Katarina Živec1, Kristina Ziherl2
Fluidnost eritrocitnih membran pri rakavih bolnikih - študija z elektronsko paramagnetno resonanco3
Fluidity of Red Blood Cells' Membranes in Cancer Patients -an Electronic Paramagnetic Resonance Study
IZVLEČEK
KLJUČNE BESEDE: rakavi bolniki, serumski lipidi, elektronska paramagnetna resonanca, fluidnost plazemskih membran, membranske domene, eritrociti
Izhodišče: Porabnostna hipoholesterolemija je na račun hitro delečih se rakavih celic pri bolnikih z rakom pogost in pričakovan pojav. Rakave celice imajo povečano fluidnost plazemskih membran zaradi znižane koncentracije holesterola. Eritrociti so celice brez možnosti lastne sinteze lipidov. Spremembe koncentracije serumskih lipidov se lahko kažejo v lipidni sestavi membrane eritrocita in posledično v fluidnosti membrane.
Namen: Primerjava fluidnosti membran eritrocitov pri rakavih bolnikih in pri zdravih kontrolah v odvisnosti od koncentracije serumskih lipidov, vrste, stadija raka in starosti.
Hipoteza: Membrane eritrocitov rakavih bolnikov imajo zaradi pričakovane hipoholeste-rolemije povečano fluidnost.
Metode: Vključenih je bilo 49 rakavih bolnikov in 25 zdravih kontrol. Fluidnost membran izoliranih eritrocitov smo proučevali z elektronsko paramagnetno resonanco. V membrano smo vgradili spinski označevalec, ki posreduje informacije o fluidnosti membrane v neposredni okolici, kar smo kasneje razbrali iz spektrov. Da bi dodatno dokazali povezavo med vgradnjo holesterola v membrano in fluidnostjo, smo vzorcem eritrocitov zdravih kontrol dodali holesterol in merili posledično spremembo fluidnosti.
Rezultati: Bolniki z rakom v primerjavi z zdravimi kontrolami nimajo povečane fluidnosti membran eritrocitov, v serumu pa imajo pomembno manjše vrednosti serumskih lipidov. Fluidnost membran eritrocitov se premosorazmerno povečuje z večanjem vrednosti holesterola v serumu. Dodatek holesterola (0,5 M) eritrocitom v poskusu in vitro pomembno zviša koncentracijo holesterola v eritrocitnih membranah in pa tudi fluidnost teh membran.
Zaključek: Presenetljiv rezultat, da hipoholesterolemija ne povzroči večje fluidnosti membran eritrocitov, smo razložili z obstojem membranskih domen in pa spremenjenih metabolnih mehanizmov pri rakavih bolnikih. Metoda ni klinično uporabna, primerna pa je za nadaljnje bazične raziskave eritrocitnih membran zaradi dobre korelacije le-teh s spremembami serumskimih lipidov. Poleg lipidov v plazmi bi bilo treba z biokemičnimi postopki meriti tudi dejansko koncentracijo holesterola v eritrocitni membrani.
3
1	Katarina Živec, štud.med., Klinični oddelek za torakalno kirurgijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana in Inštitut Jožef Štefan, Jamova 39, 1000 Ljubljana.
2	Kristina Ziherl, štud.med., Klinični oddelek za torakalno kirurgijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana in Inštitut Jožef Štefan, Jamova 39, 1000 Ljubljana.
3	Delo je bilo nagrajeno s Prešernovim priznanjem študentom za leto 2004.
ABSTRACT_
KEY WORDS: cancer patients, serum lipids, electronic paramagnetic resonance, plasma membrane fluidity, membrane domains, erythrocytes
Background: Hypocholesterolemia in cancer patients is a frequent and expected phenomenon. Higher fluidity of plasma membranes (as a result of lower concentration of cholesterol) is a characteristic of most cancer cells. Erythrocytes lack organelles and inner membranes and with that any possibility of endogenous synthesis of lipids. Changes in serum lipid concentration could be shown in the fluidity of erythrocyte cell membranes.
Aim: To compare the fluidity of erythrocyte membranes in cancer patients and in healthy controls in relation to serum lipid concentration, type, stage of cancer and age.
Hypothesis: Hypocholesterolemia in cancer patients is the cause, that erythrocyte membranes have higher fluidity.
Methods: In prospective study we included 49 cancer patients and 25 healthy controls. We studied the membrane fluidity of isolated erythrocytes by the electronic paramagnetic resonance method. In membranes incorporated spin label gives us information (spectrum) about fluidity in the neighborhood. We also added 0.5 M cholesterol to erythrocytes samples from healthy individuals and measured the change in membrane fluidity.
Results: Cancer patients in comparison to healthy controls do not have higher erythrocytes membrane fluidity but they do have significantly lower serum lipid concentrations. Fluidity of erythrocyte membranes is higher in patients with higher total serum cholesterol, HDL and LDL. Addition of cholesterol (in vitro) to erythrocytes of healthy individuals significantly increases the concentration of cholesterol in cell membranes and their fluidity as well.
Conclusions: The surprising result that hypocholesterolemia does not cause higher fluidity of erythrocyte membranes we explained with the existence of membrane domains and 4 changes in metabolism in cancer patients. The EPR method is not clinically important; however it could be used for further basic science research for there is very good correlation between fluidity of erythrocytes membranes and serum lipid concentration. It would also be necessary to biochemically measure the real cholesterol concentration in erythrocytes membranes.
UVOD
Struktura eritrocitne plazemske membrane: holesterol, izmenjava le-tega s serumskimi lipoproteini, razmerje holesterol/ fosfolipidi in fluidnost
Zreli humani eritrociti nimajo jedra, organe-lov (notranjih membran), zato predstavljajo enega najboljših modelov za študij membran. 50 % teže membrane eritrocita predstavljajo lipidi (fosfolipidi, holesterol, glikolipidi), drugo polovico pa proteini (spektrin, aktin, ankirin, band 4.1, band 3). Glavni fosfolipidi (slika 1), asimetrično razporejeni med polovicama membrane, so fosfatidilholin (lecitin, 29,3 %), sfingomielin (25,5 %), fosfatidilserin (14,9 %) in fosfatidiletanolamin (27,6%). V zunanji polovici sta predvsem fosfatidilholin in sfingomielin, notranjo polovico pa tvorita večinoma
fosfatidiletanolamin in fosfatidilserin. Glikolipidi so prisotni izključno v zunanjem delu. Nekaj je tudi prostih maščobnih kislin, ni pa trigliceridov niti holesterolnih estrov. Membranske proteine delimo v periferne in integralne (1, 2).
Dve glavni značilnosti fosfolipidnega dvosloja sta neprepustnost za v vodi topne molekule in pa fleksibilnost, dinamičnost membrane ter z njo povezana prosta difuzija lipidov in proteinov v membrani. Se danes splošno priznan izraz za membrano, po modelu Singer-Nicolson, je zato fluidni mozaik (1, 3).
Razmerje holesterol/fosfolipidi (H/F-raz-merje) je razmerje med nevtralnimi lipidi (holesterol) in polarnimi lipidi (fosfolipidi in glikolipidi); v eritrocitni membrani je v normalnih razmerah 0,9-1,0. Dejavniki, ki vplivajo na te razlike, so različna koncentracija gli-kolipidov v membrani, ki tudi raztapljajo
zunanjost celice
sfingomielin	glikolipid	fosfatidilholin holesterol
Slika 1. Lipidni dvosloj, prikazani so fosfolipidi, holesterol, glikolipidi.
holesterol (razmerje holesterol proti fosfolipi-dom in glikolipidom ostane nespremenjeno), preferenca holesterola do ene vrste fosfolipi-dov in pa tudi medsebojni vplivi med proteini in fosfolipidi, ki tako zmanjšujejo raztapljanje holesterola (4, 5). Preferenca do določenih fosfolipidov je vprašljiva, kajti nekateri so dokazali večjo preferenco do sfingomielina in lecitina in manjšo do fosfatidiletanolamina, nekateri pa so to zanikali (6).
