Acta agriculturae Slovenica, 118/4, 1–12, Ljubljana 2022 doi:10.14720/aas.2022.118.4.2831 Review article / pregledni znanstveni članek Vloga malih RNK pri odzivu rastlin na okužbo s patogenimi organizmi Urban KUNEJ 1, 2 in Ester STAJIČ 1 Received August 25, 2022; accepted November 29, 2022. Delo je prispelo 25. avgusta 2022, sprejeto 29. novembra 2022 1 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Ljubljana, Slovenija 2 Korespondenčni avtor, e-naslov: urban.kunej@bf.uni-lj.si The role of small RNA molecules in plant response to patho- gen infection Abstract: Plants have evolved diverse and complex mech- anisms to regulate gene expression. Recently, a new mecha- nism called RNA interference (RNAi) has been discovered. At the core of RNAi are small non-coding RNAs (sRNAs), 21-24 nucleotides in length, that prevent the translation of transcripts into proteins by binding to complementary sites in transcripts. Because sRNAs are determined by origin, precursor structural properties, and sequence characteristics, they are classified into several classes like microRNAs (miRNAs) and secondary small interfering RNAs (siRNAs), which include tasiRNAs and phasiRNAs. They play important roles in regulating gene ex- pression in a wide range of biological processes and in plant responses to biotic or abiotic stresses. Despite the numerous conserved sRNAs among plant species and the characterization of their function, there is still no comprehensive understanding of their role in plant defense responses against phytopathogens. This review summarizes the current understanding of Verti- cillium wilt pathogenesis, plant defense mechanisms against phytopathogens, and the biogenesis and roles of miRNAs, tasiRNAs, and phasiRNAs in plant defense responses against fungal pathogens. Further studies on plant sRNAs and their expression in response to various phytopathogens are needed to clearly define their roles. New sequencing approaches, bioin- formatic analysis, and prediction of the role of miRNA targets during infection may allow us to develop new forms of plant protection in non-model organisms. Key words: biotic stress; microRNA; Verticillium nonal- falfae; small RNAs Vloga malih RNK pri odzivu rastlin na okužbo s patogenimi organizmi Izvleček: Rastline imajo razvite raznolike in komple- ksne mehanizme za regulacijo izražanja genov. Nedavno je bil odkrit nov mehanizem, imenovan RNK interferenca (RNKi). Osrednjo vlogo v RNKi imajo male nekodirajoče RNK (sRNK) dolge od 21-24 nukleotidov, ki z vezavo na komplementarna mesta v transkriptih preprečijo njihovo prevajanje v proteine. Ker sRNK definira izvor, strukturne lastnosti prekurzorjev ter sekvenčne lastnosti, jih delimo v več različnih razredov. mi- kroRNK (miRNK) ter sekundarne male interferenčne RNK (siRNK), med katere prištevamo tasiRNK in phasiRNK imajo pomembno vlogo v regulaciji izražanja genov v številnih biolo- ških procesih ter odzivu rastlin na biotske ali abiotske dejavni- ke stresa. Kljub številnim ohranjenim sRNK med rastlinskimi vrstami ter karakterizaciji njihovega delovanja, do danes še ni celovitega razumevanja njihove vloge v obrambnem odzivu rastlin pred fitopatogeni. Ta pregled povzema trenutno razu- mevanje patogeneze verticilijske uvelosti, obrambnega meha- nizma rastlin pred fitopatogeni in biogeneze ter vloge miRNK, tasiRNK ter phasiRNK v obrambnem odzivu rastlin pred gliv- nimi patogeni. Nadaljnje raziskave rastlinskih sRNK in njihovo izražanje v odzivu rastlin na različne fitopatogene organizme so potrebne za jasno določitev njihove vloge. Novi pristopi se- kvenciranja ter bioinformacijske analize in napovedovanja vlo- ge miRNK tarč v času okužb nam lahko pri nemodelnih orga- nizmih omogočijo razvoj novih načinov varstva rastlin. Ključne besede: biotski stres; mikroRNK; Verticillium nonalfalfae; male RNK Acta agriculturae Slovenica, 118/4 – 20222 U. KUNEJ in E. STAJIČ 1 UVOD Male RNK (sRNA; angl. small RNA) so nekodirajo- če RNK, ki jih glede na sekvenčne in funkcijske lastnosti delimo v male interferenčne RNK (siRNK), sekundar- ne male interferenčne RNK (sekundarne sRNK) in mi- kroRNK (miRNK). Za male RNK je znano, da so vple- tene v številne biološke in fiziološke procese rastlin, prav tako pa imajo pomembno vlogo v odzivu rastlin na de- javnike abiotskega stresa in tudi v odzivu na biotski stres, ki ga povzročajo različni patogeni organizmi. V zadnjem času se vse več študij ukvarja z vlogo miRNK v procesih odziva rastlin na glivne patogene in potencialnih aplika- cijah miRNK za boj proti glivnim boleznim (Gupta in sod. , 2014). Patogeni mikroorganizmi rastlin so, skupaj z rastli- nojedimi živalmi in pleveli, odgovorni za kar 20 do 40 % izgube svetovne pridelave gospodarsko pomembnih kmetijskih rastlin (Savary in sod., 2012). K velikemu de- ležu izgube pridelka prispevajo različna glivna obolenja, še posebej pa tista, ki jih povzročajo talni fitopatogeni, kot sta glivi Verticillium nonalfalfae Inderbitzin et al. in Verticillium dahliae Kleb. (Neve, 1991). V Sloveniji gliva V. nonalfalfae povzroča veliko iz- gubo v izplenu storžkov ženskih rastlin hmelja (Humulus lupulus L.), ki se uporabljajo v pivovarski industriji. Iz- guba pridelka je še posebej izrazita od leta 1997, ko smo v Sloveniji prvič zaznali pojav agresivnejšega, letalnega patotipa glive, ki se v hmeljiščih sporadično pojavlja še danes. Letalna oblika te bolezni je prav tako prisotna v Angliji, Nemčiji in na Češkem. Bolezen verticilijske uvelosti je bila sprva uvrščena na seznam karantenskih bolezni, danes pa sodi med glivne bolezni razreda II/ A2, kar pomeni, da so potrebna dodatna prizadevanja za spremljanje in preprečevanje te bolezni, kar prinaša tudi večje stroške pridelave hmelja (Radišek in sod., 2004; IHGC, 2019). Hmelj se goji predvsem za uporabo v pivovarstvu, saj storžki ženskih rastlin vsebujejo snovi, ki pivu zago- tavljajo značilen okus in aromo, hkrati pa delujejo kot stabilizatorji in konzervansi. V zadnjih letih se hmelj uporablja tudi v farmacevtske namene, saj študije kažejo številne pozitivne učinke na zdravje (Steenackers in sod., 2015; Hrnčič in sod., 2019). Programi žlahtnjenja hmelja so osredotočeni predvsem na povečanje donosa, kako- vosti ter sestavo in vsebnost sekundarnih metabolitov v storžkih, medtem ko so študije odpornosti hmelja proti verticilijski uvelosti manj obširne. Trenutno ni na voljo učinkovite metode oziroma fitofarmacevtskega sredstva, ki bi širjenje bolezni uspešno omejila. Molekularna pa- togeneza je premalo poznana zaradi tega je razumevanje bioloških procesov, ki so vključeni v občutljivost oziroma toleranco rastlin ob okužbi z glivo, izrednega pomena. 