ERK'2022, Portorož, 428-431 428 Genska elektrotransfekcija na komercialno dostopnih poroznih insertih Tina Vindiš, Anja Blažič, Tjaša Potočnik, Shaurya Sachdev, Lea Rems 1 Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko, Tržaška cesta 25, Ljubljana, Slovenija E-pošta: tina.vindis3@gmail.com Gene electrotransfer on the commercial porous inserts Abstract. Electroporation is a technique where the per- meability of the cell membrane is increased by exposing biological cells to pulsed electric field, allowing thera- peutic molecules to be introduced into the cell. Delivery of genetic material into cells using electroporation, known as Gene Electrotransfer (GET), is crucial for gene therapy and gene editing. The disadvantage of conven- tional GET is the highly permeabilized cell membrane, which can cause severe cell damage often leading to cell death. By localizing electric field over a small membrane area using nanochannels, nanostraws and nanopores, it is possible to improve GET efficiency while providing greater cell survival and better control over gene expres- sion. The disadvantages of such nanofabricated devices are that they are not widely available and require exper- tise in nanofabrication and access to cleanroom. It has recently been shown that highly efficient electrotransfer of plasmids can be achieved using commercial polycar- bonate membranes with 0.1 μm diameter nanopores. In this study, we tested whether similar transfection effi- ciency can be achieved using membranes with larger pores (0.4 μm pore diameter) which are commercially available in the form of cell culture inserts. We first de- termined the parameters that would lead to successful gene transfection with numerical models and then per- formed experiments on mammalian cells. 1 Uvod Eden prvih konceptov, ki temelji na nanostrukturni geo- metriji v namen zmanjšanja poškodbe celic in povečanja nadzora nad procesom dostave genskega materiala v ce- lico predstavlja nanokanal, ki povezuje dva mikrokanala [1]. Celico namestimo v en mikrokanal, v drugega pa raz- topino s plazmidno DNK, oziroma drugimi molekulami, ki jih želimo prenesti preko nanokanala v celico. Ob do- vedenem napetostnem pulzu se znotraj nanokanala, ki predstavlja najvišjo upornost sistema, električno polje močno poveča, kar omogoči elektroforetični prenos na- bitih molekul iz enega mikrokanala v celico v nasprot- nem mikrokanalu. Spreminjanje trajanja dovedenih pul- zov omogoča nadzor nad količino vnosa molekul v ce- lico. Kasnejši sorodni koncepti vključujejo nanofabrici- rane strukture, kot so nanoslamice [2] in porozne mem- brane, na katerih raste celična kultura [3]. Omejitev vseh teh konceptov je, da zahtevajo strokovno znanje o nano- fabrikaciji in dostop do čistih prostorov (angl. clean- room). Nedavno so raziskovalci [4], [5] predlagali sistem, ki temelji na držalu iz polidimetilsiloksana (PDMS) s ko- mercialno dostopno polikarbonatno membrano, ki vse- buje pore s premerom 0,1-0,2 μm in se navadno uporablja za filtracijo vode. Z električnimi pulzi so omogočili do- stavo učinkovin v obliki nukleinskih kislin, proteinov in ribonukleoproteinov v celice pritrjene na membrano. S svojim sistemom so dosegli visoko učinkovito transfek- cijo (do 80 %) brez znatnega vpliva na preživetje celic (<5 % mrtvih celic) [4]. Njihova študija nas je navdihnila, da smo preizkusili, ali je mogoče podoben uspeh doseči s poroznimi membranami vgrajenimi v komercialne