Holesterol se izmenjuje med membrano in plazemskimi lipoproteini, končni ravnotežni delež holesterola pa je odvisen od H/F-razmer-ja v obeh predelkih. Holesterol in razmerje H/F v lipoproteinih se odraža na razmerju v eritrocitni membrani in je v ravnotežju (4-8). Zanimivo je, da prenos holesterola iz lipoproteinov v membrano ni odvisen od plazemske koncentracije holesterola niti od koncentracije lipoproteinov, ampak od razmerja H/F v LDL oz. v drugih lipoproteinih. Tako eritrociti dobijo holesterol iz lipo-proteinov, ki imajo zvišano H/F-razmerje. Upoštevati moramo tudi, da lipoproteini vsebujejo tri- do štirikrat več holesterol-nih estrov kot neesterificiranega holesterola, le-ti pa so slabo topni v fosfolipidih in tako nepomembni za membrano eritrocita (6). Izmenjava je izrednega pomena za eritrocite, kajti le-ti nimajo encimov za sintezo holesterola, fosfolipidov oz. za esterifikacijo. Tako imajo dejavniki, ki vplivajo na izmenjavo med lipoproteini in eritrocitnimi membranami, velik pomen pri spremembi fluidnosti membran (4).
Holesterol ima kondenzirajoči, »utrditve-ni« učinek na membrano, ohranja pa fluid-nost (4-12). Zvišana koncentracija holesterola v membrani utrdi acilne verige, hkrati pa zmanjša interakcijo med lipidnimi glavami; obratno je pri znižanju koncentracije (12). Pri višji temperaturi holesterol interreagira z gibajočimi verigami maščobnih kislin ter tako povzroči, da postane zunanji del manj fluiden; 5 obratno je pri znižani temperaturi (1,8). Zniževanje temperature zmanjšuje fluidnost, večje kot pa je razmerje holesterol/fosfolipi-di, večje bo tudi zmanjšanje fluidnosti (9). Holesterol lahko membrano tudi fluidizira, kajti njegova zgradba se bolje prilagodi nenasičenim maščobnim verigam, čeprav pa ima večjo afiniteto do nasičenih (11). Holesterol vpliva tudi na propustnost, osmotsko fragil-nost, obliko eritrocita, encimsko aktivnost, površinske receptorje (4, 5, 9).
Fluidnost membrane je proces gibanja molekul v membrani in odraža urejenost lipidnega dvosloja. Je obratnosorazmerna mikroviskoznosti. Gibanje je zaradi interakcij med steroli in fosfolipidi izrazitejše v sredini lipidnega dvosloja, manjše pa ob stiku z vodno fazo (4, 5, 7). Obstajajo tudi razlike v fluid-nosti med zunanjim in notranjim slojem membrane, in sicer, da je zunanji del manj fluiden; razlaga za to pa naj bi bila, da se holesterol bolj zadržuje v zunanjem delu in pa da obstaja razlika v nenasičenosti fosfatidilholi-na v primerjavi s fosfatidiletanolaminom in fosfatidilserinom (13,14). Na fluidnost vpliva še število nenasičenih, nasičenih in dolžina
acilnih verig, H/F-razmerje, tudi delež določenih fosfolipidov (večanje razmerja sfingomielin/ lecitin vmembrani zmanjšuje fluidnost) (4, 7). Več nenasičenih maščobnih kislin poveča fluidnost (15). Nenasičene maščobne verige močno znižajo utrditveni učinek holesterola, nenasičenost kot taka pa nima pomembnejšega vpliva na zmanjšanje fluidnosti, govori druga študija (16). Znano pa je, da je nižanje fluidnosti vseeno končno, kajti ob H/F več kot 2, se le-ta ne znižuje več. To razlagajo z domenami s takimi oblikami holesterola, ki ne vpliva na fluidnost membrane (6). Ob staranju eritrocitov in vivo se razmerje (holesterol + fosfolipidi)/proteini zmanjša, spremenijo se interakcije proteini-lipidi; zmanjša se fluidnost membrane, razmerje H/F pa se ne spremeni (17). S staranjem organizma pa se koncentracija holesterola in fosfolipidov zvišuje, medtem ko ostane razmerje H/F nespremenjeno. Poveča se tudi delež stearinske (18:0) in palmitinske (16:0) kisline v membrani, zmanjša pa delež linolenske (18:2). Saturacijski indeks (glej spodaj) in fluidnost sta znižana (18). Fluidizirajoči učinek imajo tudi amfipatične molekule (mila, alkoholi, detergenti), psihotropna zdravila, lokalni anestetiki, statini (posredno preko znižanja LDL-partiklov kot tudi neposrednno učinkovanje na membrano) (4, 19, 20).
Veliko študij je dokazalo, da je fluidnost membran rakavih celic večja kot pri normalnih kontrolah (21-26). Vzrok za povečano fluidnost tumorskih celic bi lahko bila zmanjšana vsebnost holesterola vmembrani (21, 22), in sicer zaradi velike porabe hitro se delečih rakavih celic in stalnega izplavljanja membranskih vezikul, ki so bogate z antigeni in holesterolom.
Bolniki z večjo fluidnostjo membran rakavih celic imajo slabšo napoved kot tisti z manjšo fluidnostjo (25); take celice imajo tudi večjo moč metastaziranja.
Heterogenost membrane -lipidni rafti
Lipidni rafti (slika 2) ali domene so sestavljeni iz holesterola in sfingolipidov (sfingomielin in glikosfingolipidi), le-ti pa vključujejo tudi različne membranske proteine; odporni so na delovanje z detergenti. Velikost raftov je odvisna od količine holesterola in sfingolipidov v membrani. Med seboj se lahko
združujejo, na to pa vplivajo koncentracije lipidov v okolju. (10). Rafti so pomembni za prevajanje celičnih signalov in pa za ureditev in prenos lipidov in proteinov vmembrani (3,27).
Že omenjeni tekoči mozaik vključuje gel fazo (bolj trdna, lipidi so urejeni in se malo gibljejo, pretežno nasičene maščobne verige) in tekočo fazo (velika gibljivost lipidov, pretežno nenasičene maščobne kisline). Obstaja tudi t. i. vmesno stanje (tekoče urejeno stanje, »liquid-ordered«, opazna je lateralna difuzija), katere nastanek inducira holesterol in s tem lahko prepreči fazne prehode (11). Za prehod iz trdne v tekočo fazo je odločilna tranzicijska temperatura, najvišjo imajo glikos-fingolipidi, najnižjo pa fosfatidilholin s pretežno nenasičenimi vezmi (3, 28). Tudi rafti se med seboj lahko ločijo po lastnostih, značilnih za membrane, na prehode med fazami pa vpliva koncentracija holesterola, ki hkrati vpliva tudi na samo tvorbo le-teh (3, 29, 30). Dokazano je, da holesterol povečuje delež gel oz. urejene faze (29), hkrati pa ima preferenco za nasičene lipide (10, 28). Vendar v večini naj bi bili rafti sestavljeni iz urejene faze, ki jo obdajajo bolj fluidne domene z večjim deležem nenasičenih maščobnih kislin (28-30). Ce je približno 47 % membrane v gel stanju, se ob dodatku okoli 20-30 % holesterola urejene domene med seboj povežejo, neurejene pa ločijo, tako lahko minimalne spremembe vhomeostazi holesterola močno vplivajo na zgradbo membrane (29).
Stabilnost raftov je vprašljiva, kajti zelo hitro pride do izmenjav med deli membrane. To bi lahko tudi imelo vlogo pri celičnem signaliziranju (3, 31). Poudariti je treba, da je večina študij narejena na modelnih membranah.
OOOOOC OOOOOO_____
^UO^OQPOOO x <
Slika 2. Prikaz rafta v lipidnem dvosloju.
6
Elektronska paramagnetna resonanca
Elektronska paramagnetna resonanca (EPR) je spektroskopska metoda, s katero lahko zaznavamo paramagnetne centre v snovi. To so prosti radikali, ioni prehodnih elementov (Cu2+, Fe3+, Co2+..., običajno kofaktorji encimov) in umetno pripravljeni spinski označevalci (angl. spin labels). Paramagnetni centri nam omogočajo, da z EPR-metodo opazujemo biokemične procese, degenerativne spremembe v živih tkivih. Mi smo opazovali fluidnost membran eritrocitov.
Osnova EPR-metode je spin elektrona, ki opredeljuje vrtenje elektrona okoli svoje osi in s tem ustvarja okoli sebe magnetno polje. Elektron je tako kot majhen magnet z magnetnim momentom vzporednim osi vrtenja. V biokemičnih snoveh so elektroni večinoma združeni v pare in so tako brez magnetnih momentov. Pri lihem številu elektronov magnetni moment ostane in take molekule imenujemo paramagnetne, mesto v molekuli, kjer je nesparjen elektron pa paramagnetni center.
