Branka Rozman1, Mirjana Gasperlin2, Julijana Kristl3 Preventivno delovanje naravnih antioksidantov na nastanek kožnega raka pod vplivom ultravijoličnih žarkov Preventive Effects of Natural Antioxidants On Ultraviolet - Induced Skin Cancer IZVLEČEK_ KLJUČNE BESEDE: kožni rak, ultravijolično sevanje, oksidativni stres, antioksidanti, učinkovine naravnega izvora Pogostost nemelanomskega kožnega raka narašča in primarna preventiva, vključno z uporabo varovalnih izdelkov za sončenje, se je pokazala kot neustrezna. Kožni rak je močno povezan s kronično izpostavljenostjo soncu. Ultravijolični B-žarki lahko sprožijo nastanek kožnih tumorjev z neposrednimi poškodbami DNA, mutacijami tumorsupresorskih genov in protoonkogenov, medtem ko ultravijolični A-žarki povzročajo kožnega raka predvsem posredno, preko nastanka reaktivnih kisikovih in dušikovih spojin, kot so superoksidni anion, hidroksilni radikal, vodikov peroksid, dušikov oksid in drugi. Ultravijolično sevanje povzroča tudi vnetje in imunosupre-sijo v koži. Članek podaja pregled možnosti preventive kožnega raka s spojinami biogenega in naravnega izvora. Zanimiva možnost zaščite je krepitev endogenega sistema antioksidantov z nanosom na kožo bodisi encimskih bodisi neencimskih antioksidantov. Med pomembnejše encimske antioksidante sodijo glutation peroksidaza, katalaza, superoksid dismutaza in hem oksigenaza, med neencimske pa glutation, vitamina C in E, P-karoten, ubikinon in melani-ni. Močno antioksidativno delovanje izkazujejo tudi številne spojine, ki se nahajajo v užitnih rastlinah. V slednjo skupino uvrščamo mnoge polifenole, flavonoide in aciklične karotenoi-de. Nekatere naravne spojine, kot so na primer kurkumin, gingerol ali kapsaicin, sicer niso antioksidanti, vendar dokazano delujejo preventivno pri kožnem raku, saj zavirajo vnetje, mutacije genov in imunosupresijo. Rezultati predkliničnih testiranj naravnih antioksidantov v preventivi kožnega raka so sicer zelo obetajujoči, podatki o klinični učinkovitosti pa niso vedno prepričljivi. ABSTRACT_ KEY WORDS: skin cancer, ultraviolet radiation, oxidative stress, antioxidants, active substances of natural orïgn The incidence of non-melanoma skin cancer is rising and primary prevention, including the use of sunscreens, has been proven inadequate. Skin cancer strongly correlates with chronic sun exposure. Here we first describe the effects of ultraviolet light on skin: ultraviolet B light can initiate skin tumor development through direct DNA damage and mutation in tumor suppressor and prooncogenes whereas ultraviolet A light is particulary important in causing oxidative stress by inducing reactive oxygen and nitrogen species such as superoxide anion, hydroxyl radical, hydrogen peroxide and nitric oxide. Ultraviolet radiation also causes 1 As. Branka Rozman, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, Ljubljana. 2 Izr. prof. dr. Mirjana Gašperlin, mag.farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, Ljubljana. 3 Prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, Ljubljana. inflammation and immunosuppression in the skin. The possibilities for photoprotection of the skin are rewieved. A preventive strategy to support the endogenous antioxidant system by topical delivery of various enzymes or non-enzymatic antioxidants is described. The most important enzymatic antioxidants are glutathione peroxidase, catalase, superoxide dismutase and haem-oxygenase. The representatives of non-enzymatic skin antioxidants are glutathione, a-tocopherol, ascorbate, P-carotene, ubiquinon and melanins. Numerous substances, partic-ulary polyphenols, flavonoids and acyclic carotenids, derived from nutrient plants demonstrate strong antioxidant activity, too. Some substances of the natural orign such as curcumin, cap-saicin and gingerol have also been shown to reduce photocarcinogenesis, not only because of their antioxidant activity but also due to their capacity to prevent inflammation, gene mutation or immunosuppression. Although the results of preclinical studies are very promising, clinical evidence that natural antioxidants prevent skin cancer is not always convincing. 