2 PATOGENEZA VERTICILIJSKE UVELOS- TI Simptomi bolezni verticilijske uvelosti, ki jo pov- zroča gliva V. nonalfalfae, se razlikujejo glede na pato- genost seva. Ob okužbi rastlin z blagim patotipom lahko opazimo neznatne simptome uvelosti rastlin, medtem ko okužba z letalnim patotipom vodi v pojav simptomov, kot so kloroze, nekroze, odebelitev stebla in odmiranje tkiva, kar v končni fazi patogeneze vodi v propad rastline oziroma propad celotnega nasada (Neve, 1991; Radišek in sod., 2006). Ob zaznavi koreninskih eksudatov gostitelja, gliva preide iz dormantne v parazitsko fazo in prične s kolo- nizacijo korenin. Hife glive prodrejo preko rizoderma ali eksoderma v primarno skorjo korenine. Endoderm, kot zadnja plast primarne skorje predstavlja prvo bariero pred vstopom glive v ksilem, saj so njegove celične stene trakasto okrepljene s plastjo lignina in tvorijo tako ime- novan Kasparijev trak. Prav tako se lahko v endodermal- nem tkivu nalaga suberin, ki dodatno otežuje prodiranje glivnih hif proti prevajalnemu sistemu. Ob vstopu hif v prevajalno tkivo, gliva začne tvoriti konidiospore, katere se nato s ksilemskim sokom sistematično razširijo iz ko- reninskega v stebelno tkivo (Yadeta & Thomma, 2013). Rastline v tej fazi sprožijo procese za tvorbo različnih fizičnih barier v prevajalnem sistemu, s katerimi posku- šajo ustaviti prenos konidiospor. Eden takšnih procesov so tiloze, v katerem prihaja do vraščanja mehurjastih iz- rastkov celic parenhimov v traheide in traheje in nastaja- nja til, ki preprečijo pretok ksilemskega soka in s tem ko- nidiospor (Talboys, 1958a). Slednji proces je bil opažen predvsem pri občutljivih sortah, medtem ko je bil proces nalaganja suberina v endodermalni plasti bolj intenziven pri odpornih sortah hmelja (Talboys, 1958a; Cregeen in sod., 2015). Ko konidiospore naletijo na fizične bariere, pričnejo tvoriti hife, s katerimi lahko zaobidejo bariere in vstopijo v sosednje žile, preko katerih se dalje s ksilem- skim sokom prenašajo kot konidiospore (Chen in sod., 2004). Tekom kolonizacije gliva izloča različne hidrolitič- ne encime, ki razgradijo komponente rastlinskih celičnih sten, kar ji omogoča lažji prehod med žilami prevajalne- ga sistema (Talboys, 1958b). Prav tako pa ji v zadnji fazi patogeneze encimi omogočajo prehod iz prevajalnega tkiva v preostala tkiva ter s tem popolno kolonizacijo go- stitelja, pri čemer pri občutljivih sortah prihaja do pojava izrazitih simptomov kot so kloroze in nekroze listov in odmiranje tkiva (Talboys, 1958a). 3 OBRAMBNI MEHANIZEM RASTLIN Ksilem si lahko torej predstavljamo kot bojišče, na Acta agriculturae Slovenica, 118/4 – 2022 3 Vloga malih RNK pri odzivu rastlin na okužbo s patogenimi organizmi katerem gliva napada in poskuša zaobiti bariere, ki jih ustvarja gostitelj, ta pa prav tako z različnimi obramb- nimi mehanizmi poskuša zaustaviti nadaljnjo koloniza- cijo glive. Odziv hmelja na okužbo z glivo sledi modelu interakcij med rastlinami in patogeni, ki ga predstavlja večplastni imunski sistem rastlin (Jones & Dangl, 2006). Prvi nivo obrambnega odziva tega modela se nave- zuje na receptorje rastlin za prepoznavo molekularnih vzorcev (angl. pattern recognition receptors - PRRs), ki se nahajajo na površini celičnih membran in prepoznajo s patogeni povezane molekularne vzorce (angl. pathogen associated molecular patterns - PAMPs). PAMP direk- tno z vezavo na PRR-je ali posredno z vezavo na druge molekule, ki so v interakciji s PRR-ji, stimulirajo bazalni imunski odziv rastline, ki vključuje tako fizično kot ke- mično obrambo pred patogeni. Patogeni lahko zaobidejo bazalni imunski odziv in sprostijo t.i. efektorje v apoplast ali citoplazmo rastlinskih celic. Efektorji so raznolika skupina sekretornih proteinov, ki jih patogeni prenesejo v gostiteljeve celice, kjer povzročajo motnje v signalizaciji, ter s tem onemogočajo prepoznavo proteinov, s katerimi patogen napada gostitelja, prav tako pa lahko patogena obvarujejo pred obrambnimi molekulami gostitelja (Jo- nes & Dangl, 2006). Njihovo prisotnost v citoplazmi za- znajo receptorji, imenovani odpornostni proteini oziro- ma z rezistenco povezani proteini, ki jih kodirajo R geni (angl. resistance (R) proteins). Slednji obsegajo raznolike znotrajcelične receptorje, katerim je skupna predvsem domena za vezavo nukleotidov (angl. nucleotide-binding domain - NB) ter domena bogata s ponovitvami levcina (angl. leucine-rich repeat domain - LRR), ki je odgovorna za prepoznavo efektorskih proteinov (Padmanabhan in sod., 2009). Imunski odziv rastlin, sprožen z odporno- stnimi proteini v citoplazmi, je drugi nivo obrambe pred patogeni in predstavlja močnejšo obliko odziva, ki zago- tavlja z efektorji sproženo odpornost (angl. effector-tri- ggered immunity – ETI) (Jones & Dangl, 2006; Thomma in sod., 2011). Ko rastline preko zgoraj opisanega mehanizma za- znajo patogena v ksilemu, se sprožijo obsežne metabolne spremembe v celicah parenhima, ki se nahajajo v nepo- sredni bližini okuženega prevodnega sistema in povzro- čijo akumulacijo različnih proteinov ter sekundarnih metabolitov v rastlinskem ksilemu ali tvorjenje til. Zna- no je, da lahko številne molekule in spojine, ki se tvorijo v času patogeneze, prispevajo k obrambi rastlin in po- polnoma zavrejo ali upočasnijo razrast in širjenje glive v rastlini (Gayoso in sod., 2010). Nekatere spojine, ki se po okužbi nakopičijo v ksilemskem soku, spremenijo mor- fologijo ksilemskega tkiva in s tem zavrejo vertikalno in lateralno širjenje patogena po rastlini, medtem ko druge nakopičene spojine delujejo protimikrobno in tako tudi eliminirajo povzročitelja bolezni (Yadeta & Thomma, 2013). Pomembno vlogo pri regulaciji izražanja genov ob okužbi, ki se odvija pred ali med prepisom DNK v mRNK, imajo transkripcijski faktorji in sekvenčni motivi ali regulatorne regije, ki se nahajajo pred začetkom gena. Nekateri izzovejo začetek transkripcije, drugi pa delujejo kot njeni aktivatorji ali represorji. Nov način regulaci- je genske ekspresije je bil potrjen z odkritjem sRNK, ki delujejo na post-transkripcijskem nivoju in vplivajo na stabilnost transkriptov (mRNK). Slednje je bilo pri pro- kariontih opisano v devetdesetih letih prejšnjega stole- tja, njena funkcija, tako v homeostatskih procesih, kot v procesih odziva na različne biotske in abiotske dejavnike, pa je bila pri evkariontih potrjena šele desetletje kasneje (Wagner & Simons, 1994). Danes vse procese regulaci- je izražanja genov z sRNK uvrščamo v mehanizem in- terference RNK (RNKi), ki jo vodita obe glavni skupini sRNK, mikroRNK in siRNK (Saurabh in sod., 2014). 4 BIOGENEZA mIRNK, tasiRNK IN pha- siRNK TER Z NJIMI VODENA INTERFER- ENCA RNK miRNK so nekodirajoče RNK molekule, ki so v svoji zreli oziroma aktivni obliki dolge 20-24 nukleoti- dov (nt). Geni miRNK (MIR) so v rastlinskih genomih kodirani večinoma v med-genskih regijah, redki pa so locirani tudi v intronskih regijah protein kodirajočih genov. MIR geni spadajo v razred II genov, kar pomeni, da so samostojne transkripcijske enote, ki se v primar- ne transkripte (pri-miRNK) prepisujejo s pomočjo RNK polimeraze II (Lee in sod., 2004). Pri-miRNK so podob- no kot protein-kodirajoči geni stabilizirani z 7-metilgva- nozinsko kapo na 5‘ koncu in poli(A) repom na 3‘ koncu ter zviti v obliko lasnične zanke, ki meri do 1000 nukle- otidov. Proces zorenja rastlinske pri-miRNK do končne zrele in aktivne oblike miRNK v celoti poteka v celičnem jedru, kjer ga usmerja več-proteinski kompleks v dvo- stopenjskem procesu. Slednjega sestavlja encim RNaza III Dicer-ju podobni protein (DCL1), ki je odgovoren za razrez pri-miRNK v krajše, prav tako v lasnico zvi- te prekurzorske miRNK (pre-miRNK) ter spremljajoča proteina HYL1 (angl. HYPONASTIC LEAVES 1) in SE (angl. SERRATE). V drugem koraku procesiranja struk- turne in sekvenčne lastnosti pre-miRNK lasnice proteinu DCL1 narekujejo mesta za endonukleolitično cepljenje stebla lasnice pre-miRNK iz katerega nastane