Tomaž Smrkolj1
Morfometri~na analiza sinapti~nih jedrnih skupkov v posami~nih vlaknih hitre in po~asne skeletne mi{ice2
A Morphometric Analysis of Synaptic Nuclear Clusters in Isolated Fibers of Fast and Slow Skeletal Muscle2
IZVLEČEK_
KLJUČNE BESEDE: mišica skeletna - anatomija in histologija, živčno-mišični stik, celično jedro, miSICna vlakna počasna, mišična vlakna hitra, mikroskopija konfokalna, podgane
V področju živčno-mišičnega stika prečno progastega mišičnega vlakna pri sesalcih so jedra bolj zgoščena kot izvensinaptično. Počasna skeletna mišična vlakna so elektromehanično aktivna večji del časa kot hitra vlakna in so tako tudi vzorci frekvenc prenesenih akcijskih potencialov pri obeh tipih vlaken različni. Ta razlika med tipi vlaken bi se lahko odrazila tudi v različni razporeditvi mišičnih jeder in Schwannovih celic v sinaptičnem področju, kar do zdaj še ni bilo raziskano. Postavili smo naslednje hipoteze: 1. število mišičnih jeder v sinaptičnem skupku je v počasnem skeletnem mišičnem vlaknu značilno večje kot v hitrem vlaknu; _
2. število Schwannovih celic v področju živčno-mišičnega stika, ki ga lahko ugotovimo tako, 135 da preštejemo njihova jedra, je premosorazmerno s površino živčno-mišičnega stika; 3. maksimalna razdalja, do katere znotraj mišičnega vlakna še sežejo vplivi živčnih trofičnih dejavnikov, je v hitrih in počasnih skeletnih mišičnih vlaknih enaka.
V posamičnih skeletnih mišičnih vlaknih, ki smo jih izolirali iz m. extensor digitorum lon-gus (hitra vlakna) in m. soleus (počasna vlakna), smo obarvali jedra s fluorescenčnim barvilom »SYTOX zeleno«. Živčno-mišični stik smo v teh vlaknih obarvali z a-bungarotoksinom, označenim z rodaminom. Ustrezna morfometrična merjenja razporejenosti jeder smo opravili na konfokalnem mikroskopu.
Dobljeni rezultati so nas pripeljali do naslednjih zaključkov: 1. v sinaptičnem jedrnem skupku odraslega počasnega skeletnega mišičnega vlakna je 7,15 ± 2,37 (n = 20) mišičnih jeder, medtem ko je v sinaptičnem jedrnem skupku hitrega vlakna teh jeder 4,60 ± 0,75 (n = 20). Ta razlika je statistično značilna (p< 0,05, neparni Študentov T-test). 2. korelacija med sinaptič-no površino živčno-mišičnega stika in številom jeder, ki pripadajo Schwannovim celicam, je bila v hitrem vlaknu višja (KK=0,4) kot v počasnem (KK = 0,07), a po naši oceni še vedno premajhna za potrditev naše druge hipoteze. 3. Maksimalna razdalja v mišičnem vlaknu, do katere so še vidni znaki delovanja živčnih trofičnih dejavnikov, in ki smo jo ocenili z merjenjem razdalje med robom živčno-mišičnega stika in prvim zunajsinaptičnim jedrom, znaša za hitra skeletna mišična vlakna 25,5 ± 9,3 |im (n = 20), za počasna pa 26,9 ± 7,4 |im (n = 20). Med obema razdaljama ni statistično značilnih razlik (p > 0,05; Študentov T-test).
1	Tomaž Smrkolj, štud. med., Inštitut za patološko fiziologijo, Medicinska fakulteta, Zaloška 4, 1000 Ljubljana.
2	Objavljeno delo je bilo nagrajeno s fakultetno Prešernovo nagrado študentom za leto 2000.
ABSTRACT_
KEYWORDS: muscle skeletal - anatomy and histology, neuromuscular junction, cell nucleus, muscle fibers fast-twitch, muscle fibers slow-twitch, microscopy confocal, rats
Myonuclei of mamalian skeletar muscle fibers are packed at much higher density in the neuromuscular junction region than in the extrajunctional parts of the fiber. Slow muscle fibers are electromechanically active for longer time periods than fast fibers and the frequency patterns of action potentials are different in both fiber types. This difference might reflect in the distribution of synaptic myonclei and the arrangement of synaptic Schwann cells. Our hypotheses were: 1. The number of synaptic myonuclei is significantly higher in slow fibers than in fast fibers. 2. The number of synaptic Schwann cells determined by counting their nuclei is proportional to the neuromuscular junction area. 3. The reach of the influences of neural trophic factors in the skeletal muscle fibers does not differ in regard to the fiber type.
Nuclei in single muscle fibers of m. extensor digitorum longus (fast) and m. soleus (slow) were labelled with SYTOX green nuclear acid stain and the endplates with rhodamine-tagged a-bungarotoxin. Images obtained by confocal microscopy were morphometircally analysed.
There are 7,15 ± 2,37 (n=20) synaptic myonuclei in slow muscle fiber and 4,60 ± 0,75 (n=20) synaptic myonuclei in fast muscle fiber. The difference is significantly different (p < 0,05; Student's T-test), The correlation coefficient between the area of the neuromuscular junction and the number of Schwann cell nuclei was higher in fast fibers (KK= 0,4) than in slow fibers (KK = 0,07), but to our opinion still too low to confirm our second hypothesis; 3. Maximal distance of the action of neuronal trophic factors was estimated by measuring the distance between the border of the neuromuscular junction and the first extrasynaptic nucleus. It was found to be 25,5 ±9,3 |im, (n = 20) in fast fiber type and 26,9 ±7,4 |im (n = 20) in slow fiber type and the difference was not statistically significant (p > 0,05; Student's T-test).
136
UVOD
Pomen sinapticnega prevajanja signalov
V evoluciji so večcelični organizmi pridobili zmožnost prenosa informacij iz enega v druge dele organizma, kar je omogočilo celicam in s tem celotnemu organizmu koordinirano delovanje. Za prenos informacij iz ene na drugo celico so se v evoluciji posamezni deli na površini celice specializirali za prenos in sprejem signala. Ko gre za komunikacijo med nevronom in njegovimi tarčnimi celicami, se taka specializirana struktura imenuje sinapsa. V sinapsi glede na smer prenosa informacij ločimo pred-sinaptično in posinaptično membrano. Kadar gre za sinaptično komunikacijo med končičem motonevrona in skeletnim mišičnim vlaknom, pravimo tej sinapsi živčno-mišični stik (ZMS) ali tudi motorična ploščica.
Eno od osrednjih vprašanj, s katerimi se ukvarjajo sodobne nevrološke znanosti, so mehanizmi in procesi, ki uravnavajo morfološko
in funkcionalno specializacijo celic v sinaptič-nem področju. Poznavanje teh mehanizmov je ključnega pomena ne le za razumevanje delovanja ZMS in ostalih sinaps, ampak tudi za razumevanje njihove plastičnosti in vrste procesov, v katere je ta vpletena (spomin, učenje, itd). Zaradi eksperimentalne dostopnosti je ZMS trenutno daleč najbolj preučena med vsemi sinapsami in večina današnjega znanja o sinaptični zgradbi in sinaptičnem prenosu je bila pridobljena prav na ZMS.