142 UVOD Rak je eden najpogostejših vzrokov smrti v razvitem svetu. Z daljšanjem življenjske dobe in večanjem deleža mestnega prebivalstva ter posledičnih sprememb v življenjskem okolju in slogu je pričakovati, da se bo število obolelih še večalo (1). V Avstraliji in v državah zahodne Evrope je pri belopoltih prebivalcih najpogostejša vrsta raka kožni rak (2). Samo v ZDA odkrijejo vsako leto več kot 700.000 primerov nemelanomskega kožnega raka. Malignega melanoma ne prištevamo h kožnemu raku v ožjem pomenu besede, saj je povezanost nastanka melanoma z izpostavljanjem soncu slabo poznana. Kožni rak se namreč praviloma pojavlja na mestih, izpostavljenih soncu, in danes vemo, da so UV-žarki najpomembnejši etiološki dejavnik kožnih karcinomov. Najpogostejši in klinično najpomembnejši obliki malignega tumorja kože sta bazocelularni karcinom (basal cell carcinoma - BCC), ki predstavlja več kot 80 % vseh kožnih rakov, in spinocelularni karcinom (squamous cell carcinoma - SCC), ki predstavlja približno 16 % malignomov kože (2). Tako pri BCC kot pri SCC pride do preobrazbe celic zarodne plasti kože, vendar je BCC počasi rastoč in redko metastazira, medtem ko je lahko SCC zelo invaziven in pogosto metasta-zira (3, 4). Glavni vzrok za nastanek kožnega raka je torej tako pri ljudeh kot pri živalih UV-seva-nje. Ultravijolični del svetlobe lahko, glede na valovno dolžino, delimo na tri dele: • UVA-spekter z valovno dolžino 320-400 nm in energijo okoli 310kJ/mol predstavlja 90-99% UV-svetlobe, ki doseže površje zemlje in je šibek iniciator raka, je pa močan tumor promotor. Prodira globoko v kožo in lahko povzroči tudi poškodbe usnjice. • UVB-spekter z valovno dolžino med 280 in 320 nm predstavlja 1-10% UV-svetlobe in je najnevarnejši del spektra, saj je močan tumor iniciator, deluje pa tudi kot tumor promotor. Večina UVB-svetlobe se absorbira v pokožnici. Pri ljudeh z občutljivo kožo povzroča blage sončne opekline že po 15 minutah obsevanja. • UVC-spekter z valovno dolžino 200-280 nm in energijo do 12000 kJ/mol zaradi ozonske plasti praktično ne doseže površja zemlje (4-7). Učinki UV-žarkov na kožo so odvisni od njihove moči in časa obsevanja. Kratkotrajno izpostavljanje UV-sevanju deluje na kožo ugodno, saj poveča sintezo vitamina D, ki varuje pred genetskimi poškodbami in karcinoge-nezo. Visoki odmerki UV-sevanja povzročijo smrt celic kože, kar se odraža kot sončne opekline. Kronična izpostavljenost odmerkom UV-sevanja med obema skrajnostima pa: • povzroča mutacije, • povzroča vnetja in • zavira imunski sistem kože, kar vodi do nastanka kožnega raka - slika 1 (5). Primarna preventiva, tj. uporaba varovalnih izdelkov za sončenje in nošenje zaščitnih oblačil, se je pokazala kot nezadostna, saj pojavnost kožnega karcinoma, predvsem zaradi pomanjkljive ozaveščenosti ljudi, raste. Rezultati raziskav učinkovitosti izdelkov za sončenje so si nasprotujoči. V nekaterih primerih so celo dokazali, da se po njihovi uporabi zdrava koža bazocelularni karcinom sončna svetloba -► reaktivne spojine solarna keratoza vnetje vnetna solarna keratoza celična imunost spontana regresija Slika 1. Model razvoja spinocelularnega karcinoma. Sončna svetloba povzroči mutacije genov in imunosupresijo, kar vodi do nastanka benignih lezij solarne keratoze. Ce se nadalje razvije vnetje, se v kožo infiltrirajo makrofagi in nevtrofilci, poveča se nastajanje prostih radikalov, kar vodi do preobrazbe benignega tumorja v maligni. V nekaterih primerih se okrepi imunski odziv v koži in tumor se spontano zmanjša (prirejeno po 5). ljudje dlje izpostavljajo soncu, zato se možnost nastanka raka poveča (4). Nove strategije preprečevanja kožnega raka poudarjajo predvsem osveščanje ljudi o nevarnosti sončnih žarkov in pomen učinkovitejše zaščite kože. Izredno pomembno je, da pričnemo s preventivnim ravnanjem dovolj zgodaj, saj se bolezen pojavi po letih ali desetletjih delovanja škodljivih dejavnikov (3, 4). VPLIV ULTRAVIJOLIČNIH ŽARKOV NA NASTANEK IN RAZVOJ KOŽNEGA RAKA Proces kožne kancerogeneze, ki jo sproži UVB-svetloba, je povzet na sliki 2. Rast tumorjev je razdeljena v tri dele: ini-ciacijo, promocijo in progresijo. Za iniciacijo je dovolj subkancerogeni odmerek t. i. inicia-torja, ki nepovratno spremeni genski material celic, tako da se te začnejo drugače odzivati na tumor promotorje. UVB-svetloba prodira do bazalne plasti vrhnjice in neposredno povzroča poškodbe DNA, predvsem dimerizacijo timina. V procesu kožne kancerogeneze pride tako že v zgodnji fazi do mutacije tumor supresorskega gena TP53. Za razvoj raka so poleg mutacij tumorsupresorskih genov pomembne tudi mutacije proonkoge-nov, zlasti RAS. Promocija tumorja je posledica izpostavljenosti tkiva ponavljajočim se odmerkom t. i. promotorja. UVB-svetloba deluje kot tumor promotor predvsem preko 143 UVB svetloba Iniciacija Promocija 1 Progresija DNA poškodbe Aktivacija AP-1 in indukcija COX2 Konstitutivna ekspresija AP-1in COX2 genetska nestabilnost Mutacija RAS in TP53 Nastanek benignih tumorjev Pretvorba benignega tumorja v maligni, metastaziranje Slika 2. Stopnje kožne kancerogeneze, ki jo sproži UVB-svetloba (prirejeno po 4). RRAS- proonkogen; JP53 - tumor supresorski gen; AP-1 - proteinski aktivator 1; COX2 - ciklooksigenaza 2. 