folia biologica et geologica 57/2, 65–75, ljubljana 2016 UPORABA DVO-FOTONSKEGA KONFOKALNEGA MIKROSKOPA ZA RAZISKOVANJE ENCIMSKE AKTIVNOSTI EKTOMIKORIZNIH GLIV IN ANALIZA SLIK S PROGRAMOM ImageJ USE OF TWO-CONFOCAL MyCROSCOPy FOR RESEARCH OF ENZyMATIC ACTIVITy OF ECTOMyCORRHIZAL FUNGI AND IMAGE ANALySIS WITH ImageJ PROGRAM Ines Štraus1*, Marko Kreft2 & Hojka Kraigher1 Delo je prispelo 27. decembra 2016, sprejeto 31. decembra 2016. Received December 27, 2016; accepted December 31, 2016. 1 Gozdarski inštitut Slovenije, Večna pot 2, 1000 Ljubljana, Slovenija 2 Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, & Inštitut za patofiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Večna pot 111, 1000 Ljubljana, Slovenia; Celica Biomedical, Tehnološki park 24, 1000 Ljubljana, Slovenia * ines.straus@gozdis.si iZVleČeK Uporaba dvo­fotonskega konfokalnega mikroskopa za raziskovanje encimske aktivnosti ektomikoriznih gliv in analiza slik s programom imageJ Simbioza med ektomikoriznimi glivami in gozdnimi drevesi prispeva k rasti dreves in delovanju ekosistema. Ek- tomikorizne glive so razvile visoko diferencirane strukture, ki omogočajo različne načine privzemanja hranilnih snovi in transport le teh do korenin. Aktivnost fosfataz v mikoriznih glivah omogoča dostopnost fosfatnih spojin v tleh, do katerih rastline sicer nimajo dostopa. V raziskavi smo analizirali aktivnost na površino hif vezane fosfataze (SBP) mikoriznih gliv pri sadikah bukve (Fagus sylvatica L.) in predstavili metodo za zajemanje in analizo slik fosfatazne aktivnosti. Uporabili smo dvofotonski konfokalni laserski mikroskop LSM 7 MP, ki omogoča zajemanje slik od površine mikoriznega plašča skozi mikorizni plašč vse do površine koreninskih celic. Koreninske vršičke smo obar- vali s komercialnim barvilom ELF® 97. Slike smo analizirali s prosto dostopnim programom ImageJ. V članku smo pod- robno opisali postopek analize in predstavili prednosti in slabosti izbrane metode. Ključne besede: na površino vezana fosfataza, eksplo- racijski tipi, fosfat, ELF® 97, bukev abStRact Use of two­confocal mycroscopy for research of en­ zymatic activity of ectomycorrhizal fungi and image analysis with imageJ program The ectomycorrhizal symbiosis of forest trees contrib- utes to the function of ecosystem and tree growth. The sym- biotic organs of ectomycorrhiza (ECM) are highly differenti- ated structures differing in nutrient uptake, transfer capaci- ties and ability to promote tree growth. In the present study surface-bound phosphatase activity (SBP) was analyzed on ectomycorrhiza of beech seedlings (Fagus sylvatica L.). The method for images acquisition and their analysis was dis- cussed. Two-photon confocal laser scanning microscope LSM 7 MP was used to study spatial distribution of SBP en- zymatic activity in various thicknesses of ECM mantle in intact (non-sectioned) ECM root tips. ELF® 97 was used for staining phosphatase enzymes. Images were analyzed using the freely available program ImageJ. In this article, we de- scribe in detail the analysis procedure and the advantages and disadvantages of the method. Key words: surface-bound phosphatase, exploration types, phosphate, ELF® 97, beech Štraus, kreft & kraigher: uPOraBa DVO-fOtONskega kONfOkaLNega MikrOskOPa Za raZiskOVaNJe 66 folia biologica et geologica 57/2 – 2016 Encimska aktivnost ektomikoriznih gliv (ECM) in nji- hovega zunaj koreninskega micelija ima pomembno vlogo pri prenosu hranil iz gozdnih tal in listnega opada do rastline. Encimi, ki jih glive sproščajo v oko- lico, omogočajo razgradnjo snovi, ki so vezane v tleh in rastlinam nedostopne (Kjøller & Struwe 2002). V gozdnih ekosistemih imajo glive ključno vlogo pri obratu, preperevanju in mineralizaciji ogljika, dušika, fosforja in drugih snovi, ki jih pretvorijo v obliko, ki je zopet dostopna rastlinam in drugi talni mikroflori (Ekblad s sod. 2013, Wallander s sod. 2013). Za opazovanje encimske aktivnosti lahko izbira- mo med nedestruktivnimi in destruktivnimi metoda- mi. Nedestruktivne metode temeljijo na opazovanju encimske aktivnosti pri živih celicah. Navadno te me- tode ne vključujejo barvanja, za opazovanje pa izbere- mo svetlobni mikroskop (arbuskularna mikoriza), epi- fluorescenčni mikroskop (avtofluorescenca) (Vier- heilig, Schweiger & Brundrett 