dvoverižni dupleks sestavljen iz zrele miRNK ter njene komplemen- tarne miRNK*. Za nastali dupleks je značilen 3‘-štrleči konec z dvema nukleotidoma. Za večjo stabilnost oziro- ma preprečitev razgradnje dupleksa, ga metiltransferaza Acta agriculturae Slovenica, 118/4 – 20224 U. KUNEJ in E. STAJIČ HEN1 (angl. HUA ENHANCER 1) na 3‘ štrlečem koncu metilira (Song in sod., 2010). V naslednjem koraku se nato metiliran dupleks s pomočjo proteina HST1 (angl. HASTY) prenese v citoplazmo (Yang in sod., 2006; Ren in sod., 2014), kjer se naloži v kompleks RISC (z RNK induciran kompleks utišanja genov, angl. RNA-induced silencing complex), ki je sestavljen iz različnih proteinov. Med njimi protein Argonavt (AGO) razcepi komplemen- tarno verigo dupleksa in jo usmeri v pot razgradnje v ek- sosome, zrela oblika miRNK, vezana v kompleks RISC, pa le-tega vodi na njej komplementarno mesto v tarčnem transkriptu. Ob vezavi na tarčno mesto protein AGO, ki predstavlja glavno katalitično komponento, izvede cepitev tarčnega transkripta (Khraiwesh in sod., 2012). Družina proteinov Argonavtov ima torej osrednjo vlo- go v procesih utišanja RNK, pri čemer vsak protein kaže preferenčno vezavo določenih miRNK in s tem delno na- rekuje vlogo miRNK v določenih procesih; npr. procesih rasti, razvoja, obrambnih odzivih, z malimi RNK vodeni metilaciji DNK in podobno (Henderson in sod., 2006). Za razliko od interakcij med miRNK in tarčo pri ži- valih, kjer je dopuščeno neujemanje, je za interakcije pri rastlinah značilno skoraj popolno ujemanje. Prepoznava vezavnega mesta temelji na ohranjenosti nukleotidnega zaporedja tarče in miRNK, kar omogoča, da lahko eno tarčo regulira več miRNK ter obratno, torej ena miRNK regulira več tarč s podobno ohranjenim mestom vezave (Axtell & Meyers, 2018). Na podlagi ohranjenosti nu- kleotidnega zaporedja in posledično podobnosti njihove vloge pri različnih rastlinskih vrstah, lahko miRNK uvr- ščamo v družine. Po drugi strani pa v številnih študijah opisujejo tudi vrstno-specifično ali tkivno-specifično pojavljanje miRNK, tako v fizioloških procesih, kot tudi obrambnih odzivih na abiotske in biotske dejavnike stre- sa (Dezulian in sod., 2005). V zadnjih letih je prišlo do izrednega napredka pri razumevanju malih RNK pri rastlinah. Karakterizacija genov, ki kodirajo komponente poti RNKi, kot sta prote- ina DCL in AGO ter od RNK-odvisna RNK polimeraza (RDR), je potrdila obstoj več različnih poti utišanja, ki jih vodijo sRNK. siRNK so druga skupina sRNK, za katero je značilno, da nastajajo iz popolnoma ujemajoče prekur- zorske dvoverižne RNK (dsRNK). Te pa izvirajo s prepi- som protismiselne verige ali pa z obratnim prepisom z miRNK razrezanega transkripta s pomočjo RDR. Slednje uvrščamo med sekundarne siRNK, saj njihov nastanek povzroči delovanje specifičnih miRNK. Sekundarne siRNK delimo glede na njihov izvor oziroma biogene- zo in delovanje na fazne siRNK (angl. phased siRNA; phasiRNA) in trans-delujoče male interferenčne RNK (tasiRNK). phasiRNK nastajajo iz RNK, ki se prepišejo iz PHAS lokusov (lahko so kodirajoči ali ne kodirajoči), njihovo biogenezo pa sprožijo specifične miRNK, ki raz- režejo transkripte PHAS lokusov. Po razrezu transkripta se le-ta obratno prepiše s pomočjo RDR6, DCL4 pa nato nastalo dvoverižno RNK razreže na 21-24 nukleotidov dolge fragmente, s čimer nastajajo popolnoma ujemajoči se dsRNK dupleksi (Fei in sod., 2013). Enako kot pri de- lovanju miRNK, se ena od verig inkorporira v AGO pro- teine, ki phasiRNK usmerjajo na transkripte PHAS loku- sov iz katerih izhajajo, torej delujejo v cis načinu (Axtell & Meyers, 2018). V eksperimentalnih in bioinformacijskih študijah ugotavljajo, da phasiRNK nastajajo iz genov, ki kodirajo proteine vpletene v imunski odziv (z rezistenco povezani geni), transkripcijske faktorje iz družine MYB ter proteine, vpletene v signalizacijo z avksinom (angl. transporter inhibitor response/auxin F-box gene - TIR/ AFB) (Yu in sod., 2019). Za razliko od phasiRNK, trans- -delujoče siRNK izhajajo izključno iz ne-kodirajočih lo- kusov TAS (angl. trans-acting siRNA) in kot njihovo ime nakazuje, delujejo v trans načinu, kar pomeni, da utišajo transkripte iz katerih same ne izhajajo. miRNK, ki spro- žijo cepitev TAS lokusov, so večinoma vezane v AGO7 ali AGO2. Najbolj natančno je karakterizirana biogeneza tasiRNK, ki izhajajo iz lokusa TAS3. Te imajo pomemb- no funkcijo v regulaciji izražanja dejavnikov odziva na avksin (angl. auxin response factors; ARF). Njihovo bio- genezo povzroči miR390 vezana v AGO7 (Montgomery in sod., 2008). Po cepitvi z miR390-AGO7 se 3′-konec razrezanega TAS transkripta obratno prepiše s pomočjo RDR6, s čimer nastane popolnoma ujemajoča dsRNK, ki jo nadalje protein DCL4 zaporedno razreže v 21 nt dolge fragmente, s čimer nastajajo tasiRNK, ki dodatno ojačajo utišanje z RNKi (Cuperus in sod., 2010) (Slika 1). 5 miRNK V OBRAMBNEM ODZIVU RAST- LIN PRED GLIVNIMI PATOGENI REGU- LIRAJO HORMONSKO SIGNALIZACIJO Ena izmed prvih opisanih družin miRNK, ki sode- luje pri odzivu na biotski stres, je bila miR393. Navarro in sod. (2006) so dokazali, da peptid, ki izvira iz flagelina, povzroči izražanje rastlinske miRNK, ki negativno urav- nava transkripte za receptorje avksina TIR1 (angl. tran- sport inhibitor response1), AFB2 in AFB3 (angl. auxin- -signalling F-Box corepressor). Utišanje signalizacije z avksinom vodi v omejevanje rasti bakterije Pseudomo- nas syringae Van Hall, 1904 pri navadnem repnjakovcu (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.), kar nakazuje, da je avksin odgovoren za dovzetnost na bolezen, pri čemer z miRNK-posredovano utišanje signalizacije avksina vodi v odpornost (Navarro in sod., 2006). Hormonska signalizacija modulira odziv rastlin na biotski stres ter posredno ali neposredno narekuje kom- promis med primarno rastjo in odzivnimi mehanizmi Acta agriculturae Slovenica, 118/4 – 2022 5 Vloga malih RNK pri odzivu rastlin na okužbo s patogenimi organizmi med patogenezo glivnih obolenj (Bari & Jones, 2009). Signalizacija posredovana z avksinom temelji na priso- tnosti ali odsotnosti avksina v jedru celice. Ob odsotnosti avksina so proteini Aux/IAA (avksin/indolocetna kislina, angl. auxin/indole acetic acid) vezani na ARF, s čimer jih inaktivirajo. Ob zaznavi avksina se tvori kompleks pro- teina TIR1 ter spremljajočih proteinov AFB1, AFB2 in AFB3, ki povzroči ubikvitinacijo proteinov Aux/IAA, s čimer se slednji sprostijo iz dejavnikov ARF, kar vodi v aktivacijo (lahko pa tudi represijo – odvisno od vloge družine ARF proteinov) transkripcije na avksin odziv- nih genov (Quint & Gray, 2006). Prav tako pa avksinska signalizacija utiša delovanje signalizacije posredovane s salicilno kislino. To nakazuje, da lahko povečano izraža- nje miR393 ter s tem utišanje avksinske signalizacije vodi v kopičenje salicilne kisline, ki dodatno zagotavlja večjo odpornost na fitopatogene (Wang in sod., 2007) (Slika 2). Prav tako v študijah opisujejo regulacijo avksinske signalizacije z drugimi miRNK, ki delujejo na transkripte različnih genov vpletenih v signalizacijo. Pri navadnem repnjakovcu miR160 nadzoruje nastanek koreninske čepice z uravnavanjem izražanja genov ARF10 in ARF16. Zaradi spremembe v izražanju ARF16, ki jo povzroči miR160, se je pri rastlinah zmanjšala vitalnost ter število Slika 1: Shematski prikaz biogeneze miRNK, tasiRNK in phasiRNK. Po prepisu MIR genov v primarne miRNK, se le-ta zvi- je v delno komplementarno obliko lasnice, ki se v večih korakih z Dicer-ju podobnimi proteini procesira do nastanka deloma ujemajočega dupleksa. Ena od verig slednjega se inkorporira v AGO1 protein, ki predstavlja glavno katalitično komponento RISC kompleksa. miRNK vodi celoten kompleks na njej komplementarno mesto v tarčnem transkriptu ter s pomočjo AGO1 proteina izvede razrez (miRNK-inducirano utišanje genov). V primeru izražanja specifičnih miRNK (npr. miR390), se lahko te inkorpori- rajo v druge AGO proteine (npr. AGO7) ter povzročijo razrez nekodirajočih TAS transkriptov ali kodirajočih PHAS transkriptov (miRNK-inducirana biogeneza sekundarnih malih interferenčnih RNK – tasiRNK ali phasiRNK). Za te transkripte je značilno, da se obratno prepišejo s pomočjo RDR v dsRNK. Tako nastalo dsRNK DCL4 razreže v popolnoma ujemajoče se duplekse, katerih ena od verig se inkorporira v AGO protein in dodatno ojača signal utišanja genov, ki je značilen za siRNK Figure 1: Schematic representation of the biogenesis of miRNAs, tasiRNAs, and phasiRNAs. After transcription of MIR genes into primary miRNAs, the latter is coiled into a partially complementary hairpin form that is processed in several steps by Dicer-like proteins to form a partially matched duplex. One of the strands of the resulting duplex is incorporated into the AGO1 protein, which is the major catalytic component of the RISC complex. The miRNA guides the entire complex to its complementary site in the target transcript and, with the help of the AGO1 protein, performs the cut (miRNA-induced gene silencing). When specific miRNAs are expressed (e.g. miR390), they can be incorporated into other AGO proteins (e.g. AGO7) and induce cleavage of non- coding TAS transcripts or coding PHAS transcripts (miRNA-induced biogenesis of secondary small interfering RNAs - tasiRNAs or phasiRNAs). These transcripts are characterized by their reverse transcription by RDR into dsRNAs. The resulting dsRNA is cut by DCL4 into perfectly matched duplexes, one strand of which is incorporated into the protein AGO, further amplifying the gene silencing signal characteristic of siRNA Acta agriculturae Slovenica, 118/4 – 20226 U. KUNEJ in E. STAJIČ Slika 2: Model „zig-zag-zig“ rastlinskega imunskega sistema. Izvirni model Jones and Dangl (2006) opisuje stopničast – več nivoj- ski, evolucijski model obrambe rastlin pred patogeni, ki opisuje kvantitativno naravo in molekularno evolucijo odpornosti proti boleznim pri rastlinah. Z odkritjem regulatorne vloge malih RNK v obrambnem odzivu rastlin so številne mikroRNK in fazne sekundarne male interferenčne RNK (phasiRNK) v „zig-zag-zig“ modelu rastlinskega imunskega sistema dobile svoje mesto, bodi- si na nivoju PTI ali ETI. V različici tega modela molekularni vzorci, povezani s patogeni (PAMP), povzročijo izražanje miRNK, ki prek hormonske signalizacije sodelujejo v imunosti sproženi s PAMP (angl. PAMP triggered imunity - PTI). Na primer, tretiranje s flagelinom poveča izražanje miR393, ki regulira izražanje genov, vključenih v avksinsko signalizacijo (TIR1, AFB2 in AFB3). Uti- šanje signalizacije avksina v času okužbe posledično izboljša gostiteljevo PTI. Prav tako pa miR393 sproži biogenezo phasiRNK, ki okrepijo aktivnost te miRNK, saj prav tako delujejo na gene, vključene v pot signalizacije avksina. Efektorski proteini patogenov lahko zavirajo delovanje rastlinskih miRNK, kar poveča občutljivost rastlin na okužbo. Pri tem lahko rastline aktivirajo drugi nivo obrambe v katerem sodeluje miR482. Slednja je negativni regulator rastlinskih genov za odpornost (R genov) in se ji ob zazna- vi efektorjev zmanjša izražanje, kar poveča odpornost sproženo z efektorji (angl. effector triggered immunity - ETI). Nekatere miRNK lahko sprožijo biogenezo phasiRNK, ki izhajajo iz R genov, te phasiRNK pa lahko delujejo sinergistično z miRNK bodisi v cis ali trans načinu in dodatno zmanjšujejo nivo transkriptov R genov. Nekateri efektorji lahko spodbudijo stabilnost oziroma izražanje miRNK z delovanjem na RNKi komponente, vključene v biogenezo miRNK. Mehanizmi tega modela še niso popolnoma razjasnjeni in so v sliki označeni z vprašajem. Na primer, ali lahko efektorji aktivirajo izražanje miRNK vključenih v ETI in s tem oslabijo imunski odziv gostitelja (povzeto po Fei in sod. (2013), Copyright © 2016 The American Phytopathological Society DOI: 10.1094/MPMI-09-15-0212-FI) Figure 2: A “zig-zag-zig” model of the plant immune system. The original model proposed by Jones and Dangl (2006) describes a stepwise, multi-level, evolutionary model of plant defense against pathogens that describes the quantitative nature and molecular evolution of disease resistance in plants. With the discovery of the regulatory role of small RNAs in plant defense responses, a number of microRNAs and secondary sRNAs, namely phased small interfering RNAs (phasiRNAs), have found their place in the ‘zig-zag-zig’ model of the plant immune system, either at the PTI or the ETI level. In a version of this model, pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) induce the expression of miRNAs that participate in PAMP-triggered immunity (PTI) via hormonal signalling. For example, flagellin treatment increases the expression of miR393, which regulates the expression of genes involved in auxin signalling (TIR1, AFB2 and AFB3). Consequently, suppression of auxin signalling during infection enhances host PTI. In addition, miR393 triggers the biogenesis of phasiRNAs that enhance the activity of this miRNA, as they also act on genes involved in the auxin signalling pathway. Pathogen effector proteins can inhibit the activity of plant miRNAs, increasing the susceptibility of plants to infection. In this context, plants may activate a second level of defense involving miR482. The latter is a negative regulator of plant resistance genes (R genes) and its expression is reduced when effectors are detected, increasing effector triggered immu- nity (ETI). Some miRNAs can trigger the biogenesis of R gene-derived phasiRNAs, and these phasiRNAs can act synergistically with miRNAs in either cis or trans mode to further reduce the level of R gene transcripts. Some effectors may promote miRNA stability or expression by acting on RNAi components involved in miRNA biogenesis. The mechanisms of this model are not yet fully understood and are indicated by a question mark in the figure. For example, whether effectors can activate the expression of miRNAs involved in ETIs and thereby attenuate the host immune response (reproduced from Fei et al. (2013), Copyright © 2016 The American Phytopathological Society DOI: 10.1094/MPMI-09-15-0212-FI) Acta agriculturae Slovenica, 118/4 – 2022 7 Vloga malih RNK pri odzivu rastlin na okužbo s patogenimi organizmi stranskih korenin (Wang in sod., 2005). Prav tako pa so nepravilno rast koreninskega tkiva opazili pri mutantih navadnega repnjakovca, ki so izražali različico ARF17, na katero miR160 ni imela vpliva. Rastline, ki so izra- žale različico ARF17, odporno na miRNK, so imele po- večane ravni transkriptov ARF17 in spremenjeno kopi- čenje mRNK GH3-podobnih proteinov (YDK1/GH3.2, GH3.3, GH3.5 in DFL1/GH3.6), katerih