DOKAZOVANJE MUTACIJ V BRCA 1 GENU Z ANALIZO TA LIT V ENE KRIVULJE PCR PRODUKTOV
Srdjan Novakovič, Vida Stegel, Mateja Kraje, Janez Žgajnar, Nikola Bešic, Marko Hočevar, Cvetka Bilban Jakopin, Katarina Lokar
Onkološki inštitut Ljubljana
Povzetek
Rak dojke je z nekaj več kot 1000 novimi bolnicami na leto na prvem mestu po številu obolelih žensk za rakastimi boleznimi v Sloveniji. Številka vključuje sporadične in dedne oblike raka dojk. Dedne oblike raka dojke so najpogosteje povezane z mutacijami v BRCA1 in BRCA2 genih. Zato se številni strokovnjaki s tega področja zavzemajo za genetsko testiranje bolnikov, pri katerih obstaja sum na dedno obliko bolezni. Testiranje bolnic/kov in njihovih sorodnikov je dokaj težavno zaradi zahtevnosti metod genetskega testiranja, stroškov testiranja in nezadostnega poznavanja in predvidevanja vseh možnih vplivov dokazane mutacije pri nastanku raka dojke. V tem delu predstavljamo osnovne metodološke podatke za odkrivanje petih različnih mutacij v BRCA1 genu pri bolnicah/kih s karcinomom dojke in njihovih sorodnikih. Mutacije 1806C>T, 300T>G, 300T>A, 310G>A, 5382insC določamo s pomočjo polime-razne verižne reakcije (PCR) v realnem času in analizo talitvene krivulje. Primerjava z direktnim sekveniranjem je pokazala, da je uporabljena metoda dovolj občutljiva in hitra za dnevno rutinsko določanje mutacij v DNA izolirani iz periferne krvi.
Uvod
Pet do 10% vseh primerov raka dojk so dedna oblika te bolezni. Od vseh dednih rakov dojk so le-ti posledica mutacij v genu BRCA1 v približno 20% do 40% in v genu BRCA2 v 10% do 35%. Incidenca raka dojk je pri nosilkah/cih mutacij v genu BRCA1 okrog 50%. Poleg tega imajo nosilci teh mutacij povečano tveganje za nastanek raka jajčnikov, širokega črevesa in prostate. V primeru, da poznamo vrsto in mesto mutacije, jih lahko relativno enostavno in hitro dokažemo. Ena skupina metod za hitro določanje mutacij temelji na pomnoževanju tistih delov gena, kjer mutacijo pričakujemo, ter vezavi specifičnih sond na pomnoženo DNA. Iz nastalih razlik v talitveni krivulji pri nemuti-ranih in mutiranih genih potrdimo prisotnost mutacij. Vtem prispevku prikazu-
59
jemo določanje znanih mutacij v genu BRCA1 - 1806C>i, 300l>G, 300T>A, 310G>A, 5382insC z uporabo PCR v realnem času.
Materiali in metode
Genomsko DNA smo izolirali iz periferne krvi preiskovancev s pomočjo »DNA blood isolation kit« (Quiagen, Hilden, Germany). Primerje in sonde smo zasnovali in oblikovali v našem laboratoriju, sintetizirala pa jih jo firma TIB Molbiol (Berlin, Germany).
PCR v realnem času in analizo talitvene krivulje smo opravili na Light Cycler-ju (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) po navodilih proizvajalca (Light Cycler Fast Start master hybridization probes, Roche Molecular Biochemicals). Če na kratko povzamem - DNA smo pomnožili s pomočjo PCR z našimi primerji. K mešanici smo dodali še specifične hibridizacijske sonde, ki so nosile fluorescentna barvila. Po končani PCR smo opravili talitveno analizo produktov, na katerih so bile vezane sonde, ter ugotovili prisotnost mutacij.
Rezultati in diskusija
Različne vrste raka so povezane z mutacijami v genih BRCA1 in BRCA2. Med najpogostejšimi so rak dojk, jajčnikov, trebušne slinavke, prostate, jajcevodov, rak grla, ter levkemije in limfomi pri odraslih. Kljub številnim vrstam rakov, ki nastanejo kot posledica mutacij v omenjenih genih, so nosilke/ci teh mutacij predvsem rizične/i za nastanek raka dojk in/ali jajčnikov. Mutacije v genih BRCA1 in BRCA2 povečajo verjetnost nastanka raka dojk glede na normalno populacijo tudi za 10x. Tveganje za nastanek raka jajčnikov je pri nosilkah mutacij v genu BRCA1 glede na normalno populacijo 5-7x večje, medtem ko je pri nosilkah mutacij v genu BRCA2 nekoliko manjše in je 2-3x večje kot pri normalni populaciji.
