Pregledni œlanki - Review Articles
Ciljana dostava uœinkovin v tumorske celice z liposomi
Tumor-specific targeting of drugs by liposomes
Nina Koœevar, Julijana Kristl
POVZETEK: Liposomi so danes predmet intenzivnih raziskav na podroœju zdravljenja rakavih obolenj. Novejøi liposomski sistemi omogoœajo doseganje dobrih terapevtskih uœinkov, ki so posledica zmanjøane toksiœnosti zaradi omejenega porazdeljevanja uœinkovin v zdrava tkiva in poveœanega zadræevanja v tumorjih. Poleg tega predstavljajo tudi velik potencial v genski terapiji. V œlanku so predstavljene novejøe strategije oblikovanja liposomskih sistemov, s katerimi dosegamo selektivno kopiœenje uœinkovin v tumorskih celicah in nadzorovano sproøœanje.
Kljuœne besede: liposomi, tumorske celice, ciljano dostavljanje, ciljano sproøœanje, genska terapija
ABSTRACT: Liposomes have been studied extensively as drug carriers in cancer therapy. Advanced strategies can decrease toxicity and therefore enhance therapeutic effects through limited distribution to healthy tissues and selective accumulation at the diseased site. Liposomes also offer a promising potencial in gene therapy. The article represents some novel developments in liposome-based drug delivery that enhance tumor-specific targeting and controlled drug release.
Key words: liposomes, tumor cells, targeted delivery, targeted release, gene therapy
1  Uvod
Odkrivanje novih uœinkovitejøih protitumornih uœinkovin postaja vodilna smer razvoja farmacevtske znanosti in je posledica naraøœajoœega øtevila rakavih obolenj v svetovnem merilu. Obetavni citostatiœni uœin-ki øtevilnih novih molekul na celiœnih kulturah so le zaœetek zahtevnih raziskav, ki pa se velikokrat konœajo zaradi slabe terapevtske uœinkovitosti oziroma hudih toksiœnih uœinkov kot posledice neselek-tivnega delovanja na zdrava tkiva.
Liposomi so danes predmet intenzivnega raziskovanja na podroœju razvoja novih farmacevtskih oblik za zdravljenje rakavih obolenj. Omogoœajo doseganje optimalnih terapevtskih uœinkov, ki so posledica podaljøanega zadræevanja v centralnem krvnem obtoku, visoke stopnje kopiœenja v tumorskem tkivu ter nadzorovanega sproøœanja uœinkovine s hitrim privzemom v rakave celice.
2  Znaœilnosti liposomov
Liposomi so mikroskopski lipidni vezikli velikosti od 20 nm do 4 µm (slika 1). Sestavljeni so iz enega (enoslojni liposomi) ali veœ lipidnih dvoslojev, ki so urejeni koncentriœno in vsebujejo enako øtevilo prostorov z vodo (veœslojni liposomi). Manjøi enoslojni liposomi dosegajo velikosti 20-100 nm, veœji enoslojni 100-800 nm, veœslojni pa 100-4000 nm. Debelina lipidnega dvosloja je 4 nm (1, 2).
Glavne sestavine membrane liposoma so fosfolipidi (slika 2) in holesterol, ki zmanjøa prepustnost za hidrofilne molekule ter poveœa stabilnost v prisotnosti bioloøkih tekoœin, kot sta kri oziroma plazma (3).
V liposome lahko vgrajujemo tako hidrofilne in amfifilne kot tudi lipofilne uœinkovine (nizkomolekularne uœinkovine, peptide, proteine, RNK, DNK). Hidrofilne se nahajajo v vodnem mediju v osrednjem delu liposoma in ob njegovi membrani. Amfifilne so razporejene ob membrani in se z lipofilnim delom vanjo delno vgradijo. Lipofilne uœinkovine pa so popolnoma vkljuœene v lipidni dvosloj (4).
Liposomi prihajajo v stik s celicami na øtiri naœine: z adsorpcijo na celiœno membrano, zlitjem in izmenjavo lipidnih komponent z njo ter endocitozo kot najpomembnejøo vrsto interakcij (slika 3) (2, 5).
