Zoran Žlabravec HERPESVIRUSI PRI IZBRANIH SKUPINAH PROSTOŽIVEČIH PTIC Doktorska disertacija Ljubljana, 2022 UDK 636.09:578.8:577.21:616-036.2(497.4)(043.3) Zoran Žlabravec, dr. vet. med. HERPESVIRUSI PRI IZBRANIH SKUPINAH PROSTOŽIVEČIH PTIC Doktorska disertacija HERPESVIRUSES IN SELECTED GROUPS OF FREE-LIVING BIRDS Doctoral dissertation Ljubljana, 2022 Zoran Žlabravec Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic Delo je bilo opravljeno na Inštitutu za perutnino, ptice, male sesalce in plazilce Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani. Javni zagovor je bil opravljen: ___________________________. Mentor: izr. prof. dr. Joško Račnik Somentor: doc. dr. Al Vrezec Izjava o delu: Izjavljam, da je doktorska disertacija rezultat lastnega raziskovalnega dela, da so rezultati korektno navedeni in nisem kršil avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih. Izjavljam, da je elektronski izvod identičen tiskanemu. Člani strokovne komisije za oceno in zagovor: predsednica: prof. dr. Alenka Dovč (Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta) članica: akad. prof. dr. Tatjana Avšič Županc (Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta) član: prof. dr. Davorin Tome (Nacionalni inštitut za biologijo) Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic. 4 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija IZVLEČEK Ključne besede: bolezni ptic – virologija; Alphaherpesvirinae; herpesvirusne infekcije – diagnostika – genetika – klasifikacija; verižna reakcija s polimerazo – metoda; analiza zaporedja DNA; filogeneza; sove Ptice so gostitelji številnih herpesvirusov (HV). Okužba pri njih lahko ostane neopažena ali povzroči (letalno) bolezen. Za razliko od HV pri perutnini so podatki o okužbi, prisotnosti in vplivu HV na prostoživeče ptice skopi. Celotni seznam naravnih gostiteljev HV pri pticah ni poznan. Vzorce organov, orofaringealnih in/ali kloakalnih brisov 1212 živih in mrtvih prostoživečih ptic iz 15 redov smo pregledali na prisotnost odseka gena DNA polimeraze HV. HV smo dokazali v vzorcih organov osmih od 55 (14,5 %) pregledanih poginjenih sov, v brisih kloake štirih od 525 (0,7 %) pregledanih prostoživečih pevk, odlovljenih med jesensko selitvijo, v orofaringealnih in/ali kloakalnih brisih 34 od 447 (7,5 %) prostoživečih bolnih, poškodovanih ali oslabelih ptic, ki so potrebovale nujno veterinarsko pomoč in so bile sprejete na Kliniko za ptice, male sesalce in plazilce Veterinarske fakultete, in v orofaringealnih brisih 16 od 170 (9,4 %) živih prostoživečih sov, vzorčenih na območju Krima in Jelovice. HV smo odkrili tako pri poginjenih kot tudi pri živih, klinično zdravih prostoživečih pticah. V gnezdeči populaciji sov nismo ugotovili vpliva HV na produktivnost sov, saj se število jajc in mladičev med okuženimi in neokuženimi gnezdi ni razlikovalo. Filogenetska analiza nukleotidnih zaporedij odseka gena DNA polimeraze HV je pokazala, da se HV, dokazani pri prostoživečih pticah, uvrščajo v poddružino Alphaherpesvirinae in da v populaciji prostoživečih ptic v Sloveniji krožijo različni HV, ki se v večini primerov razlikujejo od že znanih HV, objavljenih v genski banki. Nekateri HV so specifični za gostiteljsko vrsto ptic, medtem ko smo v nekaterih primerih v različnih redovih ptic odkrili zelo podobna oziroma identična nukleotidna zaporedja, kar pomeni, da HV niso vedno omejeni na vrsto ptice. Do prenosa HV bi lahko prišlo s plenjenjem ptičjega plena ali celo s superplenilstvom. Ugotovili smo tudi, da mali glodavci kot plen ne predstavljajo vira okužbe s HV za ptice iz reda sov, sokolov in ujed. Z opravljenimi študijami smo močno razširili seznam dovzetnih gostiteljskih vrst prostoživečih ptic in ugotovili, da je za dokaz HV pri prostoživečih pticah z neznanim statusom okužbe treba odvzeti tako brise orofarinksa kot brise kloake. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 5 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija ABSTRACT Key words: bird diseases – virology; Alphaherpesvirinae; herpesvirus infections – diagnosis – genetics – classification; polymerase chain reaction – methods; sequence analysis, DNA; phylogeny; Strigiformes Birds are hosts of many herpesviruses (HVs), in which the infection can go unnoticed or cause (lethal) disease. In contrast to HV in poultry, data on infection with and the presence and impact of HV in wild birds are limited. In birds, the full list of natural hosts of HV is unknown. Samples of organs and oropharyngeal and/or cloacal swabs of 1,212 live and dead free-living birds from 15 orders were examined for the presence of a fragment of the HV DNA polymerase gene. HV was detected in organ samples in eight out of 55 (14.5%) dead owls, in cloacal swabs in four out of 525 (0.7%) free-living songbirds caught during the autumn migration, in oropharyngeal and/or cloacal swabs in 34 out of 447 (7.5%) free-living birds admitted as wildlife casualties to the Clinic for Birds, Small Mammals, and Reptiles at the Faculty of Veterinary Medicine, and in oropharyngeal swabs in 16 out of 170 (9.4%) live free-living owls sampled on Mount Krim and the Jelovica Plateau. HVs were detected in individuals found dead as well as in live individuals with no clinical signs of illness. Furthermore, no productivity deviances (i.e., in clutch and brood size) were recorded in a breeding population of clinical healthy owls. Phylogenetic analysis of nucleotide sequences of the partial DNA polymerase gene of HVs showed that HVs detected in free-living birds belong to the subfamily Alphaherpesvirinae and that different HVs have been circulating in the population of free-living birds in Slovenia, which in most cases are different from known HV nucleotide sequences published in GenBank. Some HVs are specific to the host bird species, whereas in some cases HVs very similar to identical nucleotide sequences were found in different bird orders, meaning that HVs are not always restricted to bird host species. HV transmission could occur through bird predation or even superpredation. It was also found that small rodents are not a source of HV infections in owls, falcons, and birds of prey. The results of the research greatly expand the list of HV-susceptible host species of free-living birds and show that free-living birds with unknown infection status should be tested with a combination of oropharyngeal and cloacal swabs, which would maximize the probability of HV detection. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 6 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija KAZALO VSEBINE IZVLEČEK ............................................................................................................................... 4 ABSTRACT .............................................................................................................................. 5 KAZALO VSEBINE ................................................................................................................ 6 SEZNAM KRATIC IN OKRAJŠAV ...................................................................................... 7 1 UVOD .................................................................................................................................... 8 1.1 Predstavitev problematike ................................................................................................... 8 1.2 Namen dela in hipoteze ....................................................................................................... 9 2 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA .......................................................................... 11 2.1 Detekcija in filogenetska analiza herpesvirusov pri prostoživečih vrstah sov v Sloveniji .......................................................................................................................... 11 2.2 Detekcija herpesvirusov pri pticah pevkah, odlovljenih v obdobju jesenske selitve v Sloveniji .......................................................................................................................... 20 2.3 Okužba s herpesvirusom v gnezdečih populacijah dveh sobivajočih sov rodu Strix ........ 30 2.4 Detekcija herpesvirusov pri bolnih, oslabelih ali poškodovanih prostoživečih pticah v Sloveniji .......................................................................................................................... 43 3 RAZPRAVA ....................................................................................................................... 55 4 SKLEPI (ZAKLJUČKI) ................................................................................................... 68 5 POVZETEK ....................................................................................................................... 70 6 SUMMARY ........................................................................................................................ 72 7 ZAHVALA ......................................................................................................................... 74 8 LITERATURA ................................................................................................................... 76 9 PRILOGE ........................................................................................................................... 86 Priloga 1: Dovoljenje za objavo članka 2.1 ............................................................................. 86 Priloga 2: Dovoljenje za objavo članka 2.3 ............................................................................. 87 Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 7 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija SEZNAM KRATIC IN OKRAJŠAV kbp kilobazni par DNA deoksiribonukleinska kislina (angl. deoxyribonucleic acid) HV herpesvirus NCBI Nacionalni center za biotehnološke informacije (angl. National Center for Biotechnology Information) PCR verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction) ILT infekciozni laringotraheitis (angl. infectious laryngotracheitis) CoHV herpesvirus golobov (angl. columbid herpesvirus) StHV herpesvirus sov (angl. strigid herpesvirus) FaHV herpesvirus sokolov (angl. falconid herpesvirus) PaHV herpesvirus pevk (angl. passerine herpesvirus) PsHV herpesvirus papig (angl. psittacid herpesvirus) GaHV herpesvirus kokoši (angl. gallid herpesvirus) MeHV herpesvirus puranov (angl. meleagrid herpesvirus) MD Marekova bolezen (angl. Marek's disease) PD bolezen Pacheco (angl. Pacheco's disease) SuHV herpesvirus prašičev (angl. Suid herpesvirus) CMV citomegalovirus (angl. cytomegalovirus) MHV mišji gama herpesvirus (angl. murine gammaherpesvirus) Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 8 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 1 UVOD 1.1 Predstavitev problematike Herpesvirusi (HV) so dokazani pri gostiteljih v skupinah vseh vretenčarjev: ribah, dvoživkah, plazilcih, pticah in sesalcih (1). HV so zunaj organizma razmeroma neobstojni in hitro propadejo, zato je najpogostejši neposreden prenos HV med osebki gostitelja. Virusna DNA polimeraza je ključen encim v litični fazi HV infekcije, ki omogoča replikacijo virusnega genoma (2). Genom predstavlja ena linearna dvojnovijačna molekula DNA v velikosti od 125 do 290 kbp (3) in vsebuje od 32 do 74 % gvanina in citozina (4). Genom kodira več kot 80 različnih strukturnih in nestrukturnih proteinov. Razlike med posameznimi vrstami HV so v organizaciji (zaporedju in orientaciji), velikosti (125–290 kbp) in sestavi (predvsem variacija deleža gvanina in citozina) genoma (3). Skupna lastnost HV je zmožnost prikrite (latentne) in trajne okužbe, kar pomeni, da je okužena žival lahko dosmrtni prikriti nosilec virusa, ki se občasno reaktivira in predstavlja potencialni vir okužbe za druge živali (2). Družina Herpesviridae je razdeljena v tri poddružine: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae in Gammaherpesvirinae (5). Vsi HV, dokazani pri pticah, so trenutno klasificirani