Helena Lenasi1
Endotelijski hiperpolarizirajoci dejavnik in mikrocirkulacija kože
Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor and Skin Microcirculation
IZVLEČEK_
KLJUČNE BESEDE: koža - prekrvavitev, mikrocirkulacija, laser - doplersko merjenje pretoka, endotelij žilni, vazodilatacija
Tonus žil v mikrocirkulaciji kože poleg sistemskih uravnavajo tudi lokalni dejavniki, od katerih so zelo pomembni vazodilatatorji, ki se sproščajo iz endotelija. Razen dušikovemu oksidu (NO) in prostaciklinu (PGI2) v zadnjem času pripisujejo vse večji pomen endotelijskemu hiper-polarizirajočemu dejavniku (EDHF), katerega kemijska zgradba in vloga pri človeku še nista pojasnjeni. V raziskavi smo želeli preučiti vlogo EDHF pri uravnavanju pretokov v mikrocirkulaciji kože. Zanimalo nas je tudi, če je, tako kot v nekaterih drugih žilah, v mehanizem njegovega nastanka vpleten citokrom P450 (CYP) 2C9. V raziskavi je sodelovalo 14 zdravih preiskovancev moškega spola, starih od 20 do 37 let (povprečna starost 25,9 ± 1,7). Pretoke v mikrocirkulaciji kože smo merili z laser Dopplerjevo (LD) metodo na volarni strani pod-lakti. Delovanje ostalih vazodilatatorjev smo zavrli tako, da smo v kožo z metodo mikroinjekcije istočasno vnesli Nm-monometil L-arginin (L-NMMA), ki je zaviralec endotelijske sintaze dušikovega oksida (eNOS), ter diklofenak, zaviralec ciklooksigenaze (COX). Delovanje CYP pa smo zavrli s selektivnim zaviralcem CYP 2C9, sulfafenazolom. Ocenjevali smo pretoke v mirovanju ter odzivnost žil po uporabi acetilholina (ACh, od endotelija odvisni vazodilatator) in natrijevega nitroprusida (NaNP, od endotelija neodvisni vazodilatator), ki smo ju v kožo vnesli z iontoforezo, ter hiperemijo po popustitvi arterijskega zažema (pookluzijska reaktivna hiperemija, PRH). Zaviranje eNOS in COX ni vplivalo na bazalne LD pretoke (12,5 ± 2,3 PE (perfuzijske enote) na obravnavanem in 10,9 ± 1,8 PE na kontrolnem mestu, t-test), povzročilo pa je statistično značilno zmanjšanje z ACh izzvane vazodilatacije (35,6 ±5,7 PE na kontrolnem in 66,6 ± 8,3 PE na obravnavanem mestu, t-test, p < 0,05); še vedno je bilo ohranjene 70 % vazodilatacije. Zaviranje eNOS in COX ni imelo vpliva na z NaNP izzvano vazodilatacijo. Po zaviranju eNOS in COX se je značilno zmanjšala površina pod krivuljo PRH (985,4 ± 202 PE x sek na obravnavanem in 1252 ± 186 PE x sek na kontrolnem mestu, t-test, p < 0,05). Sulfafenazol ni vplival na bazalne LD pretoke niti na odzivnost mikrocirkulacije po iontoforezi ACh in popustitvi zažema arterije. Zaključimo lahko, da pri uravnavanju pretokov v mikrocirkulaciji kože igra pomembno vlogo od endotelija odvisni mehanizem, ki ni odvisen od NO in PGI2 in ga lahko potencialno pripišemo delovanju EDHF. Morebitni EDHF najverjetneje ni derivat CYP 2C9.
ABSTRACT_
KEY WORDS: skin - blood supply, microcirculation, laser - Doppler flowmetry, endothelium vascular, vasodilatation
The skin microcirculation is controlled by systemic and local factors; the latter are mainly released from the endothelium. One of important endothelial vasodilators is endotheli-um-derived hyperpolarizing factor (EDHF) whose function can be assessed by blocking other
1 Asist. dr. Helena Lenasi, dr.med., Inštitut za fiziologijo, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Zaloška 4, 1000 Ljubljana.
vasodilators, such as nitric oxide (NO) and prostacyclin (PGI2). The role and nature of EDHF in humans remains to be elucidated. The aim of our study was therefore to investigate and characterize the NO- and PGI2-independent mechanism, potentially attributable to EDHF, in human skin microcirculation. 14 healthy male volunteers (aged 20 to 37 years, mean age 25.9 ± 1.7) were included in the study. Cutaneous blood flow was measured using the laser Doppler (LD) method on the volar aspect of the forearm and expressed in perfusion units (PU). Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and cyclooxygenase (COX) were inhibited by subcutaneously injecting Nm-monomethyl L-arginine (L-NMMA) and diclofenac, respectively. The potential involvement of cytochrome P450 (CYP) in the generation of EDHF was evaluated by injecting the selective CYP 2C9 inhibitor sulfaphenazole. The baseline LD flow and microvascular reactivity were assessed by performing iontophoresis of acetylcholine (ACh, endothelium-dependent vasodilator) and by measuring postocclusive reactive hyperemia (PRH). eNOS and COX inhibition did not affect the baseline LDF (12.5±2.3 PU in the treated site and 10.9 ± 1.8 PU in the control site, t-test), but it significantly attenuated ACh-induced vasodilatation in the eNOS and COX-treated site (35.6 ± 5.7 PU in the treated site vs. 66.6 ± 8.3 PU in the control site, t-test, p < 0.05). Nevertheless, about 70% of ACh-induced vasodilatation persisted. In addition, L-NMMA and diclofenac significantly attenuated the area under the PRH curve, but LDF increase after removal of occlusion was preserved. Sulfaphenazole had no impact either on the baseline LDF or on ACh-induced vasodilatation or PRH parameters. It was concluded that the NO- and PGI2-independent mechanism, potentially attributable to EDHF, plays an important role in the regulation of vascular tone in the human cutaneous microcirculation and that it is probably not a CYP-derived metabolite.
UVOD
Koža je eden največjih organov v telesu: tehta 5 % telesne teže in s svojo površino 1,8 m2 prekriva telo in ga varuje pred zunanjimi vplivi (1,2). Ena njenih najpomembnejših funkcij je izmenjava toplote med telesom in okolico, kar omogoča uravnavanje telesne temperature; glede na temperaturo okolja in temperaturo jedra telesa, ki je med drugim pogojena s telesno aktivnostjo, so pretoki krvi skozi kožo podvrženi zelo velikim nihanjem. Ocenjujejo, da je v mirovanju v termonevtral-nih razmerah pretok skozi kožo od 200 do 500 ml/min, ob hudih telesnih obremenitvah pa lahko naraste do 8 l/min in pri tem predstavlja kar 60 % minutnega volumna srca (2). Prav zaradi velikih nihanj pretoka sta zelo pomembna nadzor in uravnavanje mikro-cirkulacije v koži, ki ima svoje anatomske in funkcionalne posebnosti. Ena od anatomskih posebnosti so arteriovenske anastomo-ze (2,3), ki jih najdemo predvsem na akralnih delih telesa in omogočajo zelo učinkovito izmenjavo toplote. Uravnavanje upornosti žil, ki poteka prek vpliva na žilni tonus, v mi-krocirkulaciji kože še ni docela pojasnjeno. Žil-
no upornost uravnavajo tako centralni kot tudi lokalni mehanizmi, ki jim v zadnjem času pripisujejo vse večji pomen (3-6). Omenimo, da so uporovne žile pod toničnim vplivom vazokonstriktornega adrenergičnega nitja simpatičnega živčevja in da se njihova aktivnost z naraščanjem temperature jedra zmanjšuje, kar povzroči vazodilatacijo (2, 4, 5). Znanstveniki so si edini, da obstaja še aktivni vazodilatatorni nevrotransmiter (4, 5), vendar njegova vloga in narava še nista povsem pojasnjeni.
Pomembno vlogo pri lokalnem uravnavanju pretoka ima endotelij; iz njega se sproščajo vazokonstriktorji in vazodilatatorji in uravnoteženo razmerje med njimi je ključnega pomena za normalno uravnavanje žilnega tonusa in s tem pretoka (3-7). Najpomembnejša vazodilatatorja, ki se sproščata iz endotelija pod vplivom mehanskih in kemičnih dražljajev, sta dušikov oksid (NO) in prostaciklin (PGI2), pred nedavnim pa so odkrili še tretji zelo pomemben vazodilatator in ga, zaradi mehanizma njegovega delovanja, poimenovali 'endotelijski hiperpolarizirajoči dejavnik' (EDHF, iz angleščine 'endothe-lium-derived hyperpolarizing factor').
Endotelijski
hiperpolarizirajoči
dejavnik
V zadnjem desetletju so s številnimi raziskavami predvsem na živalskih žilah, v manjši meri pa tudi pri ljudeh, potrdili od endote-lija odvisno vazodilatacijo, do katere pride tudi po zaviranju dveh najbolj raziskanih endotelijskih vazodilatatorjev, NO in PGI2. Pokazali so tudi, da pride do vazodilatacije zaradi hiperpolarizacije v celicah gladkih mišic (GMC) žil, ki je najverjetneje posledica aktivacije od kalcija odvisnih kalijevih kanalov (KCa). Zaradi omenjenega so neznani vazodilatator poimenovali EDHF (8-11). Kasneje se je izkazalo, da najverjetneje ne gre za en sam mehanizem, kajti odgovori so bili močno odvisni tako od živalske vrste kot tudi od preiskovanega organa. Tako danes prevladuje mnenje, da obstaja več mehanizmov, ki se razlikujejo med žilami in so odvisni od velikosti in funkcije žil, prvotno poimenovanje EDHF pa je ostalo. Znanstveniki so si bolj ali manj enotni tudi v ugotovitvi, da je vloga EDHF najverjetneje bolj kot v prevodnih pomembna v uporovnih žilah in da je z manjšanjem premera žile njegov prispevek k od endotelija odvisni vazodilatacji vedno večji (9, 12, 13). Se vedno pa so si nasprotujoča mnenja o pomenu EDHF pri bolezenskih procesih. Nekatere raziskave so namreč potrdile, da naj bi EDHF prevzel glavno vlogo endotelijskega vazodilatatorja v stanjih, kjer je funkcija endotelija okrnjena zaradi zmanjšanega izločanja NO, kot so hiperten-zija (14, 15), hiperholesterolemija (16), sladkorna bolezen (17) ali popuščanje srca (18). Zanimivo pa je, da obstajajo tudi prav nasprotni dokazi, ki trdijo, da je endotelijska vazodi-latacija, ki je posledica delovanja EDHF, pri nekaterih bolezenskih procesih lahko tudi zmanjšana (19). Tudi narava EDHF oziroma njegova kemijska struktura še nista docela pojasnjeni. Zato bomo našteli le nekaj najbolj znanih ugotovitev, ki opisujejo EDHF (8-10).
