Andrej Steyer1, Tina Mikuletič2, Tjaša Cerar Kišek3, Tina Triglav4 virucidna učinkovitost pastil s kombinacijo cetilpiridinijevega klorida in benzidaminijevega klorida na virus influence a Virucidal Efficacy of Lozenges with a Fixed-dose Combination of Cetylpyridinium Chloride and Benzydamine Hydrochloride Against Influenza A Virus IZvLEČEK KLJUČNE BESEDE: cetilpiridinijev klorid, benzidaminijev klorid, virus influence A tipa H3N2, okužba dihal IZHODIŠČA. Virusi so najpogostejši povzročitelji vnetja žrela. Čeprav se večina okužb dihal konča spontano, bolniki pogosto uporabljajo različne izdelke za samozdravljenje. Pastile s kombinacijo benzidaminijevega klorida (BK) in cetilpiridinijevega klorida (CPK) dokazano učinkovito lajšajo simptome vnetega žrela. Antiseptik CPK so že opisa- li kot učinkovit baktericid, nekatere raziskave pa potrjujejo njegovo učinkovitost tudi pri določenih virusih z ovojnico. METODE. Namen raziskave je bil preučiti virucidno delo- vanje CPK ter kombinacije BK in CPK v obliki proste (čiste) učinkovine in v obliki pastil (testne snovi) na virus influence A v pogojih in vitro. Testne snovi v suspenzijah različnih koncentracij in virus smo inkubirali 1 minuto, 5 minut ali 15 minut ter ugotavljali koli- čino infektivnih virusov. REZULTATI. Kombinacija BK in CPK v obliki pastile v suspen- ziji z visoko koncentracijo zniža virusni titer za več kot 4 log10(c) po eni minuti, medtem ko CPK ter BK in CPK kot proste učinkovine podobno znižanje dosežejo po petih minu- tah. Po 5–15 minutah znižanje virusnega titra za 4 log10(c) dosega še kombinacija BK in CPK v obliki pastile v suspenziji s srednjo koncentracijo. RAZPRAVA. Rezultati testira- nja in vitro dokazujejo učinkovito, močno virucidno delovanje pastil s kombinacijo BK in CPK na virus influence A. 1 Dr. Andrej Steyer, univ. dipl. mikrobiol., Oddelek za javnozdravstveno mikrobiologijo, Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje in hrano, Prvomajska ulica 1, 2000 Maribor 2 Dr. Tina Mikuletič, univ. dipl. mikrobiol., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška cesta 4, 1000 Ljubljana 3 Znan. sod. dr. Tjaša Cerar Kišek, univ. dipl. mikrobiol., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška cesta 4, 1000 Ljubljana 4 Asist. Tina Triglav, dr. med., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška cesta 4, 1000 Ljubljana 121Med Razgl. 2022; 61 (1): 121–30 • Pregledni članek mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 121 običajno vsebujejo izdelki za lokalno per- oralno uporabo v obliki tekočine za izpira- nje ust (grgranje), pastil in pršil. Virusne okužbe dihal spadajo med naj- pogostejše bolezni na svetu. Običajno se kažejo s simptomi, kot so vnetje nosne sluz- nice, kašelj, zvišana telesna temperatura in vnetje žrela. Čeprav se večina okužb dihal konča spontano in ne zahteva posebnega zdravljenja, bolniki zelo pogosto upora- bljajo različne izdelke za samozdravljenje, ki lahko blažijo simptome ali odpravijo vzrok okužbe (4). Pastile s fiksno kombinacijo benzid- aminijevega klorida (BK) in CPK so klinično učinkovite pri odpravljanju simptomov vnetega žrela (5). Nedavno je bil v testira- nju in vitro potrjen tudi njihov virucidni uči- nek na SARS-CoV-2 (6). Virucidna učinko- vitost CPK je dokazana tudi za različne seve virusa influence, saj so s testiranji in vitro dokazali razpad virusne ovojnice ob izpo- stavitvi tej učinkovini (7). 