298 ■ Proteus 83/7 • Marec 2021 299Nobelova nagrada za kemijo 2020 • Nobelove nagrade za leto 2020Nobelove nagrade za leto 2020 • Nobelova nagrada za kemijo 2020 Emmanuelle Charpentier in Jennifer Doud- na sta prejeli Nobelovo nagrado za kemijo za leto 2020 za odkritje enega od najna- tančnejših orodij genske tehnologije: ge- netske škarje CRISPR/Cas9. Raziskovalci jih lahko uporabljajo za spreminjanje DNA živali, rastlin in mikroorganizmov z izjem- no visoko natančnostjo. Nova tehnologija prinaša revolucionarne spremembe moleku- larne znanosti o življenju, nove možnosti za vzrejo rastlin in živali, prispeva k ino- vativnim pristopom pri zdravljenju raka in morda bo tudi uresničila sanje o ozdravitvi dednih bolezni. Emannuelle Charpentier bo tudi vabljena plenarna predavateljica na 45. kongresu evropske biokemije (FEBS 2021), ki bo julija v organizaciji Slovenskega bioke- mijskega društva potekal v Ljubljani. Ko so raziskovalci primerjali genski mate- rial zelo različnih bakterij in arhej (vrste mikroorganizma), so našli ponavljajoča se zaporedja DNA, ki so med vrstami bakterij presenetljivo dobro ohranjena. Isti genetski zapis (zaporedje nukleotidov) se vedno zno- va pojavlja, med ponovitvami pa so prisotna edinstvena zaporedja, ki se med seboj razli- kujejo. Kot da bi se ena in ista beseda po- navljala med posameznimi (različnimi) stav- ki v knjigi. Ponavljajoča se zaporedja DNA so poimenovali CRISPR, kar je kratica za angleško besedno zvezo Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (grozd enakomerno ločenih ponovitev kratkih pa- lindromskih zaporedij nukleotidov). Poseb- nost teh zaporedij je, da so »palindromska«, kar pomeni, da se berejo enako, ne glede s katerega konca začnemo brati (‚perica-re- že-raci-rep‘), in to, da, kot rečeno, razdva- jajo neka posebna, drugačna in edinstvena zaporedja nukleotidov. Ugotovili so, da so ta različna zaporedja nekakšen spomin na predhodno okužbo bakterije z virusom, bakterije, ki je to okužbo preživela. Virus je namreč ob okužbi svojo škodljivo DNA vbrizgal v bakterijo, ta pa si je del virusne DNA vcepila v svoj odsek CRISPR, ne- kam med dve palindromski ponovitvi, kot spomin na okužbo, ki bo sedaj njo in njene potomke varoval pred novim napadom iste vrste virusa. Bakterije, ki preživijo virusno okužbo, si ustvarijo orodje obrambe pred novim napadom Bakterijin genomski odsek CRISPR je to- rej sestavljen iz samega niza CRISPR, v katerem so »spominski« delci (poimenovani »vmesniki«) virusov iz predhodnih okužb, poleg tega pa pred tem vsebuje še zapis (cas operon) za proteine Cas, v katerem je tudi zapis za poseben protein Cas9 kot tudi gen, ki je zapis za tako imenovano »transaktiva- cijsko crispr RNA« - tracrRNA. CRISPR/Cas9 – od bakterijske imunosti do preurejanja genoma Nobelova nagrada za kemijo za leto 2020 Radovan Komel Emmanuelle Charpentier Rodila se je leta 1968 v Juvisy-sur-Orgeu v Franciji. Doktorirala je leta 1995 na Inštitutu Louisa Pasteurja v Parizu v Franciji. Sedaj je direktorica enote Inštituta Maxa Plancka za znanstvene raziskave patogenih organizmov v Berlinu v Nemčiji. Jennifer A. Doudna Rodila se je leta 1964 v Washingtonu v ZDA. Doktorirala je leta 1989 na Harvardski medicinski šoli v Bostonu v ZDA. Sedaj je profesorica na Kalifornijski univerzi v Berkeleyju v ZDA in raziskovalka na Medicinskem inštitutu Howarda Hughesa v ZDA. Vir: https://www.statnews.com. Foto: Hallbauer & Fioretti/Vilnius University/UC Berkeley. Ob virusni okužbi in prihodu njegove DNA v bakterijsko celico tujek zaznajo bakterijski proteini razreda Cas in ga razrežejo na manjše delce. Če bakterija okužbo preživi, proteini Cas vgradijo kakšnega od teh delcev v genom bakterije, med dva palindromska segmenta CRISPR. Zato tak delec virusne DNA sedaj imenujemo »vmesnik«. Na sliki so označeni vmesniki V1, V2 in V3, ki so lahko delci istega virusa, lahko (vmesnika V1 in V2) pa izvirajo tudi iz predhodnih okužb z drugimi vrstami virusov. Prirejeno (R.K.) po: https://en.wikipedia.org/wiki/ CRISPR. Virusna DNA 1. Izrez dela virusne DNA Vmesnik V3CRISPR Bakterijski kromosom V2V1 298 ■ Proteus 83/7 • Marec 2021 299Nobelova nagrada za kemijo 2020 • Nobelove nagrade za leto 2020Nobelove nagrade za leto 2020 • Nobelova nagrada za kemijo 2020 Emmanuelle Charpentier in Jennifer Doud- na sta prejeli Nobelovo nagrado za kemijo za leto 2020 za odkritje enega od najna- tančnejših orodij genske tehnologije: ge- netske škarje CRISPR/Cas9. Raziskovalci jih lahko uporabljajo za spreminjanje DNA živali, rastlin in mikroorganizmov z izjem- no visoko natančnostjo. Nova tehnologija prinaša revolucionarne spremembe moleku- larne znanosti o življenju, nove možnosti za vzrejo rastlin in živali, prispeva k ino- vativnim pristopom pri zdravljenju raka in morda bo tudi uresničila