Zgradba živčno-mišičnega stika
Osnovna zgradba @MS sledi zgradbi ostalih kemičnih sinaps. Tako končič motoričnega živca tvori predsinaptični del, skeletno mišično vlakno prispeva posinaptični del, med seboj pa ju ločuje sinaptična špranja. a-motorični nevron izhaja iz sprednjih rogov hrbtenjače. Njegov akson potuje po perifernem živcu, se v mišici razveji, njegovi razvejki pa oživčuje-jo posamezna skeletna mišična vlakna. Na površini mišičnega vlakna razvejani akson izgubi mielinsko ovojnico, končiče pa prekrijejo
Schwannove celice (1). ŽMS sestavljajo tri vrste celic: motorični nevron s svojim živčnim končičem, skeletno mišično vlakno in Schwannova celica, ki prekriva živčni končič. Med živčnim končičem in Schwannovo celico na eni in skeletnim mišičnim vlaknom na drugi strani je bazalna lamina, ki ima v področju ŽMS drugačno molekulsko zgradbo kot izven ŽMS (2).
Podrobnejša molekularna zgradba in natančnejši molekularni mehanizni prenosa, predvsem pa molekularni mehanizmi, ki uravnavajo sinaptogenezo ŽMS in njegovo plastičnost, se nam razkrivajo šele v zadnjem času. Novejše raziskovalne metode molekularne biologije, elektrofiziologije in kri-stalografije so razkrile izredno kompleksnost v molekularni zgradbi ŽMS. Znanih je že okrog 50 različnih molekul, ki veljajo kot specifične za ŽMS, tudi to število pa najbrž še ni dokončno (3-5). Glede funkcij posameznih molekul je odprta še vrsta vprašanj, eno od najpomembnejših pa je, po kakšnih mehanizmih se vse te različne molekule kopičijo in združujejo v strukturo ŽMS. V predsinap-tičnem delu ŽMS obstaja vrsta molekul, ki so povezane s sintezo, transportom in izločanjem acetilholina (ACh), ki je kemični prenašalec v ŽMS. Poleg tega so tu še napetostni kanalč-ki Ca2+, encim holinacetil transferaza (ChAT) in komponente transportnega sistema za privzem holina, v zadnjem času pa se raziskave usmerjajo k molekulam, ki sodelujejo pri eksocitozi mehurčkov na predsinaptični membrani (5, 6). Na posinaptični membrani se nahaja acetilholinski receptor (AChR) in vrsta drugih molekul, ki skrbijo za ustrezno strukturo ŽMS. Neposredno pod posinaptič-no membrano se nahaja skupek sinaptičnih jeder, ki so pod kontrolo ekspresijskih dejavnikov, ki jih izloča motorični nevron (4). Med predsinaptično in posinaptično membrano je bazalna lamina, ki ima pomembno razvojno, strukturno in funkcijsko vlogo. Bazalna lamina v sinaptičnem področju se razlikuje od tiste v izvensinaptičnem področju. Sestavljajo jo molekule laminina, različnih tipov kolagena, pripetih molekul acetilholine-steraze (AChE) in nekaterih dejavnikov, ki se izločajo iz živčnega končiča, kot sta npr. ARIA (angl. Acetylcholine Receptor Inducing Agent) in agrin (angl. agregation inducer). V sinap-
tičnem področju najdemo tudi izoformni obliki laminina (laminin 4, laminin P1/P2 ali S-laminin) in nekatere oblike kolagena, hepa-ransulfat proteoglikanov in S-entaktina, ki so visoko koncentrirane le v sinaptični bazalni lamini (5,6,8).
Prenos signala prek živčno-mišičnega stika
Proces prenosa signala iz živčnega vlakna na mišično vlakno poteka po naslednjem vrstnem redu:
•	Signal potuje v obliki depolarizacijskega vala, ki mu pravimo akcijski potencial, skokovito po aksonu živčnega vlakna in de-polarizira membrano živčnega končiča. Posledica depolarizacije je odprtje napetostno odvisnih kanalčkov Ca2+ in vdor Ca2+ v živčni končič. Zvišana koncentracija Ca2+ v končiču sproži zaporedje dogodkov, ki privedejo do lokaliziranega sproščanja ACh v sinaptično špranjo.
•	ACh prosto difundira prek špranje in se veže na nikotinski AChR na površini membrane mišičnega vlakna. Zaradi vezave ACh na AChR se odprejo kationski kanalč-ki, ki so del AChR. Poveča se prepustnost membrane za Na+ in K+, kar pomakne membranski potencial z njegove mirovne vrednosti proti vrednosti praga. To depolarizacijo imenujemo ekscitacijski po-sinaptični potencial (EPSP).
•	Ko EPSP doseže vrednost praga, se z različnim časovnim potekom odprejo in zaprejo napetostni kanalčki Na+ in K+, kar privede do nastanka akcijskega potenciala, ki se razširi vzdolž in v notranjost skeletnega mišičnega vlakna.
Generalizirana depolarizacija membrane mišičnega vlakna povzroči aktivacijo napetostno odvisnih kanalčkov Ca2+ v določenih regijah (T-tubuli) in aktivacijo kanalčkov Ca2+ v sar-koplazemskem retikulumu. Posledično zvišana koncentracija Ca2+ v citosolu mišičnega vlakna povzroči skrčenje vlakna (9).
Sinaptogeneza živčno-mišičnega stika
Nastanek ŽMS obsega mnogo stopenj, od diferenciacije motoričnih živcev in izraščanja
37
aksonov do tarčnih celic - skeletnih mišičnih vlaken, pa vse do specializacije in diferenciacije tako tarčne celice kot tudi aksona na mestu njunega stika. Tudi večina današnjega znanja o sinaptogenezi izvira prav iz preučevanja nastajanja ZMS in prevladuje mnenje, da podobni mehanizmi verjetno veljajo tudi za druge sinapse v organizmu (3). V razvoju perifernega živčnega sistema pri človeku motorični živci izraščajo iz ventralnih rogov razvijajoče se hrbtenjače med šestim in desetim tednom razvoja. Aksoni rastejo proti miotomu, ki je mezodermalna struktura in v kateri poteka razvoj in diferenciacija mišič-nine. Skeletno mišično vlakno, ki nastane v končni fazi tega diferenciacijskega procesa, je večjedrni sincicij, ki nastane s fuzijo prekurzor-skih celic - mononuklearnih mioblastov (10). Mioblasti izhajajo iz mezodermalnega dela embrija, od koder potujejo v različne dele telesa, kjer tvorijo miotome somitov. Tam se prenehajo deliti in preidejo v proces fuzije. Preživetje in nadaljnja diferenciacija mišičnih cevčic je odvisna od prisotnosti motoričnih živcev in oživčenja prek njihovih končičev (10, 11). Pri opisanem dogajanju v embrio-nalnem razvoju imajo po vsej verjetnosti pomembno vlogo tudi celice glije, zlasti Schwannove celice (12).