144 UVB svetloba COX1 in COX2 PLC PLAj \ _ / 2O2, 2e- PGH tromboksan PGE2, pgf2, pgi2 T proliferacija keratinocitov T vnetje T kožna kancerogeneza Slika 3. Vpliv UVB-sevonjo na promocijo kožnega raka. COXI je konstitutiven encim, ki je vnizkih koncentracijah izražen vStevilnih organih, med drugim tudi vkoži, COX2 pa je inducibilen encim, katerega ekspresijo lahko vkoži sproži UVB-svetloba (prirejeno po 4). PLC - fosfolipaza C; PLA - fosfolipaza A2; PGH2, PGE2, PGF2, PGI2-prostaglandini. aktivacije transkripcijskega faktorja, imenovanega proteinski aktivator 1 (AP-1) in preko izražanja gena za ciklooksigenazo 2 (COX2). AP-1 sproži sintezo matriks metaloproteinaz, citokinov, hem oksigenaze in ornitin dekar-boksilaze (ODC). Povečano delovanje matriks metaloproteinaz ima za posledico poškodbe kolagena. Ornitin dekarboksilaza je najpomembnejši encim pri sintezi poliaminov, ki imajo v celicah številne funkcije in so nujno potrebni za rast in razvoj celic. V zdravi celi- ci sprožijo delovanje ODC, hormoni in rastni faktorji, v tumorskih celicah pa je neprestano aktivna. Sinteza COX2 je verjetno posledica povečane količine arahidonske kisline v celicah, saj UV-svetloba poveča tudi delovanje fosfolipaze A2. Vzroke in posledice akti-vacije COX2 prikazuje slika 3. V tej fazi nastanejo na koži benigni tumorji, imenovani papilomi. V stopnji progresije kožnega raka je AP-1 neprestano aktivirana, COX2 postane konstitutivni encim in posledično se benigni tumorji preobrazijo v maligne. Maligni tumorji izkazujejo nestabilnost genetskega materiala (spremembe v številu kopij gena, mutacije, premikanje genov idr.) (2, 4, 5, 8, 9). Medtem ko UVB povzroča neposredno škodo na celicah kože, pa UVA-svetloba povzroča kožnega raka predvsem posredno, preko nastanka reaktivnih spojin (RS - reactive species), ki med drugim povzročajo poškodbo DNA, kar vodi do mutacij in nenormalnega razvoja celic (8). DEFINICIJA REAKTIVNIH SPOJIN, NJIHOV NASTANEK IN VLOGA PRI RAZVOJU RAKA Tabela 1 podaja najpogostejše reaktivne spojine. ROS je skupno ime za kisikove radikale in nekatere kisikove spojine, ki sicer niso radikali, vendar se zlahka pretvorijo v radikale in/ali pa delujejo kot oksidanti. Reaktivne dušikove spojine (RNS - reactive nitrogen species) je skupno ime za dušikov oksid, njegove radikale in nekatere neradikalske dušikove spojine. Poleg ROS in RNS sodelujejo pri nastanku raka tudi reaktivne klorove spojine (reactive chlorine species) (6). Slika 4 prikazuje učinke UVA-sevanja, ki je glavni vir RS v koži. Številni kromofori (npr. porfirini, hem, mnogi viri pa so še neraziskani) lahko v prisotnosti UV-svetlobe tvorijo ROS. UVA-sevanje poveča tudi delovanje ksantin oksidaze v kerati-nocitih, s čimer se poveča količina superok-sidnih radikalov. Tako UVA- kot UVB-svetloba Tabela 1. Radikalske in neradikalske reaktivne spojine (10). Prosti radikali Neradikalske reaktivne spojine Reaktivne kisikove spojine Superoksid O2 Vodikov peroksid H2O2 Hidroksil OH Hipoklorna kislina HOCl Hidroperoksil HO2 Ozon O3 Peroksil RO2 Singletni kisik O2' Alkoksil RO- Organski peroksidi ROOH Karbonat CO3- Peroksinitrit ONOO- Ogljikov dioksid CO2- Peroksinitrilna kislina ONOOH Reaktivne du{ikove spojine Dušikov oksid NO' Dušikova (III) kislina HNO2 Dušikov dioksid NO2 Nitrozilni kation NO+ Nitrozilni anion NO- Didušikov tetroksid N2O4 Didušikov trioksid N2O3 Peroksinitrit ONOO- Peroksinitrilna kislina ONOOH Nitrilni kation NO2+ Alkil peroksinitriti ROONO Nitril klorid NO2Cl Reaktivne klorove spojine Atomarni klor Cl' Hipoklorna kislina HOCl Nitrilni klorid NO2Cl Kloramini Molekularni klor Cl2 aktivirata NO-sintaze (NOS), ki iz L-arginina tvorijo NO. Nastali NO reagira s superoksi-dom, nastane peroksinitrit, ki je v ravnotežju s peroksinitrilno kislino. Obe spojini povzročata 145 kromofori .. i > ROS ■ i > NO-sintaza L-arginin peroksi- peroksinitrilna NO nitrit kislina po{kodbe DNA Slika 4. UV-svetloba sproži zaporedje oksidativnih poškodb v koži, kot je razloženo v besedilu (5). OBRAMBNI MEHANIZMI CELIC PRED RS POPRAVLJALNI MEHANIZMI PREPREČEVALNI MEHANIZMI FIZIKALNA OBRAMBA ANTIOKSIDATIVNA OBRAMBA 1 1 1 \ encimi za popravljanje preprečevanje nastajanja ROS stabilizacija encimi, lovilci napak v DNA s keliranjem kovinskih ionov bioloških membran prostih radikalov Slika 5 A. Pregled vseh obrambnih mehanizmov celic pred RS s primeri (II). poškodbe DNA in proteinov ter začenjata peroksidacijo lipidov (8). Vkeratinocitih nastajajo RS tudi kot odgovor na vnetje, ki ga je sprožila UVB-svetloba. Rezultati raziskav nakazujejo, da UV-žarki sprožijo vdiranje nev-trofilcev in makrofagov v kožo, zaradi česar se poveča količina faktorja tumorske nekroze 146 (TNF) in interlevkina 1a (IL-1a), kar še razširi vnetje in nastajanje prostih radikalov, med drugim tudi hipoklorne