v poddružino Alphaherpesvirinae, vendar številni od njih niso popolnoma raziskani in so uvrščeni med neklasificirane viruse znotraj družine Herpesviridae (2). Za viruse iz poddružine Alphaherpesvirinae so značilni širok krog gostiteljev, kratki replikacijski cikli virusa, hitra destrukcija inficiranih celic, hitro širjenje virusa po gostitelju in velikokrat akuten potek bolezni. Poleg tega imajo sposobnost vzpostavitve vseživljenjske latentne okužbe v senzornih in tudi preostalih ganglijih (5). HV iz poddružine Betaherpesvirinae imajo ožji krog gostiteljev, dolg replikacijski cikel in značilno počasno širjenje okužbe po telesu. Latentna ali persistentna okužba se vzpostavi v limforetikularnih celicah, sekretorne žlezah in ledvicah. Okužba največkrat povzroči povečanje določenih celic oziroma citomegalijo. Okužbe ponavadi ne povzročajo kliničnih znakov, edino v primeru, ko se virus zanese v neokuženo populacijo. HV, ki spadajo v poddružino Gammaherpesvirinae, so ponavadi omejeni na gostiteljsko družino ali red. Virusi te poddružine okužijo limfocite B ali limfocite T in lahko povzročijo limfoproliferativne bolezni ter vzpostavijo latentno stanje v limfoidnih tkivih. Pri glavnem gostitelju okužba pogosto povzroči pojav bolezenskih znakov, niso pa izključeni pogini tudi pri drugih gostiteljih (5). HV pri perutnini povzročajo zelo dobro raziskane bolezni, kot sta Marekova bolezen (angl. Marek's disease – MD) in infekciozni laringotraheitis (angl. infectious Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 9 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija laryngotracheitis – ILT), med okrasnimi in sobnimi pticami pri papigah povzročajo bolezen Pacheco (angl. Pacheco's disease – PD) (6, 7). Pri prostoživečih pticah so podatki o okužbi s HV skopi in pri pticah celotnega seznama naravnih gostiteljev HV ni. HV imajo bolj kot kateri koli drugi virusi nagnjenost k prikriti in trajni okužbi. Prehod v produktivno okužbo in pojav bolezni se lahko pojavita ob različnih stresnih dejavnikih, kot so odlov, rokovanje, sprememba okolja, dodajanje novih ptic v jato, poškodbe/travme ter sočasne okužbe z drugimi bolezenski povzročitelji (8). Pri prostoživečih pticah so za bolezni, ki jih povzročajo HV, značilni nespecifični klinični znaki, kot so oslabelost, anoreksija, poliurija, konjuktivitis, rinitis in difteroidni traheitis, v nekaterih primerih tudi nenadni ali povišani pogini (9). Večina opravljenih študij temelji na dokazu HV pri poginjenih pticah (8). Prisotnost HV pri prostoživečih pticah je trenutno najbolj raziskana pri domačih golobih ( Columba livia domestica). Pri njih HV najpogosteje povzroči latentno okužbo, ki ima malo ali nič vpliva na zdravje golobje populacije. Ob pojavu kliničnih znakov imajo golobi znake respiratornega obolenja. Pri poginjenih golobih so opisane fokalne nekroze jeter, vranice, kostnega mozga, požiralnika in nekroze ob področju sapišča (10). Kot je opisano v nekaterih študijah, so okuženi golobi kot plen vir okužbe za prostoživeče plenilske ptice iz reda ujed ( Accipitriformes), sokolov ( Falconiformes) in sov ( Strigiformes). Pri njih so opisani podobni klinični znaki in patološke spremembe kot pri golobih, vendar z višjo intenziteto bolezni in višjo stopnjo smrtnosti (11, 12, 13, 14). Čeprav približno kar polovica vseh vrst ptic spada med ptice pevke ( Passeriformes), je izolacija in karakterizacija HV pri omenjenem redu ptic redko opisana (15, 16) in trenutno ni objavljenih študij o okuženih prostoživečih pticah pevkah v Evropi. Iz literature je razvidno, da večina objavljenih podatkov o HV pri prostoživečih pticah temelji na dokazu prisotnosti virusa pri poginulih pticah, redkejši so opisi detekcije HV pri živih pticah. Poleg tega je število pregledanih osebkov, predvsem znotraj posameznih družin in vrst, skromno. 1.2 Namen dela in hipoteze Namen doktorske disertacije je bil dokazati prisotnost HV pri prostoživečih pticah v Sloveniji in razširiti seznam dovzetnih gostiteljskih vrst prostoživečih ptic. Dokazanim HV smo določili tudi nukleotidna zaporedja DNA polimeraze ter jih primerjali med seboj in z virusnimi sevi iz drugih držav, ki smo jih dobili iz podatkovne zbirke Nacionalnega centra za biotehnološke informacije (angl. National Center for Biotechnology Information – NCBI GenBank). Zanimal Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 10 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija nas je tudi način prenosa HV, vpliv HV na določeno populacijo prostoživečih ptic ter povezava z ekološkimi lastnostmi obravnavanih vrst ptic s HV. Hipoteze 1) Pri prostoživečih pticah v Sloveniji so prisotne okužbe s HV. Ti so genetsko podobni, kakor tudi različni od HV, ki so trenutno objavljeni v genski banki. Z molekularnimi metodami bomo HV dokazali pri novih vrstah ptic, pri katerih do zdaj še niso bili dokazani. 2) Prenos HV poteka tako na horizontalni ravni med plenilci kot tudi s plena na plenilca. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 11 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 2 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA 2.1 Detekcija in filogenetska analiza herpesvirusov pri prostoživečih vrstah sov v Sloveniji Detection and phylogenetic analysis of herpesviruses detected in wild owls in Slovenia Zoran Žlabravec1, Uroš Krapež1, Brigita Slavec1, Al Vrezec2,3, Olga Zorman Rojs1, Jožko Račnik1 1 Inštitut za perutnino, ptice, male sesalce in plazilce, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani 2 Kustodiat za vretenčarje, Prirodoslovni muzej Slovenije 3 Oddelek za raziskavo organizmov in ekosistemov, Nacionalni inštitut za biologijo Avian diseases, 2018, 62(4), 397-403, doi: 10.1637/11899-051418-Reg.1 Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 12 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Izvleček HV smo z metodo verižne reakcije s polimerazo (angl. polymerase chain reaction – PCR) dokazali v vzorcih organov pri 14,5 % (8/55) pregledanih prostoživečih sov, ki so bile najdene poginule na različnih lokacijah v Sloveniji med letoma 1995 in 2015. HV smo dokazali pri veliki uharici ( Bubo bubo), kozači ( Strix uralensis) in mali uharici ( Asio otus). Filogenetska analiza nukleotidnega zaporedja odseka gena DNA polimeraze HV je pokazala, da so dokazani HV podobni drugim HV ptic in sesalcev iz poddružine Alphaherpesvirinae. Nukleotidni zaporedji dveh HV sov sta bili zelo podobni oziroma identični znanim nukleotidnim zaporedjem HV ptic. Eno nukleotidno zaporedje HV, dokazano pri veliki uharici, je bilo identično nukleotidnemu zaporedju HV golobov 1 (angl. Columbid herpesvirus 1 – CoHV1), drugo nukleotidno zaporedje HV, dokazano pri kozači, pa je bilo zelo podobno nukleotidnemu zaporedju HV kokoši 2 (angl. Gallid herpesvirus 2 – GaHV2). Preostala nukleotidna zaporedja HV, dokazana pri eni veliki uharici, dveh malih uharicah in treh kozačah, so pokazala manjšo homologijo z nukleotidnimi zaporedji HV ptic in sesalcev ter so se v filogenetskem drevesu razvrstila v ločeno skupino znotraj poddružine Alphaherpesvirinae. Gre za prvo študijo, ki poroča o prisotnosti različnih HV pri prostoživečih sovah. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 13 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 14 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 15 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 16 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 17 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 18 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 19 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 20 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 2.2 Detekcija herpesvirusov pri pticah pevkah, odlovljenih v obdobju jesenske selitve v Sloveniji Detection of herpesviruses in passerine birds captured during autumn migration in Slovenia Zoran Žlabravec1, Tomi Trilar2, Brigita Slavec1, Uroš Krapež1, Al Vrezec3,4, Olga Zorman Rojs1, Jožko Račnik1 1 Inštitut za perutnino, ptice, male sesalce in plazilce, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani 2 Kustodiat za nevretenčarje, Prirodoslovni muzej Slovenije 3 Kustodiat za vretenčarje, Prirodoslovni muzej Slovenije 4 Oddelek za raziskavo organizmov in ekosistemov, Nacionalni inštitut za biologijo Journal of wildlife diseases, 2021, 57(2), 368-375. doi: 10.7589/JWD-D-20-00032 Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 21 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Izvleček HV smo z metodo PCR dokazali v brisih kloake pri 0,76 % (4/525) pregledanih klinično zdravih prostoživečih ptic pevk pri 32 različnih vrstah. Ptice pevke so bile odlovljene z ornitološkimi mrežami v obdobju jesenske selitve med letoma 2014 in 2017. HV smo dokazali pri črnoglavki ( Sylvia atricapilla), kosu ( Turdus merula) in plavčku ( Cyanistes caeruleus). Filogenetska analiza nukleotidnih zaporedij odseka gena DNA polimeraze HV je pokazala oddaljeno sorodstvo z drugimi alfaherpesvirusi ptic. V filogenetskem drevesu so bili dokazani HV uvrščeni skupaj in najbolj sorodni HV, odkritimi pri rumenočopastem kakaduju ( Cacatua galerita) in olivnem kormoranu ( Phalacrocorax brasilianus), pa tudi z bolj znanimi HV, kot so HV kokoši 1 (angl. Gallid HV 1 – GaHV1), HV papig 1 (angl. Psittacid HV 1 – PsHV1) in HV papig 2 (angl. Psittacid HV 2 – PsHV2). Z opravljeno študijo smo dokazali prisotnost različnih nukleotidnih zaporedij HV z relativno nizko homologijo, kar kaže na to, da v vzorčenih pticah pevkah v jesenski selitvi v Sloveniji krožijo različni HV, ki nimajo zaznavnega vpliva na zdravje teh populacij ptic. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 22 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 23 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 24 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 25 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 26 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 27 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 28 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 29 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 30 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 2.3 Okužba s herpesvirusom v gnezdečih populacijah dveh sobivajočih sov rodu Strix Herpesvirus infection in a breeding population of two coexisting Strix owls Zoran Žlabravec1, Al Vrezec2,3, Brigita Slavec1, Urška Kuhar4, Olga Zorman Rojs1, Joško Račnik1 1 Inštitut za perutnino, ptice, male sesalce in plazilce, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani 2 Oddelek za raziskavo organizmov in ekosistemov, Nacionalni inštitut za biologijo 3 Prirodoslovni muzej Slovenije 4 Inštitut za mikrobiologijo in parazitologijo, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani Animals, 2021, 11(9):2519). doi: 10.3390/ani11092519 Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 31 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Izvleček Pri pticah, ki so gostiteljice številnih HV, lahko okužba ostane neopažena ali povzroči bolezen (letalno). Podatkov o prisotnosti, vplivu in možnem prenosu HV v populaciji prostoživečih sov je zelo malo. Z metodo PCR smo odsek gena DNA polimeraze HV dokazali v brisih orofarinksa pri 9,4 % (16/170) pregledanih sov, ki so bile ujete v gnezdilnicah ali blizu njih. HV smo odkrili pri kozači, in sicer tako pri odraslih kot pri mladičih. HV nismo dokazali pri lesni sovi ( Strix aluco). Pri rumenogrlih miših ( Apodemus flavicollis), ki so glavni plen lesnih sov in kozač na območju raziskave, je bil HV odkrit v organih 5 % (2/40) miši, ujetih na istih lokacijah kot sove. Filogenetska analiza je pokazala, da se nukleotidna zaporedja HV, odkrita pri kozačah, razlikujejo od nukleotidnih zaporedij HV, odkritih pri rumenogrlih miših. Izsledki raziskave kažejo, da je v populaciji prostoživečih kozač prisotna okužba s HV, vendar okužene sove niso pokazale nobenih kliničnih ali produktivnih odstopanj. Na podlagi filogenetske primerjave dokazanih nukleotidnih zaporedij HV in nukleotidnih zaporedij HV, dobljenih iz baze podatkov NCBI GenBank, se zdi, da rumenogrla miš in drugi glodavci niso vir HV okužbe sov. Najverjetnejša pot prenosa je intraspecifična, zlasti z odraslih osebkov na njihove mladiče. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 32 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 33 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 34 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 35 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 36 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 37 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 38 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 39 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 40 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 41 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 42 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 43 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 2.4 Detekcija herpesvirusov pri bolnih, oslabelih ali poškodovanih prostoživečih pticah v Sloveniji Detection of herpesviruses in wild bird casualties in Slovenia Zoran Žlabravec1, Brigita Slavec1, Al Vrezec2,3, Urška Kuhar4, Olga Zorman Rojs1, Zlatko Golob5, Jožko Račnik1 1 Inštitut za perutnino, ptice, male sesalce in plazilce, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani 2 Oddelek za raziskavo organizmov in ekosistemov, Nacionalni inštitut za biologijo 3 Prirodoslovni muzej Slovenije 4 Inštitut za mikrobiologijo in parazitologijo, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani 5 Golob, d. o. o., Ambulanta za male, divje in eksotične živali, zatočišče za prostoživeče živali Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 44 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Frontiers in veterinary science, 2022, 9:822212. doi: 10.3389/fvets.2022.822212 Izvleček Celotnega gostiteljskega seznama HV pri prostoživečih pticah ni, informacije o nukleotidnih zaporedjih HV so na voljo le v nekaterih primerih. Namen te študije je bil ugotoviti prisotnost HV pri različnih prostoživečih pticah in dobiti več informacij o njihovem filogenetskem razmerju. V brisih orofarinksa in kloake 447 prostoživečih bolnih, poškodovanih ali oslabelih ptic iz 15 različnih vrst, ki so bile sprejete na Kliniko za ptice, male sesalce in plazilce Veterinarske fakultete, smo z metodo PCR dokazovali prisotnost odseka gena DNA polimeraze HV. HV so bili odkriti v brisu orofarinksa in/ali kloake pri 34 pticah (7,5 %), ki pripadajo 11 vrstam iz šestih različnih ptičjih redov: Accipitriformes, Charadriiformes, Columbiformes, Falconiformes, Passeriformes in Strigiformes. Filogenetska analiza je pokazala, da so v populaciji prostoživečih ptic prisotna različna nukleotidna zaporedja HV. Nekateri HV so specifični za gostiteljsko vrsto ptic, medtem ko smo v nekaterih primerih v različnih redovih ptic odkrili zelo podobna nukleotidna zaporedja, kar potrjuje ugotovitve, da HV niso vedno omejeni na vrsto ptic. Zdi se, da bi lahko do prenosa HV prišlo s plenjenjem iz ptičjega plena in celo s superplenitvijo – na primer velike sove, kot sta velika uharica ali kozača, ki plenijo manjše plenilske ptice. To lahko povzroči večjo izpostavljenost okužbam in je v skladu z dejstvom, da so bile plenilske ptice najbolj okužene skupine vrst. Dokaz HV samo v enem od obeh odvzetih brisov kaže na to, da je za dokaz HV pri prostoživečih pticah treba odvzeti tako orofaringealni kot kloakalni bris. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 45 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 46 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 47 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 48 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 49 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 50 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 51 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 52 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 53 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 54 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 55 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 3 RAZPRAVA Ugotavljanje in genetska karakterizacija HV pri poginjenih prostoživečih sovah v Sloveniji Študija o prisotnosti HV pri poginjenih prostoživečih sovah je pokazala, da so v populaciji prostoživečih sov v Sloveniji prisotni HV z različnimi nukleotidnimi zaporedji odseka gena DNA polimeraze, ki se večinoma (7/8) razlikujejo od predhodno opisanih HV pri sovah in tudi od drugih nukleotidnih zaporedij HV, ki so objavljeni v genski banki. Z metodo PCR smo HV dokazali pri 8 od 55 (14,5 %) pregledanih sov. HV smo ugotovili pri veliki uharici (2/3), kozači (4/11) in mali uharici (2/15). Podobno incidenco (14,2 %) prisotnosti HV pri sovah so ugotovili tudi v poljski študiji leta 2012 (17), vendar je treba poudariti, da so v omenjeni študiji poleg manjšega števila pregledanih sov (n = 7) in detekcije HV samo v vzorcih možganov uporabili specifične začetne oligonukleotide za detekcijo CoHV1 z metodo PCR v realnem času. V naši študiji smo odkrili le eno nukleotidno zaporedje odseka gena DNA polimeraze HV, ki je bilo identično znanemu nukleotidnemu zaporedju CoHV1. Za razliko od uporabljenih specifičnih oligonukleotidnih zaporedij smo v naši raziskavi z uporabo konsenznih začetnih oligonukleotidov za detekcijo HV in metodo PCR ugotovili veliko raznolikost med odkritimi nukleotidnimi zaporedji HV pri poginjenih prostoživečih sovah v Sloveniji. Predvsem genetsko različni HV, latentna okužba s HV (18, 19) in možen obstoj različnih serovarov (20) predstavljajo izziv pri izbiri najprimernejših metod za proučevanje razširjenosti okužb s HV pri pticah. Študiji iz Severne Amerike sta pokazali, da okužba s CoHV1 povzroča pogine pri jastrebih, sokolih in sovah (11, 12). V populaciji domačih golobov ( Columba livia) je CoHV1 pogosto prisoten in nima skoraj nobenega vpliva na zdravje te vrste (11). Znano je, da HV niso vedno omejeni na določenega gostitelja in/ali na tarčni organ in da preskok na drugega gostitelja ali drug organski sistem lahko precej spremeni patogenost virusa (18). Različne študije so pokazale, da golobi, okuženi s CoHV1, predstavljajo vir okužbe za ptice ujede (21, 22, 23) in da se nukleotidno zaporedje HV, odkrito pri sovah, ne razlikuje od nukleotidnega zaporedja HV, odkritega pri golobih in sokolih (11, 13). Tako so vse študije genetske karakterizacije HV pri sovah pokazale, da so nekateri dokazani HV pri sovah genetsko zelo podobni ali celo identični CoHV1 (11, 13, 14, 17, 24). V naši študiji o detekciji HV pri poginjenih prostoživečih sovah (25) je bilo samo eno od osmih ugotovljenih nukleotidnih zaporedij HV pri sovah Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 56 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija identično CoHV1, in sicer HV sev BB/258/12, ki je bil dokazan pri veliki uharici, najdeni leta 2012. Do zdaj je bil CoHV1 ugotovljen pri virginijskem viru ( Bubo virginianus) (11, 24), pasjem bubuku ( Ninox connivens) in velikem bubuku ( Ninox strenua) (13, 14). Na podlagi nam znanih podatkov in primerjave nukleotidnega zaporedja odseka gena DNA polimeraze HV nam je kot prvim uspelo dokazati prisotnost CoHV1 pri veliki uharici. Čeprav so naši rezultati potrdili prejšnje podatke iz študij o identičnosti CoHV1, ugotovljenega pri golobih, sovah in preostalih ujedah (11, 13, 14, 17), je treba poudariti, da je primerjava nukleotidnega zaporedja v omenjenih raziskavah potekala na nukleotidnem zaporedju odseka gena DNA polimeraze HV, ne pa na celotnem genomu. Študiji iz leta 2014 in 2017 (26, 27), v katerih so avtorji primerjali genom CoHV1, ki je bil dokazan pri domačem golobu, in genom sokoljega herpesvirusa 1 (angl. Falconid herpesvirus 1 – FaHV1), ki je bil dokazan pri prerijskem sokolu ( Falco mexicanus), sta pokazali, da se genoma razlikujeta vsaj v enem genu in da sta virusa zelo podobna, ne pa enaka. Da bi dobili jasnejšo sliko o raznolikosti HV pri sovah in pticah ujedah, bi bilo treba izvesti karakterizacijo genoma v celotni dolžini HV, kar je cilj prihodnjih študij. Vir okužbe s CoHV1, ki smo ga dokazali pri veliki uharici, ostaja neznan, vendar avtorji nekaterih študij (11, 13, 14, 22) predpostavljajo, da se virus prenese s plena na plenilca. Do 50 % prehrane velike uharice predstavljajo ptice (28), med katerimi so tudi vrste ptic, pri katerih je bil dokazan HV, kot so golobi in sokoli (29). Nukleotidno zaporedje HV SU/436/13, dokazano pri poginjeni kozači, najdeni leta 2013, je bilo v primerjanem nukleotidnem zaporedju odseka gena DNA polimeraze HV najbolj podobno (95 %) nukleotidnemu zaporedju GaHV2. V filogenetsko drevo sta se poleg nukleotidnega zaporedja HV SU/436/13 in GaHV2 uvrstila tudi GaHV3 in puranji herpesvirus 1 (angl. Meleagrid herpesvirus 1 – MeHV1). GaHV2 je znan tudi kot virus Marekove bolezni (angl. Marek's disease – MD), ki povzroča neoplastično limfoproliferativno bolezen ptic. Ta povzroča imunosupresijo z visceralnim in/ali kožnim limfomom, paralizo in/ali smrt (7). Naravne gostiteljice virusa MD so kokoši. Za okužbo in bolezen so dovzetne tudi prepelice, purani, fazani ter nekatere vrste rac in gosi. Druge vrste ptic, vključno z vrabci, jerebicami, golobi in pavi, so domnevno odporne na okužbo (7). Patološke in histopatološke lezije, ki so skladne z opisom MD, so bile opisane pri veliki uharici, čuku ( Athene noctua) in virginijskem viru (30, 31), vendar v nobenem primeru ni bila dokazana dejanska prisotnost HV. Dokaz HV, ki je v primerjani regiji zelo podoben GaHV2, potrjuje predhodne opise o dovzetnosti sov za okužbo z virusom MD. Način okužbe kozače z virusom MD ni znan, vendar bi lahko domnevali – Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 57 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija podobno kot pri okužbah ptic ujed s CoHV1 (11, 13, 14, 22) – da je vir okužbe plen, okužen z virusom MD. Preostalih šest nukleotidnih zaporedij HV, dokaznih pri poginjenih sovah, najdenih med letoma 1995 in 2015 v Sloveniji, se je v filogenetskem drevesu združilo v enotno skupino in so v oddaljenem sorodstvu z drugimi znanimi nukleotidnimi zaporedji DNA polimeraze alfaherpesvirusov ptic in sesalcev. Ti rezultati niso presenetljivi, saj se novi HV nenehno ugotavljajo pri različnih vrstah ptic, kot so indijski plešec ( Gyps indicus) (32), gorski pavovec ( Polyplectron inopinatum), malajski pavovec ( Polyplectron malacense) in afriški pav ( Afropavo congensis) (33), pa tudi pri drugih živalskih vrstah, kot so domači kunec ( Oryctolagus cuniculus) (34), indonezijski pteropodidni netopir ( Cynopterus titthaecheilus) (35), planinski pečinar ( Procavia capensis) (36) in velika pliskavka ( Tursiops truncatus) (37). Poleg tega smo z našo študijo pokazali, da so različne vrste sov različno dovzetne za okužbo s HV. Iz proučevanih populacij sov, dovzetnih za okužbo s HV, smo zaradi majhne velikosti vzorca (1–3 predstavniki posameznih vrst) izključili pegasto sovo ( Tyto alba), velikega skovika ( Otus scops), močvirsko uharico ( Asio flammeus) in veliko uharico. Na podlagi razmeroma velikega števila pregledanih osebkov (n = 19) lesne sove, pri katerih HV nismo dokazali, predvidevamo, da lesna sova kot predstavnik svoje vrste ni dovzetna za okužbo s HV. Lesna sova je zelo polimorfna vrsta, kar se ne kaže le v različnih barvnih odtenkih in oblikah, temveč tudi v veliki fiziološki variabilnosti in sposobnosti preživetja v spremenljivih okoljskih razmerah (38, 39, 40, 41). Pri okuženih vrstah sov je bil polimorfizem do neke mere ugotovljen le pri kozači (42), vendar v primerjavi z lesno sovo v precej manjšem obsegu. V primeru okužbe s HV smo ugotovili, da je bolj polimorfna lesna sova manj dovzetna za okužbo v primerjavi z manj polimorfnimi vrstami sov, kot so velika uharica, kozača in mala uharica. Domnevamo, da večji polimorfizem v populaciji na splošno poveča odpornost proti nekaterim boleznim, vendar je to treba še dodatno raziskati. Vse proučevane vrste