58 Zdrav Vestn | januar – februar 2018 | Letnik 87
Srce in ožilje
Zavod Republike Slovenije 
za transfuzijsko medicino, 
Ljubljana
Korespondenca/
Correspondence:
elvira Maličev, e: elvira.
malicev@ztm.si
Ključne besede:
krvotvorne matične 
celice; celice CD34+; 
celični pripravki; pretočna 
citometrija; CFU-test
Key words:
hematopoietic stem cells; 
CD34+ cells; cell products; 
flow cytometry; CFU assay
Prispelo: 7. 6. 2016 
Sprejeto: 3. 12. 2017
Opredelitev krvotvornih matičnih in 
predniških celic v pripravkih za presaditev
Characterisation of haematopoietic stem and progenitor cells  
in products intended for transplantation
Elvira Maličev, Metka Krašna
Izvleček
Avtologne in alogenske presaditve krvotvornih matičnih celic in predniških celic se izvajajo že 
vrsto let. Pripravki celic za presaditev so lahko različni, odvisni od vrste zdravljenja. Zbiranje, 
koncentriranje in shranjevanje matičnih celic se nadzoruje z laboratorijskimi kvantitativnimi 
in kvalitativnimi testi. Podatki o številu, živosti in funkcionalnosti matičnih celic ter čistosti pri-
pravka zagotavljajo varnost uporabe in prispevajo k napovedi uspešnosti presaditve. Krvotvor-
ne matične in predniške celice za rutinsko uporabo se identificirajo na podlagi molekule CD34, 
vendar je skoraj 50 let raziskovanja na tem področju razkrilo veliko heterogenost teh celic. To 
bi v prihodnosti omogočilo identificiranje, ločevanje in uporabo subpopulacij celic z različnim 
krvotvornim potencialom.
Abstract
Haematopoietic stem and progenitor cells have been successfully used for autologous and al-
logeneic transplantations for many years. Quantitative and qualitative laboratory assays allow 
controlling different cellular products during collection, concentration and preservation. The in-
formation about cell number, viability, functionality and purity of the graft ensure safe applica-
tion and help predict the likelihood of successful engraftment. Almost 50 years of research have 
disclosed the great heterogeneity of cells that exhibit a haematopoietic differentiation potential. 
This will enable the identification of subpopulations within the population of CD34-positive ha-
ematopoietic stem cells.
Citirajte kot/Cite as: Maličev e, Krašna M. opredelitev krvotvornih matičnih in predniških celic v pripravkih 
za presaditev. Zdrav Vestn. 2018;87(1–2):58–68.
DOI: 10.6016/ZdravVestn.1602
1. Uvod
S pojmom transfuzija označujemo 
predvsem uporabo pripravkov zrelih 
krvnih celic (izjema je krvna plazma), 
najpogosteje eritrocitov in trombocitov. 
Te celice le začasno nadomestijo krvne 
celice v krvnem obtoku, saj se ne pom-
nožujejo in imajo sorazmerno kratko ži-
vljenjsko dobo. Za razliko od transfuzije 
zrelih krvnih celic pa gre pri celičnem 
zdravljenju za vnos krvotvornih matič-
nih in predniških celic (KMC), ki naj bi 
poskrbele za trajno tvorbo zrelih celic. 
Matična celica je nediferencirana celica 
s sposobnostjo asimetrične delitve, pri 
čemer ena hčerinska celica ostane ne-
diferencirana, iz druge hčerinske celice 
opredelitev krvotvornih matičnih in predniških celic v pripravkih za presaditev 59
StroKoVni članeK
pa nastane linijsko usmerjena predniška 
celica, ki se med celičnimi delitvami di-
ferencira do zrele celice.
Tako kot pri pripravkih zrelih krv-
nih celic, je potrebno tudi pri pripravi 
KMC za presaditev postopke odvzema, 
koncentriranja, shranjevanja in prenosa 
čim bolj standardizirati, optimizirati in 
validirati v skladu z veljavno zakonodajo 
(Zakon o kakovosti in varnosti človeških 
tkiv in celic, namenjenih za zdravljenje), 
pri tem pa potrebujemo zanesljive labo-
ratorijske teste za opredelitev celičnega 
pripravka (1).
2. Krvotvorne matične 
in predniške celice v 
pripravkih za presaditev
Od presaditve prvih KMC, ki so jih 
pridobili iz kostnega mozga, je minilo 
že več kot pol stoletja. Od takrat se je ta 
postopek razširil za zdravljenje malig-
nih in nemalignih hematoloških bolez-
ni. Odvzem kostnega mozga je v večini 
primerov nadomestilo zbiranje KMC 
iz periferne krvi po stimulaciji bolnika 
ali darovalca s citokini (npr. G-CSF), ki 
pospešijo migracijo KMC iz kostnega 
mozga v periferno kri. KMC lahko po 
odvzemu na različne načine procesira-
mo: odstranimo jim eritrocite, limfocite 
T (pri alogenskih presaditvah), lahko jih 
zamrzujemo in odmrzujemo, spiramo, 
zmanjšamo volumen na količino, ki je 
primernejša za shranjevanje in presadi-
tev, lahko jih koncentriramo s postop-
kom imunskega ločevanja celic. Vsak od 
teh korakov lahko vpliva na kakovost 
končnega pripravka KMC, zato z različ-
nimi testi spremljamo spremembo števi-
la celic, njihovo živost in funkcionalnost. 
