Barbara Soba1, Jernej Logar2
Molekularna epidemiologija humane kriptosporidioze
Molecular Epidemiology of Human Cryptosporidiosis
IZVLEČEK
KLJUČNE BESEDE: kriptosporidioza, Cryptosporidium, epidemiologija molekularna, genotip
Praživali iz rodu Cryptosporidium so za ljudi in živali patogeni paraziti. Povzročajo bolezen kriptosporidiozo, ki se kaže v akutni ali kronični driski. Kužne oblike parazita so izredno odporne oociste, ki jih gostitelj izloča z blatom. Človek se z njimi okuži neposredno od okuženih ljudi in živali ali posredno z onesnaženo vodo in hrano. Uspešnega zdravila za zdravljenje kriptosporidioze zaenkrat še ni, zato je zelo pomembno preprečevanje te okužbe. Uporaba molekularno-bioloških metod na področju raziskav kriptosporidijev in kriptosporidioze je razkrila obsežno genetično raznolikost teh parazitov. Danes je znanih štirinajst vrst in preko trideset genotipov kriptosporidijev. Pri človeku so opisali okužbe s sedmimi vrstami in enim genotipom. Molekularno ugotavljanje vrst oz. genotipov kriptosporidijev, ki najpogosteje okužijo ljudi na nekem področju, nam omogoča sklepati o virih okužbe in načinih širjenja bolezni ter uvedbo ukrepov za preprečevanje okužb s temi praživalmi. Pred nedavnim smo z uvedeno molekularno-biološko metodo ugotavljali, katere vrste oz. genotipi kriptosporidijev najpogosteje povzročajo kriptosporidiozo pri ljudeh v Sloveniji.	91
ABSTRACT
KEY WORDS: cryptosporidiosis, Cryptosporidium, epidemiology molecular, genotype
The protozoon parasite Cryptosporidium is a pathogen that infects humans and animals. It causes cryptosporidiosis, which results in an acute or chronic diarrhea. The infectious agents of this parasite are oocysts, which are excreted into the environment with feces of the infected host. Humans can become infected either directly through contact with infected humans and animals, or indirectly via contaminated water and food. In the absence of effective therapeutics against this parasite, preventing the infection is very important. The development of molecular biology-based techniques gave the insight into the extensive genetical variation within Cryptosporidium. In adition to the thirteen accepted species of Cryptosporidium, over thirty Cryptosporidium genotypes have been described. Thus far, seven species and one genotype have been identified in humans. Molecular characterization of Cryptosporidium species/genotypes that infect humans in a certain area most frequently enables us to infer about the sources of infection and transmission routes of Cryptosporidiosis in this area and to introduce appropriate intervention measures to prevent the infection. A molecular biology based technique was used in our laboratory to determine the species and genotypes of Cryptosporidium that infect humans in Slovenia.
1	Mag. Barbara Soba, univ. dipl. mikrobiol., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška 4, 1000 Ljubljana.
2	Prof. dr. Jernej Logar, univ. dipl. biol., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška 4, 1000 Ljubljana.
92
UVOD
Pražival Cryptosporidium je leta 1907 prvi opazil in opisal Tyzzer v želodčnih žlezah miši (Mus musculus) (1). Kasneje so kriptospori-dije našli še pri drugih živalskih vrstah. Z boleznijo, kriptosporidiozo, so to pražival prvič povezali leta 1955, ko je Slavin poročal o driskah pri puranih, pri katerih je našel ooci-ste tega parazita (2). Pri človeku sta okužbo s tem parazitom prva zasledila Nime in Mei-sel s sodelavci leta 1976 (3, 4). Kriptosporidiji danes veljajo za ene najpogostejših povzročiteljev drisk tako pri imunsko oslabljenih osebah kot tudi pri osebah z normalno imunostjo. Center za nadzor in preprečevanje bolezni v Atlanti, ZDA, je kriptosporidiozo uvrstil med t. i. »porajajoče se« nalezljive bolezni (5). Med te bolezni uvrščajo tiste, ki se zaradi vpliva družbenih dejavnikov, tehnološkega razvoja in spreminjanja naravnega okolja na novo porajajo, vendar jih večinoma ne povzročajo novi neznani povzročitelji, temveč dobro znani mikrobi (6).