122 Andrej Steyer, Tina Mikuletič, Tjaša Cerar Kišek, Tina Triglav virucidna učinkovitost pastil… aBSTRaCT KEY WORDS: cetylpyridinium chloride, benzydamine hydrochloride, influenza virus A subtype H3N2, respiratory tract infection BACKGROUNDS. Viruses are the most common causes of pharyngitis. Although most respiratory infections resolve spontaneously, patients very often use various self-medi- cation therapies. Lozenges with a fixed-dose combination of benzydamine hydrochlori- de (BH) and cetylpyridinium chloride (CPC) have been shown to be effective in relieving symptomatic sore throat. The antiseptic CPC has already been described as an effective bactericide, and some researches confirm its effectiveness in certain enveloped viruses. METHODS. The aim of the study was to investigate the in vitro virucidal activity of CPC and the fixed-dose combination of BH/CPC as a free active substance or as a lozenge on influenza A virus. The virus and the suspensions of different concentrations of test sub- stances were incubated for 1 minute, 5 minutes and 15 minutes, and the amount of infec- tious viruses was determined. RESULTS. The fixed-dose combination of BH/CPC in the form of a lozenge in high-concentration suspension reduces the viral titer by 4 log10(c) after only one minute, while in the case of CPC and BH/CPC as free active substances, a similar reduction is achieved only after five minutes. A reduction of the viral titer by 4 log10(c) is also achieved by BH/CPC lozenges in medium-concentration suspension bet- ween 5 and 15 minutes. DISCUSSION. The results of in vitro testing demonstrate effec- tive, potent virucidal activity of BH/CPC lozenges on influenza A virus. IZHODIšČa Izbruh koronavirusa hudega akutnega respi- ratornega sindroma 2 (angl. severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS- -CoV-2) je sprožil intenzivno iskanje in preučevanje učinkovitih metod zdravljenja in preprečevanja okužbe. Pozornost so pri- tegnili tudi oralni antiseptiki, s katerimi bi morda lahko zmanjšali virusno obremeni- tev ustne votline in tveganje za prenos okužbe. Med preučevanimi antiseptiki je cetilpiridinijev klorid (CPK), za katerega raz- položljivi znanstveni podatki kažejo najbolj spodbudne rezultate. Ima širok razpon delovanja, saj deluje baktericidno in viru- cidno (1). V nekaterih kliničnih raziskavah so ugotovili, da ustne vode s CPK lahko zmanjšajo virusno obremenitev s SARS- -CoV-2, kar kaže na možno vlogo te učin- kovine pri nadzoru koronavirusne bolezni 2019 (angl. coronavirus disease-19, COVID- -19) (2, 3). CPK kot samostojno učinkovino ali v kombinaciji z drugimi učinkovinami mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 122 pancreas, TPCK) v končni koncentraciji trip- sina 2 µg/ml. Koncentracija virusnega izo- lata je bila določena s Spearman-Kärberjevo metodo (9). Virusnemu sevu smo določili razredčino virusa (izraženo v virusni enoti na mililiter), pri kateri virus okuži 50% celic v celični kulturi – 50-% odmerek za tkivno kulturo (angl. median tissue culture infectious dose, TCID50/ml). Izhodna koncentracija pomnoženega virusa je bila 109,41 TCID50/ml (tabela 1). Test virucidnosti in nadzorni postopki Testne snovi smo raztopili v trdi vodi z dodatkom »moteče snovi« (v nadaljevanju suspenzija), da smo ustvarili biološko obremenjene pogoje in simulirali sestavo sline. Suspenzija je bila raztopina goveje- ga serumskega albumina (GSA) (3,0 g/l vode) z eritrociti v koncentraciji 3,0 ml/l. Virusne kulture smo izpostavili testnim snovem pri temperaturi 37 °C za 1 minuto, 5 minut ali 15 minut, kar ustreza povpre- čnemu času lizanju