Ko damo snov s paramagnetnimi centri v magnetno polje, interreagirajo magnetni momenti prej poljubno usmerjenih elektronov z magnetnim poljem. Elektroni se sedaj obrnejo paralelno in antiparalelno glede na magnetno polje, le-ti pa imajo nekoliko drugačno energijo. To energijsko razliko merimo z metodo EPR.
Ce pa delujemo na to magnetno polje še z energijo elektromagnetnega valovanja (EMV), ki je enaka energijski razliki med nivojema, preidejo elektroni iz enega energijskega nivoja na drugega, posledica tega pa je absorb-cija EMV, ki jo zaznavamo z metodo EPR.
Spinski označevalec za proučevanje bioloških membran se vgradi v membrano in izbiramo jih tako, da je po zgradbi in kemičnih lastnostih čimbolj podoben maščobnim kislinam, saj bo le-tak najbolje pokazal spremembe v lipidnem dvosloju. Je »sredstvo« za oceno viskoznosti lipidov v membrani. Pri naši raziskavi smo uporabili MeFASL (5-dok-sil metilester palmitinske kisline 10,3).
Iz dobljenega spektra (slika 3) lahko razberemo za fluidnost pomemben ureditveni parameter (S) in rotacijski korelacijski čas (tc). Nizka urejenost in hitra dinamika pomenita veliko fluidnost. Parameter S pove povprečni odklon acilnih verig od normalnega dvoslo-ja; ima vrednosti od 0 (nepopolna ureditev, npr. neviskozna tekočina) do 1 (popolna ureditev). Parameter Tc pa sporoča čas, v katerem molekule pozabijo svoje prvotno mesto; ima vrednosti od 10-11 do 10-9 s pri hitri dinamiki (večja fluidnost) in okoli 10-7 s pri počasni (manjša fluidnost) (32).
Spremembe eritrocitne membrane pri rakavih bolnikih
Celotni holesterol, LDL, HDL, TGC pri rakavih bolnikih
Rakavi bolniki naj bi imeli zmanjšano serumsko koncentracijo holesterola (23, 33-36). To je bolj izraženo pri mlajših bolnikih in pa moških (35, 37). Vzrok bi lahko bila povečana poraba holesterola zaradi pospešene sinteze membran tumorskih celic zaradi rasti in razmnoževanja (23). Uničenje membran z lipidno peroksidacijo lahko kompenzatorno povzroči večjo uporabo holesterola za sintezo membran (34). Lahko pa gre za povečano aktivnost LDL-receptorjev na tumorskih celicah (35, 36).
Slika 3. Primer tipi~nega spektra eritrocitnih membran.
Možno je tudi, da bi bil znižan holesterol dejavnik tveganja za raka (34, 36, 37). Tako se postavlja vprašanje, ali je hipoholesterole-mija vzrok ali posledica raka.
Saturacijski indeks
Saturacijski indeks (SI) je razmerje med koncentracijo stearinske (18:0) in oleinske (18:1 A9) kisline v membrani. Pri tem je pomemben encim A9-desaturaza, ki pretvori stearinsko kislino v oleinsko (23, 38, 39). Na ta encim in s tem na SI vpliva več dejavnikov: prehrana (delež nasičenih, nenasičenih maščobnih kislin, koncentracija holesterola, ogljikovih hidratov), hormoni (estrogeni, testosteron, insulin), stradanje, virusi, interferon... (23, 38-41).
Manjši SI pomeni večjo fluidnost membrane (23, 38, 39). V večini gre za relativni porast oleinske kisline in tako zvečanje deleža nenasičenih maščobnih kislin. Nenasičene maščobne kisline so tudi zelo dovzetne za proste radikale, ki imajo pomembno vlogo pri kancerogenezi in spremembi fluidnosti (glej spodaj), tako bi lahko le-te še pospešile siceršnje učinke lipidne peroksidacije (42). SI je manjši pri eritrocitih pri kolorektalnem in pljučnem karcinomu, limfomu, levkemiji, kar-cinomu žolčnika, jeter, dojke, prostate (23, 38, 39, 41-46). Z lipidno ekstrakcijo eritrocitnih membran so določili SI več kot 1,0 pri zdravih kontrolah in bolnikih po uspešni odstranitvi tumorja in SI manj kot 1,0 pri rakavih bolnikih in bolnikih s ponovitvijo (23). Nižje SI imajo bolj napredovali tumorji in kahektični bolniki, vendar kaheksija ne povzroča desa-turacije (23, 47). Vzrok tem spremembam bi lahko bili razni dejavniki (rastni faktor, DPF -desaturationproducing factor), ki jih izločajo tumorske celice in prav tako vplivajo na zmanjšano fluidnost tumorskih celic samih (23, 47). Tako bi bil lahko SI diagnostični označevalec tumorja in tudi znanilec ponovitve (23, 38-40, 45, 47). Vsekakor spremembe SI kažejo na sistemski učinek rakavega obolenja (46).
Mnogi avtorji dvomijo o zanesljivosti znižanega SI eritrocitnih membran pri rakavih obolenjih, kajti poleg zgoraj naštetih dejavnikov vplivajo na SI tudi starost, spol, sladkorna bolezen, druge presnovne bolezni, uporaba
metode za analizo maščobnih kislin, čas od odvzema krvi do analize (48-50). Nekatere raziskave niso dokazale spremenjenega SI pri bolnikih z rakom in zdravih kontrolah.
HIPOTEZI
Predpostavljali smo, da bodo imeli rakavi bolniki nižje koncentracije serumskih holesterolov kot zdrave kontrole. Posledično naj bi imele eritrocitne membrane rakavih bolnikov večjo fluidnost kot membrane eritrocitov zdravih kontrol.
METODE
Bolniki in kontrolna skupina
V prospektivno raziskavo smo vključili 49 bolnikov z rakom in 20 zdravih kontrol. Bolniki so bili operirani zaradi tumorja na Kliniki za torakalno kirurgijo Kliničnega centra v Ljubljani v času od 22.11.2002 do 14.4.2004.
V	preiskovalni skupini je bilo 39 moških in 10 žensk, starih od 33 do 85 let. 28 bolnikov je imelo karcinom pljuč: devet stadij I, pet stadij II, devet stadij III, trije stadij IV, v dveh primerih pa stadij ni bil določen (NS). 10 bolnikov je imelo karcinom požiralnika: dva stadij I, eden stadij II, dva stadij III, eden stadij IV in štirje NS. Karcinom želodca je imelo 6 bolnikov: dva stadij III, eden stadij IV in trije NS.
V	kontrolni skupini je bilo 8 moških in 12 žensk, starih od 23 do 55 let.
Jemanje vzorca
Bolnikom smo na dan operacije ali dan prej vzeli dva vzorca s 5 ml krvi iz kubitalne vene: en vzorec smo imeli za meritev z EPR-me-todo, drugemu pa so v laboratoriju Kliničnega inštituta za klinično kemijo in biokemijo v Kliničnem centru določili koncentracije celotnega serumskega holesterola, HDL, LDL in TGC. V čim krajšem možnem času (najkasneje dve uri) po odvzemu krvi smo z EPR-metodo na Inštitutu Jožef Štefan (IJS) izvajali meritve. Kontrolni skupini nismo merili koncentracij celotnega holesterola, HDL, LDL in TGC, saj smo menili, da so v mejah normale glede na zdravo splošno stanje.
8
MeFASL		
CH3(CH2^0	C -	(CH2)3 cooch3
0 1		\ K —O 1
Slika 4. Struktura MeFASL-a.
Priprava vzorcev in EPR-spektroskopija
Postopek priprave osnovnega vzorca eritrocitov za merjenje v EPR-spektrometru
Za vsak vzorec smo pripravili dve paraleli. Z večkratnim centrifugiranjem in pufranjem smo se trudili dobiti čimbolj koncentrirane in očiščene eritrocite. Nato smo dodali spinski označevalec MeFASL 10.3 (slika 4) in težili k temu, da bi se čimbolj vgradil v eritrocitno membrano. Na koncu smo eritrocite iz epruvete posesali v kapilaro, jo zamašili z umetno maso in s tem je bil vzorec pripravljen za merjenje v EPR-spektrometru.
Postopek priprave vzorca eritrocitov z dodanim holesterolom
Holesterol smo dodajali z namenom, da bi prikazali razliko v spektru na račun zvečane oz. zmanjšane fluidnosti membrane. Seveda se je moral holesterol čimbolj vgraditi v membrano eritrocitov. Za ta poskus smo vzeli eritocite petih zdravih ljudi, le-tem pa smo kasneje tudi ekstrahirali holesterol in skušali določiti količino vgrajenega holesterola (glej spodaj). Vzorec smo najprej pripravili po zgoraj opisanem načinu. Pravtako smo imeli dve kontroli. Eni smo dodali le 10 |ll kloroforma, drugi 10 |il 0,5 M holesterola, raztopljenega v kloroformu. Vsako smo nato ročno mešali, centrifugirali, odstranili supernatant in posedek z eritrociti posrkali v kapilaro, da je bil pripravljen za EPR-spektroskopijo.