in- serte, ki se uporabljajo predvsem za raziskave transporta zdravil prek celičnega monosloja, invazije in migracije celic ter kemotaksijo [6]. Predvidene prednosti insertov za GET so, da so njihove membrane že predhodno pri- pravljene za optimalno pritrditev celic in ne potrebujejo posebne opreme za sestavljanje. Izbrali smo cenovno do- stopne inserte s poroznimi membranami iz politetilena te- raftalata (PET), ki omogočajo tudi opazovanje celic in vnosa molekul z invertiranim mikroskopom. Najprej smo z numeričnimi modeli določili parame- tre, ki omogočajo učinkovito gensko elektrotransfekcijo in nato poskuse naredili na celicah sesalcev. 2 Materiali in metode 2.1 Numerično modeliranje V programskem okolju Comsol Multiphysics 6.0, ki te- melji na metodi končnih elementov, smo naredili dva modela, kjer smo najprej modelirali elektroporacijo ce- lice na majhnem delu porozne membrane in nato model celotnega sistema z insertom s porozno membrano, pre- vodnim medijem in parom elektrod (Slika 1). Porazdeli- tev električnega potenciala je bila določena z rešitvijo enačbe −∇ ∙ [(𝜎 𝑖 ,𝑒 + 𝜀 𝑖 ,𝑒 𝜕 𝜕𝑡 )∇𝑉 𝑖 ,𝑒 ] = 0 ( 1 ) kjer 𝜎 𝑖 ,𝑒 in 𝜀 𝑖 ,𝑒 predstavljata prevodnost in dielektričnost znotrajceličnega (indeks i) in zunajceličnega (indeks e) medija. Celična membrana je bila modelirana kot tanka plast z dano prevodnostjo in dielektričnostjo. Povečanje prepustnosti celične membrane zaradi elektroporacije je določeno z enačbo [7] 𝑑𝑁 𝑑𝑡 = 𝛼 (𝑉 𝑚 𝑉 𝑒𝑝 ⁄ ) 2 (1 − 𝑁 𝑁 0 𝑒 −𝑞 ( 𝑉 𝑚 𝑉 𝑒𝑝 ) 2 ) ( 2 ) kjer N prestavlja gostoto por v celični membrani, ki na- stane zaradi električnega polja, 𝑁 0 predstavlja gostoto 429 por pred dovedenim pulzom, α, 𝑞 in 𝑉 𝑒𝑝 pa opisujejo ka- rakteristiko elektroporacije. Porozna membrana je bila prav tako modelirana kot tanka plast z dano efektivno prevodnostjo, ki je funkcija poroznosti in velikosti por v membrani. 𝐺 𝑃𝐸𝑇 ,𝑒𝑓𝑓 = 𝜌 𝑃𝐸𝑇 2𝜎 𝑒 𝜋 (𝑟 𝑝 ) 2 𝜋 𝑟 𝑝 + 2𝑑 𝑃𝐸𝑇 ( 3 ) Parametre modelov predstavlja Tabela 1. Tabela 1. Parametri modela Parameter Simbol Vrednost Prevodnost zunajceličnega medija [izmerjeno 1 ] e 1,5 S/m Prevodnost znotrajcelič- nega medija [6] i 0,5 S/m Prevodnost celične mem. [6] Gcm 2 S/m 2 Kapacitivnost celične membrane [6] Ccm 0,01 F/m 2 Debelina celične mem- brane [5] dcm 5 nm Radij elektropore [5] rp 1 nm Prevodnost elektropore [5] p (σ e−σ i)/ln( 𝜎 𝑒 𝜎 𝑖 ) Elektroporacijska kon- stanta [6] q 2,46 Parameter elektroporacije [6]  10 9 m -2 s -1 Karakteristična napetost elektroporacije [6] Vep 0,25 V Ravnotežna gostota por [6] N0 1,5·10 9 m -2 Debelina porozne mem. [8] dPET 10 mm Poroznost porozne mem. [8] PET 2,0·10 6 cm -2 Efektivna prevodnost po- rozne mem. [enačba ( 3 )] GPET,eff 366 S/m 2 1 Prevodnost LCIS izmerjena s konduktometrom Geometrijo modela celice na porozni membrani obdani z prevodnima medijema predstavlja Slika 1a. Zgornji in spodnji ploskvi je bil pripisan električni potencial v ča- sovni obliki 10 ms pulza. PET material je bil definiran kot idealni izolator. Z modelom smo raziskali, kako veli- kost por v porozni membrani in napetost, ki se vzpostavi na porozni membrani, vplivata na celično elektropora- cijo. Celotni eksperimentalni sistem je sestavljen iz jamice mikrotitrske plošče z medijem, v katero je potopljen in- sert s porozno membrano na kateri raste celična kultura. Uporabili smo žične elektrode iz zlitine Pt/Ir s premerom 0.5 mm in spodnjo elektrodo oblikovali v spiralo, zgornjo elektrodo pa v obliko črke L. Numerični model