Slika 1: Shematska predstavitev enoslojnega liposoma Figure 1: Schematic representation of an unilamellar liposome
Nina Koœevar, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana
Prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana
202 farm vestn 2005; 56
Ciljana dostava uœinkovin v tumorske celice z liposomi
MAŠCOBNI VERIGI
GLICEROLNI DEL
FOSFATNA SKUPINA
Slika 2: Molekula fosfolipida – najpogosteje uporabljane maøœobne kisline so lavrinska, miristinska, oleinska, palmitinska in stearinska, alkoholi (R) pa etanolamin, glicerol in holin.
Figure 2: A phospholipid molecule – the most used fatty acids are lau-ryl, myristic, oleic, palmitic and stearic acid and alcohols (R) ethanolamine, glycerol and cholin.
3 Liposomi kot dostavni sistemi za protitumorske uœinkovine
Osnovni pogoj za doseganje optimalnih terapevtskih uœinkov je izpolnitev treh pomembnih zahtev: podaljøano zadræevanje liposomov v centralnem krvnem obtoku, visoka stopnja kopiœenja v tumorskem tkivu ter kontrolirano sproøœanje uœinkovine s hitrim privzemom v rakave celice (6).
Razvoj liposomskih sistemov se je zaœel s prvo generacijo, ki jo predstavljajo strukturno najenostavnejøi liposomi (slika 4, preglednica 1). Zanje je znaœilno, da jih retikuloendotelijski sistem zelo hitro odstrani iz krvi (6).
V drugo generacijo uvrøœamo steriœno stabilizirane sisteme, ki imajo membrano prekrito z molekulami hidrofilnega polietilenglikola (PEG; slika 5). Pegilirani lipidi s stopnjo polimerizacije od 30 do 120 navadno predstavljajo 5 molskih odstotkov lipidnega dela. Povrøina liposo-ma je zato moœno hidratirana in zaøœitena pred adsorpcijo na plazemske proteine in opsonizacijo. Razpolovni œas v krvi s tem podaljøamo tudi do 72 ur (6).
Slika 3: Vrste in posledice interakcij med liposomi in celicami: speci-fiœna (a) in nespecifiœna (b) adsorpcija na povrøino celice s poslediœno destabilizacijo membrane liposoma in mikropinocitozo sproøœene uœinkovine (c); zlitje s celiœno membrano (d) in sprostitev uœinkovine direktno v citoplazmo; izmenjava lipidnih molekul s celiœno membrano (e); specifiœna ali nespecifiœna endocitoza (f) in nastanek endosoma s poslediœno zdruæitvijo z lizosomom in razgradnjo vsebine (g) ali z razpadom membrane endosoma (h) in sprostitvijo uœinkovine v citoplazmo.
Figure 3: Liposome-cell interactions and their effects: specific (a) and non-specific (b) adsorption onto the cell surface with subsequent destabilization of liposome membrane and micropinocytosis of the released drug (c); fusion with the cell membrane (d) and drug release directly into the cytoplasm; exchange of lipid molecules with the cell membrane (e); specific or non-specific endocytosis (f) and the formation of an endosome with subsequent fusion with the lysosome and drug degradation (g) or with subsequent endosome membrane degradation (h) and drug release into the cytoplasm.
Preglednica 1: Razdelitev liposomov glede na zapletenost zgradbe lipidnega dvosloja, njihove funkcionalne in bioloøke lastnosti ter stopnja razvoja (6)
Table 1: Liposome classification according to their membrane complexity, functional and biological properties and stage of development (6)
	OPIS	PREDNOST	STOPNJA RAZVOJA
PRVA GENERACIJA	enostavni liposomi: naravni ali sintezni fosfolipidi	Ø toksiœnost, ? uœinkovitost pasivno akumuliranje v tumorju	odobrena pri FDA
DRUGA GENERACIJA	steriœno stabilizirani liposomi: pegilirani lipidi	T t1/2, izboljøano pasivno akumuliranje v tumorju	odobrena pri FDA
TRETJA GENERACIJA	steriœno stabilizirani liposomi z ligandi za ciljano dostavo in kontrolirano sproøœanje	T terapevtski indeks ciljana dostava, sproøœanje	eksperimentalno
farm vestn 2005; 56 203
Pregledni œlanki - Review Articles
Slika 4: Shematska predstavitev enoslojnih liposomov z razliœno stopnjo kompleksnosti lipidnega dvosloja. A: Enostavni liposom z vgrajenima hidrofilno (a) in lipofilno uœinkovino (b). B: Steriœno stabilizirani liposom z molekulami PEG (c), ki øœitijo povrøino liposoma pred opsonizirajoœimi proteini (d). C: Razliœno modificirani steriœno stabilizirani liposom tretje generacije – veriga PEG (e), veriga PEG z lig-andom za ciljano dostavo (f), kationski lipidi (g), ki omogoœajo vgrajevanje DNK (h), fuzogeni lipidi (i), lipidni konjugati, ki omogoœajo cil-jano sproøœanje uœinkovine (j), fuzogeni virusni proteini (k).