Kriptosporidioza se pri večini bolnikov z normalno imunostjo kaže v obilni vodeni ali sluzasti driski tudi pet do desetkrat na dan. Driska se pojavi 7 do 10 dni po okužbi. Navadno jo spremljajo še bolečine v trebuhu, slabost, bruhanje, pomanjkanje teka in nekoliko zvišana telesna temperatura. Driska traja približno 9 do 15 dni, redkeje več tednov. Bolezen, ki je lahko tudi brez bolezenskih znakov, navadno preneha sama od sebe (7, 8). Kriptosporidioza predstavlja velik problem pri bolnikih s pomanjkljivo imunostjo, saj njihov imunski sistem ni sposoben sam zamejiti okužbe, uspešnega zdravila za zdravljenje krip-tosporidioze pa zaenkrat še ni. Pri teh bolnikih se driska ponavlja, traja več mesecev in se lahko konča s smrtjo. Bolniki močno shujšajo, saj zaradi driske izgubijo veliko tekočine, okoli tri litre na dan, lahko pa tudi mnogo več. Okužba lahko pri omenjenih bolnikih povzroči tudi vnetje dihalnih poti, žolčnika, jeter in trebušne slinavke. Bolezensko stanje se izboljša, če se izboljša imunsko stanje (npr. prenehanje jemanja raznih imunosupresivnih sredstev, protiretrovirusno zdravljenje pri bolnikih z aidsom) (7, 9).
O pojavljanju parazita Cryptosporidium pri ljudeh obeh spolov poročajo povsod po sve-
tu. Obolevnost s kriptosporidiji je večja v državah v razvoju (6,1 % pri bolnikih z drisko in 1-5,2 % pri osebah brez driske) kot v razvitih državah (2,2 % pri bolnikih z drisko in 0,2 % pri osebah brez driske). V Sloveniji so kriptos-poridije kot edine povzročitelje driske našli pri 3,2 % bolnikov (10). Pri otrocih v razvitih državah je okužba s kriptosporidiji vzrok za 7 % drisk, v državah v razvoju pa za 12 %. Okužba je pogostejša tudi pri bolnikih z oslabljeno imunostjo, predvsem pri bolnikih z aidsom, pri katerih število limfocitov T CD4+ že pade pod 200 na |ll. Pri njih je kriptospori-dioza ena izmed najpomembnejših oportuni-stičnih okužb. V razvitih državah je pri bolnikih z aidsom okužba s kriptosporidiji vzrok za 14 % drisk, v državah v razvoju pa za 24 % (11).
Kriptosporidioza se pojavlja sporadično in epidemično. Kužne oblike parazitov so 4 do 6 |im velike in izredno odporne oociste, ki jih gostitelj izloča z blatom. Človek se z oocista-mi kriptosporidijev okuži na različne načine: neposredno od okuženih ljudi ali živali in posredno z onesnaženo vodo ali hrano (12).
Uspešnega zdravila za zdravljenje kriptos-poridioze zaenkrat še ni, zato je zelo pomembno preprečevanje te okužbe (13). Pri uvajanju ustreznih ukrepov za preprečevanje okužbe je pomembno poznavanje virov okužbe in načinov širjenja bolezni. Tradicionalne diagnostične metode za ugotavljanje okužb s kriptosporidiji (histološke preiskave bioptičnega materiala črevesa, preiskave razmazov iztrebkov obarvanih z različnimi specifičnimi barvanji, specifične imunodiagnostične metode za dokazovanje antigenov kriptosporidijev) samo potrdijo oz. izključijo okužbo, o viru okužbe pa na podlagi teh rezultatov ne moremo sklepati. Ravno zaradi te pomanjkljivosti so na področju raziskav kriptosporidijev in kriptos-poridioze v začetku devetdesetih let prejšnjega stoletja uvedli molekularno-biološke metode. Z njihovo uporabo se je razkrila obsežna gene-tična raznolikost teh parazitov. Molekular-no-biološke metode so omogočile razločevanje po obliki in zgradbi izredno podobnih vrst oz. genotipov kriptosporidijev in pokazale, da lahko človeka okužijo različne vrste oz. genotipi teh parazitov ter da se človek z njimi okuži iz različnih virov. Molekularno-biološke metode zato pomenijo pomemben napredek pri proučevanju epidemiologije kriptosporidijev.
Izsledki teh raziskav so ključni tudi pri uvajanju ustreznih ukrepov za preprečevanje okužb s temi paraziti (14).
