UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA BIOLOGIJO Maja ZOROVIĆ STRUKTURNE IN FUNKCIONALNE ZNAČILNOSTI VIBRACIJSKIH NEVRONOV V TORAKALNIH GANGLIJIH STENICE Nezara viridula (Heteroptera: Pentatomidae) DOKTORSKA DISERTACIJA MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL PROPERTIES OF VIBRATIONAL NEURONES IN THORACIC GANGLIA OF THE STINKBUG Nezara viridula (Heteroptera: Pentatomidae) DISSERTATION THESIS Ljubljana, 2005 ‘Protect me from knowing what I don't need to know. Protect me from even knowing that there are things to know that I don't know. Protect me from knowing that I decided not to know about the things that I decided not to know about.’ Douglas Adams ‘We don't know a millionth of one percent about anything.’ Thomas A. Edison II Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Praktični del doktorske disertacije je bil v celoti opravljen v laboratorijih Oddelka za entomologijo Nacionalnega inštituta za biologijo v Ljubljani. Senat Biotehniške fakultete je za mentorja doktorskega dela imenoval prof. dr. Andreja Čokla. Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: doc. dr. Kazimir Drašlar Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Mentor in član: prof. dr. Andrej Čokl Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za entomologijo Mentor: prof. dr. Dušan Devetak Univerza v Mariboru, Pedagoška fakulteta, Oddelek za biologijo Datum zagovora: 2. november 2005 Disertacija je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Maja Zorović III Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd DK 591.18:595.75(043.3)=863 KG Nezara viridula/žuželke/vibracijska komunikacija/internevroni/receptorske celice AV ZOROVIĆ, Maja, univ. dipl. biol., mag. znanosti SA ČOKL, Andrej (mentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Večna pot 111 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo LI 2005 IN STRUKTURNE IN FUNKCIONALNE ZNAČILNOSTI VIBRACIJSKIH NEVRONOV V TORAKALNIH GANGLIJIH STENICE Nezara viridula (Heteroptera: Pentatomidae) TD Doktorska disertacija OP X, 133 str., 1 tab., 71 sl., 1 pril., 187 vir. IJ sl JI sl/en AI Nevrobiološki nivo vibracijske komunikacije je pri žuželkah, pri katerih komunikacija s signali preko podlage predstavlja primarni komunikacijski kanal, v veliki meri neraziskan. Za osvetlitev mehanizmov centralnega procesiranja vibracijskih signalov in orientacije žuželk na podlagi vibracij smo kot poskusno žival izbrali stenico vrste Nezara viridula (L.), zeleno smrdljivko, pri kateri je vibracijska komunikacija, kot pomemben del paritvenega vedenja, na vedenjskem nivoju že zelo dobro obdelana. Samica in samec producirata vibracijske signale s tresenjem zadka, vibracije pa se nato preko nog prenesejo na rastlino. Tako pri samcih kot pri samicah poznamo več napevov, ki so vezani na specifične vedenjske situacije. Med tem ko mirujoča samica oddaja t.i. samičin pozivni napev (FCS), ji samec odgovarja in se premika proti njej. Komunikacija med njima zahteva razpoznavanje lastne vrste in orientacijo v smeri vira vibracij. V pričujočem delu smo opisali centralno procesiranje vibracijskih signalov ter kodiranje sprememb v časovno-frekvenčni strukturi vibracijskih signalov, do katerih pride med prenosom signalov po rastlinah. Z laserskim vibrometrom smo snemali vibracijske signale FCS na različnih delih rastlin in ti posnetki so sestavljali del stimulacijskega programa, s katerim smo preko računalnika in tresalnika dražili poskusno žival. S tehniko znotrajceličnega odvajanja električne aktivnosti nevronov v centralnih ganglijih in sočasnim ionoforetičnim vnašanjem barvila Lucifer yellow smo identificirali dva morfološka tipa receptorskih nevronov ter devet morfoloških tipov vibracijskih internevronov, med njimi lokalne internevrone, omejene na centralni ganglij, internevrone, podobne DUM celicam ravnokrilcev in vzpenjajoče nevrone, ki nosijo informacijo v možgane. Opisani tipi celic tvorijo dve skupini: nizkofrekvenčne, uglašene na 50 Hz in srednjefrekvenčne, uglašene na 100-300 Hz. Vzdražni prag nizkofrekvenčnih internevronov je višji (10-20 cm/ s2) od srednjefrekvenčnih (0,5 cm/s2). Na podlagi lege vhodnih in izhodnih regij ter latenc odgovorov smo opisali povezljivost identificiranih nevronov in hipotetično živčno mrežo za procesiranje vibracijskih signalov. Z analizo odzivov nevronov na signale FCS smo ugotovili, da so spremembe v amplitudnih razmerjih posameznih frekvenčnih vrhov, do katerih pride med prenosom vibracijskih signalov po rastlini, dovolj velike, da jih živčni sistem zazna. Na osnovi analize prenosa vibracijskih signalov preko križišča in fizioloških lastnosti vibracijskih nevronov sklepamo, da se živali na križišču orientirajo na podlagi časovnih zamikov med receptorji posameznih nog. IV Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 KEY WORDS DOCUMENTATION DN Dd DC 591.18:595.75(043.3)=863 CX Nezara viridula/insects/vibrational communication/interneurones/receptor cells AU ZOROVIĆ, Maja AA ČOKL, Andrej (supervisor) PP SI-1000, Ljubljana, Večna pot 111 PB University of Ljubljana, Biotehnical faculty, Department of biology PY 2005 TI MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL PROPERTIES OF VIBRATIONAL NEURONES IN THORACIC GANGLIA OF THE STINKBUG Nezara viridula (Heteroptera: Pentatomidae) DT Doctoral Dissertation NO X, 133 p., 1 tab., 71 fig., 1 ann., 187 ref. LA sl AL sl/en AB Although communication using vibration signals propagating through the substrate is more widespread among insects than any other form of mechanical signalling, the data on neural processing of these signals is still lacking. Because the behavioural level of vibrational communication for this species has been studied in great detail, the southern green stinkbug, Nezara viridula (L.), was an ideal experimental animal for studying central processing of vibration signals and orientation towards the vibration source. Both the males and females produce vibration signals by vibrating the abdomen and the vibrations are transmitted through their legs to the underlying plant tissue. They produce several songs, differing in temporal parameters, that are related to specific behavioural contexts. While the stationary female is emitting the female calling song (FCS), the male moves towards her, pausing occasionally and emitting the signals of the male calling song. For their communication to be effective, species recognition and orientation of the male towards the vibration source is necessary. In the present thesis we describe central processing of vibration signals and coding of changes in the temporal and spectral structure of the vibration signals that occur with propagation of the signals through plants. Laser vibrometer was used to record signals of the FCS on different parts of the plant and these recordings were a part of stimulation programme designed to vibrate the legs of the experimental animal with a minishaker. Using intracellular recording combined with electrophoretic staining techniques we identified two morphological types of receptor cells and nine types of vibrational interneurones, of which some are local neurones, limited to the central ganglion, some resemble DUM cells of Orthoptera and the rest are mainly ascending interneurones, carrying information to the brain. All identified neurones fall into two distinct groups: the low frequency neurones are tuned to 50 Hz and middle frequency neurons are tuned to 100-300 Hz. The middle frequency interneurones have lower thresholds (0.5 cm/s2) than those tuned to lower frequencies (10-20 cm/s2). The connectivity of the neurones was described through their response latencies and input/output regions and the model neural network for processing vibration signals was proposed. Analysis of the neurones’ responses to the signals of FCS showed that the changes in relative amplitudes of different frequency peaks resulting from propagation of signals through plants are large enough to be detected by the nervous system. Based on analysis of transmission of vibration signals through the crossing point we concluded that the animals orientate using time-of-arrival differences between different receptors rather than intensity differences. V Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ........................................................ III KEY WORDS DOCUMENTATION ................................................................................... IV KAZALO SLIK ................................................................................................................ VIII KAZALO TABEL ................................................................................................................. X 1 UVOD ................................................................................................................................. 1 1.1 KOMUNIKACIJA ŽUŽELK .......................................................................................... 1 1.1.1 Vibracijska komunikacija ......................................................................................... 1 1.2 NEZARA VIRIDULA – ZELENA SMRDLJIVKA ......................................................... 2 1.2.1 Vloga vibracijske komunikacije v paritvenem vedenju stenice N. viridula .......... 3 1.3 RASTLINE KOT MEDIJ ZA PRENOS VIBRACIJSKIH SIGNALOV ....................... 4 1.4 ZGRADBA CENTRALNEGA ŽIVČNEGA SISTEMA ............................................... 5 1.5 VIBRACIJSKI RECEPTORJI ....................................................................................... 6 1.5.1 Zgradba organov ........................................................................................................ 6 1.5.2 Receptorske živčne celice .......................................................................................... 8 1.5.2.1 Delovanje ................................................................................................................. 8 1.5.2.2 Centralne projekcije ................................................................................................ 10 1.6 VIBRACIJSKI INTERNEVRONI .............................................................................. 11 1.6.1 Delovanje .................................................................................................................. 11 1.6.2 Morfologija ............................................................................................................... 13 1.7 ORIENTACIJA ............................................................................................................. 13 1.8 KODIRANJE SPEKTRALNIH IN ČASOVNIH PARAMETROV NARAVNIH NAPEVOV ......................................................................................................................... 15 1.9 NAMEN NALOGE ...................................................................................................... 16 2 MATERIAL IN METODE ............................................................................................ 18 2.1 ŽIVALI .......................................................................................................................... 18 2.1.1 Gojenje ...................................................................................................................... 18 2.1.2 Preparacija za nevrofiziološke poskuse .................................................................. 18 2.2 SNEMANJE VIBRACIJSKIH SIGNALOV NA RASTLINI ...................................... 18 2.3 IZVEDBA FIZIOLOŠKEGA POSKUSA ................................................................... 19 2.3.1 Postavitev poskusa in beleženje aktivnosti celic .................................................... 19 VI Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 2.3.2 Draženje .................................................................................................................... 21 2.3.2.1 Naravni vibracijski signali ....................................................................................... 21 2.3.2.2 Umetno sintetizirani vibracijski signali .................................................................. 22 2.3.3 Označevanje celic ..................................................................................................... 23 2.3.4 Obdelava tkiva in mikroskopiranje ....................................................................... 23 2.4 ANALIZA REZULTATOV ........................................................................................... 24 2.4.1 Analiza elektrofizioloških podatkov ....................................................... . ................. 24 2.4.1.1 Odzivi na signale samičinega pozivnega napeva .................................................... 24 2.4.1.2 Odzivi na umetno sintetizirane vibracijske signale ................................................ 24 2.4.2 Analiza oblike živčnih celic ..................................................................................... 26 2.5 POIMENOVANJE ŽIVČNIH CELIC .......................................................................... 27 3 REZULTATI .................................................................................................................... 28 3.1 RECEPTORSKE CELICE ............................................................................................. 28 3.1.1 LFR – oblika in delovanje ......................................................................................... 28 3.1.2 MFR – oblika in delovanje ....................................................................................... 32 3. 2 INTERNEVRONI ......................................................................................................... 36 3.2.1 Internevroni CG-AC ................................................................................................. 37 3.2.1.1 CG-AC-1 .................................................................................................................. 37 3.2.1.2 CG-AC-2 .................................................................................................................. 45 3.2.1.3 CG-AC-3 in CG-AC-4 ............................................................................................. 50 3.2.1.4 CG-AC-5 .................................................................................................................. 54 3.2.2 CG-AB ........................................................................................................................ 57 3.2.3 Lokalni internevroni CG-L ...................................................................................... 62 3.2.4 PTG-DC ..................................................................................................................... 67 3.2.5 Neidentificirani internevroni .................................................................................... 70 3.2.5.1 V-1 ............................................................................................................................ 70 3.2.5.2 V-2 ............................................................................................................................ 72 3.2.5.3 V-3 ............................................................................................................................ 74 3.3 ČASOVNI ZAMIK IN AMPLITUDNA RAZLIKA ..................................................... 77 3.3.1 Časovni zamik ............................................................................................................ 77 3.3.1 Amplitudna razlika .................................................................................................... 78 3.4 KODIRANJE PARAMETROV NARAVNIH NAPEVOV ........................................... 79 3.4.1 Fižol ............................................................................................................................ 79 3.4.2 Ciperus ....................................................................................................................... 85 VII Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 4 RAZPRAVA IN SKLEPI ................................................................................................ 91 4.1 RECEPTORSKE CELICE ............................................................................................. 91 4.1.1 Oblika ......................................................................................................................... 91 4.1.2 Delovanje .................................................................................................................... 94 4.1.3 Spontana aktivnost in izvor inhibicije v receptorskih celicah .............................. 96 4.2 OBLIKA, DELOVANJE IN POVEZLJIVOST INTERNEVRONOV .......................... 98 4.2.1 Interindividualna variabilnost ali različni nevroni? .............................................. 98 4.2.2 Povezava med obliko in delovanjem internevronov ............................................... 99 4.2.2.1 Internevroni CG-AC-1 ............................................................................................ 100 4.2.2.2 Internevroni CG-AC-2 ............................................................................................ 101 4.2.2.3 Internevroni CG-AC-3 in CG-AC-4 ....................................................................... 102 4.2.2.4 Internevroni CG-AC-5 ............................................................................................ 102 4.2.2.5 Internevroni CG-AB ............................................................................................... 103 4.2.2.6 Internevroni CG-L .................................................................................................. 103 4.2.2.7 Internevron PTG-DC .............................................................................................. 104 4.2.2.8 Neidentificirani internevroni V-1, V-2 in V-3 ......................................................... 104 4.2.3 Uglašenost in občutljivost internevronov .............................................................. 105 4.2.4 Fazično-tonični odziv ali adaptacija celic? ........................................................... 107 4.3 KODIRANJE PARAMETROV NARAVNIH NAPEVOV ......................................... 107 4.4 ORIENTACIJA V SMERI VIRA VIBRACIJSKIH SIGNALOV ............................... 109 4.4.1 Amplitudne razlike ................................................................................................. 109 4.4.2 Časovni zamik ......................................................................................................... 110 4.5 MODEL ŽIVČNE MREŽE ZA PROCESIRANJE VIBRACIJSKIH SIGNALOV ..... 111 4.6 SKLEPI ........................................................................................................................ 114 5 POVZETEK .................................................................................................................. 115 6 SUMMARY ................................................................................................................... 117 7 VIRI ................................................................................................................................ 119 ZAHVALA PRILOGA VIII Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 KAZALO SLIK Slika 1: Zelena smrdljivka Nezara viridula (L.) .................................................................. 2 Slika 2: Fotografija centralnega živčnega sistema stenice N. viridula ........................ . ......... .5 Slika 3: Morfologija hordotonalnih organov v nogah stenice N. viridula ............................. 7 Slika 4: Točke na fižolu in ciperusu .................................................................................... 19 Slika 5: Shema postavitve poskusa (set-up) ........................................................................ 20 Slika 6: Zaporedji vibracijskih signalov samičinega pozivnega napeva ............................ 21 Slika 7: Umetno sintetiziran vibracijski signal ................................................................... 22 Slika 8: Prikaz poimenovanja smeri pri opisu lege živčnih celic v gangliju ....................... 26 Slika 9: Primer poimenovanja internevrona ........................................................................ 27 Slika 10: Morfologija nizkofrekvenčnih receptorskih celic LFR ........................................ 29 Slika 11: Krivulje vzdražnega praga in zapisi odgovorov LFR ........................................... 30 Slika 12: Izointenzitetne, intenzitetne in latenčne krivulje LFR .................................. . ....... 31 Slika 13: Morfologija srednjefrekvenčnih receptorskih celic MFR .................................... 32 Slika 14: Krivulje vzdražnega praga in zapisi odgovorov MFR ......................................... 34 Slika 15: Izointenzitetne, intenzitetne in latenčne krivulje MFR ........................................ 35 Slika 16: Morfologija CG-AC-1 .......................................................................................... 37 Slika 17: Morfologija CG-AC-1 .......................................................................................... 38 Slika 18: Morfologija CG-AC-1 .......................................................................................... 39 Slika 19: Morfologija CG-AC-1 .......................................................................................... 40 Slika 20: Zapisi odgovorov CG-AC-1 ................................................................................. 40 Slika 21: Zapisi odgovorov CG-AC-1 ................................................................................. 41 Slika 22: Zapisi odgovorov CG-AC-1 ................................................................................. 42 Slika 23: Krivulje vzdražnega praga CG-AC-1 ................................................................... 42 Slika 24: Izointenzitetne krivulje CG-AC-1 ........................................................................ 43 Slika 25: Intenzitetne krivulje CG-AC-1 ............................................................................. 43 Slika 26: Latenčne krivulje CG-AC-1 ................................................................................. 44 Slika 27: Morfologija CG-AC-2 .......................................................................................... 45 Slika 28: Morfologija CG-AC-2 .......................................................................................... 46 Slika 29: Zapisi odgovorov CG-AC-2 ................................................................................. 46 Slika 30: Zapisi odgovorov CG-AC-2 ................................................................................. 47 Slika 31: Krivulje vzdražnega praga CG-AC-2 ........................................................... . ....... 48 IX Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Slika 32: Intenzitetne in latenčne krivulje CG-AC-2 ................................................... . ....... 49 Slika 33: Morfologija CG-AC-3 in CG-AC-4 ..................................................................... 50 Slika 34: Zapisi odgovorov in krivulji vzdražnega praga CG-AC-3 in CG-AC-4 .............. 52 Slika 35: Izointenzitetne, intenzitetne in latenčne krivulje CG-AC-3 in CG-AC-4 ........... 53 Slika 36: Morfologija CG-AC-5 ......................................................................................... 54 Slika 37: Krivulja vzdražnega praga in zapisi odgovorov CG-AC-5 ................................. 55 Slika 38: Izointenzitetne, intenzitetne in latenčne krivulje CG-AC-5 .............................. 56 Slika 39: Morfologija CG-AB ............................................................................................. 58 Slika 40: Zapisi odgovorov in krivulje vzdražnih pragov CG-AB ..................................... 60 Slika 41: Izointenzitetne, intenzitetne in latenčne krivulje CG-AB .................................... 61 Slika 42: Morfologija lokalnih internevronov CG-L .......................................................... 64 Slika 43: Zapisi odgovorov in krivulje vzdražnih pragov CG-L-1, 2, 3 ............................ 65 Slika 44: Izointenzitetne, intenzitetne in latenčne krivulje CG-L-1. . ................................. 66 Slika 45: Morfologija PTG-DC ........................................................................................... 67 Slika 46: Zapisi odgovorov in krivulja vzdražnega praga PTG-DC .................................... 68 Slika 47: Izointenzitetne, intenzitetne in latenčne krivulje PTG-DC .................................. 69 Slika 48: Morfologija V-1 ................................................................................................... 70 Slika 49: Zapisi odgovorov in krivulja vzdražnega praga V-1 ........................................... 71 Slika 50: Izointenzitetne, intenzitetne in latenčne krivulje V-1 .......................................... 71 Slika 51: Morfologija V-2 .................................................................................................... 72 Slika 52: Zapisi odgovorov ter intenzitetna in latenčna krivulja V-2 ................................. 73 Slika 53: Morfologija V-3 .................................................................................................... 74 Slika 54: Zapisi odgovorov in krivulja vzdražnega praga V-3 ........................................... 75 Slika 55: Hitrost širjenja vibracijskih signalov po rastlini ................................................... 77 Slika 56: Intenziteta vibracijskih signalov na listnih pecljih ............................................ ....78 Slika 57: Zapisi odgovorov na vibracijski signal samičinega pozivnega napeva; fižol ....... 79 Slika 58: Oscilogram in sonogram signala FCS ter rasterski diagram odzivov; fižol ........ ..81 Slika 59: Krivulje vzdražnih pragov celic skupine A, B in C .............................................. 82 Slika 60: Graf kumulativih frekvenc proženja akcijskih potencialov; fižol ..................... ....83 Slika 61: Dendrogram podobnosti 51 internevronov v odzivu na signal FCS; fižol ........... 84 Slika 62: Relativna intenziteta frekvenčnih vrhov v signalu FCS ...................................... 86 Slika 63: Oscilograma in sonograma signalov FCS ter rasterska diagrama; ciperus .......... 87 Slika 64: Grafa kumulativnih frekvenc proženja akcijskih potencialov; ciperus ................ 88 X Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Slike 65: Dendrograma podobnosti 30 internevronov v odzivu na signala FCS; ciperus....89 Slika 66: Korelacijski diagram odzivov internevronov na signala FCS .............................. 90 Slika 67: Ostanki členjenosti v centralnem gangliju ........................................................... 92 Slika 68: Območja senzoričnih nevropil v centralnem gangliju ......................................... 93 Slika 69: Osnovni morfološki tipi vibracijskih internevronov pri stenici N. viridula ....... 101 Slika 70: Krivulje vzdražnega praga identificiranih vibracijskih internevronov ............... 105 Slika 71: Modela živčnih mrež .......................................................................................... 113 KAZALO TABEL Tabela 1: Pregled tipov internevronov v centralnih ganglijih stenice N. viridula ............... 76 1 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 1 UVOD 1.1 KOMUNIKACIJA ŽUŽELK Čeprav za pojem komunikacija obstaja verjetno prav toliko definicij, kolikor je bilo na to temo napisanih knjig, so si vsi avtorji edini v tem, da gre pri komunikaciji za izmenjavo informacije med oddajnikom in sprejemnikom, pri čemer lahko oba pričakujeta od izmenjave takšno ali drugačno korist (Bradbury in Veherencamp, 1998; Greenfield, 2002). Pri komunikaciji žuželk pa ne gre zgolj za miniatuarizacijo istih in bolje poznanih procesov pri vretenčarjih, saj majhna telesna velikost omejuje naravo signalov, ki jih te živali lahko producirajo in zaznavajo, natančnost, s katero jih lahko lokalizirajo ter vrsto informacije, ki jo sprejemnik lahko povzame iz signala. Zato pri raziskavah na področju komunikacije žuželk nenehno srečujemo ilustrativne primere vpliva velikosti v biologiji ter prilagoditve živali na strukturnem, živčnem in vedenjskem nivoju na omejitve, ki jih predstavljajo fizikalni zakoni (Bennet-Clark, 1999; Greenfield, 2002). Pri nekaterih skupinah žuželk (murni, črički, kobilice, škržati) je zelo dobro razvita zvočna komunikacija, ki je tudi eno najbolje raziskanih področij nevrobiologije žuželk. Neko telo pa lahko učinkovito oddaja zvočno valovanje le, če je veliko v primerjavi z valovno dolžino oddanega zvoka. Mejno velikost telesa določa pogoj 2r > ?