pastil (5–10 minut). Uporabili smo tri koncentracije testnih snovi, ki smo jih pridobili z raztapljanjem testne snovi v 4 ml (visoka koncentracija), 20ml (srednja koncentracija) in 30ml (nizka koncentracija) suspenzije. Testne snovi so prikazane v tabeli 2. Sočasno s testom virucidnosti vsake od testnih snovi so potekale ustrezne kontro- le celic in virusa, virusa v celotnem inku- bacijskem času testa, zaviralnega učinka testne snovi v ledeno hladnem celičnem mediju, vpliva testne snovi na dovzetnost celic za virus in njenega citotoksičnega učinka na celice. 123Med Razgl. 2022; 61 (1): Z raziskavo, ki smo jo izvedli na Inštitutu za mikrobiologijo in imunologijo Medicin- ske fakultete, smo želeli v pogojih in vitro potrditi virucidno delovanje pastil s fiksno kombinacijo BK in CPK na virus influence A in hkrati primerjati virucidni učinek CPK ter kombinacije BK in CPK kot prostih učinkovin. Tako smo želeli ovrednotiti možni vpliv ostalih učinkovin (BK) in pomožnih sestavin v pastili na virucidno učinkovitost. METODE Testiranje je potekalo skladno z metodami in zahtevami, ki jih določa standard Sloven- skega inštituta za standardizacijo za vred- notenje virucidnega delovanja v humani medicini (8). Pogoji testiranja in časi stika so bili izbrani in prilagojeni fizikalno- -kemičnim lastnostim ustne votline pri človeku z upoštevanjem dejavnikov, kot so temperatura, sestava (biološka obremeni- tev) in količina sline, ki nastane med raz- tapljanjem pastil, ter dinamika raztapljanja pastil (različen čas stika). Osamitev virusa in kvantifikacija Testni ortomiksovirus, tj. virus influence A, sev A/Victoria/3/75, tip hemaglutinin 3 nevraminidaza 2 (H3N2), smo pridobili iz Ameriške zbirke tipskih kultur (American Type Culture Collection, ATCC), ga pred- hodno pomnožili v celični kulturi in dolo- čili količino virusa. Za gojenje virusa smo uporabili celično linijo Madin-Darbyjevih pasjih ledvičnih (angl. Madin-Darby canine kidney, MDCK) celic in najmanjše osnovno gojišče z dodatkom 10 % fetalnega goveje- ga seruma (FGS) in tripsina iz goveje tre- bušne slinavke (angl. trypsin from bovine Tabela 1. Izhodne koncentracije virusa, uporabljenega pri testiranju. IZ – interval zaupanja, H3N2 – hem- aglutinin 3, nevraminidaza 2. Testni virus Oznaka seva Prvi datum log10(c)  95-% IZ osamitve Virus influence A, A/Victoria/3/75 3. 5. 2021 9,41 ± 0,67 tip H3N2 mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 123 REZULTaTI Rezultati kontrolnih testov V pogojih testnega sistema je bil virus stabilen ves čas testiranja, koncentracija infektivnih virusov se ni bistveno znižala. Zaviralni učinek hladnega celičnega medija na delovanje testne snovi v visoki koncentraciji (testna snov, raztopljena v 4ml medija) je bil potrjen. Titer virusa pred izpo- stavitvijo in po njej se ni bistveno razliko- val in ni presegel razlike 1 – log10(c) vrednosti koncentracije, ki jo standard dolo- ča kot mejno vrednost. Nobena od testnih snovi v najvišji ne- citotoksični koncentraciji ni vplivala na dovzetnost celic za virus. Opazili smo le zelo majhna, a še sprejemljiva odstopanja. Citotoksičnost testnih snovi v visoki koncentraciji smo testirali na razredčitvah od 10-1 do 10-11. Citotoksičnost z deformacijo ali uničenjem celičnega sloja se je pri test- nih snoveh CPK, kombinaciji BK in CPK kot prostih učinkovin, pri pastilah z BK in CPK z okusom po evkaliptu in pri pastilah s pla- cebom ter okusom po evkaliptu pokazala pri razredčitvah 10-1 in 10-2. Pri pastilah z BK in CPK z okusom po limoni