2005) ali konfokal- ni laserski mikroskop (Schweiger s sod. 2002). De- struktivne metode zajemajo dva tipa barvanj: vitalna barvanja, kjer opazovanje aktivnosti encimov temelji na metabolno aktivnem miceliju gliv in nevitalna bar- vanja, kjer tehnike barvanja obarvajo tako vitalen kot odmrl mikorizni micelij (Vierheilig, Schweiger & Brundrett 2005). Nedestruktivne metode so nava- dno bolj v uporabi pri arbuskularni mikorizi, kjer so korenine neobarvane in ni potrebno predhodno raz- barvanje, medtem ko je primarna skorja in plašč ekto- mikoriznih korenin naravno obarvan, kar zahteva predhodno razbarvanje korenin (Vierheilig, Schwe- iger & Brundrett 2005). Pritsch s sodelavci (2004) so razvili avtomatizirano metodo z mikrotitrskimi ploščami, ki omogoča merjenje encimske aktivnosti fosfataze, hitinaze in ß-glukozidaze s spektrofotome- trom (oz. čitalcem mikrotitrskih plošč). V članku bomo predstavili uporabo dvofotonskega konfokalnega laserskega mikroskopa LSM 7 MP, ki omogoča opazovanje debelih preparatov ektomikori- znih korenin, brez predhodne priprave rezin in analizo slik s programom ImageJ ter prednosti oziroma slabo- sti omenjene metode. Opazovali smo aktivnost na po- vršino vezane fosfomonoesteraze (angl. surface bound phosphatase – SBP) pri različnih morfotipih ektomiko- riznih gliv. Fosfomonoesteraze so encimi, ki razgraju- jejo različne substrate v tleh, kot so inozitol fosfat, po- lifosfati, mononukleotidi in fosforilirani sladkorji. Glede na optimum pH fosfomonoesteraz ločimo kisle in alkalne fosfataze (Criquet s sod. 2004). Aktivnost kisle fosfataze, ki smo jo preučevali, temelji na hidroli- zi p-nitrofenil fosfata (pNPP) v p-nitrofenol fosfat (pNP) in fosfat (P) (Alvarez s sod. 2004). 1 UVOD 2 MATERIAL IN METODE 2.1 Vzorčenje in priprava vzorca za mik­ roskopiranje Za mikroskopiranje smo pripravili sveže vzorce miko- riznih kratkih korenin. Vzorčili smo iz rizotronov (Slika 1), lončnih poskusov ali iz narave. Mikorizne kratke korenine smo odrezali s škarjami in jih prenesli v petrijevke z vodo. S korenin smo s pomočjo čopiča odstranili substrat in jih pripravili za barvanje. Za vsak vzorec smo pripravili po tri mikorizne kratke ko- renine dolžine 3 do 4 mm. Protokol za pripravo mikoriznih preparatov smo prilagodili po Alvarez s sodelavci (2004). Za pripravo preparata smo uporabili fosfatazni substrat ELF® 97 (Molecular Probes, Inc., USA) za barvanje in citrat fos- fatni pufer za spiranje korenin po barvanju. Citrat fos- fatni pufer smo pripravili z mešanjem 3,025 g/l Tris- -(hidroksimetil)-aminometana, 2,9 g/l maleinske ki- sline, 3,5 g/l citronske kisline, 1,57 g/l borove kisline in 1 M NaOH. Pufer smo s pomočjo 1 M HCl umerili na pH 5. Raztopino ELF® 97 smo redčili s citrat fosfatnim pufrom v razmerju 10:2 v/v (pufer/ELF® 97) 2.2 barvanje mikoriznih korenin z raztopino elF® 97 Za vsak tip ektomikorize smo barvali po tri kratke ko- renine (Slika 1). Za analize encimske aktivnosti fosfa- taze pri glivah (Alvarez s sod. 2004) je v uporabi ko- mercialni kit ELF® 97 (Johnson & Spence 2010). Kit vsebuje topni substrat, ki ob prisotnosti delovanja fos- fataze fluorescira. Prednost ELF® 97 je ta, da je razlika med vrhovoma ekscitacijske in emisijske valovne dol- žine približno 200 nm, kar omogoča, da lahko signal, ki nastane kot posledica delovanja encimov, jasno loči- mo od signala, ki nastane kot posledica avtofluore- scence mikoriznega micelija (Johnson & Spence 2010). Očiščene mikorizne korenine smo prenesli v 1,5 ml mikrocentrifugirke in dodali 44 µl raztopine ELF® Štraus, kreft & kraigher: uPOraBa DVO-fOtONskega kONfOkaLNega MikrOskOPa Za raZiskOVaNJe 67folia biologica et geologica 57/2 – 2016 97 (pH=5), 5x redčitev. Korenine smo barvali 15 minut, nato smo jih previdno prenesli v nove 1,5 µl mikrocen- trifugirke, ter jih sprali s 100 µl citrat fosfatnega pufra (pH=5). Obarvane mikorizne korenine smo po spira- nju prenesli na objektna stekelca s pufrom, na katera smo v obliki kroga nakapljali stopljen vosek v debelini mikoriznih korenin. Na korenine smo položili krovna stekelca in jih dodatno zalepili s stopljenim voskom vzdolž robov. 