Figure 4: Schematic representation of unilamellar liposomes with different degrees of membrane complexity. A: Plain liposome with incorporated hydrophilic (a) and lipophilic drug (b). B: Sterically stabilized liposome with PEG molecules (c), which protect the liposome from opsonizing proteins (d). C: Different modifications of sterically stabilized third generation liposome: PEG chain (e), PEG chain with targeting ligand (f), cationic lipids (g) which enable the incorporation of DNA (h), fusogenic lipids (i), lipid conjugates, which enable site-specific drug release (j), fusogenic viral proteins (k).
Predstavniki tretje generacije so prav tako steriœno stabilizirani pegilirani liposomi, ki pa na svoji povrøini vsebujejo tudi informacijo za ciljano dostavo uœinkovine v tumorsko tkivo oziroma ciljano sproøœanje uœinkovine. Prvi pristop temelji na pripenjanju ligandov, ki so sposobni prepoznati specifiœne tarœne molekule na tumorskih celicah, drugi pa na specifiœnih dejavnikih, ki sproæijo sprostitev uœinkovine. Kombinacija obeh omenjenih pristopov – dostava uœinkovine na specifiœno mesto in sledeœe sproøœanje – znaœilno poveœa koncentracijo uœinkovine v tumorju in s tem bioloøko uporabnost (6, 7).
Dokazano je, da se liposomi v veliki meri kopiœijo v tumorskem tkivu, kar je posledica dobro prepustnih æil in odsotnosti limfnega sistema (6). Velikost por æilnih sten v tumorskem tkivu se giblje v obmoœju 100-780 nm, medtem ko znaøa v normalnem oæilju manj kot 6 nm.
3.1 Ciljano dostavljanje
Poveœano koliœino protitumorne uœinkovine v rakavem tkivu lahko doseæemo s procesom ciljane dostave. Liposomi na svoji povrøini nosijo ligande (protitelesa ali njihove fragmente, proteine, glikoproteine, ogljikove hidrate), ki prepoznajo tarœni antigen ali receptor na membrani tumorske oziroma endotelijske neovaskularne celice (7, 8, 9).
3.1.1 Ciljanje s protitelesi
S protitelesi prekrite liposome imenujemo tudi imunoliposomi. Protitelesa lahko pripnemo direktno na polarni fosfolipidni del ali na
204 farm vestn 2005; 56
Slika 5: Molekula pegiliranega fosfolipida Figure 5: A pegylated phospholipid molecule
konœni del verige polietilenglikola. Slednji pristop daje ugodnejøe rezultate, saj protitelo laæje doseæe antigen.
Øtevilo na liposom pripetih protiteles odloœa o stopnji vezave na tumorsko celico, poudariti pa je potrebno, da je hkrati sorazmerno z obsegom odstranjevanja veziklov z retikuloendotelijskim sistemom. Optimalno razmerje med dostavo uœinkovine do tumorskega tkiva in øe sprejemljivim poveœanjem privzema v monocite in makrofage doseæemo z vezavo 10-30 molekul protiteles na liposom.
Primeri laboratorijskih raziskav s to vrsto liposomov na æivalih dajejo dobre rezultate. Z imunoliposomi z monoklonskim protitelesom IgG 34A proti glikoproteinskemu receptorju gp112 na pulmonalnih endotelijskih celicah miøi so tako ugotovili, da se æe po 30 minutah veœ kot 50 % odmerka nahaja v pljuœih (7).
V drugi øtudji so uporabljali na pH obœutljive liposome (3.2.1) z dok-sorubicinom, prekrite s protitelesi proti receptorju CD19 na limfomskih celicah B. Miøi, ki so prejemale doksorubicin, so dosegale v primerjavi s kontrolno skupino znaœilno viøje stopnje preæivetja (9).