kisline, ki je močen oksidant. Aktivirani nevtrofilci v koži so tudi vir proteinaz in nekaterih drugih snovi, ki delujejo sinergistično z ROS in povzročajo oksidativne poškodbe celic (7, 8). Nastali Sintetizirani v celici (GSH, NADH, karnozin) Vneseni v telo (karoten, tokoferoli, polifenolili...) Slika 5 B. Antioksidativni obrambni sistem živih celic (II). ROS OH' O," RNOS NO' ONOO- N2O3 CELICNA MEMBRANA POŠKODBE PROTEINOV POŠKODBE DNA IN MUTACIJE PEROKSIDACIJA LIPIDOV MDA 4-HNE ALKILIRANJE RNA KASKADA ARAHIDONSKE KISLINE EIKOZANOIDI CELIČNA PROLIFERACIJA 147 Slika 6. Vpliv reaktivnih spojin na celične makromolekule. MDA (malondialdehid) in 4-HNE (4-hidroksinonenol) sta stranska produkta kaskade arahidonske kisline, ki lahko poškodujeta DNA (povzeto po 12). prosti radikali lahko preko aktivacije transkrip-cijskih dejavnikov, ki nadzirajo prepisovanje genov, sodelujočih pri delitvah celic, povečajo celično rast in sprožijo rast tumorja. Tako je na primer raziskovanje mehanizma delovanja ROS pokazalo, da fosforilacija in poliADP-ribozilacija jedrnih proteinov, ki ju sprožijo kisikovi radikali, aktivirata protoonkogen c-FOS (2, 8). Možno je, da prav povečana količina ROS v celicah kože sproži preobrazbo benignega tumorja (npr. solarne keratoze) v maligni (npr. SCC). Imunosupresivno delovanje ROS še raziskujejo, obstaja pa čedalje več pokazateljev, da so tudi za imunosupresijo v koži, ki omogoča širjenje tumorja, najbolj odgovorni ravno ROS (8). OBRAMBA TELESA PRED REAKTIVNIMI SPOJINAMI Prosti radikali nastajajo v organizmu tudi v normalnih fizioloških procesih (npr. v procesu celičnega dihanja), zato je telo razvilo številne obrambne sisteme, ki celice bodisi varujejo pred radikali (jih lovijo ali preprečujejo njihov nastanek) bodisi popravljajo poškodovano DNA, kar prikazujeta sliki 5 A in 5 B. Pri izpostavitvi kože UV-svetlobi pride poleg povečanega nastajanja prostih radikalov istočasno tudi do zaviranja delovanja pomembnejših encimov, ki odstranjujejo proste radikale. Ko pride do porušenja ravnotežja med nastajanjem radikalov in antioksidativno obrambo v prid prvih, lahko pride do potencialnih poškodb organizma. Tako stanje imenujemo oksidativni stres, katerega posledica so oksida-tivne poškodbe celic, ki so podane na sliki 6 (8,5). MERJENJE PROSTIH RADIKALOV IN ANTIOKSIDATIVNE SPOSOBNOSTI KOŽE Da bi lahko ugotovili učinke prostih radikalov na celice, jih je treba znati pravilno določiti. Večina RS je in vivo zelo neobstojnih, zato jih praktično ne morejo neposredno meriti (10). Z razvojem stabilnih nitroksidov sicer lahko z elektronsko spinsko resonanco (ESR), imenovano tudi elektronska paramagnetna resonanca (EPR), na živalih merijo tudi zelo neobstojne RS, vendar metoda zaradi nedokazane varnosti ni primerna za uporabo na ljudeh. Pri ljudeh pa za merjenje RS v splošnem uporabljajo dva pristopa: • poskušajo »uloviti« RS in nato meriti koncentracije »ujetih molekul«, • določijo stopnjo oksidativne poškodbe (9,10). Prvi pristop uporabljajo predvsem v raziskovalne namene, klinično pa se učinke RS meri posredno, torej preko določanja oksidativnih poškodb. Ko RS zreagira z biološko makromo-lekulo, nastane nova spojina, ki jo imenujemo biooznačevalec. Biooznačevalci oksidativne poškodbe lipidov so izoprostani, končni produkti peroksidacije polinenasičenih maščobnih kislin. Za ugotavljanje stopnje oksidativne poškodbe DNA najpogosteje določajo 8-hi-droksi-2'-deoksigvanozin (8OHdG). Najbolj uporabljeni preskus za določevanje oksidativ-nih poškodb proteinov pa je t. i. karbonilni test, kjer merimo število karbonilnih skupin na proteinih (10). Čeprav pride pri obsežnem oksidativnem stresu do sočasnega porasta številnih biooznačevalcev, pa za določevanje oksidativnega stresa ne zadostuje določitev enega biooznačevalca, saj so mehanizmi odstranjevanja poškodovanih bioloških makromolekul zelo različni in pri različnih boleznih različno prizadeti (10). Včasih se za določanje oksidativnega stresa poslužijo tudi drugih pristopov. S pomočjo ciklične voltametrije, s katero merimo redukcijske sposobnosti kože, lahko tako ocenimo celokupno antioksidativno učinkovitost lovilcev prostih radikalov v koži (10, 11). PREPREČEVANJE KOŽNEGA RAKA Novejše smernice za preventivo kožnega raka izhajajo iz hipoteze, da če so oksidativne poškodbe keratinocitov glavni vzrok za nastanek kožnega raka, potem bi moralo ustrezno antioksidativno zdravljenje preprečiti ali vsaj odložiti začetek bolezni. Antioksidativni obrambni sistem kože lahko krepimo z dermalnim dajanjem bioloških antioksidatov ali pa z dajanjem eksogenih spojin, ki delujejo kot lovilci prostih radikalov oz. vzpodbujajo delovanje endogenega sistema (1, 3, 10). ENDOGENI ANTIOKSIDANTI Zanimiv pristop k zaščiti