Ko se vzpostavi prvi stik med rastočim motoričnim živcem in diferencirajočo se mišično cevčico, pride do intenzivne izmenjave signalov med njima, kar omogoči nadaljnjo diferenciacijo in nastanek visoko specializirane strukture na tem stiku (2, 13). Mesto nastanka ZMS ni vnaprej določeno. Pri vretenčarjih lahko ZMS nastane na kateremkoli delu na površini mišice. Funkcionalni stik s šibkim živčno-mišičnim prenosom nastane že v zelo kratkem času, vendar je za nastanek zrele in polno funkcionalne sinapse potreben dodaten čas, ki je - odvisno od species - v ran-gu nekaj tednov (3). Dokončna diferenciacija ZMS privede do eliminacije vseh razen enega od več stikov med živcem in mišičnim vlaknom, ki se vzpostavijo v začetnih fazah oživčenja. Sinaptogeneza obsega diferenciacijo predsinaptične in posinaptične membrane. Diferenciacija slednje je povezana z vrsto dogodkov, od katerih je najbolje preučeno zgoščevanje AChR v sinaptičnem področju in »up-regulacija« njihove ekspresije v sinaptič-
nih jedrih. V proces diferenciacije predsi-naptične membrane pa sodi akumulacija molekul, specifičnih za živčni končič, povečanje učinkovitosti sproščanja ACh, inhibicija rasti aksona in nadaljnje modifikacije te membrane. Ti procesi so združeni z akumulacijo različnih molekul na mestu nastanka ZMS (14, 15). Od vseh molekul, ki se akumulirajo v področju ZMS, je najbolj preučena akumulacija AChR v posinaptični membrani, do katere pride po prvem stiku z motoričnim živcem, kar se pri podgani zgodi med 15. in 18. embrionalnim dnevom (16). Akumuliranje AChR je eden ključnih dogodkov v sinaptoge-nezi in je odločilnega pomena za normalno delovanje sinapse, ker le zadostna koncentracija AChR omogoča nastanek ekscitacijskega potenciala na posinaptični membrani mišičnega vlakna. AChR je sestavljen iz petih homolognih podenot, najdemo pa ga v dveh podoblikah: sinaptični in izvensinaptični, ki se razlikujeta veni podenoti (17). Transkripcijo podenot AChR v sinaptičnem področju uravnava ARIA. To je 42kDa velika beljakovina, ki jo sintetizirajo in izločajo motorični živci in ki deluje prek ErbB-receptorjev, od katerih so ErbB2, ErbB3 in ErbB4 koncentrirani v posi-naptični membrani.
Bazalna lamina verjetno vsebuje signale, ki so potrebni za sproženje sinaptogeneze ZMS, kar so ugotovili pri študijah sinaptične diferenciacije regenerirajočega mišičnega vlakna (18,19). Vteh študijah so pokazali, da tudi po uničenju motoričnih živcev, in torej v njihovi odsotnosti, v skeletnem mišičnem vlaknu pride do koncentriranja AChR na mestu sinapse, vendar le ob prisotnosti nepoškodovane bazalne lamine na mestu prvotnega stika z motonevronom (20, 21). Na bazalno lamino se veže prek kolagenskega repa tudi asimetrična (A12) oblika AChE. Med diferenciacijo in sinaptogenezo vmišič-nih celicah se ekspresija, oblike molekule in lokacija AChE spreminjajo. Pred sinaptogene-zo se nahaja AChE po vsej dolžini razvijajoče se mišične cevčice, takoj po vzpostavitvi prvega stika z motoričnim živcem pa se prične hitro nabirati na področju nastajajočega ZMS, medtem ko v izvensinaptičnih predelih njena koncentracija pade (2, 22, 23). Večino AChE v ZMS prispeva mišična celica, možno pa je, da del le-te prispeva tudi motorični ži-
vec (24). Lokalizacija in sinteza AChE v mišični cevčici je omejena na področje jedra, v katerih se prepisuje AChE mRNA (25). Ekspresija in sinteza sinaptičnih komponent med sinaptogenezo in po njej sta v veliki meri pod nadzorom dejavnikov, ki jih izloča motorični živec, ni pa še raziskano, do katere oddaljenosti od ZMS sega ta regulacija.
Za nastanek funkcionalnih sinaps je po vsej verjetnosti zelo pomembno tudi sodelovanje drugih celic, zlasti celic glije. Njihova vloga je v usmerjanju motoričnih nevronov do cilja, preskrbovanju z ustreznimi prežive-tvenimi dejavniki ter zagotavljanju ustrezne strukturne podpore (26). Mielinizirajoče celice imajo pomembno vlogo pri vzpostavitvi @MS. Mielinizacija aksonov pospeši fosforila-cijo živčnih filamentov, kar je pomembno za diferenciacijo in migracijo motoričnih živcev (27). Schwannove celice, ki so odgovorne za mielanizacijo aksonov v perifernem živčnem sistemu, pospešujejo zorenje na novo nastalih @MS-ov (28) in s tem omogočijo normalen živčno-mišični prenos (29). Tako Schwannove celice kot tudi astrociti v centralnem živčnem sistemu izločajo razne rastne in preživetvene dejavnike, ki so nujni za razvoj in preživetje motoričnih živcev (30), ravno tako pa je za njihovo preživetje nujno tudi to, da najdejo ustrezne tarčne celice (31, 32).
Morfometrične značilnosti razporeditve jeder in njihov vpliv na beljakovinsko sintezo
ZMS sicer predstavlja najbolj raziskan model sinapse, vendar ga od drugih sinaps loči nekaj morfoloških posebnosti. Le v ZMS se namreč tvorijo skupki jeder pod posinaptič-no membrano. Po eni od zadnjih ocen naj bi koncentracija jeder v sinaptičnem področju presegala koncentracijo jeder izvensinaptič-nega področja za faktor 17 (33), vendar je verjetno to število v resnici še večje. Jedra v mišični cevčici niso zmožna mitotske delitve, zato je nastanek skupkov neizogibno povezan s premeščanjem obstoječih jeder znotraj mišične cevke (34). Število jeder, ki ga k skupku prispevajo Schwannove celice, še ni znano. Po nekaterih podatkih naj bi šlo za eno samo jedro (35). Število Schwannovih celic naj bi po drugih avtorjih bilo odvisno od starosti poskusne živali. Ko so preučevali m. soleus podgane,
so 7 dni po rojstvu našli eno do dve Schwan-novi celici na ZMS, po 28 dneh pa že tri ali štiri celice na ZMS (36).
Večjedrna zgradba mišičnega vlakna nudi dodatne načine regulacije beljakovinske ekspresije, saj različna razporeditev jeder, skupaj s kompartmentalizacijo citoplazme mišičnega vlakna, predstavlja področno variabilnost prisotnosti in preko drugih dejavnikov tudi ekspresije določenih genov (33). Tako se na primer različne podenote AChR ter AChE tvorijo le v sinaptičnem področju, ekspresije teh genov v ostalem delu mišice pa ni oziroma je zelo majhna. Z metodo in situ hibridizacije so prikazali, da so mRNA za AChE prisotne do oddaljenosti 10 |im od središča jedra (37). Koncept kompartmentalizacije so razširili v koncept jedrnih domen, kjer vsakemu jedru v skupku pripada določen del citoplazme in or-ganelov, ki sodelujejo v beljakovinski sintezi. Kljub višji koncentraciji jeder pa prisotnost za sinapso značilnih beljakovin samo v predelu sinapse ni posledica zgolj jedrne razporeditve, temveč tudi za sinaptična jedra značilne sinteze sinaptičnih beljakovin (2). Med dejavnike, ki bi lahko prispevali k ekspresiji teh genov v si-naptičnem predelu, štejejo nekatere molekule v sinaptični bazalni lamini ter krčenje same mišice (38).
Jedra pa niso edini celični organeli, katerih koncentracija se razlikuje v sinaptičnem in izvensinaptičnem področju. V poskusih, kjer so merili aktivnost mitohondrijskega encima sukcinatne dehidrogenaze v sinaptičnem in izvensinaptičnem področju skeletnega mišičnega vlakna, so odkrili 2- do 3- krat večjo aktivnost v sinaptičnem področju v primerjavi z izvensinaptičnim. Celotna aktivnost sukcinatne dehidrogenaze v ZMS je izvirala iz posinaptične regije ZMS. ATP, ki ga mito-hondriji v @MS proizvajajo, je verjetno potreben za obnavljanje mirovnega membranskega potenciala, ki je ves čas moten z majhnimi ZMS-potenciali iz motoričnega živca (39).