sanje o ozdravitvi dednih bolezni. Emannuelle Charpentier bo tudi vabljena plenarna predavateljica na 45. kongresu evropske biokemije (FEBS 2021), ki bo julija v organizaciji Slovenskega bioke- mijskega društva potekal v Ljubljani. Ko so raziskovalci primerjali genski mate- rial zelo različnih bakterij in arhej (vrste mikroorganizma), so našli ponavljajoča se zaporedja DNA, ki so med vrstami bakterij presenetljivo dobro ohranjena. Isti genetski zapis (zaporedje nukleotidov) se vedno zno- va pojavlja, med ponovitvami pa so prisotna edinstvena zaporedja, ki se med seboj razli- kujejo. Kot da bi se ena in ista beseda po- navljala med posameznimi (različnimi) stav- ki v knjigi. Ponavljajoča se zaporedja DNA so poimenovali CRISPR, kar je kratica za angleško besedno zvezo Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (grozd enakomerno ločenih ponovitev kratkih pa- lindromskih zaporedij nukleotidov). Poseb- nost teh zaporedij je, da so »palindromska«, kar pomeni, da se berejo enako, ne glede s katerega konca začnemo brati (‚perica-re- že-raci-rep‘), in to, da, kot rečeno, razdva- jajo neka posebna, drugačna in edinstvena zaporedja nukleotidov. Ugotovili so, da so ta različna zaporedja nekakšen spomin na predhodno okužbo bakterije z virusom, bakterije, ki je to okužbo preživela. Virus je namreč ob okužbi svojo škodljivo DNA vbrizgal v bakterijo, ta pa si je del virusne DNA vcepila v svoj odsek CRISPR, ne- kam med dve palindromski ponovitvi, kot spomin na okužbo, ki bo sedaj njo in njene potomke varoval pred novim napadom iste vrste virusa. Bakterije, ki preživijo virusno okužbo, si ustvarijo orodje obrambe pred novim napadom Bakterijin genomski odsek CRISPR je to- rej sestavljen iz samega niza CRISPR, v katerem so »spominski« delci (poimenovani »vmesniki«) virusov iz predhodnih okužb, poleg tega pa pred tem vsebuje še zapis (cas operon) za proteine Cas, v katerem je tudi zapis za poseben protein Cas9 kot tudi gen, ki je zapis za tako imenovano »transaktiva- cijsko crispr RNA« - tracrRNA. CRISPR/Cas9 – od bakterijske imunosti do preurejanja genoma Nobelova nagrada za kemijo za leto 2020 Radovan Komel Emmanuelle Charpentier Rodila se je leta 1968 v Juvisy-sur-Orgeu v Franciji. Doktorirala je leta 1995 na Inštitutu Louisa Pasteurja v Parizu v Franciji. Sedaj je direktorica enote Inštituta Maxa Plancka za znanstvene raziskave patogenih organizmov v Berlinu v Nemčiji. Jennifer A. Doudna Rodila se je leta 1964 v Washingtonu v ZDA. Doktorirala je leta 1989 na Harvardski medicinski šoli v Bostonu v ZDA. Sedaj je profesorica na Kalifornijski univerzi v Berkeleyju v ZDA in raziskovalka na Medicinskem inštitutu Howarda Hughesa v ZDA. Vir: https://www.statnews.com. Foto: Hallbauer & Fioretti/Vilnius University/UC Berkeley. Ob virusni okužbi in prihodu njegove DNA v bakterijsko celico tujek zaznajo bakterijski proteini razreda Cas in ga razrežejo na manjše delce. Če bakterija okužbo preživi, proteini Cas vgradijo kakšnega od teh delcev v genom bakterije, med dva palindromska segmenta CRISPR. Zato tak delec virusne DNA sedaj imenujemo »vmesnik«. Na sliki so označeni vmesniki V1, V2 in V3, ki so lahko delci istega virusa, lahko (vmesnika V1 in V2) pa izvirajo tudi iz predhodnih okužb z drugimi vrstami virusov. Prirejeno (R.K.) po: https://en.wikipedia.org/wiki/ CRISPR. Virusna DNA 1. Izrez dela virusne DNA Vmesnik V3CRISPR Bakterijski kromosom V2V1 300 ■ Proteus 83/7 • Marec 2021 301Nobelova nagrada za kemijo 2020 • Nobelove nagrade za leto 2020Nobelove nagrade za leto 2020 • Nobelova nagrada za kemijo 2020 (1) Iz genomskega odseka CRISPR se v procesu transkripcije prepišejo tracrRNA, Cas9 RNA in CRISPR RNA. Del tracrRNA predstavlja zaporedje nukleotidov za prepoznavo palindromskega zaporedja v CRISPR RNA, Cas9 RNA pa se nadalje prevede v protein Cas9. (2) Sledi preureditev v nadzorni kompleks, tako imenovane genske škarje. V tem procesu se tracrRNA pari s ponavljajočim palindromskim zaporedjem CRISPR RNA, kar prepozna protein Cas9, da tvori trojni kompleks s tracrRNA in delom CRISPR RNA, ki obsega palindromsko ponovitev (CRISPR) in virusno zaporedje (vmesnik, V) tik ob njej. Nato se posamezni kompleksi sprostijo s cepitvijo z encimom RNAza III. (3) Posamezen kompleks za nadzor nove virusne okužbe (genske škarje) je tako sestavljen iz proteina Cas9 in dupleksa, ki ga sestavljata tracrRNA in virusni del (V) CRISPR RNA, sedaj poimenovan crRNA. crRNA predstavlja spominsko virusno zaporedje za primerjavo z novodošlo virusno DNA ob ponovni okužbi, z drugim delom pa, kot rečeno, tvori dupleks s tracrRNA. Prirejeno (R.K.) po: https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR. Odsek CRISPR v bakterijskem genomu niz CRISPRcas operon tracr tracrRNA tracrRNA RNAza IIICRISPR RNA tracrRNA crRNA Cas9 Cas9 Cas1 Cas2 