MOLEKULARNO-BIOLOSKE METODE
Od razvoja prve verižne reakcije s polimera-zo (PCR, angl. polymerase chain reaction) za raziskave kriptosporidijev in kriptosporidio-ze so opisali številne molekularno-biološke metode za ugotavljanje prisotnosti DNA krip-tosporidijev tako v kliničnih vzorcih kot tudi v vzorcih iz okolja. Danes največ uporabljajo metode, s katerimi je mogoča tudi opredelitev vrste oz. genotipa kriptosporidijev (14):
•	Analiza polimorfizma dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP, angl. restriction fragment lenght polymorphism) pridelkov PCR, predvsem gena za malo ribosomsko pode-noto (SSU rRNA, angl. small subunit ribo-somal RNA), gena za protein stene oocist kriptosporidijev (COWP, angl. Cryptosporidium oocyst wall protein), in gena za 60 k-Da glikoprotein (GP60). Pri tej metodi se pridelek PCR za določen čas izpostavi delovanju ustreznih restrikcijskih endonu-kleaz (encimi, ki režejo dvojno vijačnico DNA na točno določenem mestu), nato pa se analizira razlike v vzorcih encimske razgradnje pridelkov PCR.
•	Analiza mobilnosti heterodupleksov (HMA, angl. heteroduplex mobility assay). Pri tej metodi se k pridelku PCR najprej primeša znana t. i. referenčna DNA, to mešanico pa se segreje do temperature, pri kateri se začnejo komplementarne vijačnice DNA razdvojevati. Mešanico se nato počasi ohlaja, pri čemer se komplementarne vijačnice ponovno povežejo v dvojnovijačno DNA (v t. i. homoduplekse), nastanejo pa tudi t. i. heterodupleksi med enojnimi vijačni-cami pridelka PCR in referenčne DNA, ki se od homodupleksov razlikujejo po hitrosti potovanja v gelu.
•	Analiza polimorfizma konformacije enovi-jačnic (SSCP, angl. single strand conformation polymorphism) pridelkov PCR, predvsem gena za SSU rRNA, gena za ITS (angl. internal transcribed spacer), gena za 70kDa protein toplotnega šoka (HSP70, angl. 70kDa heat shock protein) in gena za
GP60. Pri tej metodi se komplementarne vijačnice DNA pridelkov PCR najprej razdvoji pri visoki temperaturi. Nastale eno-vijačnice pod določenimi pogoji oblikujejo sekundarne strukture. Sekundarna struktura enovijačnic je odvisna od njihove nukleo-tidne sestave, nanjo lahko vpliva že razlika v enem samem nukleotidu. Razlike v sekundarni strukturi enovijačnic se analizira glede na hitrost potovanja enovijačnic v gelu. • Sekvenčna analiza pridelkov PCR, predvsem gena za SSU rRNA, 23kDa glikoprotein (p23), GP60 in 900kDa glikoprotein (GP900), s katero se pridelkom PCR določi njihovo nukleotidno zaporedje in s tem opredeli vrsta oz. genotip kriptosporidija.
Prve tri od naštetih metod posredno opredelijo vrsto oz. genotip kriptosporidijev s primerjavo vzorcev encimske razgradnje pridelkov PCR in razlik v potovanju heterodupleksov oz. enovijačnic v gelu. Te metode so dokaj enostavne, hitre in poceni. V nekaterih primerih s temi metodami vrst oz. genotipov ni mogoče dokončno opredeliti. V teh primerih si pomagamo s sekvenčno analizo pridelkov PCR. Ta metoda neposredno in dokončno opredeli vrsto oz. genotip kriptosporidijev z določitvijo nukleotidnega zaporedja. Metoda je zanesljiva, vendar časovno zamudna, draga in tehnično zahtevna (15).
Molekularno-biološke metode so omogočile razločevanje med različnimi vrstami oz. genotipi kriptosporidijev. Z nekaterimi je mogoče kriptosporidije opredeliti celo pod nivojem vrste, kar dodatno razširi njihovo uporabnost pri proučevanju epidemiologije teh praživa-li (14,16). Iz ugotovitev molekularno-bioloških metod, tj. iz spoznave različnih vrst oz. genotipov kriptosporidijev, lahko ugotavljamo različne vire kriptosporidijev in načine njihovega prenosa ter tudi sklepamo na njihovo patogenost (16).
VRSTE OZ. GENOTIPI KRIPTOSPORIDIJEV IN POMEN NJIHOVEGA DOLOČANJA ZA JAVNO ZDRAVSTVO
Za rod Cryptosporidium je značilna obsežna genetična raznolikost. Danes je poimenovanih štirinajst vrst in preko trideset genotipov
93
Tabela 1. Vrste in genotipi kriptosporidijev ter njihoviglovnigostitelji (14).