2.3 Mikroskopiranje Mikroskopiranje smo izvajali na Inštitutu za patofizi- ologijo v Ljubljani, v Laboratoriju za neuroendokrino- logijo in molekularno celično fiziologijo (referenčni center za konfokalno mikroskopijo Carl Zeiss). Za mi- kroskopiranje smo uporabili dvofotonski konfokalni mikroskop LSM 7 MP (Zeiss, Nemčija), ki je bil name- ščen v zatemnjenem prostoru na protivibracijski mizi, saj lahko mehanski tresljaji in svetloba motijo meritve. Slike za analize (serija optičnih rezin po z-osi; ang.: Z- -stack) smo zajemali s programsko opremo ZEN 2012 (black edition, Release version 8.0, © Carl Zeiss Micro- scopy GmbH 1997-2013). Razmik med rezinami je bil 10 µm. Za vsak vzorec smo opravili tri ponovitve me- ritev na treh različnih lokacijah na korenini. 2.4 Dvofotonski konfokalni laserski mikroskop Za razliko od elektronske mikroskopije (Stempak & Ward 1964), ki je sicer tudi zelo razširjena metoda, omogoča fluorescenčna mikroskopija opazovanje živih celic in procesov, ki potekajo v njih (Heintz- mann & Ficz 2006, Lippincott-Schwartz & Pat- terson 2003). Fluorescenca je pojav, pri katerem lahko s svetlobo primerne valovne dolžine molekulo vzbudi- mo v višje energetsko stanje, nato pa vzbujena moleku- la izseva foton in preide nazaj v osnovno energetsko stanje (Hell & Wichmann 1994). Osnova konfokal- nega mikroskopa je fluorescenčni mikroskop (Hein- tzmann & Ficz 2006). Konfokalni mikroskop ne osvetljuje celotnega vzorca hkrati, temveč ga z laser- Slika 1: 1-vzorčenje ECM korenin iz rizotrona; 2-priprava ECM korenin za barvanje; 3-barvanje ECM korenin z ELF® 97 za 15 minut, spiranje s citrat fosfatnim pufrom, da zaustavimo encimatsko reakcijo in prenos obarvanih koreninskih vršičkov na objektno stekelce, kjer smo jih pokrili s krovnim stekelcem in zalepili z voskom Figure 1: 1-ECM roots tips were sampled from rhizotron; 2- ECM roots tips were prepared for staining; 3-ECM root tips were stained using ELF® 97 staining, after 15 minutes incubation they were rinsed with citrate-phosphate buffer solution in order to stop the enzymatic reaction and transferred to object slides and sealed with cover slides and wax Štraus, kreft & kraigher: uPOraBa DVO-fOtONskega kONfOkaLNega MikrOskOPa Za raZiskOVaNJe 68 folia biologica et geologica 57/2 – 2016 skim žarkom pregledujemo v določeni optični ravnini (Heintzmann & Ficz 2006). Vzbujeno fluorescentno svetlobo iz točk sprejme detektor, ki informacijo s po- močjo računalnika pretvori v sliko. Običajni enofoton- ski konfokalni mikroskop ima vgrajeno zaslonko, ki preprečuje pot svetlobe iz ozadja vzorca do detektorja (Földes-Papp, Demel & Tilz 2003, Wilhelm s sod. 2014). Dvofotonski konfokalni mikroskop vzbuja mo- lekule z dvema fotonoma daljše valovne dolžine (Denk s sod. 1990). Molekula mora sočasno absorbirati dva fotona, da preide v višje energetsko stanje, kar zagoto- vimo z veliko gostoto fotonov, oziroma z zelo veliko intenziteto svetlobe (Denk s sod. 1990, Helmchen & Denk 2005), kar dosežemo z zbiranjem žarkov v gori- šču in s pulznim delovanjem laserja. Posledično je in- tenziteta svetlobe dovolj velika, da pride do vzbujanja fotonov le v gorišču, hkrati pa se izognemo moteči sve- tlobi iz ozadja vzorca (Denk s sod. 1994). Ker pri dvo- fotonskem mikroskopu vzbujamo fotone z dvakrat daljšo valovno dolžino, je v primerjavi z navadnim konfokalnim mikroskopom tudi ločljivost slike posle- dično nekoliko manjša, medtem ko je sipanje fotonov manjše. Zato izbiro mikroskopa prilagodimo vzorcu: če je vzorec debel in se svetloba fotonov močno siplje, izberemo dvofotonski konfokalni mikroskop, v na- sprotnem primeru pa enofotonski konfokalni mikro- skop (Denk s sod. 1994). Za naše raziskave smo upora- bili dvofotonski laserski mikroskop. Slika 2: Izvoz slike iz programa ZEN 2011 v formatu .tif za nadaljnje analize Figure 2: Image export from ZEN 2011 in .tif format for further analysis 3 ANALIZA SLIK S PROGRAMOM ImageJ 1.46R Slike smo analizirali s programom ImageJ 1.46r (Nati- onal Institutes of Health, USA). Za analizo smo slike najprej izvozili iz programa ZEN 2011 (Slika 2) in jih shranili v formatu .tif. Pri slikah smo pred izvažanjem izklopili kanal z belo svetlobo, ker je sicer le-ta motil nadaljnje analize. Štraus, kreft & kraigher: uPOraBa DVO-fOtONskega kONfOkaLNega MikrOskOPa Za raZiskOVaNJe 69folia biologica et geologica 57/2 – 2016 Nato smo sliko odprli v programu ImageJ 1.46r, jo razdelili na kanale (Split channels) in zaprli vse razen zelenega kanala (Slika 3). Iz originalne slike smo nare- dili dvojnike, na katerih smo nadaljevali z analizami. 