/?, kjer r predstavlja polmer krogle s površino ekvivalentno površini telesa žuželke, ? pa valovno dolžino. Za učinkovito zvočno komunikacijo mora biti tako premer telesa živali večji od 1/3 valovne dolžine zvoka (Markl, 1983; Bennet-Clark, 1998). To pomeni, da je za žuželke, velike ok. 1 cm, akustična komunikacija učinkovita v le frekvenčnem območju nad 10 kHz. Komunikacijska razdalja takih signalov pa je omejena, saj se visokofrekvenčni signali (nad 10 kHz) v gosti vegetaciji hitro dušijo (Michelsen in Larsen, 1983). Zato je za manjše žuželke primernejša komunikacija z vibracijskimi signali, ki se prenašajo po podlagi, to pa lahko dopolnjuje komunikacija s feromoni na večje razdalje ter z vidom in dotikom na krajše (Borges in sod., 1987; Kon in sod., 1988). 1.1.1 Vibracijska komunikacija Vibracijska komunikacija je pri žuželkah splošno razširjena in prevladujoča, ne glede na to, ali štejemo po vrstah, družinah ali filogenetski razširjenosti (Cocroft in Rodríguez, 2005). Pri murnih, čričkih, kobilicah in škržatih zaznavanje vibracij podlage dopolnjuje zvočno komunikacijo (Čokl in sod., 1977; Kalmring in sod., 1996, 1997a in b; Stölting in sod., 2002). Pri zeleni smrdljivki, ki je predmet naše raziskave (glej 1.2), je vibracijska komunikacija 2 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 pomemben del paritvenega vedenja. Vedenjske študije opisujejo vibracijsko komunikacijo kot del paritvenega vedenja tudi pri ravnokrilcih (Loher in Dambach, 1989; Field in Bailey 1997), vrbnicah (Stewart, 1997), škržatih (Claridge, 1985), raznokrilcih (Wilcox, 1995; Čokl in Virant-Doberlet, 2003), mrežekrilcih (Henry, 1994; Devetak, 1998), hroščih (Birch in Keenlyside, 1991; Hirschberger, 2001), škorpijonskih muhah (Rupprecht, 1974), dvokrilcih (Hoy in sod., 1988) in mladoletnicah (Ivanov, 1993) (pregled v: Virant-Doberlet in Čokl, 2004). Nekatere žuželke na podlagi vibracij zgolj locirajo plen, kot na primer larva volkca Myrmeleon formicarius (Devetak, 1985) ali gostitelja, kot na primer parazitske ose (Meyhöfer in Casas, 1999). Med členonožci je vibracijska komunikacija oz. zaznavanje vibracij opisana tudi pri pajkih (Barth, 1998), škorpijonih (Brownell, 1977; Brownell in Farley, 1979) in rakih (Aicher in Tautz, 1990). Za produkcijo vibracijskih signalov uporabljajo členonožci različne mehanizme – iztiskanje zraka, timbal, stridulacija, vibracije različnih delov telesa, trkanje z zadkom ali drugimi deli telesa po podlagi ipd. (Ewing, 1989). 1.2 NEZARA VIRIDULA – ZELENA SMRDLJIVKA V želji čim bolje razumeti vibracijsko komunikacijo majhnih žuželk smo sledili principu Augusta Krogh-a, ki pravi: ‘Za veliko različnih problemov obstaja žival, na kateri lahko ta problem (mehanizem ipd.) najbolj enostavno preučujemo’ (For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied) (Sanford et al., 2002). Kot najprimernejšo eksperimentalno žival smo izbrali stenico vrste Nezara viridula L., ki jo lahko gojimo v laboratoriju in pri kateri je že zelo dobro obdelan vedenjski nivo vibracijske komunikacije (Čokl in sod., 1999, 2000a, 2000b, 2001, 2005; Stritih in sod., 2000; Miklas in sod., 2001, 2003a, 2003b; Čokl in Virant-Doberlet, 2003; Virant-Doberlet in Čokl, 2004), znana pa je tudi struktura vibracijskih receptorjev (Michel in sod., 1983). Slika 1: Zelena smrdljivka Nezara viridula (L.) na listu fižola. 3 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Zelena smrdljivka (Nezara viridula L.) (sl. 1) je žuželka iz družine Pentatomidae, red Heteroptera (stenice). Sklepajo, da vrsta izvira iz Etiopske biogeografske regije, od koder se je v zadnjih 250 letih razširila po vsem svetu (Hokkanen, 1986; Jones, 1988); tako jo danes najdemo na vseh kontinentih med 45° severne in južne zemljepisne širine (Todd, 1989). Zelena smrdljivka je polifagna vrsta, ekonomsko pomembna kot škodljivec na bombažu, fižolu, soji, paradižniku in drugih kulturnih rastlinah (Panizzi, 1997). V Sloveniji je Nezara viridula edina predstavnica svojega rodu. Razširjena je v primorski regiji do kraškega roba (Gogala in Gogala, 1989). Zimo stenice preživijo v stanju diapavze; takrat so obarvane rjavo. Ko se zgodaj spomladi dvigne temperatura in podaljša dan, zimsko obarvane stenice pridejo iz prezimovališč, iščejo hrano, se obarvajo zeleno in poiščejo partnerja (Michieli in Žener, 1968). Po parjenju samice ležejo jajca rumenkaste barve v poligonalnih jajčnih masah. Inkubacija traja poleti v povprečju pet dni, zgodaj spomladi in pozno jeseni pa tudi do 45 dni. Razvoj do odraslega osebka poteka preko petih larvalnih stadijev. Življenjski cikel traja od 50 do 70 dni, na leto se zamenja štiri do pet generacij, odvisno od temperature na določenem območju. Optimalna temperatura za razvoj od jajčeca do odraslega osebka je 30°C (Walker in Jones, 1985; Todd, 1989). 1.2.1 Vloga vibracijske komunikacije v paritvenem vedenju stenice N. viridula Komunikacija med osebki zelene smrdljivke v sklopu paritvenega vedenja poteka v dveh fazah: komunikaciji s feromoni na večje razdalje sledi vibracijska komunikacija, ki poteka na krajših razdaljah (Borges in sod., 1987) in v sklopu katere imajo fermoni modulacijsko vlogo (Miklas s sod., 2003b). Spolni feromoni, ki jih izločajo le samci, privabijo samice v njihovo bližino in prožijo oddajanje pozivnega napeva samic, kar lahko traja tudi več kot pol ure. Tako samci kot samice producirajo vibracijske signale s tresenjem zadka, ki se pri tem ne dotika podlage, vibracije pa se preko nog prenašajo na rastlino. Samica med petjem pozivnega napeva ostaja na istem mestu, samec pa se premika v smeri vira vibracij in odgovarja s svojim pozivnim napevom (Ota in Čokl, 1991; Čokl in sod., 1999). Pozivni napev samca in njegov napev dvorjenja vzdržujeta ter modulirata oddajanje samičinega pozivnega napeva (Čokl in Bogataj, 1982), medtem ko slednji povratno vpliva na izločanje samčevih feromonov (Miklas s sod., 2003b). Z orientacijo in premikanjem v smeri vira vibracij samec naposled pride do samice. Ko sta v neposredni bližini, imajo pomembno vlogo pri parjenju tudi signali drugih modalitet (vidni, taktilni in kemični dražljaji) (Borges in sod., 1987; Kon in sod., 1988). 4 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Različni napevi zelene smrdljivke se razlikujejo predvsem po časovnih parametrih. Tako poznamo poleg samičinega in samčevega pozivnega napeva še napeva dvorjenja ter rivalni napev samca in zavrnitveni napev samic (Čokl in sod., 2000a). Dominantni frekvenčni vrh vseh napevov se giblje med 90 in 120 Hz, z višjefrekvenčnimi harmoničnimi vrhovi ter subdominantnimi vrhovi (Čokl in sod., 2000a, 2000b, 2005b). Pri nekaterih napevih je prisotna tudi frekvenčna modulacija. Samičin pozivni napev sestavljajo 1,5 do 2 s dolgi vibracijski signali, ki se ponavljajo enakomerno vsakih 4-6 s. 1.3 RASTLINE KOT MEDIJ ZA PRENOS VIBRACIJSKIH SIGNALOV Uspešnost prenosa informacije je odvisna od učinkovitosti oddajnika, občutljivosti sprejemnika in od lastnosti medija za prenos signalov. Uglašenost vseh treh komponent zagotavlja optimalno učinkovitost komunikacije. Nedavne raziskave so pokazale, da učinkovit prenos vibracijskih signalov pri zeleni smrdljivki temelji na uglašenosti frekvenčnih parametrov vibracijskih napevov s frekvenčno občutljivostjo vibracijskih receptorjev in resonančnimi lastnostmi zelenih rastlin (Čokl in sod., 2005b). Zelene rastline so zaradi majhnega dušenja dober medij za prenos vibracijskih signalov. (Michelsen in sod., 1982; Markl, 1983; Barth, 2002). Vedenjski poskusi so pokazali, da samci zelene smrdljivke alternirajo s samicami na razdalji dveh metrov skozi sosednji stebli ciperusa, ki sta mehansko povezani zgolj skozi koreninski sistem, izmerjena intenziteta vibracijskih signalov samičinega pozivnega napeva na razdalji 1 m od vira vibracij na steblu ciperusa pa je upadla za manj kot 5 dB (Čokl, osebna komunikacija). Vibracije vzbujajo v rastlinah različne tipe valov – longitudinalne, kvazi longitudinalne, transverzalne (torzijske), Rayleigheve in upogibne (bending waves) (Markl, 1983; Gogala, 1985; Barth, 1998, 2002). Žuželke za sporazumevanje z vibracijskimi signali preko rastlinskega tkiva uporabljajo upogibne valove, katerih glavna značilnost je relativno nizka hitrost prevajanja in frekvenčno odvisna hitrost širjenja (Michelsen in sod., 1982; Barth, 1998). Zaradi odbojev valovanja na vrhu rastline in pri koreninah pride v paličastih delih rastlin do pojava stoječega valovanja, kar dodatno doprinese k distorziji izhodiščnega vibracijskega signala. Razdalje med vozli (mesta minimalne intenzitete vibracijskega signala) padajo z naraščajočo frekvenco (Čokl, 1988). Domnevajo, da take spremembe časovnih in spektralnih karakteristik vibracijskega signala omogočajo samcu, da se orientira proti viru vibracij (Čokl, 1988). Hitrost prenosa vibracij je poleg frekvence v veliki meri odvisna tudi od mehanskih lastnosti rastlin. Tako so na bobu izmerili hitrosti od 36 m/s (200 Hz) do 120 m/s (2000 Hz) (Michelsen in sod., 1982), na agavi pa je hitrost signalov frekvence 30 Hz na apikalni tretjini lista znašala 4,4 m/s, na bazalnem delu pa kar 35,7 m/s (Barth, 1998). 5 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 1.4 ZGRADBA CENTRALNEGA ŽIVČNEGA SISTEMA Centralni živčni sistem žuželk je sestavljen iz možganskega dela, ki leži nad anteriornim delom stomodeuma v glavini kapsuli in trebušnjače, ki se razteza v torakalnem in abdominalnem delu telesa (Chapman, 1998). Telesa živčnih celic so združena v ganglije. Trebušnjačo običajno sestavlja serija segmentalnih ganglijev tik nad ventralno steno telesa. Kot pri mnogih drugih redovih žuželk je tudi pri skupini Heteroptera prišlo do modifikacije tega splošnega modela. Pri stenici Oncopeltus fasciatus iz družine Lygeidae je prišlo do kondenzacije in centralizacije ganglijev, kar je imelo za posledico podaljšanje abdominalnih lateralnih živcev (Rutschky in Stryjak, 1955). Podobno je pri zeleni smrdljivki: subezofagealnemu gangliju sledita protorakalni ganglij in centralni ganglij; slednji je nastal kot posledica zlitja meso- in metatorakalnega ter abdominalnih ganglijev (sl. 2). Slika 2: Fotografija centralnega živčnega sistema stenice Nezara viridula. OŽ - optični živec; OL - optični lobus; PCL - protocerebralni lobus; PTG - protorakalni ganglij; CG - centralni ganglij; NŽ1-3 - nožni živci prvega, drugega in tretjega para nog; ABŽ - abdominalni živci (živci abdominalnih segmentov); GŽ - genitalni živec. 6 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 1.5 VIBRACIJSKI RECEPTORJI 1.5.1 Zgradba organov Čutilni organi žuželk, ki so najbolj občutljivi za zaznavanje vibracij podlage, se nahajajo v nogah; to so kampaniformne senzile in hordotonalni organi. Kampaniformne senzile so integumentni mehanoreceptorji, pri katerih je dendritski končič pritrjen na kutikulo, oblikovano v kupolo oz. kapo (Keil, 1998). Deformacija kutikule se prenese na septum med kupolo in kutikulo okoli nje ter deluje na dendrit. Pri mnogih žuželkah so kampaniformne senzile organizirane v receptivna polja ob sklepih (Grosch in sod., 1985; Keil, 1998; Devetak in sod., 2004), medtem ko so pri zeleni smrdljivki razporejene po vsej površini noge (Čokl in sod., 2005a), večinoma po femurju in tibiji (lastna opažanja). Hordotonalni organi ležijo znotraj nog ob sklepih in se distalno pritrjajo na različne strukture. Njihovi osnovni gradniki so skolopidiji. Skolopidij je sestavljen iz bipolarnega čutilnega nevrona, skolopalne, pritrjevalne (kapne) celice ter ovojne celice (Field in Matheson, 1998). Ugotovili so, da so na vibracije podlage pri zeleni smrdljivki občutljive tudi kampaniformne senzile ter Johnstonov organ na oz. v antenah. Njihova občutljivost je manjša od čutilnih organov nog (Jeram in Čokl, 1996; Jeram in Pabst, 1996). N. viridula ima v vsaki nogi po štiri hordotonalne organe (sl. 3): femoralni hordotonalni organ (FCO), subgenualni organ (SO), tibialno-distalni hordotonalni organ (TDCO) ter tarzo-pretarzalni hordotonalni organ (TPCO) (Michel in sod., 1983). Najobčutljivejši čutilni organ za vibracije podlage je subgenualni organ, ki se nahaja v tibiji vseh šestih nog, distalno od sklepa med femurjem in tibijo (Debaisieux, 1938; Devetak, 1998; Vilhelmsen in sod., 2001). SO zaznava odmike podlage, manjše od 1 nm ter pospeške, manjše od 1 cm/s2 (Kühne, 1982a; Shaw, 1994b; Devetak, 1998). Frekvenčno območje največje občutljivosti SO se pri različnih skupinah žuželk giblje od 200 pa tja do 2000 Hz (Čokl, 1983; Shaw, 1994a, b; Devetak in Amon, 1997). Tudi struktura SO se med različnimi skupinami žuželk precej razlikuje. Pri ravnokrilcih in ščurkih je sestavljen iz 20 do 40 skolopidijev, ki so v obliki zastave napeti prečno prek skoraj celotnega hemolimfnega kanala proksimalne tibije (Schnorbus, 1971; Lakes in Schikorski, 1990), pri osah iz družine Orussidae pa ga sestavlja tudi do 400 čutilnih celic (Vilhelmsen in sod., 2001). Pri stenici Pyrrhocoris apterus (Pyrrhocoridae) je v primerjavi z ravnokrilci opaziti redukcijo števila skolopidijev v vseh skolopidialnih organih (Debaisieux, 1938). SO tako sestavljata le dve receptorski celici. Enako je pri stenici N. viridula; subgenualni organ v proksimalnem delu tibije sestavljata dva skolopidija, vsak s po eno čutilno celico. Kapni celici tvorita ligament, ki je v začetnem delu okrogel, nato pa se splošči in razdeli v dve krpi, ki se pritrjata na steno tibije. Ligament je pritrjen ohlapno Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 a anteriorno sksk sk dfž sk sk sk 1-3 4-8 9 . 10 11 12 b ap ku posteriorno mlt f a b d atž lig k'u posteriorno 1,2 oHi3'^ ig anteriorno ligA ligB sm .------. posteriorno Slika 3: Morfologija hordotonalnih organov v nogah stenice N. viridula. Shematske risbe femoralnega hordotonalnega organa (FCO) (a), subgenualnega organa (SO) (b), tibialno-distalnega hordotonalnega organa (TDCO) (c) in tarzo-pretarzalnega hordotonalnega organa (TPCO) (d). ap - apodema; atž - anteriorni tibialni živec; dfž - dorzalni femoralni živec; f - femur; kh - kanal hemolimfe; kr - krempeljci; ku - kutikula; lig -ligament; lut - ligament m. unguitractor; mk - mišični kanal; mlt - musculus levator tibiae; ptž - posteriorni tibialni živec; pu - pulvilus; se - septum; sk - skolopidij; sm - sklepna membrana; t - tibija; ta - tarzus; tr -traheja; ut - pritrdišče m. unguitractor; žfc - živec femoralnega hordotonalnega organa. Merilca predstavljajo 200 µm (a, b) in 100 µm (c, d). Mod. po Michel in sod., 1983. in lahko bolj ali manj prosto niha v kanalu hemolimfe (Michel in sod., 1983). Podobno je zgrajen SO tenčičarice Chrysoperla carnea (Neuroptera) – sestavljajo ga trije skolopidiji, ekvivalent ligamentu pa predstavlja velum lečaste oblike, ki leži prečno v hemolimfnem kanalu ter se ohlapno pritrja na trahejo in stene tibije (Devetak in Pabst, 1994). Do sedaj so subgenualni organ opisali že pri vseh krilatih žuželkah (Pterygota), razen pri hroščih (Coleoptera) in dvokrilcih (Diptera) (Virant-Doberlet in Čokl, 2004). Michel in sod. (1983) so natančno opisali tudi ostale hordotonalne organe pri vrsti N. viridula. FCO leži v lateralni distalni tretjini femurja in je sestavljen iz dvanajstih skolopidijev, od katerih vsak vsebuje po dve čutilni celici. Prvih osem skolopidijev tvori t.i. kondenzirani skoloparij v proksimalnem delu FCO, medtem ko ostali skolopidiji tvorijo t.i. disperzni skoloparij. FCO se pritja na apodemo (kutikularni greben) in mišice na distalnem delu 7 8 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 femurja, ob sklepu s tibijo. TDCO leži v distalnem delu tibije ob tibialno-tarzalnem sklepu. Sestavljen je iz dveh skolopidijev, od tega ima eden eno in drugi dve čutilni celici. Kapni celici tvorita okroglasto oblikovan ligament, ki se pritrja na membrano v sklepu med tibijo in prvim členom tarzusa. TPCO leži v zadnjem tarzalnem členu. Enako kot FCO je sestavljen iz dveh skoloparijev: proksimalnega tvorita dva skolopidija, distalnega pa trije. Kapne celice skolopidijev se pritrjajo na različne distalne strukture v stopalcu. 1.5.2 Receptorske živčne celice 1.5.2.1 Delovanje Največ informacij o delovanju receptorskih celic, občutljivih na vibracije podlage, je rezultat raziskav slušne komunikacije ravnokrilcev (Orthoptera). Žuželke, ki se sporazumevajo z zvokom, zaznavajo namreč tudi vibracije podlage. Domnevajo, da sta se akustično signaliziranje in sluh razvila iz vibracijske komunikacije (Stumpner in von Helversen, 2001). Kompleksni tibialni organ v prvem paru nog dolgorogih kobilic (Tettigoniidae) sestavljajo tri skupine receptorskih celic: zvočno, vibracijsko-zvočno in vibracijsko občutljive celice (Kalmring in sod., 1978). Fiziologijo receptorskih celic kompleksnega tibialnega organa v skupini Tettigoniidae so opisali Kalmring in sod. (1978, 1996). Kühne (1982a) je primerjal funkcionalne lastnosti vibroreceptorjev pri kratkorogih (Acrididae, vrsta Locusta migratoria) in dolgorogih (Tettigonia cantans, Decticus verrucivorus) kobilicah. Sočasno procesiranje vibracijskih in akustičnih dražljajev ter fiziologijo receptorskih celic so opisali tudi pri murnu (Gryllidae) (Kühne in sod., 1984; Dambach, 1989). Mason (1991) je opisal delovanje receptorskih celic tibialnega organa pri primitivnih dolgorogih kobilicah družine Haglidae. Čokl in sod. (1995) so opisali fiziologijo tibialnega organa pri jamski kobilici Troglophilus neglectus iz družine dolgorogih kobilic Rhaphidophoridae, pri katerih je tibialni organ v primerjavi z ostalimi dolgorogimi kobilicami okrnjen – manjka t.i. crista acoustica, del tibialnega organa, ki je namenjen zaznavanju zvoka. Ščurki (Blattidae) so znani po domnevno enem od najobčutljivejših subgenualnih organov. Po prvih raziskavah naj bi se odzival že na odmike podlage velikosti 0,002 nm (Schnorbus, 1971). Ponovna vrednotenja vzdražnega praga (Shaw, 1994b) so pokazala, da leži precej višje, in sicer pri 0,2 nm. 9 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Pri ostalih skupinah žuželk so med drugim opisali funkcionalne lastnosti vibroreceptorjev pri tenčičarici (Chrysoperla carnea) (Devetak in Amon, 1997) in paličnjaku (Stein in Sauer, 1999). V skupini Heteroptera so raziskave na tem področju še precej skope. Devetak in sod. (1978) so opisali funkcionalne lastnosti vibracijskih receptorjev pri stenicah iz družine Cydnidae. Čokl (1983) je opisal funkcionalne lastnosti vibroreceptorjev pri vrsti N. viridula. Nizkofrekvenčni receptorji (low frequency receptors – LFR) se odzivajo na vibracije podlage v frekvenčnem območju pod 400 Hz; najnižje testirana frekvenca je bila 30 Hz, domnevajo, da sega območje delovanja še nižje. Ti receptorji do 120 Hz odgovarjajo fazno-vezano. Krivulja vzdražnega praga sledi liniji enakega odmika od ravnovesne lege (okoli 100 nm) med 50 in 400 Hz. Vzdražni prag pri 50 Hz, izražen kot pospešek, je pri 1,6 cm/s2 (oz. 5 x 10-5 m/s). Srednjefrekvenčni receptorji (middle frequency receptors – MFR) odgovarjajo na dražljaje v frekvenčnem območju od 100 Hz do 1kHz z največjo občutljivostjo pri 200 Hz, kjer je vzdražni prag pri 1 cm/s2 (oz. 10-5 m/s). Pod 200 Hz sledi krivulja njihovega vzdražnega praga liniji enakega pospeška (okoli 1 cm/s2), pri 200 Hz se ostro obrne in sledi liniji enakih odmikov od ravnovesne lege (med 10 in 100 nm). Visokofrekvenčni receptorji (high frequency receptors – HFR) delujejo v območju od 100 Hz do 5 kHz, z največjo občutljivostjo med 750 in 1000 Hz. V tem območju je vzdražni prag pri 0,9 cm/s2 (oz. 2 x 10-6 m/s). Pod 1000 Hz sledi krivulja vzdražnega praga liniji enakega pospeška (okoli 1 cm/s2), nad 1000 Hz pa sledi liniji enakega odmika iz ravnovesne lege (med 0,1 in 1 nm). Tipa MFR in HFR kažeta pri pražnih intenzitetah podobne karakteristike odzivov, medtem ko nad vzdražnim pragom pride do razlik v frekvenčno-intenzitetnem kodiranju. Pri obeh tipih pride pri dražljajih frekvence 200 Hz do podaljšanega odgovora. Domnevajo, da je to posledica pojava resonance ligamenta, ki ga tvorita kapni celici subgenualnega organa (Čokl, 1983). Glede na frekvenčno območje delovanja in najmanjšo občutljivost na vibracije podlage izmed vseh treh opisanih tipov, odgovori LFR receptorjev najverjetneje izvirajo iz kampaniformnih senzil in/ali sklepnih hordotonalnih organov. O takem izvoru izvoru teh vibroreceptorjev sklepamo na podlagi raziskav na drugih skupinah žuželk (Devetak in sod., 1978; Kühne, 1982a; Čokl, 1983; Kühne s sod., 1984; Dambach, 1989; Devetak in Amon, 1997). Dosedanje raziskave subgenualnega organa pri različnih vrstah žuželk so potrdile njegovo visoko občutljivost na vibracije podlage in zaznavanje signalov v širokem frekvenčnem razponu do nekaj kHz (Schnorbus, 1971; Devetak s sod, 1978; Kühne, 1982a; Čokl, 1983; Kühne s sod., 1984; Dambach, 1989; Devetak in Amon, 1997). Na podlagi funkcionalnih lastnosti MFR in HFR nevronov pri zeleni smrdljivki pa lahko sklepamo, da izvirajo v subgenualnem organu. Čeprav za to trditev neposredni dokazi še manjkajo, pa raziskave 10 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Devetaka s sod. (1978) pri družini Cydnidae ter raziskave na tenčičarici (Devetak in Amon, 1997) potrjujejo to hipotezo. MFR in HFR celice kažejo mnogo podobnih lastnosti, a se razlikujejo v frekvenčno-intenzitetni občutljivosti. Če izhajamo iz domneve, da obe receptorski celici izvirata v SO, lahko razlike pripišemo njuni medsebojni prostorski organiziranosti. Čokl (1983) meni, da na skolopidij, ki leži bolj medialno, vibracije vplivajo drugače kot na tistega, ki leži bolj lateralno, tik ob steni tibije, posledica česar so razlike v odgovoru obeh tipov receptorskih nevronov. 1.5.2.2 Centralne projekcije Aksoni celic tibialnega organa ravnokrilcev vstopajo v trebušnjačo prek glavnega nožnega živca in se razvejijo v ipsilateralni polovici segmentalnega ganglija (Kalmring in sod., 1978; Eibl in Huber, 1979; Esch in sod., 1980). Končne razvejitve aksonov tvorijo nevropilo v antero-ventralnem področju protorakalnega ganglija, imenovanem aRT (anterior ring tract (Tyrer in Gregory, 1982)). Aksoni zvočno občutljivih receptorskih celic tvorijo akustično nevropilo na sredini aRT, aksoni vibracijskih in bimodalnih čutilnih celic tibialnega organa pa nevropilo na antero- in postero-lateralnem robu aRT (Römer, 1985; Kalmring in sod., 1996). Dejstvo, da so poteki senzoričnih vlaken tibialnega organa in kampaniformnih senzil v posameznem paru nog, ter cone, v katere projicirajo, prostorsko skoraj identični, kaže na to, da imajo senzorične strukture, ki se ponavljajo v zaporednih segmentih, podobno prostorsko organizacijo znotraj ganglija (Eibl in Huber, 1979). Grosch in sod. (1985) so primerjali centralne projekcije vibracijskih receptorjev pri petem larvalnem stadiju in odraslih osebkih kratkorogih kobilic iz družine Acrididae in ugotovili, da med projekcijskimi vzorci ni znatnih razlik. Mücke in Lakes-Harlan (1995) sta opisala centralne projekcije senzoričnih nevronov iz drugega para nog pri kratkorogi kobilici Schistocerca gregaria. Razen pri ravnokrilcih je morfologija vibroreceptorskih nevronov pri žuželkah še povsem neraziskana. Oblika senzorične nevropile je delno opisana le pri stenici N. viridula (Čokl in Amon, 1980). Enako kot pri ravnokrilcih je le-ta omejena na ipsilateralno polovico ganglija. Vsako nevropilo sestavljajo tri dobro definirane regije: frontalna, centralna in kavdalna regija. Večina nevronov, katerih terminalne razvejitve tvorijo frontalni del nevropile, so motonevroni, katerih telesa ležijo v latero-frontalnem delu ipsilateralne strani protorakalnega ganglija. Med frontalnim in kavdalnim delom je okroglasto oblikovan centralni del, ki leži lateralno med aksoni, ki potekajo v kavdalno in frontalno regijo. Nevropile različnih nog se med seboj strukturno ne razlikujejo (Čokl in Amon, 1980). 11 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 1.6 VIBRACIJSKI INTERNEVRONI 1.6.1 Delovanje Tudi na področju delovanja vibracijskih internevronov je največ raziskav do sedaj bilo narejenih na ravnokrilcih, pri katerih je osnovna komunikacija z zvokom. Enako, kot velja za receptorske celice kompleksnega tibialnega organa dolgorogih kobilic (Kalmring s sod., 1978; Kühne, 1982a), so tudi na nivoju internevronov ravnokrilcev prisotni trije fiziološki tipi: slušni (S), vibracijsko-slušni (VS) ter vibracijski (V) internevroni (Kühne, 1982b; Kalmring, 1983; Kalmring in sod., 1997), pri čemer je treba upoštevati dejstvo, da je bimodalnost receptorskih celic pogojena s samo zgradbo kompleksnega tibialnega organa, medtem ko je bimodalnost internevronov posledica nevronalnih povezav. Čeprav se frekvenčna uglašenost posameznih internevronov med različnimi vrstami dolgorogih kobilic precej razlikuje, pa velja, da je največja občutljivost slušnih internevronov v območju dominantnih frekvenčnih vrhov njihovih napevov (med 10 in 20 kHz), medtem ko so vibracijski internevroni najbolj občutljivi v nizkofrekvenčnem območju, pod 1 kHz (Silver in sod., 1980; Kalmring in sod., 1997; Nebeling, 2000). Bimodalni nevroni delujejo v širokem frekvenčnem območju in prejemajo vhode tako slušnih kot vibracijskih receptorjev (Čokl in sod., 1977). Občutljivost bimodalnih internevronov za vibracije podlage izboljšuje njihove sposobnosti frekvenčno-amplitudnega kodiranja pri sočasni stimulaciji s konspecifičnimi napevi ter vibracijskimi signali (Kühne, 1982b; Kalmring in sod., 1983). Jamske kobilice (Rhaphidophoridae) so v nasprotju z večino dnevno aktivnih travniških kobilic in talno živečih murnov popolnoma brez kril, ne stridulirajo in imajo okrnjen slušni organ (Čokl in sod., 1995). Funkcionalne (Čokl in sod., 1995; Stritih, 2001) in morfološke lastnosti njihovih na vibracije podlage občutljivih internevronov kažejo na homolognost dela vibracijskih in slušnih živčnih mrež, kar potrjuje domnevo, da so se tibialni slušni organi dolgorogih kobilic (Ensifera) razvili iz organov, podobnih vibroreceptorskim organom gluhih jamskih kobilic (Stritih, 2001). Čeprav so t.i. V internevroni pri ravnokrilcih občutljivi zgolj na vibracije podlage oz. nespecifično tudi na zvočne dražljaje zelo visokih intenzitet v frekvenčem območju napevov lastne vrste, je Silver s sodelavci (1980) opisala pri vrsti dolgorogih kobilic Decticus verrucivorus tudi V internevron, ki je prejemal inhibitorne vhode iz ultrazvočni receptorjev. Koprocesiranje zvoka in vibracij na istih nevronih je pri murnih podobno kot pri skupini Tettigoniidae, z bolj poudarjeno frekvenčno selektivnostjo na centralnem nivoju (Kühne in sod., 1984; Kühne in sod., 1985). Pri kratkorogi kobilici vrste Locusta migratoria so opisali tri tipe na vibracije podlage občutljivih internevronov: bimodalne internevrone, ki so funkcionalno primerljivi z VS 12 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 internevroni dolgorogih kobilic; vzpenjajoče vibracijske internevrone, ki integrirajo vhode iz vibracijskih receptorjev vseh šestih nog ter vibracijske internevrone, ki so omejeni na torakalni del centralnega živčnega sistema in pri katerih je vhod enega para nog dominanten (Čokl in sod., 1977, 1985). Vzorci odzivov bimodalnih internevronov na zvok in na vibracije podlage se razlikujejo; medtem ko so prvi rezultat kompleksnih ekscitatornih in/ali inhibitornih interakcij signalov iz obeh timpanalnih organov, gre pri drugih za bolj nekoliko bolj preprosto integracijo senzoričnih vhodov iz vseh nog; senzorični vhodi imajo namreč na posamezen internevron ekscitatorni ali inhibitorni vpliv, nikoli pa kombinacije obeh (Čokl in sod., 1977). Bickmeyer in sod. (1992) domnevajo, da so med vibracijskimi receptorji ter vzpenjanjočimi bimodalnimi nevroni interkalirani segmentalno in intersegmentalno ležeči vibracijski internevroni prvega reda. To hipotezo podpirajo s prostorskim sovpadanjem dendritskih razvejitev vibracijskih internevronov in projekcijskega vzorca receptorskih celic ter z vrednotenjem latenc odgovorov posameznih celic na poti procesiranja vibracijskih dražljajev. Funkcionalne lastnosti vibracijskih internevronov so opisali tudi pri čebelah (Kilpinen in Michelsen, 1994), paličnjaku (Sauer in Stein, 1999) ter zeleni smrdljivki (Čokl in Amon, 1980). Občutljivost vibracijskih internevronov čebel je bolj ali manj frekvenčno neodvisna (odzivajo se v širokem frekvenčnem pasu), različni internevroni pa se kljub podobnim krivuljam vzdražnega praga precej razlikujejo glede na vzorce proženja akcijskih potencialov (Kilpinen in Michelsen, 1994). Raziskave senzorično-motorične poti procesiranja vibracijskih signalov femoralnega hordotonalnega organa pri paličnjaku so pokazale veliko vlogo internevronov, ki ne prožijo akcijskih potencialov (non-spiking interneurons) (Sauer in Stein, 1999). Ti internevroni imajo velik vpliv pri integraciji in komunikaciji med nevroni zaradi stopnjevanja vpliva na membranski potencial svojih postsinaptičnih celic (Burrows, 1996). Čokl in Amon (1980) sta pri stenici N. viridula opisala štiri funkcionalne tipe vibracijskih internevronov. Nizkofrekvenčni vibracijski internevroni (LFVI – low frequency vibratory interneuron), nizkofrekvenčni T vibracijski internevron (LFTVI – low frequency through vibratory interneuron) in nizkofrekvenčni segmentalni vibracijski internevron (LFSVI – low frequency segmental interneuron) so najobčutljivejši v območju frekvenc med 100 in 600 Hz, medtem ko je četrti tip, visokofrekvenčni vibracijski internevron (HFVI – high frequency vibratory interneuron) najobčutljivejši v območju med 600 in 1500 Hz. LFVI odgovarja v frekvenčnem območju od 50 do 600 Hz in je najobčutljivejši pri 100 Hz. LFTVI je najobčutljivejši med 150 in 200 Hz, deluje pa v frekvenčnem območju od 100 do nad 2000 Hz. LFSVI je najobčutljivejši med 150 in 600 Hz, deluje pa v območju od 100 do 13 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 preko 2500 Hz. HFVI, visokofrekvenčni vibracijski internevron, kaže največjo občutljivost pri frekvencah od 600 do 1500 Hz. Vsi štirje tipi so ekscitatorni in se na dražljaje odzivajo fazično-tonično. 