94
Vrsta/genotip kriptosporidija	Glavni gostitelj
	Ptiči
C. boileyi	kokoši, purani, ostali ptiči
C. golli	ščinkavci, kokoši,
	divji petelini, dleski
C. meleogridis	purani in ostali ptiči, ljudje
gosji genotip I in II	gosi
klunačji genotip	evrazijski kljunači
neimenovan gosji genotip 3b	gosi
neimenovan gosji genotip 7	gosi
račji genotip	race, gosi
	Ljudje in domače živali
C. andersoni	govedo, azijske kamele, ovce
C. canis	psi
C. felis	mačke
C. hominis	ljudje, opice
C. parvum	ljudje, govedo, ovce, koze,
	jelenjad in srnjad, rakuni, konji
C. suis	prašiči
C. miri	morski prašički
bovini genotip B	govedo, ovce
genotip podoben genotipu	govedo
jelenjadi in srnjadi	
konjski genotip	konji
prašičji genotip II	prašiči
	Divje živali
C. muris	glodavci, azijske kamele
C. canis kojotji genotip	kojoti
Vrsta/genotip kriptosporidija	Glavni gostitelj
	Divje živali
C. canis lisičji genotip	lisice
C. hominis opičji genotip	opice
genotip belega dihurja	beli dihurji
genotip jelenjadi in srnjadi	jelenjad in srnjad
genotip miši vrste	miši vrste Peromyscus
Peromyscus maniculatus	maniculatus
genotip mungov	mungi
genotip oposumov	oposumi
genotip pižmovk I in II	pižmovke
genotip vrečarjev I in II	vrečarji
jelenji genotip	jelenjad in srnjad, ovce, lemurji
lisičji genotip	lisice
medvedji genotip	medvedi
mišji genotip	miši, podgane
skunčji genotip	skunki, rakuni
veveričji genotip	veverice
zajčji genotip	zajci
	Plazilci, ribe
C. molnari	ribe
C. saurophilum	kuščarji
C. serpentis	kače, kuščarji
neimenovan genotip kuščarjev	kuščarji
neimenovan kačji genotip	kače
neimenovan kačji genotip W11	kače
želvji genotip	želve
kriptosporidijev (tabela 1). Kriptosporidiji so uvrščeni v vrste glede na biološke (oblika in zgradba oocist, zanje značilni gostitelji) in genetske značilnosti. Mnogi kriptosporidiji danes še niso uvrščeni v vrste, ker so proučene le njihove genetske značilnosti, zgolj na osnovi katerih pa uvrstitev ni mogoča. Govorimo o genotipih kriptosporidijev (skupini organizmov z isto dedno zasnovo), ki so običajno poimenovani po gostitelju, v katerem so jih prvič opisali (npr. gosji genotip so prvič opisali pri goseh). Genetske značilnosti teh genotipov se razlikujejo od genetskih značilnosti že obstoječih vrst. Številni genotipi bodo v prihodnje, ko bodo proučili tudi njihove biološke značilnosti, najverjetneje predstavljali samostojne vrste (14, 17).
Molekularno-biološke raziskave so pokazale, da so vrste oz. genotipi kriptosporidijev večinoma prilagojeni na zanje značilne gostitelje. Raziskovalci zato menijo, da večina vrst oz. genotipov ne ogroža zdravja ljudi (14,17).
Dolgo časa je prevladovalo mnenje, da je C. parvum edina vrsta, ki povzroča okužbo pri človeku. Praživali iz vrste C. parvum so do nedavnega razvrščali v dva genotipa; humani genotip in bovini genotip. Za humani genotip (genotip 1) so menili, da okuži izključno človeka, za bovini genotip (genotip 2) pa so menili, da poleg goveda, ovc, koz ter jelenjadi in srnjadi okuži tudi človeka. Danes predstavljata oba genotipa ločeni vrsti, ki se različno prenašata. V vrsto C. parvum uvrščajo parazite, ki so jih prej uvrščali v bovini genotip. Na človeka se ti paraziti prenesejo posredno ali neposredno predvsem z okuženih živali lahko pa tudi z okuženih ljudi. Humani genotip zaradi svojih bioloških in genetskih značilnosti danes tvori samostojno vrsto C. hominis. Ta se lahko na človeka prenese posredno ali neposredno le z okuženih ljudi (18).