in medu ter pasti- lah s placebom in z okusom po limoni in medu pa smo citotoksičnost zaznali le pri razredčitvi 10-1. S tem smo določili mejo, pri kateri je smiselno odčitavanje citopatskega učinka virusa. Raven citotoksičnosti glede na razredčitev virusa v testni suspenziji je pri- kazana v tabeli 4. Rezultati učinkovanja testnih snovi na inaktivacijo virusa Vsako testno koncentracijo smo testirali dvakrat, na različna dneva. Končni rezultat je prikazan kot povprečje obeh testiranj. Številski prikaz rezultatov je v tabelah 3 in 4, grafični prikaz pa na slikah 1, 2 in 3. Virucidnost je bila močno izražena v najvišji koncentraciji, ki je ekvivalent raztapljanja ene pastile v 4 ml suspenzije. V srednji koncentraciji, ki je ekvivalent raztapljanja ene pastile v 20 ml suspenzi- je, je bila virucidnost še vedno izražena, toda s spremenjeno dinamiko, saj so se podob- ni učinki pokazali šele po 15 minutah. Rezultati kažejo na izrazito razliko med virucidnostjo pastil z učinkovinami in pastilami s placebom. Najbolj opazna je pri visoki in srednji koncentraciji, vidna pa je tudi pri nizki koncentraciji. 124 Andrej Steyer, Tina Mikuletič, Tjaša Cerar Kišek, Tina Triglav virucidna učinkovitost pastil… Tabela 2. Testne snovi, ki smo jih preizkusili. BK – benzidaminijev klorid, CPK – cetilpiridinijev klorid, E – Evropa, FCF – za obarvanje hrane (angl. for coloring food). Testna snov Sestava testne snovi Pastila z BK in CPK, evkalipt 3 mg BK, 1 mg CPK, evkaliptovo olje, levomentol, citronska (pastila Septabene®) kislina (E 330), sukraloza (E 955), izomalt (E 953), briljantno modro FCF (E 133) Pastila s placebom, evkalipt evkaliptovo olje, levomentol, citronska kislina (E 330), sukraloza (E 955), izomalt (E 953), briljantno modro FCF (E 133) Pastila z BK in CPK 3 mg BK, 1 mg CPK, eterično olje poprove mete, (pastila Septabene®), levomentol, sukraloza (E 955), citronska kislina limona, med (E 330), izomalt (E 953), aroma limone, aroma medu, kurkumin (E 100), natrijev benzoat (E 211) Pastila s placebom, limona, med eterično olje poprove mete, levomentol, sukraloza (E 955), citronska kislina (E 330), izomalt (E 953), aroma limone, aroma medu, kurkumin (E 100), natrijev benzoat (E 211) CPK kot prosta učinkovina 1 mg CPK BK in CPK kot prosti učinkovini 3 mg BK, 1 mg CPK mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 124 125Med Razgl. 2022; 61 (1): CPK placebo PE BK + CPK BK + CPK PLM BK + CPK PE placebo PLM L o g (c )/ T C ID /m l 10 5 0 3,50 4,50 5,50 6,50 8,50 9,50 7,50 Čas stika (min) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Slika 1. Izpostavitev virusa influence A testni snovi v najvišji koncentraciji (ekvivalent raztopine ene pastile v 4 ml suspenzije) v treh različnih časih stika. TCID50/ml – 50-% kužni odmerek za tkivno kulturo (angl. median tissue culture infectious dose), CPK – cetilpiridinijev klorid, BK – benzidaminijev klorid, PE – pastila, evkalipt, PLM – pastila, limona, med. CPK placebo PE BK + CPK BK + CPK PLM BK + CPK PE placebo PLM L o g (c )/ T C ID /m l 10 5 0 3,50 4,50 5,50 6,50 8,50 9,50 7,50 Čas stika (min) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Slika 2. Izpostavitev virusa influence A testni snovi v srednji koncentraciji (ekvivalent raztopine ene pastile v 20 ml suspenzije) v treh različnih časih stika. TCID50/ml – 50-% kužni odmerek za tkivno kulturo (angl. median tissue culture infectious dose), CPK – cetilpiridinijev klorid, BK – benzidaminijev klorid, PE – pastila, evkalipt, PLM – pastila, limona, med. mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 125 126 Andrej Steyer, Tina Mikuletič, Tjaša Cerar Kišek, Tina Triglav virucidna učinkovitost pastil… Ta be la  3 .T es tn e uč in ko vi ne z  v re dn os tj o pH in z ni ža nj em k on ce nt ra ci je in fe kt iv ni h de lc ev v iru sa in fl ue nc e A  g le de n a ko nc en tr ac ijo in č as s ti ka . C PK  – c et ilp iri di ni je v kl or id , B K  – b en zi da m in ije v kl or id , I Z  – in te rv al z au pa nj a. CP K  k ot  p ro st a B K  in  C P K  k ot  p ro st i P as ti la  z  B K  in  C P K , P as ti la  s  p la ce bo m , P as ti la  z  B K  in  C P K , P as ti la  s  p la ce bo m , uč in ko vi na uč in ko vi ni ev ka lip t ev ka lip t lim on a,  m ed lim on a,  m ed V is ok a ko nc en tr ac ija (r az to pl je no v  4 m l s us pe nz ije ) V re dn os t pH 7, 86 8, 06 3, 27 3, 14 2, 73 2, 69 Ča s (m in ) ∆ lo g 1 0( c) ± 9 5- % IZ 1 –2 ,9 4 ± 0, 51 –3 ,6 3 ± 0, 47 –4 ,5 0 ± 0, 41 –1 ,2 5 ± 0, 48 –4 ,5 7 ± 0, 40 –0 ,8 8 ± 0, 45 5 –4 ,2 5 ± 0, 47 –4 ,6 9 ± 0, 40 –4 ,6 9 ± 0, 36 –2 ,1 3 ± 0, 48 –4 ,6 9 ± 0, 36 –1 ,7 5 ± 0, 49 15 –4 ,6 3 ± 0, 41 –4 ,8 2 ± 0, 36 –4 ,6 9 ± 0, 36 –2 ,8 2 ± 0, 48 –4 ,5 7 ± 0, 36 –2 ,3 8 ± 0, 48 Sr ed nj a ko nc en tr ac ija (r az to pl je no v  2 0 m l s us pe nz ije ) V re dn os t pH 7, 92 7, 93 4, 45 4, 61 3, 72 3, 55 Ča s (m in ) ∆ lo g 1 0( c) ± 9 5- % IZ 1 –2 ,0 6 ± 0, 42 –1 ,6 3 ± 0, 49 –2 ,8 8 ± 0, 49 –1 ,5 0 ± 0, 45 –1 ,2 5 ± 0, 48 –0 ,5 6 ± 0, 47 5 –2 ,7 5 ± 0, 48 –3 ,1 9 ± 0, 50 –3 ,8 1 ± 0, 49 –2 ,5 0 ± 0, 47 –3 ,1 3 ± 0, 47 –2 ,0 6 ± 0, 47 15 –3 ,3 1 ± 0, 51 –3 ,7 5 ± 0, 47 –5 ,4 4 ± 0, 45 –2 ,4 4 ± 0, 45 –4 ,5 0 ± 0, 44 –2 ,6 2 ± 0, 48 N iz ka k on ce nt ra ci ja (r az to pl je no v  3 0 m l s us pe nz ije ) V re dn os t pH 7, 85 7, 97 5, 33 5, 21 4, 00 4, 04 Ča s (m in ) ∆ lo g 1 0( c) ± 9 5- % IZ 1 –0 ,6 2 ± 0, 34 –1 ,1 9 ± 0, 47 –1 ,5 0 ± 0, 44 –1 ,0 0 ± 0, 45 –1 ,2 6 ± 0, 47 –0 ,7 5 ± 0, 45 5 –1 ,8 7 ± 0, 32 –1 ,6 3 ± 0, 44 –2 ,2 5 ± 0, 47 –1 ,3 2 ± 0, 47 –2 ,0 0 ± 0, 47 –1 ,1 9 ± 0, 47 15 –2 ,6 2 ± 0, 34 –3 ,3 8 ± 0, 47 –3 ,3 2 ± 0, 41 –1 ,9 4 ± 0, 47 –3 ,0 0 ± 0, 43 –2 ,1 3 ± 0, 40 mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 126 127Med Razgl. 2022; 61 (1): Ta be la  4 .R ez ul ta ti t es ti ra nj a vi ru ci dn os ti n a vi ru s in fl ue nc e A . C PK  – c et ilp iri di ni je v kl or id , B K  – b en zi da m in ije v kl or id , I Z  – in te rv al z au pa nj a. CP K  (0 ,2 5  m g/ m l) BK  in  C PK Pa st ile  z  B K  in  C PK , Pa st ile  s  p la ce bo m , Pa st ile  z  B K  in  C PK , Pa st ile  s  p la ce bo m , Ko nt ro la (0 ,2 5  in  0 ,7 5  m g/ m l) ev ka lip t ( 1 p as ti la /4  m l) ev ka lip t ( 1 p as ti la /4  m l) lim on a,  m ed  (1  p as ti la /4  m l) lim on a,  m ed  (1  p as ti la /4  m l) z  vi ru so m Ča s (m in ) lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ 0 9, 32 0, 72 9, 32 0, 72 9, 19 0, 72 9, 63 0, 68 9, 19 0, 72 9, 51 0, 70 9, 41 0, 67 1 6, 38 0, 71 5, 69 0, 61 4, 69 0, 40 8, 38 0, 68 4, 63 0, 35 8, 63 0, 58 / / 5 5, 07 0, 62 4, 63 0, 35 4, 50 0, 00 7, 50 0, 69 4, 50 0, 00 7, 76 0, 68 / / 15 4, 69 0, 40 4, 50 0, 00 4, 50 0, 00 6, 82 0, 68 4, 63 0, 00 7, 13 0, 67 9, 36 0, 62 Ci to to ks ič no st 4, 50 / 4, 50 / 4, 50 / 4, 50 / 3, 50 / 3, 50 / / / CP K  (0 ,0 5  m g/ m l) BK  in  C PK Pa st ile  z  B K  in  C PK , Pa st ile  s  p la ce bo m , Pa st ile  z  B K  in  C PK , Pa st ile  s  p la ce bo m , Ko nt ro la  z  v iru so m (0 ,0 5  in  0 ,1 5  m g/ m l) ev ka lip t ( 1 p as ti la /2 0  m l) ev ka lip t   (1  p as ti la /  20 m l) lim on a,  m ed  (1  p as ti la /2 0  m l) lim on a,  m ed  (1  p as ti la /2 0  m l) Ča s (m in ) lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ 0 9, 44 0, 71 9, 44 0, 71 9, 44 0, 71 9, 57 0, 63 9, 38 0, 67 9, 38 0, 67 9, 41 0, 67 1 7, 38 0, 46 7, 82 0, 67 6, 57 0, 67 8, 07 0, 65 8, 13 0, 70 8, 82 0, 65 / / 5 6, 69 0, 64 6, 26 0, 70 5, 63 0, 68 7, 07 0, 69 6, 25 0, 67 7, 32 0, 66 / / 15 6, 13 0, 72 5, 69 0, 60 4, 01 0, 56 7, 13 0, 65 4, 88 0, 56 6, 76 0, 69 9, 36 0, 62 Ci to to ks ič no st 3, 50 / 3, 50 / 3, 50 / 3, 50 / 3, 50 / 3, 50 / / / CP K  (0 ,0 33  m g/ m l) BK  in  C PK Pa st ile  z  B K  in  C PK , Pa st ile  s  p la ce bo m , Pa st ile  z  B K  in  C PK , Pa st ile  s  p la ce bo m , Ko nt ro la  z  v iru so m (0 ,0 33  in  0 ,0 99  m g/ m l) ev ka lip t ( 1 p as ti la /3 0  m l) ev ka lip t ( 1 p as ti la /  30  m l) lim on a,  m ed  (1  p as ti la /3 0  m l) lim on a,  m ed  (1  p as ti la /3 0  m l) Ča s m in ) lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ lo g 1 0( c) 95 -% IZ 0 9, 25 0, 51 9, 63 0, 65 9, 63 0, 65 9, 63 0, 65 9, 63 0, 65 9, 63 0, 65 9, 41 0, 67 1 8, 63 0, 44 8, 44 0, 68 8, 13 0, 59 8, 63 0, 63 8, 38 0, 68 8, 88 0, 63 / / 5 7, 38 0, 38 8, 00 0, 60 7, 38 0, 68 8, 32 0, 69 7, 63 0, 67 8, 44 0, 67 / / 15 6, 63 0, 46 6, 26 0, 68 6, 32 0, 50 7, 69 0, 68 6, 63 0, 57 7, 50 0, 48 9, 36 0, 62 Ci to to ks ič no st / / / / / / / / / / / / / / mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 127 RaZPRava Virucidno delovanje CPK proti virusu in- fluence so preučevale in potrdile že neka- tere predhodne raziskave (7). V nedavnem testiranju in vitro je bila dokazana virucid- na učinkovitost pastil s kombinacijo BK in CPK proti SARS-CoV-2. Koncentracija viru- sa v suspenziji z najvišjo koncentracijo se je že po eni minuti znižala za 4 log10(c) (6). Ta raziskava je, kot je bilo pričakovano, pokazala podobne trende virucidnosti pasti- le s kombinacijo BK in CPK na virus in- fluence A, saj sta bila v obeh testiranjih in vitro uporabljena virusa z ovojnico, na kate- ro naj bi neposredno učinkoval CPK (6, 7). Testiranje je potekalo po enakem pro- tokolu in pod enakimi pogoji, kot so bili uporabljeni pri testiranju z virusom SARS- -CoV-2. Pomembno razliko je predstavljal le tripsin v vzdrževalnem mediju, saj ga je bilo treba dodati zaradi zagotavljanja infek- tivnosti virusov influence. Zaradi izjemno nizke koncentracije tripsina v gojišču nje- govega vpliva na testne snovi nismo pre- verjali, saj je bila prvotna inkubacija virusa z učinkovino brez tega dodatka. Dodan je bil le mediju, v katerem smo pripravljali razred- čitve testne snovi z virusom pred nanosom na celične kulture. Največji virucidni učinek vseh testnih snovi se je po pričakovanjih pokazal pri suspenzijah z visoko koncentracijo, pri katerih smo dokazali, da se koncentracija infektivnih virusov že po petih minutah zniža za več kot 4 log10(c) (10.000-kratno oz. 99,99-% znižanje). Pastile s kombinacijo BK in CPK (z okusom po evkaliptu in z okusom po limoni in medu) so znižanje za 4 log10(c) dosegle že po eni minuti (sliki 1 in 3). Ob upoštevanju vseh kontrolnih postopkov rezultati nakazujejo veliko virucidno učin- kovitost testnih snovi z učinkovinami. Virucidni učinek pastil s placebom (z oku- som po evkaliptu in z okusom po limoni in 128 Andrej Steyer, Tina Mikuletič, Tjaša Cerar Kišek, Tina Triglav virucidna učinkovitost pastil… CPK placebo PE BK + CPK BK + CPK PLM BK + CPK PE placebo PLM 0 1 2 3 5 6 4 Čas stika (min) 1 5 