Te teste razdelimo v dve večji skupini: 
na fenotipske teste in funkcijske teste. S 
fenotipskimi testi analiziramo izražene 
lastnosti celic, najpogosteje so to priso-
tnost specifičnih proteinov na površini 
celic, t. i. celičnih označevalcev. Šele ko 
KMC identificiramo, jih lahko tudi preš-
tejemo. Funkcijski testi pa merijo biolo-
ške lastnosti celic, kot so zmožnost pom-
noževanja ali diferenciacije celic v zrele 
celice.
3. Fenotipske analize 
krvotvornih matičnih 
in predniških celic
Hematopoeza se prične z asimetrično 
delitvijo krvotvorne matične celice, ki jo 
spodbudijo različni okoljski dejavniki. 
Postopoma in preko različnih predni-
ških celic nastaja zrela krvna celica (2,3). 
Dozorevanje krvne celice se natančno 
kontrolira z izražanjem specifičnih ge-
nov in njihovih produktov, kar se zrcali 
na morfoloških in funkcionalnih spre-
membah celice. Novo nastali proteini 
lahko služijo kot receptorji za rastne de-
javnike, so adhezijske molekule, encimi 
ali signalne transdukcijske molekule, za 
številne molekule pa njihove vloge še ne 
poznamo. Nekateri od teh antigenov so 
značilni za določeno celično linijo, med-
tem ko se drugi lahko izražajo na raz-
ličnih vrstah celic. Celice se lahko med 
seboj razlikujejo tudi glede na količino 
določenega antigena. S pomočjo antige-
nov oziroma celičnih označevalcev tako 
celice identificiramo in jih ločimo od 
drugih celic (4,5).
4. Celični označevalci ter 
določanje koncentracije celic
Od začetka uporabe KMC za zdravlje-
nje se je za oceno njihove koncentraci-
je uporabljal podatek o koncentraciji 
vseh celic oziroma vseh enojedrnih ce-
lic v pripravku. Ta povezava temelji na 
predpostavki, da se ob povečanju celo-
kupnega števila celic poveča tudi števi-
60 Zdrav Vestn | januar – februar 2018 | Letnik 87
Srce in ožilje
lo matičnih in predniških celic. Potrdili 
so, da se ti podatki v veliki meri ujema-
jo z uspešnostjo presaditve KMC (6). 
A šele odkritje, da krvotvorne matične 
in predniške celice na površini izražajo 
molekulo CD34, je omogočilo njihovo 
neposredno prepoznavanje in štetje (7). 
Antigen CD34 je transmembranski gli-
koprotein velikosti 104–120 kDa, ki pri-
pada adhezijskim molekulam sialomuci-
nom. Celice, označene s protitelesi proti 
antigenu CD34, preštejemo s pretočnim 
citometrom, kar je trenutno edini način 
določanja koncentracije matičnih ce-
lic (8). Da bi se štetje KMC čim bolj stan-
dardiziralo, je združenje International 
Society for Hematotherapy and Graft 
Engineering (ISHAGE) predlagalo 
enoten postopek za označevanje celic 
CD34+ v različnih vzorcih (periferna 
kri, kostni mozeg, popkovnična kri) ter 
postopek za njihovo večstopenjsko ana-
lizo z metodo pretočne citometrije (9). 
S to metodo pridemo do rezultata dokaj 
hitro in terapevtski potencial celičnega 
pripravka natančneje napovemo (6,10). 
Kljub temu je na tem mestu potrebno 
poudariti nekaj dejstev. Izražanje mole-
kul CD34 se lahko spremeni, če so celi-
ce izpostavljene različnim pogojem ex 
vivo (11). Poleg tega postopek ISHAGE 
ne upošteva prisotnosti apoptotičnih ce-
lic, kar je pomembno predvsem pri za-
mrzovanju in odmrzovanju ter prevozu 
Tabela 1: Pregled najpogosteje uporabljenih označevalcev za fenotipsko opredelitev krvotvornih matičnih celic in njihovih 
subpopulacij.
Vrsta testa/ kombinacija označevalcev pripadnosti Literatura
Določanje 
koncentracije 
KMc celic
štetje enojedrnih celic s hematološkim analizatorjem Stewart s sod., 1995 (18)
celice cD34+cD45Low (heterogena populacija celic s krvotvornimi matičnimi 
celicami)
Donnenberg s sod., 2002 (19);
Sasnoor s sod., 2003; (21)
Fisher s sod., 2014 (20);
Kresnik s sod., 2016 (8)
Določanje 
subpopulacij 
KMc
celice cD34+cD38- (primitivna populacija celic brez izraženih diferenciacijskih 
označevalcev);
celice cD34+cD38+ (heterogena populacija z mieloblasti, eritroblasti, limfoblasti)
Terstappen s sod., 1991 (22);
Bhatia s sod., 1997 (23)
celice lin-cD34+cD38-cD90+cD45ra- (primitivna populacija celic odgovorna za 
dolgoročno repopulacijo);
celice cD34+cD38-cD90-lin- (kratkoročna repopulacija)
Weissman in Shizuru, 2008 (24)
celice cD34-cD38-lin- celice; cD34+cD38-lin-;
celice cD34+cD38-lin- rho123Low;
celice cD34+cD38-lin- cD45ra-rho123Low cD49f (različno dolgo prijetje presadka 
pri miših)
Dooley s sod., 2004 (25);
McKenzie s sod., 2007 (26);
Notta s sod., 2011 (27)
celice cD34+cD117+ (več cFU-GM) in celice cD34+cD117Low (več BFU-e);
celice cD34+cD33-cD38-rho- in cD34+cD33-cD38- (različno velike populacije 
limfo-mieloidnih predniških celic)
Gunji s sod., 1993 (28);
Liu in Verfaillie, 2002 (29)
celice cD34-cD133+ (predhodnice celic cD34+cD133+) Yin s sod., 1997 (30);
Gallacher s sod., 2000 (16);
Mizrak s sod., 2008 (17);
Takahashi s sod., 2014 (31)
celice cD133+cD34+cD45ra- (multipotentne predniške)
celice cD133+cD34+cD45ra+ (limfo-mieloidne predniške); celice 
cD133LowcD34+cD45ra- (eritro-mieloidne predniške)
Radtke s sod., 2015 (32)
opredelitev krvotvornih matičnih in predniških celic v pripravkih za presaditev 61
StroKoVni članeK
celičnih pripravkov. Celice so namreč 
v zgodnjih stopnjah procesa apoptoze 
nedovzetne za barvila, s katerimi obar-
vamo mrtve celice. Zato bi lahko v teh 
primerih določili večje število živih celic 
CD34+, kot jih je dejansko prisotnih v 
analiziranem vzorcu (12).