Izolacija holesterola iz eritrocitnih membran
Poskus smo opravili na Inštitutu za biokemijo Medicinske fakultete. Delali smo po protokolu Bligh-Dyer (51). Izolacijo smo naredili na _
9
c
b
a
3380	3400	3420	3440	3460
[G]
Slika 5. Primeri spektrov pri različnih temperaturah (a=4°C, h=2l °C, c=37°C); na spektru »b« so označeni parametri, ki smo jih merili, in sicer: Hl, H3, hl, h0, h-l, AH0,2A|| 2Ar Za razlago parametrov glej sledeče besedilo.
vzorcih 5 zdravih kontrol, kjer smo po zgoraj opisanem načinu dodali kloroform oziroma holesterol, raztopljen v kloroformu (0,5 M). S pomočjo spektrofotometrije smo ločeno določevali koncentracijo holesterola in pro-teinov v eritrocitnih membranah. Proteine smo v vseh vzorcih določili z namenom, da je bilo sploh umestno računati koncentracijo holesterola v membrani, kajti dejanskega števila eritrocitov v vzorcu nismo mogli poznati. Tako smo na podlagi razmerja holesterol/pro-teini sklepali na koncentracijo holesterola v membrani.
Merjenje in analiza EPR-spektrov
Uporabili smo Bruker ESP 300 spektrometer. Pogoji meritev so bili naslednji: modulacijska amplituda 1 G, modulacijska frekvenca 100 kHz, mikrovalovna moč 20 mV, mikrovalovna frekvenca 9,61 GHz, ojačanje običajno 8 x 103, temperatura 4 °C, 21 °C in 37 °C.
EPR-spekter je superpozicija več spektrov (v našem primeru 10), ki pripadajo spinske-mu označevalcu.
Iz oblike spektra (slika 5) lahko ocenjujemo fluidnost membran.
Iz spektra smo s pomočjo programa na EPR-spektrometru določili naslednje parametre: A | |, A±, AH0, h_1, H1, H3 (H13), h0, h1
(h1-h0). Nato smo s pomočjo enačbe izračunali empirični korelacijski čas (tc) in razliko med maksimalnim in minimalnim hiperfinim razcepom (A | | - A±), ki korelira z ureditvenim parametrom (S). Kot smo že omenili, nizka urejenost in hitra dinamika pomenita veliko fluidnost. Parameter S pove povprečni odklon acilnih verig od normalnega dvoslo-ja. Parameter Tc pa sporoča čas, v katerem molekule pozabijo svoje prvotno mesto; ima manjše vrednosti pri hitri dinamiki (večja fluidnost) in večje vrednosti pri počasni (manjša fluidnost) (32).
Za izračun je potrebna naslednja enačba:
Tc = kAH0(h0/h-1- 1)1/2
Konstanta k je odvisna od polarnosti okolice spinskega označevalca, znaša 5,93 x 10-10.
Parameter H13 odraža razmerje med bolj in manj fluidnimi regijami v tkivu. H1 ponazarja regijo z najmanjšo fluidnostjo, H3 pa z največjo. Visok H13 kaže na tkivo z veliko fluidnimi domenami (21).
REZULTATI
Parametre, ki opisujejo fluidnost membrane in smo jih razbrali iz spektrov smo primerjali glede na naslednje kategorije.
celokupni holesterol (m mol/l)
Slika 6. Tcv odvisnosti od celokupnega holesterola.
starost (leta)
Slika 7. H13 vodvisnosti od starosti bolnikov
EPR-znacilnosti s kontrolami
primerjava
Parametri, določeni iz EPR-spektrov, ki opisujejo fluidnost eritrocitnih membran (H13, A | | - A± pri 4 °C, A|| - A±pri 21 °C in Tc [ns]), niso pokazali statistično značilne razlike med skupino bolnikov in zdravimi kontrolami.
EPR-znacilnosti in celokupni serumski holesterol, HDL, LDL in TGC
Bolnike smo glede na celokupni holesterol in glede na LDL razdelili v tri skupine glede na normalno, povišano oziroma znižano koncentracijo holesterola. Glede na HDL-vrednosti smo bolnike razvrstili v dve skupini, saj nihče od njih ni imel povišanega HDL; glede na TGC pa smo jih razdelili na tiste s povišano in tiste z normalno koncentracijo TGC.
Nismo dokazali statistično pomembnih razlik v fluidnosti (primerjava parametrov H13, A | | - A± pri 4 °C, A | | - A± pri 21 °C in Tc [ns]) med kontrolno skupino in zgoraj opisanimi posameznimi skupinami bolnikov glede na celokupni serumski holesterol, LDL, HDL in TGC.
Po Pearsonovi korelacijski metodi pa se je pokazala statistično pomembna povezava
med celokupnim holesterolom, LDL, HDL in Tc. Izkazalo se je, da Tc pada z naraščanjem koncentracije celokupnega holesterola (slika 6), LDL, HDL. Za TGC to ne drži.
EPR-znacilnosti in starost bolnikov
Po Pearsonovi korelacijski metodi smo primerjali EPR-parametre in starost bolnikov. Parameter H13 je v povezavi s starostjo, in sicer se z naraščajočo starostjo veča, kar prikazuje tudi slika 7.
EPR-znacilnosti in stadiji
Statistično pomembna je razlika A y - A± pri 21 °C, ki kaže, da ta parameter narašča z višjim stadijem (stadij I, II glede na stadij III, IV). Drugi parametri ne pokažejo pomembnih razlik pri višjih stadijih.
Razlicni tumorji, njihovi stadiji in vrednosti serumskih holesterolov
Primerjava med serumskimi holesteroli pri treh pogostejših tumorjih, pri katerih smo delali raziskavo, je pokazala, da med tumorjem želodca in požiralnika ni bistvene razlike v koncentraciji serumskih holesterolov,
medtem ko obstaja statistično značilna razlika med pljučnimi tumorji na eni strani ter tumorji želodca in požiralnika na drugi. Pri pljučnih tumorjih smo opazili večje koncentracije celokupnega holesterola, LDL in TGC. Vrednosti HDL ne pokažejo značilne razlike.
Glede na stadij smo bolnike razvrstili v dve skupini (stadij I, II in stadij III, IV). Statistično pomembna razlika se pokaže pri celokupnem holesterolu, HDL in pri LDL in kaže, da imajo ti holesteroli nižje vrednosti pri višjih stadijih. Pri TGC razlika ni značilna.
Dodatek holesterola eritrocitom
Izbrali smo 5 posameznikov, jim vzeli vzorce krvi in jim dodali holesterol v koncentraciji 0,5 M. Relativen porast holesterola v eritrocitih kaže zvišano razmerje med holesteroli in proteini (protokol Bligh-Dyer). Ta porast smo primerjali s t . t z dodatkom holesterola statistično značilno pade, kar pomeni, da membrana postane bolj fluidna.
RAZPRAVA
Ali ima holesterol utrditveni učinek
Raziskave kažejo, da imajo rakavi bolniki znižane vrednosti serumskih lipoprotei-nov (7, 34, 40). To je potrdila tudi naša raziskava. Ker se vzpostavlja ravnotežje med lipoproteini in eritrocitno membrano, ki temelji na uravnoteženem razmerju med holesteroli in fosfolipidi (5), smo sklepali, da imajo rakavi bolniki znižano razmerje holeste-rol/fosfolipidi v eritrocitni membrani, kar bi po dosedanjih dognanjih pomenilo večjo fluidnost eritrocitne membrane (13). Tega pa naša študija ni potrdila. Izkazalo se je, da empiričen parameter Tc z naraščanjem celokupnega holesterola v serumu pada, kar kaže na povečano fluidnost. To si lahko razlagamo z dvema teorijama: prva temelji na spremenjeni presnovi lipidov pri rakavih bolnikih, po drugi pa holesterol v visokih koncentracijah nima utrditvenega učinka, ampak deluje ravno obratno. To teorijo bomo razložili s teorijo o domenski zgradbi membrane.