Splošno veljavna načela opredeljujejo EDHF kot vazodilatatorni mehanizem, ki je odvisen od endotelija, ne vključuje NO ali vazodilatatornih prostanoidov (od katerih je najbolj raziskan PGI2) ter povzroči hiper-polarizacijo GMC tako, da aktivira kalijeve
kanale, najpogosteje iz podvrste KCa, kar privede do vazodilatacije. EDHF naj bi se sproščal iz endotelijskih celic (EC) pod vplivom delovanja mehanskih dražljajev, kot so pul-zirajoč tok krvi, napetost v žilni steni in striž-na sila, ki jo tok krvi izvaja na EC, ter kemijskih dražljajev, od katerih so zelo pomembni razni agonisti različnih receptorjev (acetilholin (ACh), bradikinin (BK), snov P, histamin, ade-nozin difosfat (ADP), endotelin). Vsi omenjeni dražljaji privedejo do zvišanja znotrajcelične koncentracije kalcija ([Ca2+]i) v EC, kar aktivira dva tipa KCa kanalov, namreč kanale nizke (SKCa, iz angleščine 'small conductance calcium-activated potassium channel') in srednje prevodnosti (IKCa, iz angleščine 'intermediate conductance calcium-activated potassium channel'). Aktivacija SKCa in IKCa povzroči hiperpolarizacijo EC, kar je prvi korak pri nastanku oziroma sproščanju EDHF. Dvig [Ca2+]i v EC pa ima za posledico tudi akti-vacijo številnih encimov v celici, ki naj bi bili domnevno vpleteni pri nastanku EDHF; najpomembnejši se zdi danes citokrom P450 (CYP). Morebitni EDHF nato difundira iz EC do GMC ali se, po nekaterih predpostavkah (8-10), prevede kot električni dražljaj do GMC preko mioendotelijskih presledkovnih stikov (angleško 'myoendothelial gap junctions'), kjer izzove že prej omenjeno hiperpolarizacijo GMC preko aktivacije KCa kanalov velike prevodnosti (BKCa, iz angleščine 'large conductance calcium-activated potassium channel'). Pri nekaterih žilah pa verjetno pride tudi do akti-vacije kalijevih kanalov podvrste Kir (iz angleščine 'inward rectifier') oziroma Na+-K+-ATPaze (8, 9, 20), kar tudi privede do hiperpolarizacije GMC. Posledica slednje je zaprtje napetostno odvisnih kalcijevih kanalov, kar zmanjša [Ca2+]i v GMC in povzroči vazodilatacijo. Ni še znano, ali naj bi imel EDHF tudi vpliv na občutljivost GMC na kalcij; občutljivost kon-traktilnega aparata za Ca2+ je namreč eden od mehanizmov, ki vplivajo na krčljivost GMC in s tem uravnavajo žilni tonus.
O kemijski naravi EDHF: EDHF in citokrom P450
Kot smo že omenili, se narava EDHF močno razlikuje med živalskimi vrstami in med tkivi. Po nekaterih hipotezah je EDHF lahko: derivat CYP, kalij, električni signal, ki se
preko mioendotelijskih presledkovnih stikov prevede od EC do GMC, vodikov peroksid (H2O2), C-natriuretični peptid (8-10). Omejili se bomo na predpostavko, da je EDHF morebitni derivat CYP, saj smo omenjeni mehanizem preučevali v naši raziskavi.
Po tej predpostavki pride zaradi zvišanja [Ca2+]i v EC kot posledice delovanja mehanskih in kemičnih dražljajev do translokacije fosfolipaze A iz citosola na celične membrane, kar povzroči sproščanje arahidonske kisline iz membranskih fosfolipidov (8-11, 21). Pod vplivom delovanja epoksigenaz (encimov, katerih aktivno sestavino predstavlja CYP) se arahidonska kislina razgradi na epoksiei-kozatrienoične kisline (EET), ki naj bi bile EDHF. EET naj bi difundirale iz EC do GMC in tam aktivirale že omenjene BK^a. Raziskovalci so omenjeni mehanizem razkrili bodisi z uporabo selektivnih zaviralcev CYP-epok-sigenaz, najpogosteje iz skupine CYP 2C, z analogi EET z antagonističnim delovanjem, s snovmi, ki povečajo ekspresijo CYP-epoksi-genaz in sicer predvsem na koronarnih in ledvičnih arterijah različnih vrst (10, 11, 21-23), morda je vpleten tudi pri regulaciji tonusa v žilah skeletnih mišic (24).
EDHF in raziskave na ljudeh
V	nasprotju s študijami na živalih je bilo na ljudeh narejenih razmeroma malo raziskav, ki bi skušale opredeliti vlogo in naravo EDHF (23), največ seveda na izoliranih žilah. Večina študij je nedvomno potrdila, da praktično v vseh raziskanih žilah obstaja nek mehanizem, ki privede do od endotelija odvisne vazodilatacije, ki ni odvisna od NO ali prostanoidov, medtem ko si izsledki raziskav možnih mehanizmov delovanja EDHF zelo nasprotujejo. Tako so od NO in PGI2 neodvisno vazodilatacijo potrdili na izoliranih prevodnih žilah, kot sta a. mammaria int. (14, 25, 26) in a. radialis (26), vendar pa so vpletenost CYP dokazali le v eni študiji (25).
V	ledvični interlobarni arteriji naj bi bili v mehanizem od NO in PGI2 neodvisne vazo-dilatacije vpleteni kalijevi ioni in aktivacija Na+-K+-ATPaze in ne CYP (20). Tudi v malih gastroepiploičnih žilah naj EDHF ne bi bil derivat CYP (13). Nesporni pa so dokazi o vpletenosti CYP pri aktivaciji BKCa kanalov na GMC v koronarnih arteriolah (22, 27). Zelo
nasprotujoči so si tudi podatki o vpletenosti CYP v izoliranih podkožnih malih uporovnih žilah (28-32). Medtem ko so Coats in sodelavci dokazali, da je ketokonazol, neselektivni zaviralec CYP, zmanjšal od NO in PGI2 neodvisno vazodilatacijo, ki jo je izzval ACh v podkožnih uporovnih žilah (29), pa v drugih študijah na podkožnih uporovnih žilah vpletenosti CYP niso dokazali (28, 31). Tudi K+ ioni naj ne bi bili EDHF v podkožnih uporovnih žilah (32), pri nosečnicah pa so pokazali, da naj bi EDHF v slednjih deloval preko mioendotelijskih presledkovnih stikov (30).
Tudi in vivo so pokazali, da od NO in PGI2 neodvisni mehanizem, ki ga lahko pripišemo delovanju EDHF, pomembno prispeva k endotelijski vazodilataciji, najverjetneje z delovanjem na KCa kanale (33-36). Izsledki raziskav, ki so skušale opredeliti kemijsko naravo EDHF, pa si nasprotujejo (18, 24, 36-40). Največkrat so za oceno pretokov skozi uporovne žile uporabljali vensko okluzij-sko pletizmografijo, ki vrednoti pretoke skozi uporovne žile v več tkivih naenkrat (koži in spodaj ležečih tkivih, skeletnih mišicah in maščevju) (35, 41), zaviralce eNOS in COX in endotelijske agoniste, kot sta ACh in BK, pa so v žile vnesli s perfuzijo brahialne arterije.
Zanimive so raziskave, kjer so poleg funkcije EDHF, ki naj bi bil presnovek CYP, dokazali tudi ekspresijo CYP 2C9 v EC preiskovanih žil (24, 25, 27). Nekatere raziskave so pokazale, da naj bi bila vloga EDHF pomembnejša pri boleznih (14, 15, 18, 37). Ob vseh navedenih podatkih je jasno, da vloga EDHF pri človeku še zdaleč ni znana.
EDHF in mikrocirkulacija kože
Vloga EDHF v mikrocirkulaciji kože ostaja nepojasnjena. V študijah, kjer so z uporabo laser Dopplerjeve (LD) metode in provokacij-skih testov, kot sta uporaba raznih endotelij-skih agonistov ali reaktivna hiperemija po popustitvi zažema arterije (PRH) (obe sta podrobneje opisani v metodah) ocenjevali pretoke in odzivnost v mikrocirkulaciji kože, so namreč raziskovali le prispevek bodisi NO bodisi prostaglandinov k od endotelija odvisni vazodilataciji. Rezultati si izrazito nasprotujejo (3, 6, 42-45). V spet drugih so vrednotili mehanizem vazodilatacije, ki jo izzove ACh; vazodilatacijo so delno pripisali od NO
in PGI2 neodvisnemu mehanizmu (46, 47). Spričo pomembne vloge, ki jo ima koža pri uravnavanju telesne temperature, je nujno potrebno poznati tudi lokalne mehanizme, kot je EDHF, pri uravnavanju pretokov v mi-krocirkulaciji. Izsledki pa so pomembni tudi s kliničnega vidika, saj je znano, da je pri številnih boleznih, kot je, denimo, sladkorna bolezen, močno okvarjena mikrocirkulacija kože (23, 48, 49). Razen tega je pretoke skozi kožo razmeroma enostavno meriti, saj metode niso invazivne; res pa je, da dobimo le posredno oceno. Obstajajo tudi domneve, da pretoki in odzivnost žil v koži odražajo funkcijo drugih žil, denimo uporovnih arteriol v srcu, in tako nudijo vpogled v stanje koronarnih žil (6, 41, 48, 50). Znano je, da je prispevek EDHF k uravnavanju žilnega tonusa večji v manjših uporovnih žilah (9,12,13) in prav zato je smotrno raziskati tudi njegov pomen v mikrocirkulaciji kože.
