UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Ana BRGLEZ ANTAGONIZEM MED GLIVO Eutypella parasitica IN IZBRANIMI VRSTAMI GLIV V LESU ODMRLIH VEJ GORSKEGA JAVORJA ( Acer pseudoplatanus) DOKTORSKA DISERTACIJA Ljubljana, 2022 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Ana BRGLEZ ANTAGONIZEM MED GLIVO Eutypella parasitica IN IZBRANIMI VRSTAMI GLIV V LESU ODMRLIH VEJ GORSKEGA JAVORJA ( Acer pseudoplatanus) DOKTORSKA DISERTACIJA ANTAGONISM BETWEEN THE FUNGUS Eutypella parasitica AND SELECTED FUNGAL SPECIES IN DEAD BRANCHWOOD OF SYCAMORE MAPLE ( Acer pseudoplatanus) DOCTORAL DISSERTATION Ljubljana, 2022 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani in po sklepu Senata Biotehniške fakultete ter sklepa 24. seje Komisije za doktorski študij Univerze v Ljubljani z dne 4. 2. 2020 (po pooblastilu 6. seje Senata Univerze v Ljubljani z dne 27. 3. 2018) je bilo potrjeno, da kandidatka Ana Brglez izpolnjuje pogoje za opravljanje doktorata znanosti na bolonjskem Interdisciplinarnem doktorskem študiju Bioznanosti, znanstveno področje upravljanje gozdnih ekosistemov. Za mentorja je bil imenovan višji znan. sod. dr. Nikica Ogris. Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: doc. dr. Tine Hauptman Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za gozdarstvo in obnovljive gozdne vire Član: doc. dr. Boštjan Lesar Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za lesarstvo Član: prof. dr. Danko Diminić Sveučilište u Zagrebu, Fakultet šumarstva i drvne tehnologije Datum zagovora: 14. 10. 2022 Ana Brglez II Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd DK GDK 172.8+176.1Acer spp+161.2(043.3)=163.6 KG Eutypella parasitica, javorov rak, Acer spp., javorji, glivne združbe, antagonizem, razkroj lesa, izguba mase AV BRGLEZ, Ana, mag. inž. gozd. SA OGRIS, Nikica (mentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Interdisciplinarni doktorski študijski program Bioznanosti, znanstveno področje upravljanje gozdnih ekosistemov LI 2022 IN ANTAGONIZEM MED GLIVO Eutypella parasitica IN IZBRANIMI VRSTAMI GLIV V LESU ODMRLIH VEJ GORSKEGA JAVORJA ( Acer pseudoplatanus) TD doktorska disertacija OP IX, 97 str., 6 sl., 151 vir. IJ sl JI sl/en AI Eutypella parasitica, povzročiteljica javorovega raka, uničujoče bolezni javorjev v Evropi in Severni Ameriki, najpogosteje okuži deblo gostitelja skozi odmrle veje ali rane v skorji. Zaradi morebitnega vpliva glivne združbe na okužbo in rast E. parasitica smo proučili vrstno sestavo gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus). Glive smo izolirali v čiste kulture iz različnih mest v odmrli veji. Najpogosteje smo izolirali Eutypa maura, Eutypa sp., Fusarium avenaceum, Neocucurbitaria acerina in E. parasitica. Ugotovili smo neznačilne razlike v pestrosti glivnih vrst in značilne razlike v glivnih združbah med različnimi lokacijami, med različnimi mesti izolacije in med različnimi debelinami vej. Analizirali smo vpliv najpogostejših vrst gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja na rast E. parasitica v čisti kulturi in s testom mini-blok ugotavljali njihov vpliv na razkroj lesa naših najpogostejših vrst javorjev. Na podlagi izračuna antagonističnega indeksa in uspešnosti reizolacij iz interakcijske cone smo E. parasitica šteli za šibkejšo tekmovalno vrsto. Izolati Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp. in Peniophora incarnata so se izkazali za najučinkovitejše inhibitorje E. parasitica, ki bi jih lahko potencialno uporabili tudi za zatiranje E. parasitica. S testom mini-blok smo ugotovili relativno počasen razkroj lesa zaradi delovanja E. parasitica. V primerjavi z izolatoma znanih trohnobnih gliv je povzročila značilno manjše izgube mase. Na podlagi mikroskopije in obarvanja vzorcev sklepamo, da E. parisitica povzroča belo trohnobo. Z raziskavo smo podrobneje raziskali določene lastnosti E. parasitica in pri tem odprli številna nova vprašanja. III Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KEY WORDS DOCUMENTATION DN Dd DC FDC 172.8+176.1Acer spp+161.2(043.3)=163.6 CX Eutypella parasitica, Eutypella canker of maple, Acer spp., maples, fungal communities, antagonism, wood decay, mass loss AU BRGLEZ, Ana AA OGRIS, Nikica (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Interdisciplinary Doctoral Programme in Biosciences, Scientific Field Managing of Forest Ecosystems PY 2022 TI ANTAGONISM BETWEEN THE FUNGUS Eutypella parasitica AND SELECTED FUNGAL SPECIES IN DEAD BRANCHWOOD OF SYCAMORE MAPLE ( Acer pseudoplatanus) DT doctoral dissertation NO IX, 97 p., 6 fig., 151 ref. LA sl AL sl/en AB Eutypella parasitica, the causative agent of Eutypella canker of maple, a destructive disease of maples in Europe and North America, most frequently infects the trunk through a branch stub or bark wound. Because the fungal community may have an impact on infection and colonization by E. parasitica, we examined the species composition of fungi colonizing the wood of the dead branches of sycamore maple ( Acer pseudoplatanus). Isolations were made from different isolation sources in a dead branch. The most frequently isolated species were Eutypa maura, Eutypa sp., Fusarium avenaceum, Neocucurbitaria acerina, and E. parasitica. We did not detect differences in species diversity, but fungal communities differed between sampling sites, between isolation sources, and between branch thickness classes. We tested the most frequently isolated fungi from the wood of dead branches of sycamore maple in dual cultures with E. parasitica and determined their effect on wood decay in our most common maple species using a mini-block test. Based on the calculation of an index of antagonism and re‐isolation success from the interaction zone, we consider E. parasitica to be a weak competitor. Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp., and Peniophora incarnata have been shown to be the most effective inhibitors of E. parasitica. Relatively slow wood decay due to the action of E. parasitica was detected by the mini-block test. Compared to isolates of known decay fungi, it resulted in significantly lower weight loss. Based on microscopy and staining of the samples, we conclude that E. parasitica could be considered to cause white rot. We have examined certain areas of E. parasitica biology and raised several new questions. IV Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ................................................ III KEY WORDS DOCUMENTATION .............................................................................. IV KAZALO VSEBINE .......................................................................................................... V KAZALO ZNANSTVENIH DEL .................................................................................. VII KAZALO SLIK .............................................................................................................. VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ............................................................................................ IX 1 UVOD ........................................................................................................................... 1 1.1 PREDSTAVITEV RAZISKOVALNEGA PROBLEMA ..................................... 1 1.1.1 Eutypella parasitica in javorov rak ................................................................. 1 1.1.2 Združbe gliv, ki se pojavljajo na odmrlih vejah gorskega javorja ............. 7 1.1.3 Konkurenčnost gliv in morebiten antagonizem ............................................ 8 1.1.4 Obarvanje in razkroj lesa ............................................................................... 9 1.2 PREDSTAVITEV NAMENA, CILJEV IN HIPOTEZ ....................................... 12 2 ZNANSTVENA DELA ............................................................................................. 14 2.1 EUTYPELLA PARASITICA IN DRUGE POGOSTO IZOLIRANE VRSTE GLIV IZ LESA ODMRLIH VEJ MLADIH GORSKIH JAVORJEV ( ACER PSEUDOPLATANUS) V SLOVENIJI ..................................................................................................................... 14 2.2 IN VITRO INTERAKCIJE MED EUTYPELLA PARASITICA IN NEKATERIMI POGOSTO IZOLIRANIMI GLIVAMI IZ LESA ODMRLIH VEJ GORSKEGA JAVORJA ( ACER PSEUDOPLATANUS)................................................................................ 33 2.3 VPLIV EUTYPELLA PARASITICA NA RAZKROJ LESA TREH VRST JAVORJEV 46 3 RAZPRAVA IN SKLEPI .......................................................................................... 65 3.1 RAZPRAVA ........................................................................................................ 65 3.1.1 Združbe gliv, ki se pojavljajo na odmrlih vejah gorskega javorja ........... 65 3.1.2 Konkurenčnost gliv in morebiten antagonizem .......................................... 69 3.1.3 Obarvanje in razkroj lesa ............................................................................. 72 3.2 SKLEPI ................................................................................................................ 76 4 POVZETEK (SUMMARY) ...................................................................................... 81 V Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 4.1 POVZETEK ........................................................................................................ 81 4.2 SUMMARY ........................................................................................................ 84 5 VIRI ............................................................................................................................ 88 ZAHVALA VI Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO ZNANSTVENIH DEL Brglez A., Piškur B., Ogris N. 2020. Eutypella parasitica and other frequently isolated fungi in wood of dead branches of young sycamore maple ( Acer pseudoplatanus) in Slovenia. Forests 11, 4: 467, doi: 10.3390/f11040467: 18 str. ………………………………….….. 14 Brglez A., Piškur B., Ogris N. 2020. In vitro interactions between Eutypella parasitica and some frequently isolated fungi from the wood of the dead branches of young sycamore maple ( Acer pseudoplatanus). Forests 11, 10: 1072, doi: 10.3390/f11101072: 12 str. …………. 33 Brglez A., Piškur B., Humar M., Gričar J., Ogris N. 2020. The effect of Eutypella parasitica on the wood decay of three maple species. Forests 11, 6: 671, doi: 10.3390/f11060671: 18 str. ………………………………………………………………………………………... 46 VII Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO SLIK Slika 1: Prečni (a) in podolžni (b) prerez skozi lumne peritecijev (Foto: A. Brglez). .......... 