Antigen CD34 pogosto in napačno 
povezujemo le s KMC in obratno (13). Ta 
molekula se izraža tudi na drugih celi-
cah, kot so na primer epitelne in endotel-
ne celice. Na splošno je v kostnem moz-
gu, popkovnični krvi in periferni krvi 
populacija celic CD34+ zelo heterogena, 
zato je napačno enačiti celice CD34+ 
s krvotvornimi matičnimi celicami. V 
popkovnični krvi ima le približno po-
lovica izmed celic CD34+ tudi funkcio-
nalne lastnosti KMC. Ugotovili so tudi, 
da je izražanje tega proteina lahko re-
verzibilno in ne vpliva na funkcionalne 
sposobnosti celice. Poleg tega, da večina 
KMC izraža antigen CD34, so dokazali 
tudi populacijo KMC, ki so negativne 
za celični označevalec CD34. Te celice 
CD34- naj bi bile primitivnejše matične 
celice od celic CD34+, oziroma naj bi šlo 
za predhodnice celic CD34+ (14,15).
V rutinski praksi je identifikacija 
KMC s pomočjo protiteles anti-CD34 še 
vedno najpogostejša, tako za štetje KMC 
kot tudi za njihovo koncentriranje. Tako 
je tudi v Sloveniji: na Kliničnem oddelku 
za hematologijo in Zavodu RS za trans-
fuzijsko medicino. V različnih raziskavah 
pa se pojavljajo označevalci in kombina-
cije označevalcev, ki bi lahko nadomesti-
li označevalec CD34 oziroma bi ločevali 
med subpopulacijami celic CD34+. Tako 
na primer označevalec CD133 ali promi-
nin-1, ki se izraža tako pri celicah CD34+ 
kot CD34-, označuje primitivnejše KMC, 
njihovo učinkovitost proučujejo v različ-
nih kliničnih raziskavah. Te celice naj bi 
bile bolj klonogene in naj bi omogoča-
le dolgoročno prijetje presadka (16,17). 
Nekateri drugi označevalci za KMC so 
zbrani v Tabeli 1.
V mešanici KMC bi se s pomočjo 
različnih označevalcev lahko izločila 
subpopulacija KMC z najprimernejšimi 
proliferacijskimi in diferenciacijskimi 
lastnostmi celic za določeno zdravlje-
nje. Pri nas v raziskovalne namene KMC 
uporabljamo označevalce CD34, CD184, 
CD133, CD90, CD166, CD117, CD146 in 
CD105.
5. Funkcijske analize 
krvotvornih matičnih 
in predniških celic
Fenotipske analize celic CD34+ so 
običajno hitre, a žal ne podajo podatka 
o biološkem potencialu KMC, njihovo 
izmerjeno število je lahko pretirano, po-
sebno pri odmrznjenih pripravkih (33). 
KMC lahko dodatno identificiramo z 
enim od funkcijskih testov, saj s tem 
natančneje opredelimo njihove migra-
cijske, proliferacijske ali diferenciacijske 
sposobnosti. V raziskovalne namene ali 
za kontrolo kakovosti celičnih priprav-
kov po obdelavi in odmrzovanju najpo-
gosteje merimo število funkcionalnih 
matičnih celic, sposobnih tvorbe kolonij 
krvotvornih celic. To so klonogeni ali 
CFU (angl. Colony-Forming Unit) testi. 
Vsaka kolonija namreč nastane iz ene 
predniške celice ali ene CFU. Nastajajoče 
kolonije lahko spremljamo ex vivo ali in 
vivo. V klasičnem CFU-testu pripravi-
mo celično kulturo v 35 mm petrijevki z 
gojiščem, ki vsebuje ustrezne rastne de-
javnike za KMC. V 14–21 dneh kolonije 
dosežejo določeno velikost in obarva-
nost, zato so primerne za opazovanje in 
štetje z mikroskopom. Poznamo različne 
klonogene teste (Tabela 2) za: BFU-E 
(angl. Burts Forming Unit Erythroid), 
CFU-GM (angl. Colony Forming Unit 
Granulocyte/Macrophage), CFU-
62 Zdrav Vestn | januar – februar 2018 | Letnik 87
Srce in ožilje
GEMM (angl. Colony Forming Unit 
Granulocyte/ Erythrocyte/ Macrophage/
Megakaryocyte), CFU-S (angl. Colony-
Forming Unit Spleen), ki v obsevanih 
miših v vranici tvorijo mieloidne koloni-
je in LTC-IC (angl. Long-Term Culture-
Initiating Cells). Testi za CFU-S in testi 
prijetja presadka v NOD/SCID miših so 
bolj prefinjeni, zato se uporabljajo pred-
vsem v raziskavah.