1.6.2 Morfologija Nebeling (2000) je primerjal morfologijo slušnih, vibracijskih ter bimodalnih vzpenjajočih internevronov v možganih, subezofagealnem ter protorakalnem gangliju dolgorogih kobilic (Tettigoniidae). Prvi imajo izhodne regije v vseh treh ganglijih, medtem so izhodne regije vibracijskih in bimodalnih internevronov praviloma le v možganih. Stritih (2001) je vibracijske internevrone v protorakalnem gangliju jamske kobilice razdelila v 10 morfoloških tipov. Podobnosti z morfologijo slušnih internevronov ravnokrilcev potrjujejo domneve o evoluciji slušnih sistemov pri žuželkah (Stumpner in von Helversen, 2001). Čokl in sod. (1985) so pri kobilici Locusta migratoria identificirali internevron, občutljiv izključno na vibracije podlage, ki je omejen na torakalne ganglije. Pripisujejo mu funkcijo povezovalnega nevrona med vibracijskimi receptorji ter vzpenjajočimi vibracijskimi in bimodalnimi internevroni. Bickmeyer in sod. (1992) so opisali morfologijo nekaterih intersegmentalnih vibracijskih (VI1 in VI2) ter bimodalnih (G in V-3) internevronov pri isti vrsti. Čokl in Amon (1980) sta opisala morfologijo nevrona LFTVI pri stenici N. viridula. Ta nizkofrekvenčna celica je omejena na torakalni del živčnega sistema: somo in dendritske razvejitve ima v protorakalnem gangliju, izhodne regije pa v centralnem gangliju. 1.7 ORIENTACIJA Vedenjski poskusi so pokazali sposobnost orientacije v smeri vira vibracij pri mnogih skupinah žuželk v različnih vedenjskih kontekstih – iskanje partnerja (Kraus, 1989; Stiedl in Kalmring, 1989; Abbott in Stewart, 1993; Goulson in sod., 1994; Čokl in sod., 1999; Hunt, 1994; Cocroft in Rodríguez, 2005), plena (Markl in sod., 1973; Jackson in Walls, 1998), gostitelja (Meyhöfer in sod., 1997) ali druge hrane (Roces in sod., 1993; Cocroft, 2001); pregled v: Virant-Doberlet in sod. (2005). Pri zeleni smrdljivki se samec orientira proti pojoči samici; stacionarne samice kontinuirano oddajajo signale pozivnega napeva, medtem ko se samci usmerjeno gibljejo proti njim (Čokl in sod., 1999). Na razvejitvah se samci ustavijo, postavijo noge in antene na peclje oz. stranske veje okoli ‘križišča’, počakajo na samičin signal, ter se šele nato premaknejo naprej (Ota in Čokl, 1991). 14 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Obstaja več hipotez o tem, kateri parameter prejetega signala igra glavno vlogo pri orientaciji žuželk. Podlaga za zaznavanje smeri izvora signala je zaznavanje intenzitetnih ali časovnih razlik med posameznimi receptorji. V primeru zvoka so to navadno razlike v intenziteti med enim in drugim ušesom (Pollack, 1998), saj je časovni zamik, ki nastane pri potovanju zvoka po zraku namreč za večino žuželk premajhen, da bi ga živčni sistem zaznal. Izjema so majhne žuželke, kjer sta ušesi tako blizu skupaj, da med njima ne nastane nadpražna intenzitetna razlika; te žuželke so razvile posebne mehanizme, ki jim kljub omejitvam omogočajo orientacijo na podlagi zakasnitve dražljaja. Primer takega organizma je parazitska mušica Ormia ochracea, ki se je sposobna orientirati na podlagi časovnega zamika med ušesoma v velikosti 25 ns (Mason in sod., 2001). Njena slušna organa sta namreč anatomsko in funkcionalno povezana; v takem sistemu se neznatni časovni zamik med ušesoma ojači, nastanejo pa tudi intenzitetne razlike, ki omogočijo specializiranemu živčnemu sistemu zaznavanje smeri zvoka (Robert in sod., 1998). V primeru zaznavanja vibracijskih signalov, ki se prevajajo po podlagi (rastline, pesek, vodna površina), pa je časovni zamik, ki nastane med potovanjem signalov od enega do drugega receptorja, navadno dovolj velik, da ga živali lahko zaznajo. Vedenjski poskusi kažejo, da lahko škorpijoni, pri katerih je časovna zakasnitev med posameznimi receptorji vodilni parameter za orientacijo, zaznajo zamik 0,2 ms (Brownell in Farley, 1979). Upoštevaje izmerjene hitrosti potovanja vibracijskih signalov po posameznih odsekih različnih rastlin (Michelsen, 1982; Barth, 1998, 2002) sklepamo, da so zamiki, vsaj na določenih delih rastline, dovolj veliki, da jih živčni sistem žuželk lahko zazna (Stritih in sod., 2000). Hergenröder in Barth (1983) sta pri pajkih opisala enostavno živčno mrežo za procesiranje prostorsko-časovne informacije iz zunanjega okolja. Podoben model interakcij sta predlagala Brownell in van Hemmen (2001) pri škorpijonih. Gre za model inhibitornih triad v sistemu osmih prostorsko ločenih receptorjev. Zaznavanje smeri vira vibracij pa lahko poteka tudi na podlagi analize razlik v intenziteti (Keuper in Kühne, 1983; Čokl, 1988) ali časovnem zamiku med posameznimi frekvenčnimi komponentami v vibracijskem signalu (Michelsen in sod., 1982; Čokl in sod., 1999). Pri žuželkah s specifično obliko telesa, npr. pri vrsti Umbonia crassicornis iz družine Membracidae (ang. thorn bug), ki ima pronotum povečan in oblikovan kot trn vrtnice, je informacija o smeri vibracijkih dražljajev lahko skrita v mehanskem odgovoru telesa na vibracije podlage (Cocroft in sod., 2000). Nevrobiološka podlaga orientacije s pomočjo vibracijskih signalov je slabo obdelana. Največ podatkov o centralnem procesiranju vibracijskih signalov izvira iz raziskav na kobilicah in murnih, pri katerih je pomembnejša komunikacija z zvokom in za katere orientacija proti viru vibracij ni bila dokazana (kratkoroge kobilice) ali pa je relativno šibka (murni). Iz raziskav na murnih lahko strnemo temeljne zakonitosti centralne integracije senzoričnih vhodov na 15 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 podlagi naslednjih dognanj: a) večina vzpenjajočih vibracijskih internevronov sprejema ekscitatorne vhode iz subgenualnih organov vseh šestih nog (Dambach, 1972; Kühne in sod., 1984, 1985; Virant-Doberlet, 1989); b) vhodi enega (navadno drugega) para nog so dominantni (Kühne in sod., 1984, 1985; Virant-Doberlet, 1989); c) v odgovoru nekaterih internevronov so opazni vplivi kontralateralne inhibicije (Kühne in sod., 1984, 1985; Virant-Doberlet, 1989); d) vzorec odzivov nekaterih internevronov je v veliki meri odvisen od časovnega zaporedja stimulacije nog (Virant-Doberlet, 1989). Čeprav pri murnih niso zabeležili aktivnosti internevronov, ki bi povezovali vhode iz različnih nog z vzpenjajočimi internevroni, pa taka intersegmentalna integracijska mreža zagotovo obstaja. Centralne projekcije subgenualnih receptorjev so omejene na ipsilateralno polovico ustreznega ganglija (Eibl in Huber, 1979). Dendritske regije opisanih vzpenjajočih internevronov so bile večinoma omejene na en torakalni ganglij, poleg tega pa se vhodi iz različnih nog med seboj razlikujejo v latencah odgovorov (Virant-Doberlet, 1989). Pri kratkorogi kobilici Locusta migratoria se odziv internevronov spreminja v odvisnosti od zaporedja draženja različnih parov nog, kar kaže jasno odvisnost vzorcev proženja akcijskih potencialov od smeri dražljaja (Čokl in sod., 1985). Ta se je pri nekaterih internevronih še dodatno povečala ob hkratni simulaciji dušenja signalov (nižja intenziteta ‘kasnejših’ signalov). Kot pri murnu so tudi pri kratkorogi kobilici opazili vplive kontralateralne inhibicije; zabeležili so pa tudi aktivnost internevronov, omejenih na torkalne ganglije, ki so se selektivno odzivali na draženje enega samega para nog (Čokl in sod., 1985). Domnevajo, da ti internevroni povezujejo senzorične vhode posameznih nog z vzpenjajočimi internevroni. 1.8 KODIRANJE SPEKTRALNIH IN ČASOVNIH PARAMETROV NARAVNIH NAPEVOV Tudi na področju kodiranja frekvenčnih in časovnih parametrov je zvočna komunikacija žuželk neprimerno bolj raziskana kot vibracijska. Pri razpoznavanju zvočnih napevov lastne vrste igrajo pri ravnokrilcih glavno vlogo časovni parametri, kot npr. dolžina signalov, njihova ponavljalna frekvenca ali dolžina premorov (Stumpner in Ronacher, 1994; von Helversen in von Helversen, 1998; Pollack, 2000). Pri kratkorogih kobilicah spreminjanje dolžine zvočnih signalov in njihove ponavljalne frekvence odločilno vpliva na prepoznavanje vrstno specifičnih signalov (Ronacher in sod., 2000). Zvočni in vibracijski nevroni so običajno široko uglašeni, z največjo občutljivostjo v frekvenčnem območju dominantne frekvence napeva lastne vrste. Pri murnu Teleogryllus 16 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 oceanicus najdemo na primer dva vrhova občutljivosti – pri 4,5 kHz (dominantna frekvenca napevov) ter pri 25-50 kHz, frekvenci, ki jo uporabljajo netopirji pri eholokaciji. Tu je funkcija slušnega sistema dvojna – lociranje spolnih partnerjev ter opozarjanje na nevarnost (Pollack in Imaizumi, 1999). Vibracijski napevi stenic iz družine Pentatomidae so vrstno specifični. Signali različnih vrst se med seboj razlikujejo predvsem v časovnih parametrih vibracijskih signalov in njihovi frekvenčni modulaciji, dominantna frekvenca vseh napevov pa se giblje med 70 in 130 Hz (Čokl in sod., 2001; Blassioli Moraes in sod., 2005). Vedenjski poskusi so pokazali, da signali samičinega pozivnega napeva vrste Acrosternum hilare (Pentatomidae) ne prožijo odziva pri samcih vrste N. viridula (Miklas in sod., 2003a), prav tako pa so samci zelene smrdljivke sposobni razločevanja med napevi samic iste vrste in simpatričnih vrst Thyanta pallidovirens in T. custator accera (Hrabar in sod., 2004). K sistemu vrstno specifičnega razpoznavanja ob omenjenih razlikah v parametrih vibracijskih napevov pa doprinesejo tudi razlike v kemični sestavi feromonov (Aldrich in sod., 1987; Baker in sod., 1987; Aldrich in sod., 1989; McBrien in Millar, 1999). Pri zeleni smrdljivki je ena od receptorskih celic subgenualnega organa uglašena na 200 Hz, kar odstopa od dominantne frekvence napevov (Čokl, 1983). Uglašenost sovpada z resonančnim spektrom zelenih rastlin gostiteljic (Čokl in sod., 2005). Druga celica je uglašena na višje frekvence in najverjetneje nima pomembnejše vloge v intraspecifični komunikaciji. Receptorske celice, uglašene med 60 in 80 Hz, pa so lahko občutljive na enega od subdominantnih vrhov napevov. 1.9 NAMEN NALOGE Vedenjski aspekt vibracijske komunikacije je pri stenici Nezara viridula (L.), zeleni smrdljivki, že obsežno raziskan, kar predstavlja primerno izhodišče za pričujočo nalogo. Samci zelene smrdljivke so sposobni orientacije v smeri vira vibracij v kompleksnem okolju in na relativno velike razdalje. Za razliko od ravnokrilcev, pri katerih je do sedaj bilo opravljenih največ raziskav o procesiranju vibracij, čeprav pri njih zaznavanje le-teh zgolj dopolnjuje komunikacijo z zvokom, pa je pri zeleni smrdljivki vibracijska komunikacija osrednjega pomena v paritvenem vedenju. Namen naloge je opisati vlogo delovanja živčevja pri vodenju procesov v okviru vibracijske komunikacije ter integriranje senzoričnih vhodov in centralno procesiranje vibracijskih signalov. V nalogi smo prvič morfološko opisali vibracijske nevrone pri žuželkah, pri katerih je primarna komunikacija z vibracijskimi signali. 17 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Z umetno sintetiziranimi vibracijskimi signali in tehniko intracelularnega odvajanja aktivnosti s hkratnim barvanjem živčnih celic smo fiziološko in morfološko identificirali vibracijske internevrone v centralnem gangliju in receptorske celice, ki projicirajo v centralni ganglij iz drugega in tretjega para nog. Na podlagi lege vhodnih in izhodnih regij posameznih internevronov ter latence in tipa odgovora na vibracijske dražljaje smo sklepali na njihovo povezljivost. Funkcijo in obliko identificiranih celic smo primerjali z doslej opisanimi vibracijskimi in bimodalnimi nevroni ravnokrilcev. Da bi simulirali naravne razmere, s katerimi se žival srečuje na rastlinah, smo posneli vibracijske signale pozivnega napeva samice na različnih delih rastline in jih nato uporabili kot dražljaj pri zunajceličnem odvajanju aktivnosti iz internevronov in receptorskih celic v centralnem gangliju. Z analizo odzivov celic na te signale smo ugotavljali, kateri parametri imajo pomembno vlogo pri orientaciji živali proti viru vibracij in kako so v odzivu celic kodirane spremembe v spektralni, intenzitetni in časovni strukturi signalov, do katerih pride med prevajanjem vibracij po rastlinah. 18 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 2 MATERIAL IN METODE 2.1 ŽIVALI 2.1.1 Gojenje Vse poskuse smo izvedli na odraslih stenicah vrste Nezara viridula L. (Heteroptera: Pentatomidae), ki so bile starejše od 10 dni po zadnji levitvi. Uporabili smo osebke obeh spolov (skupno 105 živali). Živali so izhajale iz kalifornijske, japonske, francoske ter slovenske populacije. Gojili smo jih v laboratoriju v plastičnih posodah (38x23x23 cm) pri 22-26°C, 70-80% relativni zračni vlagi ter pri dnevno-nočnem ciklu 16h:8h. Živali smo hranili s sončničnimi semeni (Helianthus anuus L.), z rastlinami in stroki fižola (Phaseolus vulgaris L.) ter z arašidi (Arachis hypogaea L.). 2.1.2 Preparacija živali za nevrofiziološke poskuse Poskusno žival smo s segreto mešanico kolofonije in voska pritrdili z dorzalno stranjo navzgor na kovinski nosilec v obliki črke U. Odrezali smo ji ščitek (scutelum) in protorakalni tergit (pronotum) ter odstranili mišično maso v oprsju in večino notranjih organov. Tako smo izpostavili centralni ganglij. Da bi preprečili izsušitev, smo ganglij ves čas poskusa vlažili s fiziološko raztopino (Priloga). 2.2 SNEMANJE VIBRACIJSKIH SIGNALOV NA RASTLINI Naravne vibracijske signale spolno zrelih samic smo snemali z laserskim vibrometrom (Polytec, Waldbronn, Germany; OFV-353 – senzorska glava, OFV-2200 – kontrolni del) na rastlinah fižola (Phaseolus vulgaris) in na ciperusu (Cyperus sp.). Samico smo postavili na rastlino ter ji približali samca. Ko je začela oddajati signale t.i. samičinega pozivnega napeva, smo laserski žarek usmerjali na različne točke na rastlini, predhodno označene s korekturnim belilom zaradi boljšega odboja svetlobe. Nekaj meritev smo opravili tudi tako, da smo na listno bazo pritrdili magnet in ga vibrirali z elektromagnetom, ki je bil od njega oddaljen 0,5-1 cm. Magnet je tehtal 26 g, kar približno ustreza teži odraslih samic. Na fižolu smo izbrali štiri točke okoli križišča (dve na listnih pecljih, dve na steblu), ki so bile od razvejitve oddaljene po 1 cm (sl. 4). Na ciperusu smo signale snemali na 19-ih točkah, ki so si sledile na razdalji 1-2 cm od vrha do baze stebla. Samica je med oddajanjem pozivnega napeva stala ves čas na istem mestu na enem od listov, blizu listne baze (sl 4). 19 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Na vsaki točki smo posneli po 10 signalov, ki smo jih shranjevali v računalnik s programom Cool Edit Pro 2.0 (Syntrillium Software Corporation, Phoenix, ZDA). Slika 4: Točke na fižolu (4 točke) in ciperusu (19 točk), na katerih smo posneli vibracijske signale samičinega pozivnega napeva. 2. 3 IZVEDBA FIZIOLOŠKEGA POSKUSA 2.3.1 Postavitev poskusa in beleženje aktivnosti celic Poskuse smo izvajali v Faradayevi kletki (sl. 5). Jekleno mizo, na kateri smo izvajali poskuse, smo podložili z gumijastimi podstavki debeline 5 cm; tako smo zagotovili dovolj učinkovito dušenje tresljajev iz okolja. Nosilec s stenico smo pritrdili na mikromanipulator (M-152; Narishige, Tokio, Japonska) ter žival namestili nad vibracijski vzbujevalnik - ang. minishaker (tip 4810, Bruel & Kjar, Narum, Danska). Vseh šest nog smo z mešanico voska in kolofonije s pomočjo zobotrebcev pritrdili na konico vibracijskega vzbujevalnika. Da bi omejili premikanje centralnega ganglija tekom poskusa in olajšali dostop z elektrodo, smo ga podložili z jekleno žičko ter rahlo privzdignili. V zadek živali smo namestili srebrno žičko, ki je služila kot indiferentna elektroda. Za zunajcelično beleženje aktivnosti živčnih celic smo uporabljali borosilikatne elektrode s filamentom (tip BF 100-58-15; Sutter Instrument, Novato, ZDA), za znotrajcelične odvode pa prav tako borosilikatne elektrode, a z nekoliko debelejšo steno (tip BF 120-69-15; Sutter Instruments, Novato, ZDA). Elektrode smo izdelali s horizontalnim vlečnikom Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 20 (Micropipette Puller P-87; Sutter Instrument, Novato, ZDA). Elektrode za zunajcelične odvode smo napolnili s 3M raztopino KCl. Njihova upornost je znašala med 20 in 35 M?. Elektrode za znotrajcelično odvajanje aktivnosti živčnih celic pa smo pripravili tako, da smo konico napolnili s 5% raztopino barvila Lucifer Yellow (L0259, Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, ZDA) v 0,5M LiCl, preostali del elektrode pa z 0,5M LiCl; njihova upornost je znašala 80 do 120 M?. Elektrodo smo pritrdili v polčlen, tega pa namestili na sondo znotrajceličnega ojačevalnika (Cyto 721; WPI, Sarasota, ZDA). Sondo smo vpeli v držalo na mikromanipulatorju (Leitz, Wetzlar, Nemčija). Odzive celic smo beležili iz medialnega dela centralnega ganglija. Ojačane živčne impulze smo skupaj z dražljaji (te smo ojačali preko ojačevalnika, izdelanega v laboratoriju, intenziteto pa smo spreminjali z v laboratoriju narejenim stikalom) opazovali na osciloskopu (OS 5020P; Goldstar, Koreja). Draženje in odzive celic smo na dveh kanalih shranjevali v standardni PC s programom Cool Edit Pro 2.0. Podatke smo zajemali s stopnjo Slika 5: Shema postavitve poskusa (set-up). 21 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 vzorčenja 44100 Hz. Zapise zunajceličnih odvodov smo za nadaljnjo obdelavo shranili v program Spike 2 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, VB) preko A/D pretvornika (CED 1401 plus). 2.3.2 Draženje Z vibracijskim vzbujevalnikom smo hkrati tresli vseh šest nog stenice. Živali smo dražili z naravnimi in umetnimi vibracijskimi signali. 2.3.2.1 Naravni vibracijskih signali Za draženje smo izbrali zaporedje vibracijskih signalov samičinega pozivnega napeva, posnetih z laserskim vibrometrom na fižolu (zaporedje je sestavljalo po 10 signalov z vsake od štirih točk okoli križišča (sl. 6, A)) ter zaporedje signalov, posnetih na ciperusu (zaporedje so sestavljali po štirje signali z vsake od 19-ih točk (sl. 6, B)). A ---- 200 ms 19 Slika 6: Zaporedji vibracijskih signalov samičinega pozivnega napeva, posnetih na fižolu (A) in steblu ciperusa (B). 1 * 2 3 4 4 1 2 6 1 8 7 * Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 22 2.3.2.2 Umetno sintetizirani vibracijski signali Sinusne signale smo naredili s pomočjo računalniškega programa Sound Forge 4.0 (Sonic Foundry; Madison, ZDA) in jih ojačali z močnostnim ojačevalnikom Startech A-50 (StarTech, Groveport, ZDA). Močnostni ojačevalnik je bil povezan z vibracijskim vzbujevalnikom, na katerega smo pritrdili noge poskusne živali. Intenziteto dražljajev na vibracijskem vzbujevalniku smo umerili z laserskim vibrometrom. Z v laboratoriju narejenim stikalom smo spreminjali intenziteto dražljajev med posameznimi serijami v stimulacijskem protokolu. Dolžina signalov je bila 100 ms, z 10 ms trajajočo fazo naraščanja amplitude na začetku ter 10 ms trajajočo fazo upadanja na koncu signala (sl. 7). Njihova ponavljalna frekvenca je bila 2 Hz (400 ms trajajoč interval med enim in drugim dražljajem). 10 ms (iiuif.|U 100 ms 10 ms Slika 7: Umetno sintetiziran vibracijski signal frekvence 300 Hz. Ostale parametre dražljajev (frekvenco in intenziteto signalov) v stimulacijskem programu smo izbrali glede na znano območje delovanja vibracijskih receptorjev pri zeleni smrdljivki (Čokl, 1983). Stimulacijski protokol: Žival smo dražili z osmimi serijami 14-ih dražljajev naslednjih frekvenc: 50, 70, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000 in 4000 Hz. Znotraj ene serije so imeli dražljaji isto intenziteto. Serije dražljajev so si sledile od tiste z najvišjo do tiste z najnižjo intenziteto: 100, 70, 50, 20, 10, 5, 1 in 0˙5 cm/s2. Sledil je še t.i. intenzitetni test – sekvenca enajstih dražljajev frekvence 100 Hz z naraščajočo intenziteto od 50 do 7500 cm/s2 (50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000 in 7500 cm/s2). Pri vseh živalih smo opravili osem serij 14-ih dražljajev; če je bil signal celice stabilen, smo serije 1-2 krat ponovili. Intenzitetni test smo izvedli 1-3 krat, prav tako v odvisnosti od 23 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 stabilnosti signala celice. Dražljajem najmočnejših intenzitet je sledil premor, dolg vsaj 1 s. Pri spontano aktivnih celicah smo posneli nekaj sekund aktivnosti brez draženja, tako da smo lahko ovrednotili stopnjo spontane aktivnosti. 2.3.3 Označevanje celic V sklopu poskusov znotrajceličnega odvajanja živčnih implulzov smo po zaključku fiziološkega testiranja vsako od celic, pri katerih smo zabeležili odzive na vibracijske signale, pobarvali z znotrajceličnim fluorescentnim barvilom Lucifer Yellow (metoda opisana v Stewart, 1978). Barvilo smo injicirali v celico s konstantnim hiperpolarizacijskim tokom (2-4 nA, 1-5 min). Amplituda akcijskih potencialov se je po hiperpolarizaciji povečala. Moč hiperpolarizacijskega toka smo povečevali do stopnje, pri kateri smo še lahko spremljali odziv celice na draženje. Pri vsaki poskusni živali smo s hiperpolarizacijo barvali največ po eno celico. 2.3.4 Obdelava tkiva in mikroskopiranje Po končanem barvanju smo prsno votlino živali navlažili s fiziološko raztopino ter jo dali za nekaj minut v temo, da je barvilo še nekaj časa difundiralo po celici. Nato smo iz živali izpreparirali protorakalni in centralni ganglij ter ju 1-2 uri fiksirali v 4% raztopini formaldehida v fosfatnem pufru (PB) (Priloga). Po spiranju v PB (2 x 10 min.) smo preparat dehidrirali v alkoholni vrsti (1 x po 10 min. v 50, 70, 90 in 96% etanolu ter 2 x po 10 min v 100% etanolu) ter ga nazadnje zbistrili v metil salicilatu (5-10 min.). Tako je bil preparat pripravljen za opazovanje pod mikroskopom. Na objektno stekelce smo kanili kapljico metil salicilata in preparat položili vanjo. Okoli kapljice smo nanesli silikonski gel, da krovno stekelce ne bi sploščilo preparata. Preparate smo opazovali pod svetlobnim mikroskopom (Leica DMRB/E, Leica Microsystems AG, Wetzlar, Nemčija) pri različnih povečavah (100, 160, 250 in 400 x). Presvetljevali smo jih z modro svetlobo valovne dolžine 430 nm in jih opazovali kot fluorescenten objekt v temnem polju. Preparate smo fotografirali s kamero AxioCam MR (Carl Zeiss, Oberkcohen, Nemčija) s pomočjo programa AxioVision 3.1 (Zeiss) v različnih ravninah. Zabeležili smo razdalje med glavnimi deli živčne celice (telo, akson in dendritska regija) v tretji dimenziji in njihovo medsebojno lego. V programu Photoshop 8.0 (Adobe Systems Inc., San Jose, ZDA) smo fotografije različnih ravnin nalagali eno na drugo ter s pomočjo sistema Graphire 2 (grafična tabla in brezžično pero, Wacom Europe, Krefeld, Nemčija) izrisali celotno celico. 24 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 2.4 ANALIZA REZULTATOV 2.4.1 Analiza elektrofizioloških podatkov 2.4.1.1 Odzivi na signale samičinega pozivnega napeva S programom Spike 2 5.11 (CED, Cambridge, VB) smo analizirali odzive internevronov v centralnem gangliju na vibracijske signale samičinega pozivnega napeva, posnete na fižolu in ciperusu. Analizirali smo odgovore 51 celic 37 živali na signal, posnet na ipsilateralnem peclju na fižolu, 3 cm stran od samice, ki je oddajala samičin pozivni napev in odgovore 30 celic 23 živali na signala, posneta na steblu ciperusa na razdaljah 9 in 15 cm od samice (zaradi obsežnosti naloge smo se omejili zgolj na analizo odzivov na tri signale naravnih napevov). Akcijske potenciale (v nadaljevanju AP) smo kot dogodke v času predstavili v obliki rasterskega diagrama. Obravnavane dražljaje smo predstavili v obliki oscilogramov in sonogramov, izdelanih s programom SoundForge in Raven 1.2 (Cornell Lab of Ornithology, Bioacoustics Research program). Odgovore različnih celic na isti dražljaj smo predstavili tudi v obliki grafa kumulativnih frekvenc ter analizirali podobnosti in razlike med njihovimi vzorci proženja akcijskih potencialov s klastrsko analizo, katere rezultati so predstavljeni v obliki dendrogramov. Za klastrsko analizo smo uporabili standardizirano evklidsko razdaljo in metodo skupinskega povprečja (group average). Mera za primerjavo aktivnosti posameznih celic med draženjem je bila stopnja proženja akcijskih potencialov v času. Za analize smo uporabili program Excell in program za statistično obdelavo podatkov R 2.1.0 (vir: www.r-project.org). 2.4.1.2 Odzivi na umetno sintetizirane vibracijske signale Odzive 38 celic 38 živali smo analizirali v programu Sound Forge (Sonic Foundry; Madison, ZDA). Nekatere celice so prožile AP neodvisno od draženja, kar imenujemo spontana aktivnost. Pri takih celicah smo odgovor ovrednotili z odštevanjem spontane aktivnosti. Kot odgovor celice smo šteli število AP v intervalu 300 ms od nastopa dražljaja oz. od nastopa dražljaja do začetka pojava hiperpolarizacije (pri celicah z izraženo hiperpolarizacijo po ekscitacijskem odgovoru). Povprečno frekvenco spontane aktivnosti celice smo ovrednotili tako, da smo prešteli število akcijskih potencialov v 10 naključno izbranih intervalih brez draženja v trajanju 500-1000 ms. Če je bila spontana aktivnost izjemno neenakomerna, smo jo določali v časovnem oknu 300 ms neposredno pred določenim dražljajem. Število AP v enakem časovnem intervalu, kot je bil tisti, v katerem smo določali odziv celice, smo odšteli od odgovora celice. Če je bil rezultat pozitiven, smo odgovor ovrednotili kot ekscitacijo, če pa je bil negativen, pa kot inhibicijo. Enak način vrednotenja smo uporabljali tudi pri celicah, kjer sta bila v odgovoru jasno vidna tako inhibitorni kot ekscitatorni input. 