pred škodljivimi vplivi svetlobe in razvojem kožnega raka je krepitev endogenega sistema antioksidantov, kar lahko dosežemo z dermalnim dajanjem encimov, ki delujejo antioksidativno. Druga, tudi precej učinkovita možnost fotoprotekcije, pa je dodajanje neencimskih nizkomolekular-nih antioksidantov (LMWA - low molecular weight antioksidants - glej sliko 5B) (10). Encimski antioksidativni sistem • Glutation peroksidaza (GSH-Px) katalizi-ra razgradnjo H2O2 in lipidnih peroksidov z glutationom. Je najpomembnejši obrambni mehanizem pred UV-poškodbami v koži. Za delovanje omenjenega encima je nujen selen in dokazano je, da pomanjkanje selena poveča peroksidacijo lipidov v kulturah fibroblastov in verjetnost kožnega raka pri miši. Jemanje selena je smiselno le pred izpostavitvijo soncu, saj se v encim ne more vgraditi posttranslacijsko, za sintezo novih encimov pa je potreben določen čas (11,14). • Katalaza (CAT) lovi H2O2 v koži. Raziskave dokazujejo, da se delovanje tega encima močno zmanjša po izpostavitvi kože UV-žarkom, kar je verjetno posledica nepovratne oksidativne poškodbe encima. Ker se CAT v celici nahaja v peroksisomih, lahko dosežemo povečanje njene aktivnosti tudi z uporabo zdravil, ki povečajo njihovo proliferacijo. Proliferacija peroksisomov je eden od stranskih učinkov inhibitorjev HMG-CoA reduktaze (11, 14, 15). • Superoksid dismutaza (SOD) katalizira pretvorbo superoksidnega radikala v H2O2. V koži se nahaja v dveh oblikah: Cu/Zn-SOD in Mn-SOD. Podobno kot pri CAT se tudi aktivnost tega encima močno zmanjša ob izpostavitvi UV-svetlobi zaradi oksidativne poškodbe. Produkt delovanja SOD je vodikov peroksid, ki je strupen, zato je nujno, da sledi povečanju aktivnosti SOD tudi povečanje aktivnosti GSH-Px in CAT (14, 15). • Aktivnost hem oksigenaze (HO), ki katalizira razpad hema do dveh močnih anti-oksidantov, biliverdina in bilirubina, se v nasprotju s prej omenjenimi encimi ob izpostavitvi UV-svetlobi poveča. HO je zlasti pomembna pri zaščiti kože ob kronični izpostavitvi kože majhnim odmerkom UV-svetlobe (14, 15). Neencimski antioksidativni sistem • Glutation (GSH) je endogeni tripeptid, ki ima najpomembnejšo vlogo pri obrambi celic pred oksidativnimi poškodbami praktično v vseh tkivih. Deluje neposredno kot lovilec prostih radikalov in tudi kot proton donor za številne druge endogene antiok-sidante, npr. askorbat. Oksidiran GSH (GSSG) obnovi GSH-reduktaza v reakciji, kjer deluje NADPH kot proton donor. Aktivnost kožne GSH-reduktaze je izjemno visoka, saj lahko obnovi ves v koži prisoten GSH hitreje kot v eni minuti. Zadostna količina GSH v koži je torej nujna za delovanje antioksidativnega sistema kože. Zdravljenje z dermalnimi pripravki z glutationom ni uspešno, saj zaradi velikosti in naboja molekule zelo slabo prehaja v keratinocite. Z uporabo estrov glutatio-na, npr. etilnega, metilnega, izopropilne-ga, se prehod GSH v celico močno poveča, dokazan je tudi povečan varovalni učinek. Nivo GSH v koži lahko povečajo tudi z dodajanjem substratov za encime, ki sodelujejo pri sintezi GSH. Najpogosteje dodajajo cistein, ki je omejujoč dejavnik pri sintezi GSH. Ker se le-ta nahaja v obliki ionov dvojčkov in tako zelo težko vstopa v keratinocite, pogosto uporabljajo N- in S-acetil derivate. Derivati se po prihodu v celico metabolizirajo do cisteina. S pomočjo derivatov cisteina pa lahko povečamo raven GSH v celicah le do določene meje. Z naraščajočo koncentracijo GSH v celici je namreč povratno inhibirana y-gluta-milcistein sintetaza, prvi encim pri sintezi GSH. To inhibicijo lahko obidemo z uporabo Y-glutamilcisteina, substrata za GSH-sin-tetazo, ki deluje neodvisno od znotrajce-lične koncentracije GSH (14, 15, 17). • Vitamin E (a-tokoferol, a-TOC), lipofilni endogeni antioksidant, zagotavlja zaščito pred oksidativno poškodbo membran in je dokazano učinkovit pri preprečevanju lipidne peroksidacije in tvorbe tumorjev kože. Omenjeni učinki so bolje izraženi po lokalni kot po sistemski aplikaciji. Njegova aktivnost se z izpostavitvijo soncu zmanjša, saj je molekula na svetlobi nestabilna. Pri razpadu vitamina E na svetlobi se tvorijo tokoferoksilni radikali, ki se odstranjujejo s pomočjo vitamina C in GSH (kar pomeni trošenje drugih antioksidantov), v presežku pa lahko celo povzročijo lipid-no peroksidacijo. Temu problemu se lahko izognemo z uporabo bolj stabilnih derivatov vitamina E, kot je a-tokoferol acetat, ki je sicer biološko neaktiven, vendar se v koži počasi hidrolizira. Tako je količna vitamina E v koži le malo višja od fiziološke in presežek deluje varovalno. Ker se oksidiran vitamin E regenerira z vitaminom C, GSH ali P-karotenom, je priporočljivo kombinirano dajanje (5, 8, 14, 15). • Količina vitamina C (askorbinske