Cas3 CRISPR CRISPR CRISPR RNA V1 V2 V3 CRISPR CRISPR GENSKE ŠKARJE Zgodba o odkritju sistema CRISPR/ Cas9 kot dejavnika imunosti in obrambe bakterij pred virusi Emmanuelle Charpentier, mlada raziskoval- ka francoskega porekla in nemirnega duha, je bila že od samega začetka svojega razisko- valnega življenja navdušena nad patogenimi bakterijami. Zakaj so tako agresivne? Kako razvijejo odpornost proti antibiotikom? Ali je mogoče najti nove načine zdravljenja, ki bi zaustavili njihov pohod? Vključno z do- ktorskim študijem na Inštitutu Louisa Pas- teurja v Parizu je živela v petih različnih državah, sedmih različnih mestih in delala v desetih različnih ustanovah. Leta 2002, ko je ustanovila svojo raziskovalno skupino na dunajski univerzi, se je osredotočila na eno od bakterij, ki človeštvu povzročajo naj- več škode: Streptococcus pyogenes. Vsako leto okuži milijone ljudi, ki sicer pogosto zbo- lijo za lahko ozdravljivimi boleznimi, kot sta angina (tonzilitis) in kožna krastavost (impetigo), lahko pa se okužba konča tudi z življenjsko nevarnim telesnim vnetnim odzivom (sepso) in razgradnjo mehkih tkiv. Da bi bolje razumela življenjski krog bakte- Na okužbo z virusom bakterijska celica odgovori tako, da spodbudi izražanje genov, ki so del njenega obrambnega sistema. Slika zaradi preglednosti poenostavlja dogajanje, saj na njej ni prikazana tracrRNA (glej predhodno sliko!), ki je sicer nujno potrebna za izgradnjo genskih škarij, ima pa tudi vlogo zaščite pred razgradnjo bakteriji lastne DNA. V primeru, da enim od genskih škarij odgovarja zaporedje virusne DNA, se ta na to DNA vežejo in jo razrežejo ter predajo nadaljnji razgradnji. Prirejeno (R.K.) po: https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR. Nova okužba z virusom 1. Transkripcija 2. Povezava s Cas9 3. Primerjava zaporedij DNA 4. Razrez virusne DNA V1 V2 V3 Cas9 300 ■ Proteus 83/7 • Marec 2021 301Nobelova nagrada za kemijo 2020 • Nobelove nagrade za leto 2020Nobelove nagrade za leto 2020 • Nobelova nagrada za kemijo 2020 (1) Iz genomskega odseka CRISPR se v procesu transkripcije prepišejo tracrRNA, Cas9 RNA in CRISPR RNA. Del tracrRNA predstavlja zaporedje nukleotidov za prepoznavo palindromskega zaporedja v CRISPR RNA, Cas9 RNA pa se nadalje prevede v protein Cas9. (2) Sledi preureditev v nadzorni kompleks, tako imenovane genske škarje. V tem procesu se tracrRNA pari s ponavljajočim palindromskim zaporedjem CRISPR RNA, kar prepozna protein Cas9, da tvori trojni kompleks s tracrRNA in delom CRISPR RNA, ki obsega palindromsko ponovitev (CRISPR) in virusno zaporedje (vmesnik, V) tik ob njej. Nato se posamezni kompleksi sprostijo s cepitvijo z encimom RNAza III. (3) Posamezen kompleks za nadzor nove virusne okužbe (genske škarje) je tako sestavljen iz proteina Cas9 in dupleksa, ki ga sestavljata tracrRNA in virusni del (V) CRISPR RNA, sedaj poimenovan crRNA. crRNA predstavlja spominsko virusno zaporedje za primerjavo z novodošlo virusno DNA ob ponovni okužbi, z drugim delom pa, kot rečeno, tvori dupleks s tracrRNA. Prirejeno (R.K.) po: https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR. Odsek CRISPR v bakterijskem genomu niz CRISPRcas operon tracr tracrRNA tracrRNA RNAza IIICRISPR RNA tracrRNA crRNA Cas9 Cas9 Cas1 Cas2 Cas3 CRISPR CRISPR CRISPR RNA V1 V2 V3 CRISPR CRISPR GENSKE ŠKARJE Zgodba o odkritju sistema CRISPR/ Cas9 kot dejavnika imunosti in obrambe bakterij pred virusi Emmanuelle Charpentier, mlada raziskoval- ka francoskega porekla in nemirnega duha, je bila že od samega začetka svojega razisko- valnega življenja navdušena nad patogenimi bakterijami. Zakaj so tako agresivne? Kako razvijejo odpornost proti antibiotikom? Ali je mogoče najti nove načine zdravljenja, ki bi zaustavili njihov pohod? Vključno z do- ktorskim študijem na Inštitutu Louisa Pas- teurja v Parizu je živela v petih različnih državah, sedmih različnih mestih in delala v desetih različnih ustanovah. Leta 2002, ko je ustanovila svojo raziskovalno skupino na dunajski univerzi, se je osredotočila na eno od bakterij, ki človeštvu povzročajo naj- več škode: Streptococcus pyogenes. Vsako leto okuži milijone ljudi, ki sicer pogosto zbo- lijo za lahko ozdravljivimi boleznimi, kot sta angina (tonzilitis) in kožna krastavost (impetigo), lahko pa se okužba konča tudi z življenjsko nevarnim telesnim vnetnim odzivom (sepso) in razgradnjo mehkih tkiv. Da bi bolje razumela življenjski krog bakte- Na okužbo z virusom bakterijska celica odgovori tako, da spodbudi izražanje genov, ki so del njenega obrambnega sistema. Slika zaradi preglednosti poenostavlja dogajanje, saj na njej ni prikazana tracrRNA (glej predhodno sliko!), ki je sicer nujno potrebna za izgradnjo genskih škarij, ima pa tudi vlogo zaščite pred razgradnjo bakteriji lastne DNA. V primeru, da enim