izražanje indu- cira avksin in so odgovorni za konjugacijo avksina. Spre- membe v izražanju teh genov so povezane z drastičnimi razvojnimi okvarami, vključno z anomalijami simetrije embrijev in rastočih listov, okvarami oblike listov, prez- godnjim razvojem socvetja, spremenjeno filotaksijo, zmanjšano velikostjo cvetnih listov, nenormalnimi stebli, sterilnostjo in okvarami rasti korenin (Mallory in sod., 2005). V naši nedavni študiji smo v koreninskih vzorcih odporne sorte hmelja, ki je bila inokulirana z letalnim patotipom glive V. nonalfalfae, opazili povečano izra- žanje hlu-miR160b. V analizi napovedovanja tarč, smo tarčno mesto te miRNK določili v transkriptih genov ARF10 in ARF18 (Kunej in sod., 2021). Za slednjega je znano, da zavira signalizacijo z avksinom, kar vodi v po- daljševanje hipokotilov pri rastlinah, ki rastejo v senčnih razmerah (Jia in sod., 2020). Povečano izražanje miR160 ter uravnavanje transkriptov ARF je bilo dokazano tudi med patogenezo bolezni stebelnega raka pri topolu vrste Populus trichocarpa Torr. & A.Gray ex. Hook. (Zhao in sod., 2012) in pri krompirju, pri katerem je bilo izražan- je StARF10 utišano. Slednji se veže na promotorje gena DFL1/GH3.6, ki posreduje v navzkrižni povezavi poti signalizacije s salicilno kislino in avksinom ter je tako s tem vpleten v lokalno obrambo in sistemsko pridob- ljeno odpornost proti krompirjevi plesni (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary) (Natarajan in sod., 2018). Prav tako pa so v študiji na rižu dokazali, da lahko prekomer- na ekspresija miR160a ali miR398b poveča odpornost riža na glivo Magnaporthe oryzae (Li in sod., 2014). Nasprotno pa so v študijah na jajčevcu (Yang in sod., 2013) ter oljni ogrščici (Shen in sod., 2014) opazili, da okužba z glivama V. dahliae oziroma V. longisporum povzroči zmanjšano izražanje miR160. Slednje naka- zuje, da je izražanje te miRNK potencialno vrstno- ali sortno-specifično oziroma povezano z občutljivostjo ali odpornostjo rastlin na glivne patogene. Večina odpornih sort kaže povečano izražanje miR160, medtem ko v ob- čutljivih opazimo zmanjšano ali nespremenjeno izražan- je tako miRNK, kot njihovih tarč (Yang in sod., 2013; Li in sod., 2014; Shen in sod., 2014). Tako kot miR393 in miR160, imajo tudi miR167 vlogo v regulaciji avksinske signalizacije. Za slednje so pri navadnem repnjakovcu dokazali, da regulirajo izra- žanje ARF6 in ARF8 (Jones-Rhoades & Bartel, 2004). Pri rižu, okuženem z glivo M. oryzae, je občutljiva sorta kazala manjše izražanje miR167a/b/c, odporna sorta pa znatno povečano, kar nakazuje, da so te miRNK poten- cialni pozitivni regulatorji odpornosti riža proti omenje- ni glivi (Li in sod., 2014). Dodaten nivo regulacije oziroma vzdrževanja ho- meostaze avksina zagotavljajo tudi miR164, ki regulira- jo izražanje transkripcijskih faktorjev z domenam zna- čilnimi za družino NAC. Med njimi NAC1 pozitivno uravnava razvoj stranskih korenin preko signalizacije z avksinom, pri čemer miR164, ki jo inducira avksin, na- dzoruje raven transkriptov NAC1 (Guo in sod., 2005). Regulacijo te miRNK so opazili pri bombažu in rižu kot odziv na okužbo z glivama V. dahliae in M. oryzae (Li in sod., 2014; Hu in sod., 2020). To lahko nakazuje na rast in razvoj novih stranskih korenin v času okužbe, saj rast- lina z mašenjem prevajalnega tkiva (tvorbo til) poskuša omejiti širjenje glive po rastlini (Talboys, 1958a). Nadaljnja karakterizacija interakcije miR164- NAC100 pri bombažu je pokazala, da povečano izražanje miR164 v odzivu na okužbo z V. dahliae vodi v neposred- no cepitev transkriptov NAC100. Prav tako pa so dokaza- li, da izražanje miR164 in tudi izbitje NAC100 pozitivno prispeva k odpornosti na glivo, saj je slednji represor gena GhPR3 (s patogenezo povezan gen 3; angl. pathogenesis related gene 3). Slednje nakazuje, da interakcija miR164- NAC100 igra pomembno vlogo v obrambo rastlin prek RNKi (Hu in sod., 2020). Povečano izražanje miR164 so opazili tudi pri od- pornih sortah riža, okuženih z glivo M. oryzae, pri čemer so opazili, da ta cepi transkripte gena »s salicilno kislino induciran protein 19« (angl. Salicylic acid-induced protein 19 – LOC_Os12g41680). To dodatno nakazuje na vlogo te miRNK v hormonski signalizaciji in potencialni od- pornosti na glivne patogene (Li in sod., 2019). Prav tako pa obstajajo še druge miRNK, ki so odziv- ne na okužbo z glivnimi patogeni in katerih tarče niso vpletene v hormonsko signalizacijo, ampak lahko po- sredno vplivajo na odpornost rastlin na okužbo. Študije kažejo, da je povečana odpornost rastlin povezana s povečanim izražanjem miRNK, ki so vpletene v rast in razvoj tkiv (Guo in sod., 2005; Mallory in sod., 2005; Wang in sod., 2005; Singh in sod., 2014). Po drugi strani pa v študijah opisujejo različno izražanje miRNK, ki so posredno ali neposredno vpletene v regulacijo obramb- nih mehanizmov in imunost (Yi & Richards, 2007; Gupta in sod., 2012; Zhao in sod., 2012; Wong in sod., 2014). Pri miRNK, ki so vpletene v obrambne mehanizme, lah- ko opazimo različno izražanje, ki je odvisno od patosis- tema. Medtem ko miRNK, ki so neposredno vpletene v imunost, t.j. regulirajo izražanje s patogenezo povezanih genov ali genov za odpornost proti patogenom, kažejo znižano izražanje. Acta agriculturae Slovenica, 118/4 – 20228 U. KUNEJ in E. STAJIČ 6 miRNK SO VPLETENE V OBRAMBNE MEHANIZME V mehanizme odpornosti vključujemo tudi nasta- janje strukturnih barier, sintezo sekundarnih metabo- litov in protimikrobnih encimov in proteinov. Rastline lahko širjenje patogenov omejijo s tvorbo fizičnih barier v prevajalnem tkivu ter nalaganjem lignina v endoderm- ne plasti. Slednje procese so v odzivu na glivo V. nonal- falfae opazili pri občutljivi sorti hmelja, medtem ko so pri odporni opazili intenzivno nalaganje suberina (Talboys, 1958a; Cregeen in sod., 2015). Omenjeni procesi so zelo dobro uravnavani na različnih ravneh, pri čemer imajo miRNK pomembno vlogo v njihovi post-transkripcij- ski regulaciji. Na primer za miRNK iz družin miR397, miR398 in miR408 je znano, da so v času patogeneze glivnih obolenj preko uravnavanja bakrove superoksidne dismutaze, lakaz in plantacianinov vpletene v regulacijo bakra, ki ima biocidno aktivnost (Abdel-Ghany & Pilon, 2008). Še posebej pomembni sta slednji dve skupini, la- kaze in plantacianini, ki so tarče miR408. Ti so ključni encimi v biosintezi lignina, saj katalizirajo zadnji korak polimerizacije monolignolov (Huang in sod., 2016). Pri občutljivi in odporni sorti pšenice so v odzivu na okužbo z glivo Puccinia graminis f. sp. tritici patotip 62G29-1 ugotovili zmanjšano izražanje miR408 in miR1138, kar se je odražalo v povečanem izražanju tarč in povečani biosintezi kaloze in lignina v času preobčutljivostnega odziva na mestu okužbe (Gupta in sod., 2012). Karak- terizacija interakcije ghr-miR397 in njene tarče GhLAC4 je pri bombažu v času okužbe z glivo V. dahliae pokazala njegovo pomembno vlogo v odpornosti. Po okužbi z glivo V. dahliae so raziskovalci ugotovili večjo vsebnost lignina pri rastlinah z izbito miR397 v primerjavi s kontrolnimi rastlinami, medtem ko je prekomerno izražanje miR397 in izbitje gena GhLAC4 zmanjšalo vsebnost lignina, pri čemer so rastline kazale večjo občutljivost na okužbo z glivo. To nakazuje na pomembno vlogo biosinteze in na- laganja lignina v