Upoštevajoč, da je slovenska populacija dokaj etnično omejena in da je rak dojk na prvem mestu od vseh rakastih bolezni pri ženskah v Sloveniji, smo leta
Tabela 1. Mutacije pri slovenskih bolnikih, ki smo jih določali z metodo PCR v realnem času ter z analizo talitvene krivulje produktov.
Vrsta mutacije	Število preiskovancev	Število določenih mutacij	St. LC pozitivnih/št. s sekv. reak. potrjenih *
1806C>T	177	12	12/12
300 T>G	31	4	4/4
300T>A	5	0	0/2
310G>A	2	1	1/1
5382insC	17	4	4/4
" število pozitivnih vzorcev, ki smo jih določili z metodo PCR v realnem času in analizo talitvene krivulje produktov na Light Cycler-ju (LC)/število vzorcev, ki smo jih potrdili s sekvenčno analizo
60
2001 začeli z genetskim svetovanjem in testiranjem oseb, ki so navajale več primerov raka dojk ali jajčnikov v družini.
Na Onkološkem inštitutu Ljubljana določamo prvenstveno tiste mutacije, ki so se izkazale kot najbolj pogoste v slovenskih družinah. Med te sodijo mutacije v genu BRCA1 - 1806C>T, 300T>G, 300T>A, 310G>A, 5382insC in pridobljena slovenska mutacija IVS162A>G v genu BRCA2. Metoda, ki smo jo uvedli za testiranje mutacij 1806C>T, 300T>G, 310G>A in 5382insC v genu BRCA1, popolnoma korelira z rezultati sekvenčne analize, ki je bila opravljena v Laboratory of Medical Genetics - Vrije University Brussels (Tabela 1). V primeru mutacije 300T>A pa s to metodo nismo uspeli potrditi prisotnosti mutacij, ki so jih sicer dokazali s sekvenčno analizo.
Zaključek
Na osnovi naših rezultatov in rezultatov sodelovanja z laboratorijem iz Bruslja lahko zaključimo, da smo uspešno zasnovali in oblikovali primerje in sonde za dokazovanje mutacij 1806C>T, 300T>G, 310G>A in 5382insC v genu BRCA 1. Po optimizaciji je metoda PCR v realnem času in analiza talitvene krivulje produktov izredno občutljiva (senzitivna) in kot taka uporabna za določanje mutacij. Čeprav smo primerje za mutacijo 300T>A pravilno izbrali in pripravili, metoda ni bila dovolj občutljiva in je torej neuporabna za rutinsko določanje te mutacije.
Viri in literatura
1.	Roest PAM, Roberts RG, Sugino S, van Omen GJB, den Dünnen JT. Protein truncation test (PTT) for rapid detection of translation-terminating mutation. Hum Mol Genet 1993; 2: 1719-21.
2.	Hayashi K, Wenz HM, Inazuka M, Tahira T, Sasaki T, Atha DH. SSCP analysis of point mutations by multicolor capillary electrophoresis. Methods Mol Biol 2001; 163: 10926.
3.	Myer RM, Lumelsky N, Lerman LS, Maniatis T. Detection of single base substitution in total genomic DNA. Nature 1985; 313: 495-8.
4.	Foy CA, Parkers HC. Emerging homogeneous DNA-based technologies in the clinical laboratory. Clin Chem 2001; 47: 990-1000.
5.	Wilhelm J, Pingout A. Real-time polymerase chain reaction. Chembiochem 2003; 4: 1120-8.
6.	Gerard P, Pindolia MS, Worsham MJ. A rapid and sensitive approach to mutation detection using real-time polymerase chain reaction and melting curve analyses, using BRCA1 as example. Mol Diagn 1999; 4: 241-6.
7.	DeVita TV, Hellman S, Rosenberg AS, editors. Principles and practice of Oncology 7th edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2005.
8.	King MC, Marks JH, Mandell JB. Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2. Science 2003; 302: 643-6.
61
9. Loman N, Johannsson O, Kristoffersson U, Oisson H, Borg A. Famiiy history of breast and ovarian cancers and BRCA1 and BRCA2 mutations in a population-based series of early-onset breast cancer. J Natl Cancer Inst 2001; 93: 1215-23.
10. Struewing JP, Hartge P, Wacholder S, Baker SM, Berlin M, McAdams M, Timmerman MM, Brody LC, Tucker MA.The risk of cancer associated with specific mutations of BRCA1 and BRCA2 among Ashkenazi Jews. N Engl J Med 1997; 336: 1401-8.
62