25 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005___________________________ Za vsako celico smo določili vzdražni prag pri posamezni frekvenci dražljajev. Vzdražni prag za ekscitacijo smo definirali kot najnižjo intenziteto dražljaja, pri kateri je vsaj v polovici ponovitev prišlo do pojava AP v odzivu. V primeru, da je celica spontano prožila AP, smo vzdražni prag za ekscitacijo definirali kot najnižjo intenziteto dražljaja, pri kateri smo vsaj v polovici ponovitev dobili pozitivno vrednost pri oceni jakosti odziva celice na opisani način. Vzdražni prag za inhibicijo smo nasprotno definirali kot najnižjo intenziteto, pri kateri smo vsaj v polovici ponovitev dobili negativno vrednost. Frekvenčno odvisnost vzdražnega praga smo prikazali v krivuljah vzdražnega praga. Kot merilo za jakost odgovora smo obravnavali število AP na dražljaj. Izointenzitetne krivulje prikazujejo odvisnost jakosti oz. velikosti odgovora celice od frekvence dražljaja pri konstantnem pospešku 100 cm/s2. Intenzitetne krivulje kažejo odvisnost jakosti odziva od intenzitete dražljaja. Prikazali smo jo pri frekvenci največje občutljivosti posamezne celice, nekajkrat pa tudi pri več frekvencah. Latenco odziva smo definirali kot čas od začetka dražljaja do vrha prvega AP v odzivu. Pri celicah z neprestanim spontanim proženjem AP relativno konstantne frekvence smo ocenili, kje bi se po nastopu dražljaja pojavil naslednji AP, upoštevaje frekvenco spontane aktivnosti, če draženja ne bi bilo. Če se je AP pojavil prej, smo latenco ekscitacijskega odgovora definirali kot čas od začetka nastopa dražljaja do vrha omenjenega AP. Če je prišlo do izpada AP na pričakovanem mestu, smo čas med začetkom dražljaja in mestom, kjer naj bi se le-ta pojavil ob nemoteni spontani aktivnosti ocenili kot latenco inhibicije. Z latenčnimi krivuljami smo prikazali latence odzivov v odvisnosti od intenzitete dražljajev. Pri intenzitetnih in latenčnih krivuljah smo intenziteto dražljaja izrazili v decibelih (dB), in sicer relativno glede na intenziteto vzdražnega praga pri določeni frekvenci (vrednosti so navedene ob grafih). Relativno intenziteto vibracij smo izračunali po naslednji enačbi: dB = 20 log (x/x f); pri tem je x pospešek vibracijskega dražljaja pri določeni frekvenci, x pa je pospešek ref pražnega dražljaja za to frekvenco. Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 2.4.2 Analiza oblike živčnih celic Pri opisovanju lege celic v gangliju smo uporabili naslednje termine (sl. 8): lateralno pomeni v smeri proti levemu oz. desnemu robu ganglija; medialno pomeni proti sredini med lateralnima robovoma ganglija; anteriorno označuje sprednji del ganglija, bližje glavi; posteriorno označuje del ganglija, ki je bližje zadku; dorzalno opisuje smer proti zgornjemu, hrbtnemu delu ganglija; ventralno označuje smer proti spodnjemu, trebušnemu delu ganglija; ipsilateralno se nanaša na lateralno polovico ganglija, v kateri leži celično telo (soma); kontralateralno se nanaša na nasprotno ganglijsko polovico, kjer ni some; bilateralno označuje lego v obeh polovicah ganglija. 26 Na skicah ganglijev so prikazani konektiv v protorakalni oz. subezofagealni ganglij (anteriorno), vhodi nožnih živcev (lateralno) ter vhod genitalnega živca (posteriorno). anteriorno N2 N3 N2 N3 posteriorno N1-3 nožni živci prvih, srednjih in zadnjih nog G genitalni živec Slika 8: Prikaz poimenovanja smeri pri opisu lege živčnih celic v gangliju. PTG - protorakalni ganglij; CG - centralni ganglij. 27 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 2.5 POIMENOVANJE ŽIVČNIH CELIC Receptorske celice smo poimenovali glede na njihove fiziološke značilnosti (frekvenčno območje največje občutljivosti oz. uglašenost). Za poimenovanje internevronov oz. njihovih tipov smo uporabili poimenovanje glede na morfologijo celice, kot ga je za slušne internevrone ravnokrilcev uvedel Hedwig (1986). Izhodišče takega poimenovanja je lokacija some celice v živčnem sistemu (sl. 9). Ker pri treh nevronih, ki smo jih opisali, lega some ni znana, smo jih začasno poimenovali V-1, 2 in 3 (vibracijski internevron 1, 2 in 3). CG - AC - 5 1. 2. 3. 4. vzpenjajoči akson telo celice = soma Slika 9: Primer poimenovanja internevrona v centralnem gangliju zelene smrdljivke. 1. Lega some: PTG = protorakalni ganglij CG = centralni ganglij 2. Potek aksona: A = ascending – vzpenjajoči se akson D = descending – spuščajoči se akson L = local – lokalni akson 3. Lega aksona glede na somo: I = ipsilateral – ipsilateralno; v isti lateralni polovici ganglija C = contralateral – kontralateralno; v nasprotni lateralni polovici ganglija B = bilateral – bilateralno; v obeh lateralnih ganglijskih polovicah 4. Zaporedna številka opisanega tipa celice (poljubno) 28 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 3 REZULTATI 3.1 RECEPTORSKE CELICE Pri različnih osebkih smo obarvali pet na vibracije podlage občutljivih čutilnih celic iz drugega in tretjega para nog. Na podlagi strukture in funkcije smo jih razdelili v dve skupini; poimenovali smo jih glede na frekvenčno območje največje občutljivosti: a) LFR (low frequency receptors) - nizkofrekvenčne in b) MFR (middle frequency receptors) - srednjefrekvenčne receptorske celice. Visokofrekvenčnih receptorskih celic nismo identificirali. 3.1.1 LFR – oblika in delovanje Oblika Centralne projekcije tega tipa celic smo pobarvali pri dveh živalih. Čutilni akson vstopa v centralni ganglij v posteriorni tretjini glavnega nožnega živca in v obliki loka projicira anteriorno do medialne linije ganglija (sl. 10). Anteriorno izraščajo iz aksona kolaterale, ki so vse krajše proti sredini ganglija. Akson je omejen na ipsilateralni del centralnega ganglija. Delovanje Obe LFR celici sta se odzivali na dražljaje frekvenc 50-300 Hz z vrhom občutljivosti pri najnižji testni frekvenci – 50 Hz. Krivulji vzdražnega praga obeh celic sta enaki (sl. 11, A). Vzdražni prag pri 50 Hz leži pod najnižjo testirano intenziteto (0,5 cm/s2 oz. 1,6 x 10-5 m/s). Prva celica je občasno spontano prožila akcijske potenciale (v nadaljevanju AP) s frekvenco do 45 Hz. Drugo celico je označevala enakomerna spontana aktivnost s frekvenco okoli 12 Hz. Celici sta odgovarjali fazno vezano do frekvence 150 Hz (sl.11, B). Pri dražljaju frekvence 50 Hz celici odgovarjata z 1-4 AP na fazo. Število AP na fazo je večje v začetnem delu dražljaja in narašča z naraščajočo intenziteto dražljaja (sl. 11, C). Izointenzitetni krivulji obeh celic sta podobni na glavo obrnjeni krivulji njunega vzdražnega praga (sl. 12, A); število AP na dražljaj je upadalo s 13-15 pri 50 Hz preko 10 pri 70 in 100 Hz do 1-4 pri 300 Hz. Intenzitetne krivulje kažejo spreminjanje jakosti odziva celic z naraščajočo intenziteto (sl. 12, B). Pri celici a je bil odziv pri 100 Hz konstanten (8-9 AP) v vsem merjenem območju, medtem ko je pri celici b narasel od 1 na 10 AP že v območju med 0 in 7 dB ter ostal na istem nivoju v območju med 7 in 26 dB nad vzdražnim pragom. 29 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Latence odzivov pri 50 Hz so bile ob vzdražnem pragu 14 oz. 18 ms; do 25 dB nad vzdražnim pragom so se krajšale in se ustalile pri 9 oz. 13 ms (sl. 12, C). Pri 100 Hz so bile latence odzivov bolj ali manj konstantne med 10 in 13 ms v vsem območju draženja. Slika 10: Morfologija nizkofrekvenčnih receptorskih celic LFR. Risbe in fotografija celic, napolnjenih z barvilom Lucifer yellow, v centralnem gangliju. Celici sta enako orientirani zaradi lažje primerjave (celica a – ventralni pogled, celica b – dorzalni pogled). 30 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 A B 100 10 1 0,1 15 mV L *V" N-iUvJL^ 40 ms 10 100 1000 10000 Frekvenca [Hz] C 30 mV —JUUUUL*. 70 cm/s2 5 cm/s2 0,5 cm/s2 50 Hz 70 Hz 100 Hz 200 Hz 100 ms Slika 11: A. Krivulji vzdražnega praga celic a in b tipa LFR (morfologija na str. 29). Bel znak kaže frekvenco, pri kateri vzdražni prag leži verjetno pod prikazanimi (najnižjimi testiranimi) intenzitetami. B. Fazno-vezan odgovor celice b na dražljaj frekvence 100 Hz, intenzitete 100 cm/s2 in trajanja 100 ms. C. Zapis odgovorov celice b na dražljaje različnih frekvenc in intenzitet. Dražljaji so prikazani pod odzivi celic. 31 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 A 16 12 8 4 C 20 18 16 14 12 10 8 100 200 300 Frekvenca [Hz] B 16 12 8 4 400 5 15 25 35 45 55 Intenziteta [dB] ¦-----a - 50 Hz ¦-----a - 100 Hz ¦A- ¦ -b - 50 Hz ¦A- - -b - 100 Hz a - 50 Hz a - 100 Hz b - 50 Hz b - 100 Hz -5 5 15 25 35 45 55 Intenziteta [dB] Slika 12: Izointenzitetne (A), intenzitetne (B) ter latenčne (C) krivulje celic a in b tipa LFR (morf. na str. 29). A. Jakost odziva celic a in b pri različnih frekvencah ter intenziteti 100 cm/s2. Pri celici a krivulja prikazuje povprečje treh meritev, pri celici b pa povprečje dveh meritev. Posamezni znaki prikazujejo posamezne meritve. B, C. Krivulje so prikaz ene meritve. Referenčne intenzitete (0 dB): pri 50 Hz – 0,5 cm/s2, pri 100 Hz – 5 cm/s2. 0 0 0 32 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 3.1.2 MFR – oblika in delovanje Oblika Pobarvali smo tri receptorske celice tipa MFR (sl. 13). Akson vstopa v centralni ganglij v posteriorni tretjini glavnega nožnega živca in projicira medio-anteriorno do medialne linije ganglija. Končne razvejitve so zelo goste in omejene na medialno polovico ipsilateralne polovice ganglija. Dobro so vidne terminalne zadebelitve. Slika 13: Morfologija srednjefrekvenčnih receptorskih celic MFR v centralnem gangliju. Risbe celic a, b in c ter fotografija celice a, napolnjene z barvilom Lucifer yellow. Vse dorzalni pogled. 33 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Delovanje Zabeležili smo odzive celic z oznakama a in b; celica c se je obarvala hkrati z enim od internevronov (str. 38), katerega aktivnost smo posneli. V nasprotju s precej podobno obliko se po funkciji celici a in b precej razlikujeta. Celica a je spontano prožila AP frekvenco 52 ± 16 Hz, mestoma v skupkih po 4-10 AP (sl. 14, A). V frekvenčnem območju med 50 in 100 Hz je med draženjem prišlo do inhibicije, a le pri nizkih intenzitetah dražljaja (sl. 14; B, C). Vzdražni prag za inhibicijo je bil pri intenziteti 1 cm/s2 (2,3 x 10-5 m/s pri 70 Hz; 1,6 x 10-5 m/s pri 100 Hz). Nad 20 cm/s2 inhibicija ni bila vidna; pri 70 in 100 Hz je bil pri visokih intenzitetah opazna celo ekscitacija (sl. 14, C). V frekvenčnem območju med 150 in 1000 Hz je imela celica vrh občutljivosti med 300 in 500 Hz, kjer je bil vzdražni prag pri 5 cm/s2 (2,6 x 10-5 m/s pri 300 Hz; 2 x 10-5 m/s pri 400 Hz; 1,6 x 10-5 m/s pri 500 Hz). Pri 300 Hz je pri intenziteti nad 50 cm/s2 prišlo do podaljšanega odziva (sl. 14, C). Celica b se je odzivala z enim samim AP vrh ekscitatornega postsinaptičnega potenciala do nekaj AP na dražljaj (sl. 14, D). Odzivala se je med 50 in 700 Hz, z vrhom občutljivosti pri 100-150 Hz, kjer je bil vzdražni prag verjetno nižji od najnižje testirane intenzitete dražljajev – 0,5 cm/s2 (8 x 10-6 m/s pri 100 Hz; 5,3 x 10-6 m/s pri 150 Hz). Izointenzitetni krivulji obeh celic sta zvonasti (sl. 15, A); pri celici a je jakost odgovora maksimalna pri 300 Hz, pri celici b pa med 100 in 200 Hz. Jakost odgovora obeh celic je najvišja pri frekvenci, kjer je celica najbolj občutljiva. Izointenzitetna krivulja celice a je veliko bolj strma, jakost odgovora med posameznimi frekvencami se razlikuje za faktor 10, medtem ko so razlike pri celici b manjše (število AP se poveča za faktor 2-3). Jakost odzivov smo izmerili pri frekvenci, pri kateri je bila posamezna celica najbolj občutljiva (sl. 15, B). Jakost odziva je pri celici a enakomerno naraščala od 5 AP na dražljaj pri vzdražnem pragu do 19 AP pri najvišjih merjenih intenzitetah. Pri celici b je prišlo do manjšega porasta jakosti odziva – število AP se je povečalo od 2 pri vzdražnem pragu do 8 pri 45 dB. Latence smo izmerili le pri celici a (sl. 15, C). Latence odgovorov pri dražljajih frekvence 300 in 400 Hz so se enakomerno krajšale z naraščajočo intenziteto dražljajev, od 21-22 ms na dražljaj so upadle na do 7-10 ms pri 23 dB nad vzdražnim pragom, ter se pri najvišji merjeni intenziteti znova nekoliko podaljšale. 34 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 A 10 mV 100 ms B 100 10 1 0,1 a - eksc. a - inh. b 10 100 1000 10000 Frekvenca [Hz] C 20 mV , ,„, * ::;:: m 70 Hz D 20 mV >u 300 Hz % 70 cm/s2 5 cm/s2 500 Hz \»u^-vvy «Nh X „w/> A, '"^v-v U 70 cm/s2 5 cm/s2 0,5 cm/s2 50 Hz 100 Hz 400 Hz Slika 14: A. Zapis spontane aktivnosti celice a tipa MFR (morfologija na str. 32). B. Krivulji vzdražnega praga celic MFR. Prikazane so vrednosti za celici a in b. S sivimi znaki je pri celici a prikazano območje inhibicije. Beli znaki kažejo frekevenčno območje, znotraj katerega leži vzdražni prag verjetno pod prikazanimi (najnižjimi testiranimi) intenzitetami. C, D. Zapis odgovorov celice a (C) in celice b (D) na dražljaje različnih frekvenc in intenzitet. Dolžina dražljajev, shematično prikazanih pod odgovori, je 100 ms. 35 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 A B 25 20 15 10 5 0 10 100 1000 Frekvenca [Hz] C 25 20 15 10 5 10000 25 20 15 10 5 0 a - 300 Hz Ab - 100 Hz -5 5 15 25 35 45 55 Intenziteta [dB] a - 300 Hz a - 400 Hz -5 0 5 10 15 20 25 30 Intenziteta [dB] Slika 15: Izointenzitetne (A), intenzitetne (B) in latenčne (C) krivulje celic MFR (morfologija na str. 32). A. Jakost odziva pri različnih frekvencah ter intenziteti 100 cm/s2. Pri celici a krivulja prikazuje povprečje treh, pri celici b pa povprečje dveh meritev. Posamezni znaki prikazujejo posamezne meritve. B, C. Krivulje so prikaz po ene meritve. Referenčne intenzitete (0 dB): celica a: pri 300 in 400 Hz – 5 cm/s2; celica b: pri 100 Hz – 0,5 cm/s2. 36 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 3. 2 INTERNEVRONI Pri različnih osebkih smo pobarvali 29 na vibracije podlage občutljivih internevronov. Na osnovi oblike, lege in funkcijskih lastnosti smo jih razvrstili v 9 skupin oz. tipov. Poimenovali smo jih z oznakami, ki opisujejo njihovo obliko in lego znotraj torakalnih ganglijev (glej str. 27). 25 celic ima somo v centralnem gangliju. Največ celic je v skupini CG-AC (19). To so celice s somo v centralnem gangliju in kontralateralno ležečim vzpenjajočim aksonom. Glede na razlike v strukturi in funkciji smo jih razdelili v pet tipov (CG-AC-1, 2, 3, 4 in 5). Pobarvali smo še 3 nevrone z dvema vzpenjajočima aksonoma, ki projicirata anteriorno v protorakalni ganglij (tip CG-AB) ter 3 lokalne nevrone, omejene na centralni ganglij (tip CG-L). Soma slednjih leži približno v medialni liniji centralnega ganglija. Identificirali smo en nevron s somo v protorakalnem gangliju in kontralateralno ležečim spuščajočim aksonom (tip PTG-DC). Pobarvali smo tudi 3 celice, za katere zaenkrat še ne poznamo lokacije some (celice V-1, V-2 in V-3). 37 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 3.2.1 Internevroni CG-AC 3.2.1.1 CG-AC-1 Oblika Pobarvali smo 13 celic tipa CG-AC-1 (sl. 16-19 ); čeprav se v podrobnostih razvejitev med seboj nekoliko razlikujejo, je vsem skupna lega some med vstopoma živcev drugega in tretjega para nog v centralni ganglij oz. med nevropilama druge in tretje noge. Pri celicah z oznakama g in h je lega some nekoliko drugačna, vendar domnevamo, da so te razlike zgolj posledica delne sploščitve ganglija pri opazovanju pod imerzijo pri večjih povečavah. Dendritsko drevo s končiči gladkega videza leži v celoti v ipsilateralni polovici ganglija, in sicer v senzorični nevropili zadnje ipsilateralne noge, kar lahko sklepamo iz hkratnega obarvanja receptorske celice in internevrona (celici i in i’). Aksonske razvejitve z dobro vidnimi odebelitvami na terminalnih končičih so omejene na kontralateralno polovico centralnega in protorakalnega ganglija. Akson prečka medialno linijo ganglija in tvori razvejitev v nevropili zadnje kontralateralne noge. Pri celicah a, b in j’ opazimo na tem mestu dve izraziti veji, ena je usmerjena lateralno in druga posteriorno. Pri ostalih celicah razvejitev pokriva območje ovalne oblike. Od tam se akson pod kotom 90° usmeri anteriorno proti protorakalnemu gangliju. Vzpenjajoči akson je omejen na medialno polovico kontralateralne polovice ganglija. Druga aksonska razvejitev je na nivoju nevropile druge kontralateralne noge. Pri nekaterih celicah (a, b, d, f, g, i, j’) vidimo eno ali dve močnejši veji z grahastimi odebelitvami na terminalnih odrastkih, ki potekata lateralno proti nožnemu živcu. Pri ostalih celicah je razvejitev strnjena, brez izrazitih vej. Na medialni strani aksona ni močnejših izrastkov, opazimo zgolj posamezne odebelitve terminalnih končičev. Akson se vzpenja v Slika 16: Morfologija celic a in b tipa CG-AC-1; risbi celic v centralnem gangliju ter fotografija celice b, napolnjene z barvilom Lucifer yellow. Orientacija celic je enotna zaradi lažje primerjave (a – ventralni pogled, b – dorzalni pogled). 38 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Slika 17: Morfologija celic c, d, e, f, g in h tipa CG-AC-1; risbe celic v centralnem oz. centralnem in protorakalnem gangliju. Desno fotografije celic, napolnjenih z barvilom Lucifer yellow. Orientacija celic je enotna zaradi lažje primerjave (c, e, h – ventralni pogled; d, f, g – dorzalni pogled). Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 39 protorakalni ganglij in pri celicah e, f, g, h in k vidimo, da tvori razvejitev tudi v nevropili prve kontralateralne noge. Pri omenjenih celicah (razen pri e in g) je bilo jasno vidno, da se akson iz protorakalnega ganglija vzpenja naprej v subezofagealni ganglij. Pri preparatih z oznakami i, j, k sta se obarvali po dve celici. Pri i je šlo za hkratno obarvanje receptorske celice in internevrona, čeprav smo zabeležili le odzive internevrona. Pri preparatu j se je pobarval bilateralno simetrični par celic (domnevamo, da sta celici fiziološko enaki, ne moremo pa z gotovostjo trditi, iz katere od obeh smo odvajali impulze). Pri preparatu k sta se pobarvali morfološko zelo podobni celici, katerih aksona potekata tesno drug ob drugem. Slika 18: Morfologija celic i in j tipa CG-AC-1. Risbe in fotografije celic, napolnjenih z barvilom Lucifer yellow, v centralnem gangliju. Vse dorzalni pogled. 40 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Slika 19: Morfologija celice k tipa CG-AC-1; risba in fotografija celice, napolnjene z barvilom Lucifer yellow, v centralnem in protorakalnem gangliju. Dorzalni pogled. Delovanje Od enajstih celic so štiri spontano prožile AP. Za celico i je bila značilna zelo neenakomerna spontana aktivnost, frekvenca proženja AP je nihala med 13 in 27 Hz. Od vseh ostalih se je razlikovala po obliki krivulje vzdražnega praga; največjo občutljivost je kazala pri 100 in 150 Hz z vzdražnim pragom pri 5 cm/s2, čeprav je bil pri višjih intenzitetah draženja odgovor močnejši pri najnižjih testnih frekvencah, tako kot pri vseh ostalih celicah iz te skupine. Spontano aktivne so bile tudi celice h, j in k, s frekvenco proženja AP med 8 in 18 Hz. Nekatere celice so se na dražljaje do 100 Hz pri visokih intenzitetah odzivale fazno vezano (sl. 20). Odzivi celic kažejo različno dinamiko proženja AP kot odziv na dražljaj in različne stopnje adaptacije (sl. 21, 22). Slika 20: Zapis fazno vezanega odgovora celice j tipa CG-AC-1 (morf. na sl. 18) na dražljaj frekvence 100 Hz, intenzitete 200 cm/s2 in dolžine 100 ms. Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 41 A 20 mV r^^ -^-frr _J^k^ -V, 50 Hz 70 Hz B 20 mV ^i/vW^ l\«W ^w 50 Hz 100 Hz U L^V ^v^ ~--..^v--v A^A/ 100 cm/s2 50 cm/s2 10 cm/s2 \J\s-AA 100 cm/s2 50 cm/s2 5 cm/s2 100 Hz 150 Hz C 20 mV 100 cm/s2 50 cm/s2 5 cm/s2 50 Hz 70 Hz 100 Hz Slika 21: Zapis odgovorov celic b (A), i (B) in j (C) tipa CG-AC (morfologija na str. 37 in 39) na dražljaje naraščajočih frekvenc in intenzitet. Dražljaji so shematsko prikazani pod odzivi, njihova dolžina je 100 ms. Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 42 mVl ... ^r^r^-f y 100 cm/s2 50 cm/s2 20 cm/s2 5 cm/s2 50 Hz 70 Hz 100 Hz 150 Hz 200 Hz Slika 22: Zapis odgovorov celice f tipa CG-AC-1 (morfologija na str. 38) na dražljaje naraščajočih frekvenc in intenzitet. Dolžina dražljajev je 100 ms; shematsko so prikazani pod odzivi. Vse celice v skupini CG-AC-1 so bile najbolj občutljive pri najnižji testni frekvenci, 50 Hz, razen celice i (največja občutljivost pri 100 in 150 Hz z vzdražnim pragom pri 5 cm/s2 (oz. 8 x 10-5 m/s pri 100 Hz in 5,3 x 10-5 m/s)) (sl. 23), vendar pa so se precej razlikovale po legi vzdražnega praga, ki je segal od 1 cm/s2 (3,2 x 10-5 m/s) pri celicah c in j do 100 cm/s2 (1,6 x 10-3 m/s) pri celicah d in h (za ti dve celici krivulja ni prikazana). Večina celic je odgovarjala na dražljaje v območju med 50 in 200 Hz (celici f in i do 300 Hz). 100 10 0,1 10 100 Frekvenca [Hz] 1000 Slika 23: Krivulje vzdražnega praga celic tipa CG-AC-1 (morfologija str. 37-40). Pri celicah c in f so bile vrednosti določene po dveh meritvah, pri ostalih celicah je bila opravljena po ena meritev. g 1 k Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 43 Glede na izointenzitetne krivulje lahko razdelimo celice v dve skupini, in sicer tiste, pri katerih je bil največji odgovor 8 ali več AP na dražljaj in tiste, pri katerih največji odgovor ni presegel 5 AP na dražljaj (sl. 24). Pri vseh je bil pri maksimalni testni intenziteti 100 cm/s2 največji odgovor pri 50 Hz in je strmo upadel na en akcijski potencial pri 200 oz. 300 Hz. 16 14 12 10 8 6 4 2 0 10 100 Frekvenca [Hz] 1000 10 100 Frekvenca [Hz] 1000 Slika 24: Izointenzitetne krivulje celic tipa CG-AC-1 (morfologija na str. 37-40) pri 100 cm/s2. Krivulje predstavljajo eno meritev oz. povprečje dveh (b, c, i, j), treh (f) ali sedmih (g) meritev. Intenzitetne krivulje prav tako razdelijo celice v dve skupini na podlagi jakosti odgovora (sl. 25), ki je bila pri vseh frekvenčno odvisna in je bolj ali manj enakomerno naraščala od vzdražnega praga do najvišje testne intenzitete. Razen pri celici f je jakost odgovora od vzdražnega praga do najvišje intenzitete vedno najbolj narasla pri 50 Hz. 20 16 12 8 4 15 25 35 45 Intenziteta [dB] 55 a - 100 Hz d - 100 Hz f - 50 Hz f - 100 Hz i - 50 Hz i - 100 Hz j - 100 Hz ¦¦o-o -5 15 35 Intenziteta [dB] 55 b - 50 Hz b - 100 Hz c - 50 Hz c - 100 Hz e - 50 Hz g - 50 Hz g - 70 Hz g - 100 Hz h - 100 Hz k - 100 Hz Slika 25: Intenzitetne krivulje celic tipa CG-AC-1 (morfologija na str. 37-40). Krivulje predstavljajo eno meritev oz. povprečje dveh (a, f), treh (d, j, k) ali štirih (b-100 Hz) meritev. 5 a 0 0 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 44 Latence odgovora celic so se na nivoju vzdražnega praga gibale med 30 in 40 ms; z višanjem intenzitete dražljaja so se močno skrajševale in se ustalile pri 15 do 25 ms (sl. 26, levo). Pri nekaterih celicah so bile ob vzdražnem pragu latence daljše; znašale so tudi do 70 ms (sl. 26, desno), z naraščanjem intenzitete draženja pa so se skrajšale na okoli 20 (b) oz. 45 ms (e). 45 40 35 30 25 20 15 10 -5 5 15 25 35 Intenziteta [dB] 45 a - 100 Hz f - 50 Hz f - 100 Hz h - 100 Hz i - 50 Hz i - 100 Hz k - 50 Hz k - 100 Hz 75 65 55 45 35 25 15 b - 50 Hz b - 100 Hz c - 50 Hz e - 50 Hz e - 70 Hz g - 50 Hz g - 70 Hz g - 100 hz -5 5 15 25 35 45 Intenziteta [dB] Slika 26: Latenčne krivulje celic tipa CG-AC-1 (morfologija na str. 37-40). Krivulje predstavljajo eno meritev oz. povprečje dveh (a, c, f, h) ali treh (b, k) meritev. Referenčne intenzitete (0 dB) (sl. 25 in 26 ): celica a: pri 100 Hz – 20 cm/s2; celica b: pri 50 in 100 Hz – 5 cm/s2; celica c: pri 50 Hz – 50 cm/s2, pri 100 Hz – 100 cm/s2; celica d: pri 100 Hz – 100 cm/s2; celica e: pri 50 Hz – 10 cm/s2, pri 70 Hz – 20 cm/s2; celica f: pri 50 Hz – 5 cm/s2, pri 100 Hz – 10 cm/s2; celica g: pri 50 in 70 Hz – 1 cm/s2, pri 100 Hz – 5 cm/s2; celica h: pri 100 Hz – 100 cm/s2; celica i: pri 100 Hz – 5 cm/s2; celica j: pri 100 Hz – 5 cm/s2; celica k: pri 50 Hz – 70 cm/s2, pri 100 Hz – 100 cm/s2. 45 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 3.2.1.2 CG-AC-2 Oblika Pobarvali smo tri celice tega tipa. Celici a in b imata skoraj identično obliko, medtem ko se celica c nekoliko razlikuje (sl. 27 in 28). Glede lege some in vzpenjajočega aksona so celice podobne tipu CG-AC-1, vendar pa jih krivulja vzdražnega praga od omenjene skupine ločuje in hkrati povezuje v poseben tip. Njihova soma leži med nevropilama druge in tretje noge, v lateralni četrtini ipsilateralne polovice ganglija. Primarni izrastek some, dolg približno eno tretjino širine ganglija teče medialno proti sredini ganglija. V centralnem delu ganglija iz glavne veje izraščajo kratke kolaterale posteriorno-lateralno v smeri nevropil tretjega para nog in anteriorno. Vsi končiči v centralnem gangliju so gladkega videza. Znotraj medialne tretjine kontralateralne polovice ganglija se akson usmeri anteriorno. Na nivoju drugega para nog izraščajo kratke kolaterale proti nevropili kontralateralne (a, b) in ipsilateralne noge (c). Akson zapušča centralni ganglij v medialni polovici kontralateralne polovice konektiva s protorakalnim ganglijem. Delovanje Vse celice so spontano prožile AP v neenakomernem ritmu s frekvenco med 15 in 35 Hz (a 19,6 ± 3,4 Hz; b 22,5 ± 2,5 Hz; c 29,8 ± 3,8 Hz). Celica a je na dražljaje odgovarjala z ekscitacijo (sl. 29), medtem ko so bili odgovori pri celicah b in c rezultat seštevanja različno intenzitetno odvisnih ekscitatornih ter inhibitornih vhodov (sl. 30). a y 200 Slika 27: Morfologija celice a tipa CG-AC-2. Risba in fotografija celice, napolnjene z barvilom Lucifer yellow v centralnem gangliju. Dorzalni pogled. 46 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 100 \im Slika 28: Morfologija celic b in c tipa CG-AC-2. Risbe in fotografije celic, napolnjenih z barvilom Lucifer yellow, v centralnem gangliju. Oboje dorzalni pogled. 30 mV 100 cm/s2 Slika 29: Zapis odgovorov celice a tipa CG-AC-2 (morf. na sl. 27) na dražljaj frekvence 100 Hz, dolžine 100 ms in naraščajočih intenzitet. Dražljaj je shematsko prikazan pod odgovori. 10 cm/s2 0mj& 1 cm/s2 100 Hz b c 47 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 A 30 mV ^^ «^f»W+*)JJ> J\J *f s %mi ^JMKXAJs XJ^ Wj /W v4**- jtix^^w*^". XJkß ,>? •'/t;. MJ* I 40 I 35 m 30 • • • 25 ^ ^••^» •• • !¦•• M • • • ••)•«¦ • • • • ••• • • • • • • •» • • • • • • •M • • • • • • • • • • • • • • • • • • 5 ^«js^j.-: ^^^^z: &vLh^L:- LL&•• •• JtliSSU ****¦—*««—»— »»««¦¦»»¦»««¦¦¦»«» .........«-¦¦........«~.-»........ .»»»r...»~. . • ««•M ¦¦»¦¦¦¦¦¦¦¦¦¦¦¦¦¦•• • ••¦••««¦•«••«••• «••••«•«••••••«••«••««••«¦«•«•¦••• «MMMMM iii---------1iiii---------1i---------1---------1i---------1---------1i---------1---------1i---------r C B A 400 350 300 25° 200 150 100 50 0 -~~wv^1ViIJ| li I I i|j|ttVM~~~ i--------'i'i'-------1'-------1-------'i'-------1'-------1'i-------'i-------' i ' i ' i ' i ' r 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 Čas [s] Slika 58: Oscilogram (spodaj) in sonogram (v sredini) vibracijskega signala samičinega pozivnega napeva ter rasterski diagram (zgoraj), ki prikazuje odzive 51 internevronov v centralnem gangliju na spodnji signal. Internevroni so razporejeni glede na vrstni red v dendrogramu. Vibracijski signal je bil posnet na fižolu, in sicer na listnem peclju 3 cm od lista, na katerem je stala pojoča samica. 82 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 A 100 0,1 B 100 0,1 C 100 10 1 0,1 •—5 8 3K11 - eksc. X11 - inh •—15 16 10 100 1000 10000 Frekvenca [Hz] 19 - inh. 21 27 29 100 10 100 1000 10000 Fr e k ve n ca [ Hz] 0,1 40 A47 10 100 1000 10000 Frekvenca [Hz] 100 10 1 0,1 mcv mfjm/Jt 100 10 100 1000 10000 Frekvenca [Hz] 10 1 0,1 17 20 10 100 1000 10000 Frekvenca [Hz] ^hJ A36 •—43 O—43 - inh 10 100 1000 10000 Frekvenca [Hz] Slika 59: Krivulje vzdražnih pragov celic skupin A (celice od 1 do 16), B (celice od 17 do 33) in C (celice od 34 do 51). Celice so razdeljene na osnovi pasov v rasterskem diagramu (str. 80) oz. skupin v dendrogramu (str. 83). Slika 60 (str. 82): Graf kumulativih frekvenc proženja akcijskih potencialov 51 internevronov v centralnem gangliju kot odgovor na vibracijski signal samičinega pozivnega napeva. 1 1 1 83 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 mt+i HtllHHHilimWtmmH+IIHHI r Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 84 C B A Slika 61: Dendrogram podobnosti 51 internevronov v odzivu na vibracijski signal samičinega pozivnega napeva (str. 80), posnet na fižolu. 