času okužbe (Wei in sod., 2021). Nekatere tarče teh miRNK so negativni regulatorji mehanizmov odpornosti, kar pomeni, da lahko poveča- no izražanje miRNK prispeva k manjšemu izražanju tarč in s tem povečani odpornosti rastlin. Na primer, miR166 in miR165 delujeta tarčno na transkripte genov iz dru- žine HD-ZIP III (angl. Class III homeodomain-leucine zipper). Povečano izražanje miR166 so opazili v apikal- nem meristemu korenin pri navadnem repnjakovcu ter opazili večjo aktivnost apikalnega meristema in rast ko- renin, hkrati pa tudi razvoj sekundarne celične stene in prevajalnega tkiva (Singh in sod., 2014). Progar in sod. (2017) so primerjali transkriptomska profila odporne in občutljive sorte hmelja po okužbi z glivo V. nonalfalfae in opazili 2,3-krat manjše izražanje genov družine HD- ZIP III v okuženih rastlinah odporne sorte hmelja Wye Target šesti dan po inokulaciji, česar pa niso opazili pri občutljisorti Celeia. Slednje nakazuje, da so v proces re- gulacije genov družine HD-ZIP III v času okužbe poten- cialno vpletene miR165 in miR166, kar bi lahko botrova- lo k opaženi večji odpornosti sorte Wye Target. miR166 je še posebej zanimiva, saj spada v kategorijo miRKA, ki se lahko prenaša med kraljestvi. (Zhang in sod.(2016) so dokazali, da rastline bombaža v odzivu na okužbo z gli- vo V. dahliae povečajo izražanje miR166 in miR159 ter ju prenesejo v hife glive. Prav tako so tudi dokazali, da delujeta tarčno na transkripte glivnih genov Clp-1 (od Ca2+odvisna cisteinska proteaza) in HiC-15 (izotrihoder- min C-15 hidroksilaza), ki sta odgovorna za virulenco glive. 7 miRNK REGULIRAJO IZRAŽANJE GENOV Z REZISTENCO POVEZANIH PROTEINOV V primeru, da patogeni preidejo prvi nivo obram- be, t.j. PTI in začnejo sproščati efektorske proteine v ce- lice, se aktivira izražanje znotrajceličnih receptorjev, ki jih kodirajo R geni. Ti prepoznavajo efektorske proteine in sprožijo ETI (Jones & Dangl, 2006; Thomma in sod., 2011). Glavna skupina R proteinov je sestavljena iz NB domene za vezavo nukleotidov in LRR domene boga- te s ponovitvami levcina. Kodirajo jih NB-LRR R-geni. NB domena preferenčno veže ATP/ADP ali GTP/GDP, domena LRR pa je pogosto vključena v interakcije med proteini (protein-protein) in vezavo ligandov. NB-LRR R-gene lahko nadalje, glede na vrsto N-terminalne do- mene, delimo na receptorje z N-terminalno domeno po- dobno toll interlevkinu-1 (TIR-NB-LRR) in receptorje z domeno v obliki vijačnice (CC-NB-LRR) (Knepper & Day, 2010). Tako kot v prejšnjih poglavjih opisane miRNK, ki so odzivne na s patogeni-povezanimi molekularnimi vzor- ci v prvem nivoju odziva rastlin na patogene (PTI) ter imajo vlogo obrambnih mehanizmih, obstajajo miRNK, ki neposredno ali posredno – z aktivacijo biogeneze se- kundarnih siRNK - regulirajo izražanje R genov in so od- govorne za uravnavanje prirojene imunosti (Fei in sod., 2013). Leta 2007 sta Yi in Richards prva poročala o mo- rebitnih učinkih post-transkripcijskega utišanja pri blaženju prekomernega izražanja R genov iz komplek- snega lokusa pri navadnem repnjakovcu. Lokus RPP5 (angl.  recognition of Peronospora parasitica 5) pri navad- nem repnjakovcu vsebuje sedem genov iz TIR-NB-LRR družine R genov. Dva gena na tem lokusu, imenovana RPP4 in SNC1, zagotavljata odpornost proti bakteriji P. Acta agriculturae Slovenica, 118/4 – 2022 9 Vloga malih RNK pri odzivu rastlin na okužbo s patogenimi organizmi syringae in oomiceti Hyaloperonospora parasitica (Pers.) Constant., V študiji sta potrdila, da endogene male RNK, ki nastanejo s prepisom protismiselne verige transkrip- tov SNC1, zavirajo izražanje ostalih genov tega lokusa. Pri mutantih z okvarjenimi komponentami RNKi, kot sta dcl4 in ago1, se je povečalo kopičenje SNC1 (Yi & Richards, 2007). V nadaljnjih študijah pa so odkrili tudi ostale specifične miRNK, ki posredno, preko indukcije biogeneze sekundarnih sRNK (phasiRNK), regulirajo izražanje NB-LRR genov ter eksperimentalno potrdili in natančneje karakterizirali celotno RNKi pot (Shivapra- sad in sod., 2012). Pri paradižniku so opisali 15 lokusov iz katerih izhajajo phasiRNK, od katerih jih 6 kodira NB-LRR pro- teine. Avtorji so ugotovili, da miR482 vezana v AGO1 povzroči cepitev mRNK LRR1, proteina tipa CC-NR- LRR, ki se nato obratno prepiše s pomočjo RDR6. Tako nastalo dsRNKA nato DCL4 od začetka mesta cepitve, ki ga določa vezavno mesto miR482, v fazah razreže v 21 nt dolge phasiRNK. Ob okužbi paradižnika z bakteri- jo P. syringae so opazili zmanjšano izražanje miR482 ter sočasno indukcijo R genov, kar potencialno ščiti rastli- ne pred napadom patogena (Shivaprasad in sod., 2012). Povečano izražanje miR482 so opazili tudi v interakciji med bombažem in glivo V. dahliae, kar je verjetno vodilo do de-represije R genov po okužbi ter s tem specifičnega imunskega odziva - ETI na glivno okužbo (Zhu in sod., 2013). Podobno so zmanjšano izražanje te miRNK opa- zili tudi pri soji, okuženi z oomiceto Phytophthora sojae Kaufm. & Gerd. (Wong in sod., 2014). Dodatno so avtorji opisali še dve miRNK; miR2109, ki se veže na motiv TIR1 v mRNK TIR-NB-LRR in miR1507, ki deluje na motiv kinaza-2 v mRNK CC-NB-LRR. Za slednji miRNK so ugotovili, da kažeta povečano izražanje pri soji okuženi z P. sojae, ne pa pri soji inokulirani z neaktivno obliko seva. To kaže na njuno vlogo uravnavanja ETI odziva, saj lahko dodatno zmanjšanje izražanje teh miRNK vodi v hitro povečanje vsebnosti NB-LRR proteinov ter s tem še bolj intenzivnega odziva na okužbo (Wong in sod., 2014). Na podlagi teh analiz lahko domnevamo, da je re- gulacija NB-LRR, ki jo posredujejo male RNK, ključna za imunske odzive rastlin. 8 ZAKLJUČEK Razumevanje delovanja malih RNK je odvisno od identifikacije tarčnih genov ter njihove vloge. Identifika- cija siRNK in miRNK ter njihovih tarč postavlja temelje, ki so potrebni za boljšo karakterizacijo kompleksnega omrežja regulatornih interakcij, ki nadzorujejo rast in razvoj ter druge fiziološke procese rastlin in so prav tako vključeni v odziv rastlin na biotske in abiotske dejavni- ke stresa. Kljub temu, da so bile miRNK odkrite pred približno tremi desetletji, nam je razvoj tehnologije se- kvenciranja zelo kratkih RNK omogočil hitro odkritje in postavitev modela delovanja poti RNK interference, ki jo vodijo male interferenčne RNK. Z dobro identifikacijo delovanja nekaterih sRNK pa se vzpostavljajo metode, ki kažejo velik potencial za izboljšave nekaterih lastnosti rastlin. Predvsem pa je poudarek na razvoju strategij za izboljšanje lastnosti rastlin, ki pripomorejo k večji od- pornosti agronomsko pomembnih rastlin, ki nam zago- tavljajo prehransko varnost. 