Koncentracija serumskega holesterola in fluidnost eritrocitnih membran pri rakavih bolnikih
Pri rakavih bolnikih pride do sprememb v presnovi lipidov (48). Te spremembe so slabo definirane, vendar je zanimivo opažanje pri kolorektalnem karcinomu, kjer naj bi bili povišani serumski holesteroli in trigliceridi vzrok za nastanek tumorja in naj bi bili posledica povečanega vnosa visoko nasičenih maščob (40). Tako opisujejo visoke vrednosti holesterolov in trigliceridov v začetku bolezni, ki se ne spremenijo, dokler gre za carcinoma in situ, ter znižanje holesterolov v napredovalih stadijih (33). Znižanje si razlagajo s povečano aktivnostjo LDL-recep-torjev. Ta aktivnost je velika predvsem na tumorskih celicah, ki naj bi za svojo delitev porabile veliko holesterola, hkrati pa ga potrebujejo za tvorjenje veziklov, s katerimi odplavljalo antigene (52). Drugi avtorji opisujejo, da naj bi prišlo do povečane porabe holesterola v perifernih tkivih na račun večje okvare membran kot posledice lipidne perok-sidacije, ki je spremljevalec rakotvorb zaradi tvorbe prostih radikalov. Produkti lipidne peroksidacije namreč prehajajo iz mesta nastanka v kri po telesu (53). Celice za novo biogenezo potrebujejo več holesterola (34). Od tod prva teorija o hipoholesterolemiji pri rakavih bolnikih, po kateri naj bi bila hipoho-lesterolemija posledica tumorja. Za to govori tudi reverzibilnost znižanih koncentracij celotnega holesterola in LDL ob uspešnem zdravljenju s kemoterapijo (35). Ker pa predstavlja hiperholesterolemija visoko tveganje za srčno-žilne bolezni in ker za temi boleha kar polovica prebivalstva razvitega sveta, se postavlja druga teorija, po kateri naj bi bila hipoholesterolemija predhodna rakotvorbi, saj naj bi ljudje z nizkimi vrednostmi holesterola v krvi živeli dlje, s starostjo pa se možnosti za razvoj raka večajo (35, 37). Vsekakor naj bi bile nizke vrednosti holesterola povezane z večjo umrljivostjo in nekateri celo menijo, da bi bil znižan holesterol v krvi lahko indikator za novotvorbo (34, 37).
Naša študija je pokazala, da imajo bolniki v napredovalem stadiju znižane vrednosti celokupnega holesterola, HDL in LDL ter da
TGC niso pomembno spremenjeni. To je v skladu z drugimi raziskavami (34, 37, 40). Ceravno je LDL glavni prenašalec holesterola, pa so pri rakavih bolnikih znižane tudi vrednosti HDL, zmanjšanje le-tega se tudi smatra kot napovednik raka.
Vendar vsi tumorji niso povezani z nizkimi vrednostmi holesterola. Pomembna izjema je karcinom dojke, kjer je opaziti povišane vrednosti celokupnega holesterola, LDL in TGC. Razlog naj bi bila večja incidenca tumorja pri debelih ženskah in povečan vnos maščob s hrano (35).
Vsi tumorji tudi ne vplivajo enako na organizem. Zato nas je zanimalo, kakšne so razlike med različnimi vrstami tumorjev glede na vrednosti serumskega holesterola. Ker smo imeli že tako majhen vzorec bolnikov (49), smo izbrali le tri najpogostejše tumorje -karcinom pljuč (28 bolnikov), požiralnika (10 bolnikov) in želodca (6 bolnikov). Prikazali smo, da imajo bolniki s karcinomom požiralnika in želodca precej nižje vrednosti celokupnega holesterola, LDL in trigliceridov kot bolniki s karcinomom pljuč. Ta opažanja si razlagamo kot razlike zaradi izpostavljenosti različnim kancerogenom v dveh ločenih organskih sistemih - prebavila in dihala. V pljuča lahko prihajajo snovi iz zraka, vendar se le delci, veliki od 0,5 do 2,5 |im, ustavijo valveolih (54). Med najpomembnejše kance-rogene v dihalih štejemo sestavine cigaretnega dima, ki se sicer lahko nalagajo tudi v prebavila. V prebavni trakt pa pridejo najrazličnejši kancerogeni s hrano. Seveda pa je treba vzeti v zakup tudi dejstvo, da vzorci niso bili enako veliki in da temelji naša domneva na majhnih vzorcih.
Zaradi sistemskega vpliva raka na telo se zdi verjetno, da bi bil lahko spremenjen tudi izmenjevalni sistem med lipoproteini in eritrocitno membrano in torej vrednosti serumskih holesterolov ne bi odražale količine holesterola v eritrocitih (40-42). Poleg tega bi bile lahko zaradi spremenjenega metabolizma lipidov spremenjene (zvišane) tudi koncentracije sfingomielina v eritro-citni membrani. To bi bilo v skladu z zgoraj omenjenimi fluidizirajočimi učniki holesterola na lipidne dvosloje, zgrajene iz sfingomie-lina.
Dejavniki, ki bi pri na{ih rakavih bolnikih lahko vplivali na spremenjeno fluidnost eritrocitnih membran
Reaktivne kisikove spojine
V organizmu rakavega bolnika naj bi bilo več prostih radikalov, ki povzročajo lipidno peroksidacijo (LP), le-ta pa zmanjša fluidnost membran, poveča propustnost, inaktivira membranske encime in povzroči pomanjkanje esencialnih maščobnih kislin v membrani (53). Zaradi povečane permeabilnosti prosti radikali okvarjajo tudi hemoglobin, tako da ga pretvorijo v methemoglobin, ki nadaljnje povzroča LP, in začaran krog je sklenjen (55). Eritrocitne membrane so še posebej dovzetne za proste radikale zaradi stalne izpostavljenosti kisiku in pa tudi velike vsebnosti polinenasičenih maščobnih kislin (53, 56). Koncentracija lipoproteinov v krvi naj bi tudi vplivala na količino prostih radikalov: LDL so zelo dovzetni za oksidacijo in tako višja koncentracija le-teh pripomore k večji LP. HDL imajo nasprotni učinek in preprečujejo LP in delujejo kot antioksidant (57). Zanimiva je 13 raziskava z ozonom, ki je močan vir prostih radikalov in kaže, da ima ozon pri nizkih koncentracijah rigidizirajoč učinek na eritrocitno membrano, pri velikih pa fluidizirajoče-ga (58). V fizioloških razmerah sicer verjetno koncentracije prostih radikalov nikoli ne dosežejo takih vrednosti, kot so jih v opisanem poizkusu.
Starost bolnikov
S staranjem organizma se tudi eritrociti spreminjajo, in sicer se spremeni njihova oblika, deformabilnost, fragilnost in tudi fluidnost njihovih membran (59). Staranje eritrocitov lahko razumemo na dva načina, in sicer kot življenjski cikel posameznega eritrocita, ki traja približno tri mesece, ter kot spremembe na eritrocitih zaradi starega eritropoetskega sistema. V prvem primeru gre za zmanjšano fluidnost membran starejših eritrocitov predvsem na račun zmanjšanega razmerja lipidi/proteini, zmanjšane vsebnosti ATP-ja (ki naj bi bil pomemben za interakcijo pro-teinov in lipidov) in spremenjene oblike eritrocitov (17). V drugem primeru pa je
zmanjšana fluidnost povezana z zmanjšanim razmerjem fosfatidilserin/sfingomielin, kar poveča togost. Prav tako pa na spremembe v membrani vpliva LP, ki ima tudi v starosti velik pomen in prispeva k bolj togi membrani (59). S starostjo se kopičijo v telesu prosti radikali, poleg tega se poveča občutljivost eri-trocitnih membran na oksidativni stres. To v prvi vrsti okvarja lipide, vendar ti lipidi povzročijo tudi strukturne spremembe na sosednjih proteinih, zaradi česar pride do povezovanja med proteini, fragmentacije in oblikovanja proteinsko-lipidnih domen (60).
V naši raziskavi se je izkazalo, da se s starostjo povečuje parameter H13, ki je empiričen parameter, ki določa razliko v fluid-nosti med različnimi membranskimi domenami (24). Ostali parametri fluidnosti niso pokazali pomembnejše povezave s starostjo. H13 je najbolj odvisen od razmerja med holesteroli in fosfolipidi v membrani, stopnje nenasičenosti fosfolipidnih acilnih verig in količine in razporeditve membranskih protei-nov (26). S starostjo naj bi se povečala količina holesterola v membrani, prav tako tudi fosfolipidov, vendar naj bi njuno razmerje ostalo bolj ali manj nespremenjeno (61). Nenasičene acilne verige imajo v membrani fluidizirajoč učinek (22), povečana količina transmembranskih proteinov pa ima za posledico ustvarjenje proteinsko-lipidnih domen, ki zmanjšajo dinamiko membrane (16). Iz naštetega lahko sklepamo, da na naraščanje H13-parametra pri naših bolnikih in s tem na razliko v fluidnosti različnih domen najpomembneje vpliva obilnejše nastajanje protein-sko-lipidnih domen.