Klonogeni testi matičnih ce-
lic se po priporočilu NetCord-FACT 
International standards for cord blood 
collection, banking, and release for ad-
ministration redno uporabljajo v ban-
kah popkovnične krvi. Če iz vzorca ce-
ličnega pripravka, ki je namenjen trajni 
presaditvi, ne uspemo pomnožiti celic 
in dokazati kolonij, potem pripravek ni 
primeren za klinično uporabo. Za ostale 
pripravke uporabljamo CFU-test občas-
no, na primer za preverjanje ustreznosti 
postopkov obdelave pripravkov in same-
ga shranjevanja v tekočem dušiku.
6. Določanje nekrotičnosti 
in apoptotičnosti v 
celičnih pripravkih
Nekroza je patološka celična smrt, ki 
nastopi zaradi ekstremnih sprememb v 
okolju. Ker ob tem pride do poškodbe 
celične membrane, lahko v celico poleg 
vode in ionov vdrejo tudi barvila, na 
podlagi katerih mrtve celice ločimo od 
živih. Apoptoza je ključna pri razvoju in 
delovanju organizma, saj se organizem 
s tem znebi odvečnih celic. Apoptozo 
sproži pomanjkanje ali prisotnost dolo-
čenih rastnih dejavnikov, pa tudi dejav-
niki iz okolja, ki poškodujejo DNA, kot 
so prosti radikali, različni virusi, obseva-
Slika 1: Postopek izvedbe CFU-testa, s katerim določimo število krvotvornih matičnih in 
predniških celic, ki so sposobne tvorbe kolonij.
Slika 2: Svetlobna mikroskopija kolonij po 
CFU-testu: tri rdeče obarvane eritroidne 
kolonije (BFU-E) in ena belo obarvana 
granulocitno-makrofagna kolonija (CFU-GM).
opredelitev krvotvornih matičnih in predniških celic v pripravkih za presaditev 63
StroKoVni članeK
nje. Apoptozo celic ex vivo lahko sproži 
sprememba temperature, prisotnost ali 
odsotnost določenih snovi v gojiščih za 
celice ali zamrzovalnih raztopinah.
Barvanje citoplazme mrtvih celic s 
tripanskim modrilom je bil eden prvih 
načinov določanja živosti ali viabilnosti 
celic v laboratoriju (34,35). Za ločeva-
nje živih od mrtvih celic se uporabljajo 
tudi flurokromi, kot so propidijev jodid 
(PI) (34) in 7-amino-aktinomicin D (7-
AAD) (8,12,35), ki se po vstopu v nekro-
tične ali pozno apoptotične celice vežejo 
na nukleinke kisline. V rutinski uporabi 
se najpogosteje uporablja fluorokrom 
7-AAD.
Dobra plat testov viabilnosti je ta, 
da so hitri: v večini primerov je dovolj 
že do 10-minutna izpostavljenost barvi-
lu. Slaba plat pa je ta, da se nam celice 
v zgodnjih fazah apoptoze največkrat 
izmuznejo, ker barvil še ne prepušča-
jo. Zato apoptozo določamo na podlagi 
drugih celičnih sprememb, kot je na pri-
mer porušenost membranske asimetrije. 
Molekule fosfatidilserina, ki se nahajajo 
v citosolnem delu celične membrane, se 
na začetku apoptoze začnejo premeščati 
v zunajcelično plast celične membrane, 
kjer služijo kot signal za prepoznavanje 
in odstranitev z makrofagi. Aneksini 
se v prisotnosti kalcijevih ionov lahko 
vežejo na izpostavljeni fosfatidilserin, 
zato apoptotične celice, obarvane s fluo-
rescenčno označenim aneksinom loči-
mo od mrtvih (Slika 1). Spremembam, ki 
se dogajajo med apoptozo, sledimo tudi 
s testom fragmentacije DNA, merjenjem 
aktivnosti kaspaz, merjenjem membran-
skega potenciala mitohondrijev, sprošča-
njem citokroma C in drugimi postopki. 
Katero vrsto testa izberemo, je odvisno 
od vrste celic. Za krvotvorne matične ce-
lice pa se najpogosteje uporablja označe-
vanje z aneksinom V.
7. Pripravki krvotvornih 
matičnih celic po citaferezi
Citafereza je postopek zbiranja krvnih 
celic s celičnim ločevalnikom, ki odvza-
me polno kri ter izloči želene krvne ce-
Slika 3: Označevanje apoptotičnih celic. Med apoptozo se molekule fosfatidilserina prestavijo 
iz citosolne plasti celične membrane v zunajcelično plast. Ob prisotnosti Ca(2)+ ionov se na 
izpostavljene fosfatilidserine veže protein aneksin V, ki je označen s fluorokromom.