prikazuje Slika 1b. 2.2 Eksperimentalno delo V vsak insert (Falcon #353095) smo nasadili 8000 ova- rijskih celic kitajskega hrčka (CHO) in jih gojili v 25 mm 2 posodicah v gojišču HAM's F12 (HAM's Nutritieon Mix, Gibco) dva dni v vlažnem ozračju pri 37ºC in 5% CO 2. Na dan poskusov je bil posamezni insert nameščen v jamico pripadajoče mikrotitrske plošče na dvignjene zavihke, ki omogočajo dobro definirano razdaljo med dnom mikrotitrske plošče in insertom. V jamici se je na- hajala raztopina plazmidne DNK (pEGFP-N1, volumna 1 ml s koncentracijo 100 g/ml ali volumna 0.4 ml s kon- centracijo 500 g/ml), ki kodira zeleni fluorescentni pro- tein (eGFP). Zgornja elektroda je bila pozitivna za prenos negativno nabitega plazmida iz spodnjega medija skozi pore porozne membrane v celice in zgornji medij. Za elektroporacijo smo uporabili elektroporator ELECTRO cell B10 (Lecroy Biotech). Dovedli smo od 1 do 12 pul- zov dolžine 10 ms pri napetostih med 10 V in 40 V in ponavljalni frekvenci 1 Hz. Pri vsakem nizu poskusov smo imeli kontrolni insert, ki je bil le potopljen v plazmid za 1 min. Ostali inserti so bili potopljeni v raztopino s plazmidom in po dovedenem pulzu ostali v njej še 1 min. Insert smo nato prenesli v 800 l svežega gojišča v mi- krotitrsko ploščo (Falcon #353504) in postavili v inkuba- tor za 24 ur. Nato smo določili delež transfeciranih celic in preživetje celic. Delež transfeciranih celic smo določili s pretočnim ci- tometrom Attune NxT. Celice v insertih so bile najprej odstranjene s podlage s tripsinizacijo, celična suspenzija pa je bila nato centrifugirana s centrifugo Sigma 3-16 PK (5 minut na 4ºC in 200g) in resuspendirana v fosfatnem pufru (PBS). Za vzbujanje fluorescence eGFP je bila iz- brana valovna dolžina 488 nm, oddana fluorescenca pa je bila spuščena skozi 530/30 nm filter. Za vsako meritev smo zabeležili nad 8000 dogodkov. Delež preživelih celic je bil določen z metabolnim testom CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proli- feration Assay (MTS, Promega). 24 ur po transfekciji je bil celicam v insertih dodanih 40 l MTS reagenta na 200 l gojišča. Po 4 urah inkubacije na 37C je bilo 120 l gojišča z MTS prenešenega v ploščo s 96 jami- cami, absorbanca vzorcev pa prebrana pri 490 nm s spek- trofotometrom Infinite M200 (Tecan). 3 Rezultati in razprava 3.1 Rezultati numeričnega modela celice na porozni membrani Z numeričnim modelom smo potrdili, da se znotraj por poroznih membran električno polje ojači (Slika 2a). Pre- učili smo porozne membrane z velikostjo por 0.4 m, 1,0 m in 3,0 m. Ko dovedemo električni pulz, lokalizirano električno polje doseže dele celične membrane, ki so nad porami porozne membrane, in povzroči elektroporacijo, ki v celični membrani ustvari "elektropore". 430 Pri uporabi 0,4 m por se elektroporacija pojavi pri napetosti porozne membrane ~5 V in ostane lokalizirana na bližino por porozne membrane do ~15 V. Pri uporabi membran z 1,0 m in 3,0 m porami pride do elektropo- racije pri ~3 V, vendar je že pri 7,5 V (3,0 m) poriran 80 % in pri 15 V (1,0 m) 50 % delež celične membrane (Slika 2b). Če je elektroporiran prevelik del celične membrane, lahko privede do znatnih poškodb celice, zato smo za eksperimente in doseganje lokalizirane elektroporacije membrane s premerom por 3,0 µm izključili iz nadaljnje študije, v članku pa predstavimo le rezultate 0,4 µm po- roznih membran, ki so se izkazale za najboljše. Slika 2. a) 2-D prerez porazdelitve električnega polja v ustalje- nem stanju in b) delež elektroporirane celične membrane pri različnih napetostih na porozni membrani. 