Morfološke in funkcionalne razlike med hitrimi in počasnimi mišičnimi vlakni
Izbrani mišici se med seboj razlikujeta po funkciji. M. extensor digitorum longus je predstavnik fazičnega tipa mišic, ki se skrči za
39
140
krajši čas, medtem ko m. soleus sodeluje pri zagotavljanju normalne stoje in je tonična mišica. To se odraža tudi pri prevladujočem tipu mišičnih vlaken, ki jih mišici vsebujeta, vendar sta obe mišici kljub temu še vedno sestavljeni iz mešanice počasnih in hitrih mišičnih vlaken. Pullen je v svoji raziskavi pri soleusu našel 76,3 % vlaken tipa 1 (počasna vlakna) in 23,7 % tipa2A (hitra vlakna). Pri m. extensordigitorum longus pa je našel 9,61 % vlaken tipa 1, 51,18 % tipa 2A in 39,34% tipa 2B (hitra vlakna) (40).
Na ravni enega mišičnega vlakna se morfološke razlike med hitrim in počasnim vlaknom pokažejo v dolžinski gostoti mišičnih jeder tako sinaptično kot izvensinaptično, z večjo gostoto pri počasnem vlaknu. Fiziološke razlike pa so raziskovali v in vivo študijah proženja akcijskih potencialov mišičnih enot, kjer so opazovali frekvenco proženja, delež časa, ko je mišično vlakno aktivno, ter modu-lacije mišične sile. Na osnovi prožitvenih vzorcev so vlakna razdelili v tri kategorije. Hitra vlakna so razdeljena v dve kategoriji (Ila, Ilb), ki sta aktivni 0,04-0,22 % in 1,6-5 % časa. Počasna vlakna (I) so aktivna 22-35 % časa. Frekvenca impulzov proženja za hitra vlakna je bila med 58 in 91 Hz, za počasna pa med 18 in 21 Hz, trajanje pa od 0,83 do 1,15 s v prvi kategoriji hitrih vlaken, od 59 do 141 s v drugi kategoriji hitrih vlaken in med 290 in 548 s pri počasnih vlaknih (41).
Hitrost krčenja mišičnega vlakna je odvisna od aktivnosti miozinske ATPaze, povezana pa je tudi s prisotnostjo različnih oblik kon-traktilnih beljakovin in encimov, ki vežejo kalcij znotraj sarkoplazemskega retikuluma. Razlike so biokemično dokazali pri težkih in lahkih verigah miozina, troponinih T, I in C, aktininih in beljakovini C.
Glede na izomero težke verige miozina delimo vlakna na 10 tipov, ki delno ustrezajo histokemični razdelitvi. Tako histokemično poznamo vlakna: I, super hitra ekstraokular-na, IIm, IIa, IIb, IIx(d) in IIc. Razdelitev po težki verigi miozina pa vključuje: srčna a, srčna P, IIeom, IIm, IIa, IIb, IIx(d), embrionalna, neonatalna/perinatalna in počasna tonična vlakna. Koncentracija mioglobina in encimov za aerobni metabolizem je v mišicah s prevladujočim počasnim tipom vlaken (rdeče mišice) višja kot v mišicah, kjer prevladujejo hitra vlakna (bele mišice).
V diferenciranem vlaknu lahko s spremembo vzorca aktivacije, ki prihaja po motoričnem živcu, spremenimo tudi nabor kontraktilnih beljakovin in metaboličnih encimov in s tem tip vlakna. Presenetljivo je bilo odkritje, da do začetne diferenciacije ne pride na ta način in da ni odvisna od oživčenja, temveč je vzorec na ne povsem razumljen način zapisan v sami mišici. Menijo, da sta ena ključnih dejavnikov položaj vlakna v mišici in čas nastanka vlakna (42).
Namen dela
Namen naše naloge je bil ugotoviti, ali morfološke in funkcionalne razlike med hitrimi in počasnimi skeletnimi mišičnimi vlakni odsevajo tudi na ravni razporeditve mišičnih jeder v sinaptičnem področju. Ker razporeditev jeder v mišičnem sinciciju določa prav tako razporeditev genov, pa tudi nekaterih organelov (grobi endoplazemski retikulum, mitohon-driji, Golgijev aparat), ki so v mišičnem sinciciju pridruženi mišičnim jedrom, gre pri tem za potencialno pomemben način uravnavanja beljakovinske ekspresije in energijske preskrbe. Po naših podatkih morfometrična analiza razporeditev jeder v ZM-področjih različnih tipov skeletnih mišičnih vlaken še ni bila opravljena. V okviru naše naloge bomo preizkusili naslednje hipoteze:
1.	Število mišičnih jeder v sinaptičnem skupku je v počasnem skeletnem mišičnem vlaknu značilno večje kot v hitrem vlaknu.
Utemeljitev: Počasno skeletno mišično vlakno je aktivno okrog 30% svojega časa, medtem ko je ta odstotek pri hitrem skeletnem mišičnem vlaknu manjši od 1. Oba tipa vlaken se razlikujeta tudi po vzorcu frekvenc akcijskih potencialov, ki jih prevajata. Večja aktivnost prenašanja AP v sinaptičnem področju zahteva večjo preskrbo z energijo in nemara tudi živahnejšo beljakovinsko sintezo, za to pa bi lahko poskrbelo večje število jeder in njim pridruženih mitohondrijev.
2.	Število Schwannovih celic v področju živč-no-mišičnega stika, ki ga lahko ugotovimo tako, da preštejemo njihova jedra, je premo-sorazmerno s površino živčno-mišičnega stika.
Utemeljitev: Obstaja vrsta podatkov, ki kažejo, da Schwannove celice aktivno sodelujejo pri razvoju in vzdrževanju sinaptičnih struk-
tur v ŽMS. Ob predpostavki, da je področje, ki ga oskrbuje ena Schwannova celica, omejeno, bi pričakovali, da bo število Schwannovih celic v sinaptičnem področju sorazmerno s površino tega področja. Ker v ŽMS površina posinaptične membrane ustreza površini predsinaptične, bi ob predpostavki, da vsaka Schwannova celica pokriva enak delež živčnega končiča, število Schwannovih celic moralo biti premosorazmerno s površino ŽMS.
3. Maksimalna razdalja, do katere znotraj mišičnega vlakna se sežejo vplivi živčnih trofičnih dejavnikov, je v hitrih in počasnih skeletnih mišičnih vlaknih enaka.
Utemeljitev: Živčni trofični dejavniki, kot so agrin ali ARIA, delujejo na skeletno mišično vlakno prek svojih receptorjev: receptor za agrin je MuSK, za ARIA pa podskupine recep-torja ErbB. Oba receptorja sodita v družino tirozinskih kinaz. Za zdaj ni podatka o razdalji, do katere v sinaptičnem področju skeletnih mišičnih vlaken seže vpliv fosforiliranih produktov, ki nastanejo po vzdraženju omenjenih tirozinskokinaznih receptorjev. Ker, kot je do sedaj znano, oba mehanizma delujeta na enak način tako v hitrem kot tudi v počasnem skeletnem mišičnem vlaknu, ni razlogov, da bi bilo območje delovanja teh dejavnikov v različnih tipih vlaken različno.
METODE Izolacija mišic
Programska skupina Medicinske fakultete »Molekularna nevrobiologija« v okviru katere je bila izdelana ta naloga, ima dovoljenje za delo s poskusnimi živalmi, ki ga je izdala Veterinarska uprava Republike Slovenije (Dovoljenje št. 323-02-74/00). Vsi poskusi so bili izvedeni v skladu z določili tega dovoljenja.
Odrasle samičke podgan vrste Wistar smo žrtvovali z dovajanjem ogljikovega dioksida v škatlo z živaljo. Nato smo izrezali mišici m. extensor digitorum longus ter soleus iz vsake zadnje tačke.