3.1 analiza originala: S funkcijo Polygon Selections smo označili celotno površino mikorizne korenine oziroma hife, ki smo jo želeli analizirati (Slika 4). Slika 3: Slika originala preden smo jo razdelili na kanale (levo) in slika z izbranim zelenim kanalom pripravljena za nadaljnje analize (desno) Figure 3: Original image before separating on channels (left) and selected gren channel image of the same picture ready for analyses (right) Slika 4: Označevanje površine, kjer se pojavljajo aktivni encimi SBP na mikoriznem plašču z orodjem Polygon selections Figure 4: Marking areas where active enzymes SBP were present on mycorrhizal mantle surface using tool Polygon Selections Štraus, kreft & kraigher: uPOraBa DVO-fOtONskega kONfOkaLNega MikrOskOPa Za raZiskOVaNJe 70 folia biologica et geologica 57/2 – 2016 Ko smo nastavili parametre, smo nadaljevali z me- ritvami: Analyze → Measure. Pojavilo se je okno z me- ritvami (Slika 6), ki smo jih prepisali v tabelo v MS Excel, ki smo jo pripravili sami. Prepisali smo podatke za površino (Area) in povprečno intenziteto fluore- scence v konkretni sliki v plašču (Mean gray value). Slika 5: Določevanje velikosti točkovne enote (piksel) (levo) in izbor želenih parametrov za analize, v našem primeru površina označene površine (Area) in povprečna intenziteta fluorescence v konkretni sliki v plašču (Mean gray value) (desno). Pri nastavitvah za analize originala odkljukamo funkcijo omejitve na nadpražno vrednost. Figure 5: Determination of the size of the pixel unit (left) and selection of the parameters for the analysis in this case the area of the selected surface (Area) and the average intensity of fluorescence (Mean gray value) (right). In window Set Measurements for analyses of the original image tick off option Limit to threshold. Nato smo nadaljevali z nastavitvami: Analyze → Set Scale…, kjer smo pri prvi postavki Distance in Pixels vpisali 1 in tako določili velikost točkovne enote. Pri nastavitvah (Set Measurements) smo za izbrana pa- rametra izbrali površino označene površine (Area) in povprečno intenziteto fluorescence v konkretni sliki v plašču (Mean gray value). Podatek Mean gray value ima smisel le v sivi sliki preden določimo prag. Pri analizi originala odkljukamo opcijo omejitev na prag (Limit to Threshold) (Slika 5). Slika 6: Okno z meritvami, ki jih prepišemo v tabelo MS Excel za nadaljnje analize. Figure 6: Window with results of measurements, that should be copied in MS Excel table for further analyses. Štraus, kreft & kraigher: uPOraBa DVO-fOtONskega kONfOkaLNega MikrOskOPa Za raZiskOVaNJe 71folia biologica et geologica 57/2 – 2016 Po analizi originala smo nadaljevali z analizo na dvojnikih, kjer smo merili vrednosti pri pragu 10 %. 3.2 analiza dvojnika Preden smo začeli z analizo, smo postavili prag: Image → Adjust → Threshold… (Slika 7). V odprtem oknu se pojavi graf in dva drsnika. Za analize premi- kamo le zgornji drsnik, ki na nastavimo na želeno nad- pražno vrednost vseh dimenzij, pri čemer upoštevamo da je slika 8-bitna. Za prag 10 % nastavimo drsnik na 25. Nastavitev potrdimo s klikom na gumb Apply. Nato smo kopirali označeno površino iz original- ne slike na dvojnik: CTRL+C → Edit → Selection → Restore Selection Sledile so nastavitve za analize: Analyze → Set Scale… → Distance in Pixels = 1, Set Measurements…, kjer smo odkljukali Limit to Threshold Pri opravljenih meritvah smo prepisali le vrednost za površino (Area): Analyze → Measure… Slika 7: Nastavitev želene nadpražne vrednosti za analize. Figure 7: Setting of threshold value for analyses. 