v drugo, ampak je sprememba
zvezna, zaradi česar odbita svetloba tudi pri Brewstrovem kotu ni povsem
linearno polarizirana. Na meji zrak-voda je tako na območju α ∼ αB naj-
manǰsa dosegljiva odbojnost za TM polarizirano svetlobo RTM ∼ 10−8 [5],
medtem ko ima odbojnost za TE polarizirano svetlobo na tem območju
vrednost RTE ∼ 0,08. Če pri α ∼ αB površino vode opazujemo skozi pola-
rizator (polarizacijski filter), katerega prepustna smer sovpada s smerjo TM
88–96 89
i
i
“Olenik” — 2015/8/11 — 8:27 — page 90 — #3 i
i
i
i
i
i
Lucija Čoga, Irena Drevenšek Olenik
Slika 1. Shema loma in odboja svetlobe pri Brewstrovem kotu αB brez vmesne tanke
plasti (levo) in z vmesno tanko plastjo (desno).
polarizacije, je površina videti temna oz. nereflektivna, saj je intenziteta
odbite svetlobe s TM polarizacijo izredno šibka. Navedeni učinek polariza-
cijskih filtrov izkorǐsčamo, kadar se pri fotografiranju ali pa pri gledanju v
objekte, napolnjene z vodo, želimo znebiti odboja svetlobe od vodne povr-
šine.
Opisane razmere pa se močno spremenijo, če na površino nanesemo
tanko plast neke tretje snovi z lomnim količnikom n3 (slika 1 desno). Posku-
šajmo dobiti oceno za spremembo odbojnosti za TM polarizirano svetlobo
pri α = αB na meji zrak-voda, če nanjo nanesemo plast snovi z lomnim
količnikom n3 = 1,5 in debelino d = 1 nm. Odbojnosti na mejnih ploskvah
zrak-vmesna plast in vmesna plast-voda podajata Fresnelovi enačbi [6]
R13 =
(
tg(α− γ)
tg(α+ γ)
)2
, R32 =
(
tg(γ − β)
tg(γ + β)
)2
, (2)
pri čemer velja n1 sinα = n2 sinβ = n3 sin γ. S kotom γ smo označili nagib
žarkov glede na vpadno pravokotnico v vmesni plasti. Vrednosti R13 in R32
sta si pri izbranih podatkih med seboj zelo podobni in z mirno vestjo lahko
vzamemo R13 ∼ R32 = R0 ∼ 10−3. V okviru tega približka lahko za izračun
celostne odbojnosti RTM , ki jo dobimo z upoštevanjem večkratnih odbojev
na obeh mejah, uporabimo znano zvezo, podano z Airyjevo funkcijo [6]:
RTM = 1 − TTM = 1 −
(
1
1 + F · sin2 φ2
)
, (3)
90 Obzornik mat. fiz. 62 (2015) 3
i
i
“Olenik” — 2015/8/11 — 8:27 — page 91 — #4 i
i
i
i
i
i
Mikroskopija pri Brewstrovem kotu
kjer TTM označuje prepustnost, F = 4R0/(1 − R0)2 kontrast meje, φ =
4πdn3 cos γ/λ pa fazni zamik med zaporednimi odbitimi žarki. Za nadaljnji
izračun bomo vzeli še λ = 658 nm, kar ustreza valovni dolžini laserja v BAM
sistemu, ki ga uporabljamo pri naših eksperimentih, ki so podrobneje opisani
v nadaljevanju. Pri navedenih podatkih potem dobimo φ ∼ 8π · 10−3. Ker
velja R0  1 in tudi φ  1, izraze v enačbi (3) razvijemo do prvega člena
v Taylorjevi vrsti in pridemo do zelo preprosto zveze
RTM ∼ R0φ2, (4)
iz katere sledi RTM ∼ 60 · 10−8. Z opisanim računom smo ugotovili, da le 1
nm debela površinska plast z lomnim količnikom n3 = 1,5 v območju α ∼ αB
povzroči povečanje odbojnosti za TM polarizirano svetlobo kar za faktor 60
glede na čisto vodno površino. To povečanje odbojnosti posledično povzroči
znatno povečanje intenzitete odbite svetlobe, ki ga z modernimi videoka-
merami brez težav zaznamo. Če med polarizator in videokamero dodamo
še objektiv za običajno optično mikroskopijo, lahko z opisanim sistemom
opazujemo mikroskopske podrobnosti pri nastanku, strukturiranju in faznih
transformacijah površinske plasti. Pri tem, podobno kot pri drugih vrstah
optične mikroskopije, lahko dosežemo lateralno ločljivost do okoli 0,5 µm.