2 Slika 2: Mikroskopske značilnosti javorovega raka: a) nastajajoči aski in b) sproščeni aski z askosporami (Foto: A. Brglez). ............................................................................................. 3 Slika 3: Značilni simptomi javorovega raka: a) uleknjena skorja z odmrlo vejo v središču raka, b) eliptična rakava rana, c) micelijske pahljačice v skorji in d) periteciji (Foto: A. Brglez). .................................................................................................................................. 4 Slika 4: Nespolni trosi (konidiji) iz kulture E. parasitica (Foto: A. Brglez). ........................ 5 Slika 5: Razširjenost potrjenih okužb z Eutypella parasitica v Sloveniji 25. 3. 2022 (Ogris in sod., 2022). ........................................................................................................................ 6 Slika 6: Lokacije inventure in vzorčenja (zelena barva označuje prisotnost javorovega raka, rdeča barva pa odsotnost javorovega raka).......................................................................... 67 VIII Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 OKRAJŠAVE IN SIMBOLI AI antagonistični indeks CODIT kompartmentalizacija razkroja v drevesu (angl. Compartmentalization Of Decay In Trees) DSMZ nemška zbirka mikroorganizmov in celičnih kultur (nem. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) EF-1α elongacijski faktor 1-alfa (angl. elongation factor 1-alfa) ITS notranji prepisni vmesnik (angl. internal transcripted spacer) LM svetlobna mikroskopija (angl. light microscopy) MEA gojišče z ekstraktom ječmenovega slada (angl. malt extract agar) PDA krompirjev agar z glukozo (angl. potato dextrose agar) rDNA ribosomska deoksiribonukleinska kislina s uspešnost reizolacij iz interakcijske cone SEM vrstična elektronska mikroskopija (angl. scanning electron microscopy) ZIM Zbirka industrijskih mikroorganizmov ZLVG Zbirka živih kultur Laboratorija za varstvo gozdov ZGS Zavod za gozdove Slovenije IX Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 1 UVOD 1.1 PREDSTAVITEV RAZISKOVALNEGA PROBLEMA Gozdna fitopatologija je veda o boleznih gozdnega drevja, ki jih povzročajo abiotski in biotski dejavniki, kot so glive, bakterije, fitoplazme, virusi, parazitske cvetnice ipd. (Maček, 2008). Beseda fitopatologija je sestavljena iz grških besed: phyton (rastlina), pathos (bolezen) in logos (veda). Glavna naloga fitopatologije je spoznavati povzročitelje obolenj, njihov način življenja in razvojni krog ter najti morebitne načine za zatiranje bolezni (Maček, 2008). Rastlinske bolezni so okuževale rastline že v pradavnini (Maček, 2008), pojavi novih oz. tujerodnih škodljivih organizmov pa se v zadnjih desetletjih hitro širijo zaradi podnebnih sprememb, globalne trgovine, povečanega prometa in turizma (Hulme in sod., 2009; MacLeod in sod., 2010; Seebens in sod., 2015). S človekovo pomočjo tujerodne vrste lažje dosežejo nova območja in se širijo na daljše razdalje. 1.1.1 Eutypella parasitica in javorov rak Ena izmed tujerodnih vrst gliv, ki je bila vnesena v evropski prostor, kjer se je tu tudi uspešno udomačila, je Eutypella parasitica R. W. Davidson & R. C. Lorenz. Glivo so odkrili in opisali leta 1937 v okolici Velikih jezer, na meji med Kanado in Združenimi državami Amerike (Davidson in Lorenz, 1938). Vrsta okužuje vse vrste javorjev ( Acer spp.) in povzroča bolezen javorov rak. V Ameriki se pojavlja na sladkornem ( Acer saccharum Marsh.) in rdečem javorju ( A. rubrum L.), redkeje tudi na ameriškem ( A. negundo L.), ostrolistnem ( A. platanoides L.), srebrnem ( A. saccharinum L.), črnem ( A. nigrum Mich.), gorskem ( A. pseudoplatanus L.), progastem ( A. pennsylvanicum L.) in oregonskem javorju ( A. macrophyllum Prush.) (Davidson in Lorenz, 1938; French, 1967; Kliejunas in Kuntz, 1972, 1974). Javorov rak je bil v Sloveniji in hkrati tudi v Evropi prvič zabeležen leta 2005 (Jurc in sod., 2006). Pri nas sta najpogosteje okužena gorski javor in maklen ( A. campestre L.), bolezen pa se pojavlja tudi na ostrolistnem javorju in drugih vrstah javorjev (Ogris in sod., 2022). Eutypella parasitica je taksonomsko uvrščena med zaprtotrosnice (Ascomycota), poddeblo Pezizomycotina, razred Sordariomycetes, podrazred Xylariomycetidae, red Xylariales in družino Diatrypaceae (Index Fungorum, 2009). Gliva E. parasitica najpogosteje okuži gostitelja skozi odmrlo vejo ali poškodbo na deblu (French, 1967). Pri tem starost gostitelja nima pomembne vloge (French, 1967), čeprav Davidson in Lorenz (1938) v prvem opisu bolezni navajata, da lahko gliva okuži gostitelja le v mladosti. French (1967) s svojo raziskavo ni ugotovil enotne razporeditve okužb po debelinskih razredih gostiteljskih dreves. Prav tako tudi ni odkril povezave med deležem gostiteljskih dreves v sestoju in stopnjo okuženosti (French, 1967). Navadno je v sestoju okuženih 3–5 % javorjev (ponekod celo do 50 %) (Ogris in sod., 2009), kar je glede na infekcijski potencial vrste relativno malo (French, 1967). Po podatkih raziskave, ki so jo opravili Ogris in sod. (2009), se namreč na eni rakavi rani v povprečju razvije 647.000 1 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 peritecijev (Slika 1), ki v ugodnih razmerah lahko v eni uri sprostijo približno eno milijardo spor. Optimalna temperatura za rast glive je 24–28 °C (French, 1967; Johnson in Kuntz, 1979). Za sproščanje spor imata poleg ugodne temperature pomembno vlogo tudi zadostna količina padavin in zračna vlaga (French, 1967). Lachance (1971) navaja, da je za sproščanje askospor potrebnih vsaj 2,5 mm padavin na m2, ki zadostno navlažijo skorjo s periteciji, in temperatura zraka več kot 4 °C. Visoka zračna vlažnost vpliva na počasnejše sušenje skorje s periteciji in podaljša obdobje sproščanja spor po dežju, neposredno pa ne vpliva na sam začetek sproščanja. Največje količine se sprostijo v šestih urah po navlažitvi (Johnson in Kuntz, 1979). Temperatura ni kritičen dejavnik za sproščanje spor, vpliva pa na absorpcijo vode v stene peritecijev. Pri višji temperaturi se higroskopne stene peritecijev hitreje navlažijo, nabreknejo in izvržejo aske z askosporami (French, 1967) (Slika 2). Z oddaljevanjem od vira se hitro zmanjšuje število spor (Johnson in Kuntz, 1979). Večina novih okužb se pojavlja v skupinah okoli izvornih rakov (Kliejunas in Kuntz, 1974; Martinez in sod., 2003; Ogris in sod., 2009). Pogosteje se raki razvijejo na podstojnem drevju (Kliejunas in Kuntz, 1974). Vzroki za maloštevilne okužbe še niso raziskani. Eden izmed morebitnih vzrokov je nizka stopnja virulentnosti, ki E. parasitica uvršča med šibke patogene. Drugi je način izmetavanja askospor, ki iz peritecijev izhajajo v skupinah po osem, imajo relativno veliko maso, zato padejo na tla večinoma v radiju 25 m od okuženega drevesa (Johnson in Kuntz, 1979). Tretji, še ne raziskan vzrok redkih okužb pa so domnevno združbe gliv, ki se pojavljajo v odmrlih vejah javorjev. Vrste med seboj tekmujejo in vplivajo na uspešnost naselitve in izražanja bolezenskih znakov (Porter in Carter, 1938; Holmer in sod., 1997; Schmit, 1999; Rezgui in sod., 2018). Morda je E. parasitica šibek patogen z nizko stopnjo virulentnosti, ki ga hitro izločijo oz. nadomestijo druge, tekmovalno uspešnejše vrste. Slika 1: Prečni (a) in vzdolžni (b) prerez skozi lumne peritecijev (Foto: A. Brglez). Figure 1: Cross (a) and longitudinal (b) section through the lumens of the perithecia (Photo: A. Brglez). 2 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 2: Mikroskopske značilnosti javorovega raka: a) nastajajoči aski in b) sproščeni aski z askosporami (Foto: A. Brglez). Figure 2: Microscopic characteristics of Eutypella cancer of maple: a) asci formation, and b) released asci with ascospores (Photo: A. Brglez). Eutypella parasitic a se na krajših razdaljah razširja z vetrom, ki prenaša askospore iz peritecijev. Na daljših razdaljah pa se bolezen širi s trgovino z lesom in okrasnim drevjem (EPPO, 2008). Na deblih javorjev povzroči razvoj pravilne eliptične rakave rane (Slika 3, a in b) (Ogris in sod., 2009), kar je posledica hitrejše rasti glive v vertikalni kot lateralni smeri (French, 1967). Navadno je na posameznem okuženem deblu le ena rakava rana (Davidson in Lorenz, 1938). Skoraj vedno so v središču raka opazni ostanki odmrle veje, skorja je rahlo ugreznjena, v skorji se razrašča belo do bež podgobje (micelijske pahljačice) (Slika 3, c) (French, 1967). Deblo je deformirano, odmrla skorja pa ostane na deblu pritrjena več let zaradi močnega podgobja. Na osrednjem delu rane se okoli sedem let po okužbi pojavijo črna trosišča v obliki peritecijev z dolgimi črnimi vratovi, ki jih zaradi velikega števila opazimo na površini rane (Slika 3, d) (Davidson in Lorenz, 1938). Večina peritecijev nastane v rastni sezoni (Kliejunas in Kuntz, 1972). Zreli periteciji v povprečju v premeru merijo 600–1000 μm, medtem ko so njihovi vratovi lahko dolgi tudi do 5 mm (Lachance in Kuntz, 1970). Gliva se razrašča v skorji in lesu, ki ga razgrajuje. V lesu je rast hitrejša, zato je poškodba večja, kot je videti po velikosti raka od zunaj (Ogris in sod., 2009). Sinclair in sod. (1987) navajajo, da gliva zraste od 1 do 2 cm na leto. Okužena mlajša drevesa navadno hitro propadejo, še preden bi se razvili očitni simptomi bolezni. Najočitnejši simptom zgodnjih okužb so micelijske pahljačice, uleknjena skorja in manjša odebelitev na mestu okužbe (French, 1967). 