64 Zdrav Vestn | januar – februar 2018 | Letnik 87
Srce in ožilje
lice, ostale sestavine pa postopno vrača 
v krvni obtok. S tem postopkom zbira-
mo KMC v levkocitni pripravek, kjer se 
nahaja tudi preostanek eritrocitov, gra-
nulocitov in trombocitov. Koncentracija 
KMC v periferni krvi bolnika pred in po 
citaferezi ter v levkocitnem pripravku se 
določa s pretočno citometrijo po stan-
dardnem postopku (ISHAGE). Celice 
se označijo s protitelesi proti celičnima 
označevalcema CD34 in CD45. Količino 
KMC izrazimo tudi v % glede na celo-
kupno število levkocitov, ki ga izmerimo 
s hematološkim analizatorjem ali s pre-
točnim citometrom. Delež celic CD34+ v 
levkocitnih pripravkih bolnikov, ki smo 
jih zbrali s celičnim ločevalnikom, je 
0,09–2 %, v povprečju 0,7 %. Tako zbra-
ne celice se v Sloveniji uporabljajo za 
zdravljenje različnih bolezni na podro-
čju hematologije, onkologije in kardiolo-
gije (8,47,48,49).
8. Odmrznjeni pripravki 
krvotvornih matičnih celic
Pri analizi odmrznjenih celičnih pri-
pravkov s pretočno citometrijo mora-
mo postopke prilagoditi. Mrtve celice 
v vzorcu lahko motijo meritev in dajo 
napačen rezultat zaradi nespecifične ve-
zave protiteles. Zaradi povečanja ozad-
ja fluorescence se lahko zgodi, da šibko 
pozitivnih celic ne vidimo. Poleg tega 
mrtve celice sproščajo DNA, ki je leplji-
va in povzroči nastajanje skupkov celic, 
ki ovirajo analizo. Zamrznjeni pripravki 
poleg KMC vsebujejo tudi druge krv-
ne celice. Problematični so predvsem 
granulociti, ki te oblike zamrzovanja ne 
Tabela 2: Pregled funkcijskih testov za opredelitev KMC in njihovih subpopulacij.
Vrsta testa Literatura
Določanje 
viabilnosti/ 
apoptotičnosti celic
Tripansko modrilo Mascotti s sod., 2000 (34);
Xiao in Dooley, 2003 (35);
Propidium jodid Mascotti s sod., 2000 (34)
7-amino-aktinomicin D Xiao in Dooley, 2003 (35); 
Krašna s sod., 2015 (12);
Kresnik s sod., 2016 (8)
SYto16 test Sparrow s sod., 2006 (36)
toPro-3 López in lawrence, 2008 (37)
aneksin V anthony s sod., 1998 (38);
Xiao in Dooley, 2003 (35)
Klonogeni testi CFU Weissman in Shizuru, 2008 (24);
Radke s sod., 2013 (39)
cFU-sd12, cFU-GM, cFU-GeMM Balint s sod., 1999 (40);
Matsumoto s sod., 2002 (41)
BFU-E Balint s sod., 1999 (40);
Buchanan, 2004 (42)
LTC-IC Barker in Wagner, 2003 (43);
Ito s sod., 2010 (44)
Testi in vivo noD/Sci miši Valeri in Pivacek, 1996 (45);
Halle s sod., 2001 (46)
opredelitev krvotvornih matičnih in predniških celic v pripravkih za presaditev 65
StroKoVni članeK
preživijo. Celokupno število levkocitov v 
odmrznjenem pripravku je zato manjše 
kot pred zamrzovanjem. Zato se spreme-
ni tudi delež celic CD34+, ki se običajno 
izračuna glede na število levkocitov. Zato 
je v odmrznjenih pripravkih potrebno 
ponovno določiti koncentracijo CD34+ 
s pomočjo kroglic za štetje in ne samo 
določati delež mrtvih celic. Hkrati je pri-
poročljivo preveriti tudi apoptotičnost 
celic. Na Zavodu RS za transfuzijsko me-
dicino smo ocenili, da pri odmrzovanju 
pripravkov KMC, ki so shranjeni v naši 
kriobanki in so namenjenih za avtolog-
no presaditev, v povprečju propade 20 % 
celic CD34+, kar je primerljivo z dru-
gimi laboratoriji, ki pripravljajo celične 
pripravke za klinično uporabo (12). Vse 
celice ne preživijo zamrzovanja in odmr-
zovanja, saj jih poškoduje osmotski šok 
ob dodatku krioprotektorja pri procesu 
zamrzovanja in kristali ledu, ki poškodu-
jejo membrane. Ker je delež mrtvih celic 
po odmrzovanju pričakovan, to upošte-
vamo že na začetku pri samem zbiranju 
celic. Po drugi strani pa smo ugotovili, 
da se živost krvotvornih matičnih ce-
lic v zamrznjenih pripravkih, ki so dalj 
časa shranjeni v tekočem dušiku, skoraj 
ne zmanjšuje. Zato tudi standardi, ki do-
ločajo pripravo celičnih pripravkov ne 
omejujejo rok uporabnosti zamrznjenih 
pripravkov (50,51).
9. Pripravki koncentriranih 
krvotvornih matičnih celic
V nekaterih primerih za zdravlje-
nje potrebujemo KMC, ki so zbrane v 
manjšem volumnu pripravka oziroma 
v takšni obliki, da ne vsebujejo drugih 
krvnih celic. Takrat se celice CD34+ 
po citaferezi še dodatno koncentrira-
jo (8,12). Ker so KMC po velikosti in 
specifični teži podobne levkocitom, jih 
s centrifugiranjem ne moremo osamiti, 
zato uporabimo postopek ločevanja ce-
lic, ki temelji na vezavi ustreznih proti-
teles v magnetnem polju. Celice bi lahko 
koncentrirali tudi s posebnim pretočnim 
citometrom – celičnim ločevalnikom 
(angl. cell sorter), vendar je trenutno za 
pripravke, namenjene zdravljenju, pri-
mernejše imunomagnetno ločevanje ce-
lic, ker zagotavlja aseptičnost priprave. 