3.2 Rezultati numeričnega modela sistema in- serta s porozno membrano Preverili smo porazdelitev električnega potenciala po ce- lotnem sistemu in določili, kakšna naj bo dovedena napetost prek elektrod, da bomo zagotovili želeno nape- tost na porozni membrani na podlagi numeričnih izraču- nov modela celice na porozni membrani. Dovedli smo pulz dolžine 10 ms pri napetosti 100 V in opazovali po- razdelitev električnega polja pri spreminjanju konfigura- cije in položaja elektrod. Ker je sistem linearen smo lahko preračunali, kakšno dovedeno napetost potrebu- jemo. Če smo zunanjo elektrodo le potopili v zunanji medij in dovedli napetost, smo dobili najslabše rezultate, pri ka- terih je napetost na porozni membrani nehomogena in va- riira med 20 % in 40 % dovedene napetosti. Z zunanjo krožno elektrodo smo dosegli boljše rezultate, vendar je napetost na porozni membrani variirala med 30 % in 50 % dovedene napetosti. S spiralno zunanjo elektrodo pa dosežemo homogenost čez celotno porozno membrano, kjer se potencial giblje nad 50 % dovedene napetosti (Slika 3). Število zavojev spiralne elektrode ne vpliva bistveno na porazdelitev potenciala, rezultati pa so po- dobni, kot če bi uporabili ploščato zunanjo elektrodo. Slika 3. Konfiguracija notranje L elektrode in zunanje (I) ravne, (II) krožne in (III) spiralne elektrode z električnim potencialom celotnega sistema in napetosti na porozni membrani UPET. 3.3 Eksperimenti s končnim sestavom Pri končnem eksperimentalnem sestavu so bile žične el- ektrode z inštalacijsko sponko pritrjene na 24-jamično ploščo (Slika 1c). Spodnja elektroda je bila spiralna in se Slika 1 a) Numerični model sestavlja cilinder, ki predstavlja insert, porozna membrana na dnu pa je definirana z robnim pogojem. Znotraj in zunaj cilindra se nahaja prevodni medij. Razdalja med dnom in insertom znaša 0,8 mm, določena pa je na podlagi podatkov pripadajoče 24-jamične plošče. Spiralna elektroda se nahaja v zunanjem mediju, znotraj cilindra pa je notranja L elektroda. b) Model je sestavljen iz porozne membrane, medijema na obeh straneh in celice. Pore porozne mem- brane so razporejene v nizu, ki posnema povprečno poroznost poroznih membran, uporabljenih pri poskusih. c) Realni sestav z elektrodama insertom znotraj mikrotitrske plošče in elektrodama povezanima z elektroporatorjem. 431 pritiskala ob dno, zgornja pa se je nahajala približno 2 mm do 3 mm nad porozno membrano. Insert je bil postavljen na dvignjene zavihke pripradajoče plošče in s tem 0,8 mm oddaljen od dna. 3.3.1 Genska elektrotransfekcija Celice priraščene na porozno membrano inserta smo iz- postavili bodisi enemu 10 ms pulzu napetosti 10 V, 20 V ali 40 V bodisi več pulzom (4, 8 ali 12) napetosti 20 V. Slika 4. Delež transfeciranih celic in test viabilnosti Pri enem dovedenem pulzu je bil delež transfeciranih celic najvišji pri 20 V in je dosegel 12 %. Z večanjem števila pulzov pa se je povečal tudi delež transfeciranih celic in je segel čez 30 %. Preživetje celic po elektropo- raciji in genski transfekciji se je gibalo okoli 80 % pri vseh poskusih (Slika 4). S povečanjem koncentracije pla- zmida smo pri 4 dovedenih pulzih 20 V dosegli 44 % transfekcijo (Slika 5). Slika 5. Primerjava deleža transfeciranih celic pri 100 ug/ml in 500 ug/ml koncentraciji plazmida Dobljeni rezultati so sicer slabši