85 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 3.4.2 Ciperus Spreminjanje maksimalne intenzitete vibracijskih signalov samičinega pozivnega napeva po steblu ciperusa je podobno spreminjanju intenzitete dominantnega frekvenčnega vrha (105 Hz) (sl. 62, A in B). Vozli in vmesne ojačitve, ki so nastali zaradi stoječega valovanja v steblu, so za različne frekvence na različnih točkah (sl. 62, B), kar je posledica disperznega širjenja upogibnih valov. Analizirali smo odgovore 31 internevronov na vibracijska signala samičinega pozivnega napeva, posneta na steblu ciperusa na oddaljenosti 9 (signal 1) in 15 cm (signal 2) od samice (sl. 62). Signala sta se razlikovala po časovnih in spektralnih lastnostih (sl. 62 in 63). Pri signalu 1 je izstopal dominantni vrh (105 Hz), ki je imel intenziteto 46 dB višjo kot prvi subdominantni vrh (60 Hz). Pri drugem signalu je bil dominantni frekvenčni vrh še vedno pri isti frekvenci, vendar pa je njegova intenziteta glede na signal 1 upadla za 10 dB, medtem ko se je intenziteta subdominantnih frekvenčnih vrhov povečala. Posledica tega je sprememba v razmerjih med intenzitetami posameznih frekvenčnih vrhov znotraj vibracijskega signala. Rasterski diagram odzivov 30 internevronov na oba signala kaže jasen vpliv spremembe časovnih parametrov (sl. 63). Delno zliti pulzi signala 1 so se pri signalu 2 povsem zlili, kar se odraža v vzorcu proženja akcijskih potencialov. Grafa kumulativnih frekvenc (sl. 64) kažeta spreminjanje hitrosti proženja akcijskih potencialov v času. Grafa se razlikujeta po naklonih krivulj in njihovi razporeditvi. Dendrograma (sl. 65) razvrščata celice v skupine na podlagi podobnosti oz. razlik v dinamiki proženja akcijskih potencialov kot odgovor na vibracijski signal samičinega pozivnega napeva. Tako dendrograma kot grafa kumulativnih frekvenc odražata različne funkcionalne lastnosti celic in različne odzive na spremembe v spektralnih in časovnih parametrih napevov, do katerih pride med prenosom vibracijskih signalov po rastlinah. Korelacijski diagram odziva celic na signal 1 in signal 2 kaže, da je pri večjem delu celic kumulativna frekvenca proženja akcijskih potencialov nekoliko višja pri signalu 1 (sl. 66). Najbolj odstopata celici 6 in 30. Pri prvi se frekvenca proženja akcijskih potencialov zniža s 70-80 pri signalu 1 na 20-30 pri signalu 2. Pri drugi pa se frekvenca pri odgovoru na signal 2 zviša približno za faktor dva v primerjavi z odzivom na signal 1. 86 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 A 1 0,8 0,6 0,4 B 0,2 0 60 50 40 30 20 10 0 C 10 15 20 25 30 35 05 signal 1 signal 2 60 50 60 105 172 Frekvenca [Hz] 60 50 40 30 20 10 0 40 10 15 20 25 30 35 40 Oddaljenost od vira vibracij [cm] 60 Hz 105 Hz 172 Hz LU 60 105 172 Frekvenca [Hz] Slika 62: A. Spreminjanje intenzitete signala samičinega pozivnega napeva po steblu ciperusa navzdol. B. Spreminjanje relativnih intenzitet posameznih frekvenčnih vrhov v signalu samičinega pozivnega napeva. C. Relativna intenziteta frekvenčnih vrhov v vibracijskem signalu samičinega pozivnega napeva – spektralne lastnosti dveh signalov, posnetih na razdalji 9 cm (signal 1) in 15 cm (signal 2) od samice. 0 5 87 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 30 25 20« 15 10 5 < ••• • ••• • •« 300 250 200 150 100 50 0 -• i • ••••••• •• ••••••• •• • •• Signal 1 Signal 2 ,H„!l! Ill»*»*- W/i^Ä || 'ill' %\ H,i, „W" !»»* 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Čas [s] Čas [s] Slika 63: Oscilograma (spodaj) in sonograma (v sredini) vibracijskih signalov samičinega pozivnega napeva ter rasterska diagrama (zgoraj), ki prikazujeta odzive 30 internevronov v centralnem gangliju na spodnja signala. Diagram na levi in diagram na desni prikazujeta odgovore istih internevronov v istem vrstnem redu. Vibracijska signala sta bila posneta na steblu ciperusa medtem, ko je samica, ki je oddajala vibracijske signale, stala na enem izmed listov blizu listne baze. Signal 1 je bil posnet na razdalji 9 cm, signal 2 pa na razdalji 15 cm od samice. 1 999952 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 88 140 120 100 80 60 40 20 i*ftJWw*rtlWft~*WWl**WVIA- 120 100 80 60 40 20 200 400 600 800 Čas [ms] 1000 1200 1200 —¦- -1 —¦- -2 -3 —X- 4 —ä^ -5 —•- -6 —1— -7 ------ -8 -9 10 -11 12 —^— 13 -14 —•— -15 —1— 16 ------ -17 ------ -18 —¦- -19 —¦- 20 —A- -21 —^ -22 —*- -23 —•— -24 ----1— -25 -26 ------ -27 —¦- 28 —¦- -29 —A- -30 Slika 64: Grafa kumulativnih frekvenc proženja akcijskih potencialov 30 internevronov v centralnem gangliju kot odgovor na vibracijska signala samičinega pozivnega napeva (predstavljena sta na str. 77). 0 0 0 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 89 A 10 12-J 14—1 11—r 23 13i 16y 8 ' 6 — 30-i 22—f 18------1 17—il 20—' 15—i 29—' 27-1 19 26-1 21 25 9 5 2 7 1 4 3 B 30— 29-----1 28-----' 27- 26-25-24—1 23i| 22 21i 20l 19—i 18-iT 17-T 16- i------------1 15—| |~ 14—I 13--------------- 12--------------- 11-1________ 10 9 8 7 6 5 —i 4 —' 3 2 1 Slike 65: Dendrograma podobnosti 30 internevronov v odzivu na vibracijska signala samičinega pozivnega napeva, posneta na ciperusu na različnih razdaljah od vira vibracij (str. 85). A. Dendrogram podobnosti odziva celic na signal 1. B. Dendrogram podobnosti odziva celic na signal 2. 90 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 Kumulativna frekvenca proženja akcijskih potencialov kot odgovor na Signal 2 Slika 66: Korelacijski diagram odzivov 30 internevronov na vibracijska signala samičinega pozivnega napeva, posneta na ciperusu na različnih razdaljah od vira vibracij (str. 85). 91 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 4 RAZPRAVA IN SKLEPI Kljub obilici raziskav vibracijske komunikacije žuželk na vedenjskem nivoju je centralno procesiranje vibracijskih signalov še v veliki meri neraziskano. Večina informacij izvira iz raziskav na murnih in kobilicah, pri katerih je prevladujoča zvočna komunikacija in pri katerih orientacija v smeri vira vibracij ni bila opisana (kratkoroge kobilice) ali pa je relativno šibka (murni). V pričujoči disertaciji smo prvič morfološko in fiziološko identificirali vibracijske nevrone pri žuželkah, pri katerih je sporazumevanje z vibracijskimi signali preko podlage osnovni komunikacijski kanal. Pri zeleni smrdljivki (Nezara viridula (L.)) smo opisali strukturo in funkcijo dveh tipov receptorskih celic in devetih tipov vibracijskih internevronov. Z analizo odzivov vibracijskih internevronov na naravne napeve stenice, posnete na različnih delih rastline, smo osvetlili mehanizme za orientacijo v smeri vira vibracijskih signalov. 4.1 RECEPTORSKE CELICE 4.1.1 Oblika receptorskih celic in členjenost centralnega ganglija Obliko centralnih projekcij identificiranih receptorskih celic lahko primerjamo s centralnimi projekcijami vibracijskih receptorjev kompleksnega tibialnega organa, femoralnega hordotonalnega organa in kampaniformnih senzil ravnokrilcev. Enako kot pri ravnokrilcih (Eibl in Huber, 1979; Esch in sod., 1980; Grosch in sod, 1985; Römer in sod., 1988) so tudi pri zeleni smrdljivki centralne projekcije vibracijskih receptorjev omejene na ipsilateralno polovico ganglija. Raziskave vibracijsko-slušnega receptorskega sistema pri murnih so pokazale veliko podobnost med torakalnimi gangliji v tipih in projekcijah senzoričnih vlaken (Eibl in Huber, 1979). Iz tega sledi, da so si serijsko homonimne senzorične strukture v posameznih nogah podobne v območjih svojih centralnih projekcij in zato tudi v svoji povezavah z ostalimi živčnimi podsistemi v sklopu torakalnih ganglijev. Čeprav je centralni živčni sistem zelene smrdljivke v primerjavi z ravnokrilci v veliki meri centraliziran in reduciran (manjše število ganglijev kot posledica fuzije), pa je v centralnem gangliju še vedno opazen ostanek členjenosti – ločimo lahko mezotorakalni, metatorakalni in abdominalni del ganglija (sl. 67). V pričujočem delu smo opisali centralne projekcije dveh nizkofrekvenčnih (LFR) in treh srednjefrekvenčnih (MFR) receptorskih celic zelene smrdljivke. Med projekcijami receptorskih celic v mezotorakalno (iz drugega para nog) oz. metatorakalno (iz tretjega para nog) regijo centralnega ganglija ni bilo opaziti večjih strukturnih razlik, kar kaže na ostanek členjenosti znotraj reduciranega in centraliziranega živčnega sistema zelene smrdljivke in podpira domnevo, da se nevropile posameznih nog pri zeleni smrdljivki med seboj strukturno ne razlikujejo (Čokl in Amon, 1980). Prav tako so tudi posamezne razvejitve internevronov navadno omejene na eno regijo ganglija. 92 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Slika 67: Ostanki členjenosti centralnega živčnega sistema v centralnem gangliju stenice N. viridula. Pri ravnokrilcih sta vibracijski in slušni del nevropile ločena, bimodalni receptorji pa projicirajo v obe področji (Eibl in Huber, 1979; Römer, 1985; Kalmring in sod., 1996). Za centralne projekcije vibracijskih receptorjev murnov in dolgorogih kobilic je značilno, da se razvejijo takoj po vstopu v ganglij. Za kampaniformne senzile in hordotonalne organe je značilen bifurkacijski vzorec razvejitve, ki ga pri centralnih projekcijah subgenualnih receptorskih nevronov niso zasledili (Eibl in Huber, 1979; Grosch in sod., 1985; Bickmeyer in sod., 1992). Aksoni LFR celic zelene smrdljivke se prav tako razvejijo ob vstopu v ganglij, vendar so vse kolaterale aksona na frontalni strani. Najdaljša je prva kolaterala v frontalni smeri, podobno kot pri centralnih projekcijah receptorskih celic femoralnega hordotonalnega organa pri kratkorogih kobilicah (Matheson, 1992). Pri kratkorogih kobilicah so centralne projekcije subgenualnega organa podobne kot pri ostalih ravnokrilcih, medtem ko je morfologija aksonov dlačnih čutnic podobna centralnim projekcijam MFR nevronov zelene smrdljivke: gol akson brez kolateral z gosto razvejitvijo ob medialni liniji (Mücke in LakesHarlan, 1995). Centralne projekcije opisanih MFR receptorjev so tako strukturno kot po svoji legi precej podobne tudi tistim pri slušnih senzoričnih vlaknih tipa 5 pri murnu (Eibl in Huber, 1979; Esch in sod., 1980) in centralnim projekcijam slušnih receptorjev dolgorogih kobilic (Tettigoniidae) (Römer in sod., 1988); pri obeh gre za anteriorno-medialno usmerjeno projekcijo slušnega aksona z gosto terminalno razvejitvijo ob medialni liniji ganglija. 93 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Slika 68: Območja senzoričnih nevropil v centralnem gangliju. Zelena barva - LFR nevroni; modra in rdeča barva - MFR nevroni. Zaradi lažje predstavitve prostorske urejenosti aksonov znotraj posamezne nevropile so vse centralne projekcije na isti strani ganglija. Slušna nevropila ravnokrilcev je, prav tako kot čutnice na periferiji, urejena tonotopično – čutilne celice, uglašene na nižje frekvence zvoka, projicirajo v anteriorni del, tiste celice, ki pa se odzivajo na višje frekvence zvoka, pa v bolj posteriorni del nevropile (Oldfield, 1983; Römer in sod., 1988). Na podlagi svojih rezultatov lahko sklepamo na določeno stopnjo tonotopične organizacije tudi pri vibracijskem sistemu zelene smrdljivke, saj centralne projekcije različno uglašenih receptorskih celic pokrivajo prostorsko ločena področja v senzorični nevropili (sl. 68). Tako LFR kot MFR nevroni projicirajo v antero-medialni smeri do medialne linije ganglija. Prvi, z največjo občutljivostjo pri 50 Hz, pokrivajo anteriorni del nevropile od vhoda nožnega živca v ganglij do medialne linije, medtem ko MFR nevroni, z največjo občutljivostjo med 100 in 600 Hz s svojimi terminalnimi razvejitvami pokrivajo medialni del senzorične nevropile v območju medialne tretjine ipsilateralne polovice ganglija. Razen pri ravnokrilcih so centralne projekcije vibroreceptorjev delno opisane le še pri receptorskih celicah femoralnega hordotonalnega organa pri paličnjakih. Receptorski celici, ki ju je opisal Büschges (1994) in celica, ki sta jo opisala Stein in Sauer (1999) so podobne tistim pri ravnokrilcih in so prav tako omejene na ipsilateralno polovico ganglija. 94 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 4.1.2 Delovanje Kühne (1982a) je razdelil vibracijske receptorje ravnokrilcev v štiri funkcijske tipe: tip I (domnevno kampaniformne senzile) se odziva fazno vezano na vibracijske signale v frekvenčnem območju med 30 in 200 Hz, vzdražni prag odraža občutljivost na odmik iz ravnovesne lege, izražen kot pospešek znaša 3 cm/s2; tip II ima podobno delovanje kot tip I in v istem frekvenčnem območju, a je odvisen od pospeška dražljaja, njihov vzdražni prag je pri 100 cm/s2 (domnevno hordotonalni receptorji v sklepih (FCO) (Field in Pflüger, 1989)); tip III in IV predstavljajo receptorske celice subgenualnega organa, ki so občutljive na vibracije med 30 in 5000 Hz, njihovi odzivi pa izražajo občutljivost na pospešek. Tip III je najbolj občutljiv med 200 in 1000 Hz z vzdražnim pragom pri 1 cm/s2, medtem ko je občutljivost tipa IV nekoliko manjša. Tip I je fiziološko povsem primerljiv z LFR nevroni zelene smrdljivke, medtem ko celice tipa MFR glede na svojo uglašenost najverjetneje izvirajo v subgenualnem organu. Maksimalno občutljivost imajo med 100 in 600 Hz z vzdražnim pragom med 0,5 in 5 cm/s2 (v poglavju 4.1.3 spekuliramo o dugačnem izvoru celice a tipa MFR). Druge raziskave funkcionalnih lastnosti vibroreceptorskih celic pri različnih skupinah ravnokrilcev (Römer, 1985; Grosch in sod. 1985; Kühne in sod., 1984; Kalmring in sod., 1994) se večinoma ujemajo z opisano delitvijo v štiri skupine, ki jo je vpeljal Kühne (1982a). Po raziskavah Bickmeyerja (1992) naj bi bile receptorske celice femoralnega hordotonalnega organa pri kratkorogi kobilici Locusta migratoria celo nekoliko bolj občutljive (prag pod 1 cm/s2 pri frekvenci največje občutljivosti – 50 Hz) kot subgenualni organ (prag okoli 5 cm/s2 pri 200-500 Hz). Kalmring in sod. (1978) so opisali fiziološke lastnosti slušnih, bimodalnih in vibracijskih receptorjev pri dolgorogih kobilicah. Kljub težavam s pripisovanjem posameznih skupin receptorjev regijam v kompleksnem tibialnem organu je izvor enega tipa receptorjev bil zelo jasen – to so bili nizkofrekvenčni receptorji, ki so odgovarjali fazno vezano in so bili maksimalno občutljivi pri 50 Hz, kjer je bil vzdražni prag pri 3 cm/s2 – izvirali so iz kampaniformnih senzil. Sklepamo, da identificirani nizkofrekvenčni receptorji zelene smrdljivke (LFR) prav tako izvirajo v kampaniformnih senzilah, vendar je potrebno izpostaviti, da je njihov vzdražni prag najnižji od doslej opisanih. Grosch in sod. (1985) so primerjali delovanje vibracijskih receptorjev pri petem larvalnem stadiju in pri odraslem osebku kratkorogih kobilic (Locusta migratoria). Ugotovili so, da večjih razlik ni, le receptorji tipa III. (subgenualni organ) so pri larvalnem stadiju nekoliko manj občutljivi. Poskusi na dolgorogi kobilici Polysarcus denticauda so pokazali, da so vzdražni pragi vibracijskih receptorjev drugega para nog značilno nižji od vzdražnega praga receptorjev prvih in zadnjih nog (Kalmring in sod., 1996). Vendar pa je to verjetno odvisno od posamezne vrste, saj so odgovori vibroreceptorjev pri dolgorogi kobilici Gampsocleis gratiosa enaki 95 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 pri vseh parih nog (Kalmring in sod., 1994). Krivulji vzdražnega praga LFR receptorjev zelene smrdljivke sta identični, medtem ko se pri MFR receptorjih precej razlikujeta. Celica b prejema v območju nizkih frekvenc inhibitorni input, celica a pa odgovarja le z ekscitacijo. Lahko spekuliramo, da bi z blokiranjem inhibitornega inputa pri celici b prišli do krivulje, enake celici a, saj lahko pri višjih intenzitetah dražljaja frekvence 70 Hz opazimo v začetnem delu odgovora celice b ekscitacijski odgovor. Čeprav so bile sprva zmožnosti subgenualnega organa pri ščurku za zaznavanja vibracij podlage nekoliko precenjene (izmerjeni vzdražni prag je znašal 0,002 nm (Schnorbus, 1971)), saj se je kasneje izkazalo, da je ta vrednost nekoliko višje (0,2 nm (Shaw, 1994)), velja še vedno za enega najobčuljivejših vibracijskih receptorjev, ki so bili kadarkoli opisani v živalskem kraljestvu (Kalmring in sod., 1997). Vendar pa pri ravnokrilcih subgenualni organ ni nujno najobčutljivejši vibracijski receptor. Intermediarni organ, del kompleksnega tibialnega organa ravnokrilcev, je občutljiv tako na vibracije podlage kot na zvok. Raziskave Kalmringa in sod. (1994) na dolgorogih kobilicah ter Čokla in sod. (1995) na jamskih kobilicah so pokazale, da je ta organ celo bolj občutljiv za zaznavanje vibracij podlage (vzdražni prag med 1 in 2 cm/s2) kot specializirani subgenualni organ (vzdražni prag med 3 in 10 cm/s2). Z metodo ablacije (selektivno uničenje posameznih receptorskih organov), ki jo je uporabil Dambach (1972) na murnih, so Devetak in Amon (1997) ter Devetak in sod. (2004) ugotavljali fiziološke značilnosti vibracijskih receptorjev posameznih hordotonalnih organov in kampaniformnih senzil v/na nogah tenčičarice. Pri tenčičarici sta le dva od štirih hordotonalnih organov v nogah občutljiva na vibracije podlage, in sicer subgenualni in femoralni hordotonalni organ. Frekvenčno območje največje občutljivosti subgenualnega organa je pomaknjeno nekoliko višje v primerjavi z ravnokrilci - med 1500 in 2000 Hz, z vzdražnim pragom pri 2 cm/s2 (oz. 0,2 nm), femoralni hordotonalni organ pa ima v območju med 50 in 300 Hz vzdražni prag pri 10 cm/s2, med 400 in 2000 Hz pa je vzdražni prag še nekoliko nižji. Najmanj so na vibracije občutljive kampaniformne senzile, ki so pri tenčičarici razporejene po celotni površini nog, ob sklepih pa tvorijo urejene skupine. Po svoji karakteristični frekvenci (600 Hz) se razlikujejo od tistih pri ravnokrilcih, tudi njihov vzdražni prag je višji - 1 m/s2. Femoralni hordotonalni organi paličnjakov se odzivajo na vibracije podlage med 10 Hz in 4 kHz, najbolj so občutljivi v območju pod 100 Hz z vzdražnim pragom okoli 10 cm/s2 (Stein in Sauer, 1999). 96 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Čokl je leta 1983 opisal funkcionalne lastnosti vibracijskih receptorjev pri zeleni smrdljivki. Razdelil jih je v tri tipe: nizkofrekvenčne (LFR), srednjefrekvenčne (MFR) in visokofrekvenčne (HFR). V pričujočem delu smo opisali morfologijo prvih dveh tipov, medtem ko tretjega tipa nismo zabeležili. Delovanje LFR receptorjev se povsem sklada z opisanim leta 1983, medtem ko se celici tipa MFR nekoliko razlikujeta od karakteristik celic, opisanih v omenjenem članku, vendar delujeta v enakem frekvenčnem območju in imata podoben vzdražni prag. Celica a ima dva vrhova občutljivosti, in sicer za inhibicijski vhod pri 70-100 Hz in 1 cm/s2, za ekscitacijski vhod pa med 300 in 500 Hz pri 5 cm/s2 (sl. 14, B). Celica b odgovarja sicer le z ekscitacijo, vendar pa je frekvenca največje občutljivosti pomaknjena nekoliko nižje, namesto pri 200 Hz je celica najbolj občutljiva pri 100-150 Hz (sl. 14, B). Čokl (1983) je opisal pri celicah MFR in HFR podaljšan odziv na dražljaje frekvence 200 Hz, kar je pripisal resonanci kapnih celic subgenualnega organa, ki oblikujeta filament. Enako smo zabeležili pri celici a tipa MFR, in sicer pri 200 in 300 Hz (sl. 14, C). Na podlagi rezultatov omenjenih raziskav sklepamo, da so LFR receptorji kampaniformne senzile, MFR receptorji pa skolopidiji subgenualnega organa ali drugih hordotonalnih organov. Latence odgovorov receptorskih celic zelene smrdljivke so v istem velikostnem razredu kot latence odgovorov čutilnih celic tibialnega organa, ki se na dražljaj odzovejo z latencami okoli 8 do 11 ms (Stumpner in sod., 1995; Schul, 1997) in latence odgovorov proksimalnih kampaniformnih senzil pri ščurku (3 do 16 ms, odvisno od smeri dražljaja) (Ridgel in sod., 2001). 4.1.3 Spontana aktivnost in izvor inhibicije v receptorskih celicah Zmožnost čutilnih organov za zaznavanje in razlikovanje dražljajev različnih intenzitet je pri živalih z majhnim številom receptorskih celic reducirana. Ena od strategij za povečanje območja vzdražnosti receptorskih celic je spontana aktivnost oz. spontano proženje akcijskih potencialov. Receptorske celice olfaktornega sistema žuželk signalizirajo prisotnost določenih molekul s povečanjem oz. zmanjšanjem frekvence proženja akcijskih potencialov (Chapman, 1998; Park in Cork, 1999). Spontana aktivnost omogoča smerno občutljivost nekaterih mehanoreceptorjev žuželk (nitaste čutilne dlačice pri ščurku Periplaneta americana (Buno in sod., 1981), trihobotriji stenice Pyrrhocoris apterus (Drašlar, 1973)). Odmik v eno smer poveča stopnjo proženja akcijskih potencialov (ekscitacija), odmik v drugo smer pa jo zmanjša (inhibicija). Spontano aktivnost so opisali tudi pri femoralnem hordotonalnem organu (FCO) paličnjakov (Büschges, 1994; Stein in Schmitz, 1999; Stein in Sauer, 1999) in kratkorogih kobilic (Burrows in Laurent, 1993; Burrows in Matheson, 97 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 1994; Wolf in Burrows, 1995). Celice tega skolopidialnega organa se na spremembe v legi femoralno-tibialnega sklepa (fleksija, ekstenzija) odzivajo s povečanim oz. zmanjšanim proženjem akcijskih potencialov. Pri zeleni smrdljivki smo zabeležili spontano aktivnost pri receptorski celici a tipa MFR (sl. 14, C). Glede na občutljivost in uglašenost celice smo sprva domnevali, da izvira v subgenualnem organu, vendar pa zabeležena spontana aktivnost celice nakazuje večjo verjetnost, da celica izvira v enem od ostalih vibracijskih organov v nogah. Od skolopidialnih organov v nogi stenice N. viridula je subgenualni organ edini, ki je omejen zgolj na en nožni člen. Vsi ostali (FCO, TDCO, TPCO; sl. 3) povezujejo dva člena noge in zaznavajo njuno medsebojno lego. Domnevamo, da je spontana aktivnost prisotna v skolopidialnih organih sklepov, ki so smerno občutljivi, ne pa tudi pri subgenualnem organu, ki je omejen na tibijo in zaznava zgolj prisotnost oz. odsotnost vibracij. Omenjena celica tako najverjetneje izvira iz femoralnega hordotonalnega organa, saj sta TDCO in TPCO na vibracije podlage manj oz. ne-občutljiva (raziskave na tenčicaricah; Devetak in Amon, 1997). Čokl (1983) v raziskavi funkcionalnih lastnosti vibracijskih receptorjev zelene smrdljivke ni zabeležil spontano aktivnih celic. Pri isti celici (celica a tipa MFR, sl. 13 in 14) smo pri dražljajih nizkih frekvenc (50-100 Hz) opazili vplive inhibicije. Sklepamo, da gre za presinaptično inhibicijo sproščanja nevrotransmiterjev iz primarnih senzoričnih nevronov, ki je zelo razširjena strategija za regulacijo senzoričnega inputa v centralni živčni sistem (Clarac in Cattaert, 1999). Presinaptična inhibicija slušnih receptorjev pri murnu preprečuje desenzitizacijo in mu omogoča, da se odziva na zunanje zvočne signale med lastnim petjem (Poulet in Hedwig, 2002; Poulet in Hedwig, 2003). Pri paličnjakih presinaptična inhibicija receptorjev v femoralno-tibijalnem sklepu omogoča mimikrijsko kataleptično držo telesa (Sauer in sod., 1997). Celični mehanizem aferentne presinaptične inhibicije je navadno znižanje amplitude akcijskih potencialov. Poskusi odvajanja živčnih impulzov iz terminalnih aksonskih razvejitev celic femoralnega hordotonalnega organa pri kratkorogi kobilici so pokazali, da so med draženjem akcijski potenciali receptorskih celic naloženi na depolarizirajočih IPSP-jih (oz. PAD-ih – primary afferent depolarization), ki jih indirektno generirajo aferentne celice istega organa (Burrows in Matheson, 1994). Inhibicija rezultira v redukciji ortodromnih aferentnih akcijskih potencialov za 12-28% in redukciji amplitude EPSP v postsinaptičnih celicah za 50 %. Tako je učinkovitost izhodnih sinaps individualnih receptorskih celic regulirana s strani mreže hordotonalnih receptorskih celic, ki se odzivajo na enake dražljaje. To je del mehanizma, ki omogoča, da se hoteni gibi lahko odvijajo v prisotnosti vpliva senzoričnih povratnih zank, ki jih to gibanje generira in ki bi sicer lahko to gibanje ovirale (Hedwig in Burrows, 1996; Wolf in Burrows, 1995). Znižanje akcijskih potencialov in depolarizirajoče IPSP-je lahko vidimo v odzivu celice a tipa MFR zelene smrdljivke na dražljaj frekvence 98 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 500 Hz in intenzitete 70 cm/s2 (sl. 14), medtem ko se je v odzivu na dražljaj frekvence 70 Hz in intenzitete 5 cm/s2 inhibicija odrazila v popolnem prenehanju proženja akcijskih potencialov med draženjem. Ena od možnosti je, da ta dražljaj predstavlja za receptorske celice femoralnega hordotonalnega organa premik femoralno-tibialnega sklepa, na katerega se odzovejo s prenehanjem spontane aktivnosti (Burrows, 1996). Domnevamo, da celica prejema različne inhibicijske vhode, ki se na različen način odražajo v njenem delovanju. Možno je, da je pri samici med poskusom prišlo v centralnem živčevju do signala za generiranje vibracijskega napeva in posledično do inhibicije oz. regulacije prenosa vzburjenja od receptorskih celic na postsinaptične celice. Po analogiji z murnom tako morda pri zeleni smrdljivki podoben mehanizem onemogoča desenzitizacijo receptorskih celic med lastnim produciranjem vibracijskih signalov. Depolarizacija pri celici b tipa MFR je verjetno prav tako rezultat presinaptične inhibicije. Obstajajo namreč tudi depolarizacijski IPSP-ji (inhibitorni postsinaptični potenciali); npr. v primeru sinapse, kjer kot živčni prenašalec nastopa GABA in je mirovni membranski potencial postsinaptične celice nižji od reverznega potenciala za klorove ione. Ioni klora bodo zapuščali celico in tako dejansko povzročili depolarizacijo, vendar pa bo sinapsa kljub temu inhibitorna, ker bo vzdrževala membranski potencial celice na nivoju, nižjem od pražnega potenciala za generiranje AP. Vir inhibicije so poleg ostalih receptorskih celic istega hordotonalnega organa lahko tudi receptorske celice drugih mehanoreceptorjev na nogah (Stein in Schmitz, 1999) ali pa internevroni centralnega živčnega sistema (Poulet in Hedwig, 2003). 4.2 OBLIKA, DELOVANJE IN POVEZLJIVOST VIBRACIJSKIH INTERNEVRONOV 4.2.1 Interindividualna variabilnost ali različni nevroni? Posebnost živčnega sistema žuželk so t.i. prepoznavni oz. identificirani nevroni (identified neurons). To so celice značilne oblike in delovanja ter vhodno-izhodnih regij, ki jih lahko najdemo pri vsakem posamezniku določene vrste (Comer in Robertson, 2001). Posamezne internevrone lahko razpoznamo že po obliki, različne celice s podobno obliko in lego v živčevju pa se med seboj dobro ločijo v delovanju. Vsaka oblika nevrona (razen izjem, ki jih bomo obravnavali v nadaljevanju) se pojavlja kot zrcalno simetričen par celic na obeh straneh živčnega sistema (Wohlers in Huber, 1982; Burrows, 1996). Na sl. 18 (j, j’) je obarvan zrcalno simetričen par internevronov tipa CG-AC-1. Vzrok za hkratno obarvanje je najverjetneje poškodba druge celice med barvanjem prve, možno je pa tudi, da je do hkratnega obarvanja (dye coupling) prišlo preko električnih sinaps (gap junctions). Evolucijsko lahko novi internevroni nastanejo s podvojitvijo že obstoječih internevronov 99 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Evolucijsko lahko novi internevroni nastanejo s podvojitvijo že obstoječih internevronov (Goodman in sod., 1979). Internevroni, ki so na tak način nastali recentno, so morfološko težko razločljivi, zato jih je težko identificirati. Tak primer slušnih internevronov sta našla Römer in Marquart (1984) pri kratkorogi kobilici Locusta migratoria in ju poimenovala ‘celici dvojčici’ (twin cells). Projekcije teh dveh internevronov se tako prekrivajo, da jih je na nekaterih mestih nemogoče razločiti. Podobno v protorakalnem gangliju bramorja soobstajata lokalna omega internevrona nestalnih morfoloških razlik, ki so ju prav tako hkrati obarvali pri istem osebku (Mason in sod., 1998). Enak primer smo našli pri zeleni smrdljivki , kjer sta se hkrati obarvala dva internevrona tipa CG-AC-1 (sl. 19). Raziskave identificiranih nevronov žuželk so pokazale veliko mero variabilnosti, ki so povezane s spolom in socialnimi izkušnjami posameznega osebka (Comer in Robertson, 2001). V pričujočem delu je zato prikazana morfologija posameznega tipa internevrona pri vseh poskusnih živalih. Posamezen tip internevrona označuje relativna konstantnost v legi celičnega telesa, v poteku in legi aksona glede na telo celice ter v obliki in legi dendritskih in aksonskih razvejitev. Interindividualna variabilnost na nivoju oblike celic zajema predvsem natančen vzorec in obliko razvejitev v gangliju. Na nivoju variabilnosti delovanja celic smo dopuščali večja odstopanja. Dejstvo je namreč, da noge živali niso bile pri vseh poskusih povsem enako pritrjene, poleg tega pa je nekaterim poskusnim živalim manjkala posamezna noga. Domnevamo, da so lahko nekatere variabilnosti posledica časovno zamaknjenih oz. izpadlih vibracijskih vhodov, ki so se odrazili v odgovorih internevronov na dražljaje. Na podlagi naše raziskave ne moremo ugotoviti, ali posamezne celice tipov CG-AC in CG-AB kažejo široko variabilnost v delovanju enega internevrona ali pa smo odzive dejansko zabeležili iz sestrskih internevronov. Nedvoumen pokazatelj soobstoja večih različnih celic z enako morfologijo je le njihovo hkratno obarvanje pri istem osebku. 