Pri »pozitivnem« imunomagnetnem lo-
čevanju protitelesa, ki so označena z žele-
znimi nanodelci, omogočijo, da se KMC 
zadržijo v magnetnem polju, med tem 
ko vse druge celice, ki nimajo vezanih 
protiteles, potujejo skozi kolono in tvo-
rijo »negativno« frakcijo pripravka. Po 
odstranitvi kolone iz magneta zberemo 
populacijo KMC (»pozitivna« frakcija) 
in jo s centrifugiranjem zmanjšamo na 
ustrezni volumen. Število in viabilnost 
celic CD34+ v nastalem pripravku (upo-
rabijo se lahko tudi druga protitelesa za 
ločevanje KMC) preverimo s pretočnim 
citometrom. Izračunamo tudi izkoristek 
postopka in čistost pripravka po nasled-
njih dveh obrazcih: 1. izkoristek postop-
Slika 4: Svetlobna mikroskopija pripravka celic CD34+ po 
imunomagnetnem ločevanju. V povprečju je v pripravku več kot 95 % 
celic CD34+ (velikosti 7–8 µm).
66 Zdrav Vestn | januar – februar 2018 | Letnik 87
Srce in ožilje
ka je število celic CD34+ v »pozitivni« 
frakciji glede na število celic CD34+ v 
začetnem levkocitnem pripravku, 2. čis-
tost pripravka je število celic CD34+ v 
»pozitivni« frakciji glede na število lev-
kocitov v »pozitivni« frakciji.
V našem laboratoriju uporabljamo 
tehnologijo CliniMACS plus (Miltenyi 
Biotec) za pripravo koncentriranih ce-
lic CD34+. S tem postopkom skoncen-
triramo v povprečju 60 % (19–99 %) s 
citaferezo zbranih celic CD34+, vendar 
se izkoristki postopka med bolniki raz-
likujejo, verjetno zaradi različnih krv-
nih slik. Vseh dejavnikov, ki vplivajo na 
učinkovitost zbiranja, še ne poznamo. 
S slabšo učinkovitostjo zbiranja pove-
zujejo večjo koncentracijo granulocitov 
in trombocitov v začetnem pripravku. Z 
ločevanjem in koncentriranjem matič-
nih celic pripravimo čistejše pripravke, 
hkrati pa tudi izgubimo del matičnih ce-
lic v negativni frakciji, zato moramo ob 
načrtovanem zbiranju celic za klinično 
uporabo upoštevati to izgubo. Povprečna 
čistost pripravka je 80 %, povprečna ži-
vost celic pa je 98 %. V pripravku je lahko 
od 11–400 × 106 celic CD34+, odvisno od 
števila v začetnem pripravku (8).
10. Zaključek
Kakovost pripravkov KMC sprem-
ljamo z različnimi testi. Nekateri se 
uporabljajo rutinsko za vse pripravke 
(koncentracija KMC, viabilnost), drugi 
le za določene pripravke (CFU test za 
popkovnično kri). Apoptotičnost celic se 
običajno preverja pri odmrznjenih pri-
pravkih. Koncentracijo KMC določamo 
s pretočno citometrijo na podlagi ozna-
čevalca CD34. Uporaba dodatnih celič-
nih označevalcev bi omogočila ločevanje 
med različnimi subpopulacijami KMC, s 
čimer bi lahko bolje napovedali učinko-
vitost in dinamiko »prijetja« presadka.
Literatura
1. Zakon o kakovosti in varnosti človeških tkiv in celic, namenjenih za zdravljenje. Uradni list rS 
2007;17(61):8529–8536; in 2015;25(56):6539–6548.
2. ogawa M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 1993;81(11):2844–53.
3. Weissman il. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. cell. 
2000;100(1):157–68.
4. Payne Kj, crooks GM. Human hematopoietic lineage commitment. immunological reviews. 2002;187(1):48–
64.
5. Wood B. Multicolor immunophenotyping: Human immune System Hematopoiesis. Methods in cell Bio-
logy: elsevier; 2004. p. 559–76.
6. Glossmann jP, josting a, Pfistner B, Paulus U, engert a. a randomized trial of chemotherapy with carmu-
stine, etoposide, cytarabine, and melphalan (BeaM) plus peripheral stem cell transplantation (PBSct) vs 
single-agent high-dose chemotherapy followed by BeaM plus PBSct in patients with relapsed Hodgkin's 
disease (HD-r2). annals of Hematology. 2002;81(8):424–9.
7. Krause DS, Fackler Mj, civin ci, May WS. cD34: structure, biology, and clinical utility. Blood. 1996;87(1):1–13.
8. Kresnik PK, Krasna M, rozman P, Vrtovec B, Malicev e. collection and immunoselection of cD34+ cells: the 
impact of age, sex, and diabetes in patients with chronic heart failure. transfusion. 2016;56(7):1792–800.
9. Sutherland Dr, anderson l, Keeney M, nayar r, chin-Yee ian. the iSHaGe Guidelines for cD34+ cell Deter-
mination by Flow cytometry. journal of Hematotherapy. 1996;5(3):213–26.