Za osvetljevanje opazovanega območja namesto običajne žarnice uporabimo
lasersko svetlobo, saj nam njena monokromatičnost zagotavlja dobro defi-
nirane vrednosti lomnega količnika oz. Brewstrovega kota αB in s tem tudi
dober kontrast slike. Pojavi pa se manǰsa težava. Zaradi naklona optične
osi objektiva pod kotom (π/2 − αB) glede na opazovano površino je slika
ostra le za izbrani pas površinskega sloja, ki leži na ustrezni razdalji pred
objektivom. Pri mikroskopiranju večjih območij zato objektiv postopno
premikamo v smeri odbitega žarka in na koncu posnetke posamičnih pasov
združimo v enotno sliko. BAM se običajno uporablja za kvalitativno analizo
strukture filma. Za kvantitativno analizo pa ga po navadi kombiniramo z
drugimi tehnikami, na primer optično elipsometrijo.
Enomolekulske plasti na meji zrak-voda
Surfaktanti oz. površinsko aktivne snovi zmanǰsujejo površinsko napetost
vode. Najpogosteje gre za amfifilne molekule, sestavljene iz hidrofilne (po-
larne) »glave« in hidrofobnega (nepolarnega) »repa«. Tipičen predstavnik
tovrstnih molekul so maščobne kisline, katerih glavo tvori karboksilna sku-
pina, rep pa alifatska veriga. Za amfifilne molekule je lega na gladini vode
(meja zrak-voda) energijsko zelo ugodna, saj se hidrofilna glava lahko potopi
88–96 91
i
i
“Olenik” — 2015/8/11 — 8:27 — page 92 — #5 i
i
i
i
i
i
Lucija Čoga, Irena Drevenšek Olenik
Slika 2. Fazni diagram in sheme različnih faz, ki se pojavljajo pri spreminjanju površine
Langmuirjevega filma.
v vodo, hidrofobni rep pa ostane v zraku. Enomolekulske plasti amfifilnih
molekul na vodni površini imenujemo Langmuirjevi filmi, po Nobelovem na-
grajencu za kemijo Irvingu Langmuirju, ki se je poleg Agnes Pockelsove prvi
ukvarjal z znanstvenimi raziskavami na tem področju.
Za manipulacijo Langmuirjevih filmov se uporablja plitvo korito iz te-
flona. Korito napolnimo s tekočo »podfazo«, ki je najpogosteje čista voda,
vodna raztopina soli ali pa izbran pufer. Na površino podfaze nato po kaplji-
cah nanesemo majhen volumen (tj. nekaj mikrolitrov) raztopine izbranega
amfifila. Na začetku je gostota molekul v filmu tako majhna, da sta pozicija
hidrofilnih glav in orientacija hidrofobnih repov naključni. Takemu stanju
rečemo plinsko stanje oz. plinska faza Langmuirjevega filma. Ko pa zač-
nemo molekule stiskati na manǰse območje vodne gladine, medmolekulske
interakcije postajajo vedno bolj izrazite, kar vodi do nastanka novih faz in
faznih prehodov med njimi. Stiskanje izvedemo s pomikanjem zapornic, ki
omejujejo področje površinskega nanosa. Slika 2 prikazuje shemo tipičnega
faznega diagrama. Na horizontalni osi je podana površina območja vodne
gladine, ki odpade na posamično amfifilno molekulo. Izračunamo jo po zvezi
A1 = A/N , pri čemer je A površina celotnega območja filma, N pa število
amfifilnih molekul v filmu. Na vertikalni osi pa je podan površinski tlak Π,
ki označuje razliko med površinsko napetostjo čiste vode γ0 (72,8 mN/m pri
92 Obzornik mat. fiz. 62 (2015) 3
i
i
“Olenik” — 2015/8/11 — 8:27 — page 93 — #6 i
i
i
i
i
i
Mikroskopija pri Brewstrovem kotu
Slika 3. BAM posnetki Langmuirjevih filmov treh maščobnih kislin v kapljevinski kon-
denzirani fazi [7].
25 ◦C) in površinsko napetostjo vode, na kateri obstaja Langmuirjev film:
Π = γ0 − γ. Površinsko napetost merimo s preprosto napravo, ki je sesta-
vljena iz občutljive tehtnice in tanke ploščice, ki je obešena na tehtnico ter
potopljena skozi mejo podfaza-zrak (Wilhelmyjeva metoda). Rezultanto sil,
ki deluje na ploščico (odčitek na tehtnici), pretvorimo v površinsko napetost
preko znanih dimenzij ploščice.