4.2.2 Povezava med obliko in delovanjem internevronov – vhodne in izhodne regije ter ter povezljivost z receptorskimi celicami Internevroni zelene smrdljivke imajo končiče dveh oblik; končiče gladkega videza in končiče s terminalnimi in en passant (vmesnimi) odebelitvami, ki imajo videz nitke, na katero so nanizane kroglice (sl. 33; 39c; 42). Pri odvajanju živčnih impulzov iz različnih delov zvočno občutljivih internevronov kratkorogih kobilic so ugotovili, da razvejitve gladkega videza predstavljajo pretežno vhodne regije, razvejitve s številnimi odebelitvami pa pretežno izhodne, presinaptične regije (Römer in Marquart, 1984; Peters in sod., 1986). Zvočno občutljiva omega nevrona murna (ON1 in ON2) imata na ipsilateralni strani gladke razvejitve in na 100 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 kontralateralni strani razvejitve z odebelitvami. Podrobna histološka in imunocitokemična raziskava je pokazala, da je na ipsilateralni strani približno 90% vseh vhodnih sinaps celice, medtem ko je približno 70% vseh izhodnih sinaps celice na kontralateralni strani (Watson in Hardt, 1996). Čutilne celice tibialnega organa ravnokrilcev se na dražljaj odzovejo z latencami od 8 do 11 ms (Hennig, 1988; Stumpner in sod., 1995; Schul, 1997), vibracijski receptorji vseh treh parov nog pri kratkorogi kobilici Locusta migratoria pa z latencami 5-7 ms, medtem ko časovni zamiki odzivov med čutilnimi celicami in internevroni prvega reda ležijo v razredu med 0,5 in 2 ms (Kalmring in sod., 1975; Römer in sod., 1988; Hennig, 1988). Najkrajše latence slušnih internevronov murna Telleogryllus oceanicus (13 in 15 ms) avtorji navajajo kot dokaz njihove monosinaptične povezave s čutilnimi celicami slušnega organa (Atkins in Pollack, 1987). Latence LFR in MFR receptorjev zelene smrdljivke so pri frekvenci največje občutljivosti in največji merjeni intenziteti znašale od 6 do 13 ms. Sklepamo, da so internevroni z latencami odgovora med 9 in 16 ms z njimi povezani monosinaptično. 4.2.2.1 Internevroni CG-AC-1 Internevroni tipa CG-AC-1 (sl. 69) zelene smrdljivke prejemajo vhod pretežno iz tretje ipsilateralne noge (pri nekaterih celicah segajo dendritske razvejitve tudi v nevropilo druge ipsilateralne noge (sl. 18i, sl. 19)) in prenašajo informacijo v kontralateralno polovico centralnega ganglija. Izhodne regije so v nevropilah vseh kontralateralnih nog, kar je vidno na preparatih s protorakalnim ganglijem (sl. 17 in 19). Pri treh celicah (f, h in k) se akson vzpenja iz protorakalnega ganglija v možganski del centralnega živčnega sistema. Pri celicah e in g se vzpenjajoči akson bodisi ni obarval, bodisi gre za variacijo tipa celice brez vzpenjajočega aksona, ali pa je prisotnost vzpenjajočega aksona odvisna od starosti živali, kot so to ugotovili za omega nevron ON1 pri murnu (Atkins in Pollack, 1986). Po obliki so internevroni tipa CG-AC-1 podobni intersegmentalnim internevronom kratkoroge kobilice (Locusta sp.), ki so udeleženi pri koordinaciji gibanja. Enako kot celice CG-AC-1 prejemajo senzorične vhode iz ene noge, njihovi aksoni pa projicirajo v nevropile ostalih nog in kontrolirajo njihovo gibanje (Burrows, 1996).Glede na latence odgovorov, ki se gibljejo med 15 in 30 ms (sl. 26), sklepamo, da ta morfološka skupina obsega tako internevrone prvega reda kot tudi internevrone, ki so z receptorskimi celicami povezani posredno, preko vsaj enega internevrona. Celica i, pri kateri je prišlo do hkratnega obarvanja receptorske celice in internevrona (sl. 18), ima najmanjšo latenco odgovorov 16 ms; na podlagi tega podatka ter jasnega prekrivanja izhodnih regij receptorskega aksona z dendritskimi razvejitvami 101 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Slika 69: Osnovni morfološki tipi vibracijskih internevronov pri stenici N. viridula. internevrona domnevamo, da gre v tem primeru za monosinaptično povezavo med celicama. Do hkratnega obarvanja obeh celic je prišlo najverjetneje zaradi poškodbe receptorske celice ob barvanju internevrona oz. prodiranju elektrode skozi ganglij, možno pa je tudi, da sta celici povezani preko električnih sinaps. V skupini CG-AC-1 nismo zabeležili vplivov inhibicije (sl. 21 in 22). 4.2.2.2 Internevroni CG-AC-2 Pri internevronih tipa CG-AC-2 so vsi končiči v centralnem gangliju gladkega videza, zato sklepamo, da celice tega tipa prejemajo vhode iz drugega in tretjega para nog (sl. 27 in 28, sl. 69). Po obliki so internevroni CG-AC-2 podobni slušnemu vzpenjajočemu internevronu TH3-AC5 pri kratkorogi kobilici Omocestus viridulis, s somo v metatorakalnem gangliju (Hedwig in Elsner, 1985). Pri celici a, ki je na dražljaje odgovarjala s tonično ekscitacijo (sl. 102 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 29), gre glede na kratke latence odgovorov (15 ms) verjetno za monosinaptično povezavo z receptorskimi celicami, medtem ko je pri celicah b in c kompleksen odgovor na dražljaj (sl. 30) rezultat sumacije ekscitacijskih in inhibicijskih vhodov, latence pa se gibljejo med 25 in 35 ms, kar kaže, da sta to internevrona višjega reda. Območje največje občutljivosti je različno za ekscitacijske in inhibicijske vhode, kar rezultira v kompleksnih odzivih in odvisnosti prevlade vpliva enega ali drugega tipa vhodov od frekvence in/ali intenzitete dražljaja. Pri teh in ostalih celicah s kompleksnimi vplivi različnih vhodov igra pomembno vlogo tudi mesto v celici, iz katerega odvajamo akcijske potenciale (Römer in Marquart, 1984). Če odvajamo pred regijo, kjer celica prejema inhibicijske vhode, jih ne bomo zabeležili, zato določen zapis odziva neke celice velja zgolj za določeno regijo in ni osnova, na podlagi katere bi lahko razvrščali celice v funkcijske tipe. Pri celici b je vpliv inhibicije viden v začetku odgovora celice, zato sklepamo, da je latenca za inhibicijo krajša kot latenca za ekscitacijo (sl. 30, A). Pri zapisih odzivov celice c vidimo, da se inhibicija pojavi pri višjih intenzitetah; od tod zvonasta intenzitetna krivulja celice. Lega izhodnih regij za ta tip internevronov ni znana. 4.2.2.3 Internevroni CG-AC-3 in CG-AC-4 Celici CG-AC-3 in CG-AC-4, čeprav podobne oblike (sl. 33 in sl. 69), se verjetno precej razlikujeta glede povezljivosti z drugimi celicami. Prva ima namreč jasno vidne odebelitve na vseh končičih v centralnem gangliju; ti segajo v nevropile drugega in tretjega para nog. Sklepamo, da ima ta tip internevrona v centralnem gangliju pretežno izhodne regije. Glede na najkrajše latence odziva (16-18 ms) sklepamo, daje to internevron prvega ali drugega reda. Internevron CG-AC-4 pa ima, nasprotno, v centralnem gangliju končiče gladkega videza, medtem ko vzpenjajoči akson tvori v protorakalnem gangliju kolaterale z odebelitvami v nevropili prve kontralateralne noge. Sklepamo, da prejema vhode iz drugega in tretjega para nog ter prenaša informacijo do prve kontralateralne noge ter naprej anteriorno v področje možganov. Latence odzivov nad 20 ms z veliko frekvenčno odvisnostjo (sl. 32, C) in kompleksni odgovori (inhibicija in ekscitacija) ( sl. 34) kažejo, da gre za internevron višjega reda, ki prejema vhode iz različnih presinaptičnih celic. 4.2.2.4 Internevron CG-AC-5 Čeprav povsem drugačne oblike kot celica CG-AC-3, ima celica CG-AC-5 (sl. 36 in sl. 69) podobno lego vhodnih regij v nevropilah drugega in tretjega para nog. V centralnem gangliju 103 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 ni opaziti končičev z odebelitvami, ki bi označevali izhodne regije celice, zato sklepamo, da ima ta celica v centralnem gangliju pretežno vhodne regije. Pri višjih intenzitetah dražljajev prejema inhibicijske vhode (sl. 37), kar kaže, da je s čutilnimi celicami povezana posredno, prek vsaj enega (inhibitornega) internevrona. Po svoji morfologiji je zelo podobna bimodalnemu internevronu G1 kratkoroge kobilice Locusta migratoria (Kalmring, 1975; Čokl in sod., 1977). Tudi latence, izmerjene pri odgovoru internevrona G1, ki jih avtorji navajajo kot dokaz polisinaptične povezave z vibracijskimi receptorji, so podobne latencam celice CG-AC-5 zelene smrdljivke (18-22 ms; sl. 38, C). 4.2.2.5 Internevroni CG-AB Končiči internevronov CG-AB projicirajo v nevropile vseh treh parov nog (sl. 39 in sl. 69). Na nobenem od preparatov ni videti, da bi se aksona vzpenjala iz protorakalnega ganglija v možgane. Na vseh končičih so jasno vidne terminalne in en passant odebelitve, kar kaže, da prevladujejo izhodne sinapse. Po svoji obliki (dorzalna lega some in bilateralna simetrija) so celice tipa CG-AB zelo podobne t.i. intersegmentalnim DUM (dorsal unpaired median) internevronom ravnokrilcev (Burrows, 1996; Bräunig, 1997). DUM internevroni imajo običajno nevromodulatorno funkcijo, pri nekaterih je transmiter oktopamin (Grolleau in Lapied, 2000), nekateri kažejo imunoreaktivnost za nevrotransmiter GABA, kar pomeni, da imajo verjetno inhibicijske učinke (Burrows, 1996). Ena od posebnosti DUM internevronov je v sposobnosti generiranja spontanih akcijskih potencialov v somi celice. Celice tipa CG-AB prejemajo kompleksne vhode, odgovori celic pa so sumacija inhibicijskih in ekscitacijskih učinkov drugih internevronov. Z receptorskimi celicami so povezane posredno, preko vsaj enega vmesnega internevrona. 4.2.2.6 Internevroni CG-L CG-L so lokalni internevroni, omejeni na centralni ganglij (sl. 42 in sl. 69). Po svoji morfologiji so podobni lokalnim nevronom ravnokrilcev, ki prenašajo vzburjenje iz ene v drugo polovico ganglija. Na ipsilateralni strani, od koder izrašča primarni odrastek some, so končiči gladkega videza, kar kaže, da je ta regija pretežno vhodna, medtem ko so na končičih na kontralateralni strani celice jasno vidne terminalne in en passant odebelitve, kar kaže, da je ta regija pretežno izhodna. Vse dolgoroge kobilice, ki zaznavajo zvok, imajo v protorakalnem gangliju vsaj en par lokalnih internevronov, ki vodi vzburjenje iz ene v nasprotno polovico ganglija (Wohlers in Huber, 1978; Römer, 1985; Stiedl in sod., 1997; 104 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Mason in Schildberger, 1993). Delovanje teh nevronov je najbolje raziskano pri murnih; omega nevron 1 (ON1) posreduje inhibicijo na kontralateralno celico v paru ter na enega od vzpenjajočih aksonov in s tem ojačuje lateralni kontrast intenzitete zvoka (Horseman in Huber, 1994a, b). Sklepamo, da imajo internevroni zelene smrdljivke podobno funkcijo. Latence celice a, ki je odgovarjala z ekscitacijo (sl. 43), znašajo pri največji jakosti dražljaja 15 ms (sl. 44), kar kaže na verjetno monosinaptično povezavo z receptorskimi celicami. Pri celicah b in c smo zabeležili inhibicijo, zato domnevamo, da sta celici z receptorskimi celicami povezani posredno, preko vsaj enega (inhibicijskega) internevrona. Interpretacija povezav celic je seveda odvisna od mesta v celici, iz katerega smo odvajali akcijske potenciale (Römer in Marquart, 1984). 4.2.2.7 Internevron PTG-DC Internevron PTG-DC (sl. 45 in sl. 69) je morfološko in fiziološko zelo podoben edinemu že opisanemu vibracijskemu internevronu zelene smrdljivke (LFTVI; Čokl in Amon, 1980). Prej opisana celica se od tukaj opisane razlikuje po dodatnem vzpenjajočem aksonu iz protorakalnega ganglija v možgane ter nekoliko nižjem vzdražnem pragu in po frekvenčnem območju delovanja. Zaradi enake specifične oblike celice in razporeditve vhodnih in izhodnih regij pa domnevamo, da gre zgolj za variaciji iste celice. Vhodne regije celice PTG-DC so omejene na nevropilo prve kontralateralne noge v protorakalnem gangliju, izhodne regije pa so v centralnem gangliju tik ob medialni liniji, na nivoju drugega in tretjega nožnega živca; izhoda sta orientirana v smeri ipsilateralnih nog. Domnevamo, da celica prevaja vzburjenje od prve desne noge k drugi in tretji levi nogi in obratno. Minimalna latenca odgovora celice je 14 ms, kar kaže na monosinaptično povezavo z receptorskimi nevroni. 4.2.2.8 Neidentificirani internevroni V-1, V-2 in V-3 Za neidentificirane celice V-1, V-2 in V-3 lega celičnega telesa ni znana. Celici V-1 in V-2 imata v centralnem gangliju pretežno izhodne regije z jasno vidnimi terminalnimi in en passant odebelitvami (sl. 48, 51 in 69), odzivata pa se z ekscitacijo. Prva je omejena na eno lateralno polovico ganglija. Domnevamo, da prenaša vzburjenje iz bolj anteriorno ležečih centrov do nevropil druge in tretje noge na eni strani telesa. Latence odziva (nad 20 ms) kažejo, da gre za internevron višjega reda. Velika razlika v latencah odgovora celice V-1 pri različnih frekvencah draženja kaže na različne vhode. Celica V-2 projicira v nevropile drugega in tretjega para nog, sega pa tudi v abdominalni del centralnega ganglija. Internevron 105 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 V-3 se od prvih dveh razlikuje, njegovi končiči so gladkega videza, odziva pa se z inhibicijo spontane aktivnosti. Domnevamo, da prevaja vzburjenje iz vhodnih regij v centralnem gangliju anteriorno v smeri možganov. Celici V-2 in V-3 sta prav tako internevrona višjega reda, saj latence njunih odgovorov presegajo 30 ms. Zaznavanje vibracij podlage je med členonožci splošno razširjeno, medtem ko je zaznavanje zvoka omejeno zgolj na nekatere skupine žuželk. Podobnosti v morfologiji med vibracijskimi internevroni zelene smrdljivke in nekaterimi slušnimi, bimodalnimi oz. vibracijskimi internevroni ravnokrilcev podpirajo domnevo o razvoju slušnih timpanalnih organov iz hordotonalnih prekurzorjev (Stumpner in von Helversen, 2001). Čeprav ravnokrilci prav tako zaznavajo vibracije podlage, je zvočna komunikacija pri njih pomembnejša in prehod s sistema s šestimi vhodi na sistem z dvema vhodoma se odraža v enostavnejši organizaciji živčne mreže. 4.2.3 Uglašenost in občutljivost internevronov Čokl s sod. (1977) je prvi dokazal, da slušni internevroni kratkoroge kobilice Locusta migratoria prejemajo vhode tudi iz vibracijskih receptorjev. Na različen tip dražljaja pa se ti internevroni odzivajo v različni meri in na podlagi tega so jih razdelili v tri skupine: V (vibracijski), VS (vibracijsko-slušni) in S (slušni) nevroni (Kühne, 1982b; Kalmring, 1983; Kalmring in sod., 1997). Del V nevronov prejema vhode iz kampaniformnih senzil -¦— CG-AC-1 *— CG-AC-2 A CG-AC-3 X— CG-AC-5 -¦— CG-AB ¦ CG-L A PTG-DC -----V 10 100 1000 10000 Frekvenca [Hz] 10 1 Slika 70: Krivulje vzdražnega praga vibracijskih internevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. 106 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 in drugih nizkofrekvenčnih receptorjev (delovanje v frekvenčnem območju 30-300 Hz z največjo občutljivostjo ok. 150 Hz), ostali V nevroni in VS nevroni pa v največji meri iz subgenualnih receptorjev (delovanje v frekvenčnem območju 30-5000 Hz z največjo občutljivostjo okoli 700 Hz). Čeprav ta razdelitev v splošnem velja za vse ravnokrilce, so med posameznimi vrstami razlike v občutljivosti in uglašenosti posameznih vibracijsko občutljivih internevronov (Kühne in sod., 1984). Identificirani vibracijski internevroni zelene smrdljivke se odzivajo na dražljaje v frekvenčnem območju med 50 in 2000 Hz. Na podlagi rezultatov v svoji disertaciji in rezultatov Čokla (1983) domnevamo, da je spodnja meja frekvenčnega območja delovanja še nekoliko nižje. Glede frekvence največje občutljivosti lahko vibracijske internevrone zelene smrdljivke razdelimo v skupino z največjo občutljivostjo pri 50 Hz (CG-AC-1, CG-L, PTG-DC, V-1 in V-3) in skupino z največjo občutljivostjo pri 200 Hz (70-400 Hz) (CG-AC-2 do 5 in CG-AB). Domnevamo, da prva skupina prejema večino vhodov iz LFR receptorjev, druga skupina pa iz MFR receptorjev. Celica i skupine CG-AC-1 je edina uglašena na srednje frekvence; prav tako je receptorska celica, ki se je obarvala hkrati z njo po svoji morfologiji zelo podobna MFR receptorjem, kar potrjuje domnevo, da srednjefrekvenčni internevroni prejemajo vhode iz MFR, nizkofrekvenčni pa iz LFR receptorskih celic. Vzdražni pragi internevronov v največji skupini (CG-AC-1) so zelo različni, od 1 do 70 cm/s2 kar kaže na veliko interindividualno variabilnost v delovanju celic tega tipa. Ostale internevrone lahko glede nivoja vzdražnega praga razdelimo v bolj občutljive, ki se odzivajo že na dražljaje pospeška 0,5 oz 1 cm/s2 (CG-AC-2 do 5 in CG-AB), in manj občutljive, pri katerih leži vzdražni prag pri 10 cm/s2 ali višje (CG-L, CG-PTR, V-1 in V-3). Vidimo, da so internevroni, ki se domnevno povezujejo z receptorji tipa MFR, bolj občutljivi od tistih, ki se domnevno povezjujejo z nizkofrekvenčnimi receptorji (LFR). Nizkofrekvenčni internevroni so ozko uglašeni – na dražljaje odgovarjajo le v frekvenčnem območju od 50 do 150 (PTG-DC, V-1 in V-3), 200 (CG-L) oz. 300 Hz (CG-AC-1), medtem ko ostali tipi internevronov delujejo v širšem frekvenčnem območju, in sicer od 50 do 1000 (CG-AC-2 in CG-AC-5) oz. 2000 Hz (CG-AC-3, CG-AC-4 in CG-AB). Opisani fiziološki skupini se ujemata z dvema od treh fizioloških skupin, opisanih pri zeleni smrdljivki na podlagi analiz zunajceličnega beleženja aktivnosti nevronov v centralnem gangliju (Zorović, 2003) ter z dvema fiziološkima skupinama, v katere lahko razdelimo vibracijsko občutljive internevrone pri ravnokrilcih (Kühne, 1982b). 107 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 4.2.4 Fazično-tonični odziv ali adaptacija celic? Nizkofrekvenčne receptorske celice LFR so se na dražljaje nizkih frekvenc odzivale fazno vezano; pri višjih intenzitetah teh dražljajev je število AP na fazo upadalo od začetka proti koncu dražljaja, vzrok je bila adaptacija celic. Posamezen sinusni dražljaj lahko namreč obravnavamo kot serijo kratkih dražljajev, pri katerih gre za periodično spreminjanje parametrov dražljaja (pospešek, hitrost, odmik iz ravnovesne lege). Zato opisanega odziva nizkofrekvenčnih receptorskih celic, kot tudi odzivov internevronov, kjer se frekvenca proženja AP niža tekom enega dražljaja (sl. 21, B; 22; 34; 43, A; 49), ne moremo obravnavati kot fazično-tonične odgovore, temveč zgolj kot adaptacijske procese celic. Omenjeno obliko odziva bi lahko pojmovali kot fazično ali fazično-tonično, če bi bil dražljaj drugačen, in sicer t.i. ramp oz. graduiran dražljaj, kjer lahko ločimo fazo naraščanja intenzitete (hitrosti, pospeška ipd.) in fazo konstantne intenzitete (tak dražljaj je npr. odmik čutilne dlake). V primeru sinusnih vibracijskih dražljajev enakomerna ali upadajoča frekvenca proženja AP tekom enega dražljaja kaže zgolj na različne stopnje adaptacije posameznih celic na nespremenjen dražljaj. 4.3 KODIRANJE SPEKTRALNIH, INTENZITETNIH IN ČASOVNIH PARAMETROV NARAVNIH NAPEVOV Napevi žuželk so sestavljeni iz ritmičnih zaporedij bolj ali manj podobnih kratkih pulzov (signalov) in so navadno brez melodije, ki je značilna za komunikacijske signale vretenčarjev (Pollack, 2000). Receptorski sistemi mnogih žuželk so sposobni analize frekvenčnega spektra napeva, ki je v veliko primerih lahko informativen, a v večini primerov je najpomembnejši nosilec informacije časovna struktura napevov – dolžine signalov, njihova ponavljalna frekvenca in združevanje v signale višjega reda (Pollack, 2000). Čeprav je slednja trditev zapisana za zvočne napeve žuželk, pa v veliki meri velja tudi za vibracijske napeve. Receptorske celice in vibracijske internevrone zelene smrdljivke lahko razdelimo v dve skupini (sl. 69): v prvi so celice, uglašene na 50 Hz (oz. nižje), v drugi pa celice, uglašene na 100-300 Hz. Noben od identificiranih vibracijskih nevronov ni ozko uglašen na dominantno frekvenco napeva lastne vrste (ok. 80-120 Hz), medtem ko jih večina natančno kopira trajanje vibracijskega signala ter njegovo amplitudno modulacijo (sl. 57 in 58). To seveda ne velja za celice, pri katerih je odgovor seštevek ekscitacijskih in inhibicijskih vhodov, kar prekine pot kopiranja vhodnega signala. Slušni nevroni ravnokrilcev prav tako pri večini vrst niso ozko uglašeni na frekvenco napeva lastne vrste (Atkins in Pollack, 1987; Kalmring in sod., 1997) in 108 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 tudi vedenjski poskusi so pokazali široko toleranco živali do spreminjanja frekvence napeva, medtem ko lahko že manjše spremembe v njegovem časovnem vzorcu spremenijo njihov odziv. Receptorske celice kopirajo amplitudno modulacijo zvočnega dražljaja skozi vzorec proženja akcijskih potencialov, vzpenjajoči internevroni pa predstavljajo skupino celic z raznolikimi tipi odzivov z mnogoterimi interakcijami ekscitacije in inhibicije (Ronacher in Stumpner, 1988). Nekateri, npr. AN1, enako kot receptorske celice natančno kopirajo napeve z različnimi časovnimi vzorci (variacije v dolžini signala in njihovi ponavljalni frekvenci), medtem ko pri drugih, npr. AN2, odziv ni kopija časovnega vzorca signala (Schildberger, 1984). Receptorske celice in vzpenjajoči nevroni ravnokrilcev niso uglašeni na časovni vzorec napeva lastne vrste, temveč se selektivnost za določen časovni vzorec napeva pojavi šele na nivoju višjih asociacijskih centrov v možganih (Schildberger, 1984). Znano je, da tudi vrstna specifičnost napeva zelene smrdljivke temelji predvsem na časovnih parametrih napevov in manj na samem frekvenčnem spektru, že zaradi tega, ker so posamezni napevi po frekvenčni sestavi med seboj zelo podobni (Čokl in sod., 1978; Hrabar in sod., 2004). Analiza frekvenčne in amplitudne modulacije znotraj posameznega signala samičinega pozivnega napeva nam pokaže, da oba tipa modulacije sovpadata le v drugem delu signala, medtem ko v prvem delu maksimum frekvenčnega spektra nastopi pred amplitudnim. Razlika v intenziteti med dominantnim in prvim subdominantnim frekvenčnim vrhom v vibracijskem signalu samičinega pozivnega napeva na sl. 58 znaša 22 dB. Na podlagi intenzitetnih krivulj posameznih tipov identificiranih receptorskih celic in internevronov sklepamo, da so takšne razlike v intenziteti posameznih frekvenčnih vrhov zadosti velike, da jih živčni sistem stenice zazna. Skupine celic z različno uglašenostjo se na isti signal odzovejo z različnim vzorcem proženja akcijskih potencialov (sl. 58-60). Krivulje kumulativnih frekvenc kažejo, da frekvence proženja akcijskih potencialov najbolj naraščajo v delih signala, ko frekvenca in amplituda naraščata, in se ustalijo v delu signala, ko frekvenca in amplituda spet nekoliko upadeta. Znižanje intenzitete med posameznimi pulzi signala sovpada s ‘pavzami’ v rasterskem diagramu odzivov internevronov. Absolutna intenziteta v teh ‘vozlih’ znaša okoli 10 cm/s2, kar je za večino identificiranih celic nadpražna jakost. Domnevamo, da do prenehanja proženja akcijskih potencialov pride zaradi desenzitizacije po delu dražljaja z visoko intenziteto (Poulet in Hedwig, 2002), kar omogoča da se časovno-intenzitetni vzorec signala kopira v vzorcu akcijskih potencialov. Vzrok za razhajanje med uglašenostjo receptorjev in dominantno frekvenco vibracijskih napevov zelene smrdljivke lahko iščemo v dejstvu, da je komunikacija najbolj učinkovita takrat, ko je zagotovljena optimalna uglasitev med oddajnikom, medijem za prenos signalov in sprejemnikom signala. Ker sta prvi in zadnji segment komunikacijskega sistema pri zeleni smrdljivki poznana, je treba odgovore za razhajanje poiskati pri zelenih rastlinah, ki 109 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 so gostiteljice zelene smrdljivke. Dominantna resonančna frekvenca teh rastlin je 160-215 Hz, kar sovpada z območjem največje občutljivosti srednjefrekvenčnih receptorjev, medtem ko subdominantni resonančni vrhovi okoli in pod 100 Hz ležijo blizu dominantne frekvence samega vibracijskega napeva in največje občutljivosti nizkofrekvenčnih receptorjev (Čokl in sod., 2005). 4.4 ORIENTACIJA V SMERI VIRA VIBRACIJSKIH SIGNALOV 4.4.1 Amplitudne razlike Na podlagi rezultatov (sl. 56) domnevamo, da amplitudni gradienti oz. amplitudne razlike med steblom rastline in peclji oz. stranskimi vejami niso zanesljiv znak za orientacijo. Vzrok so specifične fizikalne zakonitosti prenosa vibracijskih signalov po rastlinah (Michelsen in sod., 1982; Barth 1998, 2002). Na rastlinah amplituda vibracijskega signala ne upada monotono z razdaljo od vira vibracij, temveč oscilira. Signali so lahko na vrhu rastline ali na listu močnejši kot pa na steblu v bližini pojoče samice (Michelsen in sod., 1982; Čokl, 1988), pri prenosu skozi listno ploskev pa je dušenje signala večje kot pri prenosu skozi žile (Čokl in sod., 2004). Zaradi pojava stoječega valovanja in disperznega prenosa vibracij po rastlinah se razmerja med intenzitetami posameznih frekvenčnih komponent znotraj vibracijskega signala spreminjajo z oddaljenostjo od vira vibracij (sl. 62, B in C). Razlike v razmerjih med posameznimi frekvenčnimi vrhovi, do katerih pride med prevajanjem signala po rastlini, so dovolj velike, da jih identificirani vibracijski nevroni pri zeleni smrdljivki lahko zaznajo, kar je razvidno iz intenzitetnih krivulj posameznih identificiranih receptorskih celic in internevronov. S tem potrjujemo, da na podlagi funkcijskih lastnosti identificiranih celic obstaja možnost, da omenjene razlike med posameznimi frekvenčnimi vrhovi živalim lahko služijo kot parameter za določanje razdalje do vira vibracij, kot so predlagali v raziskavah Keuper in Kühne (1983), Čokl (1988) ter Čokl in sod. (1999). Da bi omenjene parametre živali lahko uporabljale tudi za orientacijo, pa mora nujno obstajati neka zveznost oz. predvidljivost v spreminjanju signala od oddajnika do sprejemnika. Zaradi različnih relativnih intenzitet frekvenčnih vrhov znotraj vibracijskih signalov, posnetih na različnih oddaljenostih od pojoče samice na vrhu ciperusa, je vzorec aktivnosti vibracijskih nevronov različen za signala 1 in 2 (sl. 63 in 64). To pomeni, da se različni tipi internevronov različno odzovejo na spremembe v frekvenčnem spektru signala. Odgovor na signal z nižjo intenziteto ni enostavno šibkejši odgovor na prvi signal, temveč je pri različnih celicah stopnja zmanjšanja aktivnosti različna, pri nekaterih pa se ta celo poveča (sl. 66). Zaradi sprememb v relativnih intenzitetah frekvenčnih komponent 110 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 se spremeni tudi sama dinamika proženja akcijskih potencialov tekom dražljaja (različno za različne celice), kar rezultira v različni razporeditvi krivulj kumulativnih frekvenc in različnih dendrogramih za oba signala (sl. 64, 65). 