15 ∆ lo g (c ) (T C ID /m l) 10 5 0 Slika 3. Primerjava znižanja količine infektivnih virusov pri najvišji koncentraciji (ekvivalent raztopine ene pastile v 4 ml suspenzije) v treh različnih časih stika. TCID50/ml – 50-% kužni odmerek za tkivno kulturo (angl. median tissue culture infectious dose), CPK – cetilpiridinijev klorid, BK – benzidaminijev klorid, PE – pastila, evkalipt, PLM – pastila, limona, med. mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 128 medu) značilno odstopa od učinka pastil s kombinacijo BK in CPK, kar je razvidno na sliki 1 in sliki 3 ter v tabeli 4. Pastili s kombinacijo BK in CPK sta dosegli ustre- zno znižanje koncentracije infektivnih viru- sov za 4 log10(c) tudi v suspenzijah s srednjo koncentracijo, ki se je ob upoštevanju vseh parametrov dinamike raztapljanja pastile in izločanju sline (približno 4,0 do 5,0 ml/min med stimulativnimi aktivnostmi, npr. pri lizanju pastile) najbolje približala domnev- ni koncentraciji, ki bi bila lahko dosežena ob dejanski uporabi pastile, če je za razto- pitev pastile potrebnih 5–10 minut (10). Tudi CPK ter kombinacija BK in CPK kot prostih učinkovin sta se približali meji zmanjšanja za 4 log10(c). Podobno kot pri predhodnem testiranju s SARS-CoV-2 in vitro tudi pri testiranju seva virusa influence testne snovi v nizki kon- centraciji niti po 15 minutah niso dosegle znižanja za 4 log10(c) (6). Jasen trend zmanjševanja količine viru- sa je bil opažen med celotnim 15-minutnim časa stika pri suspenzijah testnih snovi v vseh koncentracijah (razen pri pastilah s placebom). Tako pastile s kombinacijo BK in CPK kot BK in CPK kot prosti učinkovini so kaza- li jasno dinamiko virucidnega delovanja – najhitrejši učinki so se kazali pri najvišji koncentraciji, hitrost delovanja pa se je manjšala z nižanjem koncentracije. Krivulja padanja koncentracije virusov je bila s časom položnejša pri srednji, še bolj pa pri naj- nižji koncentraciji (slika 1 in slika 2). Ta dinamika ni bila opazna pri pastilah s pla- cebom (z obema okusoma), pri katerih je bil po 15 minutah konstantni učinek znižanja koncentracije infektivnih virusov med 1,94 in 2,82 log10(c). Kot so pri testiranjih z viru- som SARS-CoV-2 in vitro že ugotovili, je dejavnik inaktivacije virusov verjetno tudi nizka vrednost pH, ki je podobna kot pri pastilah s kombinacijo BK in CPK (6). Ena od pomembnejših lastnosti, ki bi jih moral imeti peroralni antiseptik, je obstoj- nost na mestu nanosa. Vemo, da je obstoj- nost CPK velika (od tri do pet ur), kar lahko omogoči večjo in daljšo učinkovitost proti virusu (1). Poleg tega lahko k učinkovito- sti prispeva tudi farmacevtska oblika. Med farmacevtske oblike za lokalno lajšanje vnetja žrela spadajo tekočine za izpiranje ust (grgranje), pršila in pastile. Pokazalo se je, da pride pri pastilah do večjega začetnega odlaganja učinkovine v ustih in žrelu ter do počasnejšega izpiranja iz ustne votline kot pri pršilih in tekočinah za izpiranje ust (grgranje). To nakazuje, da je učinek pastil lahko trajnejši (11). Rezultati testiranj temeljijo na nadzo- rovanih laboratorijskih pogojih, s katerimi smo se skušali približati fiziološkim pogo- jem v ustni votlini. Rezultatov testiranja in vitro zaradi šte- vilnih dejavnikov ni mogoče preslikati v in vivo pogoje tudi, če upoštevamo fizikalno- -kemijske pogoje, ki smo se jim skušali pri- bližati. Raziskava je dokazala le, da CPK, kombinacije BK in CPK kot prostih učin- kovin in kombinacije BK in CPK v pastili delujejo virucidno in bi podobno verjetno delovale