3 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 3: Značilni simptomi javorovega raka: a) uleknjena skorja z odmrlo vejo v središču raka, b) eliptična rakava rana, c) micelijske pahljačice v skorji in d) periteciji (Foto: A. Brglez). Figure 3: Typical symptoms of Eutypella canker of maple: a) depressed bark with dead branch stub in the center, b) elliptical shape of the canker, c) mycelial fans in the bark, and d) perithecia (Photo: A. Brglez). Bolezen povzroča relativno veliko ekološko in ekonomsko škodo (Gross, 1984b; Martinez in sod., 2003). Poškodovani del debla z rakavo rano je namreč tehnično razvrednoten. Mlajša drevesa zaradi okužbe navadno propadejo, medtem ko lahko starejša z glivo rastejo več desetletij. Ker gliva razkraja tudi les, so okuženi javorji slabše mehansko stabilni in občutljivejši za veter, sneg in žled (Davidson in Lorenz, 1938; Ogris in sod., 2005). Krošnje okuženih dreves sicer niso očitno prizadete, občasno odmrejo le posamične veje. Pod rakavo rano se po navadi pojavijo tudi številni adventivni poganjki (French, 1967). Po raziskavah se 60 % okužb pojavi do višine 244 cm, samo slabih 20 % rakov se razvije višje od 488 cm (French, 1967). Bolezen se širi počasi in prav ta lastnost omogoča, da lahko precej uspešno zaustavljamo njeno širjenje. Davidson in Lorenz (1938) sta prva opisala tudi rast E. parasitica v kulturi. Gliva dobro raste na različnih hranilnih medijih in razvije gost bel micelij, ki sčasoma postaja bež do kremaste barve. Povprečna hitrost rasti je 20 mm v sedmih dneh pri temperaturi 25 °C (Davidson in Lorenz, 1938), 58 mm v sedmih dneh pri temperaturi 28 °C (French, 1967) oz. 2,4 mm na dan pri 24 °C (Ogris in sod., 2009). Raziskave so pokazale dobro rast E. parasitica med 20 in 35 °C (Davidson in Lorenz, 1938). French (1967) kot optimalno temperaturo za rast glive v kulturi navaja 28 °C. Kulture potrebujejo približno štiri do šest tednov inkubacije pri temperaturi 25 °C, da začnejo proizvajati spore v piknidijem podobnih strukturah (Davidson in Lorenz, 1938; French, 1967; Glawe, 1983; Sinclair in sod., 1987). Raziskovalci si niso enotni glede taksonomske uvrstitve nespolne oblike glive. Davidson in Lorenz (1938) sta nespolni stadij opisala kot Libertella sp., ki oblikuje konidije neposredno na miceliju, medtem ko French (1967) nespolno obliko E. parasitica uvršča med Cytosporina sp., ki v 4 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 kulturi oblikuje piknidije s konidiji v obliki vitic jantarne barve. Konidiji za samo razširjanje glive niso pomembni (Slika 4). Slika 4: Nespolni trosi (konidiji) iz kulture E. parasitica (Foto: A. Brglez). Figure 4: Asexual spores (conidia) from E. parasitica culture (Photo: A. Brglez). V Sloveniji so glivo E. parasitica odkrili leta 2005 (Jurc in sod., 2006). Ogris in sod. (2006) so nato na podlagi primernosti podnebnih razmer in prisotnosti gostiteljskih dreves razvili model tveganja za širjenje javorovega raka po Evropi; 13 % površine so uvrstili med območja z najvišjo stopnjo tveganja. Kot najbolj ogrožena območja so navedli Slovenijo, Bosno in Hercegovino, Srbijo, Makedonijo, Hrvaško, Apenine, osrednje Pireneje, Češko, jug Slovaške, Avstrijo, osrednjo in južno Nemčijo, Poljsko, sever Švice ter vzhod Francije in Ukrajine. Rezultati modela se dobro ujemajo s poznejšimi najdbami javorovega raka v evropskih državah: Avstrija (Cech, 2007), Hrvaška (Ogris in sod., 2008), Nemčija (Cech in sod., 2016), Madžarska (Jurc in sod., 2016), Poljska (Černý in sod., 2017), Češka (Černý in sod., 2017), Italija (Bregant, 2018; Jurc in sod., 2019) in Švica (Dubach in sod., 2022). Poleg modela, ki ocenjuje tveganje na nivoju celotne Evrope, je nastal tudi model širjenja javorovega raka v Sloveniji (Ogris in sod., 2007). Ocena tveganja je bila narejena za takratne razmere in tri izbrane scenarije podnebnih sprememb v dveh časovnih obdobjih. Napoved je temeljila na poznavanju občutljivosti različnih vrst javorjev, razmnoževanja in širjenja glive v povezavi z arealom gostiteljskih dreves in primernosti podnebja. Za takratne podnebne razmere je bilo 8 % gozdov Slovenije ocenjenih z visokim tveganjem, 43 % s srednjim, 44 % z majhnim in 4 % gozdov z zelo majhnim tveganjem, da se pojavi javorov rak. Raziskovalci so ugotovili, da se bo v prihodnje delež površin z javorovim rakom verjetno manjšal oz. bo večji delež površin vključen v nižjo stopnjo tveganja zaradi predvidenega zmanjševanja lesne zaloge javorjev v gozdnih sestojih zaradi podnebnih sprememb. V 5 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Sloveniji je bilo 25. 3. 2022 potrjenih 480 okužb z Eutypella parasitica (Ogris in sod., 2022) (Slika 5). Slika 5: Razširjenost potrjenih okužb z Eutypella parasitica v Sloveniji 25. 3. 2022 (Ogris in sod., 2022). Figure 5: Prevalence of confirmed Eutypella parasitica infections in Slovenia on 25.3.2022 (Ogris in sod., 2022). V Sloveniji je po podatkih Zavoda za gozdove Slovenije (ZGS) za leto 2021 lesna zaloga javorjev znašala 11,9 milijona m3. Od tega je bilo 96,3 % gorskega javorja, 1,6 % maklena in 1,3 % ostrolistnega javorja (ZGS, 2022). V rodu javorjev je sicer na severni polobli znanih 150–200 vrst, v Sloveniji pa jih samoniklo raste šest: gorski, ostrolistni, poljski, trokrpi, topokrpi in tatarski javor. V Evropi je najpogostejši gorski javor, ki izvira z gorskih predelov srednje Evrope (Spiecker in sod., 2009). Areal gorskega javorja se razteza od Turčije in Španije na jugu do Irske in Švedske na severu (Rusanen in Myking, 2003). Odlikuje ga dobra prilagodljivost na raznolike rastiščne razmere (Hein, 2009). Ostrolistni javor je domoroden na območju vse od Grčije, severne Italije in Pirenejev do juga skandinavskih držav (Caudullo in de Rigo, 2016). Razširjen je tudi v Mali Aziji in na Kavkazu (Brus, 2008). Naravno območje razširjenosti poljskega javorja oz. maklena obsega večino Evrope; raste v pasu od Pirenejev, Sicilije, Grčije in severne Turčije do srednje Anglije, južne Švedske in Danske. Posamezne primerke je mogoče najti tudi v Španiji in severni Afriki (Nagy in Ducci, 2004). Trokrpi javor je naravno razširjen po skoraj celotnem Sredozemlju do Male Azije in severne Afrike (Bavcon in sod., 2011). Topokrpi javor je endemit balkanskega visokega krasa, naravno je razširjen v gozdovih na Dinarskem gorovju na vsem Balkanskem polotoku (Brus, 6 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2008). Tatarski javor pa je naravno razširjen v vzhodni Evropi in zahodni Aziji. V Sloveniji so ga v naravi zadnjikrat zanesljivo našli leta 1907, dandanes pa ne vemo več za nobeno njegovo naravno rastišče (Brus, 2008). 1.1.2 Združbe gliv, ki se pojavljajo na odmrlih vejah gorskega javorja Glive so druga vrstno najbogatejša skupina organizmov (Purvis in Hector, 2000). Wu in sod. (2019) ocenjujejo, da je skupno število glivnih vrst od 11,7 do 13,2 milijona. Ocena je precej višja od začetne hipoteze o 1,5 milijona (Hawksworth, 1991) in 2,2–3,8 milijona (Hawksworth in Lücking, 2017) gliv. Doslej je bilo opisanih samo okoli 7 % vrst (Wu in sod., 2019), kar kaže, da je na tem področju še veliko neraziskanega. Glive so torej precej razširjena skupina organizmov. Večina je saprofitov in razgrajujejo mrtve organske snovi. Preostale glive so specializirane za okužbe živih tkiv in jih delimo na patogene in endofite (Sieber, 2007). Meja med njimi je pogosto zabrisana (Bayman, 2007). Endofiti so še posebno zanimivi, saj povsem asimptomatsko naselijo gostiteljevo tkivo. Na tak način lahko živijo ves čas ali pa po določeni inkubacijski ali latentni dobi in v ugodnih razmerah okolja (tj. v gostitelju, katerega metabolizem se je spremenil zaradi določenih stresnih dejavnikov) spremenijo svojo življenjsko strategijo (Bayman, 2007; Sieber, 2007). Takšna primera sta Cryptostroma corticale, ki povzroča sajasto odmiranje skorje (Ogris in sod., 2021), in Biscogniauxia nummularia, ki povzroči pooglenitev bukve (Luchi in sod., 2015). Splošno mnenje je, da so rastline brez endofitov izjemno redke (Gennaro in sod., 2003). Interakcije endofitov in njihovih gostiteljev so zapletene, večplastne in se lahko spreminjajo skozi čas. Večina rastlin ima izjemno pestro združbo endofitov, ki vključuje nekaj dominantnih in veliko redkih vrst. Endofiti istega gostitelja se lahko občutno razlikujejo med posameznimi lokacijami (Bayman, 2007). Življenjski slog (mutualizem, komenzalizem, parazitizem) večine endofitov ni znan (Sieber, 2007). Združbe gliv z različnimi življenjskimi strategijami, ki se pojavljajo na odmrlih vejah gorskega javorja, so slabo raziskane. Glive, ki naseljujejo odmrle veje in sodelujejo pri razkroju lesa, večinoma spadajo v debla Ascomycota in Deuteromycota (Butin in Kowalski, 1986) ter so navadno že pred odmrtjem veje v skorji in lesu na endofiten način (Maček, 2008; Parfitt in sod., 2010). Pri pregledu literature smo zasledili nekaj študij, v katerih so raziskovali glive na gorskem javorju: Butin in Kowalski (1986) – odmrle veje, Chlebicki (1988) – les odmrlih vej, Kowalski in Kehr (1992) – dnišča živih vej, Unterseher in sod. (2005) – odmrle veje v krošnji in Johnova (2009) – razkrajajoča debla, panji, poganjki in veje. Obstajajo tudi raziskave glivnih asociacij na rdečem ( A. rubrum) (Green in sod., 1981), sladkornem ( A. saccharum) (Yang, 2005), ostrolistnem ( A. platanoides) (Terho in Hallaksela, 2008) in mandžurskem javorju ( A. ginnala) (Qi in sod., 2009) ter A. truncatum (Sun in sod., 2011). V literaturi zasledimo tudi primere raziskovanja glivnih združb na listih, iglicah, vejah in deblih drugih drevesnih vrst; le-ti so nam služili kot dodaten vir 7 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 metodoloških idej za našo raziskavo (Boddy in sod., 1987; Sieber, 1988; Fisher in Petrini, 1990; Sieber in sod., 1995; Danti in sod., 2002; Gennaro in sod., 2003; Sun in sod., 2012; Kowalski in sod., 2016; Hanácková in sod., 2017). Manjka pa podrobna študija gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja v povezavi z E. parasitica. Da bi ugotovili pestrost glivnih vrst v različnih substratih, se raziskovalci tradicionalno poslužujejo morfoloških metod z dodatno uporabo v zadnjem času hitro napredujočih in razvijajočih se molekularnih tehnik. Zaradi časovne komponente in relativno enostavnejšega pristopa, ki ne terja poglobljenega mikološkega znanja, je v zadnjem času molekularni pristop privlačnejši. Številne raziskave na tem področju omogočajo hitro in enostavno identifikacijo organizmov. Takšen primer so recimo okužbe z E. parasitica, za katere sta bila razvita vrstno specifična oligonukleotidna začetnika (angl. primer) EpF in EpR, ki omogočata hitro in enostavno molekularno identifikacijo vrste (Piškur in sod., 2007). Omenjene molekularne metode smo uporabljali tudi v sklopu naših raziskovalnih ciljev. 