od genskih škarij odgovarja zaporedje virusne DNA, se ta na to DNA vežejo in jo razrežejo ter predajo nadaljnji razgradnji. Prirejeno (R.K.) po: https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR. Nova okužba z virusom 1. Transkripcija 2. Povezava s Cas9 3. Primerjava zaporedij DNA 4. Razrez virusne DNA V1 V2 V3 Cas9 302 ■ Proteus 83/7 • Marec 2021 303Nobelova nagrada za kemijo 2020 • Nobelove nagrade za leto 2020Nobelove nagrade za leto 2020 • Nobelova nagrada za kemijo 2020 rije, se je posvetila temeljitemu preučevanju uravnavanja delovanja njenih genov. Medtem na drugem koncu sveta, na Kali- fornijski univerzi v Berkeleyju, biokemičarka Jennifer Doudna raziskuje majhne različice molekul RNA, ki igrajo pomembno vlogo pri uravnavanju aktivnosti genov v celicah. Njeno pozornost vzbudi odkritje kolegov, da med različnimi vrstami bakterij obsta- jajo zelo podobna ponavljajoča se zaporedja nukleotidov, poimenovana CRISPR, ki jih prekinjajo različna kratka zaporedja, ki se ujemajo z genetsko kodo različnih virusov. Je to posledica tega, da je bakterija, če je uspela preživeti virusno okužbo, dodala v svoj genom del genetskega zapisa virusa kot spomin na okužbo? In če se edinstve- na neponavljajoča se zaporedja v genetskem grozdu CRISPR ujemajo z nukleotidnim zaporedjem različnih virusov, ali to pomeni, da je to del starodavnega imunskega siste- ma, ki varuje bakterije in arheje pred virusi? Jennifer Doudna je takrat ravno preučeva- la biološki proces, v katerem vrsta majhnih molekul RNA z ustvarjanjem dvoverižnih parov z molekulami RNA, ki prenašajo ge- netsko informacijo za sestavo celičnih pro- teinov, sodeluje pri utišanju izražanja genov (interferenca RNA). Ali bakterije uporabl- jajo podoben mehanizem za nevtralizacijo virusov? Dodatno spodbudo za iskanje od- govora na to vprašanje je dalo tudi odkritje genov cas tesno ob grozdu CRISPR, ki so zelo podobni genom že poznanih proteinov, katerih vloga je odvijanje in razrez molekul DNA. Pomeni bližina grozda CRISPR s spominom na preteklo okužbo in genov cas prisotnost zapletene obrambe bakterij pred okužbami z virusi? Emmanuelle Charpentier, ki je v tem času svoje raziskave uravnavanja delovanja bak- terijskih genov z dunajske univerze prene- sla na Univerzo Umeå na severu Švedske, je prav tako pri svojem delu naletela na mole- kule majhnih RNA kot dejavnikov izražanja genov. Med iskanjem genov, ki so v bakteriji S. pyogenes zapis za omenjene male molekule RNA, je opazila vrsto enih, katerih nukle- otidni zapis se zelo prilega nukleotidnemu zaporedju CRISPR, ki je del genoma te iste bakterije. Podrobna preiskava je razkrila, da se del te majhne molekule RNA popol- noma prilega delom grozda CRISPR, ki so enovite tandemske ponovitve zaporedja nukleotidov. Takrat je sicer že bilo poznano, da je bakterijski sistem CRISPR s sodelo- vanjem proteina Cas9 udeležen pri razgrad- nji virusnih DNA, vendar je Emmanuelle Charpentier razkrila, da pri tem odločilno vlogo igra omenjena mala RNA, ki so jo poimenovali »transaktivirajoča crispr RNA« – tracrRNA. Predpostavi, da je tracrRNA potrebna, da se dolgi prepis genomskega nukleotidnega zaporedja CRISPR pretvori v nekaj, kar delu tega zaporedju podeli aktiv- no vlogo v življenju bakterijske celice. Objava tega odkritja je prinesla povabilo na mednarodno konferenco biokemikov v Por- toriku in v kongresni kavarni je drugi dan konference prišlo do naključnega srečanja med Emmanuelle Charpentier in Jennifer Doudna. Takoj sta se ujeli in naslednji dan med sprehodom po starem delu mesta sk- lenili tesno osebno in raziskovalno prijatelj- stvo. Vzpostavita sodelovanje med laborato- rijema, med katerim preko digitalnih srečanj poteka intenzivna izmenjava podatkov in mnenj. Sodelavci Jennifer Doudne sumijo, da je CRISPR RNA potrebna za identifi- kacijo DNA virusov in da so protein Cas9 škarje, ki razrežejo molekulo virusne DNA. Vendar se, ko v laboratorijskih poskusih vi- rusni DNA dodajo CRISPR RNA in prote- in Cas9, ne zgodi nič, DNA ostane nerazre- zana. Na drugi strani v laboratoriju Emma- nuelle Charpentier za prepoznavanje novo- došlih virusov izpostavijo ključno vlogo mo- lekule tracerRNA, ki se poveže s prepisom virusne DNA, to je s CRISPR RNA, ta pa se nato razcepi na manjše delce s pomembno vlogo pri še neraziskani razgradnji virusnih DNA. Ko pa spoznanja obeh laboratorijev združijo in v poskusu k virusni DNA poleg CRISPR RNA in proteina Cas9 dodajo še tracerRNA, poskus uspe, molekula DNA se razcepi na dva dela. Emmanuelle Charpen- tier in Jennifer Doudna sta odkrili mehani- zem zaščite streptokokov pred virusi: vlogo spominske imunosti, shranjene v genetskem grozdu CRISPR, pomembne za prepoznavo nove virusne okužbe, to je molekule RNA (CRISPR RNA), ki je »odtis« pretekle vi- rusne DNA, ob sočasnem