9 REFERENCE Abdel-Ghany, S. E., and Pilon, M. (2008). MicroRNA-mediated systemic down-regulation of copper protein expression in response to low copper availability in Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry, 283(23), 15932-15945. doi: https:// doi.org/10.1074/jbc.M801406200 Axtell, M. J., and Meyers, B. C. (2018). Revisiting criteria for plant microRNA annotation in the era of big data. Plant Cell, 30(2), 272-284. doi: https://doi.org/10.1105/tpc.17.00851 Bari, R., and Jones, J. (2009). Role of plant hormones in plant defence responses. Plant Molecular Biology, 69(4), 473-488. doi: https://doi.org/10.1007/s11103-008-9435-0 Chen, P., Lee, B., and Robb, J. (2004). Tolerance to a non-host isolate of Verticillium dahliae in tomato. Physiological and Molecular Plant Pathology, 64(6), 283-291. doi: https://doi. org/10.1016/j.pmpp.2004.10.002 Cregeen, S., Radišek, S., Mandelc, S., Turk, B., Štajner, N., Jakše, J., and Javornik, B. (2015). Different gene expressions of resistant and susceptible hop cultivars in response to in- fection with a highly aggressive strain of Verticillium albo- atrum. Plant Molecular Biology Reporter, 33(3), 689-704. doi: https://doi.org/10.1007/s11105-014-0767-4 Cuperus, J. T., Carbonell, A., Fahlgren, N., Garcia-Ruiz, H., Burke, R. T., Takeda, A., . . . Carrington, J. C. (2010). Unique functionality of 22-nt miRNAs in triggering RDR6- dependent siRNA biogenesis from target transcripts in Arabidopsis. Nature Structural & Molecular Biology, 17(8), 997-1003. doi: https://doi.org/10.1038/nsmb.1866 Dezulian, T., Palatnik, J. F., Huson, D., and Weigel, D. (2005). Conservation and divergence of microRNA fami- lies in plants. Genome Biology, 6(P13). doi: https://doi. org/10.1186/gb-2005-6-11-p13 Fei, Q. L., Xia, R., and Meyers, B. C. (2013). Phased, second- ary, small interfering RNAs in posttranscriptional regula- tory networks. Plant Cell, 25(7), 2400-2415. doi: https://doi. org/10.1105/tpc.113.114652 Gayoso, C., Pomar, F., Novo-Uzal, E., Merino, F., and de Ilar- duya, O. M. (2010). The Ve-mediated resistance response of the tomato to Verticillium dahliae involves H2O2, per- oxidase and lignins and drives PAL gene expression. BMC Plant Biology, 10. doi: https://doi.org/10.1186/1471-2229- 10-232 Guo, H. S., Xie, Q., Fei, J. F., and Chua, N. H. (2005). MicroRNA Acta agriculturae Slovenica, 118/4 – 202210 U. KUNEJ in E. STAJIČ directs mRNA cleavage of the transcription factor NAC1 to downregulate auxin signals for Arabidopsis lateral root development. Plant Cell, 17(5), 1376-1386. doi: https://doi. org/10.1105/tpc.105.030841 Gupta, O. P., Permar, V., Koundal, V., Singh, U. D., and Praveen, S. (2012). MicroRNA regulated defense responses in Triti- cum aestivum L. during Puccinia graminis f.sp. tritici infec- tion. Molecular Biology Reports, 39(2), 817-824. doi: https:// doi.org/10.1007/s11033-011-0803-5 Gupta, O. P., Sharma, P., Gupta, R. K., and Sharma, I. (2014). Current status on role of miRNAs during plant-fungus in- teraction. Physiological and Molecular Plant Pathology, 85, 1-7. doi: https://doi.org/10.1016/j.pmpp.2013.10.002 Henderson, I. R., Zhang, X. Y., Lu, C., Johnson, L., Meyers, B. C., Green, P. J., and Jacobsen, S. E. (2006). Dissecting Arabi- dopsis thaliana DICER function in small RNA processing, gene silencing and DNA methylation patterning. Nature Genetics, 38(6), 721-725. doi: https://doi.org/10.1038/ ng1804 Hrnčič, M. K., Spaninger, E., Košir, I. J., Knez, Z., and Bren, U. (2019). Hop compounds: extraction techniques, chemical analyses, antioxidative, antimicrobial, and anticarcinogenic effects. Nutrients, 11(2), 275, doi: 237 str. doi: https://doi. org/10.3390/nu11020257 Hu, G., Lei, Y., Liu, J. F., Hao, M. Y., Zhang, Z. N., Tang, Y., . . . Wu, J. H. (2020). The ghr-miR164 and GhNAC100 mod- ulate cotton plant resistance against Verticillium dahlia. Plant Science, 293. doi: https://doi.org/10.1016/j.plants- ci.2020.110438 Huang, J. H., Qi, Y. P., Wen, S. X., Guo, P., Chen, X. M., and Chen, L. S. (2016). Illumina microRNA profiles reveal the involvement of miR397a in Citrus adaptation to long-term boron toxicity via modulating secondary cell-wall biosyn- thesis. Scientific Reports, 6. doi: https://doi.org/10.1038/ srep22900 IHGC. (2019). International Hop Growers’ Convention: economic commission - summary reports. Retrieved 22.11.2019, 2019, from http://www.hmelj-giz.si/ihgc/ doc/2019%20APR%20IHGC%20EC%20Report_final.pdf Jia, Y. B., Kong, X. P., Hu, K. Q., Cao, M. Q., Liu, J. J., Ma, C. L., . . . Ding, Z. J. (2020). PIFs coordinate shade avoidance by inhibiting auxin repressor ARF18 and metabolic regula- tor QQS. New Phytologist, 228(2), 609-621. doi: https://doi. org/10.1111/nph.16732 Jones-Rhoades, M. W., and Bartel, D. P. (2004). Computational identification of plant microRNAs and their targets, includ- ing a stress-induced miRNA. Molecular Cell, 14(6), 787- 799. doi: https://doi.org/10.1016/j.molcel.2004.05.027 Jones, J. D. G., and Dangl, J. L. (2006). The plant immune system. Nature, 444(7117), 323-329. doi: https://doi.org/10.1038/ nature05286 Khraiwesh, B., Zhu, J. K., and Zhu, J. H. (2012). Role of miRNAs and siRNAs in biotic and abiotic stress responses of plants. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mecha- nisms, 1819(2), 137-148. doi: https://doi.org/10.1016/j.bba- grm.2011.05.001 Knepper, C., and Day, B. (2010). From perception to activation: The molecular-genetic and biochemical landscape of dis- ease resistance signaling in plants. The Arabidopsis Book, 8(e0124), 1-17. doi: https://doi.org/10.1199/tab.0124 Kunej, U., Jakše, J., Radišek, S., and Štajner, N. (2021). Iden- tification and characterization of Verticillium nonalfalfae- responsive microRNAs in the roots of resistant and sus- ceptible hop cultivars. Plants-Basel, 10(9). doi: https://doi. org/10.3390/plants10091883 Lee, Y., Kim, M., Han, J. J., Yeom, K. H., Lee, S., Baek, S. H., and Kim, V. N. (2004). MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO Journal, 23(20), 4051-4060. doi: https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600385 Li, Y., Jeyakumar, J. M. J., Feng, Q., Zhao, Z. X., Fan, J., Khaskheli, M. I., and Wang, W. M. (2019). The roles of rice microRNAs in rice-Magnaporthe oryzae interaction. Phy- topathology Research, 1(1). doi: https://doi.org/10.1186/ s42483-019-0040-8 Li, Y., Lu, Y. G., Shi, Y., Wu, L., Xu, Y. J., Huang, F., . . . Wang, W. M. (2014). Multiple rice microRNAs are involved in im- munity against the blast fungus Magnaporthe oryzae. Plant Physiology, 164(2), 1077-1092. doi: https://doi.org/10.1104/ pp.113.230052 Mallory, A. C., Bartel, D. P., and Bartel, B. (2005). MicroRNA-di- rected regulation of Arabidopsis AUXIN RESPONSE FAC- TOR17 is essential for proper development and modulates expression of early auxin response genes. Plant Cell, 17(5), 1360-1375. doi: https://doi.org/10.1105/tpc.105.031716 Montgomery, T. A., Howell, M. D., Cuperus, J. T., Li, D. W., Hansen, J. E., Alexander, A. L., . . . Carrington, J. C. (2008). Specificity of ARGONAUTE7-miR390 interaction and dual functionality in TAS3 trans-acting siRNA forma- tion. Cell, 133(1), 128-141. doi: https://doi.org/10.1016/j. cell.2008.02.033 Natarajan, B., Kalsi, H. S., Godbole, P., Malankar, N., Thiaga- rayaselvam, A., Siddappa, S., . . . Banerjee, A. K. (2018). MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infec- tion in potato. Journal of Experimental Botany, 69(8), 2023- 2036. doi: https://doi.org/10.1093/jxb/ery025 Navarro, L., Dunoyer, P., Jay, F., Arnold, B., Dharmasiri, N., Estelle, M., . . . Jones, J. D. G. (2006). A plant miRNA con- tributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science, 312(5772), 436-439. doi: https://doi. org/10.1126/science.1126088 Neve, R. A. (1991). Hops. Dordrecht, Netherlands: Springer. https://doi.org/10.1007/978-94-011-3106-3 Padmanabhan, M., Cournoyer, P., and Dinesh-Kumar, S. P. (2009). The leucine-rich repeat domain in plant innate immunity: a wealth