kisline) se z izpostavitvijo kože svetlobi zmanjšuje. Raziskave učinkovitosti vitamina C kot fotoprotektanta so si nasprotujoče - v nekaterih študijah so potrdili zaščitno vlogo pred UV-svetlobo, v drugih ne. Zaradi večje stabilnosti sta učinkovitejša njegova derivata askorbat 2-fosfat in askorbilpal-mitat. Mehanizem delovanja je dvojen: askorbat neposredno reagira s singletnim kisikom, hidroksilnim radikalom in supe-roksidnim anionom, hkrati pa sodeluje pri 150 obnavljanju vitamina E. Pri višjih koncentracijah deluje ob prisotnosti kovinskih ionov prooksidativno (5, 12, 14). • P-karoten, predhodnik vitamina A in najpomembnejši predstavnik karotenoidnih antioksidantov, dokazano ščiti pred z UV-svetlobo induciramin rakom. Lovi singletni kisik in odstranjuje produkte lipidne perok-sidacije. Dolgotrajno jemanje, tudi v visokih odmerkih, je relativno neškodljivo (5,11,14). • Melanini: Njihova glavna vloga pri zaščiti kože je absorpcija in sipanje svetlobe, vendar pa eumelanin in njegova prekurzorja 5-S-cisteinildopa (SCD) ter 5,6-dihidroksiin-dol (DHI) delujejo tudi kot antioksidanti. Slednja lahko, če sta prisotna v večjih količinah, delujeta tudi prooksidativno. DHI in SCD se nahajata v melanosomih, strukturah, prisotnih le v melanocitih. Ti dve spojini sta, če se nahajata izven melano-somov, zelo strupeni, zato jih ne moremo, vsaj ne v večjih količinah, uporabljati za dermalno uporabo (14). • Ubikinon (koencim Q), lipofilni antioksi-dant, ki se nahaja v večini celičnih organel, je učinkovit pri nevtralizaciji različnih radikalov in obnavlja vitamin E. Po nanosu na kožo prehaja v celice kože, zato ga uvrščajo med spojine, ki zmanjšujejo oksi-dativne poškodbe (14, 15). ANTIOKSIDANTI NARAVNEGA IZVORA Populacijske raziskave so dokazale, da vsebujeta sadje in zelenjava številne antioksidante. Slika 7 prikazuje najpomembnejše učinkovine naravnega izvora, ki preprečujejo nastanek raka in njihove vire (1). Polifenoli so zelo raznolike učinkovine, ki se nahajajo v sadju, zelenjavi, vinu, čaju, olivnem olju, pridobljenem s hladnim stiskanjem, čokoladi in drugih kakavovih izdelkih. Mnogi polifenoli in vitro dokazano delujejo kot antioksidanti, zato so številne učinke, ki jih izkazujejo in vivo, pripisali njihovi redukcijski sposobnosti. Podatkov, da je njihovo delovanje dosti bolj zapleteno, je čedalje več. Poleg neposrednega učinka (lovljenja prostih radikalov) polifenoli najverjetneje delujejo tudi posredno, preko aktivacije endogenih obrambnih sistemov proti raku. Podatki naj- novejših poskusov kažejo na to, da se na genih, ki kodirajo endogene antioksidante in ki jih inducira oksidativni stres, nahajajo v promotorskem delu t. i. antioxidant responsive elements (ARE), na katerega se lahko vežejo polifenoli. Po tej poti lahko torej polifenoli vzpodbudijo prepisovanje genov za endogene antioksidante in razstrupljevalne obrambne mehanizme (13). • Resveratrol, glavni antioksidant rdečega vina, preprečuje nastanek raka tudi z zaviranjem aktivacije AP-1 in NF-kB. NF-kB je podobno kot AP-1 transkripcijski faktor, posledica njegove aktivacije pa je zaščita poškodovanih celic pred apoptozo in vzpodbujanje delitve malignih celic (1). • Epigalokatehingalat je polifenol zelenega čaja, katerega učinkovitost pri preprečevanju raka kože je bila dokazana na celičnih kulturah, živalskih modelih in na človeški koži, vendar pa so molekularni mehanizmi njegovega delovanja še vedno nerazjasnje-ni. Poleg lovljenja prostih radikalov mu pripisujejo še številne druge učinke. V kulturi keratinocitov je povečal izražanje genov za encime, ki sodelujejo v antioksidativni obrambi - glutation peroksidaze, y-glutamil-cistein sintetaze, hem oksigenaze. V kulturi celic mišje povrhnjice je zaviral maligno preobrazbo celic, najverjetneje preko inhibi-cije AP-1. Zelo verjetno se vpleta tudi v pot, ki jo sproži NF-kB. Razvoj kožnega raka naj bi, po rezultatih raziskav na kulturah kera-tinocitov, preprečeval tudi z vzpodbujanjem diferenciacije keratinocitov (1, 14, 15). • Enostavni fenoli (hidroksitirozol, tirozol), sekoiridoidi (oleuropein, aglikon ligstrozida) in lignani (pinorezinol in 1-acetoksipinore-zinol) so glavne tri skupine antioksidantov olivnega olja, pridobljenega s hladnim stiskanjem. Ker je njihovo antioksidativno delovanje zelo močno izraženo, naj bi uživanje olivnega olja imelo zaščiten učinek tudi proti raku kože. Učinkovitost olivnega olja v preventivi kožnega raka so dokazovali s poskusi na miših. Olje, nanešeno na kožo tik po izpostavitvi UV-sevanju, je zmanjšalo pojavnost kožnega raka, medtem ko isto olje, nanešeno na kožo pred obsevanjem, ni imelo nobenega zaščitnega učinka. Navadno olivno olje se je izkazalo za neučinkovito (1, 16). kurkuma H,C--- kurkumin čili