delovanju ostalih delov sistema CRISPR (tracrRNA in Cas9), potrebnih za onemogočanje novodošlega vi- rusa - z razgradnjo njegove DNA. Raziskovalci se odločijo, da bodo poskušali poenostaviti genske škarje Z novim znanjem o vlogi molekul tracr- RNA in CRISPR RNA so obe umetno združili v eno molekulo, ki so jo poime- novali »vodilna RNA«. S to poenostavl- jeno različico genskih škarij so nato izvedli epohalni eksperiment: novo gensko orodje so uporabili tako, da so razrezali poljubno DNA na mestu, ki so ga pred tem sami do- ločili. V laboratoriju Jennifer Doudna so v poskusu uporabili enega od genov s pozna- no vlogo v organizmu in v njem izbrali pet različnih mest, kjer naj bi gen razcepili. Na- to so spremenili del genskih škarij CRIS- PR, tako da so se njihova nukleotidna za- poredja ujemala z zaporedji na tarčni DNA, tam, kjer naj bi razrezi bili opravljeni. Re- zultat poskusa je bil presenetljivo natančen: molekula DNA je bila razcepljena na točno določenih mestih. Vodilna RNA GENOM DNA PREDLOŽKA ZA POPRAVEK VSTAVLJENA DNA ODPRAVA GENSKE OKVARE Cas9 Celici lahko dopustimo, da sama popravi rez v DNA. V večini primerov to povzroči izklop funkcije gena. Če želimo vstaviti, popraviti ali preurediti gen, lahko za ta namen posebej oblikujemo majhno predložko DNA. Celica jo bo uporabila, ko bo popravila zarezo v genomu, posledično se bo na tem mestu nukleotidni zapis v genomu spremenil. Prirejeno (R.K.) po: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2020/popular-information. Genske škarje CRISPR/Cas9 Ko želimo preurejati genom z uporabo genskih škarij, si umetno izdelamo »vodilno RNA«, ki se bo ujemala z zaporedjem nukleotidov DNA, kjer naj bi naredili rez. Razrezovalni protein Cas9 tvori kompleks z vodilno RNA, ki genske škarje odpelje do mesta v genomu, kjer bo izveden rez. 302 ■ Proteus 83/7 • Marec 2021 303Nobelova nagrada za kemijo 2020 • Nobelove nagrade za leto 2020Nobelove nagrade za leto 2020 • Nobelova nagrada za kemijo 2020 rije, se je posvetila temeljitemu preučevanju uravnavanja delovanja njenih genov. Medtem na drugem koncu sveta, na Kali- fornijski univerzi v Berkeleyju, biokemičarka Jennifer Doudna raziskuje majhne različice molekul RNA, ki igrajo pomembno vlogo pri uravnavanju aktivnosti genov v celicah. Njeno pozornost vzbudi odkritje kolegov, da med različnimi vrstami bakterij obsta- jajo zelo podobna ponavljajoča se zaporedja nukleotidov, poimenovana CRISPR, ki jih prekinjajo različna kratka zaporedja, ki se ujemajo z genetsko kodo različnih virusov. Je to posledica tega, da je bakterija, če je uspela preživeti virusno okužbo, dodala v svoj genom del genetskega zapisa virusa kot spomin na okužbo? In če se edinstve- na neponavljajoča se zaporedja v genetskem grozdu CRISPR ujemajo z nukleotidnim zaporedjem različnih virusov, ali to pomeni, da je to del starodavnega imunskega siste- ma, ki varuje bakterije in arheje pred virusi? Jennifer Doudna je takrat ravno preučeva- la biološki proces, v katerem vrsta majhnih molekul RNA z ustvarjanjem dvoverižnih parov z molekulami RNA, ki prenašajo ge- netsko informacijo za sestavo celičnih pro- teinov, sodeluje pri utišanju izražanja genov (interferenca RNA). Ali bakterije uporabl- jajo podoben mehanizem za nevtralizacijo virusov? Dodatno spodbudo za iskanje od- govora na to vprašanje je dalo tudi odkritje genov cas tesno ob grozdu CRISPR, ki so zelo podobni genom že poznanih proteinov, katerih vloga je odvijanje in razrez molekul DNA. Pomeni bližina grozda CRISPR s spominom na preteklo okužbo in genov cas prisotnost zapletene obrambe bakterij pred okužbami z virusi? Emmanuelle Charpentier, ki je v tem času svoje raziskave uravnavanja delovanja bak- terijskih genov z dunajske univerze prene- sla na Univerzo Umeå na severu Švedske, je prav tako pri svojem delu naletela na mole- kule majhnih RNA kot dejavnikov izražanja genov. Med iskanjem genov, ki so v bakteriji S. pyogenes zapis za omenjene male molekule RNA, je opazila vrsto enih, katerih nukle- otidni zapis se zelo prilega nukleotidnemu zaporedju CRISPR, ki je del genoma te iste bakterije. Podrobna preiskava je razkrila, da se del te majhne molekule RNA popol- noma prilega delom grozda CRISPR, ki so enovite tandemske ponovitve zaporedja nukleotidov. Takrat je sicer že bilo poznano, da je bakterijski sistem CRISPR s sodelo- vanjem proteina Cas9 udeležen pri razgrad- nji virusnih DNA, vendar je Emmanuelle Charpentier razkrila, da pri tem odločilno vlogo igra omenjena mala RNA, ki so jo poimenovali »transaktivirajoča crispr RNA« – tracrRNA. Predpostavi, da je tracrRNA potrebna, da se dolgi prepis genomskega nukleotidnega zaporedja CRISPR pretvori v nekaj, kar delu tega zaporedju podeli aktiv- no vlogo v življenju bakterijske celice. Objava tega odkritja je prinesla povabilo na