4.4.2 Časovni zamik Uporaba časovnega zamika kot parametra za orientacijo na podlagi vibracijskih signalov je bila pri majhnih žuželkah dolgo časa vprašljiva. Omejitev so predstavljale kratke razdalje med receptorskimi strukturami – razpon nog pri zeleni smrdljivki znaša na primer 1 cm. Domnevali so, da na tako kratki razdalji ne morejo nastati dovolj veliki časovni zamiki, da bi jih živčni sistem zaznal. Najkrajši vedenjski prag za časovni zamik so izmerili pri škorpijonih, ki so se lahko orientirali na podlagi zakasnitve 0,2 ms med posameznimi receptorji (Brownell in Farley, 1979). Ena od strategij, ki jih živali uporabljajo za povečanje razdalje med receptorji, je npr. specifična razporeditev nog na vejah okoli križišča (Ota in Čokl, 1991; Čokl in sod., 1999); tako je lahko na križišču razdalja, ki jo mora prepotovati dražljaj od enega do drugega receptorja, dejansko večja od samega razpona nog. Časovni zamik med prihodom vibracijskega signala na dve točki, med seboj oddaljeni 2 cm, ki smo ga izmerili na ipsilateralni in kontralateralni strani razvejitve na fižolu, znaša več kot 2 ms. Iz izmerjenih zamikov izračunana hitrost prenosa signala znaša 5-10 m/s. Tak zamik je dovolj velik, da ga živčni sistem lahko zazna. Izračunana hitrost je precej nižja od hitrosti, izmerjene na bobu (36 m/s za signal frekvence 200 Hz) (Michelsen in sod., 1982). Domnevamo, da so majhne hitrosti povezane s specifično mehansko zgradbo določenega dela rastline. Barth (1998) navaja velik vpliv mehanskih lastnosti posameznih delov rastline na hitrost prevajanja vibracijskih signalov: hitrost signalov frekvence 30 Hz je na bazalnem delu lista agave znašala 35,7 m/s, na apikalnem delu lista pa zgolj 4,4 m/s, kar je primerljivo z našimi rezultati. Kljub temu moramo biti pri oceni hitrosti prenosa signalov previdni; upoštevati moramo, da smo izmerili zgolj fazni zamik. Fazna hitrost signala (phase velocity) pa se lahko precej razlikuje od skupne hitrosti signala (group velocity) (Kremer in Heckl, 1973). Zamiki, ki smo jih izmerili, so namreč lahko zgolj posledica nihanja celotne rastline zaradi odbojev valovanja na vrhu rastline in pri koreninskem sistemu, kar pomeni, da je ocena skupne hitrosti signala iz izmerjenih vrednosti zgolj orientacijska vrednost. Fazne zamike, ki se pojavijo pri prenosu signala preko križišča lahko z gotovostjo zaznajo receptorske celice, ki se na signale odzivajo fazno vezano (sl. 11). Zamik, ki nastane med proženjem akcijskih potencialov senzoričnih vhodov na eni in drugi strani telesa lahko ojačijo lokalni internevroni, ki povezujejo lateralni polovici ustreznega ganglija. Domnevamo, da 111 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 so pri orientaciji zelene smrdljivke udeleženi CG-L internevroni, ki podobno kot omega nevroni ravnokrilcev (Römer in sod., 1981; Horseman in Huber, 1994a, b; Faulkes in Pollack, 2000) posredujejo lateralno inhibicijo na kontralateralno celico v paru in selektivno ojačijo vhode na ipsilateralni strani telesa ter ojačijo razliko v času prihoda vibracijskega signala do posameznih receptorjev. Glede na lego vhodnih in izhodnih regij ter latence odgovorov sklepamo, da so v mehanizmih orientacije udeleženi tudi internevroni tipa CG-AC-1 in PTG-DC. 4.5 MODEL ŽIVČNE MREŽE ZA PROCESIRANJE VIBRACIJSKIH SIGNALOV PRI ZELENI SMRDLJIVKI Reeve in Webbova (2003) sta na podlagi doslej opisanih strukturnih in funkcijskih lastnosti slušnih celic pri murnu skonstruirala model živčnih povezav za fonotaksijo oz. usmerjeno gibanje proti viru zvočnih signalov. Omenjeni model, predstavljen na sl. 71, A, so vgradili v robota, ki je uspešno prestal ‘vedenjske’ poskuse. Avtorji so v model vključili celice, katerih delovanje je najbolje raziskano: omega nevron ON1 v protorakalnem gangliju, vzpenjajoči internevron AN1, ki nosi vzburjenje iz protorakalnega ganglija v možgane in možganska internevrona BNC1 in BNC2. Tako AN1 kot ON1 sta monosinaptično povezana z receptorskimi celicami. AN1 nosi vzburjenje po ipsilateralni strani v možgane, medtem ko omega nevron prečka medialno linijo ganglija in inhibira delovanje kontralateralno ležeče celice AN1 ter bilateralno simetričnega omega nevrona s somo v nasprotni polovici ganglija. Omega nevroni tako ojačujejo lateralni kontrast intenzitete zvoka. Znani modeli živčnih mrež za orientacijo proti viru vibracij pri členonožcih so primeri umetnih živčnih mrež (ANN - artificial neural network = connectionist network) (Hergenröder in Barth, 1983 (pajki); Brownell in van Hemmen, 2001 (škorpijoni); Snyder, 1998 (vodni drsalci)). Te ne temeljijo na dejanskih identificiranih nevronih, kot opisani model pri murnu, temveč zgolj na rezultatih vedenjskih poskusov. Pri takih modelih mrež ne gre za dejansko posnemanje delovanja posameznih nevronov v živčnem sistemu temveč zgolj za to, da umetna mreža čim bolj uspešno posnema določen odziv živali na nek dražljaj (npr. orientacija v smeri dražljaja). Zaradi manjše omejenosti z natančnim upoštevanjem funkcionalnih lastnosti posameznih nevronov v modelu so te mreže primerne za modeliranje kompleksnejših živčnih sistemov. 112 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 V naslednjih vrsticah podajamo prvi model živčne mreže za vibrotaksijo (sl. 71, B), ki temelji na dejanskih identificiranih nevronih in njihovih karakteristikah. Pri izdelavi modela smo se naslanjali na model za fonotaksijo murna. Zaradi lažje predstave smo se omejili na vhoda iz zadnjega para nog oz. na metatorakalni del centralnega ganglija ter na celice tipov LFR, CG-L in CG-AC-1, vse uglašene na 50 Hz. Na podlagi strukture in lege CG-L celic zelene smrdljivke domnevamo, da imajo podobno vlogo kot ON1 murna. Glede na latenco odzivov ekscitirane celice (str. 65) obstaja verjetnost monosinaptične povezave z receptorskimi celicami. Pri ostalih dveh lokalnih internevronih smo zabeležili inhibicijo; domnevamo, da je eden od virov lahko bilateralno simetrična celica v paru. V model smo ob CG-L nevronih vključili še najpogosteje obarvan tip internevrona, CG-L-1. Latence odzivov kažejo, da so vsaj nekatere celice iz te skupine z receptorskimi celicami povezane neposredno. Kot AN1 nevron murna tudi celica CG-AC-1 prevaja informacijo o dražljaju proti možganom, vendar ne ostaja na ipsilateralni strani ganglija, temveč takoj prečka medialno linijo in teče anteriorno po kontralateralni strani živčnega sistema. Lokalni nevroni prejemajo vhode na eni strani ganglija ter na drugi strani inhibirajo CG-AC-1 in svoj bilateralno simetrični par. CG-AC-1 celice poleg tega, da prevajajo informacijo iz receptorskih celic v možgane, tvorijo izhodne sinapse v nevropilah kontralateralnih nog. Domnevamo, da s presinaptično inhibicijo receptorskih celic povečajo lateralni kontrast vibracijskega dražljaja. Pri tem so lahko udeleženi tudi lokalni nevroni. Procesiranje vibracijskih dražljajev v možganih zelene smrdljivke zaenkrat še ni znano. Kljub temu, da smo se pri poskusu modeliranja živčne mreže omejili zgolj na dva senzorična vhoda, kaže, da stoji za procesiranjem vibracijskih signalov veliko bolj kompleksen sistem kot je mreža za procesiranje zvoka pri murnu. Za razumevanje delovanja celotnega sistema pa moramo upoštevati še vhode iz ostalih nog, iz anten, prispevek ostalih tipov internevronov ter dejstvo, da poleg asociacijskih nevronov v možganih verjetno obstaja še kopica neidentificiranih celic tudi v torakalnih ganglijih. V protorakalnem gangliju pričakujemo dodatne lokalne internevrone, vzpenjajoče nevrone in spuščajoče nevrone, podobne celici PTG-DC, ki verjetno prav tako sodeluje pri orientaciji živali, saj vzburjene prenaša iz prve kontralateralne noge v drugo in tretjo ipsilateralno. Predstavljena živčna mreža je tako le zelo poenostavljen poskus razumevanja analize vibracijskih signalov v centralnem živčevju. 113 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 A BNC1J v' levi slušni X] f AN1 J živec_____/ y\ ^-—^ ^A [BNC1 AN1[X desni slušni N \ živec______ ^___________ ON1J N^-- Pomen oznak: O vhodna regija rs,___ ekscitacijski izhod L___ inhibicijski izhod B 1. leva noga 2. leva noga LFR 3. leve noge < ? ? [> ^ 1. desna noga 2. desna noga LFR 3. desne noge Slika 71: Modela živčnih mrež. A. Živčna mreža za fonotaksijo, temelječa na nevroanatomiji murna. ON – omega nevron; AN – vzpenjajoči (ascending) nevron; BNC – možganski (brain) nevroni. Po Reeve in Webb, 2003. B. Model dela živčne mreže za ‘vibrotaksijo’ (usmerjeno gibanje proti viru vibracij), temelječe na nevroanatomiji zelene smrdljivke. 114 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 4.6 SKLEPI V primerjavi s kompleksnostjo vedenjskega nivoja vibracijske komunikacije pri zeleni smrdljivki in zapletenimi fizikalnimi zakonitostmi prenosa vibracijskih signalov po rastlinah je receptorski nivo procesiranja vibracijskih signalov relativno enostaven. Zato smo domnevali, da je centralno procesiranje veliko bolj kompleksno. Ugotovili smo, da je podprto z mrežo internevronov, katerih odzivi na vibracijske signale so rezultat mnogoterih interakcij inhibicijskih in ekscitacijskih vhodov, ki modulirajo osnovno časovno in frekvenčno (ne)uglašenost vibracijskega sistema. Receptorske celice so omejene na ipsilateralno polovico ganglijev, v zgradbi senzoričnih nevropil v centralnem gangliju pa smo opazili določeno mero tonotopije. Območje delovanja in prenos informacije od določenih receptorskih celic na postsinaptične internevrone je uravnavano s presinaptično inhibicijo. Opisali smo devet tipov internevronov, ki so uglašeni na 50 Hz oz. na 100-200 Hz. Na podlagi latenc njihovih odgovorov ter lege vhodnih in izhodnih regij v ganglijih smo ugotavljali povezljivost posameznih tipov. Celice CG-AB so podobne DUM celicam ravnokrilcev, domnevamo, da imajo podobno, nevromodulatorno funkcijo. Opisali smo tudi tri lokalne internevrone (CG-L), ki imajo verjetno podobno vlogo kot omega nevroni ravnokrilcev in omogočajo orientacijo živali na podlagi lateralne inhibicije. Domnevamo, da se živali na križiščih na rastlinah orientirajo na podlagi časovnih zamikov, saj so ti večji od 2 ms in jih opisan živčni sistem lahko zazna. Prav tako je živčni sistem zelene smrdljivke sposoben zaznati spremembe v relativnih intenzitetah posameznih frekvenčnih komponent znotraj posameznega vibracijskega signala, do katerih pride med prenosom vibracij po rastlini. Te razlike bi lahko živalim služile za določanje oddaljenosti vira vibracijskih signalov in/ali orientacijo. Dosedanje raziskave nevrobiološke ravni zaznavanja vibracij temeljijo predvsem na skupinah žuželk, ki za komunikacijo uporabljajo primarno zvočne signale in pri katerih je zaznavanje vibracij stranskega pomena oz. zgolj dopolnjuje zvočno komunikacijo in ne omogoča (ali pa le delno) orientacije proti viru vibracij. S pričujočo nalogo smo zapolnili vrzel v raziskavah procesiranja vibracijskih signalov, saj smo prvič opisali funkcijo in strukturo vibroreceptorskih celic in internevronov pri vrsti žuželk, pri kateri komunikacija z vibracijskimi signali predstavlja primarni kanal za sporazumevanje. Na podlagi vibracijskih signalov so osebki zelene smrdljivke sposobni razpoznati vrsto in spol živali ter se orientirati proti viru vibracij. 115 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 5 POVZETEK Čeprav je vibracijska komunikacija najpogostejši način komuniciranja med žuželkami, je bila v preteklosti deležna neprimerno manj pozornosti kot zvočna komunikacija. Večina raziskav je omejena na vedenjski nivo, nevrobiološka raven vibracijske komunikacije pa je še v veliki meri neraziskana. Večina informacij o centralnem procesiranju vibracijskih signalov izvira iz raziskav na ravnokrilcih, pri katerih je primarna komunikacija z zvokom in orientacija na podlagi vibracij vedenjsko ni bila dokazana (kratkoroge kobilice) ali pa je relativno šibka (murni). Pri stenici vrste Nezara viridula (L.) je vedenjski nivo vibracijske komunikacije že dobro raziskan. Tako samci kot samice producirajo vibracijske signale s tresenjem zadka, vibracije pa se nato preko nog prenašajo na rastlino. Opisanih je bilo več različnih vibracijskih napevov, značilnih za specifične vedenjske situacije. Eden od teh je samičin pozivni napev frekvence 80-100 Hz, ki ga oddaja mirujoča samica, medtem ko samec odgovarja s pozivnim napevom samca ter se premika proti njej. Na križiščih se mora samec orientirati v smeri vira vibracij. Z laserskim vibrometrom smo snemali vibracijske signale samičinega pozivnega napeva na različnih točkah na ciperusu in fižolu. Ugotovili smo, da razlike v intenziteti med posameznimi točkami okoli križišča na fižolu (točka, kjer se odcepita listna peclja prvih dveh listov od stebla) niso zanesljiv parameter za orientacijo samca proti samici, saj intenziteta signala ni nujno višja na točki, ki je bližje viru vibracij. To je posledica disperzne propagacije vibracij po rastlinah in pojava stoječega valovanja zaradi odbojev na vrhu rastline in pri koreninah. Hitrost širjenja vibracij skozi križišče na fižolu je v primerjavi s hitrostmi, ki so jih izmerili na steblu rastline, precej nizka (5-10 m/s2), domnevamo, da zaradi specifičnih mehanskih lastnosti tega dela rastline. Časovni zamiki, ki nastanejo med prihodi vibracijskega signala do posameznih receptorjev so dovolj veliki (2-4 ms), da jih živčni sistem zelene smrdljivke zazna. V sklopu elektrofizioloških poskusov smo živali dražili s serijo umetno sintetiziranih vibracijskih signalov različnih frekvenc (50-4000 Hz) in intenzitet (0,5-100 cm/s2) ter s serijo signalov samičinega pozivnega napeva, posnetih z laserskim vibrometrom na ciperusu in fižolu. Obliko in delovanje nevronov smo opisali z znotrajceličnim odvajanjem električne aktivnosti in sočasnim ionoforetičnim vnašanjem barvila Lucifer Yellow. Posamezne 116 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 nevrone smo združili v skupine na osnovi njihove morfologije ter jih poimenovali glede na frekvenčno območje največje občutljivosti (receptorske celice) oz. glede na lego some in potek aksona (internevroni). Opisali smo dva tipa receptorskih celic, nizkofrekvenčne (LFR) in srednjefrekvenčne (MFR), ki projicirajo v centralni ganglij. Njihovi aksoni so omejeni na ipsilateralno polovico ganglija. Receptorske celice tipa LFR so najbolj občutljive pri 50 Hz in do 150 Hz odgovarjajo fazno vezano. Celice tipa MFR so bolj raznolike v svojem delovanju, pri eni od njih smo zabeležili vpliv presinaptične inhibicije. Projekcije receptorskih celic v senzorični nevropili kažejo tonotopično razporeditev. Opisali smo 29 internevronov, ki smo jih razdelili v devet morfoloških tipov. V skupini CG-AC so celice s somo v centralnem gangliju in kontralateralno ležečim vzpenjajočim aksonom. Celice tipa CG-AB imajo dva vzpenjajoča aksona, po svoji obliki pa so podobne DUM celicam ravnokrilcev. Domnevamo, da imajo nevromodulatorno vlogo. Trije lokalni internevroni CG-L so omejeni na centralni ganglij. Zaradi njihove oblike in lege vhodnih ter izhodnih regij domnevamo, da podobno kot omega nevroni ravnokrilcev posredujejo lateralno inhibicijo in tako povečajo lateralni kontrast med vhodi z nasprotnih strani telesa ter sodelujejo pri orientaciji živali v smeri vira vibracij. Nevron PTG-DC ima somo v protorakalnem gangliju; domnevamo, da prejema vhode iz prve kontralateralne noge ter posreduje vzburjenje v območje nevropil druge in tretje ipsilateralne noge. Internevrone v centralnem gangliju lahko na osnovi odziva na vibracijski signal samičinega pozivnega napeva razdelimo v tri večje skupine, v katerih so internevroni z različno frekvenčno uglašenostjo. Najvišjo frekvenco proženja akcijskih potencialov imajo internevroni z visoko spontano aktivnostjo, uglašeni na ok. 200 Hz (internevroni tipov CG-AC-2 do 5 oz. CG-AB). Vsi tipi internevronov relativno dobro kopirajo amplitudno modulacijo signala, na dinamiko proženja akcijskih potencialov pa vpliva tudi frekvenčna modulacija, ki v večjem delu vibracijskega signala sovpada z amplitudno. Iz odzivov tridesetih internevronov na vibracijska signala, posneta na ciperusu na različnih oddaljenostih od pojoče samice smo ugotovili, da živali lahko zaznajo spremembe v relativnih intenzitetah posameznih frekvenčnih komponent, do katerih pride med prenosom vibracijskih signalov po rastlinah; te razlike lahko uporabijo za določanje smeri in/ali lokacije vira vibracij. 117 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 6 SUMMARY Although vibrational communication is the most common form of communication among the insects, it has received much less attention than sound communication. The majority of research in the field of vibrations has been limited to the behavioural level of communication, while the neurobiological aspect is still largely unknown. Most of the available information about central processing of vibrational signals derives from research done on locusts and crickets that primarily rely on air-borne sound communication and for which either behavioural vibrational directionality has not been established (locusts) or is relatively weak (crickets). In the southern green stinkbug, Nezara viridula (L.), the behavioural level of vibrational communication has been very well documented, which renders this species especially suitable for further research on central processing. Both males and females produce vibrational signals by vibrating the abdomen and the vibrations of the body are transmitted through the legs to the underlying plant tissue. A number of vibrational songs, characteristic for various behavioural situations, have been described. One of them is the female calling song with dominant frequency peak at 80-100 Hz. This type of song is emitted by the stationary female. The male responds with the male calling song while walking towards her and stopping at crossing points in order to orientate towards the source of vibrations. Using the laser vibrometer we recorded vibrational signals of the female calling song from various points on cyperus and bean plants. We conclude that the intensity differences between different points around the branching are not a reliable orientation cue as the intensity of the signal is not necessarily higher on the branch leading to the vibration source. This is the result of dispersive propagation of vibration signals through plants and the occurrence of the standing wave conditions with nodes and internodes. The propagation velocity through the branching point is relatively low (5-10 cm/s2) compared to the velocities previously measured on other parts of the plant. The resulting time-of-arrival differences of the signal to vibration receptors in different legs are sufficiently large for the nervous system to detect (2-4 ms). In electrophysiological experiments the animals’ legs were stimulated by a series of computer-synthesised vibrational signals of various frequencies (50-4000 Hz) and intensities (0,5-100 cm/s2) and a series of signals of the female calling song, pre-recorded from cyperus and bean plants. We described morphology and physiology of neurones using intracellular recording 118 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 of neural activity combined with ionophoretic staining of cells with intracellular dye Lucifer Yellow. Neurons were divided into groups based on their morphology and named based on the frequency sensitivity (receptor cells) or their general shape (interneurones). We described two types of receptor cells, projecting to the central ganglion: the low frequency receptors (LFR) and the middle-frequency receptors (MFR). Their axons are limited to the ipsilateral side of the ganglion. LFR show highest sensitivity at 50 Hz and respond in a phase-locked manner up to 150 Hz. MFR cells are more heterogeneous in their physiology and in one of them presynaptic inhibition has been recorded. Central projections of receptor cells exhibit a certain level of tonotopy in the neuropils of the middle and hind legs in the central ganglion. Twenty-nine interneurones were described and grouped into nine morphological types. Interneurones in group CG-AC have the cell body positioned in the central ganglion and an axon ascending to the prothoracic ganglion contralaterally. The CG-AB cells have two ascending neurones and are similar in gross morphology to the DUM neurons of Orthoptera. We presume those neurons are involved in neuromodulation. Three local interneurones (CG-L) exhibit morphology similar to the omega neuron in crickets. Based on the location of their input and output regions we assume those neurons are involved in enhancing the lateral contrast through lateral inhibition, thus enabling orientation. The cell body of PTG-DC neuron is located in the prothoracic ganglion; the neuron receives input from the first contralateral leg and carries information to the middle and hind leg on the ipsilateral side. Based on the responses to vibrational signals of the female calling song the interneurones in the central ganglion can be divided into three groups with different tuning and sensitivity. Neurons with a high rate of spontaneous activity and best frequency sensitivity at 200 Hz exhibit the highest firing rate in response to the signal (types CG-AC-2 through 5 and CG-AB). All interneurones copy the amplitude modulation of the signal relatively well. Frequency modulation that coincides with amplitude modulation throughout most of the vibration signal also affects the dynamics of firing. Analysis of the responses of thirty interneurones to vibrational signals, recorded on different distances from the singing female on a cyperus revealed that the stinkbugs are capable of detecting the changes in the relative intensities of different frequency components of the signal that occur with the propagation of signal through a plant. The animal may use this rough frequency and intensity analysis as a cue for orientation and/or distance estimation. 119 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 7 VIRI Abbott J. C., Stewart K. W. 1993. Male search behavior of the stonefly, Pteronarcella badia (Hagen) (Plecoptera, Pteronarcyidae), in relation to drumming. Journal of Insect Behaviour, 6(4): 467-481 Aicher B., Tautz J. 1990. Vibrational communication in the fiddler crab, Uca pugilator. Journal of Comparative Physiology, 243: 345-353 Aldrich J. R., Lusby W. R. 1989. Pheromone blends of green stink bugs and possible parasitoid selection. Naturwissenschaften, 76: 173-175 Aldrich J. R., Oliver J. E., Lusby W. R., Kochansky J. P., Lockwood J. A. 1987. Pheromone strains of the cosmopolitan pest, Nezara viridula (Heteroptera: Pentatomidae). Journal of Experimental Biology, 244: 171-175 Atkins G., Pollack G. S. 1986. Age-dependent occurrence of an ascending axon on the omega neuron in the cricket Telleogryllus oceanicus. Journal of Comparative Neurology, 243: 527-534 Atkins G., Pollack G. S. 1987. Response properties of prothoracic, interganglionic, sound-activated interneurons in the cricket Teleogryllus oceanicus. Journal of Comparative Physiology A, 161: 681-693 Baker R., Borges M., Cooke N. G., Herbert R. H. 1987. Identification and synthesis of (Z)-(1’S,3’R,4’S)(–)-2-(3’,4’-Epoxy-4’-methylcyclohexyl)-6-methylhepta-2,5-diene, the sex pheromone of the souhtern green stinkbug, Nezara viridula (L.). Journal of the Chemical Society, Chemical communication, 00: 414-416 Barth F. G. 1998. The vibrational sense of spiders. V: Comparative Hearing: Insects. Hoy R. R., Popper A. N., Fay R. R. (ur.). New York, Springer Verlag(7): 228-278 Barth F. G. 2002: A spider’s world. Senses and behavior. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg Bennet-Clark H. C. 1998. Size and scale effects as constraints in insect sound communication. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B, 353(1367): 407-419 Bennet-Clark H. C. 1999. Resonators in insect sound production: How insects produce loud pure-tone songs. Journal of Experimental Biology, 202: 3347-3357 Bickmeyer U., Kalmring K., Halex H., Mücke A. 1992. The bimodal auditory-vibratory system of the thoracic ventral nerve cord in Locusta migratoria (Acrididae, Locustinae, Oedipodini). Journal of Experimental Zoology, 264(4): 381-394 120 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Birch M. C., Keenlyside J. J. 1991. Tapping behavior is a rhythmic communication in the death-watch beetle, Xestobium rufovillosum (Coleoptera: Anobiidae). Journal of Insect Behavior, 4: 257-263 Blasiolli Moraes M. C., Laumann R. A., Čokl A., Borges M. 2005. Vibratory signals of four Neotropical stink bug species. Physiological Entomology, 30: 175-188 Borges M., Jepson P. C., Howse P. E. 1987. Long-range mate location and close-range courtship behaviour of the green stink bug, Nezara viridula and its mediation by sex pheromones. Entomologia Experimentalis et Applicata, 44: 205-212 Bradbury J. W., Veherencamp S. L. 1998. Principles of Animal Communication. Sinauer, Sunderland, Massachusetts Bräunig P. 1997. The peripheral branching pattern of identified dorsal unpaired median (DUM) neurones of the locust. Cell & Tissue Research, 290: 641-654 Brownell P. 1977. Compressional and surface waves in sand: Used by desert scorpions to locate prey. Science, 197: 479-482 Brownell P., Farley R. D. 1979. Orientation to vibrations in sand by the nocturnal scorpion Paruroctonus mesaensis – Mechanism of target localization. Journal of Comparative Physiology, 131(1): 31-38 Brownell P. H., van Hemmen J. L. 2001. Vibration sensitivity and a computational theory for prey-localizing behavior in sand scorpions. American Zoologist, 41(5): 1229-1240 Buno W., Monti-Bloch L., Mateos A., Handler P. 1981. Dynamic properties of cockroach cercal “threadlike” hair sensilla. Journal of Neurobiology, 12(2): 123-141 Burrows M. 1996. The neurobiology of an insect brain. New York, Oxford University Press, Inc., 682 str. Burrows M., Laurent G. 1993. Synaptic potentials in the central terminals of locust proprioreceptive afferents generated by other afferents from the same sense organ. Journal of Neuroscience, 13(2): 808-819 Burrows M., Matheson T. 1994. A presynaptic gain control mechanism among sensory neurons of a locust leg proprioreceptor. Journal of Neuroscience, 14(1): 272-282 Büschges A. 1994. The physiology of the sensory cells in the ventral scoloparium of the stick insect femoral chordotonal organ. Journal of Experimental Biology, 189: 285-292 Chapman R. F. 1998. The Insects. Structure and function. Cambridge, Cambridge University Press 4: 546-547 121 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Clarac F., Cattaert D. 1999. Functional multimodality of axonal tree in invertebrate neurons. Journal of Physiology, 93: 319-327 Claridge M. F. 1985. Acoustic signals in the Homoptera – Behavior, taxonomy and evolution. Annual Revue of Entomology, 30: 297-317 Cocroft R. B. 2001. Vibrational communication and the ecology of group-living herbivorous insects. American Zoologist, 41: 1215-1221 Cocroft R. B., Tieu T. D., Hoy R. R., Miles R. N. 2000. Directionality in the mechanical response to substrate vibration in a treehopper (Hemiptera: Membracidae: Umbonia crassicornis). Journal of Comparative Physiology, 186: 695-705 Cocroft R. B., Rodríguez R. L. 2005. The behavioral ecology of insect vibrational communication. BioScience, 55(4): 323-334 Comer C. M., Robertson R. M. 2001. Identified nerve cells and insect behavior. Progress in Neurobiology, 63: 409-439 Čokl A. 1983. Functional properties of vibroreceptors in the legs of Nezara viridula (L.) (Heteroptera, Pentatomidae). Journal of Comparative Physiology, 150: 261-269 Čokl A. 1988. Vibratory signal transmission in plants as measured by laser vibrometry. Periodicum Biologorum, 90(2): 193-196 Čokl A., Amon T. 1980. Vibratory interneurons in the central nervous system of Nezara viridula L. (Pentatomidae, Heteroptera). Journal of Comparative Physiology, 139(1): 87-95 Čokl A., Bogataj E. 1982. Faktorji, ki vplivajo na vibracijsko komunikacijo pri stenici Nezara viridula L. (Heteroptera, Pentatomidae). Biološki vestnik 30(1): 1-20 Čokl A., Gogala M., Blaževič A. 1978. Principles of sound recognition in three Pentatomide bug species (Heteroptera). Biološki vestnik, 26(2): 81-94 Čokl A., Kalmring K., Rossler W. 1995. Physiology of atympanate tibial organs in forelegs and midlegs of the cave-living Ensifera, Troglophilus neglectus (Raphidophoridae, Gryllacridoidea). Journal of Experimental Zoology, 273(5): 376-388 Čokl A., Kalmring K., Wittig H. 1977. The responses of auditory ventral-cord neurons of Locusta migratoria to vibration stimuli. Journal of Comparative Physiology, 120: 161-172 Čokl A., McBrien H., Millar J. G. 2001. Comparison of substrate-borne vibrational signals of two stink bug species, Acrosternum hilare and Nezara viridula (Heteroptera: Pentatomidae). Annals of the Entomological Society of America 94(3): 471-479 122 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Čokl A., Otto C., Kalmring K. 1985. The processing of directional vibratory signals in the ventral nerve cord of Locusta migratoria. Journal of Comparative Physiology, 156: 45-52 Čokl A., Prešern J., Virant-Doberlet M., Bagwell G. J., Millar J. G. 2004. Vibratory signals of the harlequin bug and their transmission through plants. Physiological Entomology, 29: 1-10 Čokl A., Virant-Doberlet M. 2003. Communication with substrate-borne signals in small plant-dwelling insects. Annual Review of Entomology, 48: 29-50 Čokl A., Virant-Doberlet M., McDowell A. 1999. Vibrational directionality in the southern green stink bug Nezara viridula (L.) is mediated by female song. Animal Behaviour, 58: 1277-1283 Čokl A., Virant-Doberlet M., Stritih N. 2000a. Temporal and spectral properties of the songs of the southern green stink bug Nezara viridula (L.) from Slovenia. European Journal of Physiology, 439: 168-170 Čokl A., Virant-Doberlet M., Stritih N. 2000b. The structure