Namen
V naši raziskavi smo želeli osvetliti vlogo in pomen endotelijskega mehanizma, ki ni odvisen od NO in prostanoidov in ga lahko pripišemo delovanju EDHF, v mikrocirkula-ciji kože.
Želeli smo izmerili pretoke v mikrocirku-laciji kože v mirovanju ter oceniti odzivnost mikrocirkulacije na nekatere znane manevre, ki izzovejo od endotelija odvisno vazodilataci-jo. Nastanek NO in PGI2 smo zavrli s sočasnim dodatkom zaviralca endotelijske sintaze NO (eNOS) ter zaviralca ciklooksigenaze (COX). Od endotelija odvisno vazodilatacijo smo ocenjevali z uporabo endotelijskega agonista ACh ter z oceno reaktivne hiperemije po popusti-tvi arterijskega zažema (PRH). Istočasno smo ocenjevali še vpliv zaviranja eNOS in COX na od endotelija neodvisno vazodilatacijo, izzvano z natrijevim nitroprusidom (NaNP).
Ker naj bi bil v mehanizem nastanka EDHF v nekaterih odsekih žilja in v nekaterih tkivih vpleten CYP 2C9, nas je zanimalo, ali je temu tako tudi v koži. Zato smo zavrli delovanje CYP 2C9 in ob tem spremljali odzivnost mikrocirkulacije v koži po predhodnem zaviranju eNOS in COX.
Znano je, da je mikrocirkulacija kože prizadeta pri številnih boleznih in da lahko pogosto že pred pojavom kliničnih znakov zaz-
namo funkcionalne spremembe na nivoju endotelija, kot je porušeno razmerje med vazo-dilatatorji in vazokonstriktorji (48). Obstajajo domneve, da v takih stanjih EDHF prevzame ključno vlogo pri lokalnem uravnavanju mikrocirkulacije v okvarjenih organih. Prav zato je tudi s kliničnega vidika nujno spoznati vlogo EDHF v koži v fizioloških razmerah.
METODE Preiskovanci
V raziskavi je sodelovalo 14 zdravih preiskovancev, nekadilcev, starih od 20 do 37 let (povprečna starost 25,9 ±1,7 let), ki niso jemali nobenih zdravil in niso bili podvrženi tveganjem za nastanek srčno-žilnih bolezni. Zaradi možnih vplivov spolnih hormonov na meritve smo vključili le preiskovance moškega spola. Vsem smo izmerili normalen srednji arterijski tlak (89,9 ± 3,2 mmHg) in srčni utrip v mirovanju (68,9 ±2,9 utripov/minuto). Raziskavo je odobrila Komisija za medicinsko etiko pri Ministrstvu za zdravje Republike Slovenije. Preiskovanci so med meritvami ležali v sobi z nadzorovano temperaturo; pred izvajanjem meritev so 30 minut mirovali.
Laser Doplerjeva metoda
Pretoke v kožni mikrocirkulaciji smo merili na volarni strani podlakti z laser Dopplerje-vo (LD) metodo, katere princip je podrobneje opisan drugje (51, 52). Metoda omogoča semikvantitativno merjenje pretokov vmikro-cirkulaciji kože (51, 52). Temelji na odboju laserske svetlobe od premikajočih se eritrocitov v žilah, zaradi česar pride do Dopplerjevega učinka: spremeni se frekvenca upadle svetlobe. Končna vrednost pretoka je premosorazmer-na številu in hitrosti eritrocitov in jo izrazimo v arbitrarnih perfuzijskih enotah (PE). Za meritve smo uporabljali LD merilec pretoka (Periflux 4001 Master, Perimed, Švedska) z virom laserske svetlobe valovne dolžine 780 nm. Istočasno smo merili pretoke na dveh naključno izbranih mestih na podlak-ti. Sondi smo namestili na mesta, kjer ni bilo videti površinskih ven, približno 10 cm razmaknjeni eno od druge. Značilni zapis LD pretoka v mirovanju prikazuje slika 1A. Na obeh merilnih mestih smo istočasno merili
17
temperaturo kože z digitalnim termometrom (Peritemp PF4005, Perimed, Švedska). Ves čas poskusa smo preiskovancem merili tudi arterijski pritisk na digitalni arteriji sredinca (Finapress, Ohmeda 2300) ter standardni elektrokardiogram. Zajem podatkov je bil 500/sek. Analogne signale smo pretvorili v digitalno obliko s pomočjo analogno-digitalnega pretvornika ter jih shranili na osebni računalnik za kasnejšo obdelavo.
Intradermalna mikroinjekcija
Ker smo v raziskavi želeli ovrednotiti vpliv od NO in PGI2 neodvisnega mehanizma pri uravnavanju pretoka v kožni mikrocirkulaciji, smo morali zavreti delovanje eNOS in COX. V ta namen smo preiskovancem na merilna mesta, kjer smo bili predhodno izmerili LD pretoke v mirovanju, vbrizgali zaviralca: L-NMMA (Clinalfa, Merck-Biosciences, Darmstadt, Nemčija), ki je močan kompetitivni antagonist vseh izooblik NOS, ter diklofenak (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija), ki je eden najmočnejših zaviralcev COX. Vpletenost CYP 2C9 pa smo preiskovali tako, da smo njegovo delovanje zavrli z injekcijo sulfafena-zola (Clinalfa, Merck-Biosciences, Darmstadt, Nemčija), ki je specifični zaviralec CYP 2C9 (53). Raztopino, v kateri sta bila raztopljena oba zaviralca (končna konc. L-NMMA je bila 10 mM ter diklofenaka 10 mM, raztopljena v sterilizirani bidestilirani vodi), kot tudi raztopino sulfafenazola (10 mM), smo v kožo vnesli z metodo mikroinjekcije (45, 54, 55). Uporabili smo igle z volumnom 50 |jl (30 G, Hamilton, Bonaduz, Švica), s katerimi smo v kožo vnesli 10 jl raztopine. Za kontrolo smo po enakem protokolu vbrizgali fiziološko raztopino. Na mestu injekcije nastane manjši mehurček. Po injekciji smo na rob mehurčka, to je približno 5 mm od vbodnega mesta, namestili LD merilno sondo in spremljali LD pretok.
lontoforeza
Od endotelija odvisno vazodilatacijo smo ocenjevali z uporabo ACh, od endotelija neodvisno vazodilatacijo pa z uporabo NaNP; obe snovi smo v kožo vnesli z iontoforezo. To je neinvazivna metoda, ki preko napetostnega
polja, ki ga ustvarimo z zunanjim generatorjem toka, omogoča prenos polarnih snovi v kožo (6, 41, 51). Po iontoforezi ACh in NaNP pride do značilne vazodilatacije; učinek omenjenih dveh vazodilatatorjev traja več minut, kar lahko spremljamo z merjenjem LD pretokov (41, 51, 54, 56). Značilni zapis odziva LD pretoka na iontoforezo ACh prikazuje slika 1B, odgovor na NaNP pa slika 1C. Upora-biljali smo aparat Perilont (Perimed, Švedska). Blazinico na elektrodi smo prepojili s snovjo, ki smo jo želeli vnesti (ACh oziroma NaNP), ter elektrodo namestili na LD sondo, ki smo jo prilepili na merilno mesto na koži. Referenčno elektrodo smo nalepili 10 cm od LD sonde. Protokol iontoforeze ACh in NaNP smo povzeli po podatkih iz literature (6, 41, 51, 56). Za uporabo pozitivno nabitega ACh (1 % raztopina v sterilni bidestilirani vodi) smo raztopino nanesli na anodo ter vnesli sedem tokovnih sunkov velikosti 0,1 mA; en tokovni sunek je trajal 30 sekund, med posameznimi sunki pa je bilo 30 sekund premora. Raztopino negativno nabitega NaNP (1 % raztopina v sterilni bidestilirani vodi) smo nanesli na katodo in vnesli tri 30 sekund trajajoče tokovne sunke po 0,1 mA, ki jim je sledil 40 sekund trajajoči tokovni sunek velikosti 0,2 mA; med posameznimi sunki je bilo 90 sekund premora.
Reaktivna hiperemija po popustitvi zažema
Za vrednotenje PRH smo preiskovancem z manšeto za merjenje pritiska za tri minute zaželi brahialno arterijo nad sistolični tlak, tako da smo popolnoma prekinili pretok. Po popustitvi zažema pride do prehodnega povečanja pretoka, ki je pretežno lokalni pojav; govorimo lahko o miogeni in metabolični komponenti vazodilatacije. K slednji v veliki meri prispeva tudi endotelij. Metoda nudi zelo posreden vpogled v funkcijo endotelija, saj je znano, da so pri nastanku PRH poleg drugih lokalnih presnovkov udeleženi tudi endo-telijski vazodilatatorji (41-43, 56, 57), četudi njihov natančen doprinos in vloga še niso povsem pojasnjeni. LD pretoke smo spremljali na volarni strani podlakti pred, med in po zažemu. Značilni zapis LD odziva na popustitev zažema arterije kaže slika 1D.