1.1.3 Konkurenčnost gliv in morebiten antagonizem Interakcije imajo zelo pomembno vlogo pri strukturnem oblikovanju glivnih združb (Falconer in sod., 2008). V naravnem okolju so interakcije izjemno kompleksne (Falconer in sod., 2008) in pomembno vplivajo na razporeditev, rastne vzorce in številčnost glivnih vrst (Yuen in sod., 1999; Badalyan in sod., 2004). Medvrstne interakcije lahko pomagajo razumeti spremembe v strukturi glivnih združb in načine uporabe gliv za biološko kontrolo patogenov (Badalyan in sod., 2004). Slednje je izjemno pomembno za zagotavljanje zdravih in stabilnih gozdov. Raziskave biološke kontrole bolezni lesnatih rastlin in dreves so redke v primerjavi s tistimi, ki jih izvajajo na zelnatih enoletnicah. Biološka kontrola sicer velja za obetavno alternativo naravni odpornosti rastlin in rabi kemičnih spojin za obvladovanje rastlinskih bolezni (He in sod., 2021). Po "širši" definiciji biološka kontrola obsega zmanjševanje oz. zatiranje škodljivih aktivnosti enega organizma z enim ali več organizmi, ki jih pogosto označujemo kot "naravne sovražnike". V okviru fitopatologije gre po navadi za uporabo antagonistov, ki prek različnih mehanizmov zavirajo ali celo ustavijo rast različnih patogenih gliv (Pal in McSpadden Gardener, 2006; Jenko, 2010). Pri tem velja opozoriti na zakonske določbe o uporabi domorodnih in tujerodnih vrst organizmov za namen biotičnega varstva. Za uporabo domorodnih vrst morajo biti izpolnjeni predpisani pogoji glede strokovnosti in tehnične usposobljenosti, pri uporabi tujerodnih vrst pa je postopek nekoliko bolj zapleten. Takšne vrste morajo biti namreč na seznamu, ki ga izda pristojno ministrstvo, in morajo pridobiti dovoljenje za vnos in uporabo Uprave Republike Slovenije za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin (Zakon o zdravstvenem varstvu rastlin, 2007). Mehanizme antagonističnega delovanja v naravi lahko v prvi vrsti razdelimo na neposredne in posredne (Pal in McSpadden Gardener, 2006). V teoriji v nadaljevanju neposredne 8 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 mehanizme razdelimo na tekmovanje oz. kompeticijo, antibiozo in mikoparazitizem (Shearer in Zare-Maivan, 1988; Pal in McSpadden Gardener, 2006; Jenko, 2010). Glive po navadi tekmujejo za hranila in prostor. Ker je v določenih okoljih količina hranil omejena, nastane tekmovanje med njimi. Če je nekega hranila dovolj, se antagonistične značilnosti izničijo ali vsaj znatno zmanjšajo. Pri antibiozi nastajajo in se sproščajo hlapni in nehlapni sekundarni metaboliti oz. antagonistične spojine, ki zaviralno učinkujejo na vrste, ki so jim izpostavljene (Jenko, 2010; Prior in sod., 2017). V sklopu mikoparazitizma pa antagonistične glive oblikujejo različne encime (celulaze, hitinaze, glukanaze, proteinaze), ki delujejo neposredno na razkroj celičnih sten hif (Shearer in Zare-Maivan, 1988; Jenko, 2010). Tekmovanje in antibioza sta mehanizma, ki delujeta na daljavo, medtem ko je pri mikoparazitizmu značilen stik med patogenom in antagonistom (Pal in McSpadden Gardener, 2006). V okviru nekoliko težje razumljivega posrednega antagonizma pa govorimo o stimulaciji obrambnih mehanizmov in t. i. preobčutljivostnem odgovoru rastlin (Dangl in Jones, 2001). Z razlago slednjega bi krepko presegli začrtani okvir doktorske disertacije. Pri pregledu literature smo našli številne raziskave na področju mikologije, ki se ukvarjajo z antagonističnimi učinki posameznih vrst. Hanácková in sod. (2017) so na primer proučevali antagonistične lastnosti endofitnih gliv na glivo Hymenoscyphus fraxineus v čistih kulturah. Badalyan in sod. (2004) so s parnimi primerjavami ugotavljali medsebojne vplive med nekaterimi trohnobnimi vrstami gliv in vrstami iz rodu Trichoderma in Clonostachys. Zasledili smo tudi nekaj raziskav konkurenčnosti odnosov med glivami prostotrosnicami, ki povzročajo razkroj lesa (Holmer in sod., 1997; Boddy, 2000). Wardle in sod. (1993) so raziskovali medsebojne vplive med glivami v naravnih substratih, tj. v tleh in gozdnem opadu. Raziskave antagonizma so relativno pogoste, vendar študij, ki bi se ukvarjale specifično z vrstami, ki se pojavljajo v odmrlih vejah gorskega javorja in njihovim vplivom na E. parasitica, ni. 1.1.4 Obarvanje in razkroj lesa Les gorskega javorja in drugih vrst javorov je bele barve prek rumenkastobele do rahlo rdečkaste brez obarvane jedrovine. Lesa različnih vrst javorjev ne moremo zanesljivo razlikovati med seboj (Čufar, 2006). Traheje so v lesu razporejene difuzno oz. enakomerno s povprečnim premerom okoli 30 μm (Schumann in sod., 2019). Lahko so posamične ali v skupinah po 2 do 4 in imajo enostavne perforacije (Schoch in sod., 2004). Celične stene trahej so sestavljene iz srednje lamele (ML), primarne (P) in sekundarne (S) celične stene. Sekundarna stena se v nadaljevanju deli na tri sloje (S1, S2 in S3) glede na orientacijo mikrofibril. Celične stene v lesu so sestavljene iz osnovnih gradnikov oz. polimerov, tj. celuloze, hemiceluloze in lignina. V lesu je celuloze od 40 do 44 %, hemiceluloze 15 do 32 % in lignina 18 do 35 % (Goodell in sod., 2020). Celulozna vlakna dajejo lesu izjemno natezno trdnost. Lignin je zaradi raznolikosti povezovalnih vzorcev izjemno odporen proti 9 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 razkroju, ki ga "obvladajo" le določeni mikroorganizmi. Hemicelulozo pa lahko razumemo kot nekakšno povezavo med celulozo in ligninom, ki je najbolj občutljiva na razkroj med osnovnimi gradniki. Glive jo razkrojijo v začetnih fazah svojega delovanja (Goodell in sod., 2020). Celične stene trahej javorjev so na nekaterih mestih odebeljene (helikalne oz. spiralne odebelitve) (Čufar, 2006). Gostota trahej je od 150 do 160 n/mm2 (Schumann in sod., 2019). Parenhimske celice so razpršene, apotrahealne (niso v stiku s trahejami) ali občasno paratrahealne (razporejene okoli trahej). Trakovi so večinoma 3- do 6-redni (Schoch in sod., 2004). Les javorjev je trd in srednje gost (povprečna gostota 590 kg/m3), pri čemer je maklenov les nekoliko trši od lesa gorskega javorja. Les je homogen in podvržen okužbam z glivami in obarvanju oz. diskoloracijam (rjavo, zeleno, sivo, rumeno) (Čufar, 2006). Okužbe z glivami lahko poleg obarvanja lesa povzročajo tudi njegov razkroj. Poznamo več tipov trohnobnih gliv, ki razkrojujejo les: glive povzročiteljice rjave trohnobe, bele trohnobe in mehke trohnobe. Glive povzročiteljice rjave ali destruktivne trohnobe imajo encime predvsem za razkroj celuloze in hemiceluloze. Nerazkrojen lignin daje lesu značilno temno barvo, največkrat rjavo. Les razpada na lističe in prizme, izgubi trdnost, je lahek ter se drobi v prah (Schwarze in sod., 2000; Maček, 2008; Goodell in sod., 2020). Glive, ki povzročajo belo ali korozivno trohnobo, z encimi razgrajujejo predvsem lignin, manj pa celuloze in hemiceluloze. Zato dobi les belkasto ali rumeno barvo. Pri tem trohnenje ni enakomerno, zato se v lesu pojavljajo elipsaste lise. Delovanje omenjenih gliv lahko povzroči tudi do 97 % izgubo mase (Schwarze in sod., 2000; Maček, 2008; Goodell in sod., 2020). Glive povzročiteljice mehke trohnobe imajo encime predvsem za razkroj celuloze in hemiceluloze, manj učinkovite pa so pri razkroju lignina. Kemijsko gledano je ta tip trohnobe bolj podoben rjavim trohnobam. Posebnost mehkih trohnob je rast hif v celicah lesa in oblikovanje votlinic okoli hif v sekundarni celični steni (S2). Za les je značilna spužvasta tekstura (Schwarze in sod., 2000; Schwarze, 2007). Večina gliv, ki povzročajo mehko trohnobo, spada med zaprtotrosnice in se pojavljajo v ekstremnejših, vlažnejših razmerah, ki ne ustrezajo tradicionalnim glivam rjave oz. bele trohnobe. Večinoma so te glive omejene na nekaj zunanjih milimetrov lesa in so zanimiva mešanica značilnosti rjavih in belih trohnob (Goodell in sod., 2020). Ločevanje tipov trohnob je do neke mere subjektiven proces, ki ga v zadnjem času dojemamo bolj kot kontinuiteto (Riley in sod., 2014). Zagotovo pa so definirane kategorije uporabne pri splošnem razvrščanju delovanja trohnobnih gliv (Goodell in sod., 2020). Vsebnost vode v lesu posredno in neposredno vpliva na lastnosti lesa. Med neposrednimi so dimenzijske spremembe, med posrednimi pa vpliv vsebnosti vode na uspešnost naselitve in širjenja gliv v lesu (Goodell in sod., 2020). Najmanjša vsebnost vode v lesu za naselitev gliv je med 16 in 17 % (Zabel in sod., 2020). Vendar v večini primerov velja da mora biti vlažnost nad 25 %. Gre za t. i. točko nasičenja celičnih sten (angl. fiber saturation point), ko je vsa voda vezana v celične stene. Od 40 do 80 % vsebnosti vode je določen optimum za naselitev 10 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 gliv. Pri vsebnosti vode več kot 100 %, ko so z vodo nasičeni tudi lumni celic, pa se glive ne naseljujejo več na lesen substrat oz. vanj (Goodell in sod., 2020). Z anatomskimi značilnostmi lesa in pravili razkroja je povezano tudi širjenje gliv v gostiteljevem lesu. Pri E. parasitica naj bi se hife po vstopu glive v gostitelja na začetku najhitreje razraščale vertikalno v trahejah, pozneje pa še v lateralni smeri prek pikenj v celičnih stenah (French, 1967). Hitro napredovanje glive v vertikalni smeri je povezano z eliptično obliko raka, ki se navadno razvije na površini okuženega debla. Traheje in trakovi so po raziskavi, ki jo je opravil French (1967), najbolj občutljivi za prisotnost in razrast glive. Tam je namreč z mikroskopsko analizo najpogosteje opazil tudi hife E. parasitica. Gliva naj bi prodirala skozi celične stene vlaken (osnovno tkivo z mehansko funkcijo) in trahej, deloma tudi parenhimskih celic trakov. Celoten mehanizem razraščanja gliv v lesu je povezan z osnovnimi zakonitostmi sistema CODIT (angl. compartmentalization of decay in trees) (Shigo in Marx, 1977). Kompartmentalizacija razkroja v drevesu je preživetveni mehanizem in eden izmed najpomembnejših odzivov drevesa na mehanske poškodbe ali okužbe. Model opisuje tvorbo štirih pregrad oz. sten, ki omejujejo nadaljnji razkroj lesa v drevesu. Stena 1 omejuje širjenje razkroja v vzdolžni smeri z aspiracijo pikenj ali odlaganjem depozitov, ki blokirajo prevodne elemente. Odvisno od hitrosti tega mehanizma nastanejo krajši ali daljši kompartmenti oz. predelki. Stena 2 omejuje širjenje razkroja v radialni smeri in jo predstavlja gostejši pozni les v vsaki braniki. Stena 3 omejuje širjenje razkroja v tangencialni smeri s pomočjo trakov, ki niso enakomerno razporejeni po celotnem drevesu, zato je tudi stena na nekaterih mestih prekinjena. Stena 4 je močnejša in bolj lokalizirana različica stene 2. Gre za barierno cono, ki jo tvori kambij in ločuje tkiva, nastala pred poškodbo in po njej. "Moč" posameznih sten se veča od prve proti četrti (Shigo in Marx, 1977). Gliva E. parasitica povzroča obarvanje lesa in njegovo trohnenje. Razkroj lesne mase zaradi njenega delovanja na sladkornem, rdečem in srebrnem javorju je glede na podatke izredno počasna (French, 1967). Na splošno beležimo večje izgube mase v beljavi. Pri vseh treh vrstah javorja je po šestih mesecih izguba mase v jedrovini pri temperaturi 28 °C in konstantni vlažnosti znašala povprečno 1,29 %, v beljavi pa 2,47 % (French, 1967). Glede tipa trohnobe si raziskovalci niso enotni. Sinclair in sod. (1987) navaja, da E. parasitica povzroča počasno rjavo trohnobo, Worrall in sod. (1997) omenjajo mehko trohnobo, Pildain in sod. (2005) pa menijo, da vrste iz rodu Eutypella v začetku povzročajo mehko trohnobo, v nadaljevanju razkroja pa belo. Vsekakor ostaja vpliv E. parasitica na trohnenje naših najpogostejših domačih vrst javorjev (gorski javor, ostrolistni javor in maklen) neznan in ne raziskan. Okužbe z E. parasitica povzročajo veliko ekonomsko škodo, saj prizadenejo najvrednejši del debla (Kliejunas in Kuntz, 1974). Obolela drevesa imajo povprečno obarvanega in trohnečega 