4 RAZPRAVA Encimsko aktivnost lahko ugotavljamo s pomočjo bar- vil, ki temeljijo na fluorescenci. Za ta namen so v upo- rabi komercialno dostopni kiti (Johnson & Spence 2010). Za analize encimske aktivnosti fosfataze pri gli- vah (Alvarez s sod. 2004, 2012) je v uporabi komerci- alni kit ELF® 97 (Johnson & Spence 2010). Kit vsebuje topni substrat, ki ob prisotnosti delovanja fosfataze proizvede fotostabilen rumeno-zelen precipitat na strani aktivnega encima. Prednost ELF® 97 je ta, da je razlika med vrhovoma ekscitacijske in emisijske valov- ne dolžine približno 180 nm, kar omogoča, da lahko signal, ki nastane kot posledica delovanja encimov, jasno ločimo od signala, ki nastane kot posledica avto- fluorescence mikoriznega micelija (Johnson & Spence 2010). Substrat se lahko uporablja za opazovanje živih celic, vendar nima možnosti prehajanja skozi celično steno, zato lahko opazujemo le aktivnost na površino vezanih encimov. Avtorji (Johnson & Spence 2010) protokolov navajajo, da intenziteta fluorescentnega si- gnala fiksiranih preparatov ostaja bolj ali manj enaka več mesecev ali celo let, kar potrjujejo tudi naše izku- šnje. Vierheilig, Schweiger & Brundrett (2005) uvrščajo ELF® 97 med vitalna barvila, saj ni potrebno predhodno razbarvanje korenin. V naših raziskavah smo opazili, da barvilo prosto prehaja do mikoriznega plašča, kjer koreninski vršiček ni obdan z gostimi izha- jajočimi elementi, kot so hife, oziroma kadar je koreni- na svetlih barv. V primeru, ko je preplet hif okrog ko- Štraus, kreft & kraigher: uPOraBa DVO-fOtONskega kONfOkaLNega MikrOskOPa Za raZiskOVaNJe 72 folia biologica et geologica 57/2 – 2016 reninskega vršička gost, smo opazili, da je preparat slabše obarvan ali je obarvan le na površini in barvilo ni prodrlo v notranjost. Za temno obarvane korenin- ske vršičke pa ne moremo zagotovo trditi, ali je nizek delež opaženih encimov posledica slabšega prodiranja barvila v notranjost, ali je to posledica temno obarva- nega preparata, ki onemogoča prehod emisijske svetlo- be. Pri uporabi ELF® 97 moramo biti pozorni na biot- ske (število bakterij in gliv, koncentracija proteinov) in abiotske dejavnike (pH, temperatura, vlaga), ki lahko vplivajo na aktivnost encima in s tem na rezultate. Vpliv pH na aktivnost fosfataze je vrstno specifičen (Alvarez s sod. 2004; Baghel, Sharma & Pandey 2009). Baghel, Sharma & Pandey (2009) so pri glivi Cantharelus tropicalis dokazali višjo aktivnost SBP pri 40 °C in značilno nižjo aktivnost pri 35 °C. Korelacijo med kislo fosfatazo in temperaturo ter vlago so opazili tudi Criquet s sodelavci (2004) v listnem opadu. Al- varez s sodelavci (2012) so preučevali vpliv morfoti- pov (Paxillus involutus, Pisolithus tinctorius, Cenoco- ccum geophilum, Descolea antartica) in vnos hranilnih snovi (angl. soil fertility) v tla na aktivnost kisle fosfa- taze. Ugotovili so, da na prostorsko razporeditev kisle fosfataze v mikoriznem miceliju vpliva morfotip (zunaj koreninski micelij, mikorizni plašč in Hartigova mreža), medtem ko vnos snovi v tla vpliva na encim- sko aktivnost zunaj koreninskega micelija in Hartigo- ve mreže. Dvofotonski konfokalni mikroskop omogoča opa- zovanje vitalnih preparatov, poleg tega pa z njim lahko opazujemo debelejše preparate oziroma kar cele kore- ninske vršičke, saj lahko optično prodremo skozi mi- korizni plašč vse do celic korenine in zato predhodna priprava rezin ni potrebna. Tako prihranimo na času, poleg tega pa opazujemo nepoškodovan koreninski vr- šiček v celoti, razen v že prej omenjenem primeru temno obarvanih mikoriznih gliv, kjer bi morali kore- nine predhodno očistiti oziroma razbarvati (Schwei- ger s sod. 2002, Vierheilig, Schweiger & Brun- drett 2005). Za encimske analize so v uporabi tudi encimski testi na filter ploščah (Pritsch s sod. 2011), ki omogočajo analize različnih encimov hkrati, vendar imamo v tem primeru le podatek o jakosti fluorescen- tnega signala, nimamo pa podatka o razporejanju en- cimov v mikoriznem miceliju. Za analize slik smo izbrali prosto dostopen pro- gram ImageJ 1.46j, ki je v znanosti uporabljen že več kot 25 let, še posebej se je razširil med uporabniki za analize slik s področja biologije (Schneider, Rasband & Eliceiri 2012). ImageJ 1.46r v našem primeru na sliki originala izmeri površino, ki jo zasede vzorec. Re- zultati analize predstavljajo povprečne intenzitete fluorescence teh površin za vsak vzorec. Pri tem je po- trebno opozoriti, da ima analiza intenzitete fluore- scence na originalni sliki smisel le, kadar so vsi pogoji med vzporedno posnetimi slikami enaki (enako bar- vanje, enaka moč laserja, fotopomnoževalke in drugo). Zagotavljanje enakih pogojev je skoraj nemogoče, zato smo za analize izbrali kontrastne slike, kar pomeni merjenje površine pri določenem pragu. To nam omo- goča tudi ponovljivost metode in primerjanje podat- kov. Preden se odločimo, kateri prag bomo izbrali, na- redimo vzporedne analize slik pri različnih nadpra- žnih vrednostih in izberemo tisto nadpražno vrednost, ki najbolj ustrezno odstrani vsa nespecifična barvanja. Pri delu s programom ImageJ 1.46r smo opazili, da je enostaven za uporabo, da preprosto označimo površi- no, ki jo želimo analizirati in da so meritve zelo na- tančne. Slabosti metode, ki smo jih med uporabo opa- zili, so, da (1) je v primeru, ko je odprtih več oken (ori- ginal in dvojnik), potrebno vedno znova označiti na katero okno se nanaša ukaz oziroma meritev, (2) funk- cija razveljavi (Undo) sicer deluje, ampak naslednja meritev ni več zanesljivo pravilna. 