Slika 1. Značilni zapis LD signala na volarni strani podlakti pri enem preiskovancu. A. vmirovanju (bazalni pretok), B. odgovor na ion-toforezo acetilholina (ACh), C. odgovor na iontoforezo natrijevega nitroprusida (NaNP), D. odgovor na popustitev triminutnega zaiema brahialne arterije. Puščice pri A. in B. prikazujejo tokovne sunke. Slika D.: tmaxLD - čas do največjega pretoka po popustitvi zaiema, tPRH - čas trajanja PRH. LD - laser Dopplerjev, PE - perfuzijske enote.
čas (min)
100 80 — 60 ~ 40
cn
20 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 D	čas (min)
t	iaxLD
	
	
	
zažem	
tPRH	
100 200 300 D popustitev zažema
400 500 600 700 800 čas(sek)
19
Potek poskusov
Protokol 1. Ovrednotiti vpliv zaviranja eNOS in COX na bazalni LD pretok.
Vsak preiskovanec je na dve ločeni mesti na podlakti prejel injekcijo (10 jl), in sicer:
1.	raztopino L-NMMA (10 mM končna konc. v raztopini) in diklofenaka (10 mM končna konc. v raztopini) ter
2.	fiziološko raztopino kot kontrolno raztopino.
Nato smo nad mesta injekcije namestili merilne LD sonde, kot je opisano zgoraj, in neprekinjeno spremljali LD pretoke še 50 minut.
Protokol 2. Ovrednotiti vpliv zaviranja eNOS in COX na z ACh izzvano vazodilatacijo.
Vsakemu preiskovancu smo na dve ločeni mesti na podlakti vbrizgali:
1.	10 jl raztopine L-NMMA (10mM končna konc. v raztopini) in diklofenaka (10 mM končna konc. v raztopini) ter
2.	10 jl fiziološke raztopine.
Po 30 minutah smo tri minute merili bazalni LD pretok, to je pretok v mirovanju, nato pa smo izvedli iontoforezo ACh, kot je opisano zgoraj, ter med tem ves čas merili LD pretoke. Po podatkih iz literature in naših
20
pilotskih poskusih se je namreč izkazalo, da je učinek L-NMMA in diklofenaka največji od 30 do 40 minut po vnosu (45, 55, 58).
Protokol 3. Ovrednotiti vpliv zaviranja eNOS in COX na z NaNP izzvano vazodilatacijo. Protokol je bil enak kot protokol 2, le da smo namesto ACh z iontoforezo v kožo vnesli NaNP, kot je opisano v metodah.
Protokol 4. Ovrednotiti vpliv zaviranja eNOS in COX na PRH.
30 minut po injekciji 10 |jl L-NMMA in diklofenaka oziroma fiziološke raztopine (glej zgoraj) smo preiskovancu najprej izmerili bazalni LDF, nato pa smo mu zaželi brahial-no arterijo za tri minute. Po popustitvi zažema smo spremljali LD pretok tako dolgo, da se je vrnil na izhodiščno, bazalno vrednost.
Protokol 5. Ovrednotiti vpliv sulfafenazola na bazalni LD pretok in na z ACh izzvano vazodi-latacijo.
V tem protokolu so preiskovanci na isto merilno mesto dobili dve injekciji. Najprej:
1.	10 jl raztopine L-NMMA in diklofenaka ter
2.	10 jl fiziološke raztopine.
Po 15 minutah pa smo na isti mesti v kožo inji-cirali še 10 jl raztopine sulfafenazola (10mM). Po 15 minutah (čas največjega učinka sulfafenazola (37, 39)) smo na vseh treh mestih izmerili bazalni LD pretok, nato pa izvedli ion-toforezo ACh, kot je opisano. Enake poskuse smo pri šestih preiskovancih opravili tudi z različnimi koncentracijami sulfafenazola.
Protokol 6. Ovrednotiti vpliv sulfafenazola na PRH.
Protokol vbrizgavanja raztopine zaviralcev (L-NMMA in diklofenaka oziroma sulfafenazola) je bil enak kot v protokolu 5. Po enakem času, kot je opisano v protokolu 5, smo preiskovancem zaželi brahialno arterijo za tri minute ter nato popustili zažem in snemali LD pretoke tako dolgo, dokler se niso vrnili na izhodiščno vrednost.
Zajem in statistična obdelava podatkov
Digitalne signale LD pretokov smo analizirali z računalniškim paketom 'LDDA acqusition system' (Neurocard™ LDDA, Meditronic, Nemčija). Pretok v mirovanju (bazalni pretok) smo
izrazili kot povprečno vrednost meritev v tri-minutnem posnetku. Odgovor LD pretoka na iontoforezo ACh oziroma NaNP smo določili kot srednjo vrednost meritev triminutnega posnetka po tem, ko je LD pretok dosegel največjo vrednost (plato). Za PRH smo določili največji pretok po popustitvi zažema (LDmax), čas, ki je potreben, da LDF doseže svojo največjo vrednost (tmaxLD), čas trajanja PRH (tPRH), to je čas, ki je potreben, da LD pretok doseže svojo izhodiščno vrednost, ter površino pod krivuljo PRH (PPK). Največje vrednosti LD pretokov smo izrazili kot odstotek bazalnega LD pretoka za vsakega preiskovanca. Rezultati so podani kot srednje vrednosti in standardne napake srednjih vrednosti. Odzive LD pretoka na opisane provokacijske teste smo vrednotili z analizo variance za ponavljajoče se meritve (ANOVA). Vpliv snovi na odzivnost kožne mikrocirkulacije smo vrednotili z uporabo parnega Studentovega t-testa. Merilo za statistično značilno razliko med obravnavano in kontrolno skupino je bila vrednost p, manjša od 0,05.
Tabela 1. Vrednosti nekaterih hemodinamskih spremenljivk vmi-rovanju.
Spremenljivka	X±SN
LDPb„z„l„i <PE>	7,6 ±1,8
U (°C>	33,2 ± 0,4
psist (mm Hg)	133,7 ±5,1
Pta (mm Hg)	84,9 ± 3,5
Prikazane so srednje vrednosti± napake srednjih vrednosti (X±SN), n = 14. LDPbaza|ni — laser Dopplerjev pretok v mirovanju, PE- perluzijske enote, Tkože - temperatura kože, psist - sistolični arterijski pritisk na digitalni arteriji sredinca, pdiast- diastolični arterijski pritisk na digitalni arteriji sredinca.
REZULTATI
V tabeli 1 so prikazane vrednosti LD pretokov v mirovanju, temperature kože in arterijskega tlaka v digitalni arteriji sredinca. Po vsakršni mikroinjekciji je prišlo do lokalnega odziva: dviga LD pretoka ter seveda temperature. Znano je, da mikroinjekcija v tkivu povzroči mikrotravmo (54, 55), ki pa je kratkotrajne narave. LD pretok se je do vseh
naslednjih izvajanj (tj. približno 20 minut po injekciji) in meritev že vrnil na izhodiščno vrednost. Mesta, kjer je bil pretok po tem času še bistveno povečan, smo izločili iz nadaljnje obdelave. Nobena od opisanih provokacij ni imela sistemskih učinkov, le pri nekaterih preiskovancih sta se prehodno povečala frekvenca utripa srca in arterijski pritisk, kar je bila najverjetneje posledica aktivacije simpa-tika zaradi strahu.
Vpliv sočasnega zaviranja eNOS in COX na bazalne LD pretoke ter na od endotelija odvisno in od endotelija neodvisno vazodilatacijo
Delovanje eNOS in COX smo sočasno zavrli tako, da smo v kožo vbrizgali raztopino L-NMMA (10 mM) in diklofenaka (10mM); za kontrolo smo na neodvisno merilno mesto na koži vbrizgali fiziološko raztopino. Po 30 minutah smo izmerili LD pretok v mirovanju ter izvedli iontoforezo ACh za ovrednotenje od endotelija odvisne vazodilatacije ter iontofo-rezo NaNP za ovrednotenje od endotelija neodvisne vazodilatacije.
LD pretok v mirovanju se ni značilno razlikoval (p = 0,24, t-test) med merilnimi mesti, kamor smo bili vbrizgali raztopino L-NMMA in diklofenaka (LD pretok je bil 12,5 ± 2,3 PE na obravnavanem (tretiranem) mestu in 10,9 ± 1,8 PE na kontrolnem mestu), in kontrolnimi mesti (fiziološka raztopina).
ACh je na obeh merilnih mestih, tako obravnavanem (z raztopino L-NMMA in diklofenaka) kot tudi na kontrolnem (fiziološka raztopina), povzročil značilno povečanje pretoka (ANOVA, p < 0,001, sliki 1B in 2). Povečanje pretoka je bilo na mestih, kamor smo bili predhodno injicirali zaviralca eNOS in COX, značilno manjše (t-test, p < 0,05) kot na kontrolnih mestih (sliki 2 in 3A). Največji pretok po iontoforezi je na kontrolnih mestih narasel na 643 ± 86 % bazalnega pretoka ter na obravnavanih mestih na 390 ± 56 % bazalnega pretoka. L-NMMA in diklofenak sta za približno 30 % zavrla dvig LD pretoka po uporabi ACh.
Tudi po iontoforezi NaNP je prišlo do značilno povečanega LD pretoka (ANOVA, p < 0,001, sliki 1C in 3B) na obeh merilnih mestih. Pri tem pa nismo zasledili značilnih
~as (min)
-0- fiziolo{ka raztopina	♦ L-NMMA + diklofenak
Slika 2. Vpliv zaviranja eNOS in COX na bazalni LD pretok in na zACh izzvano vazodilatacijo. Prikazuje Časovni potek pretoka pred in po iontoforezi ACh. LD, laser Dopplerjev, PE perfuzijske enote. Odprti simboli, kontrola (mikroinjekcija fiziološke raztopine), zaprti simboli, mikroinjekcija L-NMMA in diklofenaka. Prikazane so srednje vrednosti±napake srednjih vrednosti. n = 12, *, p<0,05.