and function of songs emitted by southern green stink bugs from Brazil, Florida, Italy and Slovenia. Physiological Entomology, 25: 196-205 Čokl A., Virant-Doberlet M., Zorović M. 2005a. Sense organs involved in the vibratory communication of bugs (Hemiptera: Heteroptera). V: Insect Sounds and Communication. Claridge M. F., Drosopoulos S. (ur.). Boca Raton, Florida, CRC Press LCC, v tisku Čokl A., Zorović M., Žunič A., Virant-Doberlet M. 2005b. Tuning of host plants with vibratory songs of Nezara viridula (L.) (Heteroptera: Pentatomidae). Journal of Experimental Biology, 208: 1481-1488 Dambach M. 1972. Der Vibrationssinn von Gryllen. II. Antvorten von Neuronen im Bauchmark. Journal of Comparative Physiology A, 79: 305-324 Dambach M. 1989. Vibrational Responses. V: Cricket Behaviour and Neurobiology. Huber F., Moore J. E., Loher W. (ur.). Ithaca, London, Cornell University Press (6): 178-197 Debaisieux P. 1938. Organes scolopidiaux des pattes d’Insectes. II. La Cellule, 47: 77-202 Devetak D. 1985. Detection of substrate vibrations in the antlion larva Myrmeleon formicarius (Neuroptera: Myrmeleonidae). Biološki vestnik, 33(2): 11-22 Devetak D. 1998. Detection of substrate vibration in Neuropteroidea: A review. Acta Zoologica Fennica, 209: 87-94 Devetak D., Amon T. 1997. Substrate vibration sensitivity of the leg scolopidial organs in the green lacewing, Chrysoperla carnea. Journal of Insect Physiology, 43(5): 433-437 123 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Devetak D., Gogala M., Čokl A. 1978. Prispevek k fiziologiji vibroreceptorjev stenic iz družine Cydnidae (Heteroptera). Biološki vestnik, 26(2): 131-139 Devetak D., Pabst M. A. 1994. Structure of the subgenual organ in the green lacewing, Chrysoperla carnea. Tissue & Cell, 26(2): 249-257 Devetak D., Pabst M. A., Lipovšek Delakorda S. 2004. Leg chordotonal organs and campaniform sensilla in Chrysoperla Steinmann 1964 (Neuroptera): structure and function. Denisia, 13: 163-171 Drašlar K. 1973. Functional properties of trichobothria in the bug Pyrrhocoris apterus. Journal of Comparative Physiology, 84: 175-184 Eibl E., Huber F. 1979. Central projections of tibial sensory fibers within the three thoracic ganglia of crickets (Gryllus campestris L., Gryllus bimaculatus DeGeer). Zoomorphologie, 92: 1-17 Esch H., Huber F., Wholers D. W. 1980. Primary auditory neurons in crickets: physiology and central projections. Journal of Comparative Physiology, 137: 27-38 Ewing A. W. 1989. Mechanisms of sound production. V: Arthropod bioacoustics: Neurobiology and behaviour. Edinburgh, Edinburgh University Press: 16-57 Faulkes Z., Pollack G. S. 2000. Effects of inhibitory timing on contrast enhancement in auditory circuits in crickets (Teleogryllus oceanicus). Journal of Neurophysiology, 84(3): 1247-1255 Field L. H., Bailey W. J. 1997. Sound production in primitive Orthoptera from western Australia: Sounds used in defence and social communication in Ametrus sp. and Hadrogryllacris sp. (Gryllacrididae: Orthoptera). Journal of Natural History 31: 1127-1141 Field L. H., Pflüger H. J. 1989. The femoral chordotonal organ. A bifunctional orthopteran (Locusta migratoria) sense organ. Comparative Biochemistry and Physiology, 93A: 729-743 Field L. H., Matheson T. 1998. Chordotonal Organs of Insects. Academic Press. London, 229 str. Gogala A., Gogala M. 1989. True bugs of Slovenia (Insecta: Heteroptera). Biološki vestnik, 37(1): 11-44 Goodman C. S., Pearson K. G., Heitler W. J. 1979. Variability of identified neurons in grasshoppers. Comparative Biochemistry and Physiology A, 64: 455-462 Goulson D., Birch M. C., Wyatt T. D. 1994. Mate location in the deathwatch beetle, Xestobium rufovillosum De-Geer (Anobiidae) – Orientation to substrate vibrations. Animal Behaviour, 47(4): 899-907 124 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Greenfield M. D. 2002. Signalers and receivers. New York, Oxford University Press Grolleau F., Lapied B. 2000. Dorsal unpaired median neurones in the insect central nervous system: Towards a better understanding of the ionical mechanisms underlying spontaneous electrical activity. Journal of Experimental Biology, 203: 1633-1648 Grosch A., Callender F., Petersen M., Čokl A., Kalmring K. 1985. Vibration receptors of larvae and of imagines in locusts: Location on the legs, central projections and physiology. V: Acoustic and vibrational communication in insects. Kalmring K., Elsner N. (ur.). Berlin, Paul Parey Verlag: 151-161 Hedwig B. 1986. On the role in stridulation of plurisegmental interneurons of the acridid grasshopper Omocestus viridulus L.. I. Anatomy and physiology of descending cephalothoracic interneurons. Journal of Comparative Physiology, 158: 413-427 Hedwig B., Burrows M. 1996. Presynaptic inhibition of sensory neurons during kicking movements of the locust. Journal of Neurophysiology, 75: 1221-1232 Hedwig B., Elsner N. 1985. Sound production and sound detection in a stridulating acridid grasshopper (Omocestus viridulus). V: Acoustic and vibrational communication in insects. Kalmring K., Elsner N. (ur). Berlin, Paul Parey Verlag: 61-72 Hennig R. M. 1988. Ascending auditory interneurons in the cricket Teleogryllus commodus (Walker): comparative physiology and direct connections with afferents. Journal of Comparative Physiology A, 163: 153-143 Henry C. S. 1994. Singing and cryptic speciation in insects. Trends in Ecology & Evolution, 9: 388-392 Hergenröder R., Barth F. G. 1983. Vibratory signals and spider behavior: How do the sensory inputs from the eight legs interact in orientation? Journal of Comparative Physiology 152: 361-371 Hirschberger P. 2001. Stridulation in Aphodius dung beetles: Behavioral context and intraspecific variability of song patterns in Aphodius ater (Scarabaeidae). Journal of Insect Behavior, 14: 69-88 Hokkanen H. 1986. Polymorphism, parasites, and the native area of Nezara viridula (Hemiptera, Pentatomidae). Annales Entomologicae Fennicae, 52(1): 28-31 Horseman G., Huber F. 1994a. Sound localisation in crickets. I. Contralaletral inhibition of an ascending auditory interneuron (AN1) in the cricket Gryllus bimaculatus. Journal of Comparative Physiology, 175: 389-398 Horseman G., Huber F. 1994b. Sound localisation in crickets. II. Modelling the role of a simple neural network in the prothoracic ganglion. Journal of Comparative Physiology A, 175: 399-413 125 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Hoy R. R., Hoikkala A., Kaneshiro K. 1988. Hawaiian courtship songs – Evolutionary innovation in communication signals of Drosophila. Science, 240: 217-219 Hrabar N., Virant-Doberlet M., Čokl A. 2004. Species specificity of male southern green stink bug Nezara viridula (L.) reactions to the female calling song. Acta Zoologica Sinica 50(4): 566-575 Hunt R. E. 1994. Vibrational signals associated with mating bahavior in the treehopper, Enchenopa binotata Say (Hemiptera: Homoptera: Membracidae). Journal of the New York Entomological Society, 102: 266-270 Ivanov V. D. 1993. Principles of sexual communication in caddisflies (Insecta, Trichoptera). V: Sensory systems of arthropods. Gribakin F. G., Popov A. V., Renneinger G. (ur.). Birkenhäuser Verlag, Basel, str.: 609-626 Jackson R. R., Walls E. I. 1998. Predatory and scavenging behaviour of Microvelia macgregori (Hemiptera : Veliidae), a water-surface bug from New Zealand. New Zealand Journal of Zoology, 25(1): 23-28 Jeram S., Čokl A. 1996. Mechanoreceptors in insects: Johnston’s organ in Nezara viridula (L.) (Pentatomidae, Heteroptera). European Journal of Physiology, 431 (Suppl): R281-R282 Jeram S., Pabst M. A. 1996. Johnston’s organ and central organ in Nezara viridula (L.) (Heteroptera, Pentatomidae). Tissue & Cell, 28(2): 227-235 Jones W. A. 1988. World review of the parasitoids of the southern green stink bug, Nezara viridula (L.) (Heteroptera: Pentatomidae). Annals of the Entomological Society of America, 81(2): 262-273 Kalmring K. 1975. The afferent auditory pathway in the ventral cord of Locusta migratoria (Acrididae). I. Synaptic connectivity and information processing among the auditory neurons in the ventral cord. Journal of Comparative Physiology, 104: 103-142 Kalmring K. 1983. Convergence of auditory and vibratory senses at the neuronal level of the ventral cord in grasshoppers; its probable importance for behaviour in the habitat. V: Fortschritte der Zoologie; Bd. 28: Horn (Hrsg.), Multimodal Convergences in Sensory Systems. Stuttgart, New York, Gustav Fischer Verlag Kalmring K., Hoffmann E., Jatho M., Sickmann T., Grossbach M. 1996. The auditory-vibratory sensory system of the bushcricket Polysarcus denticauda (Phaneropteriane, Tettigoniidae). II. Physiology of receptor cells. The Journal of Experimental Zoology, 276: 315-329 Kalmring K., Jatho M., Rössler W., Sickmann T. 1997a. Acousto-vibratory communication in bushcrickets (Orthoptera: Tettigoniidae). Entomologia Generalis, 21(4): 265-291 126 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Kalmring K., Kühne R., Lewis B. 1983. The acoustic behavior of the bushcricket Tettigonia cantans. III. Coprocessing of auditory and vibratory information in the central nervous system. Behavioural Processes, 8(3): 213-228 Kalmring K., Lewis B., Eichendorf 1978. The physiological characteristics of primary neurons of the complex tibial organ of Decticus verrucivorus L. (Orthoptera, Tettigoniidae). Journal of Comparative Physiology, 127: 109-121 Kalmring K., Rössler W., Unrast C. 1994. Complex tibial organs in the forelegs, midlegs, and hindlegs of the bushcricket Gampsocleis gratiosa (Tettigoniidae): Comparison of the physiology of the organs. The Journal of Experimental Zoology 270: 155-161 Kalmring K., Sickmann T., Jatho M., Zhantiev R., Grossbach M. 1997b. The auditory-vibratory sensory system of Polysarcus denticauda (Phaneropterinae, Tettigoniidae): III. Physiology of the ventral cord neurons ascending to the head ganglia. The Journal of Experimental Zoology, 279: 9-28 Keil T. A. 1998. The structure of integumental mechanoreceptors. V: Microscopic anatomy of invertebrates. Vol. 11: Insecta. Wiley-Liss, Inc., str.: 385-404 Keuper A., Kühne R. 1983. The acoustic behaviour of the bushcricket Tettigonia cantans. II. Transmission of airborne sound and vibration signals in the biotope. Behavioral Processes 8:125-145 Kilpinen O., Michelsen A. 1994. Vibration sensitive neurons in the honeybee, Apis mellifera. Elsner N., Breer H. (ur.). Stuttgart, Georg Thieme Verlag, II, str.: 324-324 Kon M., Oe A., Numata H., Hidaka T. 1988. Comparison of the mating behaviour between two sympatric species, Nezara antennata and N. viridula (Heteroptera: Pentatomidae), with special reference to sound emission. Journal of Ethology, 6(2): 91-98 Kraus W. F. 1989. Surface wave communication during courtship in the giant water bug, Abedus indentatus (Heteroptera, Belostomatidae). Journal of the Kansas Entomological Society, 62(3): 316-328 Kremer L., Heckl M. 1973. Structure-borne sound. Berlin, Heidelberg, New York, Springer Verlag: str. 103-115 Kühne R. 1982a. Neurophysiology of the vibration sense in locusts and bushcrickets: Response characteristics of single receptor units. Journal of Insect Physiology, 28: 155-163 Kühne R. 1982b. Neurophysiology of the vibration sense in locusts and bushcrickets: The responses of ventral-cord neurones. Journal of Insect Physiology, 28(7): 615-623 127 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Kühne R., Silver S., Lewis B. 1984. Processing of vibratory and acoustic signals by ventral cord neurons in the cricket Gryllus campestris. Journal of Insect Physiology, 30(7): 575-585 Kühne R., Silver S., Lewis B. 1985. Processing of vibratory signals in the central nervous system of the cricket. V: Acoustic and vibrational communication in insects. Kalmring K., Elsner N. (ur.). Berlin, Paul Parey Verlag: 183-192 Lakes R., Schikorski T. 1990. Neuroanatomy of Tettigoniids. V: The Tettigoniidae: Biology, systematics and evolution. Bailey W. J., Rentz.W.J. (ur.). Bathurst, Crawford House Press Loher W., Dambach M. 1989. Reproductive behaviour. V: Cricket behaviour and neurobiology. Huber F., Moore J. E., Loher W. (ur.). Ithaca, London, Cornell University Press, str.: 43-82 Markl H. 1983. Vibrational communication. V: Neuroethology and Behavioral Physiology. Berlin, Heidelberg, Springer Verlag, str.: 332-353 Markl H., Lang H., Wiese K. 1973. Die Genauigkeit der Ortung eines Wellenzentrums durch ein Rückenscwimmer Notonecta glauca L.. Journal of Comparative Physiology, 86: 359-364 Mason A. C. 1991. Hearing in a primitive ensiferan: the auditory system of Cyphoderis monstrosa (Orthoptera: Haglidae). Journal of Comparative Physiology, 168: 351-363 Mason A. C., Forrest T. G., Hoy R. R. 1998. Hearing in mole crickets (Orthoptera, Gryllotalpidae) at sonic and ultrasonic frequencies. Journal of Experimental Biology, 201: 1967-1979 Mason A. C., Oshinsky M. L., Hoy R. R. 2001. Hyperacute directional hearing in a microscale auditory system. Nature, 410: 686-690 Mason A., Schildberger K. 1993. Auditory interneurones in Cyphoderris monstrosa (Orthoptera, Haglidae). Journal of Comparative Physiology, 168: 351-363 Matheson T. 1992. Morphology of the central projections of physiologically characterised neurones from the locust metathoracic femoral chordotonal organ. Journal of Comparative Physiology, 170: 101-120 McBrien H., Millar J. G. 1999. Phytophagous bugs. V: Pheromones of non-Lepidopteran insects associated with agricultural plants. Hardie J., Minks A. K. (ur.). Wallingford, CAB International, str.: 277-304 Meyhöfer R., Casas J. 1999. Vibratory stimuli in host location by parasitic wasps. Journal of Insect Physiology, 45(11): 967-971 128 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Meyhöfer R., Casas J., Dorn S. 1997. Vibration-mediated interactions in a host-parasitoid system. Proceedings of the Royal Society of London B, 264(1379): 261-266 Michel K., Amon T., Čokl A. 1983. The morphology of the leg scolopidial organs in Nezara viridula (L.) (Heteroptera, Pentatomidae). Revue Canadienne de Biologie Experimentale, 42(2): 139-150 Michelsen A., Fink F., Gogala M., Traue D. 1982. Plants as transmission channels for insect vibrational songs. Behavior, Ecology and Sociobiology, 11: 269-281 Michelsen A., Kirchner W. H., Lindauer M. 1986. Sound and vibrational signals in the dance language of the honeybee, Apis mellifera. Behavior, Ecology and Sociobiology, 18: 207-212 Michelsen A., Larsen O. N. 1983. Strategies for acoustic communication in complex environments. V: Neuroethology and behavioral physiology. Huber F., Markl F. (ur.). Berlin, Heidelberg, Springer Verlag, str.: 321-331 Michieli S., Žener B. 1968. Der Sauerstoffverbrauch verschiedener Farbstadien bei der Wanze Nezara viridula (L.). Zeitschrift fur vergleichende Physiologie, 58: 223-224 Miklas N., Stritih N., Čokl A., Virant-Doberlet M., Renou M. 2001. The influence of the substrate on the male responsiveness to the female calling song in Nezara viridula. Journal of Insect Behavior, 14(3): 313-332 Miklas N., Čokl A., Renou M., Virant-Doberlet M. 2003a. Variability of vibratory signals and mate choice selectivity in the southern green stink bug. Behavioural Processes 61(3): 131-142 Miklas N., Lasnier T., Renou M. 2003b. Male bugs modulate pheromone emission in response to vibratory signals from conspecifics. Journal of Chemical Ecology, 29(3): 561-574 Mücke A., Lakes-Harlan R. 1995. Central projections of sensory cells of the midleg of the locust, Schistocerca gregaria. Cell & Tissue Research, 280: 391-400 Nebeling B. 2000. Morphology and physiology of auditory and vibratory ascending interneurons in bushcricket. Journal of Experimental Zoology, 286: 219-230 Oldfield B. P. 1983. Central projections of primary auditory fibres in Tettigoniidae (Orthoptera, Ensifera). Journal of Comparative Physiology, 151: 389-395 Ota D., Čokl A. 1991. Mate location in the southern green stink bug, Nezara viridula (Heteroptera: Pentatomidae), mediated through substrate-borne signals on ivy. Journal of Insect Behaviour, 4(4): 441-447 129 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Park K. C., Cork A. 1999. Electrophysiological responses of antennal receptor neurons in female Australian sheep blowflies, Lucilia cuprina, to host odours. Journal of Insect Physiology, 45: 85-91 Panizzi A. R. 1997. Wild hosts of Pentatomids: Ecological significance and role in their pest status on crops. Annual Review of Entomology, 42: 99-122 Peters B. H., Römer H., Marquart V. 1986. Spatial segregation of synaptic inputs and outputs in a locust auditory interneurone. Journal of Comparative Neurology, 254: 34-50 Pollack G. S. 1998. Neural processing of acoustic signals. V: Comparative hearing: Insects. Hoy R. R., Popper A. N., Fay R. R. (ur.). New York , Springer Verlag, str.: 139-196 Pollack G. S. 2000. Who, what, where? Recognition and localization of acoustic signals by insects. Current Opinion in Neurobiology, 10: 763-767 Pollack G. S., Imaizumi K. 1999. Neural analysis of sound frequency in insects. BioEssays, 21: 295-303 Poulet J. F. A., Hedwig B. 2002. A corollary discharge maintains auditory sensitivity during sound production. Nature, 418: 872-876 Poulet J. F. A., Hedwig B. 2003. A corollary discharge mechanism modulates central auditory processing in singing crickets. Journal of Neurophysiology, 89: 1528-1540 Reeve R., Webb B. 2003. New neural circuits for robot phonotaxis. Philosophical Transactions of the Royal Society A, 361(1811): 2245-2266 Ridgel A. L., Frazier S. F., Zill S. N. 2001. Dynamic responses of tibial campaniform sensilla studied by substrate displacement in freely moving cockroaches. Journal of Comparative Physiology, 187: 405-420 Robert D., Miles R. N., Hoy R. H. 1998. Tympanal mechanics in the parasitoid fly Ormia ocracea: intertympanal coupling during mechanical vibration. Journal of Comparative Physiology, 183: 443-452 Roces F., Tautz J., Hölldobler B. 1993. Stridulation in Leaf-Cutting Ants – Short-Range Recruitment Through Plant-Borne Vibrations. Naturwissenschaften, 80(11): 521-524 Römer H. 1985. Anatomical representation of frequency and intensity in the auditory system of Orthoptera. V: Acoustic and vibrational communication in insects. Kalmring K., Elsner N. (ur.). Berlin, Paul Parey Verlag, str.: 25-32 Römer H., Marquart V. 1984. Morphology and physiology of auditory interneurons in the metathoracic ganglion of the locust. Journal of Comparative Physiology, 155: 249-262 130 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Römer H., Marquart V. , Hardt M. 1988. Organisation of a sensory neuropile in the auditory pathway of two groups of Orthopterans. Journal of Comparative Neurology, 275: 201-215 Römer H., Rheinlaender J., Dronse R. 1981. Intracellular studies on auditory processing in the metathoracic ganglion of the locust. Journal of Comparative Physiology, 144: 305-312 Ronacher B., Stumpner A. 1988. Filtering of behaviourally relevant temporal parameters of a grasshopper’s song by an auditory interneuron. Journal of Comparative Physiology, 163: 517-523 Ronacher B., Krahe R., Hennig R. M. 2000. Effects of signal duration on the recognition of masked communication signals by the grasshopper Chorthippus biguttulus. Journal of Comparative Physiology, 186: 1065-1072 Rupprecht R. 1974. Vibration signals during copulation of Panorpa (Mecoptera Insecta). Experientia, 30: 340-341 Rutschky C. W., Stryjak E. R. 1955. A gross study of the nervous system of the large milkweed bug, Oncopeltus facsiatus (Dallas). Annual Revue of Entomological Society of America, 48: 219-221 Sanford G. M., Lutterschmidt W. I., Hutchison V. H. 2002. The comparative method revisited. BioScience, 52(9): 830-836 Sauer A. E., Büschges A., Stein W. 1997. Role of presynaptic inputs to proprioreceptive afferents in tuning sensorimotor pathways of an insect joint control network. Journal of Neurobiology, 32: 359-376 Sauer A. E., Stein W. 1999. Sensorimotor pathways processing vibratory signals from the femoral chordotonal organ of the stick insect. Journal of Comparative Physiology, 185: 21-31 Schildberger K. 1984. Temporal selscitvity of identified auditory neurons in the cricket brain. Journal of Comparative Physiology, 155: 171-185 Schnorbus H. 1971. Die subgenualen Sinnesorgane von Periplaneta americana: Histologie und Vibrationsschwellen. Zeitschrift fur vergleichende Physiologie, 71: 14-48 Schul J. 1997. Neuronal basis of phonotactic behaviour in Tettigonia viridissima: processing of behaviourally relevant signals by auditory afferents and thoracic interneurons. Journal of Comparative Physiology, 180: 573-583 Shaw S. 1994a. Detection of airborne sound by a cockroach “vibration detector”: a possible missing link in insect auditory evolution. Journal of Experimental Biology, 193(1): 13-47 131 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Shaw S. R. 1994b. Re-evaluation of the absolute threshold and response mode of the most sensitive known vibration detector, the cockroach’s subgenual organ – A cochlea-like displacement threshold and a direct response to sound. Journal of Neurobiology, 25(9): 1167-1185 Silver S., Kalmring K., Kuhne R. 1980. The responses of central acoustic and vibratory interneurones in bushcrickets and locusts to ultrasonic stimulation. Physiological Entomology, 5(4): 427-435 Snyder M. R. 1998. A functionally equivalent artificial neural network model of the prey orientation behavior of waterstriders (Gerridae). Ethology 104: 285-297 Stein W., Sauer A. E. 1999. Physiology of vibration-sensitive afferents in the femoral chordotonal organ of the stick insect. Journal of Comparative Physiology, 184(3): 253-263 Stein W., Schmitz J. 1999. Multimodal convergence of presynaptic afferent inhibition in insect proprioreceptors. The Journal of Neurophysiology, 82(1): 512-514 Stewart, W. 1978. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell 14: 741-759 Stewart K. W. 1997. Vibrational communication in insects. American Entomologist 43: 81-91 Stiedl O., Stumpner A., Mbongu D. N., Atkins G., Stout J. F. 1997. Morphology and physiology of the local auditory interneurones in the prothoracic ganglion of the cricket Acheta domesticus. Journal of Experimental Zoology, 279: 43-53 Stiedl O., Kalmring K. 1989. The importance of song and vibratory signals in the behavior of the bushcricket Ephippiger ephippiger Fiebig (Orthoptera, Tettigoniidae): Taxis by females. Oecologia, 80(1): 142-144 Stölting H., Moore T. E., Lakes-Harlan R. 2002. Substrate vibrations during acoustic signalling in the cicada Okanagana rimosa. Journal of Insect Science, 2: 2 Stritih N. 2001. Vibracijski internevroni protorakalnega ganglija jamske kobilice Troglophilus neglectus (Krauss). Magistrsko delo. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta Stritih N., Virant-Doberlet M., Čokl A. 2000. Green stink bug Nezara viridula detects differences in amplitude between courtship song vibrations at stem and petiolus. European Journal of Physiology, 439(3): R190-R192 Stumpner A., Atkins G., Stout J. F. 1995. Processing of unilateral and bilateral auditory inputs by the ON1 and L1 interneurons of the cricket Acheta domesticus and comparison to other cricket species. Journal of Comparative Physiology 177: 379-388 132 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Stumpner A., Ronacher B. 1994. Neurophysiological aspects of song pattern recognition and sound localization in grasshoppers. American Zoologist, 34: 696-705 Stumpner A., von Helversen D. 2001. Evolution and function of auditory system in insects. Naturwissenschaften, 88: 159-170 Todd J. W. 1989. Ecology and behavior of Nezara viridula. Annual Review of Entomology, 34: 273-292 Tyrer N. M., Gregory G. E. 1982. A guide to the neuroanatomy of locust subesophageal and thoracic ganglia. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Phil, 297: 91-123 Vilhelmsen L., Isidoro N., Romani R., Basibuyuk H. H., Quicke D. L. J. 2001. Host location and oviposition in a basal group of parasitic wasps: the subgenual organ, ovipositor apparatus and associated structures in the Orussidae (Hymenoptera, Insecta). Zoomorphology, 121(2): 63-84 Virant-Doberlet M. 1989. Analiza vibracijskih dražljajev v centralnem živčevju murna (Gryllus campestris). Magistrsko delo. Univerza Edvarda Kardelja v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, VTOZD za biologijo Virant-Doberlet M., Čokl A. 2004. Vibrational communication in insects. Neotropical Entomology, 33(2): 121-134 Virant-Doberlet M., Čokl A., Zorović M. 2005. Use of substrate vibrations for orientation: From behaviour to physiology. V: Insect Sounds and Communication. Claridge M. F., Drosopoulos S. (ur.). Boca Raton, Florida, CRC Press LCC, v tisku von Helversen D., von Helversen O. 1998. Acoustic pattern recognition in a grasshoppers: Processing in the time or frequency domain? Biological Cybernetics, 79: 467-476 Walker A., Jones JR. 1985. Nezara viridula. V: Handbook of Insect Rearing. Singh P., Moore R. F. (ur.). Amsterdam, Elsevier Science Publishers B. V., str.: 339-343 Watson A. H. D., Hardt M. 1996. Distribution of synapses on two local auditory interneurones, ON1 and ON2, in the prothoracic ganglion of the cricket: relationships with GABA-immunoreactive neurones. Cell & Tissue Ressearch, 238: 231-246 Wilcox R. S. 1995. Ripple communication in aquatic and semiaquatic insects. Ecoscience 2: 109-115 Wohlers D. W., Huber F. 1978. Intracellular recordings and staining of cricket auditory interneurons (Gryllus campestris L., Gryllus bimaculatus DeGeer). Journal of Comparative Physiology, 127: 11-28 133 Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005 Wohlers D. W., Huber F. 1982. Processing of sound signals by six types of neurons in the prothoracic ganglion of the cricket, Gryllus campestris L.. Journal of Comparative Physiology 146: 161-173 Wolf H., Burrows M. 1995. Proprioreceptive sensory neurons of a locust leg receive rhythmic presynaptic inhibition during walking. Journal of Neuroscience, 15: 5623-5636 Zorović M. 2003. Funkcionalne lastnosti vibracijskih internevronov v centralnem gangliju stenice vrste Nezara viridula (Heteroptera: Pentatomidae). Magistrsko delo. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005___________________________ ZAHVALA Svojemu mentorju prof. dr. Andreju Čoklu se zahvaljujem za svobodo, motivacijo, spodbudo ter zanimivo temo doktorske disertacije. Delovni mentorici dr. Meti Virant-Doberlet se zahvaljujem za razumevanje in potrpežljivo prenašanje tarnanja nad nekooperativnimi poskusnimi objekti, za nadvse koristne nasvete in konstruktivne pripombe, ki so pripomogli k boljši končni podobi pričujočega dela in za hitro prvo pomoč ob pomanjkanju literature iz njenega skrajno urejenega ustvarjalnega nereda. Doc. dr. Kazimirju Drašlarju se zahvaljujem za opozarjanje na hude neumnosti in odpiranje vrat v sanjarije, prof. dr. Dušanu Devetaku pa za kritično prebiranje dela in koristne pripombe. Doc. dr. Andreju Blejcu se zahvaljujem za pomoč pri statistični obdelavi podatkov. Nataši gre zahvala za uvajanje v tehniko znotrajceličnega odvajanja živčnih impulzov in nesebično pomoč, kadarkoli se je kaj zataknilo, Petri za prijetno delovno okolje in zvrhano mero humorja, Janezu za reševanje majhnih in velikih tehničnih težav, Alenki za prevzem ISO bremena in pripravljenost vedno priskočiti na pomoč, Verici za slane palčke, muffine in kruhke ter vsem ostalim sodelavcem za prijetno delovno vzdušje, za pogovore ob čaju in pomoč, takšno in drugačno. Srčna hvala tudi staršem in bratu, za to, da so mi venomer vlivali pogum in mi stali ob strani, ko se je zoblačilo, ter se z menoj veselili sonca; in seveda fantu Jožetu, za to, da je. Zorović M. Struktura in funkcija vibracijskih nevronov v torakalnih ganglijih stenice N. viridula. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2005___________________________ PRILOGA Priprava fiziološke raztopine in fosfatnega pufra: A) Fiziološka raztopina Dawenport (1000 ml); pH = 7,2 NaCl 6,7 g KCl 0,15 g CaCl2 x 2H2O 0,12 g NaHCO3 0,15 g dest. H2O do 1000 ml B) Fosfatni pufer (PBS); pH = 7,2 NaCl 8,0 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,24 g dest. H2O do 1000 ml