Spremljajoce bolezni
Izrednega pomena so tudi spremljajoča obolenja. Imamo podatke o predhodnih tumorjih (13 bolnikov), o srčno-žilnih boleznih (ki so tudi splošno v populaciji zelo pogosta, 12 bolnikov) ter o kajenju (21 bolnikov). Kar se tiče arterijske hipertenzije, ki je najbolj pogost spremljevalec (vzrok?) srčno-žilnim boleznim, raziskave kažejo, da bi bil vzrok lahko tudi sama spremenjenost eritrocitne membrane. Izkazalo se je namreč, da imajo bolniki z arterijsko hipertenzijo manj fluidne membrane (62). Kajenje pomembno vpliva na koncentracije serumskih holesterolov, in sicer
naj bi veljalo obratno sorazmerje (33, 34). Vendar raziskave kažejo, da kadilci pojedo več nasičenih maščob, zaradi česar se jim vrednosti LDL ne spremenijo pomembno. HDL pa so nižji tako pri aktivnih kot pasivnih kadilcih (34, 37). Pri sladkorni bolezni tipa II se zaradi sprememb v koncentraciji palmitinske, stearinske (znižani) in oleinske, linolenske (povišani) kisline spremeni fluidnost, kar vodi v manjšo deformabilnost eritrocita in zaradi tega do večjih patoloških sprememb drobnega žilja (63).
Zdravila
Statini povečajo fluidnost membran in tudi na ta način potencirajo antiaterogeni učinek zdravila (19, 20). Hormonsko nadomestno zdravljenje pri pomenopavzalnih ženskah poveča fluidnost eritrocitnih membran ter s tem deluje antihipertenzivno (62). Zdravljenje z antioksidantom etretinatom je izboljšalo fluidnost ne le zaradi zmanjšane količine prostih radikalov, ampak tudi zaradi neposrednega fluidnega učinka na membrano (64). Tudi zloraba alkohola zvišuje fluidnost eri-trocitnih membran (65).
So lipidni rafti odgovor na presentljiv rezultat
Temelj naše študije in z njo povezana hipoteza je, da naj bi se zaradi znižanih vrednosti serumskih holesterolov pri rakavih bolnikih zmanjšala tudi vsebnost holesterola v eritro-citnih membranah in s tem naj bi se povečala njena fluidnost. Ker so naši rezultati v nasprotju s splošno poznano tezo o vlogi holesterola, smo naredili preizkus, v katerem smo eritrocitom dodali holesterol, raztopljen v kloroformu. S tem smo želeli ugotoviti, ali je res dodatek holesterola tisti, ki zvišuje fluidnost, ali pa gre za nek drug mehanizem. S preizkusom smo ugotovili, da tudi dodatek holesterola zviša fluidnost.
Razlago za tovrstne rezultate vidimo v domenski strukturi membrane. Temelj za nastanek lipidnih domen so tekoče lipidne faze, ki so tri: fosfolipidna faza, holesterolna faza in faza kondenziranih kompleksov (ta je bogata tako s holesteroli kot s fosfolipidi). Kondenzirani kompleksi naj bi bili osnova za tvorbo raftov (27), le-ti so domene urejenih
Tabela 1. Membranske karakteristike štirih domen.
		Domena 1	Domena 2	Domena 3	Domena 4
Ureditveni parameter (S)	Spekter 1	0,121	0,15	0,58	0,32
	Spekter 2	0,121	0,178	0,58	0,312
Rotacijski korelacijski čas (tc)	Spekter 1	2,0	0,3	0,5	1,8
	Spekter 2	2,0	0,2	0,5	1,8
Prostorska konstanta (W)	Spekter 1	0,2	1,5	2,8	0,2
	Spekter 2	0,2	1,5	2,8	0,2
Polarni korekcijski faktor (pa)	Spekter 1	1,00012	1,00028	0,999967	1,00004
	Spekter 2	0,00012	1,00028	0,99997	1,00007
Masa domene (d)	Spekter 1	0,07	0,02	0,61	0,29
	Spekter 2	0,07	0,056	0,61	0,26
lipidov (30) in so obdani z bolj neurejenimi deli membrane (29). Holesterol je eden najpomembnejših dejavnikov v tvorbi domen (27, 30). Dokazana je tvorba raftov v eritro-citnih membranah (12) in v fizioloških razmerah (30). Povišan holesterol naj bi povečal trdnost membrani, zmanjšal propustnost in pri tem ohranjal fluidnost, izkaže pa se, da holesterol lahko naredi tekoče bolj trdno in trdno bolj tekoče, zveča urejenost tekoči fazi, zmanjša urejenost gel fazi (11, 66). Holesterol zmanjša fluidnost umetno pripravljenim lipid-nim dvoslojem iz možganskega fosfatidilholina in zveča fluidnost dvoslojem, pripravljenim iz možganskega sfingomielina. Preprečeval naj bi fazno ločevanje v gel in tekočo fazo in bi lahko pretvoril obe v vmesno fazo - teko-
čo urejeno fazo (29). Možno je, da je več tipov raftov (30).
Zaradi različnih domen v membrani smo predpostavljali, da se holesterol ne vgrajuje v vse domene enakomerno in smo na podlagi tega naredili preizkus s simulacijo spektrov. EPR- spekter je sestavljen iz več spektralnih komponent, ki ustrezajo membranskim domenam. Za simulacijo potrebujemo naslednje parametre za vsako spektralno domeno: S - ureditveni parameter, Tc - rotacijski korekcijski čas, W - prostorska konstanta, pa - polarni korekcijski faktor in d - masni faktor (67). Primerjali smo dva spektra (tabela 1, slika 8), ki se razlikujeta v fluidnosti. Spekter smo opisali s štirimi komponentami (domenami), dve sta bolj rigidni (domena 3,4), dve
15
Eksperimentalno določen in preračunan spekter	Eksperimentalno določen in preračunan spekter
Slika 8.	Spekter 1
Spekter 2
domeni pa sta bolj fluidni (domena 1,2). Izkazalo se je, da se bistveno spremeni sestava domene 2, ki se poveča, hkrati pa se poveča tudi njena urejenost, vendar ne za toliko, kolikor se poveča velikost domene. Velikost domene 4 pa se zmanjša, nekoliko se zmanjša tudi njena urejenost. Predvidevamo lahko, da se holesterol vgrajuje v manj fluidno od bolj fluidnih domen (domena 2) ter poveča velikost bolj fluidnih domen. Tako si razlagamo, da pride do povečane fluidnosti pri višjih serumskih holesterolih.
Napake in uporabnost študije v bazni in klinični znanosti
Izbira skupine bolnikov in kontrolne skupine
Pri izbiri kontrolne skupine smo želeli imeti zdravo skupino posameznikov, brez kroničnih bolezni, brez rednega zdravljenja in z vrednostmi serumskih holesterolov v mejah normale. Starost smo pri tem manj upoštevali (kontrolna skupina je bistveno mlajša od skupine bolnikov), toda le-ta se je izkazala za pomemben dejavnik. Tudi razmerje med moškimi in ženskami v kontrolni skupini ni v skladu s skupino bolnikov. Vplivu prehrane na koncentracije holesterolov (18, 40, 48), smo se želeli izogniti z jemanjem krvi na teš-če. Skupina bolnikov tudi ni bila homogena glede tipa tumorja. Vse to bi veljalo v prihodnje upoštevati in raziskavo nadaljevati na enem tipu tumorja.
Napaka EPR-metode
EPR-spektroskopija je zelo zamudna metoda. Od odvzema vzorca do obdelave je poteklo različno dolgo časa (od 1 do 2h), kar vpliva na kvaliteto vzorca. V vzorcih so bile lahko prisotne tudi druge celice in nečistoče, kar ima lahko vpliv na obliko spektra. Nekatere raziskave kažejo, da se spinski označevalec ne vgradi enakomerno v membrano (12). Pomembna so tudi nihanja temperature (merili smo pri treh različnih), včasih so bila kar precejšnja in to bi lahko vplivalo na lastnosti eritrocitov v vzorcih. Pri nekaterih vzorcih so bili prisotni šumi, ki so oteževali natančnejše meritve parametrov. Lahko zaključimo, da metoda ni uporabna v klinični praksi.