3.1.2   Ciljanje na integrinski receptor
Nekatere vrste integrinskih receptorjev (aub3 in a5b1) so prekomerno izraæene na neovaskularnih celicah tumorjev, ki nastajajo v procesu tumorske angiogeneze (10). Za vezavo peptidnega liganda na te inte-grine je kljuœnega pomena njegovo aminokislinsko zaporedje Arg-Gly-Asp (sekvenca RGD). Z liposomi, ki imajo na terminalnem poli-etilenglikolnem delu vezano zaporedje RGD, doseæemo znaœilno veœjo protitumorno aktivnost (7).
3.1.3   Ciljanje na folatni receptor
Folna kislina je vitaminska substanca, ki jo celice transportirajo v svojo notranjost preko folatnega membranskega prenaøalca ali folatnega receptorja; prvi se nahaja praktiœno v vseh normalnih celicah, drugi pa na endotelijskih celicah, aktiviranih makrofagih in rakavih celicah. Prekomerna ekspresija folatnega receptorja na hitro deleœih se tumorskih celicah predstavlja mehanizem, ki ga izkoriøœamo za ciljano dostavo liposomov do tumorja – prekrijemo jih s folatnimi molekulami.
V eksperimentih in vitro na celiœnih linijah HeLa in KB so uporabljali liposome z doksorubicinom, prekrite s folatom. Raziskovalci so dokazali znaœilno poveœan privzem uœinkovine, poleg tega pa so nakazali tudi moænost, da se s takønim naœinom dostave uœinkovine izognemo rezistenci (7).
Ciljana dostava uœinkovin v tumorske celice z liposomi
Omeniti moramo tudi naraøœajoœe zanimanje za nove specifiœne pep-tidne ligande, pridobljene z metodami bakteriofagnega prikaza. Gre za posebne proteine, ki so sposobni penetrirati v tumorske celice in v pogojih in vivo æe dajejo zelo obetavne rezultate (11).
3.2  Ciljano sproøœanje
Z liposomi, pri katerih akumuliranje v tumorju doseæemo le s ciljanim dostavljanjem, niso dosegli znaœilno boljøe terapevtske uœinkovitosti v primerjavi z enostavnimi pegiliranimi liposomi. Razlog leæi v lizosom-ski razgradnji, do katere pride po vstopu liposoma v rakavo celico. Da bi se liposom razgradnji izognil, bi moral iz endosoma takoj difundirati oziroma hitro sprostiti uœinkovino v citoplazmo.
Raziskovalci so razvili kar nekaj pristopov za doseganje ciljanega sproøœanja v tumorskih tkivih, ki so predstavljeni v nadaljevanju (7).
3.2.1    S spremembo pH-ja povzroœeno ciljano sproøœanje
Prvotna ideja o razpadu v krvnem obtoku sicer stabilnih liposomov in sprostitvi uœinkovine v metabolno aktivnem tumorskem tkivu (pH pribliæno 6,5) ni dala æelenih rezultatov. Priprava liposomov, ki bi prepoznavali tako majhne razlike pH-ja, namreœ s tehnoloøkega vidika ni izvedljiva. Raziskovalci so se zato osredotoœili na zelo kislo okolje v endosomih in lizosomih, kjer pH pade pod 5. Liposomi, ki omogoœajo tak pristop, imajo posebno sposobnost, da se ob spremembi pH-ja zlijejo z membrano endosoma ali lizosoma (fuzogeni liposomi) Uœinkovina se pri tem sprosti v celiœno citoplazmo. V raziskovalnih krogih ta pristop v kombinaciji s ciljano dostavo øtejejo za eno izmed najobetavnejøih moænosti uœinkovite protitumorne terapije.
3.2.2    S svetlobo povzroœeno ciljano sproøœanje
Fotosenzitivnost liposomov doseæemo z vgraditvijo fosfolipidnih molekul, ki po fotoekscitaciji z vidno ali UV-svetlobo izomerizirajo, razpadejo ali polimerizirajo. Ti procesi povzroœijo spremembe v strukturi ipidne membrane (izomerizacija cis-trans, hidroliza ali premreæenje ipidov), ki postane prepustna zaradi nastalih defektov in sprosti uœinkovino. Te metode øe vedno razvijajo le na eksperimentalnem nivoju in njihova uœinkovitost in vivoni dokazana. Veliko pomanjkljivost predstavlja tudi dejstvo, da predpostavljajo lokalizacijo tumorja, kar je v realnosti le redko primer, saj veœina rakavih bolnikov umre zaradi metastazne razøiritve bolezni
3.2.3    S toploto povzroœeno ciljano sproøœanje
Tudi ta naœin je omejen na lokalizirane tumorje, ki morajo biti viru toplote dobro dostopni. Zaenkrat ga uporabljamo le za zdravljenje povrøinskih tumorjev, ki jih ne moremo odstraniti kirurøko.