Številne molekularno-biološke raziskave so pokazale, da sta vrsti C. parvum in C. homi-nis najpogostejši povzročiteljici okužbe pri
človeku (17). V različnih državah obstajajo razlike v pogostnosti pojavljanja okužbe ljudi z eno ali drugo vrsto. Iz takšnih ugotovitev je mogoče sklepati, da so ljudje na različnih geografskih področjih izpostavljeni različnim virom okužbe in načinom prenosa tega parazita. V Avstraliji je 83 % primerov humane kriptosporidioze posledica okužbe s C. hominis, kar kaže na to, da so vir okužbe običajno okuženi ljudje in ne živali (19). Tudi v ZDA, na Japonskem, Danskem, Kitajskem, Tajskem, v Kanadi, Indiji, Gvatemali, Malaviju, Peruju, Keniji in Ugandi večino okužb pri človeku povzroča vrsta C. hominis (16, 20-31). Nasprotno pa na Novi Zelandiji, v Veliki Britaniji, Švici in Franciji, Severni Irski, na Portugalskem in drugih delih Evrope prevladujejo okužbe ljudi z vrsto C. parvum, iz česar je mogoče sklepati, da na teh področjih predstavlja živina poglavitni vir okužbe za človeka (32-41).
Vrsti C. parvum in C. hominis sta najpogostejši povzročiteljici okužbe pri človeku in le njiju povezujejo z epidemijami humane krip-tosporidioze (16). Opisanih je več epidemij kriptosporidioze, od katerih je bila najobsežnejša epidemija v južnem Milwaukeeju leta 1993. V njej je zaradi onesnaženosti pitne vode zbolelo preko 400.000 ljudi (42). Epidemija kriptosporidioze v Milwaukeeju je do danes najobsežnejša epidemija povezana z onesnaženostjo pitne vode v zgodovini ZDA. Poleg epidemij povezanih z onesnaženostjo pitne vode so pogoste tudi epidemije kriptosporidioze v otroških vrtcih, v bolnišnicah, med starostniki v domovih za starejše in delavcih na kmetijah, ki prihajajo v stik z okuženimi živalmi.
Vrsti C. parvum in C. hominis nista edini vrsti, ki okužita človeka. Pri imunsko oslabljenih osebah in otrocih so opisali še vrste C. meleagridis, C. felis in C. canis, ki sicer povzročajo okužbo pri živalih (16, 23, 27, 28, 34, 36-38, 43). Ljudi lahko, ne glede na njihovo imunsko stanje, okužijo tudi C. muris, C. suis in jelenji genotip kriptosporidija, vendar je pogostost okužb s temi kriptosporidiji izredno nizka (20, 24, 28, 30, 34, 39, 44, 45).
Rezultati molekularno-bioloških raziskav podpirajo domnevo, da je antropofilna vrsta C. hominis na človeka bolj prilagojena in s tem zanj tudi bolj kužna kot zoofilne vrste
oz. genotipi kriptosporidijev. Ljudje, okuženi z vrsto C. hominis, v svojem blatu izločajo večje število oocist in tudi dalj časa kot tisti okuženi z zoofilnimi vrstami oz. genotipi kriptosporidijev (30). Domnevo o večji prilagojenosti C. hominis na človeka potrjuje tudi dejstvo, da je večina epidemij humane kriptosporidioze navadno povezanih z vrsto C. hominis in to celo na področjih, kjer sicer večino spo-radičnih okužb povzroča vrsta C. parvum (34).