5 ZAKLJUčKI Metoda, ki smo jo predstavili, je nova in edinstvena predvsem zaradi uporabe dvofotonskega laserskega mikroskopa. Omogoča opazovanje encimske aktivno- sti fosfataze in njeno razporejanje v mikoriznem mice- liju brez uporabe rezin. Konfokalna mikroskopija je že bila uporabljena za opazovanje aktivnosti SBP pri ECM glivah (Alvarez s sod. 2004, 2012), vendar vedno na pripravljenih rezinah ECM korenin, ki omogoča ozek vpogled v zelo majhen del korenine. V prihodnje želimo metodo še razviti in raziskati, ali je razporeja- nje encimov pri različnih eksploracijskih tipih poveza- no z njihovo funkcijo v naravi. Štraus, kreft & kraigher: uPOraBa DVO-fOtONskega kONfOkaLNega MikrOskOPa Za raZiskOVaNJe 73folia biologica et geologica 57/2 – 2016 Enzymatic activity could be detected by dyes based on fluorescence. For this purpose, the commercially avail- able kits are applicable (Johnson & Spence 2010). Al- varez et al. (2004, 2012) used commercial kit ELF® 97 for analyses of surface-bound phosphatase activity. ELF® 97 contains a soluble ELF substrate, which forms an intense yellow-green-fluorescent alcohol precipitate at the site of phosphatase activity. ELF® 97 alcohol pre- cipitate is separated from its excitation maximum by over 180 nm, so ELF 97 signal can be clearly distin- guished from most cell and mycorrhizal mycelium au- tofluorescence (Johnson & Spence 2010). Substrate can be used for observing life cells, but it can not pass the cell wall, so just surface bound enzymatic activity can be analyzed. The authors of protocols indicate, that ELF 97 phosphate-based staining of fixed samples can persist for a month to one year with little if any loss of signal, and this was noticed also in our experi- ments. Vierheilig, Schweiger & Brundrett (2005) classified ELF 97 into vital staining techniques, be- cause clearing of roots is not necessary. In our research, we noticed that the dye passes freely to the mycorrhi- zal sheath, if the root tips are not surrounded by dense emanating elements such as hyphae, or if the roots are of light colors. In the cases in which hyphae around the root tips are dense, we observed that the mycorrhizal structures are less colored or are colored only on the surface, indicating the dye has not penetrated in the interior. For dark colored root tips we cannot definite- ly claim whether a low percentage of the observed en- zyme results from lower dye penetration into the inte- rior of whether this is due to the dark-colored mycor- rhizal mantle that prevents the emission light passing through. When using ELF® 97 care must be taken on biotic (the number of bacteria and fungi, protein con- centration) and abiotic factors (pH, temperature, hu- midity), which can affect the enzyme activity and thus also the results. The influence of pH on the phospha- tase activity is species dependent (Alvarez et al. 2004, Baghel, Sharma & Pandey 2009). Baghel, Sharma & Pandey (2009), demonstrated higher activity of SBP at 40 ° C and typically a lower activity at 35 ° C for the fungus Cantharelus tropicalis. The correlation between the acid phosphatase, and the temperature and humid- ity were also observed by Criquet et al. (2004) in the leaf litter. Alvarez et al. (2012) studied the influence of morphotypes (Paxillus involutus, Pisolithus tinctori- us, Cenococcum geophilum, Descolea Antartica) and soil fertility on acid phosphatase activity. They found that spatial distribution of acid phosphatase in mycor- rhizal mycelium is affected by mycorrhizal morphot- ype (extraradical mycelium, mycorrhizal mantle and Hartig net), while soil fertility had a significant effect on the enzymatic activity in the extraradical