Fiksacija mišic
Izolirane mišice smo razpeli na silikatnem dnu posebej pripravljenih petrijevk in jih fiksirali s 4 % paraformaldehidom v fosfatnem pufru
(30 minut). Fiksativ smo odstranili z dvakratnim spiranjem (po 15 minut) z istim pufrom.
Barvanje živčno-mišičnega stika in razrez mišic
ŽMS smo v izoliranih mišicah prikazali s hi-stokemičnim barvanjem AChE s tioholinsko metodo (43) pri sobni temperaturi. Mišice v petrijevki smo prelili z raztopino po Koel-leju (50 nM CuSO4, 20 mM glicin, 4,8 mM KCN v fosfatnem pufru; pH = 7,0), ki smo ji dodali acetiltioholin (1 mg/ml). Pod ste-reoskopsko lupo smo opazovali nastajanje histokemičnega produkta v področju z motoričnimi ploščicami. Ko so se ti predeli obarvali (okrog 5 minut), smo mišice sprali s fosfatnim pufrom. Pod stereoskopsko lupo smo izrezali področja mišic, ki so vsebovala ŽMS.
Barvanje s fluorescentnimi barvili
Skupke AChR v izrezanih koščkih mišic smo 30 minut barvali z a-bungarotoksinom, označenim s flourescentnim barvilom rodaminom (Molecular Probes, Oregon, ZDA) v koncentraciji 1 |j,g/ml. Koščke smo nato 2-krat sprali s fosfatnim pufrom, nakar je sledilo 30-mi-nutno barvanje z barvilom »SYTOX zeleno« (Molecular Probes, Oregon, ZDA) v 0,5 |J.M koncentraciji. Barvilo smo odstranili s ponovnim 2-kratnim spiranjem v fosfatnem pufru.
Izolacija posamičnih vlaken in njihov prenos na polilizinska objektna stekla
Pod stereoskopsko lupo smo z drobnimi pin-cetami izolirali posamezna vlakna iz prej omenjenih koščkov mišic ter jih položili na objektno stekelce. Vlakna smo vklopili v 70% glicerol in jih prekrili s krovnim stekelcem.
Ogled preparata in zajem slike
Za ogled preparata in zajem slike smo uporabili laserski konfokalni mikroskop proizvajalca Zeiss; tip Axiovert 100M, ki je povezan z osebnim računalnikom in ustreznim programom Zeiss LSM 510. Slike smo shranjevali v obliki računalniških datotek.
141
142
Analiza slike
Slike smo analizirali s pomočjo programa Zeiss LSM 510, in sicer tako, da smo najprej izdelali tridimenzionalno sliko mišičnega vlakna, nato pa uporabili orodja za merjenje dolžin in ploščin, ki jih ta program vsebuje. S temi orodji smo izmerili dimenzije jeder, ZMS ter oddaljenosti jeder od ZMS. Za površino ZMS smo izmerili ploščino z a-bungarotoksinom obarvanega dela vlakna, število jeder nad ZMS je predstavljalo število Schwannovih celic, jedra pod @MS oziroma v vlaknu pa smo šteli za sinaptična mišična jedra. Na osnovi izkušenj drugih avtorjev (44, 45) in na osnovi prejšnjih raziskav (33, 46) smo hitra in počasna mišična vlakna ločevali po gostoti izvensinaptičnih jeder.
REZULTATI
Razporeditev mišičnih jeder v izven-sinaptičnih področjih in v sinaptičnih skupkih hitrega in počasnga skeletnega mišičnega vlakna
Z morfometrično analizo smo ugotovili, da je število mišičnih jeder v sinaptičnem skupku
počasnega skeletnega mišičnega vlakna za faktor 1,6 večje kot v sinaptičnem skupku hitrega skeletnega mišičnega vlakna. Za enak faktor je bila večja površina @MS v počasnem vlaknu. Obe razliki sta statistično pomembni (tabela 1). Upoštevaje srednje vrednosti meritev smo ugotovili, da je razmerje med površino ZMS in številom sinaptičnih mišičnih jeder (površina ZMS, ki pripada enemu sinaptične-mu mišičnemu jedru) za počasno in hitro vlakno približno enako (tabela 1).
Gostota jeder v izvensinaptičnem področju, izražena kot število jeder v enoti volumna tega področja, je bila v počasnem vlaknu 2,6-krat večja kot v hitrem vlaknu. Povprečni volumen jedrne domene v izvensinaptičnem področju vlakna, ki je obraten gostoti jeder v tem področju vlakna, je večji v hitrem vlaknu kot v počasnem. Razlika je statistično pomembna. Pri obeh tipih vlaken je bila gostota jeder večja v sinaptičnem kot v izvensinaptičnem področju. Tako se pri obeh tipih vlaken statistično pomembno razlikujeta tudi povprečna volumna domen sinaptičnega in izvensinaptičnega jedra (tabela 2).
Tabela 1. Število sinaptičnih mišičnih jeder, površina živčno-mišičnega stika ter razmerje med površino @MS in številom sinaptičnih mišičnih jeder v hitrih in počasnih vlaknih. p - statistična vrednost p po Studentovem t-testu za primerjavo dveh neodvisnih vzorcev, n=20 pri vseh srednjih vrednostih.
Tip vlakna	Število sinaptičnih	Površina ZMS	Razmerje površina
mišičnih jeder ±S.O.	(|m2±S.O.)	živčno-mišičnega stika
(|m2/število jeder ±S.O.)
hitro	4,60±0,75	680±190	150±44
počasno	7,15 ± 2,37	1060±446	155±65
p	0,000048	0,0012	0,818
Tabela 2. Volumni mišičnih jedrnih domen v @MS skupku in izven njega v hitrem in počasnem skeletnem mišičnem vlaknu ter njihovo razmerje. p - statistična vrednost p po Studentovem T-testu za primerjavo dveh neodvisnih vzorcev, n=20 za vse srednje vrednosti.
Tip vlakna	Volumen jedrne domene v skupku živčno-mišičnega stika (|m3) ±S.O.	Volumen jedrne domene izven skupka živčno-mišičnega stika (|m3) ±S.O.	Razmerje jedrnih domen v skupku in: izven skupka živčno-mišičnega stika ±S.O.
hitro	632 ± 180	20583±5781	34,5 ±11,6
počasno	508 ±258	8055 ±1782	20,9 ± 15,4
p	0,087	manj kot 0,000001	0,003
Razporejenost jeder Schwannovih celic v sinaptičnih skupkih hitrega in počasnega skeletnega mišičnega vlakna
Srednja vrednost števila jeder Schwannovih celic se od srednje vrednosti števila sinapticnih mišičnih jeder v povprečju razlikuje za 0,2 pri hitrih vlaknih in za 0,1 pri počasnih. S Pearsonovim korelacijskim testom smo za ti dve vrednosti dobili tudi srednje visoke korekcijske koeficiente tako pri počasnih (70 %) kot pri hitrih (47 %) vlaknih. Kljub enakemu razmerju povprečnih vrednosti med številom sinaptičnih mišičnih jeder in površino ZMS v hitrih in počasnih vlaknih so korelacijski količniki med površino ZMS in številom sinaptičnih mišičnih jeder ter ZMS in številom Schwannovih celic nižji (tabela 3).
Območje delovanja živčnih trofičnih dejavnikov
Oddaljenost od roba @MS do prvega jedra, ki po morfometričnih merilih ustreza definiciji izvensinaptičnega jedra, je bila tako v hitrem kot v počasnem vlaknu skoraj enaka. Pri hitrih vlaknih je znašala ta razdalja 25,5 ± 9,3 |im, pri počasnih pa 26,9 ± 7,4 |im. Po Studentovem t-te-stu se ti srednji vrednosti nista statistično pomembno razlikovali (p = 0,60, n = 20).