mednarodno konferenco biokemikov v Por- toriku in v kongresni kavarni je drugi dan konference prišlo do naključnega srečanja med Emmanuelle Charpentier in Jennifer Doudna. Takoj sta se ujeli in naslednji dan med sprehodom po starem delu mesta sk- lenili tesno osebno in raziskovalno prijatelj- stvo. Vzpostavita sodelovanje med laborato- rijema, med katerim preko digitalnih srečanj poteka intenzivna izmenjava podatkov in mnenj. Sodelavci Jennifer Doudne sumijo, da je CRISPR RNA potrebna za identifi- kacijo DNA virusov in da so protein Cas9 škarje, ki razrežejo molekulo virusne DNA. Vendar se, ko v laboratorijskih poskusih vi- rusni DNA dodajo CRISPR RNA in prote- in Cas9, ne zgodi nič, DNA ostane nerazre- zana. Na drugi strani v laboratoriju Emma- nuelle Charpentier za prepoznavanje novo- došlih virusov izpostavijo ključno vlogo mo- lekule tracerRNA, ki se poveže s prepisom virusne DNA, to je s CRISPR RNA, ta pa se nato razcepi na manjše delce s pomembno vlogo pri še neraziskani razgradnji virusnih DNA. Ko pa spoznanja obeh laboratorijev združijo in v poskusu k virusni DNA poleg CRISPR RNA in proteina Cas9 dodajo še tracerRNA, poskus uspe, molekula DNA se razcepi na dva dela. Emmanuelle Charpen- tier in Jennifer Doudna sta odkrili mehani- zem zaščite streptokokov pred virusi: vlogo spominske imunosti, shranjene v genetskem grozdu CRISPR, pomembne za prepoznavo nove virusne okužbe, to je molekule RNA (CRISPR RNA), ki je »odtis« pretekle vi- rusne DNA, ob sočasnem delovanju ostalih delov sistema CRISPR (tracrRNA in Cas9), potrebnih za onemogočanje novodošlega vi- rusa - z razgradnjo njegove DNA. Raziskovalci se odločijo, da bodo poskušali poenostaviti genske škarje Z novim znanjem o vlogi molekul tracr- RNA in CRISPR RNA so obe umetno združili v eno molekulo, ki so jo poime- novali »vodilna RNA«. S to poenostavl- jeno različico genskih škarij so nato izvedli epohalni eksperiment: novo gensko orodje so uporabili tako, da so razrezali poljubno DNA na mestu, ki so ga pred tem sami do- ločili. V laboratoriju Jennifer Doudna so v poskusu uporabili enega od genov s pozna- no vlogo v organizmu in v njem izbrali pet različnih mest, kjer naj bi gen razcepili. Na- to so spremenili del genskih škarij CRIS- PR, tako da so se njihova nukleotidna za- poredja ujemala z zaporedji na tarčni DNA, tam, kjer naj bi razrezi bili opravljeni. Re- zultat poskusa je bil presenetljivo natančen: molekula DNA je bila razcepljena na točno določenih mestih. Vodilna RNA GENOM DNA PREDLOŽKA ZA POPRAVEK VSTAVLJENA DNA ODPRAVA GENSKE OKVARE Cas9 Celici lahko dopustimo, da sama popravi rez v DNA. V večini primerov to povzroči izklop funkcije gena. Če želimo vstaviti, popraviti ali preurediti gen, lahko za ta namen posebej oblikujemo majhno predložko DNA. Celica jo bo uporabila, ko bo popravila zarezo v genomu, posledično se bo na tem mestu nukleotidni zapis v genomu spremenil. Prirejeno (R.K.) po: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2020/popular-information. Genske škarje CRISPR/Cas9 Ko želimo preurejati genom z uporabo genskih škarij, si umetno izdelamo »vodilno RNA«, ki se bo ujemala z zaporedjem nukleotidov DNA, kjer naj bi naredili rez. Razrezovalni protein Cas9 tvori kompleks z vodilno RNA, ki genske škarje odpelje do mesta v genomu, kjer bo izveden rez. 304 ■ Proteus 83/7 • Marec 2021 305Nobelove nagrade za leto 2020 • Nobelova nagrada za kemijo 2020 Nobelova nagrada za kemijo 2020 • Nobelove nagrade za leto 2020 Scopolijev vrt v Idriji • Botanični vrtovi Kmalu po objavi genskih škarij, leta 2012, je več raziskovalnih skupin dokazalo, da je to orodje mogoče uporabiti za spreminjan- je genoma tudi v celicah miši in ljudi. Pred tem je bilo spreminjanje genov višjih orga- nizmov dolgotrajno in včasih tudi nemogoče dejanje. Z uporabo genskih škarij z umetno izdelano vodilno RNA, ki se ujema s kodo DNA, kjer naj bo rez narejen, lahko razis- kovalci načeloma režejo kateri koli genom, ki ga želijo. Celici lahko dovolijo, da sama popravi zareze v DNA, kar večinoma po- vzroči izklop funkcije gena. V primeru, da želimo vstaviti, popraviti ali preurediti gen, pa lahko za to posebej oblikujemo majhno matrično DNA, ki jo bo celica uporabila pri popravku reza v genomu in na tem mestu vstavila željeno zaporedje nukleotidov. Ker je to gensko orodje tako enostavno za uporabo, je zdaj razširjeno v temeljnih ra- ziskavah. Uporabljajo ga za spreminjanje DNA celic in laboratorijskih živali, da bi razumeli, kako različni geni delujejo in se med seboj sporazumevajo, na primer med boleznijo. Genetske škarje so postale tudi standardno orodje v vzreji rastlin. Med dru- gim so preuredili gene, zaradi katerih obi- čajni riž sicer absorbira težke kovine iz tal, kar je pripeljalo do izboljšanih sort riža z nižjo vsebnostjo kadmija in