10. jansen eM, Hanks SG, terry c, akard lP, thompson jM, Dugan Mj, et al. Prediction of engraftment after 
autologous peripheral blood progenitor cell transplantation: cD34, colony-forming unit?granulocyte-ma-
crophage, or both? transfusion. 2007;47(5):817–23.
11. laura e Sidney, Matthew j Branch, Siobhán e Dunphy, Harminder S Dua, and andrew Hopkinson concise 
review: evidence for cD34 as a common Marker for Diverse Progenitors. Stem cells. 2014;32(6):1380–89.
12. Krašna M, Maličev e, jež M, nunar Perko a, cukjati M. Kakovost odmrznjenih pripravkov krvotvornih matič-
nih celic za presaditev. Slovenian Medical journal. 2015;84(6).
13. ivanovic Z, Vlaski M. Production of hematopoietic cells from umbilical cord blood stem cells for transfusion 
purposes: focus on ex vivogeneration of red blood cells. Scr Med. 2012;43(2):99–105
opredelitev krvotvornih matičnih in predniških celic v pripravkih za presaditev 67
StroKoVni članeK
14. Verfaillie cM, almeida-Porada G, Wissink S, Zanjani eD. Kinetics of engraftment of cD34− and cD34+ cells 
from mobilized blood differs from that of cD34− and cD34+ cells from bone marrow. experimental Hema-
tology. 2000;28(9):1071–9.
15. Zanjani eD, almeida-Porada G, livingston aG, Flake aW, ogawa M. Human bone marrow cD34- cells en-
graft in vivo and undergo multilineage expression that includes giving rise to cD34+ cells. exp Hematol. 
1998;26(4):353–60.
16. Gallacher l, Murdoch B, Wu DM, Karanu Fn, Keeney M, Bhatia M. isolation and characterization of human 
cD34(-)lin(-) and cD34(+)lin(-) hematopoietic stem cells using cell surface markers ac133 and cD7. Blood. 
2000;95(5):2813–20.
17. Mizrak D, Brittan M, alison Mr. cD133: molecule of the moment. the journal of Pathology. 2007;214(1):3–9.
18. Stewart aK, imrie K, Keating a, anania S, nayar r, Sutherland Dr. optimizing the cD34+ and cD34+thy-1+ 
stem cell content of peripheral blood collections. exp Hematol. 1995;23(14):1619–27.
19. Donnenberg aD, Koch eK, Griffin Dl, Stanczak HM, Kiss je, carlos tM, et al. Viability of cryopreserved BM 
progenitor cells stored for more than a decade. cytotherapy. 2002;4(2):157–63.
20. Sasnoor lM, Kale VP, limaye lS. Supplementation of conventional Freezing Medium with a combination 
of Catalase and Trehalose Results in Better Protection of Surface Molecules and Functionality of Hemato-
poietic cells. journal of Hematotherapy & Stem cell research. 2003;12(5):553–64.
21. Fisher V, Khuu H, David-ocampo V, Byrne K, Pavletic S, Bishop M, et al. analysis of the recovery of cryopre-
served and thawed cD34+ and cD3+ cells collected for hematopoietic transplantation. transfusion. 
2013;54(4):1088–92.
22. terstappen lW, Huang S, Safford M, lansdorp PM, loken Mr. Sequential generations of hematopoietic co-
lonies derived from single nonlineage-committed cD34+cD38- progenitor cells. Blood. 1991;77(6):1218–27.
23. Bhatia M, Wang jcY, Kapp U, Bonnet D, Dick je. Purification of primitive human hematopoietic cel-
ls capable of repopulating immune-deficient mice. Proceedings of the national academy of Sciences. 
1997;94(10):5320–5.
24. Weissman il, Shizuru ja. the origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and 
their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 
2008;112(9):3543–53.
25. Dooley Dc. analysis of Primitive cD34- and cD34+ Hematopoietic cells from adults: Gain and loss of 
cD34 antigen by Undifferentiated cells are closely linked to Proliferative Status in culture. Stem cells. 
2004;22(4):556–69.
26. McKenzie jl, takenaka K, Gan oi, Doedens M, Dick je. low rhodamine 123 retention identifies long-term 
human hematopoietic stem cells within the lin-cD34+cD38- population. Blood. 2007;109(2):543–5.
27. notta F, Doulatov S, laurenti e, Poeppl a, jurisica i, Dick je. isolation of Single Human Hematopoietic Stem 
cells capable of long-term Multilineage engraftment. Science. 2011;333(6039):218–21.
28. Gunji Y, nakamura M, osawa H, nagayoshi K, nakauchi H, Miura Y, Yanagisawa M, Suda t. Human pri-
mitive hematopoietic progenitor cells are more enriched in Kitlowcells than in Kithighcells. Blood. 
1993;82(11):3283–89.
29. liu H, Verfaillie cM. Myeloid-lymphoid initiating cells (Ml-ic) are highly enriched in the rhodamine-c-ki-
t+cD33−cD38− fraction of umbilical cord cD34+ cells. experimental Hematology. 2002;30(6):582–9.
30. Yin aH, Miraglia S, Zanjani eD, almeida-Porada G, ogawa M, leary aG, olweus j, Kearney j, Buck DW. (1997). 
ac133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 1997;90(12):5002–12.