Vrste oz. genotipi kriptosporidijev pri ljudeh s kriptosporidiozo v Sloveniji
Pred nedavnim smo za raziskave kriptospo-ridijev in kriptosporidioze na Inštitutu za mikrobiologijo in imunologijo Medicinske fakultete v Ljubljani uvedli molekularno-bio-loško metodo - sekvenčno analizo pridelkov PCR. Z njo proučujemo, katere vrste oz. genotipi kriptosporidijev najpogosteje povzročajo kriptosporidiozo pri ljudeh v Sloveniji, da bi na podlagi tega lahko sklepali o virih okužbe in načinih širjenja bolezni. Po naših dosedanjih raziskavah povzroča pri nas, podobno kot tudi drugod po Evropi, večino okužb ljudi vrsta C. parvum. Ugotovili smo, da je bilo od 29 bolnikov s kriptosporidiozo 26 bolnikov okuženih s C. parvum, dva sta bila okužena s C. hominis in eden z jelenjim genotipom, ki okuži človeka le izjemoma. Glede na ugotovitve, da pri nas večino okužb ljudi povzroča vrsta C. parvum, je mogoče zaključiti, da je v Sloveniji poglavitni vir okužbe človeka okuženo govedo ter drobnica in le redko okuženi ljudje. Ugotovljen jelenji genotip pri enem izmed bolnikov s kriptosporidiozo pa kaže, da določeno tveganje za okužbo ljudi pri nas predstavljajo tudi divje živali. Vse te ugotovitve bo potrebno upoštevati pri uvajanju ukrepov za preprečevanje kriptosporidioze v Sloveniji (46). Ti ukrepi naj bi bili predvsem:
•	umik živinoreje s področij, kjer so zajetja pitne vode;
•	preprečevanje nenadzorovanega iztoka odplak iz hlevov, ker lahko le-te onesnažijo podtalnico;
•	zagotavljanje neoporečne pitne vode tudi s sistemom filtracije vode skozi filtre s porami manjšimi od 1 |lm, saj kloriranje vode oocist kriptosporidijev ne uniči;
95
• občasno preverjanje pitne vode na oociste kriptosporidijev s strani za to pristojnih ustanov.
ZAKLJUČEK
Uspešnega zdravila za zdravljenje kriptospo-ridioze zaenkrat še ni, zato je zelo pomembno preprečevanje okužbe, predvsem z zagotovitvijo neoporečne pitne vode in hrane (13). Uvedba molekularno-bioloških metod za raziskave nekaterih parazitov v začetku devetdesetih let je pomenila pomemben napredek tudi na področju raziskav kriptosporidijev in kriptosporidioze. Molekularno-biološke metode so bistveno pripomogle k razločevanju po obliki in zgradbi izredno podobnih vrst oz.
genotipov kriptosporidijev in s tem dale vpogled v genetično raznolikost teh parazitov. Njihova uporaba pri proučevanju humane kriptosporidioze je pokazala, da okužbe pri človeku ne povzročata le vrsti C. hominis in C. parvum, ampak da so lahko za človeka potencialno patogene tudi vrste oz. genotipi kriptosporidijev, ki običajno povzročajo okužbo le pri živalih. Molekularno-biološke metode so zaradi svoje visoke občutljivosti omogočile neposredno ugotavljanje prisotnosti krip-tosporidijev ne samo v kužnini bolnikov ampak tudi v vodi, hrani in različnih drugih vzorcih iz okolja. Danes so te metode podlaga za poznavanje epidemiologije kriptospo-ridijev in kriptosporidioze, predvsem virov okužbe in načinov širjenja te bolezni (35).
LITERATURA
1.	Tyzzer EE. Asporozoan found in the peptic glands of the common mouse. Proc Soc Exp Biol Med 1907; 5: 12-3.
2.	Slavin D. Cryptosporidium meleagridis (sp. nov.). J Comp Pathol 1955; 65: 262-6.
3.	Nime FA, Burek JD, Page DL, Holscher MA, Yardley JH. Acute enterocolitis in a human being infected with the protozoan Cryptosporidium. Gastroenterology 1976; 70: 592-8.
4.	Meisel JL, Perera DR, Meligro C, Rubin CE. Overwhelming watery diarrhea associated with a cryptosporidium in an immunosuppressed patient. Gastroenterology 1976; 70: 1156-60.
- 5. Tzipori S. Introduction. Cryptosporidiosis: current trends and challenges. Microbes Infect 2002; 4: 1045.
96 6. Likar M. Porajajoče se nalezljive bolezni. Ljubljana: Zbornica sanitarnih tehnikov in inženirjev Slovenije; 1999.
7.	Logar J. Parazitologija v medicini. 1st ed. Ljubljana: DZS; 1999.
8.	Chen XM, Keithly JS, Paya CV, LaRusso NF. Cryptosporidiosis. N Engl J Med 2002; 346: 1723-31.
9.	Hunter PR, Nichols G. Epidemiology and clinical features of Cryptosporidium infection in immunocompromised patients. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 145-54.
10.	Logar J, Poljšak - Prijatelj M, Andlovic A. Incidence of Cryptosporidium parvum in patients with diarrhea. J Eukar-yot Microbiol 1996; 43: 67.