RAZPRAVLJANJE
Konfokalno mikroskopiranje ŽMS v hitrem in počasnem skeletnem mišičnem vlaknu
Po izkušnjah, ki smo si jih pridobili pri izdelavi te naloge, čas za zajem slike s konfokalnim
mikroskopom ne sme presegati 3 dni od izdelave preparata. Tretji dan je namreč difuzija barvila, s katerim smo barvali ZMS, že dosegla take razsežnosti, da je bilo težko določiti mesto ZMS na osnovi intenzivnejšega rdečega obarvanja. Razlik v obarvanju med @MS, mišičnim vlaknom in celo ozadjem preparata neredko ni bilo mogoče izboljšati niti s prilagajanjem osvetlitve in kontrasta v programu za zajem slik na konfokalnem mikroskopu. Nasprotno pa z barvilom »SYTOX zeleno«, ki obarva jedra, nismo imeli takih težav.
Emisijska spektra obeh fluorescentnih barvil, »SYTOXa zeleno« in rodamina, se pri nekaterih valovnih dolžinah prekrivata, s čimer lahko razložimo občasno rdeče obarvanje jeder, ki je bilo pridruženo rdečemu obarvanju ZMS ter zelenemu obarvanju jeder. Težavi smo se uspeli delno izogniti s posamičnim vzbujanjem posameznega barvila, kar je uporabljeni konfokalni mikroskop omogočal. Pri zajemu slike je namreč izmenično osvetljeval isto točko preparata s svetlobo enega laserja in ne obeh hkrati, kar je omogočilo večje ločevanje med slikama, ki sta nastali s fluorescenčnimi signali iz obeh barvil.
Razporeditev mišičnih jeder v sinaptičnih skupkih in v izvensinaptičnih področjih hitrega in počasnga skeletnega mišičnega vlakna
Naša predpostavka, da se hitro in počasno skeletno mišično vlakno razlikujeta po številu in razporeditvi mišičnih jeder, se je izkazala kot pravilna. Iz dobljenih podatkov je mogoče oceniti, da je v hitrem skeletnem mišičnem vlaknu gostota jeder v @MS 34,5-krat večja kot v preostali citoplazmi hitrega mišičnega vlakna.
143
Tabela 3. Korelacijski količniki, izračunani s Pearsonovim testom, med nekaterimi vrednostmi meritev v hitrih in počasnih vlaknih. KKI - korelacijski količnik med številom sinaptičnih mišičnih jeder in številom jeder Schwannovih celic; KK2 - korelacijski količnik med številom jeder Schwannovih celic in površino živčno-mišičnega stika; KK3 - korelacijski količnik med številom sinaptičnih mišč-nih jeder in površino živčno-mišičnega stika. n=20 za vse srednje vrednosti, p<0,05.
Tip vlakna	Število sinaptičnih	Število jeder	Površina	KKI	KK2	KK3
	mišičnih	Schwannovih	živčno-mišičnega			
	jeder ± S.O.	celic ±S.O.	stika (|m2) ±S.O.			
hitro	4,60 ±0,75	4,80 ±1,24	680 ± 190	0,47	0,40	0,33
počasno	7,15 ± 2,37	7,25 ±2,15	1060 ± 446	0,70	0,07	0,16
Pri počasnem skeletnem mišičnem vlaknu je ta razlika manjša (20,9-krat večja gostota v ŽMS kot v izvensinaptičnem delu počasnega vlakna), in to na račun večje jedrne gostote v izvensinaptičnem področju pri teh vlaknih. S pomočjo rezultatov naših meritev je možno oceniti, da je povprečni volumen izvensi-naptične jedrne domene v počasnem vlaknu 8055 |im3, v hitrem pa kar 20583 |j,m3, kar pomeni, da se ta dva volumna med seboj razlikujeta za 155 %. Volumen domene sinap-tičnega jedra pa je po naših izračunih pri počasnem vlaknu manjši od volumna sinap-tične domene pri hitrem, in sicer za okrog 24 %.
Gostota jeder v sinaptičnem skupku, ki smo jo izmerili v hitrem skeletnem mišičnem vlaknu, izoliranem iz m. extensor digitorum lon-gus, je okrog dvakrat večja od gostote, ki je bila za sinaptični jedrni skupek v hitrem vlaknu m. sternomastoideus ugotovljena v eni od prejšnjih študij v našem laboratoriju (33). Za to razliko obstajata bržkone dva pomembna razloga. Za razliko od pričujoče raziskave, kjer smo uporabili konfokalno mikroskopijo, je bila v omenjeni raziskavi uporabljena navadna fluorescenčna mikroskopija, ki ni dopuščala na-144 tančne določitve volumna jedrnega skupka. Ta volumen je bil zato le grobo ocenjen, in to ob predpostavki, da so sinaptična jedra pod ŽMS razporejena v prostoru, ki ima obliko prisekanega stožca. V naši raziskavi smo s pomočjo tridimenzionalne računalniške rekonstrukcije zajete mikroskopske slike ugotovili, da se sinaptična jedra pod posinaptično površino ŽMS nahajajo v tanki plasti tik pod posinap-tično membrano ŽMS, ki je debela zgolj za eno debelino jedra, kar znaša 4,26 |im v hitrem in 3,25 |im v počasnem vlaknu. Na ta način je izračunani volumen prostora skupka bistveno manjši, na ta račun pa smo ugotovili tudi večjo gostoto jeder v sinaptičnem skupku.
Naši rezultati kažejo, da je citoplazme v subsinaptičnem prostoru, kjer se nahajajo mišični jedrni skupki, zelo malo, zaradi česar bi lahko pričakovali zelo visoko koncentracijo genskih produktov teh jeder, vključno s pridruženimi organeli, kot so grobi endopla-zemski retikulum, mitohondriji in Golgijev aparat. Tako stanje nedvomno vodi k večji tvorbi energije na volumsko enoto v tem področju. Da bi ugotovili, kakšne so ostale posledice takega stanja, bodo potrebne še dodatne raziskave.
Razporejenost jeder Schwannovih celic v sinaptičnih skupkih hitrega in počasnega skeletnega mišičnega vlakna
Za razliko od prejšnje študije (33), kjer metodološki pristop ni omogočal natančne določitve števila jeder Schwannovih celic v sinaptičnem skupku, smo s pomočjo konfokalne mikroskopije, ki je omogočala določitev lege jeder glede na posinaptično membrano ŽMS, lahko ugotovili, katera od njih pripadajo skeletnemu mišičnemu vlaknu in katera Schwannovim celicam.
Zanimiva ugotovitev naših raziskav je ujemanje števila jeder Schwannovih celic s številom mišičnih jeder v sinaptičnem skupku, ki smo jo ugotovili tako v hitrem kot tudi počasnem skeletnem mišičnem vlaknu. Ta ugotovitev govori v prid razmišljanju, da tako kot v področju ŽMS v skeletnem mišičnem vlaknu skrbijo za določena področja posi-naptične membrane posamezna sinaptična mišična jedra, tudi posamezne Schwannove celice »oskrbujejo« podobno velika področja predsinaptičnega dela ŽMS. Tako razmišljanje pa postavljajo pod vprašaj relativno nizki korelacijski koeficienti, ki smo jih izračunali za razmerje med površino ŽMS in številom jeder Schwannovih celic, in ki so bili nižji v počasnem v primerjavi s hitrim skeletnim mišičnim vlaknom. Za dokončni odgovor bodo tako potrebni še dodatni eksperimenti.