arzena. Razvili so tudi pridelke, ki bolje prenašajo sušo v toplejšem podnebju in se upirajo žuželkam in škodljivcem, s katerimi bi se sicer morali spoprijeti s pesticidi. Metodologija CRISPR/Cas9 prinaša novo upanje na ozdravitev genetskih bolezni Genetske motnje so zdravstvene težave, ki jo povzroča ena ali več nepravilnosti v ge- nomu. Lahko jih povzroči mutacija enega samega gena (monogenske bolezni) ali več genov (večgenske bolezni), lahko pa so tu- di posledica nepravilnosti v širšem območju kromosoma. Mutacija, ki je vzrok mono- genske bolezni, se lahko pojavi spontano pred embrionalnim razvojem (mutacija de novo) ali pa se kot dedna bolezen podeduje od staršev, ki sta nosilca okvarjenega gena (avtosomno recesivno dedovanje), oziroma od enega od staršev z motnjo (avtosomno dominantno dedovanje). Znanih je več kot šest tisoč različnih genetskih motenj in za večino velja, da so z ustaljenimi medicin- skimi postopki neozdravljive. Od dednih bolezni, ki jim lahko rečemo tudi prirojene bolezni, saj so prisotne že ob rojstvu, pa se razlikujejo tako imenovane pridobljene bo- lezni, ki se začnejo kasneje v nekem obdob- ju življenja. Večina rakov, čeprav gre za gen- ske mutacije majhnega deleža celic v telesu, je pridobljenih bolezni. Genske škarje so novo upanje za zdravljenje dednih in prirojenih genetskih bolezni. Ra- ziskovalci že izvajajo klinične raziskave, da bi ugotovili, ali bi metodo CRISPR/Cas9 lahko uporabili za zdravljenje bolezni krvi, kot sta srpastocelična anemija in beta talase- mija, pa tudi za zdravljenje dednih očesnih bolezni. V razvoju so metode za popravilo genov v velikih organih, kot so možgani in mišice. Poskusi na živalih so pokaza- li, da lahko s posebno zasnovanimi virusi genske škarje ciljano dostavimo do želenih celic. Na ta način bi lahko zdravili uničujo- če dedne bolezni, kot so mišična distrofija, mišična atrofija hrbtenice in Huntingtonova bolezen. Prav tako so v razvoju tudi novi pristopi v imunoterapiji raka. Vseeno pa je potrebno, v izogib možnim stranskim učin- kom (naključni razrez DNA na nepravem mestu), natančnost tehnologije še izboljšati, preden jo bo mogoče preizkusiti in na širo- ko uporabiti pri ljudeh. Izredna moč genskih škarij zahteva tudi ustrezno pravno ureditev. Možne bi na- mreč bile zlorabe tehnologije za ustvarjan- je gensko spremenjenih zarodkov, čeprav že vrsto let obstajajo zakoni in predpisi, ki nadzorujejo uporabo genskega inženirstva in ki vključujejo prepovedi spreminjanja človeškega genoma na način, ki omogoča prenos uvedenih sprememb na potomce. Za poskuse, ki vključujejo ljudi in živali, mora- jo etični odbori pred njihovo izvedbo vedno dati ustrezno soglasje. Vseeno pa zaradi na- tančnosti in razmeroma enostavne uporabe nova tehnologija preurejanja genoma prinaša tudi tveganja nepooblaščene in zlonamerne uporabe. Gotovo pa je eno: te genetske škarje vpli- vajo na vse nas. Soočili se bomo z novimi etičnimi vprašanji, vendar bo novo orodje vsekakor lahko prispevalo k reševanju šte- vilnih izzivov, s katerimi se sooča človeštvo. Emmanuelle Charpentier in Jennifer Do- udna sta s svojimi odkritji razvili orodje, ki je znanosti o življenju popeljalo v novo obdobje. Viri: Ann Ferholm, The Royal Swedish Academy of Sciences: The Nobel Prize in Chemistry 2020 – Popular Science Background; https://www.nobelprize.org/ uploads/2020/10/popular-chemistryprize2020.pdf. Claes Gustafsson, The Royal Swedish Academy of Sciences: Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry – A Tool for Genome Editing; https:// www.nobelprize.org/uploads/2020/10/advanced- chemistryprize2020.pdf. CRISPR (Wikipedia): https://en.wikipedia.org/wiki/ CRISPR. Genetic Disorder (Wikipedia): https://en.wikipedia.org/ wiki/Genetic_disorder. Scopolijev vrt v Idriji Tinka Gantar, Ivica Kavčič, Anka Rudolf, Nada Praprotnik, Igor Dakskobler Scopolijev vrt v zgodnji pomladi: kronica ali pomladanski veliki zvonček (Leucojum vernum), navadni mali zvonček (Galanthus nivalis) in pomladanski žafran (Crocus vernus subsp. vernus). Foto Tinka Gantar. 304 ■ Proteus 83/7 • Marec 2021 305Nobelove nagrade za leto 2020 • Nobelova nagrada za kemijo 2020 Nobelova nagrada za kemijo 2020 • Nobelove nagrade za leto 2020 Scopolijev vrt v Idriji • Botanični vrtovi Kmalu po objavi genskih škarij, leta 2012, je več raziskovalnih skupin dokazalo, da je to orodje mogoče uporabiti za spreminjan- je genoma tudi v celicah miši in ljudi. Pred tem je bilo spreminjanje genov višjih orga- nizmov dolgotrajno in včasih tudi nemogoče dejanje. Z uporabo genskih škarij z umetno izdelano vodilno RNA, ki se ujema s kodo DNA, kjer naj bo rez narejen, lahko razis- kovalci načeloma režejo kateri koli genom, ki ga želijo. Celici lahko dovolijo, da sama popravi zareze v DNA, kar večinoma po- vzroči izklop funkcije