100 g 75
O
~ 50
cm
25 0
I I fiziolo{ka razt.	L-NMMA + diklofenak
I
bazalni	acetilholin
*
100
g 75 tok
et
50 25 0
I fiziolo{ka razt.	L-NMMA + diklofenak
m
bazalni	Na-nitroprusid
Slika 3. Primerjava odgovora LD pretokov na od endotelija odvisno (iontoforeza ACh) in od endotelija neodvisno (iontoforeza NaNP) vazodilatacijo pod vplivom zaviralcev eNOS in COX. Prikazane so vrednosti bazalnih pretokov in največjih pretokov po iontoforezi: A. ACh in B. NaNP. LD - laser Dopplerjev, PE - perfuzijske enote. Odprti stolpci - kontrola (mikroinjekcija fiziološke raztopine), zaprti stolpci-mikroinjekcija L-NMMA in diklofenaka. Prikazane so srednje vrednosti±napake srednjih vrednosti. n = 12, *, p<0,05 (kontrola proti L-NMMA + diklofenak).
22
razlik med merilnima mestoma (obravnavanim in kontrolnim): pretok je na kontrolnih mestih narasel na 768 ± 70 % bazalnega pretoka ter na obravnavanih mestih na 733 ± 54 % (slika 3B).
Vpliv sočasnega zaviranja eNOS in COX na LD pretoke po popustitvi arterijskega zažema
Z zažemom in popustitvijo zažema smo vrednotili vpliv zaviranja eNOS in COX na reaktivno hiperemijo. Po popustitvi zažema je prišlo do prehodno značilnega povečanja LD pretoka (slika 1D) na obravnavanih in kontrolnih mestih. Vrednosti največjega pretoka po popustitvi zažema (LDmax), časa, ki je potreben, da LD pretok doseže svojo največjo vrednost (tmaxLD), ter časa trajanja PRH (tPRH) se sicer niso statistično razlikovale med obravnavanim (z L-NMMA in diklofenakom) in kontrolnim mestom (fiziološka raztopina), vendar pa so bile p vrednosti zelo blizu statistično značilnim (t-test). Omenjene vrednosti prikazuje tabela 2. Ugotovili pa smo, da je bila površina pod krivuljo PRH (PPK) značilno manjša na mestih, kamor smo bili predhodno vbriz-
gali zaviralca eNOS in COX (slika 4, t-test, p <0,05).
Vpliv zaviranja CYP 2C9 na bazalne LD pretoke ter na odzivnost mikrocirkulacije kože
Želeli smo ovrednotiti, ali je v mehanizem, ki uravnava pretok v mikrocirkulaciji kože in ni odvisen od NO in PGI2, morda vpleten CYP 2C9. V ta namen smo na obravnavana mesta, kamor smo bili predhodno injicirali L-NMMA in diklofenak, kot tudi na kontrolna mesta (injekcija fiziološke raztopine) v kožo injicirali sulfafenazol različnih koncentracij ter izmerili bazalne LD pretoke. Odzivnost kožne mikrocirkulacije pa smo vrednotili tako, da smo izvedli iontoforezo ACh oziroma zažem brahialne arterije.
Izkazalo se je, da sulfafenazol nima vpliva na bazalne pretoke, saj se vrednosti LD pretokov med vsemi štirimi merilnimi mesti niso razlikovale, kar je razvidno iz tabele 3. Prav tako ni bilo razlik med največjimi LD pretoki po iontoforezi ACh (prikazano na sliki 5), kot tudi med parametri PRH med posameznimi merilnimi mesti. V tabeli 4 so prikazane vrednosti PPK; ostali rezultati niso prikazani.
Tabela 2. Odziv laser Dopplerjevih pretokov na popustitev triminutnega zažema brahialne arterije: vpliv zaviranja eNOS (z L-NMMA) in COX (z diklofenakom).
Spremenljivka	Kontrola	L-NMMA + diklofenak	P
LDPbazalni <PE>	11,2 ±1,5	9,9 ± 0,5	0,42
LDL* <PE>	51,9± 5,4	42,3 ± 4,9	0,06
Ud (sek)	7,3 ± 0,9	8,9 ±1,2	0,09
tPRH (sek)	63,9 ± 7,9	51,4±10,5	0,26
PPK (PExsek)	1252± 186	985,4 ±202	0,02
Prikazane so srednje vrednosti± napake srednjih vrednosti, n = 10. LDPbazalni - laser Dopplerjev pretok v mirovanju, LDP - največji laser Dopplerjev pretok po popustitvi zažema, PE - perfuzijske enote, t LD - čas po popustitvi zažema, v katerem LD pretok doseže največjo vrednost, tpRH - čas trajanja hiperemije po popustitvi zažema, sek- sekunde, PPK — površina pod krivuljo hiperemije. p- verjetnost za napako pri zavrnitvi ničelne hipoteze pri 95% intervalu zaupanja.
1500
1000
500
	
	
kontrola	LNAdiklo
0
Slika 4. Vpliv zaviranja eNOS in COX na ploščino pod krivuljo (PPK) hiperemije po popustitvi zažema. Odprti stolpci, kontrola (mikro-
injekcija fiziološke raztopine), zaprti stolpci, mikroinjekcija _
L-NMMA in diklofenaka (LNAdiklo). Prikazane so srednje vred- 23 nosti±napakesrednjih vrednosti. n = 10, *, p<0,05.
Tabela 3. Vplivsulfafenazola, zaviralca CYP 2C9, na laser Dopplerjeve pretoke vmirovanju, brez in vprisotnosti sočasnega zaviranja eNOS in COX.
Kontrola	L-NMMA +	Sulfafenazol	L-NMMA +
	Diklofenak		diklofenak +
			sulfafenazol
LDPbazalni (PE) 11,6±3,0	8,7 ±1,5	14,9 ± 3,4	13,2 ± 3,3
Prikazane so srednje vrednosti± napake srednjih vrednosti. n = 12. LDPbazalni - laser Dopplerjev pretok v mirovanju, PE - perfuzijske enote
800
'e 600 —
400 —
200 —


kontrola sulfa LNAdiklo LNAdiklosulfa
*
*
Slika 5. Vpliv sulfafenazola, selektivnega zaviralca CYP 2C9, na zACh izzvano vazodilatacijo brez in vprisotnosti zaviralcev eNOS (L-NMMA) in COX (diklofenaka). Največji pretok je prikazan kot % pretoka v mirovanju. Prikazane so srednje vrednosti± napake srednjih vrednosti. n = 12, *, p<0,05 (kontrola proti LNAdiklo in sulfa proti LNAdiklosulfa). Kontrola, fiziološka raztopina, sulfa, sulfafenazol, LNAdiklo, L-NMMA + diklofenak, LNAdiklosulfa, L-NMMA + diklofenak + sulfafenazol, LD - laser Dopplerjev.
Tabela 4. Vpliv sulfafenazola na ploščino pod krivuljo (PPK) reaktivne hiperemije po popustitvi zaiema, brez in v prisotnosti sočasnega zaviranja eNOS (z L-NMMA) in COX (z diklofenakom).
	Kontrola	L-NMMA +	Sulfafenazol	L-NMMA +
		Diklofenak		diklofenak +
				sulfafenazol
PPK (PExsek)	1252± 186	985±202*	1491 ±333	1005 ± 196*
Prikazane so srednje vrednosti±napake srednjih vrednosti. n = 10. PPK, ploščina pod krivuljo hiperemije po popustitvi zažema brahialne arterije, PExsek, perfuzijske enote krat sekunde. *, p<0,05 (kontrola proti L-NMMA + diklofenak in sulfafenazol proti L-NMMA + diklofenak + sulfafenazol).
24
Tudi višje koncentracije sulfafenazola (do nasičenja raztopine) niso imele vpliva na katerokoli zgoraj omenjeno merjeno spremenljivko (rezultati niso prikazani).
RAZPRAVLJANJE
V naši raziskavi smo pokazali, da zavrtje delovanja eNOS in COX ne vpliva na bazalne LD pretoke v mikrocirkulaciji kože, povzroči pa značilno zmanjšanje z ACh izzvane vazo-dilatacije; še vedno pa je ohranjeno 70% vazodilatacije. Tudi kazalci PRH se po zaviranju eNOS in COX značilno ne spremenijo, razen značilnega zmanjšanja PPK. Rezultati nakazujejo, da ima mehanizem, ki ni odvisen od NO in prostanoidov in ga potencialno pripišemo delovanju EDHF, pomembno vlogo pri uravnavanju mikrocirkulacije v koži. Morebitni EDHF v mikrožilju kože najverjetneje ni derivat CYP 2C9, saj sulfafenazol, ki je selektivni zaviralec CYP 2C9, ni imel vpliva na bazalne LD pretoke ter na odzivnost mikro-žilja po dodatku ACh ali zažemu brahialne arterije, tako brez kot tudi v prisotnosti zaviralcev eNOS in COX.
Preden nadaljujemo z razpravo, velja še enkrat poudariti, da rezultati nudijo le posredno oceno o EDHF, saj bi morali za neposredno potrditev obstoja EDHF poleg zaviranja delovanja ostalih znanih endotelijskih vazodi-latatorjev dokazati še hiperpolarizacijo GMC ali vsaj zavreti možne tarče delovanja EDHF (KCa-kanale) (8-10). Vse omenjeno pa je v in vivo poskusih na ljudeh praktično neizvedljivo, zato se naša tovrstna opažanja lahko opirajo zgolj na izsledke poskusov, narejenih na živalskih modelih. Vsekakor je to omejitev, zato se zavedamo, da so razglabljanja o možnem EDHF zgolj predpostavke.