Naše raziskave kažejo, da gre v zvezi z vlogo posameznih jeder oziroma celic za tri spremenljivke: površina ploščice ter število nad- in podsinaptičnih jeder, ki vplivajo druga na drugo. Površinsko večji ŽMS ima proporcionalno več nad- in podsinaptičnih jeder. Tu se postavlja vprašanje, katera od treh spremenljivk vpliva na drugi dve. Predlagamo naslednjo razlago. Trofični dejavniki, ki se sproščajo iz živčnega končiča in nemara tudi Schwannovih celic, vplivajo na število podsinaptičnih jeder, ta pa zaradi svojega večjega števila lahko sintetizirajo in nadzorujejo površinsko večjo ploščico.
Že v uvodu smo omenili dve raziskavi, ki sta dali različne odgovore glede števila Schwannovih celic v ŽMS. Naši rezultati so pokazali, da je v povprečju nadsinaptičnih jeder 4,8 (hitra vlakna) oziroma 7,25 (počasna vlakna). Uporabljena metoda nam ni omogočila,
da bi posebej lahko ugotovili število satelitnih celic v vlaknu in njim pripadajočih jeder. Verjetnost, da bi v naše analize zajeli tudi sa-telitne celice, pa je relativno majhna, saj le-te predstavljajo le majhen odstotek v primerjavi z ostalimi jedri. Obstajajo podatki, da pripada v hitrih mišicah 2,8 %, v počasnih pa 8 % vseh jeder satelitnim celicam (47).
Območje delovanja živčnih trofičnih dejavnikov
Trofični dejavniki, ki se izločajo iz predsinap-tičnih končičev, povzročajo, kot smo zapisali v uvodu, koncentriranje sinaptičnih molekul v ŽMS (AChE, AChR in druge) in, vsaj v nekaterih primerih, njihovo pospešeno transkripcijo v sinaptičnih jedrih. Mišična jedra, na katera prek še ne natančno poznanih poti delujejo ti trofični dejavniki, se morfološko razlikujejo od izvensinaptičnih mišičnih jeder, vendar ni znano, kaj je vzrok te morfološke preobrazbe. Naši rezultati se ujemanjo s sedanjo predstavo o delovanju živčnih trofičnih dejavnikov, po kateri se mehanizmi delovanja teh dejavnikov ne razlikujejo glede na tip mišičnega vlakna (4, 5). Naši rezultati torej kažejo, da so razmere za difuzijo ali kak drugačen način transporta prenašalcev vplivov trofičnih dejavnikov v obeh tipih vlaken podobne.
Gledano v celoti naše raziskave govorijo v prid razmišljanju, da je razporejanje jeder v področju ŽMS eden od mehanizmov, ki določajo nastanek, vzdrževanje in delovanje te strukture. V tem pogledu ŽMS ni model za ostale sinapse v organizmu, saj pri njih posi-naptične celice nimajo več jeder, ampak samo eno.
2.	Korelacija med sinaptično površino ŽMS in številom jeder, ki pripadajo Schwanno-vim celicam, je bila v hitrem vlaknu višja (KK 0,4) kot v počasnem (KK 0,07), a še vedno prenizka za potrditev naše druge hipoteze, po kateri naj bi bilo število jeder Schwannovih celic v področju ŽMS premo-sorazmerno s površino ŽMS. Po drugi strani pa je v povprečju število jeder Schwannovih celic v področju ŽMS praktično enako številu mišičnih jeder v tem področju, in to pri obeh tipih vlaken. Tudi povprečne vrednosti površin, izraženih bodisi na eno jedro Schwannovih celic ali pa na eno jedro sinaptičnega skupka mišičnega vlakna, so skoraj identične, kar kaže, da določene korelacije med številom jeder v sinaptičnem skupku in površino ŽMS vendarle obstajajo.
3.	Maksimalna razdalja, na kateri še delujejo živčni trofični dejavniki in ki smo jo ocenili z merjenjem razdalje med robom ŽMS in prvim zunajsinaptičnim jedrom, znaša za hitra skeletna mišična vlakna 25,5 ±9,3 |im (n=20), za počasna pa 26,9 ± 7,4 |im (n=20). Med obema razdaljama ni statistično značilnih razlik (Studentov t-test), kar govori v prid naše tretje hipoteze, ki pravi, da se maksimalna razdalja, na kateri še delujejo živčni trofični dejavniki, ne razlikuje glede na tip skeletnega mišičnega vlakna.
Razporejanje jeder v področju ŽMS je eden od mehanizmov, ki določajo nastanek, vzdrževanje in delovanje te strukture, v čemer se ŽMS razlikuje od ostalih sinaps v organizmu, saj pri njih posinaptične celice nimajo več jeder, ampak samo eno.
145
ZAKLJUČKI
1. Ugotovili smo, da je v sinaptičnem jedrnem skupku odraslega počasnega skeletnega mišičnega vlakna 7,15 ±2,37 (n = 20) jeder. V sinaptičnem jedrnem skupku hitrega vlakna je 4,60±0,75 (n=20) jeder. Ta razlika je statistično značilna (neparni Studentov t-test), kar potrjuje našo prvo hipotezo, ki pravi, da je število mišičnih jeder v sinap-tičnem skupku v počasnem skeletnem mišičnem vlaknu značilno večje kot v hitrem vlaknu.
ZAHVALA
Zahvaljujem se svojemu mentorju, prof. dr. Zoranu Grubiču, za dragocene nasvete, konstruktivne pogovore, pozorno in kritično branje tega dela.
Zahvala velja tudi somentorju, doc. dr. Marjanu Rupniku, za pomoč pri delu v kon-fokalni mikroskopiji ter za spodbudo.
Zahvaljujem se vsem iz laboratorija za pomoč, posebej pa mag. Tomažu Maršu in Zvonki Frelih za uvajanje v laboratorijsko delo.
LITERATURA
1.	Kandel ER, Siegelbaum SA. Overview of synaptic transmision. In: Kandel ER, Schwartz JH, Jessel TM, eds. Principles of neuronal science. New York: Mc Graw-Hill; 2000. p. 188.
2.	McMahan UJ, Sanes JR, Marshall LM. Cholinesterase is associated with the basal lamina at the neuromuscular junction. Nature 1978; 271:172-4.
3.	Hall ZW, Sanes JR. Synaptic structure and development: The neuromuscular junction. Cell 1993; 72 (Suppl Neuron 10): 99-121.
4.	Burden S. The formation of neuromuscular junction. Genes Dev 1998; 12:133-48.
5.	Sanes JR, Lichtman JW. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci 1999; 22:389-442.
6.	Engel AG. The Neuromuscular Junction. In: Engel AG, Franzini-Armstrong C, eds. Myology. New York: McGraw Hill; 1994. pp. 261-302.
7.	Hall ZW. Laminin beta-2 (S-laminin): A new player at the synapse. Science 1995; 269: 362-3.
8.	Carbonetto S, Lindenbaum M. The basement membrane at the neuromuscular junction: a synaptic mediatrix. Curr Opin Neurobiol 1995; 5: 596-605.
9.	Barres B in sod. Membrane Transport. In: Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD, eds. Mol Biol Cell. New York: Garland Publishing; 1994. pp. 721-4.
10.	Hauschka SD. The embryonic origin of muscle. In: Engel AG, Franzini-Armstrong C, eds. Myology. New York: McGraw Hill; 1994. pp. 3-73.
11.	Ashby PR, Wilson SJ, Harris AJ. Formation of primary and secondary myotubes in aneural muscles in the mouse mutant peroneal muscular atrophy. Dev Biol 1993; 156: 519-28.
12.	Son YJ, Thompson WJ. Nerve sprouting in muscle is induced and guided by processes extented by Schwann cells. Neuron 1995; 14:133-41.
13.	Grinnell AD. Trophic interaction between nerve and muscle. In: Engel AG, Franzini-Armstrong C, eds. Myo-logy. New York: McGraw Hill; 1994. pp. 359-91.