Nasprotno pa ta naœin v primerjavi z drugimi naœini ciljanega sproøœanja prinaøa pomembne prednosti. Zaradi poviøane temperature na mestu tumorja prihaja do kopiœenja liposomov v tkivu, ki je posledica poveœane prekrvavitve in poveœane æilne permeabilnosti Dokazano je celo, da je hipertermija æe sama po sebi citotoksiœna.
Termosenzibilni liposomi morajo izkazovati dve pomembni lastnosti fazni prehod mora biti le rahlo viøji od fizioloøke telesne temperature, hkrati pa mora obsegati zelo ozko temperaturno obmoœje. Uœinkovini s tem omogoœimo, da se po spremembi integritete membrane ob temperaturi faznega prehoda hitro in popolnoma sprosti
3.2.4 Z encimi povzroœeno ciljano sproøœanje
V  rakavih tkivih je zaradi poveœanega metabolizma veœje izraæanje doloœenih vrst encimov. To lastnost izkoriøœamo pri pripravi liposo-mov, sestavljenih iz lipidnih konjugatov, ki so obœutljivi na celiœne pro-teaze. Pod vplivom teh encimov pride do cepitve konjugatov, iz katerih nastanejo fuzogeni lipidi in povzroœijo zlitje liposoma z membrano endogenega vezikla.
V  literaturi najdemo øe øtevilne metode. Uporaba alkalne fosfataze temelji na vgraditvi fosfoholesterola v lipidni dvosloj, kar vodi do odcepitve fosfatne skupine iz holesterola in hitre destabilizacije lipo-soma. Fosfolipaza A2 cepi fosfolipidne molekule, zaradi œesar pride do razpada liposomov in sprostitve uœinkovine. Prouœujejo tudi primernost transglutaminaze, sfingomielinaze in fosfolipaze C.
4 Liposomi v genski terapiji rakavih obolenj
Osnovni cilj genske terapije je uspeøen vnos genskega materiala v tarœno tkivo. Genska terapija rakavih celic posega v procese ekspresije tumorskih supresorskih genov, ki inducirajo apoptozo, in onkogenov, ki sodelujejo pri proliferaciji. Z geni za citokine pa se vpleta tudi v procese imunskega sistema.
Sistemi za dostavo DNK do celic so bioloøki (virusni) in nebioloøki (kationski polimeri, kationski peptidi in kationski lipidi). Liposomi iz kationskih lipidov z vgrajenim genetskim materialom se imenujejo tudi lipopleksi ali genosomi in so za razliko od klasiœnih liposomov, katerih membrana je nevtralna ali negativna, pozitivno nabiti (12).
Tipiœen primer kationskega lipida, ki ga pogosto uporabljamo, je DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilaminopropan; slika 6). V vodnem okolju se negativno nabita DNK najprej razporedi tik ob zunanji, pozitivno nabiti povrøini membrane liposoma. Zaradi elektrostatskih interakcij med molekulami DNK in lipidi zaœne nato prihajati do agregacije in zlivanja liposomov, pri œemer se DNK vgradi v njihovo notranjost. Liposomi, ki nastanejo, so veœslojne oblike (12, 13).
Glavna omejitev uporabnosti liposomov iz kationskih lipidov je njihova toksiœnost. Kot pozitivno nabiti delci inducirajo agregacijo fizioloøko prisotnih makromolekul in celic v krvi (agregacija trombocitov, plazemskih proteinov), kar lahko povzroœi hemolizo (2).