sov, razen velikega skovika, ki se pretežno hrani z žuželkami, imajo sorazmerno podobno prehrano. To so mali sesalci, med katerimi njihov glavni plen predstavljajo voluharice in miši (43). Študija je tudi pokazala, da so večje vrste sov (npr. velika uharica in kozača) bolj okužene kot manjše vrste, kar bi bilo lahko povezano z njihovim načinom prehranjevanja, t. i. superplenilstvom, z večjimi pticami in tudi sesalci (44, 45). HV smo dokazali tudi pri mali uharici, ki se za razliko od že omenjenih vrst prehranjuje pretežno z voluharicami (46, 47). Pri primerjavi sov iz različnih habitatov, npr. lesne sove kot gozdne vrste in male uharice kot vrste odprtih okolij, smo ugotovili, da okužba Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 58 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija ni povezana z življenjskim prostorom oziroma habitatom (43). Pri primerjavi zelo sorodnih sov iz rodu Strix, kozače in lesne sove, smo ugotovili, da okužba ni odvisna od filogenetska odnosa (48). Okužba s HV v gnezdečih populacijah dveh sobivajočih sov rodu Strix Naša študija, v kateri smo prisotnost HV ugotavljali pri živih prostoživečih sovah, ki so bile vzorčene na območju Krima in Jelovice med letoma 2017 in 2019, je pokazala, da je HV prisoten v populaciji kozač (29,1 %; 16/55), vendar nima zaznanega vpliva oziroma posledic na zdravje in reprodukcijo kozač. Pri živih in klinično zdravih lesnih sovah kljub razmeroma visokemu številu pregledanih sov (n = 115) nismo dokazali HV. Na detekcijo HV lahko vpliva več dejavnikov, kot so premajhno število testiranih ptic, neizločanje HV med vzorčenjem, zbiranje in shranjevanje vzorcev ter občutljivost in specifičnost metode PCR. Vsi ti dejavniki lahko vplivajo na negativne rezultate, zlasti če je koncentracija virusa v vzorcu nizka ali v primeru prisotnosti novih virusov. Okužene ptice niso pokazale nobenih kliničnih ali produktivnih odstopanj, in to kljub dejstvu, da je okužba s HV pri sovah opisana kot bolezen, ki se konča s poginom (10, 19). Obstaja tudi možnost, da so posledice okužbe vidne šele na dolgoročni produktivnosti in preživetju sov, zlasti v letih, ko v okolju primanjkuje hrane oziroma plena (49, 50). Detekcija odseka gena DNA polimeraze HV v orofaringealnih brisih klinično zdravih sov dokazuje asimptomatsko izločanje HV. HV imajo sposobnost vzpostaviti prikrito (latentno) stanje v gostitelju in se občasno reaktivirati. Prav tako je znano, da s HV okuženi posameznik lahko prenaša HV brez vidnih znakov bolezni (19). Izločanje HV v področje orofarinksa ptic je pomemben dejavnik z vidika potencialnega prenosa virusa z okuženega na neokuženega posameznika. Pri sovah samec običajno hrani samico med dvorjenjem, kasneje v obdobju starševstva pa samec in samica sodelujeta pri hranjenju svojih mladičev (43). V obeh primerih je to možen način prenosa HV. Čeprav HV v brisih kloake nismo odkrili, kar bi lahko bila tudi posledica prisotnosti inhibitorjev, ne smemo zanemariti pomena kloakalnih brisov pri dokazovanju HV, saj je bil v nekaterih študijah HV dokazan tudi v brisih kloake (8, 51). Naša študija je bila opravljena v letih, ko je bilo na voljo veliko plena (52), torej z nizkim prehranskim stresom za sove, a tudi tukaj so bili zaznani prenosi HV znotraj gnezd. V obdobju pomankanja hrane (manj plena) bi pri kozači lahko pričakovali intenzivnejše izločanje ter prenos virusa in tudi morebitni pojav različnih kliničnih znakov. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 59 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Različne študije kažejo, da se HV bolezen pri pticah ujedah lahko razvije po zaužitju CoHV1 okuženih golobov (11, 13, 14, 22). Ob dokazu odseka DNA polimeraze HV pri zdravih sovah se postavlja vprašanje, ali vse okužbe s HV pri sovah (11, 14) povzročijo bolezen, ki je v nekaterih primerih opisana celo kot bolezen s 100-odstotnim poginom. Trenutno znani HV pri sovah so GaHV2, znan tudi kot virus Marekove bolezni (25), CoHV1 (11, 25, 53), herpesvirus sov 1 (angl. Strigid herpesvirus 1 – StHV1) (54) in HV, ugotovljeni pri poginjenih (25) in živih prostoživečih sovah v Sloveniji, ki smo jih poimenovali po gostiteljski vrsti (npr. Strix uralensis HV). Vsi omenjeni HV so genetsko različni in možno je, da so nekateri od njih, npr. CoHV1, bolj patogeni za populacijo sov kot drugi, prav tako bi se lahko med seboj razlikovali po načinu prenosa in patogenezi. Za popolnejše informacije o potencialni patogenosti HV pri sovah bi bilo potrebno v prihodnosti opraviti izolacijo virusa, določanje serotipov in popolno karakterizacijo genoma teh različnih HV. Nukleotidna zaporedja HV, dokazana pri kozačah na Krimu in Jelovici, so se v filogenetsko drevo uvrstila skupaj z nukleotidnimi zaporedji HV, dokazanimi pri poginjeni veliki uharici, kozači in mali uharici iz naše predhodne študije (25), in z nukleotidnim zaporedjem StHV1, dokazanim pri živem prostoživečem virginijskem viru iz Amerike (54). Kljub dokazu HV pri tesno sorodnih sovah iz rodu Bubo in Strix (55) je naša študija pokazala, da dovzetnost za okužbo s HV znotraj monofiletske skupine Striginae (56) vendarle ni enaka. Že znotraj rodu Strix je ugotovljeno, da sta lesna sova in kozača tesno sorodni vrsti (56), vendar so naši rezultati pokazali, da se vrsti bistveno razlikujeta po dovzetnosti za okužbo s HV. Treba je pa poudariti možnost prisotnosti nedetektiranih HV in se zavedati, da preprosta korelacija med HV in molekularno filogenijo sove ne zadostuje za razlago odnosa med gostiteljem in parazitom. Možni razlogi za morebitno manjšo dovzetnost lesne sove za okužbo s HV so lahko v presnovnih lastnostih (metabolizmu), kot je bilo predlagano v prejšnji študiji (25), ali v nedavnih koevolucijskih procesih, ki so se razlikovali med različnimi gostitelji sove in HV. Obe vrsti sov se zelo razlikujeta v življenjskih lastnostih. Na našem proučevanem območju kozača velja za ledenodobno reliktno vrsto, katere večji del populacije najdemo v borealnem podnebnem pasu Evrazije, medtem ko je lesna sova vrsta zmernega pasu, ki se je nedavno razširila v severno Evropo (52, 57, 58, 59). Naša študija je bila omejena na manjše geografsko območje znotraj zmernotoplega podnebnega pasu, kjer vrsti sobivata in kjer kozača doseže svojo južno mejo razširjenosti (60). Za dokaz, da so vrste sov, ki živijo na meji svojega naravnega habitata, bolj dovzetne za okužbe s HV ter za natančnejšo proučitev vpliva podnebja Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 60 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija in življenjskih lastnosti sov na okužbo s HV bi bilo treba zajeti predvsem večje geografsko območje, na katerem bi vzorčili sove iz roda Strix. Čeprav je koevolucija gostitelja in virusa primarni način evolucije HV, so v literaturi opisani tudi medvrstni prenosi (11, 61, 62). Filogenetska analiza delnega nukleotidnega zaporedja DNA polimeraze HV, ugotovljenega pri rumenogrli miši in kozači z istega območja, je pokazala, da se HV, dokazani pri rumenogrli miši, razlikujejo od HV, dokazanih pri kozači. HV, ki okuži tako sesalce kot ptice, je redko opisan. Po nam znanih podatkih je prašičji herpesvirus 1 (angl. Suid herpesvirus 1 – SuHV1) povzročitelj bolezni Aujeszkega (znana tudi kot psevdosteklina), ki spada v poddružino Alphaherpesvirinae, edini HV, ki pri prašičih večinoma povzroča blago obliko bolezni. Hujšo obliko bolezni, vključno s poginom, povzroča pri drugih vrstah sesalcev, kakor tudi pri kokoših in golobih. Prenos HV je bil s sesalcev na ptice do zdaj opisan le v eksperimentalnih pogojih (63). Nukleotidni zaporedji odseka gena DNA polimeraze HV, dokazani pri rumenogrli miši v naši študiji, sta se v filogenetskem drevesu uvrstili v poddružino Betaherpesvirinae skupaj s citomegalovirusom 3 (angl. Cytomegalovirus 3 – CMV 3), ki je bil ugotovljen pri rumenogrli miši v Nemčiji. Pri enakem gostitelju so bili odkriti tudi drugi HV, in sicer CMV 1, CMV 2, Apodemus flavicollis rhadinovirus 1 (AlphaRHV1) in Murine gammaherpesvirus 68 (MHV-68), ki so bili uvrščeni v druge skupine v poddružinah Betaherpesvirianae in Gammaherpesvirinae (64). V tej obsežni študiji iz Nemčije so bile ob več kot 1100 pregledanih vzorcih krvi in tkiva odkriti številni že znani in novi betaHV in gamaHV pri različnih vrstah prostoživečih glodavcev, kot so gozdna voluharica ( Clethrionomys glareolus), travniška voluharica ( Microtus agrestis), poljska voluharica ( Microtus arvalis), belogrla miš ( Apodemus sylvaticus), hišna miš ( Mus musculus), siva podgana ( Rattus norvegicus) in črna podgana ( Rattus rattus). Tako kot mi tudi avtorji nemške študije niso dokazali prisotnosti alfaHV pri glodavcih. Možni vzroki so nizka prevalenca alfaHV pri glodavcih, neznano mesto lokacije v latentni fazi okužbe, nizka koncentracija virusa v vzorcih ali hipoteza, da se alfaHV pri glodavcih med evolucijo HV nikoli niso razvili ali so dejansko izginili (64). Čeprav glodavci predstavljajo visok delež prehrane sov, pa vendar pri kozači in tudi pri drugih vrstah sov, kot sta velika uharica in mala uharica, nismo zaznali prisotnosti HV glodavcev. Filogenetska analiza dokazanih nukleotidnih zaporedij odseka gena DNA polimeraze HV pri prostoživečih sovah v Sloveniji in Ameriki kaže, da ugotovljeni HV spadajo v poddružino Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 61 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Alphaherpesvirinae. Virusi iz poddružine Betaherpesvirinae in Gammaherpesvirinae so znani po specifičnosti oziroma omejenosti na določene naravne gostitelje (2), kar bi lahko bil eden od razlogov, da pri sovah nismo odkrili HV glodavcev. Kljub temu bi zaradi velikega deleža prehrane, ki jo predstavljajo glodavci, in relativno občutljive metode PCR pričakovali prisotnost DNA polimeraze HV glodavcev v orofaringealnem predelu in kloaki ptic, vsaj kot posledico kontaminacije oziroma zaužitja s HV okuženega glodavca. Na podlagi naših izsledkov in študije, ki so jo napisali Ehlers in sod. (64), lahko izključimo pot prenosa HV z glodavcev na sove, saj je bila ugotovljena zelo majhna podobnost med nukleotidnimi zaporedji odseka gena DNA polimeraze HV sov, miši in drugih vrst glodavcev. Zaradi visoke stopnje raznolikosti med HV velja poudariti, da bi uporabljena metoda PCR v določenih primerih lahko tudi zgrešila pojav novega HV (8). Najverjetnejši način prenosa HV pri sovah je znotraj vrste, predvsem s staršev na njihove mladiče. V gnezdu na gori Krim smo ugotovili, da sta imela samec in samica kozače v svojem gnezdu enega mladiča kozače in enega mladiča lesne sove, kar je bila posledica tekmovalnega izgona lesne sove s strani večje kozače iz gnezda. DNA polimerazo HV smo dokazali pri samcu in samici kozače ter pri mladiču kozače, pri mladiču lesne sove pa HV nismo ugotovili. S študijo smo potrdili prejšnje ugotovitve (25, 65), da lesne sove niso dovzetne za okužbo s HV, tudi če so v tesnem stiku z okuženimi in tesno sorodnimi kozačami. Možni razlogi nedovzetnosti lesne sove za okužbo s HV so poleg že omenjenega večjega polimorfizma ter genetske in fiziološke variabilnosti (25) lahko tudi zgodovinski evolucijski razlogi. Lesna sova je zgodovinsko gledano dlje prisotna in je koevoluiran gostitelj HV, medtem ko bi se okužbe s HV pri kozačah lahko pojavile relativno nedavno, vendar bi bilo to treba v prihodnje podrobneje raziskati. Detekcija HV pri pticah pevkah, odlovljenih v obdobju jesenske selitve v Sloveniji Pri prostoživečih pticah pevkah, ki smo jih ujeli med jesensko selitvijo v Sloveniji, smo DNA polimerazo HV dokazali pri 0,76 % (4/525) testiranih ptic. Če to primerjamo s preostalimi študijami, opazimo, da je razširjenost HV pri testiranih pticah pevkah v Sloveniji dokaj nizka. Pri prostoživečih pticah ujedah je HV prisoten v 9,4 % do 17,8 % pregledanih ptic (17, 25, 66), pri prostoživečih morskih pticah je razširjenost HV nekolika nižja, in sicer med 3,8 % (4/104) in 5,6 % (14/250) (67, 68). Razlogi za različno razširjenost HV pri pticah so številni in vključujejo dejavnike, kot so biologija in