gena. V primeru, da želimo vstaviti, popraviti ali preurediti gen, pa lahko za to posebej oblikujemo majhno matrično DNA, ki jo bo celica uporabila pri popravku reza v genomu in na tem mestu vstavila željeno zaporedje nukleotidov. Ker je to gensko orodje tako enostavno za uporabo, je zdaj razširjeno v temeljnih ra- ziskavah. Uporabljajo ga za spreminjanje DNA celic in laboratorijskih živali, da bi razumeli, kako različni geni delujejo in se med seboj sporazumevajo, na primer med boleznijo. Genetske škarje so postale tudi standardno orodje v vzreji rastlin. Med dru- gim so preuredili gene, zaradi katerih obi- čajni riž sicer absorbira težke kovine iz tal, kar je pripeljalo do izboljšanih sort riža z nižjo vsebnostjo kadmija in arzena. Razvili so tudi pridelke, ki bolje prenašajo sušo v toplejšem podnebju in se upirajo žuželkam in škodljivcem, s katerimi bi se sicer morali spoprijeti s pesticidi. Metodologija CRISPR/Cas9 prinaša novo upanje na ozdravitev genetskih bolezni Genetske motnje so zdravstvene težave, ki jo povzroča ena ali več nepravilnosti v ge- nomu. Lahko jih povzroči mutacija enega samega gena (monogenske bolezni) ali več genov (večgenske bolezni), lahko pa so tu- di posledica nepravilnosti v širšem območju kromosoma. Mutacija, ki je vzrok mono- genske bolezni, se lahko pojavi spontano pred embrionalnim razvojem (mutacija de novo) ali pa se kot dedna bolezen podeduje od staršev, ki sta nosilca okvarjenega gena (avtosomno recesivno dedovanje), oziroma od enega od staršev z motnjo (avtosomno dominantno dedovanje). Znanih je več kot šest tisoč različnih genetskih motenj in za večino velja, da so z ustaljenimi medicin- skimi postopki neozdravljive. Od dednih bolezni, ki jim lahko rečemo tudi prirojene bolezni, saj so prisotne že ob rojstvu, pa se razlikujejo tako imenovane pridobljene bo- lezni, ki se začnejo kasneje v nekem obdob- ju življenja. Večina rakov, čeprav gre za gen- ske mutacije majhnega deleža celic v telesu, je pridobljenih bolezni. Genske škarje so novo upanje za zdravljenje dednih in prirojenih genetskih bolezni. Ra- ziskovalci že izvajajo klinične raziskave, da bi ugotovili, ali bi metodo CRISPR/Cas9 lahko uporabili za zdravljenje bolezni krvi, kot sta srpastocelična anemija in beta talase- mija, pa tudi za zdravljenje dednih očesnih bolezni. V razvoju so metode za popravilo genov v velikih organih, kot so možgani in mišice. Poskusi na živalih so pokaza- li, da lahko s posebno zasnovanimi virusi genske škarje ciljano dostavimo do želenih celic. Na ta način bi lahko zdravili uničujo- če dedne bolezni, kot so mišična distrofija, mišična atrofija hrbtenice in Huntingtonova bolezen. Prav tako so v razvoju tudi novi pristopi v imunoterapiji raka. Vseeno pa je potrebno, v izogib možnim stranskim učin- kom (naključni razrez DNA na nepravem mestu), natančnost tehnologije še izboljšati, preden jo bo mogoče preizkusiti in na širo- ko uporabiti pri ljudeh. Izredna moč genskih škarij zahteva tudi ustrezno pravno ureditev. Možne bi na- mreč bile zlorabe tehnologije za ustvarjan- je gensko spremenjenih zarodkov, čeprav že vrsto let obstajajo zakoni in predpisi, ki nadzorujejo uporabo genskega inženirstva in ki vključujejo prepovedi spreminjanja človeškega genoma na način, ki omogoča prenos uvedenih sprememb na potomce. Za poskuse, ki vključujejo ljudi in živali, mora- jo etični odbori pred njihovo izvedbo vedno dati ustrezno soglasje. Vseeno pa zaradi na- tančnosti in razmeroma enostavne uporabe nova tehnologija preurejanja genoma prinaša tudi tveganja nepooblaščene in zlonamerne uporabe. Gotovo pa je eno: te genetske škarje vpli- vajo na vse nas. Soočili se bomo z novimi etičnimi vprašanji, vendar bo novo orodje vsekakor lahko prispevalo k reševanju šte- vilnih izzivov, s katerimi se sooča človeštvo. Emmanuelle Charpentier in Jennifer Do- udna sta s svojimi odkritji razvili orodje, ki je znanosti o življenju popeljalo v novo obdobje. Viri: Ann Ferholm, The Royal Swedish Academy of Sciences: The Nobel Prize in Chemistry 2020 – Popular Science Background; https://www.nobelprize.org/ uploads/2020/10/popular-chemistryprize2020.pdf. Claes Gustafsson, The Royal Swedish Academy of Sciences: Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry – A Tool for Genome Editing; https:// www.nobelprize.org/uploads/2020/10/advanced- chemistryprize2020.pdf. CRISPR (Wikipedia): https://en.wikipedia.org/wiki/ CRISPR. Genetic Disorder (Wikipedia): https://en.wikipedia.org/ wiki/Genetic_disorder. Scopolijev vrt v Idriji Tinka Gantar, Ivica Kavčič, Anka Rudolf, Nada Praprotnik, Igor Dakskobler Scopolijev vrt v zgodnji pomladi: kronica ali pomladanski veliki zvonček (Leucojum vernum), navadni mali zvonček (Galanthus nivalis) in pomladanski žafran (Crocus vernus subsp. vernus). Foto Tinka Gantar.