12 % skupnega volumna in 49 % prodajnega, kar pomeni polovično izgubo pri prodaji lesa na trgu (Gross, 1984b; Ogris in sod., 2005). Tudi Sendak in sod. (1997) so raziskovali vpliv E. parasitica na ekonomsko škodo in izračunali 0,33 11 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 m3/ha izgube skupnega volumna pri sladkornem javorju, kar so ugotovili s pomočjo vizualno ocenjenega razreda razkroja lesa. Nekaj raziskav razkroja lesa z Eutypella sp. so izvajali tudi na drugih drevesnih vrstah. Pildain in sod. (2005) so na primer proučevali razkroj lesa ameriškega črnega topola ( Populus deltoides W. Bartram ex Marshall) v 12-tedenskem poskusu s štirimi izolati vrst iz rodu Eutypella. Povprečna izguba mase je znašala 17,6 %. Worrall in sod. (1997) pa so proučevali razkroj beljave rumene breze ( Betula alleghaniensis Britto) in bora ( Pinus taeda L.). V poskus so vključili tudi izolate E. parasitica in po dvanajsti tednih ugotovili 5,6 % izgubo mase pri brezi in 2,3 % izgubo pri boru. Les javorjev dosega visoke cene. Že nekaj let zapored je gorski javor najbolje ocenjen na dražbi vrednejšega lesa v Slovenj Gradcu (Katalog sortimentov, 2017, 2019, 2020). Včasih ima namreč les zaradi različnih zunanjih vplivov posebno teksturo (javor ikraš, javor rebraš in ptičji javor), zaradi česar je še posebno dragocen (Brus, 2008). Tudi s tega vidika je dobro večjo pozornost nameniti raziskavam na področju razvrednotenja zaradi delovanja E. parasitica. Gliva E. parasitica je relativno slabo raziskana vrsta. Poleg osnovnih starejših severnoameriških študij (Davidson in Lorenz, 1938; French, 1967; French, 1969; Lachance in Kuntz, 1970; Lachance, 1971; Kliejunas in Kuntz, 1972, 1974; Johnson in Kuntz, 1976, 1979; Glawe, 1983; Gross, 1984a, 1984b; Sendak in sod., 1997) in poznejših poročil o novih najdbah iz evropskih držav (Cech, 2007; Ogris in sod., 2008; Cech in sod., 2016; Jurc in sod., 2016; Černý in sod., 2017; Bregant, 2018; Jurc in sod., 2019; Dubach in sod., 2022) ni novejših člankov, ki bi obravnavali biološke in ekološke značilnosti omenjene vrste. Pomanjkanje raziskav in želja po novih odkritjih sta bila glavna povoda za nastanek tega dela. 1.2 PREDSTAVITEV NAMENA, CILJEV IN HIPOTEZ Naš glavni namen je bil raziskava izbranih področij biologije vrste E. parasitica, ki povzroča javorov rak, njenega vpliva na izgubo mase lesa treh vrst javorjev in odnosov z drugimi najpogostejšimi vrstami gliv, ki se pojavljajo v odmrlih vejah gorskega javorja. Z raziskavo smo skušali pridobiti razširjeno znanje o vrstah gliv in raziskati njihov vpliv na uspešnost naselitve in razrasti E. parasitica v odmrlih vejah gorskega javorja. Z raziskavo smo želeli odkriti in predlagati nove, biološke načine za zatiranje javorovega raka, kar bi bilo lahko zanimivo in uporabno ne le za Slovenijo, temveč tudi za širše območje Evrope in Severne Amerike, kjer se bolezen pojavlja. Ker E. parasitica navadno poškoduje spodnji in s tem tudi najdebelejši najvrednejši sortiment, smo želeli z rezultati raziskave o izgubi mase lesa pripomoči tudi k boljšemu razumevanju vpliva glive na ekonomsko in tehnično razvrednotenje okuženih javorjev. 12 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 V okviru doktorske disertacije smo v ta namen postavili raziskovalne cilje. Cilj 1: Določiti najpogostejše vrste gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja na petih lokacijah v okolici Ljubljane. Cilj 2: Izmeriti vpliv desetih najpogostejših vrst gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja na rast glive E. parasitica v čisti kulturi in ugotoviti njihov morebitni antagonizem. Cilj 3: Ugotoviti izgubo lesne mase treh vrst javorjev ( Acer pseudoplatanus, A. platanoides, A. campestre) zaradi delovanja glive E. parasitica po metodi mini-blok, ki temelji na standardu SIST EN 113:2002, in primerjati rezultate z izolati gliv Trametes versicolor, Gloeophyllum trabeum in s petimi najpogostejšimi glivami, ki povzročajo trohnobo v javorjevih odmrlih vejah. Znotraj posameznih ciljev smo postavili tudi raziskovalne hipoteze. Hipoteza 1: Glivne združbe v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( A. pseudoplatanus) se značilno razlikujejo med različnimi lokacijami vzorčenja v osrednji Sloveniji (Rožnik, Smrekovec, Mokrc, Mala voda, Samotorica), med različnima mestoma izolacije (veja, deblo) in med različnimi debelinskimi razredi vej (od 0,2 do 0,7 cm, od 0,8 do 1,2 cm, od 1,3 do 3,2 cm). Hipoteza 2: Vrednost Shannonovega diverzitetnega indeksa vrst gliv izoliranih iz lesa odmrlih vej gorskega javorja ( A. pseudoplatanus) med različnimi lokacijami vzorčenja v osrednji Sloveniji (Rožnik, Smrekovec, Mokrc, Mala voda, Samotorica), med različnima mestoma izolacije (veja, deblo) in med različnimi debelinskimi razredi vej (od 0,2 do 0,7 cm, od 0,8 do 1,2 cm, od 1,3 do 3,2 cm) je višja od 3. Hipoteza 3: Gliva E. parasitica je v čisti kulturi šibko konkurenčna desetim najpogosteje izoliranim vrstam gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( A. pseudoplatanus). Hipoteza 4: Gliva E. parasitica povzroči manjše izgube lesne mase gorskega javorja ( A. pseudoplatanus), ostrolistnega javorja ( A. platanoides) in maklena ( A. campestre) v primerjavi z glivama razkrojevalkama Trametes versicolor in Gloeophyllum trabeum. 13 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2 ZNANSTVENA DELA 2.1 Eutypella parasitica IN DRUGE POGOSTO IZOLIRANE VRSTE GLIV IZ LESA ODMRLIH VEJ MLADIH GORSKIH JAVORJEV ( Acer pseudoplatanus) V SLOVENIJI Brglez A., Piškur B., Ogris N. 2020. Eutypella parasitica and other frequently isolated fungi in wood of dead branches of young sycamore maple ( Acer pseudoplatanus) in Slovenia. Forests, 11, 4: 467, doi: 10.3390/f11040467: 18 str. Eutypella parasitica R. W. Davidson and R. C. Lorenz je povzročiteljica javorovega raka, uničujoče bolezni javorjev v Evropi in Severni Ameriki. Gliva E. parasitica okuži gostiteljevo deblo prek odmrlih vej ali ran v skorji. Zaradi morebitnega vpliva glivne združbe na okužbo in razrast E. parasitica smo na petih vzorčnih lokacijah v Sloveniji proučili sestavo gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus L.). Od novembra 2017 do marca 2018 smo na vsaki vzorčni lokaciji nabrali 40 vzorcev vej. Izolacije smo izvedli iz lesa v zunanjem delu odmrle veje in iz razbarvanega lesa v deblu, ki je izviral iz odmrle veje. Čiste kulture smo razvrstili v morfotipe in izbrali po eno reprezentativno kulturo za morfotip za nadaljnjo molekularno določitev. Iz skupno 2700 nacepljenih koščkov se je razvilo 1744 glivnih kultur, ki smo jih razvrstili v 212 morfotipov. V preiskovanih vzorcih so bile najpogosteje izolirane vrste Eutypa maura (Fr.) Sacc., Eutypa sp. Tul. and C. Tul., Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., Neocucurbitaria acerina Wanas., Camporesi, E.B.G. Jones and K.D. Hyde in E. parasitica. V raziskavi smo ločevali med vrstno pestrostjo in združbo gliv. Razlike v pestrosti glivnih vrst med petimi vzorčnimi lokacijami niso bile statistično značilne, prav tako se tudi debelina vej ni izkazala za statistično značilen dejavnik vrstne pestrosti gliv. Kljub temu so relativno nizke vrednosti Jaccardovega indeksa podobnosti kazale na morebitne razlike v združbi gliv med različnimi vzorčnimi lokacijami. Analiza podobnosti je pokazala, da se izolirane združbe gliv statistično značilno razlikujejo med petimi vzorčnimi lokacijami in med različnimi mesti izolacije. Eutypella parasitica smo izolirali iz vseh petih vzorčnih lokacij, čeprav smo javorove rake opazili le na treh lokacijah, kar kaže na možnost asimptomatskih okužb. To delo je na voljo z licenco Creative Commons Priznanje avtorstva 4.0 Mednarodna. 14 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 15 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 16 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 17 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 18 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 19 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 20 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 21 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 22 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 23 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 24 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 25 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 26 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 27 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 28 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 29 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 30 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 31 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 32 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.2 In vitro INTERAKCIJE MED Eutypella parasitica IN NEKATERIMI POGOSTO IZOLIRANIMI GLIVAMI IZ LESA ODMRLIH VEJ GORSKEGA JAVORJA ( Acer pseudoplatanus) Brglez A., Piškur B., Ogris N. 2020. In vitro interactions between Eutypella parasitica and some frequently isolated fungi from the wood of the dead branches of young Sycamore Maple ( Acer pseudoplatanus). Forests, 11, 10: 1072, doi: 10.3390/f11101072: 12 str. Za oceno in vitro antagonistične aktivnosti desetih najpogosteje izoliranih gliv iz lesa odmrlih vej Acer pseudoplatanus L. na Eutypella parasitica R. W. Davidson and R. C. Lorenz, povzročiteljico uničujoče bolezni javorjev v Evropi in Severni Ameriki, smo naredili teste dvojnih kultur. Testirali smo t. i. izzivalne izolate gliv Diaporthe sp., Eutypa sp., Eu. maura, E. parasitica, Fusarium avenaceum, Neocucurbitaria acerina, Neonectria sp., Peniophora incarnata, Petrakia irregularis in Phomopsis pustulata. Antagonistični potencial posameznega izolata smo ocenili z izračunom antagonističnega indeksa ( AI), ki temelji na tipu interakcije v dvojnih kulturah. Rezultat tekmovanja med glivnimi izolati smo opredelili po reizolacijah iz interakcijske cone ( s). V dvojnih kulturah sta bila opazna dva glavna tipa interakcij: zaustavitev rasti kot posledica medsebojnega zaviranja po micelijskem stiku ali brez njega, in zamenjava, ki se odraža v zaviranju rasti E. parasitica, čemur sledi delno preraščanje z micelijem izzivalnega izolata. S statistično analizo smo ugotovili statistično značilne razlike v povprečni vrednosti AI in s med izzivalnimi izolati v dvojnih kulturah. Na podlagi rezultatov antagonističnega indeksa so imele Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp. in P. incarnata največji zaviralni učinek na rast E. parasitica in smo jih prepoznali kot najboljše kandidate za nadaljnje študije o biološki kontroli E. parasitica. Micelij E. parasitica v interakcijski coni je večinoma ostal aktiven, razen v dvojnih kulturah z Eutypa sp., F. avenaceum in Neonectria sp., kjer reizolacije E. parasitica niso bile uspešne. Na podlagi rezultatov predvidevamo, da je E. parasitica šibek tekmec, ki vlaga manj energije v neposredno micelijsko tekmovanje. Razpravljamo o potencialu opazovanih antagonistov kot možne biološke kontrole javorovega raka. Kljub vsemu so potrebni dodatni poskusi za trdne zaključke o konkurenčni sposobnosti E. parasitica in uporabnosti antagonistov za biološko kontrolo. To delo je na voljo z licenco Creative Commons Priznanje avtorstva 4.0 Mednarodna. 