11.	Guerrant RL. Cryptosporidiosis: an emerging, highly infectious threat. Emerg Infect Dis 1997; 3: 51-7.
12.	Dillingham RA, Lima AA, Guerrant RL. Cryptosporidiosis: epidemiology and impact. Microbes Infect 2002; 4:1059-66.
13.	Petry F, ed. Cryptosporidiosis and Microsporidiosis. Basel: Karger; 2000.
14.	Xiao L, Ryan UM. Cryptosporidiosis: an update in molecular epidemiology. Curr Opin Infect Dis 2004; 17: 483-90.
15.	Poljak M, Avšič - Zupanc T, Seme K. Verižna reakcija s polimerazo - nova raziskovalna in diagnostična metoda v virologiji. Med Razgl 1994; 33: 379-400.
16.	Xiao L, Bern C, Sulaiman IM, Lal AA. Molecular epidemiology of human cryptosporidiosis. In: Thompson RCA, Armson A, Ryan UM, eds. Cryptosporidium: From Molecules to Disease. Amsterdam: Elsevier; 2003. p. 121-46.
17.	Xiao L, Fayer R, Ryan U, Upton SJ. Cryptosporidium taxonomy: recent advances and implications for public health. Clin Microbiol Rev 2004; 17: 72-97.
18.	Morgan-Ryan UM, Fall A, Ward LA, Hijjawi N, Sulaiman I, Fayer R, et al. Cryptosporidium hominis n. sp. (Api-complexa: Cryptosporidiidae) from Homo sapiens. J Eukaryot Microbiol 2002; 49: 433-40.
19.	Morgan UM, Xiao L, Fayer R, Lal AA, Thompson RC. Epidemiology and strain variation of Cryptosporidium parvum. Contrib Microbiol 2000; 6: 116-39.
20.	Yagita K, Izumiyama S, Tachibana H, Masuda G, Iseki M, Furuya K, et al. Molecular characterization of Cryptosporidium isolates obtained from human and bovine infections in Japan. Parasitol Res 2001; 87: 950-5.
21.	Enemark HL, Ahrens P, Juel CD, Petersen E, Petersen RF, Andersen JS, et al. Molecular characterization of Danish Cryptosporidium parvum isolates. Parasitology 2002; 125: 331-41.
22.	Peng MM, Matos O, Gatei W, Das P, Stantič-Pavlinič M, Bern C, et al. A comparison of Cryptosporidium sub-genotypes from several geographic regions. J Eukaryot Microbiol 2001; Suppl: 28-31.
23.	Gatei W, Suputtamongkol Y, Waywa D, Ashford RW, Bailey JW, Greensill J, et al. Zoonotic species of Cryptosporidium are as prevalent as the anthroponotic in HIV-infected patients in Thailand. Ann Trop Med Parasitol 2002; 96: 797-802.
24.	Ong CS, Eisler DL, Alikhani A, Fung VW, Tomblin J, Bowie WR, et al. Novel Cryptosporidium genotypes in sporadic cryptosporidiosis cases: first report of human infections with a cervine genotype. Emerg Infect Dis 2002; 8: 263-8.
25.	Peng MM, Xiao L, Freeman AR, Arrowood MJ, Escalante AA, Weltman AC, et al. Genetic polymorphism among Cryptosporidium parvum isolates: evidence of two distinct human transmission cycles. Emerg Infect Dis 1997; 3: 567-73.
26.	Sulaiman IM, Xiao L, Yang C, Escalante L, Moore A, Beard CB, et al. Differentiating human from animal isolates of Cryptosporidium parvum. Emerg Infect Dis 1998; 4: 681-5.
27.	Pieniazek NJ, Bornay-Llinares FJ, Slemenda SB, da Silva AJ, Moura IN, Arrowood MJ, et al. New cryptospori-dium genotypes in HIV-infected persons. Emerg Infect Dis 1999; 5: 444-9.
28.	Tiangtip R, Jongwutiwes S. Molecular analysis of Cryptosporidium species isolated from HIV-infected patients in Thailand. Trop Med Int Health 2002; 7: 357-64.
29.	Gatei W, Greensill J, Ashford RW, Cuevas LE, Parry CM, Cunliffe NA, et al. Molecular analysis of the 18S rRNA gene of Cryptosporidium parasites from patients with or without human immunodeficiency virus infections living in Kenya, Malawi, Brazil, the United Kingdom, and Vietnam. J Clin Microbiol 2003; 41: 1458-62.
30.	Xiao L, Bern C, Limor J, Sulaiman I, Roberts J, Checkley W, et al. Identification of 5 types of Cryptosporidium parasites in children in Lima, Peru. J Infect Dis 2001; 183: 492-7.