Biokemijska analiza eritrocitne membrane
V želji, da potrdimo ali ovržemo teorijo, dobljeno na rezultatih, da holesterol v visokih koncentracijah zveča fluidnost eritrocitne membrane, smo izvedli opisani preizkus na 5 zdravih posameznikih. Z dodajanjem holesterola smo hoteli doseči vrednosti, ki naj bi jih imeli bolniki s povišanimi vrednostmi serumskega holesterola. Problem preizkusa je v majhni skupini ter v dejstvu, da je šlo za zdravo skupino. Sama metoda je hitra in enostavna, tako da je uporabna v praksi, zato bi bilo priporočljivo v nadaljnjih študijah te meritve izvajati hkrati z merjenjem fluidnosti z EPR-me-todo. Tako bi dejansko lahko razjasnili povezavo med serumskimi holesteroli in holesterolom v eritrocitni membrani ter fluidnostjo, tako pri zdravih ljudeh kot pri bolnikih z rakom. Menimo, da bi bilo bolje holesterol dodajati v obliki topnega holesterola ali v obliki lipo-somov, LDL-partiklov, saj je kloroform precej močno topilo, hkrati pa pride pri pripravi vzorca do mešanja s pufrom PBS, ki vsekakor ni ugodno okolje za holesterol.
ZAKLJUČEK
Z EPR-metodo nismo potrdili hipoteze o večji fluidnosti eritrocitnih membran ob znižanih koncentracijah serumskega holesterola v krvi rakavih bolnikov. Naši rezultati so pokazali nasprotno, z višanjem koncentracij serumskih lipidov (razen TGC), se veča fluidnost eritrocitnih membran, to pa prav tako potrdi in vitro poizkus z dodatkom holesterola eritrocitim vzorcem.
Potrdili smo statistično značilno znižanje celokupnega serumskega holesterola, HDL in LDL pri rakavih bolnikih v napredovalem stadiju. V napredovalem stadiju smo tudi ugotovili povišanje parametra A y - A± pri 21 °C, kar pa kaže na manjšo fluidnost eritrocitnih membran.
Obstajajo razlike v koncentracijah serumskih lipidov pri različnih vrstah tumorja, tako so pri karcinomu požiralnika in želodca koncentracije relativno precej nižje kot pri karcinomu pljuč.
S starostjo se viša parameter H13, ki kaže na različno fluidnost membrane pri mlajši in starejši populaciji.
Vsekakor je študija pomembnejša s stališ-	bi tudi biokemijska analiza membrane, saj
ca bazne znanosti kot s kliničnega vidika.	brez te lahko le posredno sklepamo na vpliv
Morda bi bilo zaradi pomanjkljivosti EPR-me-	holesterola na fluidnost membrane. Pri štu-
tode smotrno uporabiti še kakšno drugo	diju metabolizma lipidov pri rakavih bolnikih
(fluorescenčna metoda) ter primerjati rezulta-	pa bi bilo potrebno večje poenotenje kar se
te in jih objektivizirati. Problem predstavljajo	tiče vrste tumorja, stadija, prehrane, spola,
različne definicije fluidnosti pri teh dveh	starosti, razvad, spremljajočih bolezni, zdra-
metodah. V prihodnje je nujno, da se upora-	vil, družinske obremenjenosti.
LITERATURA
1.	Cooper GM. The cell surface. In: Cooper GM, ed. The cell: a molecular approach. 1st ed. Washington: ASM Press, Sunderland: Sinauer Associates, Inc; 1997. p. 467-76.
2.	Virtanen. JA, Cheng KH, Somerharju P. Phospholipid composition of the mammalian red cell membrane can be rationalized by a superlattice model. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95 (9): 4964-9.
3.	Vereb G, Szollosi J, Matko J, et al. Dynamic, yet structured: the cell membrane three decades after the Singer -Nicolson model. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100 (14): 8053-8.
4.	Cooper RA. Abnormalities of cell-membrane fluidity in the pathogenesis of disease. N Engl J Med 1977; 297 (7): 371-7.
5.	Cooper RA. Influence of increased membrane cholesterol on membrane fluidity and cell function in human red blood cells. J Supramol Struct 1978; 8 (4): 413-30.
6.	Cooper RA, Leslie MH, Fischkoff S, et al. Factors influencing the lipid composition and fluidity of red cell membranes in vitro: production of red cell possessing more then two cholesterols per phospholipid. Biochemstry 1978; 17 (2): 327-31.
7.	Cooper RA, Durocher JR, Leslie MH. Decreased fluidity of red cell membrane lipids in abetalipoproteinemia. J Clin Invest 1977; 60 (1): 115-21.
8.	Yamaguchi T, Kuroki S, Tanaka M. Effects of temperature and cholesterol on human erythrocyte membranes. J. Biochem (tokyo) 1982; 92 (3): 673-78.
9.	Suda T, Maeda N, Shiga T. Effect of cholesterol on human erythrocyte membrane. A spin labled study. J Biochem (Tokyo) 1980; 87 (6): 1703-13.
10.	Simons K, Ikonen E. How cells handle cholesterol. Science 2000; 290 (5497): 1721-26.
11.	Bloom M. The physics of soft, natural materials. Physics in Canada 1992; 48: 7-16.
12.	Cassera MB, Silber AM, Gennaro AM. Differential effects of cholesterol on acyl chain order in erythrocyte membranes as a function of depth from the surface. An electron paramagnetic resonance (EPR) spin label study. Biophys Chem 2002; 99 (2): 117-27.
13.	Seigneuret M, Zachowski A, Hermann A, et al. Asymmetric lipid fluidity in human erythrocyte membrane: new spin-label evidence. Biochem 1984; 23 (19): 4271-5.
14.	Moore DJ, Gioioso S, Sills RH, et al. Some relationships between membrane phospholipid domains, conformational order, and cell shape in intact humen erythrocytes. Biochim Biophys Acta 1999; 1415 (2): 342-8.
15.	Yawata Y, Miyashima K, Sugihara T, et al. Self-adaptive modification of red-cell membrane lipids in lecithin: cholesterol acyltransferase deficiency. Lipid analysis and spin labeling. Biochim Biophys Acta 1984; 769 (2): 440-8.
16.	Subczynski WK, Wisniewska A. Physical properties of lipid bilyaer membranes: relevance to membrane biological functions. Acta Biochim Pol 2000; 47 (3): 613-25.
17.	Shiga T, Maeda N, Suda T, et al. The decreased membrane fluidity of in vivo aged, human erythrocytes. A spin label study. Biochim Biophys Acta 1979; 553 (1): 84-95.
18.	Prisco D, Rogasi PG, Paniccia R, et al. Age-related changes in red blood cell lipids. Angiology 1991; 42(4): 316-22
19.	Levy Y, Leibowitz R, Aviram M, et al. Reduction of plasma cholesterol by lovastatin normalizes erythrocyte membrane fluidity in patients with severe hypercholesterolemia. Br J Clin Pharmac 1992; 34 (5): 427-30.
20.	Koter M, Franiak I, Broncel M, Chojnowska-Jezierska J. Effects of simvastatin and pravastatin on peroxidation of erytrocyte plasma membrane lipids in patients with type 2 hypercholesterolemia. Can J Physiol Pharmacol 2003; 81 (5): 485-92.
21.	Sok M. Študij fluidnosti celičnih membran pljučnega raka z elektronsko paramagnetno resonanco [disertacija]. Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani; 1995
22.	Shinitzky M. Membrane fluidity in malignancy. Adversative and recuperative. Biochim Biophys Acta 1984; 738 (4): 251-61.
23.	Wood CB, Habib NA, Thompson A, et al. Increase in oleic acid in erythrocytes associated with malignancies. Br Med J (Clin Res Ed) 1985; 291 (6489): 163-5.
24.	Sok M, Šentjurc M, Schara M. Membrane fluidity charcteristics of human lung cancer. Cancer Lett 1999; 139(2): 215-220.
17
25.	Cader AA, Butterfield BA, Watkins BA, et al. Electron spin resonance studies of fatty acid-induced alterations in membrane fluidity in cultured endothelial cells. Int J Biochem Cell Biol 1995; 27 (7): 665-73.