Pri stiskanju filma, ki je v specifični fazi, površinski tlak Π narašča
s padajočo vrednostjo A1, na območjih koeksistence dveh faz pa je kon-
stanten. Detajli krivulje Π(A1), ki jo imenujemo izoterma Langmuirje-
vega filma, so določeni s kemijsko sestavo amfifilnih molekul, z lastnostmi
vodne podfaze (čista voda, voda z dodatkom soli, itd.) in s tempera-
turo sistema. Karakteristični značilnosti izbrane faze sta njena stisljivost
C = −((dA1/dΠ)/A1)max in limitna površina AL, ki jo dobimo z ekstrapo-
lacijo najstrmeǰsega dela krivulje Π(A1) na horizontalno os. Minimalna
površina, na katero lahko stisnemo eno alifatsko verigo, je okoli 20 Å2
(kvadratni angstromi), kar ustreza vrednosti AL za trdno fazo (S), v ka-
teri so hidrofobni repi orientirani pravokotno na gladino vode.
Primeri posnetkov enomolekulskih plasti
Za slikanje z BAM sistemom so ustrezne faze, katerih morfološke lastno-
sti se s časom le malo spreminjajo, saj za posnetek posamične slike, zaradi
v preǰsnjem poglavju omenjene potrebe po postopnem premikanju objek-
tiva preko opazovane površine, potrebujemo okoli 10 sekund. Opazovana
struktura se v tem času ne sme preveč premakniti oz. odplavati iz območja
opazovanja. Zato sta za BAM analizo najbolj primerni območji kapljevinske
kondenzirane faze (Lc) in trdne faze (S) (slika 2). Na sliki 3 so prikazani
BAM posnetki Lc faze Lagmuirjevih filmov treh maščobnih kislin z različno
88–96 93
i
i
“Olenik” — 2015/8/11 — 8:27 — page 94 — #7 i
i
i
i
i
i
Lucija Čoga, Irena Drevenšek Olenik
Slika 4. Shema orientacije alifatskega repa glede na vodno gladino. Vodna gladina je
vzporedna z ravnino xy.
dolgimi alifatskimi verigami: palmitinske, stearinske in arašidne. Čeprav
je debelina filmov le okoli 2 nm, je kontrast slike izjemno dober. Črna oz.
najtemneǰsa območja ustrezajo vodni površini praktično brez površinskega
nanosa, svetleǰsa območja pa domenam kondenziranega površinskega sloja.
Že majhna sprememba v strukturi amfifilne molekule lahko vodi do vidnih
sprememb v morfologiji filma. Iz slike 3 je razvidno, da se z dalǰsanjem
alkilne verige spreminja oblika domen in mej med njimi. Tako dobimo bolj
ukrivljene domene pri palmitinski kislini, ravne in žagaste domene pri stea-
rinski kislini ter meandrične domene pri arašidni kislini.
Domenska struktura, ki se kaže v različnih odtenkih sive barve, je posle-
dica nehomogene orientacije hidrofobnih repov. Medtem ko je zenitni kot
Θ za vse domene bolj ali manj enak, pa se azimutni kot ϕ od domene do
domene močno spreminja (slika 4). Zaradi tega se od domene do domene
spreminja tudi orientacija optičnih osi in s tem vrednost efektivnega lo-
mnega količnika za TM polarizirano svetlobo. Posledično nekatere domene
odbijajo več, druge pa manj svetlobe.
Za pripravo Langmuirjevih filmov lahko poleg maščobnih kislin upora-
bimo tudi številne druge molekule. Zanimiv primer so nukleozidi DNK, pri
katerih amfifilno naravo dosežemo tako, da na sladkorno skupino (deoksiri-
94 Obzornik mat. fiz. 62 (2015) 3
i
i
“Olenik” — 2015/8/11 — 8:27 — page 95 — #8 i
i
i
i
i
i
Mikroskopija pri Brewstrovem kotu
Slika 5. BAM posnetka Langmuirjevih filmov gvanozinskih derivatov z eno (a) in z
dvema (b) alifatskima verigama. Posnetek (a) je narejen na območju fazne koeksistence
med kapljevinsko ekspandirano in kapljevinsko kondenzirano fazo, posnetek (b) pa na
območju kapljevinske ekspandirane faze.
boza) pripnemo eno ali več alifatskih verig. Na sliki 5 sta prikazana BAM
posnetka Lagmuirjevih filmov derivatov gvanozina z dodatkom ene in dveh
alifatskih verig s 16 ogljikovimi atomi. Razberemo lahko, da je molekul-
ska organizacija derivata z eno verigo povsem drugačna kot pri derivatu z
dvema verigama, kar je posledica različnega razmerja med hidrofilno (nu-
kleinska baza) in hidrofobno izrazitostjo molekule (ena ali dve hidrofobni
verigi) [8].