od študije Cao et al (~80 % transfekcija)[4], ki nas je navdihnila za izvedbo poskusov s komercialno dostopnimi poroznimi membra- nami. Slabši rezultati so lahko posledica večjih por pri naši študiji (0,4 m), zaradi katerih lahko med elektropo- racijo skozi pore porozne membrane prehaja več škodlji- vih snovi, ki so produkti elektrokemične reakcije na stiku kovinske elektrode z elektrolitom. Vendar pa neposredna primerjava naših rezultatov z rezultati Cao et al. [4] ni možna, saj so slednji opravili poskuse na drugih celičnih linijah s poroznimi membranami, ki imajo poleg manjših por tudi večjo poroznost ter so narejene iz polikarbonata. Rezultati naše študije so primerljivi z rezultati GET pri klasični elektroporaciji (~40 % transfekcija)[9]. Ena od prednosti uporabe poroznega inserta je uporaba nižje napetostnih pulzov, zaradi česar lahko namesto dragih elektroporatorjev uporabimo preprosto vezje. Porozne membrane so prav tako komercialno in stroškovno do- stopne vsakemu laboratoriju, za sestavo eksperimental- nega sistema pa ne potrebujemo nikakršne posebne opreme in prostorov. Rezultati naše študije lahko tudi na- kazujejo na možnost izdelave manjših por v že obstoječe inserte in s tem stroškovno ugodno gensko elektrotrans- fekcijo. 4 Zahvala Delo je podprto s strani Evropske komisije (projekt št. 893077 in 101038051) in ARRS (projekt št. J2-2503 in I0-0022 ter financiranje MR P2-0249). 5 Reference [1] P. E. Boukany et al., “Nanochannel electroporation deli- vers precise amounts of biomolecules into living cells,” Nat. Nanotechnol., vol. 6, no. 11, pp. 747–754, Nov. 2011, doi: 10.1038/nnano.2011.164. [2] Y. Cao et al., “Universal intracellular biomolecule deli- very with precise dosage control,” Sci. Adv., vol. 4, no. 10, p. eaat8131, Oct. 2018, doi: 10.1126/sciadv.aat8131. [3] L. Chang et al., “3D nanochannel electroporation for high- throughput cell transfection with high uniformity and do- sage control,” Nanoscale, vol. 8, no. 1, pp. 243–252, 2016, doi: 10.1039/C5NR03187G. [4] Y. Cao et al., “Nontoxic nanopore electroporation for effective intracellular delivery of biological macromo- lecules,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 116, no. 16, pp. 7899–7904, Apr. 2019, doi: 10.1073/pnas.1818553116. [5] P. Mukherjee, S. S. P. Nathamgari, J. A. Kessler, and H. D. Espinosa, “Combined Numerical and Experimental In- vestigation of Localized Electroporation-Based Cell Transfection and Sampling,” ACS Nano, vol. 12, no. 12, pp. 12118–12128, Dec. 2018, doi: 10.1021/acsnano.8b05473. [6] T. Vindiš, A. Blažič, D. Khayyat, T. Potočnik, S. Sachdev, and L. Rems, “Gene Electrotransfer into Mammalian Cells Using Commercial Cell Culture Inserts with Porous Substrate,” ENGINEERING, preprint, Jul. 2022. doi: 10.20944/preprints202207.0272.v1. [7] K. A. DeBruin and W. Krassowska, “Modeling Electro- poration in a Single Cell. I. Effects of Field Strength and Rest Potential,” Biophys. J., vol. 77, no. 3, pp. 1213–1224, Sep. 1999, doi: 10.1016/S0006-3495(99)76973-0. [8] Corning Incorporated, “Permeable Supports Selection Guide.” Accessed: Jul. 17, 2022. [Online]. Available: https://www.dutscher.com/data/pdf_guides/en/Guide_se- lection_inserts_culture_transwell_falcon.pdf [9] T. Potočnik, D. Miklavčič, and A. Maček Lebar, “Gene transfer by electroporation with high frequency bipolar pulses in vitro,” Bioelectrochemistry, vol. 140, p. 107803, Aug. 2021, doi: 10.1016/j.bioelechem.2021.107803.