26.	Sok M, Sentjurc M, Schara M, et al. Cell membrane fluidity and prognosis of lung cancer. Ann Thorac Surg 2002; 73(5): 1567-71
27.	Radhakrishnan A, Anderson TG, McConnell HM. Condensed complexes, rafts, and the chemical activity of cholesterol in membranes. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97 (23): 12422-7.
28.	de Almeida RF, Fedorov A, Prieto M. Sphingomyelin/phosphatidylcholine/cholesterol phase diagram: boundaries and composition of lipid rafts. Biophy J 2003; 85 (4): 2406-16.
29.	Crane JM, Tamm LK. Role of cholesterol in the formation and nature of lipid rafts in planar and spherical model membranes. Biophy J 2004; 86(5): 2965-79.
30.	London E. Insights into lipid raft structure and formation from experiments in model membranes. Curr Opin Struct Biol 2002; 12(4): 480-6.
31.	Joly E. Hypothesis: could the signalling function of membrane microdomains involve a localized transition of lipids from liquid to solid state? BMC Cell Biol 2004; 5: 3.
32.	Sentjurc M, Stalc A. Uporaba elektronske paramagnetne resonance v biologiji in medicini. Med Razgl 1976; 15: 259-79.
33.	Yamada K, Araki S, Tamura M, et al. Relation of serum total cholesterol, serum triglycerides and fasting plasma glucose to colorectal carcinoma in situ. Int J Epidemiol 1998; 27 (5): 794-8.
34.	Patel PS, Shah MH, Jha FP, et al. Alterantions in plasma lipid profile patterns in head and neck cancer and oral precancerous conditions. Indian J Cancer 2004; 41 (1): 25-31.
35.	Alexopoulos CG, Blatsios B, Avgerinos A. Serum lipids and lipoprotein disorders in cancer patients. Cancer 1987; 60(12): 3065-70.
36.	Alexopoulos CG, Pournaras S, Vaslamatzis M, et al. Changes in serum lipids and lipoproteins in cancer patients during chemotherapy. Cancer Chemother Pharmacol 1992; 30 (5): 412-6.
37.	Eichholzer M, Stahelin HB, Gutzwiller F, et al. Association of low plasma cholesterol with mortality for cancer at various sites in men: 17-y follow-up of the prospective Basel study. Am J Clin Nutr 2000; 71 (2): 569-74.
38.	Wood CB, Habib NA, Apostolov K, et al. Reduction in the stearic to oleic acid ration in the circulating red blood cells: a possible tumour marker in solid human neoplasms. Eur J Surg Oncol 1985; 11 (2): 167-9.
39.	Wood CB, Habib NA, Apostolov K, et al. Reduction in the stearic to oleic acid ratio in human malignant liver neoplasms. Eur J Surg Oncol 1985; 11 (4): 347-8.
40.	Nicholson ML, Neoptolemos JP, Clayton HA, et al. Dietary and erythrocyte fatty acids in experimental colorectal carcinogenesis. Eur J Surg Oncol 1992; 18 (2): 146-51.
41.	Pala V, Krogh V, Muti P, et al. Erythrocyte membrane fatty acids and subsequent breast cancer: a prospective italian study. J National Cancer Inst 2001; 93: 1088-95.
42.	Pandey M, Sharma LB, Singh S, et al. Erythrocyte membrane fatty acid profile and saturation index in gallbladder carcinogenesis: a case control study. World J Surg Oncol 2003; 1 (1): 5.
43.	Worman CP, Barker WR, Apostolov K. Saturation index of blood cell membrane fatty acids before and after IFN treatment in hairy cell leukemia. Leukemia 1987; 1 (4): 379-82.
44.	Persad RA, Gillatt DA, Heinemann D, et al. Erythrocytes staeric to oleic acid ratio in prostatic carcinoma. Br J Urol 1990; 65 (3): 268-70.
45.	Apostolov K, Barker W, Catovsky D, et al. Reduction in the stearic to oleic acid ratio in leukaemic cells - a possible chemical marker. Blut 1985; 50 (6): 349-54.
46.	Kelly SB, Miller J, Wood CB, et al. Erythrocyte staeric acid desaturation in patients with colorectal carcinoma. Dis Colon Rectum 1990; 33 (12): 1026-30.
47.	Hershman MJ, Habib NA, George CD, et al. Effect of cachexia on lipid saturation of erythrocytes membranes. Curr Surg 1987; 44 (4): 292-4.
48.	Neoptolemos JP, Clayton H, Heagerty AM, et al. Dietary fat in relation to fatty acid composition of red cells and adipose tissue in colorectal cancer. Br J cancer 1988; 58 (5): 575-9.
49.	Neoptolemos JP, Heagerty AM, Nicholson M, et al. Inadequacy of oleic acids in erythrocytes as a marker for malignancies. Br Med J (Clin Res Ed) 1987; 294 (6580): 1157-8.
50.	Lawson N, Taylor AJ, Manche A, et al. Inadequacy of oleic acid in erythrocytes as a marker of malignancies. Br Med J (Clin Res Ed) 1987; 294 (6574): 769.
51.	Zheng YH, Plemenitas A, Linnemann T, et al. Nef increases infectivity of HIV via lipid rafts. Curr Biol 2001; 11 (11): 875-9.
52.	Sentjurc M, Sok M, Sersa G. Plasma membrane fluidity alternations in cancerous tissues. Radiol Oncol 1998; 32(1): 109-17.
53.	Kolanjiappan K, Manoharan S, Kayalvizhi M. Measurment of erythrocyte lipids, lipid peroxidation, antioxidants and osmotic fragility in cervical cancer patients. Clin Chim Acta 2002; 326 (1-2): 143-9.
54.	Speizer FE. Environmental lung diseases. In: Braunwald E, Isselbacher KJ, Petersdorf RG, Wilson JD, Martin JB, Fauci AS, ed. Harrison's principles of Internal medicine 2. McGraw-Hill company; 1988. p. 1068-75.
55.	Della Rovere F, Granata A, Broccio M, et al. Hemoglobin oxidative stressin cancer. Anticancer Res 1996; 15 (5B): 2089-96.
56.	Abou-Seif MA, Rabia A, Nasr M. Antioxidant status, erythrocyte membrane lipid peoxidation and osmotic fragility in malignat lymphoma patients. Clin Chem Lab Med 2000; 38 (8): 737-42.
57.	Ray G, Husain SA. Role of lipids, lipoproteins and vitamins in women with breast cancer. Clin Biochem 2001; 34(1): 71-6.
58.	Gornicki a, Gutsze A. In vitro effects of ozone on human erythrocyte membranes: an EPR study. Acta Bioch Pol 2000; 47 (4): 963-71.
59.	Marin MS, Fernandez A, Sanchez-Yague J, et al. Changes in the phospholipid and fatty acid composition in normal erythrocytes from sheep in different ages. Aminophospholipid organization in the membrane bilayer. Biochimie 1990; 72 (10): 745-50.
60.	Ozaydin B, Onaran I, Avsar K, et al. Relationship between ageing and suceptability to oxidative damage: An assessment by erythrocte membrane proteins and lipids. Turk J Med Sci 2001; 35: 95-101.
61.	Rifkind JM, Araki K, Mohanty JG, et al. Age depended changes in erythrocyte membrane function. Prog Clin Biol Res 1985; 195: 159-72.
62.	Tsuda K, Kinoshita-Shimamoto Y, Mabuchi Y, et al. Hormone replacement therapy improves membrane fluidity of erythrocytes in postmenopausal women: an electron paramagnetic resonance investigation. Am J Hypertens 2003; 16(6): 502-7.
63.	Kulacoglu DN, Kocer I, Kurtul N, et al. Alternations of fatty acid composition of erythrocyte membrane in type 2 diabetes patients with diabetic retinopathy. Jpn J Ophtalmol 2003; 47 (6): 551-6.
64.	Gornicki A, Gutsze A. In vivo and in vitro influence of etretinate on erythrocyte membrane fluidity. Eur J Pharmacol 2001; 423 (2-3): 127-34.
65.	Wrobel A, Kaminska D, Klinger M. Electron paramagnetic resonance study of erythrocyte memebrane fluidity in renal transplant recipients. Transplant Proc 2003; 35 (6): 2230-2.
66.	Koivusalo M. Probing lipid domains in model membranes and in mammalian cells [academic dissertation]. Finland: University of Helsinki; 2004.
67.	Sentjurc M, Strancar J, Koklic T. Membrane domain alternation under the action of biologically active substances: an epr study. Current topics in biophysics 2002; 26 (1): 65-73.
Prispelo 19. 9. 2005