Tanke plasti nukleozidov DNK so zanimive predvsem zaradi njihove spo-
sobnosti selektivne vezave na različne biološko pomembne molekule. Če
vodni podfazi, na površini katere je Langmuirjev film zgoraj opisanih de-
rivatov gvanozina, dodamo vodotopni derivat citozina, se zaradi specifične
interakcije med nukleozidoma medsebojna organizacija molekul v filmu in s
tem tudi oblika izoterme Π(A1) lahko močno spremeni. Langmuirjeve filme
modificiranih nukleozidov DNK zato lahko uporabimo kot zelo občutljive
senzorje za zaznavanje komplementarnega nukleozida v vodni raztopini [9].
Sklep
Zaradi razcveta nanotehnologije, ki smo mu priča v zadnjih desetletjih, se
uporaba tehnike BAM širi na vedno bolj raznolika področja. Vzporedno s
tem se razvijajo tudi novi načini mikroskopiranja, ki zmogljivosti BAM še
88–96 95
i
i
“Olenik” — 2015/8/11 — 8:27 — page 96 — #9 i
i
i
i
i
i
Lucija Čoga, Irena Drevenšek Olenik
povečujejo. Nedavne raziskave so pokazale, da je kontrast BAM posnetkov
možno znatno povečati, če Langmuirjevemu filmu dodamo molekule, ki ab-
sorbirajo svetlobo pri valovni dolžini laserskega sevanja, ki ga uporabljamo
za osvetljevanje filma [10]. Pred kratkim so se pojavile tudi komercialne
BAM naprave z alternativnim sistemom osvetljevanja, pri katerem je objek-
tiv orientiran pravokotno na površino, zaradi česar ni več treba slikati po
pasovih, ampak lahko celotno sliko v običajni video-resoluciji (20–35 posnet-
kov na sekundo) zajamemo naenkrat [11, 12]. To odpira nove možnosti za
analizo dinamičnih pojavov v Langmuirjevih filmih, kot so na primer pro-
cesi, povezani s kemičnimi reakcijami, ali pa svetlobno-inducirani strukturni
prehodi. Zato boste o BAM zelo verjetno slǐsali tudi še kdaj potem, ko bo
svetovno leto svetlobe že za nami.
LITERATURA
[1] M. Spencer, Fundamentals of Light Microscopy, Cambridge University Press, UK,
1982.
[2] J. Mertz, Introduction to Optical Microscopy, Roberts and Company Publishers,
Boulder, USA, 2010.
[3] S. Hénon in J. Meunier, Microscope at the Brewster angle: Direct observation of
first-order phase transitions in monolayers, Rev. Sci. Instrum. 62 (1991), 936–939.
[4] D. Hönig in D. Möbius, Direct visualization of monolayers at the air-water interface
by Brewster angle microscopy, J. Phys. Chem. 95 (1991), 4590–4592.
[5] J. Meunier, Why a Brewster angle microscope?, Colloids Surf. A 171 (2000), 33–40.
[6] R. Guenther, Modern Optics, John Wiley & Sons, New York, 1990, str. 72 in str.
109.
[7] A. Marin, BAM slike monoslojev maščobnih kislin, magistrsko delo, Univerza v Lju-
bljani, 2015.
[8] L. Čoga, S. Masiero in I. Drevenšek-Olenik, Lamellar versus compact self-assembly
of lipopoguanosine derivatives in thin surface films, Colloids Surf. B 121 (2014),
114-121.
[9] W. Miao, X. Du in Y. Liang, Molecular recognition of 1-(2-Octadecyloxycarbonylethyl)
cytosine monolayers to guanosine at the air-water interface investigated by infrared
reflection-absorption spectroscopy, J. Phys. Chem. B 107 (2003), 13636–13642.
[10] J. J. Giner-Casares in G. Brezesinski, Current microscopy contributions to advances
in science and technology, Vol. 2, ur. A. Méndez-Vilas, Formatex Research Center,
Badajoz, Spain, 2012.
[11] C. Lhevender, S. Hénon, R. Mercier, G. Tissot, P. Fournet in J. Meunier, A new
Brewster angle microscope, Rev. Sci. Instrum. 69 (1998), 1446–1450.
[12] http://accurion.com/thin-film-characterization-imaging-ellipsometry/
nanofilm_ultrabam, ogled 25. 5. 2015.
96 Obzornik mat. fiz. 62 (2015) 3