Zaviranje eNOS in COX ne vpliva na bazalne LD pretoke
Pokazali smo, da sočasno zaviranje eNOS in COX ne vpliva na bazalni LD pretok. Omenjeni izsledki so v nasprotju z večino raziskav (omejili se bomo na raziskave na ljudeh), ki so bile opravljene in vivo na podlakti in so v veliki večini pokazale zmanjšanje bazalnega pretoka po zavrtju delovanja eNOS in COX (24, 33, 38, 39). Nasprotno pa so v raziskavi, opravljeni na bolnikih s kroničnim popuščanjem srca, ugotovili, da zaviranje eNOS in COX ne vpliva na pretoke v mirovanju (18). Vendar pa je neposredna primerjava naše študije z omenjenimi vprašljiva, saj so pretoke v mikrocirkulaciji merili s pletiz-mografsko metodo, ki ne omogoča vpogleda zgolj v mikrocirkulacijo kože. Meri namreč pretoke skozi uporovne žile tako v koži kot v globlje ležečih tkivih, najpogosteje maščevju in skeletnih mišicah (35, 41); znano pa je, da se vpliv EDHF zelo razlikuje med različnimi tkivi (9, 34, 35). Primerljivih študij, narejenih na koži, je zelo malo; z uporabo LD metode za oceno pretokov v mikrocirkulaciji kože so preučevali le vpliv bodisi NO bodisi prostanoidov, tudi rezultati si zelo nasprotujejo (3, 6, 42-45). Le v dveh raziskavah so, četudi z drugima zaviralcema kot v naši študiji in z drugačno metodo aplikacije, istočasno zavrli delovanje eNOS in COX in pokazali, da se pri tem bazalni LD pretok ni spremenil (46, 47).
Ob predpostavki, da zavrtje delovanja NO in PGI2 razkrije delovanje EDHF, lahko sklepamo, da EDHF pomembno prispeva k nadzoru žilnega tonusa v mirovanju. Znano je, da je pomemben dražljaj za sproščanje EDHF iz endotelija strižna sila (7), torej lahko predpo-
stavimo, da je slednja že v mirovanju dovolj velika, da povzroči sproščanje EDHF (zadosten dvig [Ca2+] v EC). Po drugi strani pa so ugotovili, da je lahko vloga EDHF precenjena, če zavremo delovanje eNOS in COX, kajti pokazali so, da pride hitro do kompenzatorne-ga povečanja ostalih vazodilatatorjev (9,35). V več raziskavah so pokazali tudi, da endo-telijski vazodilatatorji medsebojno vplivajo drug na drugega. NO naj bi zaviral delovanje EDHF (59, 60); šele ko zavremo delovanje NO, naj bi se 'razkrila' od EDHF odvisna vazo-dilatacija. Zato v mnogih študijah govorijo o EDHF kot o 'nadomestnem' (v angleščini 'back-up') vazodilatatorju, ki pride do izraza ob zmanjšanem delovanju ostalih vazodila-tatorjev, denimo NO (9,10,18, 59, 60). Stem mehanizmom lahko tudi razložimo pomemben pomen EDHF pri bolezenskih stanjih, kjer je zaradi zmanjšane funkcije endotelija zmanjšano izločanje NO in v tem primeru EDHF omogoča vazodilatatoren odziv. Seveda bi bila ena od možnih razlag, zakaj ni prišlo do zmanjšanja pretoka po zaviranju eNOS in COX, tudi ta, da zaviranje ni bilo popolno. Ta razlaga se zdi manj verjetna, kajti tudi če smo zvišali koncentracijo zaviralcev, nismo opazili učinka na bazalni LD pretok. Se več: zaviranje eNOS in COX je povzročilo zmanjšanje od ACh odvisne vazodilatacije. ACh poveča pretok, kar seveda zaradi hitrejšega izplavljanja povzroči razredčitev snovi na mestu delovanja, torej bi prej pričakovali vpliv zaviralcev eNOS in COX na bazalni LD pretok kot na z ACh izzvano vazodila-tacijo.
Zaviranje eNOS in COX ne prepre~i od endotelija odvisne vazodilatacije
Od endotelija odvisno vazo dilatacij o smo ocenjevali z iontoforezo ACh, od endotelija neodvisno pa z iontoforezo NaNP. Ugotovili smo, da je bila z ACh izzvana vazodilatacija po zaviranju eNOS in COX značilno zmanjšana, ne pa zavrta, saj je še vedno dosegla skoraj 70 % maksimalne vazodilatacije. Nasprotno pa zaviranje eNOS in COX ni vplivalo na od endotelija neodvisno vazodilatacijo, izzvano z NaNP. V večini raziskav so prav tako
pokazali, da je vazodilatacija po zaviranju eNOS in COX ohranjena, četudi zmanjšana (18, 33-35, 37, 39). Kot smo že omenili, pa so za oceno pretokov uporabljali pletizmografsko metodo, zato primerjava ni povsem na mestu. Edini dve raziskavi, ki so ju naredili na koži in s katerima so raziskovali mehanizem delovanja ACh na endotelij, sta prav tako pokazali zmanjšanje od ACh odvisne vazodilatacije ob istočasnem zaviranju eNOS in COX (46, 47). V omenjenih dveh študijah pa niso vrednotili od endotelija neodvisne vazodilatacije, razen tega so za uporabo zaviralcev in ACh uporabljali mikrodializo, ki je bolj invazivna od mikroinjekcije, kot zaviralec eNOS pa so uporabili L-NAME (metilni ester L-nitro arginina). Četudi je slednji močnejši zaviralec eNOS (58), pa se zdi uporaba L-NMMA bolj utemeljena, saj naj bi imel L-NAME tudi antiholinergični učinek, kar seveda lahko vpliva na delovanje ACh (61). V mnogih študijah so za oceno od NO in PGI2 neodvisnega mehanizma od endotelija odvisne vazodila-tacije raje kot ACh uporabljali BK (15, 33, 39). ACh naj bi, za razliko od BK, namreč v večji meri deloval na eNOS kot na ostale vazodi-latatorne sisteme (34, 35). Vendar pa so v drugih raziskavah, opravljenih na ljudeh in vivo, dokazali z ACh odvisno vazodilatacijo, ki je bila prisotna tudi po zavrtju delovanja NOS in COX, ter jo pripisali EDHF (18, 35, 37, 40). Poleg tega je ACh za uporabo s pomočjo iontoforeze neprimerno bolj uporaben kot BK (41, 56), saj je po uporabi BK variabilnost zelo velika; Newton (41) je pokazal celo 70 % koeficient variabilnosti po iontofo-rezi BK. Na izoliranih podkožnih (subkutanih) uporovnih arterijah, ki so jih tretirali z zaviralci eNOS in COX, so celo pokazali, da ACh privede do hiperpolarizacije (28). Zanimiva je tudi raziskava na enakih žilah, ki je pokazala, da kombinacija apamina (zaviralec SKCa) in karibdotoksina (zaviralec IKCa in BKCa) popolnoma zavre z ACh izzvano, od NO in PGI2 neodvisno vazodilatacijo (29, 32), kar kaže na vlogo K^a kanalov in morebitni EDHF v podkožnih žilah. Če se opiramo na izsledke omenjenih raziskav, lahko z ACh izzvano vazodilatacijo v naši študiji, do katere pride tudi po zaviranju eNOS in COX, pripišemo delovanju EDHF. Ker pa je znano, da so vplivi endotelijskih vazodilatatorjev (NO,
25
26
PGI2 in EDHF) na mikrocirkulacijo in njihove medsebojne interakcije močno odvisni od uporabljenega agonista (34, 35, 41), rezultatov ne smemo posplošiti. Za osvetlitev prispevka EDHF k aktivni vazodilataciji v koži so vsekakor potrebne dodatne raziskave z uporabo drugih agonistov.
Vpliv zaviranja eNOS in COX na PRH
Kot eno od mer za oceno endotelijske funkcije smo uporabili hiperemijo po popustitvi zažema. Test PRH zelo posredno simulira delovanje strižne sile, saj po popustitvi zaže-ma pretok močno naraste zaradi delovanja metaboličnih mediatorjev, ki so se nakopičili vtkivu zaradi hipoksije (41, 43, 56, 57); prav strižna sila pa je znani dražljaj za izločanje endotelijskih vazodilatatorjev, torej tudi EDHF. Rezultati so pokazali, da zaviranje eNOS in COX ni vplivalo na največji pretok po popustitvi zažema, niti na čas, ki preteče, preden LD pretok doseže svojo največjo vrednost (tmaxLD), niti na čas trajanja PRH. V nasprotju z ostalimi kazalci pa je bila značilno manjša površina pod krivuljo PRH. Zmanjšanje PRH kaže, da je dejansko prišlo do zavrtja delovanja COX in eNOS, kar lahko potrdi ustreznost naše metode (intradermalna mikroinjekci-ja zaviralcev). Na podlagi rezultatov lahko sklepamo, da so pri mehanizmu nastanka hiperemije po popustitvi zažema prispevki drugih vazodilatatorjev pomembnejši kot NO in PGI2. To je lahko denimo EDHF, seveda pa gre tu še za množico metaboličnih dejavnikov, ki se iz endotelija sproščajo zaradi hipoksije. V literaturi ne zasledimo podatkov o podobnih raziskavah na koži, saj so ločeno vrednotili le vplive samo NO ali samo prostanoi-dov na PRH; rezultati so si spet zelo nasprotujoči (41-43, 56, 57). V in vivo pogojih vmirovanju je na ljudeh praktično nemogoče uporabiti kakšen drug test, ki bi vrednotil zgolj vplive strižne sile na endotelij; alternativa je seveda telesna aktivnost, med katero pa je težko meriti LD pretoke. Razen tega je znano, da se razmere nadzora žilnega tonusa med telesno aktivnostjo bistveno spremenijo (2, 4).