mycelium and Hartig net. Two-photon confocal microscope allows observa- tion of vital mycorrhizal fungi, in addition prepared samples can be thick, or even whole root tips can be observed, because the laser beam can penetrate through mycorrhizal mycelium layers to the root cells, therefore, the prior preparation of the t mycelium slic- es is not necessary. The advantage of this microscope is in its time-efficiency and the possibility to observe in- tact root tips, except for the before mentioned case of dark colored mycorrhizal fungi, which should be cleared before staining (Schweiger et al. 2002, Vier- heilig, Schweiger & Brundrett 2005). For analysis of enzymatic activity enzyme assays on the filter plates are also in use (Pritsch et al. 2011), which enable the analysis of several enzymes at the same time, however, this tests give only information of the intensity of the fluorescent signal, but no information about the allo- cation of enzymes in mycorrhizal mycelium. For image analysis we have selected the freely available program ImageJ 1.46j, which is used in sci- ence for more than 25 years, particularly for image analysis in biology (Schneider, Rasband & Eliceiri 2012). In our case, ImageJ measures the area covered by the sample in the original image. Results of ana- lyzes represent the average intensity of the measured areas for each sample. It is important to notice, that analyzes of intensity on original images are suitable if all conditions between compared images are the same (the same staining, the same power of laser, photomul- tiplier…). More reproducible and also simpler is to analyze the copies representing contrasted images, measuring the area above the threshold value. It is im- portant to choose the threshold that most effectively cuts off all non-specific staining. When working with the program ImageJ 1.46r we noticed that it is a simple and intuitive program to use, that has high accuracy of selection and it is simple to select the measuring area. Disadvantages of ImageJ were (1) a click on every image, and for each step, is needed if more images are open (original and duplicates), (2) caution in the work order is necessary, since if the operator uses the Undo function it can result in wrong measurements. 6 SUMMARy Štraus, kreft & kraigher: uPOraBa DVO-fOtONskega kONfOkaLNega MikrOskOPa Za raZiskOVaNJe 74 folia biologica et geologica 57/2 – 2016 The method used in our study is novel because of use of two-photon confocal microscopy. It allows to study spatial distribution of SBP enzymatic activity in various thicknesses of ECM mantle in intact (non-sectioned) ECM root tips. Although confocal microscopy for ob- servation of SBP activity in ECM was already used be- fore (Alvarez et al. 2004, 2012), it was used only in sectioned ECM roots, that allowed an insight into a very small fraction of the ECM root. We suggest that two-photon confocal microscopy could prove useful in future to study distribution of enzymatic activity of dif- ferent exploration types and their function in nature. 7 CONCLUSIONS ZAHVALA - ACKNOWLEDGEMENTS Predstavljena metoda je bila razvita v okviru doktor- ske naloge mlade raziskovalke (IŠ), in je bila financira- na iz ARRS v okviru programske skupine P4-0107, Mi- nistrstva za Kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano v okviru projektov L4-2265 in L4-4318 in projektu EU- FORINNO (RegPot No. 315982). Zahvaljujemo se tudi podjetju Celica d.o.o. in Inštitutu za patofiziologijo Medicinske univerze v Ljubljani, ki sta omogočila delo na dvo-fotonskem konfokalnem mikroskopu. 8 LITERATURA – REFERENCES Alvarez, M., R. Godoy, W. Heyser & S. Härtel, 2004: Surface-bound phosphatase activity in living hyphae of ectomycorrhizal fungi of Nothofagus obliqua. Mycologia (Lawrence) 96 (3): 479-487. Alvarez, M., D. Huygens, L. M. Díaz, C. A. Villanueva, W. Heyser & P. Boeckx, 2012: The spatial distributi- on of acid phosphatase activity in ectomycorrhizal tissues depends on soil fertility and morphotype, and relates to host plant phosphorus uptake. Plant, Cell & Environment (New Jersey) 35 (1): 126-135. Baghel, R. K., R. Sharma & A. K. Pandey, 2009: Activity of acid phosphatase in the ectomycorrhizal fungus Cantharellus tropicalis under controlled conditions. Journal of Tropical Forest Science (Ithaka) 21 (3): 218-222. Criquet, S., E. Ferre, A. M. Farnet & J. le Petit, 2004: Annual dynamics of phosphatase activities in an evergreen oak litter: influence of biotic and abiotic factors. Soil Biology and Biochemistry (Amsterdam) 36 (7): 1111-1118. Denk W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 1990. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science (New york), 248, 4951: 73-76. Denk, W., K. R. Delaney, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D.W. Tank & R. yuste, 1994: Ana- tomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods (Amsterdam) 54 (2): 151-162. Ekblad, A., H. Wallander, D. L. Godbold, C. Cruz, D. Johnson, P. Baldrijan, R. G. Björk, D. Epron, B. Kieliszewska-Rokicka, R. Kjøller, H. Kraigher, E. Matzner, J. Neumann & C. Plassard, 2013: The production and turnover of extramatrical mycelium of ectomycorrhizal fungi in forest soils: role in carbon cycling. Plant and Soil (Dordrecht) 366 (1-2): 1-27. Földes-Papp, Z., U. Demel & G. P. Tilz, 2003: Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. In- ternational Immunopharmacology (Amsterdam) 3 (13-14): 1715-1729. Heintzmann, R. & G. Ficz, 2006: Breaking the resolution limit in light microscopy. Briefings in Functional Ge- nomics & Proteomics (Oxford) 5 (4): 289-301. Hell, S. W. & J. Wichmann, 1994: Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated- -emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters (Washington) 19 (11): 780-782. Helmchen, F. & W. Denk, 2005: Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods (New york) 2 (12): 932-940. Johnson, J. & M. T. Z. Spence, 2010: Phosphatase-Based Signal Amplification Techniques. V: The Molecular Probes® Handbook. A guide ti fluorescence probes and labeling technologies. 11th edition. Life Technologies Corporation (Waltham): pp. 203-211. Kjøller, A. H. & S. Struwe, 2002: Fungal communities, succession, enzymes and decomposition. V: Bruns, R. G. & R. P. Dick R.P., (ur.): Enzymes in the environment: activity, ecology and applications. CRC Press (New york), pp. 267-285. Štraus, kreft & kraigher: uPOraBa DVO-fOtONskega kONfOkaLNega MikrOskOPa Za raZiskOVaNJe 75folia biologica et geologica 57/2 – 2016 Lippincott-Schwartz, J. & G. H. Patterson, 2003: Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science (Washington) 300 (5616): 87-91. Pritsch, K., S. Raidl, E. Marksteiner, H. Blascke, R. Agerer, M. Schloter & A. Hartmann, 2004: A rapid and highly sensitive method for measuring enzyme activities in single mycorrhizal tips using 4-methylumbellife- rone-labelled fluorogenic substrates in a microplate system. Journal of Microbiological Methods (Amsterdam) 58 (2): 233-241. Pritsch, K., P. Courty, J.-L. Churin, B. Cloutier-Hurteau, M. Ali, C. Damon, M. Duchemin, S. Egli, J. Ernst, T. Fraissinet-Tachet, F. Kuhar, E. Legname, R. Marmeisse, A. Müller, P. Nikolova, M. Peter, C. Plassard, F. Richard, M. Schloter, M.-A. Selosse, A. Franc & J. Garbaye, 2011: Optimized assay and storage conditions for enzyme activity profiling of ectomycorrhizae. Mycorrhiza (Berlin) 21 (7): 589-600. Schneider, C. A., W. S. Rasband & K. W. Eliceiri, 2012: NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods (New york) 9: 671-675. Schweiger, P. F., H. Rouhier & B. Söderström, 2002: Visualisation of ectomycorrhizal rhizomorph structure using laser scanning confocal microscopy. Mycological Research (Manchester) 106 (3): 349-354. Stempak, J. G. & R. T. Ward, 1964: An improved staining for electron microscopy. The Journal of Cell Biology (New york) 22 (3): 697-701. Vierheilig, H., P. Schweiger & M. Brundrett, 2005: An overview of methods for the detection and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Physiologia Plantarum (Chichester) 125 (4): 393-404. Wallander, H., A. Ekblad, D. L. Godbold, D. Johnson, A. Bahr, P. Baldrijan, R. G. Björk, B. Kieliszewska- -Rokicka, R. Kjøller, H. Kraigher, C. Plassard && M. Rudawska, 2013: Evaluation of methods to estima- te production, biomass and turnover of ectomycorrhizal mycelium in forests soils – A review. Soil Biology and Biochemistry (Amsterdam) 57: 1034-1047. Wilhelm, S., B. Grobler, M. Gluch & H. Heinz, 2014: Confocal laser scanning microscopy principles. Micros- copy from Carl Zeiss. Zeiss. (Jena): 1-30.