ekologija testiranih vrst ptic, občasno/različno izločanje HV preko kloake in/ali žrela ter imunski status okuženih ptic (8). Razlike lahko Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 62 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija izhajajo tudi iz različnih študijskih pristopov; v nekaterih študijah so HV dokazali pri mrtvih pticah (17, 25), pri katerih bi bila razširjenost lahko višja kot pri živih in klinično zdravih pticah. Večjo pojavnost HV pri prostoživečih pticah pevkah na migraciji bi pričakovali, če bi v študijo poleg kloakalnih brisov vključili tudi orofaringealne brise (14). Poleg tega je ugotovljena nizka prisotnost HV pri pticah pevkah na migraciji lahko povezana tudi z nekaterimi tehničnimi razlogi. Postopki vzorčenje, shranjevanja in transporta vzorcev imajo pomemben vpliv na natančno in ponovljivo diagnostiko (69). Čeprav so brisi z virusnim transportnim medijem primernejši za detekcijo virusa kot suhi brisi (70), različne študije opisujejo uporabo suhih brisov kot učinkovito metodo pri diagnostiki virusnih okužb, npr. pri virusih iz družin Orthomyxoviridae (71) in Paramyxoviridae (72), pa tudi Herpesviridae (73). Vzorci kloak ptic pevk, odlovljenih med jesensko selitvijo, so bili odvzeti in transportirani v skladu z opisanimi postopki v omenjenih študijah, zato menimo, da ima uporaba suhih brisov manjši, vendar ne bistven vpliv na nizko stopnjo detekcije HV. S HV okužene prostoživeče ptice pevke, ki so bile odlovljene med jesensko selitvijo, ob veterinarskem pregledu niso imele kliničnih znakov bolezni. V omenjeni študiji smo HV dokazali pri klinično zdravih pevkah, kar je v nasprotju z izsledki prejšnjih študij, v katerih so bili HV dokazani pri bolnih in poginulih pticah pevkah (5, 15, 16). Podobno kot pri drugih vrstah, se tudi pri pticah pevkah domneva, da se s HV naravno okužijo v zgodnjem obdobju življenja, v katerem nato različni stresni dejavniki v življenju spremenijo ravnovesje med gostiteljem in virusom ter povzročijo pojav bolezni (19, 74, 75). Treba je omeniti tudi potencialno korist HV kot del simbiotskega odnosa z gostiteljem. Nekatere študije so pokazale, da ima asimptomatska okužba s HV pri gostitelju zaščitni učinek pred virusno in bakterijsko okužbo (76). Miši, okužene z mišjimi gamaHV, so bile manj dovzetne za okužbo z bakterijama Listeria monocytogenes in Yersinia pestis ter so imele višjo stopnjo preživetja po okužbi z virusom influence tipa A (76, 77, 78). Prav tako je bila pri kronično okuženih miših s HV ugotovljena manjša pojavnosti tumorjev (79, 80). Dokaz HV v vzorcih zdravih živali tako poleg okužbe in možne bolezni dopušča tudi možnost simbioze, ki zaščiti gostitelja pred drugimi boleznimi. Filogenetska analiza je pokazala, da so dokazana nukleotidna zaporedja odseka gena DNA polimeraze HV pri štirih prostoživečih pticah pevkah, odlovljenih med jesensko selitvijo, najbolj sorodna nukleotidnim zaporedjem DNA polimeraze HV, ki so bili dokazani pri velikim Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 63 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija rumenočopastem kakaduju in olivnem kormoranu, ter bolj znanim HV, kot so GaHV1, PsHV1 in PsHV2, ki so dokazani pri perutnini in papigah. Dokaz treh nukleotidnih zaporedij DNA polimeraze HV z relativno nizko homologijo nakazuje na verjetnost, da v proučevani populaciji prostoživečih ptic pevk na migraciji v Sloveniji krožijo različni HV. Dokaz identičnih nukleotidnih zaporedij DNA polimeraze HV pri dveh črnoglavkah in dokaz identičnih nukleotidnih zaporedij DNA polimeraze HV pevk (angl. Passerine herpesvirus 1 – PaHV1) v dveh ločenih izbruhih bolezni pri Gouldinovi amadini v ujetništvu (15, 16) kaže, da so HV, odkriti pri pticah pevkah vrstno specifični, velja pa poudariti, da sposobnost preskoka gostitelja pri HV ostaja neznana (18). Izziv prihodnjih študij je ugotoviti, ali so dokazani HV pri pevkah avtohtonega evropskega izvora ali so bili vir prenosa pobegle uvožene eksotične ptice v prostoživečo avifavno (populacijo), kar je že znana pot prenosa različnih bolezni (81). Vse s HV okužene vrste ptic pevk, odlovljene med jesensko selitvijo v naši raziskavi, so vrste, ki migrirajo na kratke razdalje, ali sedentarne vrste. Najvišja pojavnost HV je bila pri plavčku (13 %), vendar je to lahko tudi posledica majhne velikosti vzorca te vrste (n = 8). Nobene okužbe ni bilo ugotovljene pri pticah pevkah, ki migrirajo na dolge razdalje, čeprav so bile v študijo vključene v razmeroma velikem številu, vključno s trstnicami ( Acrocephalus spp.), vrtno penico ( Sylvia borin) in vrbjim kovačkom ( Phylloscopus collybita). Selitev ima izjemen selekcijski vpliv na ptice (82), še predvsem na morebitno oslabele, obolele ali v našem primeru okužene osebke. Selekcijski pritisk je visok, tudi pri selivkah na kratke razdalje, kar kaže tudi ugotovljen nizek pojav okužb s HV. Dovzetnost za okužbo s HV pri prostoživečih pticah pevkah bi bilo treba v prihodnje proučiti s kombiniranim vzorčenjem živih in mrtvih ptic, pri čemer bi pričakovali višjo pojavnost pri dovzetnih vrstah ptic pevk. HV pri bolnih, poškodovanih ali oslabelih prostoživečih pticah, sprejetih na Kliniko za ptice, male sesalce in plazilce Pri prostoživečih vrstah ptic, sprejetih na Kliniko za ptice, male sesalce in plazilce Veterinarske fakultete, smo odsek gena DNA polimeraze HV dokazali pri 7,6 % (34/447) pregledanih ptic. Odvzem orofaringealnih in kloakalnih brisov pri kliničnem pregledu in za diagnostiko bolnih, poškodovanih ali oslabelih ptic se je izkazal kot uporabna metoda za proučevanje virusov pri prostoživečih pticah, saj smo se s tem izognili nepotrebnemu stresu, ki bi ga sicer povzročili z lovljenjem in fiksacijo ptic. Poudariti je treba, da je bila v tem primeru v študijo vključena pristranska populacija ptic, npr. poškodovane ptice, ptice z določenih območij, najbolj pogoste Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 64 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija ptice z območja itd., kar lahko vpliva na pojavnost HV v proučevani populaciji. HV so znani po svojih subkliničnih ali latentnih okužbah, ki se pod določenimi vplivi – v primeru ptic, sprejetih na kliniko, so to trki oziroma travme in/ali sočasne okužbe – reaktivirajo, kar vodi v pojav bolezni ali asimptomatsko izločanje in posledično tudi možno detekcijo HV v kliničnih vzorcih (brisih). Poleg detekcije DNA polimeraze HV v fazi reaktivacije je treba omeniti tudi možnost primarne okužbe in s tem povezan dokaz DNA polimeraze HV pri prostoživečih pticah. Pri plenilskih pticah je bila DNA polimeraza HV dokazana pri 9,9 % (12/121) pregledanih ptic. HV smo dokazali pri 13,6 % (6/44) pregledanih ujed ( Accipitriformes), pri 2,9 % (1/34) pregledanih sokolov ( Falconiformes) in 11,9 % (5/42) pregledanih sov ( Strigiformes). DNA polimerazo HV smo dokazali pri planinskem orlu ( Aquila chrysaetos) (1/1), kanji ( Buteo buteo) (5/32), postovki ( Falco tinnunculus) (1/32), veliki uharici (1/4), mali uharici (3/7) in kozači (1/8). Izsledki prejšnjih raziskav kažejo, da so nukleotidna zaporedja HV, dokazana pri ujedah, sovah in sokolih, zelo podobna in v nekaterih primerih identična CoHV1 ter da je plenjenje okuženih golobov ali okuženih plenilskih ptic najverjetnejši način prenosa pri roparskih pticah (11, 13, 14, 25, 53). Dokaz CoHV1 pri domačih golobih, sprejetih na kliniko, z 98,53- do 99,02-odstotno homologijo v nukleotidnem zaporedju s CoHV1, dokazanim pri veliki uharici (obe vrsti sta bili sprejeti na kliniko), podpira teorijo s plenom povezanega prenosa HV. Dokazano je, da prehrana velike uharice predvsem v zmernih regijah in nizki nadmorski višini (28) vključuje tudi potencialno okužene vrste ptic, kot so manjše ujede in golobi (29). Nukleotidna zaporedja HV, dokazana pri kozači in treh malih uharicah, sprejetih na kliniko, so bila med seboj identična in so se razlikovala od nukleotidnih zaporedij CoHV1. Te ugotovitve potrjujejo izsledke prejšnje raziskave o prisotnost različnih HV pri sovah (25). Dokaz identičnih nukleotidnih zaporedij HV pri različnih vrstah sov, sprejetih na kliniko, kaže na morebitni medvrstni prenos HV zaradi t. i. znotrajcehovskega plenjenja, npr., ko kozača upleni malo uharico (83). Na splošno smo pri prostoživečih plenilskih pticah, sprejetih v veterinarsko oskrbo, dokazali različna nukleotidna zaporedja DNA polimeraze HV. Primerjava dokazanih HV pri ujedah in sokolih je pokazala od 51,7- do 54,7-odstotno homologijo v nukleotidnem zaporedju, med ujedami in sovami od 60,29- do 63,3-odstotno homologijo v nukleotidnem zaporedju in med Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 65 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija sokoli in sovami od 55,2- do 56,2-odstotno homologijo v nukleotidnem zaporedju. Samo ena od 12 dokazanih nukleotidnih zaporedij HV je bila podobna CoHV1, ki je bil še pred nedavnim edini opisani HV pri plenilskih pticah. Nukleotidno zaporedje DNA polimeraze HV, ugotovljeno pri postovki, je bilo v filogenetskem drevesu uvrščeno skupaj s PsHV1 in PsHV2, odkritimi pri sivem žakoju ( Psittacus erithacus) in rumenoglavi amazonki ( Amazona oratrix), in se je razlikovalo od predhodno dokazanega CoHV1 pri postovki in drugih vrstah sokolov (11, 17, 26). V filogenetskem drevesu so se HV, ugotovljeni pri plenilskih pticah, razvrstili v dve ločeni skupini. HV, ugotovljeni pri pticah iz redov Accipitriformes in Strigiformes, so se združili v eno klado ter HV, ugotovljeni pri pticah iz redov Falconiformes, Psittaciformes in Passeriformes, v drugo klado. Razlika v filogenetski razvrstitvi ugotovljenih nukleotidnih zaporedij HV je v skladu s filogenetskimi odnosi ptic, kjer je red Falconiformes bolj soroden z redoma Psittaciformes in Passeriformes kot z drugimi plenilskimi pticami (84). Na podlagi tega predvidevamo, da je evolucija HV pri prostoživečih pticah sledila evoluciji njihovih gostiteljev, ne pa ekološkim konvergencam. Pri ujedah Accipitriformes so bila nukleotidna zaporedja HV, dokazana pri petih kanjah, identična in so bila v filogenetskem drevesu združena skupaj z nukleotidnim zaporedjem HV, dokazanim pri planinskem orlu in indijskem plešcu. Čeprav sta bila reda Accipitriformes in Strigiformes med plenilskimi pticami najbolj okuženi skupini ptic, so tudi v tej skupini kljub visokemu številu pregledanih osebkov prisotne vrste ptic, ki so nedovzetne za okužbo s HV, npr. skobec ( Accipiter nisus) in predvsem lesna sova, kar potrjujejo tudi prejšnje raziskave HV pri poginjenih in klinično zdravih odlovljenih sovah v Sloveniji (25, 65, 66). HV, dokazani pri plenilskih pticah, se z 49,7- do 76,1-odstotno homologijo v nukleotidnem zaporedju razlikujejo tudi od HV, dokazanih pri pticah pevkah med jesensko selitvijo (51), in od HV, dokazanih pri pticah pevkah, sprejetih na kliniko, kar izključuje možnost, da so ptice pevke vir okužbe s HV pri plenilskih pticah. Pri treh sivih vranah ( Corvus cornix), sprejetih na kliniko, smo dokazali identična nukleotidna zaporedja HV, ki so se razlikovala od nukleotidnega zaporedja HV, dokazanega pri zelencu, ki je bil prav tako sprejet na kliniko. Podobne so bili tudi izsledki raziskave o prisotnosti HV pri pevkah med jesensko selitvijo; ugotovili smo različna nukleotidna zaporedja HV pri različnih pticah pevkah, vendar identična nukleotidna zaporedja HV pri predstavnikih iste vrste. Pri pticah pevkah, sprejetih na kliniko, smo potrdili prisotnost vrstno specifičnih HV, ki se razlikujejo od predhodno dokazanega CoHV1. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 66 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Zelo podobni nukleotidni zaporedji DNA polimeraze HV (99,51 %) sta bili dokazani tudi pri rumenonogem galebu ( Larus michahellis) in grivarju ( Columba palumbus). Prenos HV med različnimi vrstami pticami je bil opisan v številnih študijah, predvsem med pticami ujedami in njihovim ptičjim plenom, kot je domači golob (11, 14, 17, 25). Znano je, da nekatere vrste galebov plenijo tudi druge vrste ptic, vključno z golobi (85, 86, 87), vendar je glede na prehranjevalne navade rumenonogega galeba (88) majhna verjetnost, da bi prišlo do prenosa HV z grivarja na rumenonogega galeba. Razlika v nukleotidnem zaporedju HV bi lahko nastala zaradi procesa prilagoditve virusa na novega gostitelja (89). Rumenonogi galeb je tako dovzeten za HV, ki se razlikuje od predhodno opisanega CoHV1, dokazanega v vzorcih možganov poginjenega srebrnega galeba ( Larus argentatus) (17). Dokazana DNA polimeraza HV pri grivarju je imela le 60,8- do 61,3-odstotno homologijo v nukleotidnem zaporedju s CoHV1, ki je bil dokazan pri domačih golobih. Dokaz različnih DNA polimeraze HV pri grivarju in mestnem golobu (znotraj istega reda ptic) ni presenetljiv, saj smo podobne rezultate dobili tudi pri pticah iz drugih redov. Nukleotidna zaporedja CoHV1, dokazana pri domačih golobih, sprejetih na kliniko, so si z 99,51- do 100-odstotno homologijo v nukleotidnem zaporedju med seboj genetsko zelo podobna/identična in so se v filogenetskem drevesu razvrstila skupaj s CoHV1, dokazanim pri veliki uharici, sprejeti na kliniko, in CoHV1, dokazanim pri prerijskem sokolu. Ti rezultati so v skladu z dejstvom, da domači golobi veljajo za naravni rezervoar CoHV1 in so potencialni vir okužbe za vse za okužbo s HV dovzetne avtohtone vrste, ki bi lahko sobivale z njimi ali jih zaužile (14). Pri prostoživečih pticah, sprejetih na kliniko, je bila DNA polimeraza HV dokazana v brisu orofarinksa in/ali brisu kloake. Čeprav je bila DNA polimeraza HV pogosteje dokazana v odvzetih brisih orofarinksa (81,6 %) kot v odvzetih brisih kloake (18,4 %), je treba poudariti pomen kloakalnih brisov pri detekciji HV pri prostoživečih pticah, saj je bil HV pri treh pticah, sprejetih na kliniko, dokazan le v brisu kloake. Nizka detekcija HV v kloakalnih brisih lahko kaže na slabo pomnoževanje HV v prebavnem traktu in/ali ledvicah. Druga možnost je, da se je HV izločal v orofaringealni regiji in širil v prebavni trakt, kjer se je DNA polimeraza HV dokazala v brisih kloake. Ti rezultati dokazujejo, da je treba prostoživečim pticam z neznanim statusom okužbe in z neznanim trajanjem okužbe za dokaz HV odvzeti tako orofaringealne kot tudi kloakalne brise. Kljub okužbi je treba poudariti možnost nedetektiranega virusa v odvzetih vzorcih, kajti latentno neproduktivno stopnjo HV pri živih prostoživečih pticah je težko odkriti zaradi zahtevnega in v nekaterih primerih nedostopnega vzorčenja morebitnih latentnih mest Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 67 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija alfaHV, kot so senzorični gangliji ali mononuklearne celice (8, 90). Poleg tega so se številna ugotovljena nukleotidna zaporedja HV razlikovala od že znanih alfaHV, kar pomeni, da so lahko prisotni tudi drugi tkivni tropizmi in mesta replikacije, kot je trenutno opisano in znano za HV. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 68 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 4 SKLEPI (ZAKLJUČKI) Z opravljenimi raziskavami in objavljenimi študijami smo prvo postavljeno hipotezo (»Pri prostoživečih pticah v Sloveniji so prisotne okužbe s HV. Ti so genetsko podobni HV, kakor tudi različni od HV, ki so trenutno objavljeni v genski banki. Z molekularnimi metodami bomo HV dokazali pri novih vrstah ptic, pri katerih do zdaj še niso bili dokazani.«) potrdili. • Z opravljenimi raziskavami smo pri prostoživečih pticah v Sloveniji dokazali prisotne okužbe s HV. Ugotovili smo, da v populaciji prostoživečih ptic krožijo različni HV. Nekateri HV so genetsko podobni že znanim HV, večina pa se jih razlikuje od trenutno objavljenih v genski banki. • Z opravljenimi raziskavami smo razširili seznam dovzetnih gostiteljskih vrst prostoživečih ptic za okužbo s HV. Z opravljenimi raziskavami in objavljenimi študijami smo drugo postavljeno hipotezo (»Prenos HV poteka tako na horizontalni ravni med plenilci kot tudi s plena na plenilca.«) delno potrdili. • Z opravljenimi raziskavami smo ugotovili, da se HV prenaša z okuženih staršev na njihove mladiče. HV se lahko prenaša tudi prek plena, okuženega s HV, kot so okuženi golobi, na plenilsko ptico. • Rezultati študije so pokazali, da so večje vrste sov (npr. velika uharica in kozača) bolj okužene kot manjše vrste, kar bi bilo lahko povezano z njihovim načinom prehranjevanja, t. i. superplenilstvom, z večjimi pticami in tudi sesalci. • Prenosa HV z malih sesalcev na prostoživečo plenilsko ptico nismo zaznali. Z opravljenimi raziskavami in objavljenimi študijami smo drugo hipotezo potrdili, vendar to velja le za prenose s ptice na ptico, ne pa tudi s sesalca na ptico, kar kaže določeno evolucijsko specifičnost HV. Druge ugotovitve: • Pri primerjavi sov iz različnih habitatov, npr. lesna sova kot gozdna vrsta in mala uharica kot negozdna vrsta smo ugotovili, da okužba ni povezana z življenjskim prostorom. Okužba prav tako ni odvisna od filogenetska odnosa sov. • HV smo dokazali tudi v populaciji živih prostoživečih kozač in ugotovili, da okužba s HV nima zaznanega vpliva oziroma posledic na zdravje in reprodukcijo kozač. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 69 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija • Kljub tesnim sorodstvom lesne sove in kozače so naši izsledki pokazali, da se vrsti bistveno razlikujeta po dovzetnosti za okužbo s HV. • S študijo smo dokazali HV pri klinično zdravih pevkah, kar je v nasprotju z izsledki prejšnjih študij, v katerih so bili HV dokazani pri bolnih in poginulih pticah pevkah. HV nismo dokazali pri pticah pevkah, ki se selijo na dolge razdalje. • Za dokaz HV pri živih prostoživečih pticah se mora odvzeti tako orofaringealne kot kloakalne brise. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 70 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 5 POVZETEK Študija o prisotnosti HV pri poginjenih prostoživečih sovah je pokazala, da so v populaciji prostoživečih sov v Sloveniji prisotni HV z različnimi nukleotidnimi zaporedji DNA polimeraze HV. Predhodne študije genetske karakterizacije HV pri sovah so pokazale, da so dokazani HV pri sovah genetsko zelo podobni oziroma identični HV, dokazanim pri golobih in poimenovanim CoHV1. Izsledki naše raziskave kažejo, da se kar sedem od osmih ugotovljenih nukleotidnih zaporedij HV razlikuje od predhodno opisanih HV pri sovah in tudi od drugih nukleotidnih zaporedij HV, ki so objavljeni v genski banki. Na podlagi razmeroma velikega števila pregledanih osebkov lesne sove, pri katerih HV nismo dokazali, predvidevamo, da lesna sova kot predstavnik svoje vrste ni dovzetna za okužbo s HV. Lesna sova je zelo polimorfna vrsta, kar se ne kaže le v različnih barvnih odtenkih in oblikah, temveč tudi v veliki fiziološki variabilnosti in sposobnosti preživetja v spremenljivih okoljskih razmerah. Dokazali smo, da so večje vrste sov (npr. velika uharica in kozača) pogosteje okužene kot manjše vrste, kar bi bilo lahko povezano z njihovim načinom prehranjevanja, t. i. superplenilstvom, z večjimi pticami in tudi sesalci. Ob pregledu literature ugotavljamo, da smo prisotnost HV prvič dokazali pri veliki uharici. Prisotnost HV smo dokazali tudi pri živih prostoživečih sovah, ki smo jih odlovili na območju Krima in Jelovice med letoma 2017 in 2019. Ugotovili smo, da HV kljub prisotnosti nima zaznanega vpliva oziroma posledic na zdravje in reprodukcijo kozač. Pri živih in klinično zdravih lesnih sovah, kljub razmeroma visokemu številu pregledanih sov, HV nismo dokazali, tudi če je bila ta vrsta v testnem stiku s kozačo, okuženo s HV. Na podlagi naših rezultatov in drugih študij lahko izključimo pot prenosa HV prek uplenjenih okuženih glodavcev na sove, saj je bila med nukleotidnimi zaporedji HV, dokazanih pri sovah, miših in drugih glodavcih, zelo majhna podobnost (51,1 %). Verjetnejši je prenos HV znotraj vrste, s staršev na mladiče, in sicer prek sline oziroma pri hranjenju mladičev. Prisotnost DNA polimeraze HV smo dokazali tudi pri prostoživečih pticah pevkah, ki smo jih ujeli med jesensko selitvijo v Sloveniji. Ob primerjavi z drugimi študijami smo ugotovili, da je razširjenost HV pri testiranih pticah pevkah v Sloveniji dokaj nizka (0,8-odstotna; 4/525). Prostoživeče ptice pevke, ki so bile odlovljene med jesensko selitvijo, ob veterinarskem pregledu niso kazale kliničnih znakov bolezni, kar pomeni, da smo v omenjeni študiji dokazali HV pri klinično zdravih osebkih, kar je v nasprotju z izsledki prejšnjih študij, v katerih so HV dokazani le pri bolnih in poginulih pticah pevkah. Dokaz treh nukleotidnih zaporedij HV z relativno nizko homologijo kaže na verjetnost, da pri proučevanih selečih se pticah pevkah v Sloveniji krožijo različni HV. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 71 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Pri prostoživečih vrstah ptic, sprejetih v veterinarsko oskrbo, smo dokazali zelo različna nukleotidna zaporedja HV. Nekateri ugotovljeni HV se prenašajo prek okuženega plena, kot so domači golobi, medtem ko so bili drugi ugotovljeni HV bolj specifični za posamezno vrsto in/ali red ptic in bi pri pticah lahko bili del koevolucijskega razvoja virusa in gostitelja. Odvzem orofaringealnih in kloakalnih brisov pri kliničnem pregledu in diagnostiko bolnih, poškodovanih ali oslabelih ptic se je izkazal kot uporabna metoda za proučevanje virusov pri prostoživečih pticah, saj smo se s tem izognili nepotrebnemu stresu, ki bi ga sicer povzročili z lovljenjem ptic. Izsledki prav tako dokazujejo, da je treba prostoživečim pticam z neznanim statusom in z neznanim trajanjem okužbe za dokaz HV odvzeti tako orofaringealne kot tudi kloakalne brise. Pri številnih vrstah prostoživečih ptic smo z opravljeno raziskavo prvič dokazali prisotnost HV. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 72 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 6 SUMMARY A study of the presence of HV in dead wild owls showed that HVs with different nucleotide sequences of HV DNA polymerase are present in the population of wild owls in Slovenia. Previous genetic characterization studies of HVs in owls have shown that HVs in owls are genetically very similar to or identical with the HVs detected in pigeons, named CoHV-1. The research showed that seven out of eight HV nucleotide sequences identified differ from previously described HVs in owls and also from other HV nucleotide sequences published in GenBank. Based on the relatively high number of tawny owls examined, in which HVs were not detected, it is assumed that the tawny owl as a representative of its species is not susceptible to HV infection. The tawny owl is a very polymorphic species, which is reflected not only in different color morphs, but also in high variability in its physiology and survival capability in variable environmental conditions. The results indicate that larger owl species (e.g., the Eurasian eagle owl and Ural owl) are more often infected than smaller species, which could be related to their diet; that is, superpredation by taking larger birds and mammals. This is believed to be the first report of HV in the Eurasian eagle owl. HV was also detected in live free-living owls captured on Mount Krim and the Jelovica Plateau between 2017 and 2019. However, HV-infected owls did not show any clinical or productivity deviances. No HVs were detected in live free-living tawny owls, despite the relatively high number of owls tested and even if they were in close contact with HV-infected Ural owls. Based on these results and the results presented in other HV studies, it is possible to rule out a HV transmission route via infected small rodents to owls because there was very little similarity between the HV nucleotide sequences detected in owls, mice, and other rodents. It is more likely that HV is transmitted in an intraspecific manner, especially from adults to their chicks. This study also detected the HV DNA polymerase gene in free-living songbirds that were caught during the autumn migration in Slovenia. The occurrence of HV in free-living songbirds was quite low (0.8%; 4/525). During veterinary examination, free-living songbirds that were caught during the autumn migration showed no clinical signs of the disease, which means that HV was detected in clinically healthy individuals, which contrasts with previous studies, in which HV was detected only in sick and dead songbirds. The detection of HV with different partial DNA polymerase gene sequences indicates the probability that different HVs have been circulating in the population of free-living songbirds in Slovenia. Very different HV nucleotide sequences were detected in wild birds presented to the Clinic for Birds, Small Mammals, and Reptiles at the Faculty of Veterinary Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 73 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Medicine as wildlife casualties. Some HVs detected are transmitted through infected prey, such as domestic pigeons, whereas other HVs detected were more specific to bird species and/or orders and could be part of the coevolutionary process of their bird host. Oropharyngeal and cloacal swab sampling as part of the clinical examination and diagnostics of sick, injured, or weakened birds has proven to be a useful method for detecting viruses in wild birds because this avoids unnecessary stress that would otherwise be caused by hunting birds. The results of this study suggest that wild birds with an unknown infection status and unknown duration of infection should be tested with a combination of oropharyngeal and cloacal swabs to maximize the probability of herpesvirus detection. HVs were detected for the first time in many wild bird species. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 74 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 7 ZAHVALA Najiskreneje in najlepše se zahvaljujem mentorju izr. prof. dr. Jošku Račniku, in sicer za vso strokovno pomoč, prijaznost in potrpežljivost, ki mi jo je namenil med raziskovalnim delom. Hvala za vpeljavo v svet kliničnega in raziskovalnega dela. Nesebičnost, preudarnost in mirnost, ki jih je ob tem izkazoval, so mi v velik vzor. Hvala za stalno prisotnost in hitro odzivnost pri vseh mojih vprašanjih in dilemah. Hvala tudi za vse nasvete in modrosti, ki so velikokrat presegli okvire raziskovanja. Hvaležen sem za priložnost, da sem lahko deloval pod njegovim skrbnim mentorstvom. Zahvaljujem se somentorju doc. dr. Alu Vrezcu za strokovnost, prijaznost in vse predloge, povezane z raziskovalnim delom. Hvala za vključitev v terensko delo, pomoč pri zbiranju vzorcev, številne napotke in popravke ter prikaz pomembnosti interdisciplinarnosti v znanosti. Zahvaljujem se članom komisije, prof. dr. Alenki Dovč, prof. dr. Tatjani Avšič Županc in prof. dr. Davorinu Tometu, za nasvete in pregled doktorske naloge. Zahvaljujem se Javni agenciji za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije za financiranje v okviru usposabljanja mladega raziskovalca. Hvala asist. dr. Brigiti Slavec za opravljeno laboratorijsko delo, ki je bil eden od temeljev raziskave. Hvala za pomoč pri odvzemu vzorcev, sodelovanje, razlago nerazumljivih pojmov, konstruktivno mnenje in spodbudo. Zahvaljujem se Ireni Bahč, Sabini Bolha, Nini Kočar in Maruši Škrbec s Klinike za ptice, male sesalce in plazilce za pomoč pri kliničnem delu, odvzemu vzorcev ter za razumevanje in potrebno prilagajanje. Hvala prof. dr. Olgi Zorman Rojs za pomoč pri vzorčenju in administrativnih zadevah ter za nesebične nasvete in prijaznost. Še enkrat hvala prof. dr. Alenki Dovč za konstruktiven pregled doktorske naloge, predvsem pa za prijaznost, spodbudne besede in dobro kavo. Hvala znan. sod. dr. Urošu Krapežu za pomoč in nasvete pri pisanju prvih znanstvenih objav. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 75 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Najlepša in iskrena hvala Tjaši Sernel in Darji Krelj za pripravo in analizo nemalo vzorcev, ki so morali biti obdelani ob njunem rednem delu. Hvala tudi asist. dr. Nini Mlakar Hrženjak, dr. Renati Lindtner Knific, Marjeti Dremelj, Mojci Šepec, Lidiji Dežman, Marku Bogataju in Boštjanu Flajniku za pomoč pri vsakodnevnem delu. Hvala znan. sod. dr. Urški Kuhar za pomoč pri obdelavi filogenetskih podatkov. Hvala dr. Tomiju Trilarju za pomoč pri vzorčenju ptic pevk in za pregled znanstvenega dela. Hvala tudi za osebno predstavitev dela kustodiata in zbirke Prirodoslovnega muzeja Slovenije. Hvala dr. Zlatku Golobu in osebju Zatočišča za živali prostoživečih vrst za sodelovanje pri vzorčenju in oskrbi prostoživečih ptic. Hvala Biljani Grubišić za spodbudo, napotke in pomoč pri urejanju birokratskih zadev. Hvala Stanki Ujc, Slavici Sekulić in Brigiti Grecs-Smole za pomoč pri urejanju literature in iskanju člankov. Za lektoriranje se zahvaljujem Martinu Vrtačniku. Za tehnični pregled naloge se zahvaljujem Adamu Šuligoju. Hvala staršem za podporo in spodbudo, predvsem pa za privzgojene delovne navade. Hvala tudi bratu in prijateljem za dobronamerno opozarjanje na končanje doktorskega študija, motiviranje in sprostitev ob naših (preredkih) srečanjih. Na koncu se najlepše zahvaljujem soprogi Rebeki za zaupanje, razumevanje, motivacijo in prepotrebno sprostitev. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 76 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 8 LITERATURA 1. McGeoch DJ, Dolan A, Ralph AC. Toward a comprehensive phylogeny for mammalian and avian herpesviruses. J Virol 2000; 74(22): 10401–6. doi: 10.1128/jvi.74.22.10401-10406.2000 2. Davison AJ, Eberle R, Ehlers B et al. The order Herpesvirales. Arch Virol 2009; 154(1): 171–7. doi: 10.1007/s00705-008-0278-4 3. Hostnik P. Izbrana poglavja iz veterinarske virologije: učbenik za študente drugega letnika Veterinarske fakultete. Ljubljana : Zobozdravstvena ordinacija, Hribar Hostnik Andreja, 2013: 53–85. 4. Honess RW. Herpes simplex and ‘the herpes complex’: diverse observations and a unifying hypothesis. J Gen Virol 1984; 65(12): 2077–107. 5. Widén F, Neves CG, Ruiz‐Fons F et al. Herpesvirus Infections. In: Gavier‐Widén D, Duff JP, Meredith A, eds. Infectious diseases of wild mammals and birds in Europe. Chichester : Wiley-Blackwell, 2012: 3–36. 6. Tomaszewski E, Wilson VG, Wigle WL, Phalen DN. Detection and heterogeneity of herpesviruses causing Pacheco's disease in parrots. J Clin Microbiol 2001; 39(2): 533–8. doi: 10.1128/jcm.39.2.533-538.2001 7. Schat KA, Nair V. Marek’s disease. In: Saif YM, ed. Diseases of poultry. 12th ed. Ames : Blackwell Publishing, 2008: 452–514. 8. Kaleta EF, Lierz MW. Herpesviruses of free-living and pet birds. In: Williams SM, Dufour-Zavala L, Jackwood MW et al., eds. A laboratory manual for the isolation, identification, and characterization of avian pathogens. 6th ed. Jacksonville : American Association of Avian Pathologists, 2016: 221–31. 9. Steinmetz D . Serologische Untersuchungen zur Verbreitung von Antik rpern ge gen ein TaubenHerpesvirus unter ber cksichtigung der flugleistung von brieftauben in S dhessen. Giessen : University of Gissen, Faculty of Veterinary Medicine, 1995. Doktorska disertacija Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 77 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 10. Kaleta EF, Docherty DE. Avian herpesviruses. In: Thomas NJ, Hunter DB, Atkinson CT, eds. Infectious diseases of wild birds. Iowa : Blackwell Publishing, 2007: 63–8. 11. Gailbreath KL, Oaks JL. Herpesviral inclusion body disease in owls and falcons is caused by the pigeon herpesvirus (columbid herpesvirus 1). J Wildl Dis 2008: 44(2); 427–33. doi: 10.7589/0090-3558-44.2.427 12. Pinkerton ME, Wellehan JFX Jr, Johnson AJ, Childress AL, Fitzgerald SD, Kinsel MJ. Columbid herpesvirus-1 in two Cooper's Hawks ( Accipiter cooperii) with fatal inclusion body disease. J Wildl Dis 2008; 44(3): 622–8. doi: 10.7589/0090-3558-44.3.622 13. Phalen DN, Holz P, Rasmussen L, Bayley C. Fatal columbid herpesvirus-1 infections in three species of Australian birds of prey. Aust Vet J 2011; 89(5): 193–6. doi: 10.1111/j.1751-0813.2011.00706.x 14. Phalen DN, Alvarado C, Grillo V, Mason P, Dobson E, Holz P. Prevalence of columbid herpesvirus infection in feral pigeons from New South Wales and Victoria, Australia, with spillover into a wild powerful owl ( Ninox struena). J Wildl Dis 2017; 53(3): 543–51. doi: 10.7589/2016-07-158 15. Wellehan JFX Jr, Gagea M, Smith DA, Taylor WM, Berhane Y, Bienzle D. Characterization of a herpesvirus associated with tracheitis in Gouldian finches ( Erythrura [ Chloebia] gouldiae). J Clin Microbiol 2003; 41(9): 4054–57. doi: 10.1128/jcm.41.9.4054-4057.2003 16. Paulman A, Lichtensteiger CA, Kohrt LJ. Outbreak of herpesviral conjunctivitis and respiratory disease in Gouldian finches. Vet Pathol 2006; 43(6): 963–70. doi: 10.1354/vp.43-6-963 17. Wozniakowski GJ, Samorek-Salamonowicz E, Szymanski P, Wencel P, Houszka M. Phylogenetic analysis of Columbid herpesvirus-1 in rock pigeons, birds of prey and non-raptorial birds in Poland. BMC Vet Res 2013; 9: e52 (9 str.) doi: 10.1186/1746-6148-9-52 18. Gerlach H. Viruses. In: Ritchie BW, Harrison GJ, Harrison LR, eds. Avian medicine: principles and application. Lake Worth : Wingers Publishing, 1994: 862–948. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 78 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 19. Ritchie BW. Avian viruses: function and control. Lake Worth: Wingers Publishing, 1995: 206–7. 20. Zsivanovits P, Forbes NA, Zvonar LT et al. Investigation into the seroprevalence of falcon herpesvirus antibodies in raptors in the UK using virus neutralization tests and different herpesvirus isolates. Avian Pathol 2004; 33(6): 599–604. doi: 10.1080/03079450400013113 21. Graham DL, Mare CJ, Ward FP, Peckham MC. Inclusion body disease (herpesvirus infection) of falcons (IBDF). J Wildl Dis 1975; 11(1): 83–91. 22. Aini I, Shih LM, Castro AE, Zee YC. Comparison of herpesvirus isolates from falcons, pigeons and psittacines by restriction endonuclease analysis. J Wildl Dis 1993; 29(2): 196– 202. doi: 10.7589/0090-3558-29.2.196 23. Remple D. Considerations on the production of a safe and efficacious falcon herpesvirus vaccine. In: Lumeij JT, Remple D, Redig PT, Lierz M, Cooper JE, eds. Raptor biomedicine III. Lake Worth: Zoological Education Network, 2000: 13–24. 24. Rose N, Warren AL, Whiteside D et al. Columbid herpesvirus-1 mortality in great horned owls ( Bubo virginianus) from Calgary, Alberta. Can Vet J 2012; 53(3): 265–8. 25. Žlabravec Z, Krapež U, Slavec B, Vrezec A, Zorman Rojs O, Račnik J. Detection and phylogenetic analysis of herpesviruses detected in wild owls in Slovenia. Avian Dis 2018; 62(4): 397–403. doi: 10.1637/11899-051418-Reg.1 26. Spatz SJ, Volkening JD, Ross TA. Molecular characterization of the complete genome of falconid herpesvirus strain S-18. Virus Res 2014; 188: 109–21. doi: 10.1016/j.virusres.2014.03.005 27. Guo Y, Li S, Sun X, et al. Complete genome sequence and evolution analysis of a columbid herpesvirus type 1 from feral pigeon in China. Arch Virol 2017; 162(7): 2131–3. doi: 10.1007/s00705-017-3329-x 28. Penteriani V, del Mar Delgado M. The eagle owl. London : Bloomsbury publishing, 2019: 122–42. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 79 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 29. Mihelič T. Diet of the eagle owl Bubo bubo in southwestern Slovenia. Acrocephalus 2002; 23(112): 81–6. 30. Halliwell WH. Lesions of Marek’s disease in great horned owl. Avian Dis 1971; 15(1): 49– 55. 31. Kaleta EF. Vermehrung, Interfenez und Interferoninduktion aviarer Herpesvirusarten. Beitrag zur Schutzimpfung gegen die Mareksche Krankheit. Zentralbl, Veterinarmed, 1975; 24: 406–75. 