H'C^pf X kapsaicin ingver 6-gingerol f\ grozdje HO y^j/ \= resveratrol med - Ho ■ * I fenetilni ester kavne kisline /¡J česen dialil sulfid zeleni čaj epigalokatehin-3-galat soja JU. J HO O p p paradižnik genistein likopen z # b b indol-3-karbinol sulfurafan OH OH O O OH O HC OH HC Nj—s. S 151 Slika 7. Najpomembnejše učinkovine naravnega izvora, ki preprečujejo razvoj raka in njihovi viri (1). • Polifenolna diterpena karnozol in karno-zoična kislina, najznačilnejša predstavnika antioksidantov v rožmarinu, imata dokazano antikancerogeno delovanje. Delujeta kot lovilca prostih radikalov in kot modu-latorja ekspresije encimov, ki sodelujejo pri presnovi ksenobiotikov (17). Silimarin, flavonoid izoliran iz pegastega badlja, je močan antioksidant, ki deluje kot lovilec prostih radikalov. Njegova uporaba v zdravljenju jetrnih bolezni je že ustaljena, skupina kanadskih znanstvenikov pa je dokazala pozitiven učinek tudi pri preventivi kožnega raka. Znano je, da se v keratinocitih kot posledica oksidativnega stresa poveča izražanje receptorja za epidermalni rastni dejavnik (epidermal growth factor receptor -EGFR), kar je eden prvih znakov pospešene celične rasti in razmnoževanja, ki vodi do nastanka novotvorb. V študijah na celičnih kulturah keratinocitov so dokazali, da silimarin z antioksidativnim delovanjem moti pot EGFR, zaradi česar ima varovalno delovanje (18). Likopen, aciklični karotenoid z 11 konjugiranimi dvojnimi vezmi, je najmočnejši antioksidant med karotenoidi. Nahaja se v paradižniku in nedavno so dokazali, da je dnevno 152 uživanje paradižnikove mezge v obdobju 10 tednov ščitilo kožo pred z UV-sevanji povzročenimi rdečinami (21). V posamezni rastlini se pogosto nahaja več različnih antioksidantov s sinergističnim delovanjem, zato namesto izolacije posamezne spojine pogosteje pripravljajo izvlečke. Tak primer je izvleček cvetov vrbe Salix caprea, ki vsebuje luteolin, kvercetin, dihidrokamfe-rol, katehin in izoramnetin, ki vsi delujejo antioksidativno. Izvleček izkazuje in vitro močne antioksidativne sposobnosti, na miškah pa so dokazali tudi njegovo učinkovitost pri preprečevanju kožnega raka (19). OSTALE UČINKOVINE NARAVNEGA IZVORA Nekatere učinkovine naravnega izvora sicer ne izkazujejo močnega antioksidativnega delovanja, pa kljub temu preprečujejo nastanek raka. Čeprav za nekatere učinkovine vemo, da delujejo preko neposredne inhibicije ornitin dekarboksilaze in sinteze DNA, pa so mehanizmi delovanja pogosto nepoznani. Običajno delijo te učinkovine v dve skupini: • snovi, ki preprečujejo nastanek in razvoj maligne novotvorbe (cancer blocking agents) s preprečevanjem: - dostopa kancerogenov do tarčnih mest, - metabolične aktivacije kancerogenov, - interakcije kancerogenov s celičnimi makromolekulami, • snovi, ki zavirajo maligno transformacijo iniciarnih celic v fazi promocije ali progre-sije raka (suppressing agents) - s sodelovanjem pri popravljanju DNA, - s spodbujanjem celične diferenciacije in apoptoze, - z uravnavanjem izražanja tumorsupre-sorskih genov, angiogeneze... (1, 23). Delitev zdravilnih učinkovin naravnega izvora na dve skupini se je z novimi dognanji izkazala kot preveč poenostavljena. V resnici je namreč učinek omenjenih naravnih spojin pogosto posledica njihovega delovanja na več mestih v celicah (1). Pomembnejši predstavniki omenjenih spojin: • Kurkumin, rumeni pigment, ki se nahaja v koreniki rastline Curcuma longa in sorodnih vrst, deluje na AP-1 in NF-kB (1). • Gingerol, fenolni derivat, ki je odgovoren za pikanten okus ingverja, naj bi zaviral promocijo tumorja in delovanje ornitin dekarboksilaze v koži miši (1). • Kapsaicin, sestavina čilija, naj bi po izsledkih nekaterih študij zaviral razmnoževanje malignih celic melanoma. Druge študije ga nasprotno uvrščajo med kancerogene, saj naj bi na živalih zaradi močno dražečega učinka deloval prokancerogeno (1). Številni viri navajajo, da je vnetje eden bistvenih vzrokov pri nastanku raka, zato je smiselna tudi uporaba protivnetnih zdravil. Ker povzroča UV-svetloba tudi vnetje preko povečane sinteze PGE2, je dokazano smiselno jemanje ribjega olja, ki verjetno zmanjša nastajanje PGE2 (8). Saleem in soavtorji so dokazali, da imajo protitumorno delovanje tudi učinkovine številnih zdravilnih rastlin, ki so sicer znane po svojem protivnetnem delovanju: Mentha spicata, Tephrosia purpurea, Cheirant-hus cheiri, Lawsonia alba, Myrica nagi (23). Nikotinamid, nanešen na kožo, zavira NOS v keratinocitih in tako zmanjšuje nastanek kožnega raka (8). ZAKLJUČEK Preventiva ima velik pomen v boju s kožnim rakom. Kljub večjemu ozaveščanju ljudi o nevarnosti UV-sevanja in hitremu razvoju varovalnih izdelkov za sončenje, je pojavnost kožnega raka v porastu. Pričakujemo lahko, da