31.	Tumwine JK, Kekitiinwa A, Nabukeera N, Akiyoshi DE, Rich SM, Widmer G, et al. Cryptosporidium parvum in children with diarrhea in Mulago Hospital, Kampala, Uganda. Am J Trop Med Hyg 2003; 68: 710-5.
32.	McLauchlin J, Pedraza-Diaz S, Amar-Hoetzeneder C, Nichols GL. Genetic characterization of Cryptosporidium strains from 218 patients with diarrhea diagnosed as having sporadic cryptosporidiosis. J Clin Microbiol 1999; 37: 3153-8.
33.	Fretz R, Svoboda P, Ryan UM, Thompson RC, Tanners M, Baumgartner A. Genotyping of Cryptosporidium spp. isolated from human stool samples in Switzerland. Epidemiol Infect 2003; 131: 663-7.
34.	Guyot K, Follet-Dumoulin A, Lelievre E, Sarfati C, Rabodonirina M, Nevez G, et al. Molecular characterization of Cryptosporidium isolates obtained from humans in France. J Clin Microbiol 2001; 39: 3472-80.
35.	McLauchlin J, Amar C, Pedraza-Diaz S, Nichols GL. Molecular epidemiological analysis of Cryptosporidium spp. in the United Kingdom: results of genotyping Cryptosporidium spp. in 1,705 fecal samples from humans and 105 fecal samples from livestock animals. J Clin Microbiol 2000; 38: 3984-90.
36.	Alves M, Matos O, Antunes F. Multilocus PCR-RFLP analysis of Cryptosporidium isolates from HIV-infected patients from Portugal. Ann Trop Med Parasitol 2001; 95: 627-32.	97~
37.	Morgan U, Weber R, Xiao L, Sulaiman I, Thompson RC, Ndiritu W, et al. Molecular characterization of Cryptosporidium isolates obtained from human immunodeficiency virus-infected individuals living in Switzerland, Kenya, and the United States. J Clin Microbiol 2000; 38: 1180-3.
38.	Alves M, Xiao L, Sulaiman I, Lal AA, Matos O, Antunes F. Subgenotype analysis of Cryptosporidium isolates from humans, cattle, and zoo ruminants in Portugal. J Clin Microbiol 2003; 41: 2744-7.
39.	Pedraza-Diaz S, Amar C, Iversen AM, Stanley PJ, McLauchlin J. Unusual cryptosporidium species recovered from human faeces: first description of Cryptosporidium felis and Cryptosporidium 'dog type' from patients in England. J Med Microbiol 2001; 50: 293-6.
40.	Lowery CJ, Millar BC, Moore JE, Xu J, Xiao L, Rooney PJ, et al. Molecular genotyping of human cryptospori-diosis in Northern Ireland: epidemiological aspects and review. Ir J Med Sci 2001; 170: 246-50.
41.	Learmonth JJ, Ionas G, Pita AB, Cowie RS. Identification and genetic characterisation of Giardia and Cryptosporidium strains in humans and dairy cattle in the Waikato Region of New Zealand. Water Sci Technol 2003; 47: 21-6.
42.	Mac Kenzie WR, Hoxie NJ, Proctor ME, Gradus MS, Blair KA, Peterson DE, et al. A massive outbreak in Milwaukee of cryptosporidium infection transmitted through the public water supply. N Engl J Med 1994; 331:161-7.
43.	Morgan U, Xiao L, Sulaiman I, Weber R, Lal AA, Thompson RC, et al. Which genotypes/species of Cryptosporidium are humans susceptible to? J Eukaryot Microbiol 1999; 46: 42-43.
44.	Gatei W, Ashford RW, Beeching NJ, Kamwati SK, Greensill J, Hart CA. Cryptosporidium muris infection in an HIV-infected adult, Kenya. Emerg Infect Dis 2002; 8: 204-6.
45.	Xiao L, Bern C, Arrowood M, Sulaiman I, Zhou L, Kawai V, et al. Identification of the cryptosporidium pig genotype in a human patient. J Infect Dis 2002; 185: 1846-8.
46.	Soba B. Ugotavljanje vrst in genotipov prazivali Cryptosporidium spp. pri ljudeh s kriptosporidiozo v Sloveniji [magistrsko delo]. Ljubljana: Univerza v Ljubljani; 2004.
Prispelo 6. 1. 2005