of possibilities. Cellular Microbiol- ogy, 11(2), 191-198. doi: https://doi.org/10.1111/j.1462- 5822.2008.01260.x Progar, V., Jakše, J., Štajner, N., Radišek, S., Javornik, B., and Berne, S. (2017). Comparative transcriptional analysis of hop responses to infection with Verticillium nonalfalfae. Plant Cell Reports, 36(10), 1599-1613. doi: https://doi. org/10.1007/s00299-017-2177-1 Quint, M., and Gray, W. M. (2006). Auxin signaling. Current Opinion in Plant Biology, 9(5), 448-453. doi: 10.1016/j. pbi.2006.07.006 Radišek, S., Jakše, J., and Javornik, B. (2004). Development Acta agriculturae Slovenica, 118/4 – 2022 11 Vloga malih RNK pri odzivu rastlin na okužbo s patogenimi organizmi of pathotype-specific SCAR markers for detection of Verticillium albo-atrum isolates from hop. Plant Dis- ease, 88(10), 1115-1122. doi: https://doi.org/10.1094/ PDIS.2004.88.10.1115 Radišek, S., Jakše, J., and Javornik, B. (2006). Genetic variability and virulence among Verticillium albo-atrum isolates from hop. European Journal of Plant Pathology, 116(4), 301-314. doi: https://doi.org/10.1007/s10658-006-9061-0 Ren, G. D., Xie, M., Zhang, S. X., Vinovskis, C., Chen, X. M., and Yu, B. (2014). Methylation protects microRNAs from an AGO1-associated activity that uridylates 5’ RNA fragments generated by AGO1 cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111(17), 6365-6370. doi: https://doi.org/10.1073/ pnas.1405083111 Saurabh, S., Vidyarthi, A. S., and Prasad, D. (2014). RNA in- terference: concept to reality in crop improvement. Planta, 239(3), 543-564. doi: https://doi.org/10.1007/s00425-013- 2019-5 Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. N., and Hollier, C. (2012). Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security, 4(4), 519-537. doi: https://doi.org/10.1007/s12571-012-0200-5 Shen, D., Suhrkamp, I., Wang, Y., Liu, S. Y., Menkhaus, J., Ver- reet, J. A., . . . Cai, D. G. (2014). Identification and charac- terization of microRNAs in oilseed rape (Brassica napus) responsive to infection with the pathogenic fungus Verticil- lium longisporum using Brassica AA (Brassica rapa) and CC (Brassica oleracea) as reference genomes. New Phytologist, 204(3), 577-594. doi: https://doi.org/10.1111/nph.12934 Shivaprasad, P. V., Chen, H. M., Patel, K., Bond, D. M., Santos, B. A. C. M., and Baulcombe, D. C. (2012). A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell, 24(3), 859-874. doi: https://doi.org/10.1105/tpc.111.095380 Singh, A., Singh, S., Panigrahi, K. C. S., Reski, R., and Sarkar, A. K. (2014). Balanced activity of microRNA166/165 and its target transcripts from the class III homeodomain- leucine zipper family regulates root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Reports, 33(6), 945-953. doi: https://doi. org/10.1007/s00299-014-1573-z Song, L., Axtell, M. J., and Fedoroff, N. V. (2010). RNA sec- ondary structural determinants of miRNA precursor pro- cessing in Arabidopsis. Current Biology, 20(1), 37-41. doi: https://doi.org/10.1016/j.cub.2009.10.076 Steenackers, B., De Cooman, L., and De Vos, D. (2015). Chemi- cal transformations of characteristic hop secondary me- tabolites in relation to beer properties and the brewing pro- cess: A review. Food Chemistry, 172, 742-756. doi: https:// doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.09.139 Talboys, P. W. (1958a). Association of tylosis and hyperplasia of the xylem with vascular invasion of the hop by Verti- cillium albo-atrum. Transaction of the British Mycological Society, 41, 249-260. doi: https://doi.org/10.1016/S0007- 1536(58)80037-6 Talboys, P. W. (1958b). Degradation of cellulose by Verticil- lium albo-atrum. Transactions of the British Mycological Society, 41(2), 242-248. doi: https://doi.org/10.1016/S0007- 1536(58)80036-4 Thomma, B. P. H. J., Nurnberger, T., and Joosten, M. H. A. J. (2011). Of PAMPs and effectors: The blurred PTI- ETI dichotomy. Plant Cell, 23(1), 4-15. doi: https://doi. org/10.1105/tpc.110.082602 Wagner, E. G. H., and Simons, R. W. (1994). Antisense RNA control in bacteria, phages, and plasmids. Annual Review of Microbiology, 48, 713-742. doi: https://doi.org/10.1146/ annurev.mi.48.100194.003433 Wang, D., Pajerowska-Mukhtar, K., Culler, A. H., and Dong, X. N. (2007). Salicylic acid inhibits pathogen growth in plants through repression of the auxin signaling pathway. Current Biology, 17(20), 1784-1790. doi: https://doi.org/10.1016/j. cub.2007.09.025 Wang, J. W., Wang, L. J., Mao, Y. B., Cai, W. J., Xue, H. W., and Chen, X. Y. (2005). Control of root cap formation by microRNA-targeted auxin response factors in Arabidopsis. Plant Cell, 17(8), 2204-2216. doi: https://doi.org/10.1105/ tpc.105.033076 Wei, T. P., Tang, Y., Jia, P., Zeng, Y. M., Wang, B. T., Wu, P., . . . Wu, J. H. (2021). A cotton lignin biosynthesis gene, GhLAC4, fine-tuned by ghr-miR397 modulates plant resist- ance against Verticillium dahliae. Frontiers in Plant Science, 12. doi: https://doi.org/10.3389/fpls.2021.743795 Wong, J., Gao, L., Yang, Y., Zhai, J. X., Arikit, S., Yu, Y., . . . Ma, W. B. (2014). Roles of small RNAs in soybean defense against Phytophthora sojae infection. Plant Journal, 79(6), 928-940. doi: https://doi.org/10.1111/tpj.12590 Yadeta, K., and Thomma, B. P. H. J. (2013). The xylem as bat- tleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science, 4. doi: https://doi.org/10.3389/ fpls.2013.00097 Yang, L., Jue, D. W., Li, W., Zhang, R. J., Chen, M., and Yang, Q. (2013). Identification of MiRNA from eggplant (Solanum melongena L.) by small RNA deep sequencing and their re- sponse to Verticillium dahliae Infection. Plos One, 8(8). doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072840 Yang, Z. Y., Ebright, Y. W., Yu, B., and Chen, X. M. (2006). HEN1 recognizes 21-24 nt small RNA duplexes and depos- its a methyl group onto the 2 ‘ OH of the 3 ‘ terminal nucle- otide. Nucleic Acids Research, 34(2), 667-675. doi: https:// doi.org/10.1093/nar/gkj474 Yi, H., and Richards, E. J. (2007). A cluster of disease resist- ance genes in Arabidopsis is coordinately regulated by tran- scriptional activation and RNA silencing. Plant Cell, 19(9), 2929-2939. doi: https://doi.org/10.1105/tpc.107.051821 Yu, L., Guo, R. K., Jiang, Y. Q., Ye, X. H., Yang, Z. H., Meng, Y. J., and Shao, C. G. (2019). Identification of novel pha- siRNAs loci on long non-coding RNAs in Arabidopsis thaliana. Genomics, 111(6), 1668-1675. doi: https://doi. org/10.1016/j.ygeno.2018.11.017 Zhang, T., Zhao, Y. L., Zhao, J. H., Wang, S., Jin, Y., Chen, Z. Q., . . . Guo, H. S. (2016). Cotton plants export microR- NAs to inhibit virulence gene expression in a fungal path- ogen. Nature Plants, 2(10). doi: https://doi.org/10.1038/ nplants.2016.153 Zhao, J. P., Jiang, X. L., Zhang, B. Y., and Su, X. H. (2012). In- volvement of microRNA-mediated gene expression regula- tion in the pathological development of stem canker dis- Acta agriculturae Slovenica, 118/4 – 202212 U. KUNEJ in E. STAJIČ ease in Populus trichocarpa. Plos One, 7(9). doi: https://doi. org/10.1371/journal.pone.0044968 Zhu, Q. H., Fan, L. J., Liu, Y., Xu, H., Llewellyn, D., and Wilson, I. (2013). miR482 regulation of NBS-LRR defense genes during fungal pathogen infection in cotton. Plos One, 8(12). doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0084390