bo v prihodnosti več poudarka na aktivni zaščiti kože z antioksidanti, protivnetnimi učinkovinami in krepitvijo imunskega sistema. Predklinične raziskave jasno nakazujejo učinkovitost naravnih spojin v preventivi kožnega raka, rezultati kliničnih raziskav pa so nekoliko manj prepričljivi, zlasti pri uživanju enega antioksidanta. Možno je, da so odmerki antioksidantov premajhni, da bi lahko le-ti izkazovali učinek v koži, zavedati pa se moramo tudi, da je antioksidantni sistem in vivo zelo kompleksen ter da lahko s prekomernim dajanjem le ene spojine še bolj porušimo fiziološko ravnotežje med antioksidanti. Prevelike koncentracije nekaterih antioksidantov lahko delujejo celo prooksidativno. Uporaba učinkovin naravnega izvora kot podpornega zdravljenja v preprečevanju kožnega raka je torej smiselna predvsem, če nanašamo na kožo ustrezno kombinacijo učinkovin. LITERATURA 1. Surh YJ. Cancer chemoprevention with dietary phytochemicals. Cancer 2003; 3: 768-80. 2. Ichihashi M, Ahmed NU, Budiyanto A et all. Preventive effect of antioxidant on ultraviolet-induced skin cancer in mice. J Derm Sci 2000; 23: 45-50. 3. Bratenjev I, Rogl Butina M. Kožni rak - skrajna posledica prekomernega sončenja. In: Kristl J ed. Koža-sonce-zdrav-je-lepota, zbornik referatov. Ljubljana: SFD; 2004. p. 103-9. 4. Bowden GT. Prevention of non-melanoma skin cancer by targeting ultraviolet-B-signalling. Cancer 2004; 4: 23-35. 5. Fuchs J. Potentials and limitations of the natural antioksidants RRR-alpha-tocopherol, L-ascorbic acid and ß-ca-rotene in cutaneous photoprotection. Free Radic Biol Med 1998; 25: 848-73. 6. Raghavan R, Joseph JC. Ultraviolet and visible spectrophotometry in pharmaceutical analysis. In: Swarbrick J, Boylan JC, eds. Encyclopedia of pharmaceutical technology. Vol. 15. New York: Marcel Dekker; 1997. p. 292-5. 7. Osterwalder U, Herzog B. Designing Broad-Spectrum UV Absorbers. Cosmet Toil 2004; 119: 61-8. 8. Halliday GM. Inflammation, gene mutation and photoimmunosupression in response to UVR-induced oxidative damage contributes to photocarcinogenesis. Mut Res 2005; 571: 107-20. 9. Tiberio L, Maier JAM, Schiaffonati L. Down-modulation of c-myc expression by phorbol ester protects CEM T leukaemia cells from starvation-induced apoptosis: role of ornithine decarboxylase and polyamines. Cell Death Differ 2001; 8: 967-76. 10. Halliwell B, Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? Br J Pharmacol 2004; 142: 231-55. 11. Kohen R. Skin antioksidants: their role in aging and in oxidative stress - New approaches for their evaluation. Biomed & Pharmacother 1999; 53: 181-92. 12. Hussain SP, Hofseth LJ, Harris CC. Radical causes of cancer. Cancer 2003; 3: 276-85. 13. Jurkovič P, Sentjurc M, Gašperlin M, et al. Skin protection against ultraviolet induced free radicals with ascorbyl palmitate in microemulsion. Eur J Pharm Biopharm 1997; 43: 37-42. 14. Steenvoorden DPT, Beijersbergen van Henegouven GMJ. The use of endogenous antioxidants to improve photoprotection. J Photochem Photobiol 1997; 41: 1-10. 15. Manček B, Pečar S. Radikali in zaščita pred poškodbami z radikali vbioloških sistemih. Farm Vest 2001; 52: 133-44. 16. Fočo A, Gašperlin M, Kristl J. Investigation of liposomes as carriers of sodium ascorbyl phosphate for cutaneous photoprotection. Int J Pharm 2005; 291: 21-9. 17. Masella R, Di Benedetto R, Vari R, et al. Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems: involvement of glutathione and glutathione-related enzymes. J Nutr Biochem. V tisku 2005. 18. Afaq F, Adhami VM, Ahmad N, et al. Inhibition of UV-B mediated activation of nuclear factor kB in normal human epidermal keratinocytes by green tea constituent (-)-epigallocatechin-3-gallate. Oncogene 2003; 22 (7): 1035-44. 19. Eckert RL, Crish JF, Efimova T, et al. Antioxidants regulate normal human keratinocyte differentiation. Biochem Pharm 2004; 68: 1125-31. 20. Owen RW, Giacosa A, Hull WE, et al. Olive-oil consumption and health: the possible role of antioxidants. The Lancet Oncology 2000; 1: 107-12. 21. Offord EA, Gautire JC, Avanti O, et al. Photoprotective potential of lycopene, ß-carotene, vitamin E, vitamin C and carnosic acid in UVA-irradiated human skin fibroblasts. Free Radic Biol Med 2002; 32: 1293-303. 22. Ahmad N, Gali H, Javed S, et al. Skin Cancer Chemopreventive Effects of a Flavonoid Antioxidant Silymarin Are Mediated via Impairment of Receptor Tyrosine Kinase Signalling and Perturbation in Cell Cycle Progression. Biochem Biophys Res Commun 1998; 248: 294-301. 23. Sultana S, Saleem M. Salix caprea inhibits skin carcinogenesis in murine skin: inhibition of oxidative stress, ornithine decarboxylase activity and DNA syntesis. J Eth Pharm 2004; 91: 267-76. Prispelo 18.10.2005