Slika 6: Molekula kationskega lipida DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetil-aminopropan)
Figure 6: The cationic lipid DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammoni-umpropane).
farm vestn 2005; 56
Pregledni œlanki - Review Articles
Ena od uspeønejøih smeri razvoja liposomov na podroœju dostave genov so virosomi. Gre za kationske liposome, ki imajo v membrano vgrajene ali nanjo pripete fuzogene proteine virusne ovojnice (14). Po vezavi virosomov na celico pride do fuzije z membrano in direktne sprostitve DNK v citoplazmo, s œimer se izognemo razgradnji uœinkovine v endosomih in lizosomih. Zlitje z membrano se v primerjavi s klasiœnimi liposomi iz kationskih lipidov konœa veliko hitreje (15).
5  Sklep
Liposomi so danes eni izmed najbolj prouœevanih dostavnih sistemov za zdravljenje rakavih obolenj. Na sploøno niso toksiœni niti imunogeni in so kompatibilni s øtevilnimi citostatiki. Ker je uœinkovina ujeta v njihovi notranjosti, predstavljajo dobro zaøœito pred kemijsko in metabol-no razgradnjo po injiciranju v krvni obtok. Toksiœnost je moœno zmanj-øana zaradi omejene porazdelitve citostatika v zdrava tkiva, uœinkovi-tost pa je veœja zaradi podaljøanega zadræevanja v tumorjih. Te lastnosti so posledica njihove kompleksnosti – tako na nivoju zgradbe kot mehanizmov za ciljano dostavo in ciljano sproøœanje – ki se nenazadnje kaæe v tehnoloøkih omejitvah. Te pa so eden od glavnih razlogov, da je danes za terapevtske namene registriranih le nekaj liposomskih pripravkov. Toda intenzivne raziskave so æe prinesle obetaven napredek, ki ga dokazuje mnoæica predkliniœnih in kliniœnih raziskav. Æe v bliænji prihodnosti lahko zato na træiøœu priœakujemo kar nekaj novih pripravkov iz liposomov.
6  Literatura
1.    Bauer KH, Frömming KH, Führer C. Mikropathrtikeln, Nanopartikeln, Liposomen. In: Pharmazeutische Technologie, 5 ed. Stuttgart: Gustav Fischer Verlag, 1997: 354-360.
2.    Lasic DD. Liposomes. In: Liposomes in Gene Delivery, Boca Raton: CRC Press LLC, 1997: 67-112.
3.    Vemuri S, Rhodes CT. Preparation and characterization of liposomes as therapeutic delivery systems: a review. Pharm Acta Helv 1995; 70: 95-111.
4.     El Maghraby GMM, Williams AC, Barry BW. Drug interaction and location in liposomes: correlation with polar surface areas. Int J Pharm 2005; 292: 179-185.
5.    Torchillin VP. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nat Rev Drug Discov 2005; 4: 145-160.
6.    Mayer LD. Future developments in the selectivity of anticancer agents: Drug delivery and molecular strategies. Cancer Metast Rev 1998; 17: 211-218.
7.    Andresen TL, Jensen SS, Jørgensen K. Advanced strategies in liposomal cancer therapy: Problems and prospects of active and tumor specific drug release. Prog Lipid Res 2005; 44: 68-97.
8.    Simões S, Moreira JN, Fonseca C et al. On the formulation of pH-sensitive liposomes with long circulation times. Adv Drug Deliv Rev 2004; 56: 947-965.
9.    Sapra P, Allen TM. Ligand-targeted liposomal anticancer drugs. Prog Lipid Res 2003; 42: 439-462.
10.  Xiong XB, Huang Y, Lu WL et al. Enhanced intracellular delivery and improved antitumor efficacy of doxorubicin by sterically stabilized liposomes modified with a sinthetic RGD mimetic. J Control Release 2005 (v tisku).
11.  Marcucci F, Lefoulon F. Active targeting with particulate drug carriers in tumor therapy: fundamentals and recent progress. Drug Disc Today 2004; 9 (5): 219-228.
12.  El-Aneed A. An overview of current delivery systems in cancer gene therapy. J Control Release 2004; 94: 1-14.
13.  Zhdanov RI, Podobed OV, Vlassov VV. Cationic lipid-DNA complexes – lipoplexes – for gene transfer and therapy. Bioelectrochemistry 2002; 58: 53-64.
14.  Felnerova D, Viret JF, Glück R et al. Liposomes and virosomes as delivery systems for antigens, nucleic acids and drugs. Curr Opin Biotech 2004; 15: 518-529.
15.  Kaneda Y. Virosomes: evolution of the liposome as a targeted drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev 2000; 43: 197-205.
farm vestn 2005; 56