33 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 34 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 35 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 36 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 37 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 38 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 39 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 40 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 41 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 42 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 43 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 44 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 45 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.3 VPLIV Eutypella parasitica NA RAZKROJ LESA TREH VRST JAVORJEV Brglez A., Piškur B., Humar M., Gričar J., Ogris N. 2020. The effect of Eutypella parasitica on the wood decay of three maple species. Forests, 11, 6: 671, doi: 10.3390/f11060671: 18 str. Eutypella parasitica R. W. Davidson and R. C. Lorenz je povzročiteljica javorovega raka, uničujoče bolezni javorjev v Evropi in Severni Ameriki. Znano je, da gliva E. parasitica povzroča obarvanje in razkroj lesa, vendar ni znano, kako uspešna je pri razkroju najbolj razširjenih vrst javorjev v Evropi. Na podlagi prilagojenega standarda EN 113 smo vzorce lesa Acer pseudoplatanus L., A. platanoides L. in A. campestre za primerjavo izpostavili štirim izolatom E. parasitica in devetim drugim glivnim vrstam. Po 15-tedenski inkubaciji sta izguba mase in mikroskopska analiza vzorcev pokazali dobro razraščanje glivnih vrst ter različne potenciale razkroja lesa. Odkrili smo statistično značilno pozitivno povezavo med izgubo mase in vsebnostjo vode pri vseh vrstah gliv. Podobno dobro povezani sta bili tudi izmerjena debelina celičnih sten in izguba mase vzorcev. V povprečju so glive povzročile najmanjšo izgubo mase pri vzorcih A. pseudoplatanus (10,0 %) in največjo pri vzorcih A. campestre (12,6 %). Med vzorci, ki so bili izpostavljeni izolatom E. parasitica, je bila največja izguba mase evidentirana pri A. pseudoplatanus (6,6 %). Statistična analiza je pokazala tudi značilne razlike v izgubi mase in vsebnosti vode med različnimi izolati E. parasitica. Na podlagi razbarvanja razpravljamo o tipu trohnobe, ki ga povzroča E. parasitica. Čeprav so izolati E. parasitica povzročili manjšo izgubo mase vzorcev v primerjavi z drugimi, učinkovitejšimi vrstami, ne smemo zanemariti njene sposobnosti razkroja lesa javorjev. Ker E. parasitica po navadi okuži nižje dele debla, ki so hkrati najdebelejši in najvrednejši deli drevesa, lahko vsaka tovrstna poškodba povzroči znatno ekonomsko izgubo. To delo je na voljo z licenco Creative Commons Priznanje avtorstva 4.0 Mednarodna. 46 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 47 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 48 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 49 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 50 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 51 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 52 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 53 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 54 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 55 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 56 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 57 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 58 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 59 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 60 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 61 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 62 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 63 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 64 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3 RAZPRAVA IN SKLEPI 3.1 RAZPRAVA 3.1.1 Združbe gliv, ki se pojavljajo na odmrlih vejah gorskega javorja Kot prvi del raziskave in osnova za nadaljevanje dela je služil naš prvi cilj: Določiti najpogostejše vrste gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja na petih lokacijah v okolici Ljubljane. S pomočjo Zavoda za gozdove Slovenije smo poiskali primerne lokacije z zadostnim številom mladih gorskih javorjev. Pri izbiri lokacij nas v osnovi ni zanimala prisotnost E. parasitica v sestoju ali bližnji okolici, temveč zgolj najpogostejše vrste gliv, ki se pojavljajo v lesu odmrlih vej gorskega javorja. Združba gliv bi namreč lahko neposredno ali posredno vplivala na okužbe in rast E. parasitica. Z izolacijami iz lesa odmrlih vej gorskega javorja smo zabeležili pester izbor glivnih vrst. Najpogosteje izolirane vrste so bile Eutypa maura (Fr.) Sacc., Eutypa sp. Tul. and C. Tul., Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., Neocucurbitaria acerina Wanas., Camporesi, E.B.G. Jones and K.D. Hyde in E. parasitica. Opozoriti velja, da je dejanskih vrst v lesu odmrlih vej gorskega javorja zagotovo precej več in da so v vzorcih zagotovo tudi druge, neprepoznane, vrste (Wu in sod., 2019). Zaradi časovne in finančne omejitve smo se omejili le na določitev najpogosteje izoliranih morfotipov, tj. vrst, ki so bile identičnega makromorfološkega videza. Pri razvrščanju kultur v morfotipe smo bili pozorni na obliko, privzdignjenost, rob in barvo kulture ter morebitne posebnosti. Na tak način smo določili le vrste z najhitrejšo rastjo in tiste, ki so sposobne rasti v uporabljenih razmerah izolacije in inkubacije. Določitev morfotipov na podlagi makromorfoloških lastnosti kolonij je sicer časovno hitrejša, kot je razločevanje z mikroskopijo ali drugimi tehnikami, vendar pa ima tudi svoje slabosti: obstaja namreč tveganje, da ne zaznamo določenih, t. i. kriptičnih vrst. To so vrste, ki imajo identične morfološke značilnosti, vendar se razlikujejo v genetskem zapisu (Balasundaram in sod., 2015). Z večanjem debeline odmrlih vej gorskega javorja se je v naši raziskavi večalo tudi povprečno število izoliranih vrst. Ker bi bile debelejše veje lahko tudi starejše, sledi logičen zaključek o večjem številu glivnih vrst na starejših vejah. Vendar pa v sklopu tega cilja nismo ugotavljali starosti in raziskovali vpliva starosti vej na vrstno pestrost gliv. Predvidevamo, da v naši raziskavi starost ni "moteč" dejavnik, saj so bila vsa drevesa približno enake starosti (do deset let) in tako se tudi debelina oz. starost vej ni značilno spreminjala. To potrjuje tudi dejstvo, da so bile razlike v povprečnem številu vrst med različnimi debelinskimi razredi vej neznačilne. Smo pa z izračunom Jaccardovega indeksa podobnosti (CJ) med glivnimi združbami različnih debelinskih razredov vej odkrili relativno visoko povprečno vrednost – 0,80. V raziskavi smo med 91 morfološko izbranimi morfotipi z molekularnimi metodami določili 58 taksonov. Lokacije vzorčenj so si bile relativno blizu (največja zračna razdalja 26 km), kar kaže na veliko pestrost glivnih vrst. V literaturi smo iskali razloge za relativno veliko 65 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 pestrost v številu vrst v primerjavi z drugimi raziskavami (Butin in Kowalski, 1986; Chlebicki, 1988; Kowalski in Kehr, 1992; Unterseher in sod., 2005; Johnova, 2009) in ugotovili, da gre najverjetneje za kombinacijo ugodnejše geografske lokacije, podnebnih značilnosti, starosti in velikosti vzorcev, metode sterilizacije in različnih mest izolacije (Danti in sod., 2002; Tedersoo in sod., 2014). Med prepoznanimi glivami so se za dominantne vrste v odmrlih vejah gorskega javorja izkazale Eu. maura, Eutypa sp. 2, F. avenaceum, N. acerina in E. parasitica. Samo Eu. maura se pojavlja tudi v drugih raziskavah, preostale vrste pa so specifične za naše rezultate. Iz treh vzorcev v naši raziskavi so bile izolacije neuspešne, sicer pa smo določili širok spekter glivnih vrst. Večinoma so prepoznane vrste spadale med zaprtotrosnice (Ascomycota) in prostotrosnice (Basidiomycota) (Butin in Kowalski, 1986; Kowalski in Kehr, 1992). V več kot 20 % vzorcev sta se pojavili le dve vrsti ( Eu. maura in F. avenaceum). Nekoliko neznačilna, vendar razumljiva je bila izolacija Eutypa sp. 3, Eu. maura, Daldinia sp. Ces. & De Not. in Dendryphion europaeum Crous & R.K. Schumach. iz kontrolnih vzorcev. Domnevamo, da je razlog v njihovi endofitski življenjski strategiji. Večina gliv, ki smo jih določili, je sicer znanih saprofitov. Med najpogosteje prepoznanimi rodovi je bil rod Eutypa spp. z vrstama Eu. maura in Eu. lata Tul. & C. Tul. Eutypa maura je precej razširjena in pogosto dominantna vrsta odmrlih poganjkov in vej. Njena stroma lahko hitro preraste površino vej in drugim sekundarnim glivam onemogoči uspešno naselitev substrata (Unterseher in Tal, 2006). Eutypa lata je svetovno razširjen patogen različnih lesnatih rastlin (Trouillas in Gubler, 2010; Wenneker in sod., 2011; Travadon in sod., 2012). Najbolj znana je kap vinske trte oz. evtipoza, ki jo povzroča na Vitis vinifera L. (Rolshausen in sod., 2008; Trouillas in Gubler, 2010; Lešnik in Mešl, 2021). Obstaja pa tudi posebna varieteta Eu. lata na lesu in skorji maklena ter gorskega javorja, ki jo je opisal Rappaz (1987) v Franciji in Švici. Med pogosto izoliranimi vrstami je bila tudi F. avenaceum, ki spada med najpogostejše vrste iz rodu Fusarium v zmernih podnebnih razmerah, in povzroča padavico kalčkov lesnatih rastlin ter trohnobo korenin, stebel in plodov žit ter stročnic (Maček, 2008; Peters in sod., 2008; Sørensen in sod., 2009). Omenimo lahko še eno izmed petih najpogosteje izoliranih vrst – N. acerina. To je vrsta, ki so jo opisali leta 2017 in živi kot endofit ali saprofit na maklenu, našli pa so jo na odmrlih maklenovih poganjkih v Italiji. Neocucurbitaria acerina so predlagali kot mogočo spolno obliko Pyrenochaeta quercina Kabát & Bubák (Wanasinghe in sod., 2017). Med petimi najpogosteje izoliranimi vrstami gliv iz lesa odmrlih vej gorskega javorja je bila tudi povzročiteljica javorovega raka, E. parasitica. Zanimiv in po svoje presenetljiv rezultat so izolacije E. parasitica iz