31. takahashi M, Matsuoka Y, Sumide K, nakatsuka r, Fujioka t, Kohno H, et al. cD133 is a positive marker for a 
distinct class of primitive human cord blood-derived cD34-negative hematopoietic stem cells. leukemia. 
2013;28(6):1308–15.
32. radtke S, Görgens a, Kordelas l, Schmidt M, Kimmig Kr, Köninger a, et al. cD133 allows elaborated di-
scrimination and quantification of haematopoietic progenitor subsets in human haematopoietic stem cell 
transplants. British journal of Haematology. 2015;169(6):868–78.
33. Yang H, acker jP, cabuhat M, McGann le. effects of incubation temperature and time after thawing on 
viability assessment of peripheral hematopoietic progenitor cells cryopreserved for transplantation. Bone 
Marrow transplantation. 2003;32(10):1021–6.
34. Mascotti K, Mccullough j, Burger Sr. HPc viability measurement: trypan blue versus acridine orange and 
propidium iodide. transfusion. 2000;40(6):693–6.
35. Xiao M, Dooley Dc. assessment of cell Viability and apoptosis in Human Umbilical cord Blood Following 
Storage. journal of Hematotherapy & Stem cell research. 2003;12(1):115–22.
36. Sparrow rl, Komodromou H, tippett e, Georgakopoulos t, Xu W. apoptotic lymphocytes and cD34+ cells 
in cryopreserved cord blood detected by the fluorescent vital dye SYto 16 and correlation with loss of l-se-
lectin (cD62l) expression. Bone Marrow transplantation. 2006;38(1):61–7.
37. lópez Mc, lawrence Da. Proficiency testing experience for viable cD34+ stem cell analysis. transfusion. 
2008;48(6):1115–21.
38. anthony rS, McKelvie nD, cunningham aj, craig jio, rogers SY, Parker ac. Flow cytometry using annexin 
V can detect early apoptosis in peripheral blood stem cell harvests from patients with leukaemia and 
lymphoma. Bone Marrow transplantation. 1998;21(5):441–6.
39. radke tF, Barbosa D, Duggleby rc, Saccardi r, Querol S, Kögler G. the assessment of Parameters affecting 
the Quality of cord Blood by the appliance of the annexin V Staining Method and correlation with cFU 
assays. Stem cells international. 2013;2013:1–10.
68 Zdrav Vestn | januar – februar 2018 | Letnik 87
Srce in ožilje
40. Balint B, ivanović Z, Petakov M, taseski j, jovčić G, Stojanović n, et al. the cryopreservation protocol op-
timal for progenitor recovery is not optimal for preservation of marrow repopulating ability. Bone Marrow 
transplantation. 1999;23(6):613–9.
41. Matsumoto n, Yoshizawa H, Kagamu H, abe t, Fujita n, Watanabe S, et al. Successful liquid storage 
of peripheral blood stem cells at subzero non-freezing temperature. Bone Marrow transplantation. 
2002;30(11):777–84.
42. Buchanan SS, Gross Sa, acker jP, toner M, carpenter jF, Pyatt DW. cryopreservation of Stem cells Using 
trehalose: evaluation of the Method Using a Human Hematopoietic cell line. Stem cells and Develo-
pment. 2004;13(3):295–305.
43. Barker jn, Wagner je. Umbilical-cord blood transplantation for the treatment of cancer. nature reviews. 
cancer. 2003;3(7):526–32.
44. ito cY, Kirouac Dc, Madlambayan Gj, Yu M, rogers i, Zandstra PW. the ac133+cD38-, but not the rhodami-
ne-low, phenotype tracks ltc-ic and Src function in human cord blood ex vivo expansion cultures. Blood. 
2010;115(2):257–60.
45. Valeri cr, Pivacek le. effects of the temperature, the duration of frozen storage, and the freezing container 
on in vitro measurements in human peripheral blood mononuclear cells. transfusion. 1996;36(4):303–8.
46. Halle P, tournilhac o, Knopinska-Posluszny W, Kanold j, Gembara P, Boiret n, rapatel c, Berger M, travade 
P, angielski S, Bonhomme j, Deméocq F. Uncontrolled-rate freezing and storage at −80 °c, with only 3.5 % 
DMSo in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations. 
transfusion. 2001;41(5):667–73.
47. Zver S, Melkić e, radevska t. Zdravljenje diseminiranega plazmocitoma na Kliničnem oddelku za hemato-
logijo UKc ljubljana z avtologno presaditvijo krvotvornih matičnih celic v letih 2014 in 2015. Zdrav Vestn. 
2016;85(9).
48. Pretnar j, tonejc M, cotič-Flajs c, Preložnik-Zupan i. nesorodna alogenična presaditev krvotvornih matič-
nih celic pri zdravljenju odraslih bolnikov z akutnimi levkemijami in kronično mieloično levkemijo – 6-letne 
izkušnje. Zdrav Vestn 2008;77 Supl: i-47–50.
49. novakovic Bj. immunotoxin – a new treatment option in patients with relapsed and refractory Hodgkin 
lymphoma. radiology and oncology. 2015;49(4):315–19.
50. Broxmeyer He, Srour eF, Hangoc G, cooper S, anderson Sa, Bodine DM. High-efficiency recovery of functi-
onal hematopoietic progenitor and stem cells from human cord blood cryopreserved for 15 years. Procee-
dings of the national academy of Sciences. 2003;100(2):645–50.
51. Fact-jacie international Standards for Hematopoietic cellular therapy Product collection, processing, 
and administration. 6th ed. nebraska: Fact; 2015.