14.	Wells DG, Fallon JR. Neuromuscular junctions: The state of the union. Curr Biol 1996; 6:1073-5.
15.	Ruegg M, Bixby JL. Agrin orchestrates synaptic differentiation at the vertebrate neuromuscular junction. Trends Neurosci 1998; 21: 22-7.
16.	Apel ED, Merlie JP. Assembly of postsynaptic apparatus. Curr Opin Neurobiol 1995; 5: 62-7.
146 17. Lindstrom J. Acetylcholinreceptor: structure, function, synthesis, destruction, and antigenecity. In: Engel AG, Franzini-Armstrong C, eds. Myology. New York: McGraw Hill; 1994. pp. 585-606.
18.	McMahan UJ. The agrin hypothesis. Cold Spring Harb Symp Quant Biol1990; 55: 407-18.
19.	Deyst KA, Jianyi M, Fallon JR. Agrin: Toward a molecular understanding of synapse regeneration. Neurosurgery 1995; 37:71-7.
20.	Reist NE, Werle MJ, McMahan UJ. Agrin released by motor neurons induces the aggregation of acetylcholine receptors at neuromuscular junction. Neuron 1992; 8: 865-8.
21.	Cohen I, Rimer M, Lomo T, McMahan UJ. Agrin-induced postsynaptic-like apparatus in skeletal muscle fibers in vivo. Mol Cell Neurosci 1997; 9: 237-53.
22.	Massoulié J, Pezzementi L, Bon S, Krejci E, Vallette FM. Molecular and cellular biology of cholinesterase. Prog Neurobiol 1993; 41: 31-91.
23.	Grubic Z, Miranda MF. Developmental expression of acetylcholinesterase in skeletal muscle. In: Quinn DM, ed. Enzymes of the cholinesterase family. New York: Plenum Press; 1995. pp. 37-43.
24.	Anglister L. Acetylcholinesterase from the motor nerve terminal accumulates on the synaptic basal lamina of the myofiber. J Cell Biol 1991; 115:755-64.
25.	Rossi SG, Rotundo RL. Cell surface acetylcholinesterase molecules on multinucleated myotubes are clustered over the nucleus of origin. J Cell Biol 1992; 119: 1657-67.
26.	DeLapeyriere O, Handerson CE. Motorneuron differentiation, survival and synaptogenesis. Curr Opin Genet Dev 1997; 7: 642-50.
27.	Starr R, Attema B, De Vries GH, Monteiro MJ. Neurofilament phosphorylation is modulated by myelination. J Neurosci Res 1996, 44: 328-37.
28.	Chapron J, De La Porte S, Delepine L, Koenig J. Schwann cells modify expression of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase at rat neuromuscular junctions. Eur J Neurosci 1997; 9: 260-70.
29.	Koenig J, De La Porte S, Chapron J. The Schwann cell at the neuromuscular junction.JPhsiolParis 1998; 92: 153-5.
30.	Junger H, Varon S. Neurotrophin-4 (NT-4) and glial cell line-derivated neurotrophic factor (GDNF) promote the survival of corticospinal motor neurons of neonatal rats in vitro. Brain Res 1997; 762: 56-60.
31.	Wetts R, Vaughn JE. Differences in developmental cell death between somatic and autonomic motor neurons of rat spinal cord. J Comp Neurol 1998; 396:438-92.
32.	Riethmacher D, Sonnenberg-Rietmacher E, Brinkmann V, Yamaai T, Lewin GR, Birchmeier C. Severe neuropathies in mice with targeted mutations in the ErbB3 receptor. Nature 1997; 389: 725-30.
33.	Milanič T, Kunstelj A, Marš T, Grubič Z. Morphometric characteristics of myonuclear distribution in the normal and denervated fast rat muscle fiber. Chem-Biol Interact 1999; 119-120: 321-6.
34.	Bruner JM, Bursztajn S. Acetylcholine receptor clusters are associated with nuclei in rat myotubes. Dev Biol 1986; 115: 35-43.
35.	Fidzianska M. Development of the human neuromuscular junction. J Neuropath Exp Neurol 1980; 39: 606-15.
36.	Hirata K, Zhou C, Nakamura K, Kawabuchi M. Postnatal development of Schwann cells at neuromuscular junctions, with special reference to synapse elimination. J Neurocytol 1997; 26: 799-809.
37.	Tsim KWK, Greenberg I, Rimer M, Randall WR. Transcripts for the acetylcholine receptor and acetylcholinesterase show distribution differences in cultured chick muscle cells. J Cell Biol 1992; 118:1201-12.
38.	Brosamle C, Kuffler DP. Rapid dispersal of clustered postsynaptic nuclei following dissociation of skeletal musl-ce fibers. J Exp Biol 1996; 199: 2359-67.
39.	Jasmin BJ, Campbell RJ, Michel RN. Nerve dependent regulation of succinate dehydrogenase in junctional and extrajunctional compartments of rat muscle fibres. J Physiol 1995; 481.1:155-64.
40.	Pullen AH. The distribution and relative sizes of fibre types in the extensor digitorum longus and soleus musc-lesof the adult rat. J Anat 1977; 123:467-86.
41.	Hennig R, Lomo T. Firing patterns of motor units in normal rats. Nature 1985; 314:164-6.
42.	Engel AG. The diversity od muscle fiber types and its origin during development. In: Engel AG, Franzini-Armstrong C, eds. Myology. New York: McGraw Hill; 1994. pp. 119-33.
43.	Koelle GB, Friedenwald JS. A histochemical method for localizing cholinesterase activity. Proc Soc Exp Biol 1949; 70:617-22.
44.	Atherton GW, James NT. Stereological analysis of the number of nuclei in the skeletal muscle fibers. Acta Anat 1980; 337: 570-3.
45.	Allen DL, Monke SR, Talmadge RJ, Roy RR, Edgerton VR: Plasticity of myonuclear number in hypertophied and atrophied mammalian skeletal muscle fibers. J Physiol 1995; 95:1969-75.
46.	Batista T. Razporeditev jeder v področju motorične ploščice pri hitri in počasni skeletni mišici podgane. [diplomska naloga]. Ljubljana: Biotehniška fakulteta, oddelek za biologijo; 1997.
47.	Viguie CA, Lu DX, Huang SK, Rengen H, Carlson BM. Quantitative study of the effects of long-term denervation on the extensor digitorum longus muscle of rat. Anat Rec 1997; 248: 346-54.
48.	Askans V, Engel WK, Alvarez RB. Fourteen newly recognized proteins at the human neuromuscular junctions-and their nonjunctional accumulation in inclusion body myositis. Ann NY Acad Sci 1998; 841: 28-56.
49.	Burden S. Synapse-specific gene expression. Trends Genet 1993; 9:12-6.
50.	Jasmin BJ, Lee RK, Rotundo RL. Compartmentalization of acetylcholinesterase mRNA and enzyme at the vertebrate neuromuscular junction. Neuron 1993; 11: 467-77.
51.	Jevšek M. Izvor acetilholinesteraze v živčno-mišičnem stiku sesalca [diplomsko delo]. Ljubljana: Biotehniška fakulteta, oddelek za biologijo; 2000.
52.	Marš T. Človeška mišica oživčena in vitro - model za študij sinaptogeneze živčno-mišičnega stika. [magistersko delo]. Ljubljana: Medicinska fakulteta; 1999.
53.	Nguyen PV, Marin L, Atwood HL. Synaptic physiology and mitochondrial function in crayfish tonic and phasic motor neurons. J Neurophsyiol 1997; 78: 281-94.
54.	Brown GL, Dale HH, Feldberg W. Reactions of the normal mammalian muscle to acteylcholine and eserine. J Physiol 1936; 87:394-424.
Prispelo 7.2.2001