Karakterizacija od NO in PGI2 neodvisne vazodilatacije: EDHF ni produkt citokroma P450 2C9
Želeli smo tudi opredeliti naravo EDHF: zanimalo nas je, ali je v 'od NO in prostanoidov neodvisni' mehanizem vpleten CYP 2C9. Izkazalo se je, da sulfafenazol, ki je selektivni zaviralec CYP 2C9, ne vpliva niti na bazalne LD pretoke niti na odzivnost mikrožilja po dodatku ACh ali zažemu brahialne arterije, kar kaže na to, da morebitni EDHF v mikro-žilju kože najverjetneje ni derivat CYP 2C9. Za selektivni zaviralec CYP 2C9 (53) smo se odločili zato, ker so na mnogih žilah živali in človeka dokazali prav vpletenost te izooblike CYP pri nastanku odgovora, ki ga posreduje EDHF (9,11, 23, 37, 39). Razen tega so pokazali, da manj selektivni zaviralci CYP delujejo tudi na KCa kanale na celičnih membranah, ki so domnevno končna tarča delovanja EDHF, ter celo vplivajo na [Ca2+]i v EC, kar je ključen proces pri nastanku EDHF (9, 62). Vse omenjeno seveda močno omaje relevantnost študij, kjer so uporabljali izoformno nespecifične zaviralce CYP (29, 36, 38), in tudi ne dopušča primerjave z našo študijo. Samo v treh in vivo raziskavah na uporovnih žilah, kjer so merili pretoke s pletizmografsko metodo, so kot zaviralec CYP uporabljali sul-fafenazol (24, 39, 40). Rezultati naše študije so skladni z omenjenimi študijami, kjer pri zdravih preiskovancih prav tako niso dokazali vpletenosti CYP 2C9 pri nastanku EDHF. Nasprotno pa so pri bolnikih z esencialno hipertenzijo Taddei in sodelavci pokazali, da sulfafenazol zmanjša od NO in PGI2 neodvisno vazodilatacijo (40), kar kaže na vpletenost CYP 2C9 pri bolezenskih procesih in je skladno s predpostavko, da naj bi bil EDHF kompen-zatorni vazodilatator v stanjih, ko je vloga NO okrnjena. Zanimiva je tudi študija Hilliga in sodelavcev, ki so pokazali vpletenost CYP 2C9 izozoblike pri hiperemiji v mikrocirkulaciji skeletnih mišic med telesno vadbo (24). Prav tako so z uporabo sulfafenazola dokazali pomembno vpletenost CYP 2C9 pri vazodi-latatornem odgovoru večjih prevodnih žil (37, 63). Vse omenjeno tako lahko potrjuje predpostavko o različni identiteti EDHF med tkivi in odseki žilja (uporovne in prevodne
žile) kot tudi med fiziološkimi procesi (mirovanje in telesna aktivnost).
Seveda pa ne moremo povsem izključiti možnosti, da sulfafenazol ni docela zavrl delovanja CYP, četudi višje koncentracije sul-fafenazola (do nasičene raztopine) prav tako niso vplivale na rezultat. Uporabnost naše študije je tako omejena zaradi metode, s katero smo v kožo vnesli snovi: tako sulfafenazol kot tudi L-NMMA in diklofenak. Mikroinjekcija namreč ne omogoča merjenja koncentracije snovi in situ. Tako ne vemo, kakšna je bila koncentracija sulfafenazola v tkivu in kako hitro se je izplavljal. To pa je tudi pomislek pri vseh metodah, ki skušajo in vivo oceniti stanje mikrocirkulacije kože, saj ni metode, ki bi omogočala neposredno in situ merjenje snovi.
ZAKLJUČEK
Na podlagi rezultatov naše študije lahko zaključimo, da ima endotelijski vazodilatatorni mehanizem, ki ni odvisen od NO in prosta-noidov in ga potencialno lahko pripišemo delovanju EDHF, pomembno vlogo pri nadzoru in uravnavanju mikrocirkulacije v koži, tako v mirovanju kot tudi v stanjih povečanega pretoka. EDHF v koži najverjetneje ni derivat CYP 2C9, kar potrjuje domnevo o več identitetah EDHF v različnih tkivih. Potrebne so temeljite nadaljnje raziskave tako na zdravih kot tudi na bolnih preiskovancih, ki bodo bolje osvetlile pomen EDHF pri človeku, nedvomno pa njegova vloga še zdaleč ni zanemarljiva.
LITERATURA
1.	Roddie IC. Circulation to skin and adipose tissue. In: Shepherd JT, Geiger SR, eds. Handbook of Physiolohy. The Cardiovascular System-Peripheral Circulation and Organ Blood Flow. Bethesda: American physiology society; 1983. p. 285-309.
2.	Rowell LB. Human Cardiovascular Control. New York, Oxford: Oxfor University Press; 1993.
3.	Coffman JD. Effects of Endothelium-derived Nitric Oxide on Skin and Digital Blood Flow in Humans. Am J Physiol
Heart Circ Physiol 1994; 267 (36): H2087-90.	_
4.	Johnson JM. Physical Training and the Control of Skin Blood Flow. Med Sci Sports Exerc 1998; 30 (3): 382-6. 27
5.	Kellogg DL Jr. In Vivo Mechanisms of Cutaneous Vasodilation And Vasoconstriction In Humans During Thermoregulatory Challenges. J Appl Physiol 2006; 100 (5): 1709-18. Review.
6.	Khan F, Davidson NC, Littleford RC, et al. Cutaneous Vascular Responses to Acetylcholine are Mediated by a Pro-stanoid-dependent Mechanism in Man. Vasc Med 1997; 2: 82-6.
7.	Busse R, Fleming I. Regulation of Endothelium-derived Vasoactive Autacoid Production by Hemodynamic Forces. Trends Pharmacol Sci 2003; 24 (1): 24-9. Review.
8.	Busse R. Edwards G, Félétou M, et al. EDHF: Bringing the Concepts Together. Trends Pharmacol Sci 2002; 23 (8): 374-80. Review.
9.	de Wit C, Wölfle SE. EDHF and Gap Junctions: Important Regulators of Vascular Tone within the Microcirculation. Curr Pharm Biotechnol 2007; 8 (1): 11-25.
10.	McGuire JJ, Ding H, Triggle CR. Endothelium-derived Relaxing Factors: a Focus on Endothelium-derived Hyper-polarizing Factor(s). Can J Physiol Pharmacol 2001; 79 (6): 443-70. Review.
11.	Fisslthaler B, Popp R, Kiss L, et al. Cytochrome P450 2C is an EDHF Synthase in Coronary Arteries. Nature 1999; 401 (6752): 493-7.
12.	Shimokawa H, Yasutake H, Fujii K, et al. The Importance of the Hyperpolarizing Mechanism Increases as the Vessel Size Decreases in Endothelium-dependent Relaxations in Rat Mesenteric Circulation. J Cardiovasc Pharmacol 1996; 28 (5): 703-11.
13.	Urakami-Harasawa L, Shimokawa H, Nakashima M, et al. Importance Of Endothelium-Derived Hyperpolari-zing Factor In Human Arteries. J Clin Invest 1997; 100 (11): 2793-9.
14.	Deja MA, Golba KS, Widenka K, et al. Angiotensin-converting Enzyme Inhibitors Reveal Non-NO-, Non-pro-stacycline-mediated Endothelium-dependent Relaxation in Internal Thoracic Artery of Hypertensive Patients. Int J Cardiol 2005; 102 (3): 455-60.
15.	Taddei S, Ghiadoni L, Virdis A, et al. Vasodilation to Bradykinin is Mediated by an Ouabain-sensitive Pathway as a Compensatory Mechanism for Impaired Nitric Oxide Availability in Essential Hypertensive Patients. Circulation 1999; 100 (13): 1400-5.
16.	Najibi S, Cohen RA. Enhanced Role of K+ Channels in Relaxations of Hypercholesterolemic Rabbit Carotid Artery to NO. Am J Physiol 1995; 269 (3 Pt 2): H805-11.
17.	Minami A, Ishimura N, Harada S, et al. Exercise Training Improves Acetylcholine-induced Endothelium-depen-dent Hyperpolarization in Type 2 Diabetic Rats, Otsuka Long-evans Tokushima Fatty Rats. Atherosclerosis 2002; 162 (1): 85-92.
H 18.
19.
20. 21. 22.
23.
24.
25.
26.
27.
28. 29.
28 3°.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
Katz SD, Krum H. Acetylcholine-mediated Vasodilation in the Forearm Circulation of Patients with Heart Failure: Indirect Evidence for the Role of Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor. Am J Cardiol 2001; 87 (9): 1089-92
Mantelli L, Amerini S, Ledda F. Roles of Nitric Oxide and Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor in Vasorelaxant Effect of Acetylcholine as Influenced by Aging and Hypertension. J Cardiovasc Pharmacol 1995; 25 (4): 595-602.
Büssemaker E, Popp R, Binder J, et al. Characterization of the Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor (EDHF) Response in the Human Interlobar Artery. Kidney Int 2003; 63 (5): 1749-55.
Campbell WB, Gebremedhin D, Pratt PF, et al. Identification of Epoxyeicosatrienoic Acids as Endothelium-derived Hyperpolarizing Factors. Circ Res 1996; 78 (3): 415-23.
Miura H, Gutterman DD. Human Coronary Arteriolar Dilation to Arachidonic Acid Depends on Cytochrome P-450 Monooxygenase and Ca2+-Activated K+ Channels. Circ Res 1998; 83 (5): 501-7.