tudi na sluznici ust in žrela. V vsa- kem primeru pa bi bil virucidni učinek omejen le na proste infektivne viruse na sluznici ali v slini, ki bi bili neposredno izpo- stavljeni učinkovini. Podatki iz literature nakazujejo, da je koncentracija virusnih delcev v slini v območju od 4 do 6 log10(c) virusnih genomskih kopij na mililiter (12). Pri testiranju smo uporabili bistveno višjo koncentracijo virusov (8–10 log10(c) infektivnih virusnih delcev na mililiter). Nadaljnje raziskave bi bile smiselne v okvi- ru kliničnih testiranj. Če bi rezultati kaza- li na podobno učinkovitost, bi lahko upo- raba pastil s kombinacijo BK in CPK močno vplivala na zmanjšanje verjetnosti kaplji- čnega prenosa. Z raziskavo in vitro smo potrdili viru- cidno delovanje CPK ter kombinacije BK in CPK v obliki proste (čiste) učinkovine in v obliki pastil na virus influence A. 129Med Razgl. 2022; 61 (1): mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 129 Najvišjo učinkovitost, ki se je pomem- bno razlikovala od učinkovitosti pastil s placebom, smo dokazali za pastile s kom- 130 Andrej Steyer, Tina Mikuletič, Tjaša Cerar Kišek, Tina Triglav virucidna učinkovitost pastil… binacijo BK in CPK; primerljiva je bila pri pastili z okusom po evkaliptu in pastili z okusom po limoni in medu. LITERaTURa 1. Mateos-Moreno MV, Mira A, Ausina-Márquez V, Ferrer MD. Oral antiseptics against coronavirus: In-vitro and clinical evidence. J Hosp Infect. 2021; 113: 30–43. 2. Ming-Hsu C, Po-Chun C. The effectiveness of mouthwash against SARS-CoV-2 infection: A review of scientific and clinical evidence. J Formos Med Assoc. 2021; S0929-6646(21)00469–1. 3. Seneviratne CJ, Balan P, Ko KKK, et al. Efficacy of commercial mouth-rinses on SARS-CoV-2 viral load in saliva: Randomized control trial in Singapore. Infection. 2021; 49: 305–11. 4. Morokutti-Kurz M, Graf C, Prieschl-Grassauer E. Amylmetacresol/2,4-dichlorobenzyl alcohol, hexylresorcinol, or carrageenan lozenges as active treatments for sore throat. Int J Gen Med. 2017; 10: 53–60. 5. Košir P. Primerjalna raziskava terapevtske enakovrednosti med testnim in referenčnim zdravilom fiksne kom- binacije 3 miligramov benzidaminijevega klorida in 1 miligrama cetilpiridinijevega klorida pri preiskovancih z vnetim žrelom, povezanim z okužbami zgornjih dihal. Med Razgl. 2015; 54 (3): 433–42. 6. Steyer A, Marušić M, Kolenc M, et al. A throat lozenge with fixed combination of cetylpyridinium chloride and benzydamine hydrochloride has direct virucidal effect on SARS-CoV-2. COVID. 2021; 1 (2): 435–46. 7. Popkin DL., Zilka S, Dimaano M, et al. Cetylpyridinium chloride (CPC) exhibits potent, rapid activity against influenza viruses in vitro and in vivo. Pathog Immun. 2017; 2 (2): 252–69. 8. SIST EN 14476:2013+A2:2019 [internet]. Ljubljana: Slovenski inštitut za standardizacijo; c2009 [citirano 2021 Dec 10]. Dosegljivo na: http://ecommerce.sist.si/catalog/project.aspx 9. Kärber G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. Arch. Exp. Path. Pharm. 1931; 162: 480–7. 10. Iorgulescu G. Saliva between normal and pathological. Important factors in determining systemic and oral health. J Med. Life. 2009; 2 (3): 303–7. 11. Farrer F. Sprays and lozenges for sore throats. S Afr Pharm J. 2011; 78 (4): 26–31. 12. Kw To K, Lu L, Cy Yip C, et al. Additional molecular testing of saliva specimens improves the detection of res- piratory viruses. Emerg Microbes Infect. 2017; 6 (6): e49. Prispelo 10. 2. 2022 mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 130