32. Cardoso M, Hyatt A, Selleck P, et al. Phylogenetic analysis of the DNA polymerase gene of a novel alphaherpesvirus isolated from an Indian gyps vulture. Virus Genes 2005; 30(3): 371–81. doi: 10.1007/s11262-005-6781-8 33. Seimon TA, McAloose D, Raphael B, et al. A novel herpesvirus in 3 species of pheasants: mountain peacock pheasant ( Polyplectron inopinatum), Malayan peacock pheasant ( Polyplectron malacense), and Congo peafowl ( Afropavo congensis). Vet Pathol 2012; 49(3): 482–91. doi: 10.1177/0300985811424733 34. Jin L, Lohr CV, Vanarsdall AL et al. Characterization of a novel alphaherpesvirus associated with fatal infections of domestic rabbits. Virology 2008; 378(1): 13–20. doi: 10.1016/j.virol.2008.05.003 35. Sasaki M, Setiyono A, Handharyani E, et al. Isolation and characterization of a novel alphaherpesvirus in fruit bats. J Virol 2014; 88(17): 9819–29. doi: 10.1128/JVI.01277-14 36. Galeota JA, Napier JE, Armstrong DL, Riethoven J, Rogers DG. Herpesvirus infection in rock hyraxes ( Procavia capensis). J Vet Diagn Invest 2009; 21(4): 531–5. doi: 10.1177/104063870902100418 37. Smolarek Benson KA, Manire CA, Ewing RY, et al. Identification of novel alpha and gammaherpesviruses from cutaneous and mucosal lesions of dolphins and whales. J Virol Methods 2006; 136(112): 261–6. doi: 10.1016/j.jviromet.2006.03.033 38. Galeotti P, Sacchi R. Differential parasitaemia in the tawny owl ( Strix aluco): effects of colour morph and habitat. J Zool 2003; 261(1): 91–9. doi: 10.1017/s0952836903003960 Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 80 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 39. Grašytė G, Rumbutis S, Dagys M, Vaitkuviene D, Treinys R. Tawny Owl females of intermediate colour morph reproduce better and increase in a local polymorphic population. Ornis Fenn 2017; 94(1): 33–44. 40. Karell P, Kohonen K, Koskenpato K. Specialist predation covaries with colour polymorphism in tawny owls. Behav Ecol Sociobiol 2021; 75: e45 (8 str.) doi: 10.1007/s00265-021-02986-6 41. Solonen T. Does plumage colour signal fitness in the tawny owl Strix aluco? J Avian Biol 2021: e02470 (7 str.) doi: 10.1111/jav.02470 42. Vrezec A. Melanism and plumage variation in macroura Ural owl. Dutch Bird 2009; 31(3): 159–70. 43. Mikkola H. Owls of Europe. London : Bloomsbury Publishing, 1983: 87–97. 44. Lourenco R, Santos SM, Rabaca JE, Penteriani V. Superpredation patterns in four large European raptors. Popul Ecol 2011; 53(1): 175–85. doi: 10.1007/s10144-010-0199-4 45. Obuch J, Danko Š, Mihok J, Karaska D, Šimák L. Diet of the Ural owl ( Strix uralensis) in Slovakia. Slovak Raptor J 2013; 7: 59–71. doi: 10.2478/srj-2013-0003 46. Birrer S. Synthesis of 312 studies on the diet of the long-eared owl Asio otus. Ardea 2009 ; 97(4): 615–24. doi: 10.5253/078.097.0430 47. Tome D. Changes in the diet of long-eared owl Asio otus: seasonal patterns of dependence on vole abundance. Ardeola 2009; 56(1): 49–56. 48. König C, Weick F, Becking JH. Owls: a guide to the owls of the world. New Haven : Yale University Press, 1999: 260–72. 49. llmonen P, Hakkarainen H, Koivunen V, Korpimäki E, Mullie A, Shutler D. Parental effort and blood parasitism in Tengmalm’s owl: effects of natural and experimental variation in food abundance. Oikos 1999; 86: 79–86. doi: 10.2307/3546571 50. Korpimäki E, Hakkarainen H, Ilmonen P, Wiehn J. Detrimental effects of blood parasites on parental effort and reproductive success of Tengmalm’s owls ( Aegolius funereus) and Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 81 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Eurasian kestrels ( Falco tinnunculus). In: Newton I, Kavanagh R, Olson J, Taylor IR, eds. Ecology and conservation of owls. Colingwood : CSIRO Publishing, 2002; 66–71. 51. Žlabravec Z, Trilar T, Slavec B, et al. Detection of herpesviruses in passerine birds captured during autumn migration in Slovenia. J Wildl Dis 2021; 57(2): 368–75. doi: https://doi.org/10.7589/JWD-D-20-00032 52. Ratajc U, Breskvar M, Džeroski S, Vrezec A. Differential responses of coexisting owls to annual small mammal population fluctuations in temperate mixed forest. Ibis 2021; 164(2): 535–51. doi: 10.1111/ibi.130290 53. Amery-Gale J, Hartley CA, Vaz PK, et al. Avian viral surveillance in Victoria, Australia, and detection of two novel avian herpesviruses. Plos One 2018; 13(3): e0194457 (19 str.) doi: 10.1371/journal.pone.0194457 54. Gleeson MD, Moore BA, Edwards SG, et al. A novel herpesvirus associated with chronic superficial keratitis and proliferative conjunctivitis in a great horned owl ( Bubo virginianus). Vet Ophthalmol 2019; 22(1): 67–75. doi: 10.1111/vop.12570 55. Kang H, Lia B, Ma X, Xua Y. Evolutionary progression of mitochondrial gene rearrangements and phylogenetic relationships in Strigidae ( Strigiformes). Gene 2018; 674: 8–14. doi: 10.1016/j.gene.2018.06.066 56. Wink M, El-Sayed AA, Sauer-Gürth H, Gonzalez J. Molecular phylogeny of owls ( Strigiformes) inferred from DNA sequences of the mitochondrial cytochrome b and the nuclear RAG-1 gene. Ardea 2009; 97(4): 581–91. doi: 10.5253/078.097.0425 57. Petty SJ, Saurola P. Strix aluco: tawny owl. In: Hagemeijer WJM, Blair MJ, Brouwer P, eds. The EBCC atlas of European breeding birds: their distribution and abundance. London : T & AD Poyser, 1997: 410–1. 58. Pietiäinen H, Saurola P. Strix uralensis: Ural Owl. In: Hagemeijer WJM, Blair MJ, Brouwer P, eds. The EBCC atlas of European breeding birds: their distribution and abundance. London : T & AD Poyser, 1997: 412–3. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 82 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 59. Huntley B, Green RE, Collingham YC, Willis SG. A climatic atlas of European breeding birds. Barcelona : Lynx Edicions, 2007: 521. 60. Vrezec A, Saurola P, Avotins A, Kocijancic S, Sulkava S. A comparative study of Ural owl Strix uralensis breeding season diet within its European breeding range, derived from nest box monitoring schemes. Bird Study 2018; 65(suppl 1): S85–S95. doi: 10.1080/00063657.2018.1553026 61. Huff JL, Barry PA. B-virus ( Cercopithecine herpesvirus 1) infection in humans and macaques: potential for zoonotic disease. Emerg Infect Dis 2003; 9(2): 246–50. doi: 10.3201/eid0902.020272 62. Estep RD, Messaoudi I, Wong SW. Simian herpesviruses and their risk to humans. Vaccine 2010; 28(suppl 2): B78–B84. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.11.026 63. Vindevogel H, Duchatel JP. Miscellaneous herpesvirus infections. In: Calnek BW, Barnes JH, Beard CW, McDougald LR, Saif YM, eds. Diseases of poultry. 10th ed. Ames : Wiley-Blackwell, 1997: 757–61. 64. Ehlers B, Küchler J, Yasmum N, Dural G, Voigt S, Schmidt-Chanasit J et al. Identification of novel rodent herpesviruses, including the first gammaherpesvirus of Mus musculus. J Virol 2007; 81(15): 8091–100. doi: 10.1128/JVI.00255-07 65. Burtscher H, Sibalin M. Herpesvirus strigis: host spectrum and distribution in infected owls. J Wildl Dis 1975; 11(2): 164–9. 66. Žlabravec Z, Vrezec A, Slavec B, Kuhar U, Zorman Rojs O, Račnik J. Herpesvirus infection in a breeding population of two coexisting Strix owls. Animals 2021; 11(9): 2519. doi: 10.3390/ani11092519. 67. Niemeyer C, Favero CM, Shivaprasad HL et al. Genetically diverse herpesviruses in South American Atlantic coast seabirds. Plos One 2017; 12(6): e0178811 (13 str.) doi: 10.1371/journal.pone.0178811 Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 83 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 68. Verdugo C, Pinto A, Ariyama N, Moroni M, Hernandez C. Molecular identification of avian viruses in neotropic cormorants ( Phalacrocorax brasilianus) in Chile. J of Wildl Dis 2019; 55(1): 105–12. doi: 10.7589/2017-10-256 69. Borsanyiova M, Kubascikova L, Sarmirova S, Vari SG, Bopegamage S. Assessment of a swab collection method without virus transport medium for PCR diagnosis of coxsackievirus infections. J Virol Methods 2018; 254: 18–20. doi: 10.1016/j.jviromet.2018.01.010 70. Spackman E, Pedersen JC, McKinley ET, Gelb J. Optimal specimen collection and transport methods for the detection of avian influenza virus and Newcastle disease virus. BMC Vet Res 2013; 9: e35 (12 str.) doi: 10.1186/1746-6148-9-35 71. Druce J, Garcia K, Tran T, Papadakis G, Birch C. Evaluation of swabs, transport media, and specimen transport conditions for optimal detection of viruses by PCR. J Clin Microbiol 2012; 50(3): 1064–5. doi: 10.1128/JCM.06551-11 72. Moore C, Corden S, Sinha J, Jones R. Dry cotton or flocked respiratory swabs as a simple collection technique for the molecular detection of respiratory viruses using real-time NASBA. J Virol Methods 2008; 153(2): 84–9. doi: 10.1016/j.jviromet.2008.08.001 73. Boppana SB, Ross SA, Shimamura M et al. Saliva polymerase-chainreaction assay for cytomegalovirus screening in newborns. N Engl J Med 2011; 364(22): 2111–8. doi: 10.1056/NEJMoa1006561 74. Ramis A, Tarreś T, Fondevila D, Ferrer L. Immunocytochemical study of the pathogenesis of Pacheco’s parrot disease in budgerigars. Vet Microbiol 1996; 52(1-2): 49–61. doi: 10.1016/0378-1135(96)00062-4 75. Phalen DN. Viruses. In: Altman RB, Clubb SL, Dorrestein GM, Quesenberry K, eds. Avian medicine and surgery. Philadelphia : W. B. Saunders Company, 1997: 281–322. 76. Barton ES, White DW, Cathelyn JS et al. Herpesvirus latency confers symbiotic protection from bacterial infection. Nature 2007; 447(7142): 326–7. doi: 10.1038/nature05762 Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 84 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 77. Saito F, Ito T, Connett JM, et al. MHV68 latency modulates the host immune response to influenza A virus. Inflammation 2013; 36(6): 1295–303. doi: 10.1007/s10753-013-9668-1 78. Furman D, Jojic V, Sharma S, et al. Cytomegalovirus infection enhances the immune response to influenza. Sci Transl Med 2015; 7(281): e281ra43 (22 str.) doi: 10.1126/scitranslmed.aaa2293 79. White DW, Keppel CR, Schneider SE et al. Latent herpesvirus infection arms NK cells. Blood 2010; 115(22): 4377–83. doi: 10.1182/blood-2009-09-245464 80. Raffegerst S, Steer B, Hohloch M, Adler H. Prevention of tumor formation by latent gammaherpesvirus infection. PLoS One 2015; 10(12): e0145678 (10 str.) doi: 10.1371/journal.pone.0145678 81. Lockwood JL, Hoppes MF, Marchetti MP. Invasion ecology. 2nd ed. Chichester : Wiley-Blackwell, 2013: 1–18. 82. Newton I. The speciation & biogeography of birds. Amsterdam : Academic Press, 2003: 143–50. 83. Vrezec A. Winter diet of one female Ural owl ( Strix uralensis) at Ljubljansko barje (central Slovenia). Buteo 2001; 12: 71–6. 84. Jarvis ED, Mirarab S, Aberer AJ, et al. Whole-genome analyses resolve early branches in the tree of life of modern birds. Science 2014; 346(6215): 1321–31. doi: 10.1126/science.1253451 85. Nietlisbach P, Germain RR, Bousquet CAH. Observations of glaucous-winged gulls preying on passerines at a Pacific northwest colony. Wilson J Ornithol 2014; 126(1): 155–8. doi: 10.1676/13-077.1 86. Skorka P, Martyka R, Wojcik JD, Lenda M. An invasive gull displaces native waterbirds to breeding habitats more exposed to native predators. Popul Ecol 2014; 56(2): 359–74. doi: 10.1007/s10144-013-0429-7 Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 85 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 87. Canestrelli A, Fraticelli F. Yellow-legged gull Larus michahellis captures and drowns a feral pigeon Columba livia. Riv Ital Ornitol 2016; 86(1): e69. doi: 10.4081/rio.2016.313 88. Glutz von Blotzheim UN. Handbuch der Vögel Mitteleuropas, Vol. 8/I Charadriiformes. Verlagsgesellschaft Wiesbaden, Akademische Verlag 1982 : 699. 89. Parrish CR, Holmes EC, Morens DM et al. Cross-species virus transmission and the emergence of new epidemic diseases. Microbiol Mol Biol Rev 2008; 72(3): 457–70. doi: 10.1128/MMBR.00004-08 90. Maclachlan NJ, Dubovi EJ, Barthold SW, Swayne DE, Winton JR. Fenner’s Veterinary Virology. 5th ed. London : Elsevier 2016: 189–216. Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 86 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija 9 PRILOGE Priloga 1: Dovoljenje za objavo članka 2.1 Z. Žlabravec: Herpesvirusi pri izbranih skupinah prostoživečih ptic 87 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2022. Doktorska disertacija Priloga 2: Dovoljenje za objavo članka 2.3