Yanga Q, Yima AP, He GW. The Significance of Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor in the Human Circulation. Curr Vasc Pharmacol 2007; 5 (1): 85-92. Review.
Hillig T, Krustrup P, Fleming I, et al. Cytochrome P450 2C9 Plays an Important Role in the Regulation of Exercise-induced Skeletal Muscle Blood Flow and Oxygen Uptake in Humans. J Physiol 2003; 546 (Pt 1): 307-14. Archer SL, Gragasin FS, Wu X, et al. Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor in Human Internal Mammary Artery is 11, 12-epoxyeicosatrienoic Acid and Causes Relaxation by Activating Smooth Muscle BK(Ca) Channels. Circulation 2003; 107 (5): 769-76.
Hamilton CA, Williams R, Pathi V, et al. Pharmacological Characterisation of Endothelium-dependent Relaxation in Human Radial Artery: Comparison with Internal Thoracic Artery. Cardiovasc Res 1999; 42 (1): 214-23. Larsen BT, Miura H, Hatoum OA, et al. Epoxyeicosatrienoic and Dihydroxyeicosatrienoic Acids Dilate Human Coronary Arterioles via BK(Ca) Channels: Implications for Soluble Epoxide Hydrolase Inhibition. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006 Feb; 290 (2): 491-9.
Buus NH, Simonsen U, Pilegaard HK, et al. Nitric Oxide, Prostanoid and Non-NO, Non-prostanoid Involvement in Acetylcholine Relaxation of Isolated Human Small Arteries. Br J Pharmacol 2000; 129 (1): 184-92. Coats P, Johnston F, Macdonald J, et al. Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor: Identification and Mechanisms of Action in Human Subcutaneous Resistance Arteries. Circulation 2001; 103 (12): 1702-8. Lang NN, Luksha L, Newby DE, et al. Connexin 43 Mediates Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor-induced Vasodilatation in Subcutaneous Resistance Arteries from Healthy Pregnant Women. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007; 292 (2): H1026-32.
Luksha L, Nisell H, Kublickiene K. The Mechanism of EDHF-mediated Responses in Subcutaneous Small Arteries from Healthy Pregnant Women. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2004; 286 (6): R1102-9. Mcintyre CA, Buckley CH, Jones GC, et al. Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor and Potassium Use Different Mechanisms to Induce Relaxation of Human Subcutaneous Resistance Arteries. Br J Pharmacol 2001; 133(6): 902-8.
Honing ML, Smits P, Morrison PJ, et al. Bradykinin-induced Vasodilation of Human Forearm Resistance Vessels is Primarily Mediated by Endothelium-dependent Hyperpolarization. Hypertension 2000; 35 (6): 1314-8. Inokuchi K, Hirooka Y, Shimokawa H, et al. Role of Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor in Human Forearm Circulation. Hypertension 2003; 42 (5): 919-24.
Schrage WG, Dietz NM, Eisenach JH, et al. Agonist-dependent Variablity of Contributions of Nitric Oxide and Prostaglandins in Human Skeletal Muscle. J Appl Physiol 2005; 98 (4): 1251-7.
Ueda K, Goto C, Jitsuiki D, et al. The Nicorandil-induced Vasodilation in Humans is Inhibited by Miconazole. J Cardiovasc Pharmacol 2005; 45 (4): 290-4.
Fischer D, Landmesser U, Spiekermann S, et al. Cytochrome P450 2C9 is Involved in Flow-dependent Vasodilatation of Peripheral Conduit Arteries in Healthy Subjects and in Patients with Chronic Heart Failure. Eur J Heart Fail 2007; 9(8): 770-5.
Halcox JP, Narayanan S, Cramer-Joyce L, et al. Characterization of Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor in the Human Forearm Microcirculation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2001; 280 (6): H2470-7. Passauer J, Büssemaker E, Lässig G, et al. Baseline Blood Flow and Bradykinin-induced Vasodilator Responses in the Human Forearm are Insensitive to the Cytochrome P450 2C9 (CYP2C9) Inhibitor Sulphaphenazole. Clin Sci (Lond) 2003; 105 (4): 513-8.
Taddei S, Versari D, Cipriano A, et al. Identification of a Cytochrome P450 2C9-derived Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor in Essential Hypertensive Patients. J Am Coll Cardiol 2006; 48 (3): 508-15. Newton DJ, Khan F, Belch JJ. Assessment of Microvascular Endothelial Function in Human Skin. Clin Sci (Lond) 2001; 101 (6): 567-72.
Abou-Elenin K, Xydakis A, Hamdy O, et al. The Effect of Aspirin and Various Iontophoresis Solution Vehicles on Skin Microvascular Reactivity. Microvasc Res 2002; 63 (1): 91-5.
43.	Dalle-Ave A, Kubli S, Golay S, et al. Acetylcholine-induced Vasodilation and Reactive Hyperemia are not Affected by Acute Cyclo-oxygenase Inhibition in Human Skin. Microcirculation 2004; 11 (4): 327-36.
44.	Kvandal P, Stefanovska A, Veber M, et al. Regulation of Human Cutaneous Circulation Evaluated by Laser Doppler Flowmetry, Iontophoresis, and Spectral Analysis: Importance of Nitric Oxide and Prostaglandines. Microvasc Res 2003; 65 (3): 160-71. Erratum In: Microvasc Res 2006; 71 (3): 227.
45.	Warren JB. Nitric Oxide and Human Skin Blood Flow Responses to Acetylcholine and Ultraviolet Light. FASEB J 1994; 8(2): 247-51.
46.	Holowatz LA, Thompson CS, Minson CT, et al. Mechanisms of Acetylcholine-Mediated Vasodilatation in Young and Aged Human Skin. J Physiol 2005; 563 (Pt 3): 965-73.
47.	Kellogg DL Jr, Zhao JL, Coey U, et al. Acetylcholine-induced Vasodilation is Mediated by Nitric Oxide and Prostaglandins in Human Skin. J Appl Physiol 2005; 98 (2): 629-32.
48.	Andreassen AK, Gullestad L, Holm T, et al. Endothelium-dependent Vasodilation of the Skin Microcirculation in Heart Transplant Recipients. Clin Transplant 1998; 12 (4): 324-32.
49.	Veves A, Saouaf R, Donaghue VM, et al. Aerobic Exercise Capacity Remains Normal Despite Impaired Endothelial Function in the Micro- and Macrocirculation of Physically Active IDDM Patients. Diabetes 1997; 46 (11): 1846-52.
50.	Anderson TJ, Uehata A, Gerhard MD, et al. Close Relation of Endothelial Function in the Human Coronary and Peripheral Circulations. J Am Coll Cardiol 1991; 26 (5): 1235-41.
51.	Morris SJ, Shore AC. Skin Blood Flow Responses to the Iontophoresis of Acetylcholine and Sodium Nitroprus-side in Man: Possible Mechanisms. J Physiol 1996; 496 (Pt 2): 531-42.
52.	Nilsson GE. Perimeds LDV Flowmeter. In: Sheperd AP, Oberg PA, Eds. Laser-Doppler Blood Flowmetry. Boston: Kluwer Academic Publishers; 1990. P. 57-72.
53.	Mancy A, Dijols S, Poli S, et al. Interaction of Sulfaphenazole Derivatives with Human Liver Cytochromes P450 2C: Molecular Origin of the Specific Inhibitory Effects of Sulfaphenazole on CYP 2C9 and Consequences for the Substrate Binding Site Topology Of CYP 2C9. Biochemistry 1996; 35 (50): 16205-12.
54.	Leslie SJ, Affolter J, Denvir MA, et al. Validation of Laser Doppler Flowmetry Coupled with Intra-dermal Injection for Investigating Effects of Vasoactive Agents on the Skin Microcirculation in Man. Eur J Clin Pharmacol 2003; 59 (2): 99-102.
55.	Wenzel RR. Minimal Invasive in Vivo Pharmacology: News of a New Method Holding Promise in Nephrology-re-lated Research. Nephrol Dial Transplant 1997; 12(4): 649-51. Review.
56.	Kubli S, Waeber B, Dalle-Ave A, et al. Reproducibility of Laser Doppler Imaging of Skin Blood Flow as a Tool to Assess Endothelial Function. J Cardiovasc Pharmacol 2000; 36 (5): 640-8.
57.	Wong BJ, Wilkins BW, Holowatz LA, et al. Nitric Oxide Synthase Inhibition Does not Alter the Reactive Hype-remic Response in the Cutaneous Circulation. J Appl Physiol 2003; 95(2): 504-10.
58.	Goldsmith PC, Leslie TA, Hayes NA, et al. Inhibitors of Nitric Oxide Synthase in Human Skin. J Invest Dermatol 1996; 106(1): 113-8.
59.	Bauersachs J, Popp R, Hecker M, et al. Nitric Oxide Attenuates the Release of Endothelium-derived Hyperpo-larizing Factor. Circulation 1996; 94 (12): 3341-7.
60.	Nishikawa Y, Stepp DW, Chilian WM. Nitric Oxide Exerts Feedback Inhibition on EDHF-induced Coronary Arteriolar Dilation in Vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000; 279 (2): H459-65.
61.	Buxton IL, Cheek DJ, Eckman D, et al. NG-nitro L-arginine Methyl Ester and Other Alkyl Esters of Arginine are Muscarinic Receptor Antagonists. Circ Res 1993; 72 (2): 387-95.
62.	Alvarez J, Montero M, Garcia - Sancho J. High Affinity Inhibition of Ca(2+)-dependent K+ Channels by Cytochrome P-450 Inhibitors. J Biol Chem 1992; 267 (17): 11789-93.
63.	Bellien J, Joannides R, Iacob M, et al. Evidence for a Basal Release of a Cytochrome-related Endothelium-derived Hyperpolarizing Factor in the Radial Artery in Humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006; 290 (4): H1347-52.
Prispelo 14.1.2008