vzorcev z vseh lokacij, čeprav na dveh (Mokrc in Samotorica) pri inventuri nismo opazili razvitih rakov (Slika 6). Na lokaciji Rožnik je bilo kar 45 % vzorčenih dreves okuženih z E. parasitica, vendar vsa drevesa niso kazala znakov okužbe. V povprečju je bilo na posamezni lokaciji okuženih 19 % vzorčenih dreves, kar se sklada z rezultati drugih raziskovalcev, ki navajajo povprečno 3–5 % oz. do 30 % pojavnost bolezni 66 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 v sestojih (Gross, 1984b; Ogris in sod., 2009). Glede na rezultate izolacij in inventure je E. parasitica očitno bolj razširjena, kot je bilo znano doslej. Verjetno je bila bolezen enostavno spregledana, saj ni sistematičnega monitoringa in je mlade okužbe težko opaziti (Jurc in sod., 2016). Morda gre za sposobnost glive, da povzroči asimptomatske okužbe ali zmožnost saprofitskega načina prehranjevanja ali pa za katere druge neznane razloge. Slika 6: Lokacije inventure in vzorčenja (zelena barva označuje prisotnost javorovega raka, rdeča barva pa odsotnost javorovega raka). Figure 6: Monitoring and sampling sites (green indicates the presence of Eutypella canker, red indicates the absence of Eutypella canker). S statističnimi izračuni nismo ugotovili značilnih razlik v pestrosti vrst in glivnih združbah med vzorci z E. parasitica ali brez nje. Nobena izmed najpogosteje izoliranih vrst ni bila strogo povezana s pojavnostjo E. parasitica. Ugotovili smo pogostejše izolacije E. parasitica iz razbarvanega lesa v deblu kot iz zunanjega dela odmrle veje. Predvidevamo, da je v zunanjem delu odmrle veje velika konkurenca, zaradi katere E. parasitica hitro napreduje v les debla in jo v zunanjem delu veje nadomestijo druge, konkurenčnejše vrste. Razlike v 67 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 združbi gliv med različnimi mesti izolacije niso nič nenavadnega, saj gre za drugačen substrat in razmere, v katerih vrste rastejo in se razvijajo. Rezultati naše raziskave kažejo na izjemno veliko pestrost prepoznanih vrst v lesu odmrlih vej gorskega javorja. Shannonov diverzitetni indeks (H´) je znašal 3,01–3,30 (p = 0,076) med različnimi lokacijami vzorčenja, 3,51–3,59 (p = 0,212) med različnimi mesti izolacije in 3,56–3,71 (p = 0,822) med različnimi debelinskimi razredi vej. Po navadi so vrednosti Hód 1,5 do 3,5 in le redko presežejo 4,0 (Magurran, 2004). Vrednosti H´ pri drugih drevesnih vrstah v tujih študijah so precej nižje od vrednosti, ki smo jih izračunali v naši raziskavi: 0,21–0,80 v tkivih Quercus robur L. in Q. cerris L. (Gennaro in sod., 2003) ter 1,28–2,11 pri Ulmus macrocarpa Hance, Q. liaotungensis Koidz. in Betula platyphylla Sukaczev (Sun in sod., 2012). Podobnost združb gliv med različnimi lokacijami vzorčenja je bila relativno majhna (0,59) v primerjavi s Kowalski in Kehr (1992), ki sta izračunala vrednosti 0,65–0,92 med živimi in odmrlimi debli ter poganjki Fraxinus excelsior L. Prepoznane glivne združbe so se značilno razlikovale med lokacijami vzorčenja, med mesti izolacije v vejah in med debelinskimi razredi vej (p < 0,003). Na sestavo, številčnost, in razporeditev gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja lahko vplivajo številni dejavniki (Kowalski in Kehr, 1992; Danti in sod., 2002; Gennaro in sod., 2003; Unterseher in sod., 2005; Unterseher in Tal, 2006; Kowalski in sod., 2016; Hanácková in sod., 2017): • gostitelj (gostiteljevo splošno zdravstveno stanje, stopnja razkroja vzorcev, starost dreves in vej, debelina vej), • okolje (temperatura, padavine, značilnosti tal, razpoložljivost vode, drevesna sestava, rastlinska združba), • značilnosti vzorčenja, izolacije in inkubacije (čas vzorčenja, metoda izolacije, posplošene inkubacijske razmere). Po predvidevanjih E. parasitica izhaja iz Severne Amerike in so jo v Evropo prinesli s sadikami okrasnega drevja (Ogris in sod., 2006). Da bi ugotovili natančnejši izvor vrste in določene populacijske značilnosti, bi bilo v prihodnje smiselno razmišljati o izvedbi populacijskih študij E. parasitica. Na to temo že poteka študija v sklopu magistrskega dela študenta biotehnologije (Marinč, neobjavljeno), katerega preliminarni rezultati kažejo na razlike med evropsko in severno ameriško populacijo E. parasitica. Z našo prvo raziskavo smo določili najpogostejše vrste gliv v odmrlih vejah gorskega javorja na petih lokacijah v okolici Ljubljane, kar nam je služilo kot osnova za nadaljnje raziskovanje medvrstnih vplivov in hitrosti razkroja lesa, o čemer razpravljamo v nadaljevanju. 68 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3.1.2 Konkurenčnost gliv in morebiten antagonizem Vrste, ki smo jih izolirali in določili v naši raziskavi, so večinoma znani saprofiti listavcev. Ker se v našem delu usmerjamo na E. parasitica, je še posebno zanimiva prepoznava hiperparazitov Eutypella spp. in Eutypa spp., ki bi jih lahko potencialno uporabili za biološko kontrolo. S tega vidika je treba omeniti določitev naslednjih vrst: Bloxamia sp., Cosmospora sp. in Pseudocosmospora rogersonii. Pseudocosmospora rogersonii je v ZDA prepoznana kot mikoparazit Eutypella spp. (Herrera in sod., 2013). Podobno velja tudi za Cosmospora spp., ki parazitira vrste iz reda Xylariales (Herrera, 2014). Bloxamia truncata pa se pojavlja na delno razkrojeni stromi Eutypella spp., zato so raziskovalci predlagali študijo njene potencialno mikoparazitske aktivnosti (Glawe, 1984). Z obdelavo podatkov najpogosteje izoliranih vrst nismo ugotovili značilnih razlik v vrstni pestrosti in združbi gliv med vzorci z E. parasitica in brez nje. To lahko kaže na dejstvo, da najpogosteje izolirane vrste ne zavirajo ali spodbujajo njene rasti. Da bi podrobneje proučili njihov vpliv, smo določili naslednji raziskovalni cilj: Izmeriti vpliv desetih najpogostejših vrst gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja na rast glive E. parasitica v čisti kulturi in ugotoviti njihov morebitni antagonizem. Predvidevali smo, da je gliva, ki povzroča javorov rak, manj konkurenčna drugim glivam, ki se prav tako pojavljajo v odmrlih vejah, saj bi bil v nasprotnem primeru javorov rak verjetno pogostejši. Zaviralni učinek desetih najpogosteje izoliranih vrst gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja na izolat E. parasitica smo raziskali s testom dvojnih kultur. Izzivalni izolati, ki smo jih uporabili v dvojnih kulturah, so se večinoma izkazali za šibke antagoniste (vrednosti antagonističnega indeksa; AI < 10), razen Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp. in P. incarnata s srednjimi vrednostmi AI (10–15). Glede na kategorije, ki so jih oblikovali Badalyan in sod. (2002), nismo odkrili visoko aktivnih antagonistov (AI > 15) E. parasitica. Zaradi v določenih primerih zelo podobnega makroskopskega videza kultur je bilo težko določiti tip interakcije in izbrati izolat, ki je preraščal drugega. Posebno nehvaležno je bilo razlikovanje med ustavitvijo rasti po stiku micelijev (tip A) in ustavitvijo rasti na razdalji brez stika micelijev (tip B). Pri določanju tipa interakcije smo sledili klasifikaciji, ki so jo razvili Badalyan in sod. (2002) in poleg že omenjenega tipa A in B razlikovali še tip C. V ta sklop so bile uvrščene dvojne kulture, kjer smo določili, da je eden izmed izolatov delno ali v celoti prerasel drugega (podtipi CA1, CA2, CB1 in CB2). Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp. in P. incarnata so bili edini izolati, ki so prerasli E. parasitica. V primeru dvojnih kultur E. parasitica in Diaporthe sp. ter N. acerina smo opazili različne tipe interakcij znotraj istih obravnavanj, o čemer poročajo tudi drugi raziskovalci (Rayner in sod., 1994; Kusari in sod., 2013; Hanácková in sod., 2017; Rezgui in sod., 2018). Eutypella parasitica ni prerasla nobenega od izzivalnih izolatov, kar nakazuje na njeno relativno neagresivnost in šibko tekmovalnost v primerjavi z izzivalnimi izolati. Slednje je 69 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nakazala že predhodna raziskava najpogosteje izoliranih vrst gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja. Ugotovili smo namreč pogostejše izolacije E. parasitica iz debla, kar je posledica velike konkurence v zunanjem delu odmrle veje, zaradi česar gliva hitro napreduje v les debla. Reizolacije iz dvojnih kultur niso bile vedno uspešne (primer dvojne kulture z F. avenaceum in P. incarnata). Če smo iz interakcijske cone reizolirali obe vrsti, smo predvidevali manjšo konkurenčnost izzivalnega izolata. Ko je uspela samo reizolacija izzivalnega izolata, pa smo predvidevali, da je bila E. parasitica v interakcijski coni premagana in sklepali na večjo tekmovalno uspešnost izzivalnega izolata. V primeru večje uspešnosti smo beležili višje vrednosti uspešnosti reizolacij (s) in obratno. Negativne vrednosti uspešnosti reizolacij smo izračunali v primeru dvojnih kultur z Diaporthe sp., N. acerina in Pe. irregularis, kar kaže na njihov manjši tekmovalni uspeh. Pri reizolacijah iz interakcijske cone tipa A smo večinoma uspešno reizolirali oba testna izolata, občasno celo iz istega koščka. Podoben rezultat je v literaturi (Koukol in sod., 2006) omenjen tudi za reizolacije iz interakcijske cone tipa B. V naši raziskavi smo sicer le v 20 % primerov reizolirali oba izolata, v preostalih primerih pa je bila uspešna samo reizolacija E. parasitica. Z reizolacijami smo ugotovili, da je ostal micelij E. parasitica v interakcijski coni večinoma aktiven (tudi v primeru delnega preraščanja s P. incarnata), razen v dvojnih kulturah z Eutypa sp., F. avenaceum in Neonectria sp., kjer reizolacije E. parasitica niso bile uspešne. Iz tega lahko sklepamo, da je E. parasitica šibek tekmec, ki vlaga manj energije v neposredno micelijsko tekmovanje z omenjenimi tremi izolati (Koukol in sod., 2006). Če na kratko povzamemo naše ugotovitve glede in vitro interakcij, lahko na podlagi vrednosti antagonističnega indeksa (AI) zaključimo, da so Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp. in P. incarnata značilno negativno vplivale na rast E. parasitica v dvojni kulturi. Rezultati se dobro ujemajo tudi s pričakovano visoko uspešnostjo reizolacij izzivalnih izolatov iz interakcijske cone. Na podlagi uspešnosti reizolacij (s) sta se Eutypa sp. in Neonectria sp. izkazali za dobra inhibitorja rasti E. parasitica. Reizolacije E. parasitica iz interakcijske cone so bile neuspešne, kar lahko pomeni, da sta jo izzivalna izolata premagala. Podoben učinek v dvojnih kulturah sta imeli tudi Eu. maura in P. incarnata, kjer smo izračunali visoke vrednosti AI in s. V interakcijskih conah omenjenih dvojnih kultur smo opazili nekoliko makroskopsko spremenjen micelij, kar je lahko prvi znak premoči in nadomestitve testnega izolata E. parasitica. Na drugi strani sta imeli N. acerina in Diaporthe sp. relativno nizek in neznačilen AI ter s tem povezane tudi nižje vrednosti s, kar kaže na večji tekmovalni uspeh E. parasitica v primeru omenjenih interakcij in vitro. Dvojne kulture E. parasitica in F. avenaceum z nizkim inhibitornim učinkom in nizko uspešnostjo reizolacij izzivalnega izolata so dober pokazatelj kompleksnosti interspecifičnih interakcij, ki lahko občasno postrežejo z nenavadnimi in nepričakovanimi rezultati (Yuen in sod., 1999). 70 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Izolati gliv Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp. in P. incarnata so se torej izkazali za najbolj obetavne za uporabo v sklopu biološke kontrole E. parasitica, vendar pa pri tem ne smemo pozabiti na potrebo po dodatnih raziskavah. Pri interpretaciji in posploševanju pridobljenih rezultatov moramo biti izjemno previdni. V prihodnje bi bilo priporočljivo zasnovati dodatne teste z več ponovitvami in s širšim naborom izolatov E. parasitica. V poskus bi lahko kot izzivalne izolate vključili tudi: Bloxamia sp., Cosmospora sp. in Pseudocosmospora rogersonii, ki jih v literaturi omenjajo kot potencialne antagoniste. Dodatno bi lahko raziskali tudi sekundarne metabolite in njihov vpliv na antagonistično aktivnost. Med interspecifičnimi interakcijami namreč nastajajo in sproščajo številne bioaktivne snovi (Yuen in sod., 1999; Prior in sod., 2017), ki lahko zavirajo rast, vplivajo na pigmentacijo v interakcijski coni, barvo kolonije ipd. (Asthana in Shearer, 1990; White in Boddy, 1992; Yuen in sod., 1999; Badalyan in sod., 2002, 2004; Evans in sod., 2008). Za vrste, ki proizvajajo malo sekundarnih metabolitov, velja, da so manj tekmovalne, ne izrabljajo dobro prostora in imajo manjši antagonistični potencial (Yuen in sod., 1999). Načeloma velja, da klimaksne vrste proizvajajo več antagonističnih substanc, so zato bolj tekmovalne in uspešneje zavirajo rast vrst, ki se pojavijo v začetku sukcesije (Yuen in sod., 1999). Smiselno bi bilo raziskati tudi interakcije v naravnem okolju, kar pa že presega cilj te raziskave. V laboratoriju namreč ni mogoče zagotoviti razmer, enakovrednih tistim v naravi – inokulacijski potencial, uspešnost kalitve, mikroklima, celotna združba gliv, naraven substrat ipd. (Yuen in sod., 1999; Boddy, 2000). So pa zagotovo testi v laboratoriju prvi korak k razumevanju interakcij in iskanju potencialno učinkovitih strategij biološke kontrole (Yuen in sod., 1999). Raziskave biološke kontrole bolezni dreves oz. lesnatih rastlin so relativno redke v primerjavi s tistimi na zelnatih, enoletnih rastlinah. Kompleksnost razvitja učinkovitih metod biološke kontrole je posledica velike biomase, zapletene anatomije, dolgoživosti in posebnosti gospodarjenja z gozdovi (Cazorla in Mercado-Blanco, 2016). Kljub omejitvam so raziskovalci razvili nekaj praktičnih ukrepov biokontrole, ki se v večini primerov osredotočajo na mlajša drevesa, po navadi v fazi sadik v drevesničarski proizvodnji (Cazorla in Mercado-Blanco, 2016). Vprašanje, ki se pojavi na tem mestu, je, ali je mogoče tovrstne ukrepe učinkovito uporabiti tudi na odraslih osebkih, v naravnih razmerah in na velikih površinah. Dodaten pomislek je tudi ekonomičnost takih ukrepov (Cazorla in Mercado-Blanco, 2016). Hardoim in sod. (2015) kot zanimivo in uporabno možnost biološke kontrole navajajo uporabo endofitnih organizmov. Njihova prilagodljivost in vzdržljivost sta najpomembnejši lastnosti, ki omogočata potencialno uporabo v okviru vzdrževanja zdravja gozdov (Pautasso in sod., 2015). V gozdni fitopatologiji že obstaja nekaj uspešnih zgodb biološke kontrole, npr. uporaba Verticillium alboatrum Reinke & Berthold pri holandski brestovi bolezni ( Ophiostoma ulmi (Buisman) Nannf. in Ophiostoma novo-ulmi Brasier), uporaba Phlebiopsis gigantea (Fr.) Jülich pri rdeči trohnobi korenin ( Heterobasidion sp. Bref.), hipovirulenca kostanjevega raka ( Cryphonectria parasitica (Murrill) M.E. Barr) ipd. (Cazorla in Mercado-Blanco, 2016). 71 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 V slovenskih gozdovih je uporaba fitofarmacevtskih sredstev dovoljena le v določenih primerih in pod določenimi pogoji, ki jih določi Zavod za gozdove Slovenije (Pravilnik o varstvu gozdov, 2009). Znana sta primera uporabe sredstva AQ-10 na osnovi hiperparazitske glive Ampelomyces quisqualis Ces. proti hrastovi pepelovki ( Erysiphe alphitoides (Griffon & Maubl.) U. Braun & S. Takam.) (MKGP, 2020) in vnos tujerodne parazitske osice Torymus sinensis Kamijo za zatiranje kostanjeve šiškarice ( Dryocosmus kuriphilus Yasumatsu) (Rot in sod., 2017). 3.1.3 Obarvanje in razkroj lesa Biološka kontrola E. parasitica bi bila odličen način, da bi se izognili ali vsaj čim bolj zmanjšali negativne učinke patogena. Okužbe z glivo E. parasitica namreč povzročijo veliko tehnično in ekonomsko razvrednotenje najvrednejših sortimentov (Gross, 1984b; Martinez in sod., 2003). Da bi podrobneje proučili razkroj lesa, smo si postavili cilj: Izmeriti izgubo lesne mase treh vrst javorjev (Acer pseudoplatanus, A. platanoides, A. campestre) zaradi delovanja glive E. parasitica po metodi mini-blok, ki temelji na standardu SIST EN 113:2002, in primerjati rezultate z izolati gliv Trametes vericolor, Gloeophyllum trabeum in s petimi najpogostejšimi glivami, ki povzročajo trohnobo v javorjevih odmrlih vejah. Predvidevali smo, da bo razkroj lesa javorjev zaradi E. parasitica relativno počasna v primerjavi z drugimi trohnobnimi glivami, ki smo jih vključili v poskus. Vzorce lesa gorskega, ostrolistnega in poljskega javorja smo za 15 tednov izpostavili izolatom gliv: Diaporthe sp., Eutypa sp., Eu. maura, E. parasitica (4x), Fusarium sp., Gloeophyllum trabeum (Pers.) Murrill (2x), N. acerina, Neonectria faginata (M.L. Lohman, A.M.J. Watson & Ayers) Castl. & Rossman, Ne. punicea (J.C. Schmidt) Castl. & Rossman in Trametes versicolor (L.) Lloyd (dva izolata). Vsi glivni izolati so povzročili večje izgube lesne mase od kontrol. V nekaterih primerih je bila izračunana izguba mase manjša od 3 %, kar glede na standard SIST EN 113:2002 (CEN, 2002) velja za neznačilno. Po pričakovanjih sta bili T. versicolor in G. trabeum najučinkovitejši vrsti pri naselitvi in razkroju vzorcev lesa. Obe vrsti sta znani, da hitro in uspešno naseljujeta odmrl substrat ter povzročata učinkovit razkroj različnih vrst lesa po svetu (Robinson in sod., 2007; Humar in sod., 2018). Trametes versicolor oz. pisana ploskocevka je zelo razširjena prostotrosnica, ki se razvija v odmrli beljavi listavcev in povzroča belo trohnobo lesa. Je saprofit vej in debel, posekanega lesa, drogov in panjev. Trosnjaki so tanki, kožasti, trdi, široki do 5 cm in enoletni. Po zgornji strani so gostodlakavi s conami od bele, rjave, sive do črne barve; spodaj so rumeni z drobnimi okroglimi porami (Maček, 2008). Gloeophyllum trabeum oz. navadna tramovka spada med najbolj kozmopolitanske vrste in povzroča rjavo trohnobo lesa. Najpogosteje se pojavlja na skladiščih, vrtnem pohištvu, ograjah, telekomunikacijskih drogovih, ostrešjih, mostovih, lesenih plovilih in oknih. Posebno pogosto razkraja tehnični les, ki se občasno navlaži. Pojavlja se na lesu listavcev in iglavcev. Trosnjaki so žilavi in 72 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 prožni, enoletni, različnih oblik, pogosto se pojavljajo v vrstah. Na zgornji strani so dobro vidne rjave koncentrične prirastne plasti, površina je rahlo razbrazdana; spodaj je gosta lamelasta trosovnica oker do rjave barve (Humar, 2008). Povprečna izguba mase zaradi delovanja izolatov T. versicolor v vzorcih gorskega in ostrolistnega javorja je bila v naši študiji skoraj dvakrat večja od rezultatov tujih študij (Kielmann in sod., 2014; Reinprecht in sod., 2016). Omenjene razlike lahko pripišemo krajšemu oz. daljšemu trajanju poskusa, različnemu izvoru, vitalnosti in moči izolatov, velikostim vzorcev, inkubacijskim razmeram, gojišču ipd. Naši rezultati kažejo na relativno veliko občutljivost lesa javorjev za delovanje omenjene glive, povzročiteljice bele trohnobe. Relativna razlika v povprečni izgubi mase v primeru izolatov G. trabeum DSMZ (nemška zbirka mikroorganizmov in celičnih kultur; nem. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) in G. trabeum ZIM (Zbirka industrijskih mikroorganizmov Katedre za biotehnologijo na Biotehniški fakulteti) je bila precej velika (beležili smo 2,8 × oz. 1,2 × večje izgube pri izolatih G. trabeum DSMZ kot pri G. trabeum ZIM). To kaže na možnost neuspešne inokulacije v primeru vzorcev gorskega javorja in delno tudi ostrolistnega. Naš sum smo potrdili tudi z neznačilno razliko v povprečni masi absolutno suhih vzorcev lesa gorskega javorja pred izpostavitvijo izolatu G. trabeum ZIM in potem ter neznačilne razlike v izgubi mase vzorcev gorskega in ostrolistnega javorja v primeru izpostavitve G. trabeum ZIM in kontrolnih vzorcev. Na podlagi podatkov o vsebnosti vode na koncu poskusa ugotavljamo, da je bila gliva vsekakor aktivna, vendar je bila moč njenega razkroja precej pod pričakovanji. Rezultati izgube mase zaradi delovanja izolatov E. parasitica so primerljivi poročilom, kot jih je navajal French (1967) o povprečnih izgubah mase vzorcev rdečega, sladkornega in srebrnega javorja. Ugotovil je nekoliko večje izgube mase v beljavi kot jedrovini. Takih razlik v sklopu našega poskusa nismo preverjali. V nasprotju z našimi ugotovitvami French (1967) ni poročal o značilnih razlikah v povprečni izgubi mase med različnimi izolati E. parasitica. Tudi Pildain in sod. (2005) so ugotavljali, kakšen je razkroj lesa Po. deltoides s štirimi različnimi izolati Eutypella spp. in izračunali v povprečju za 1,7- do 7,0-krat višje izgube mase od naših rezultatov. Worrall in sod. (1997) pa so beljavo B. alleghaniensis in Pi. taeda izpostavili delovanju E. parasitica in zabeležili primerljive vrednosti (5,6 % pri B. alleghaniensis in 2,3 % pri Pi. taeda). Pri tovrstnih primerjavah izgub mase lesa moramo opozoriti na razlike v uporabljenih metodologijah in biti previdni pri oblikovanju hitrih zaključkov. Preostali izolati, ki smo jih uporabili v poskusu, so povzročili relativno majhne izgube mase (0,45–13,07 %) in smo jih v poskus vključili zaradi povezave s predhodnima raziskavama ter morebitnih zanimivih rezultatov za nadaljnje raziskave. 73 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Razmerje med izgubo mase in vsebnostjo vode kaže na linearno pozitivno povezavo, kar ugotavljajo tudi drugi raziskovalci (Meyer in sod., 2016; Zelinka in sod., 2020). Izračunana vsebnost vode naših vzorcev je bila relativno velika. Ker vzorci lesa niso bili v neposrednem stiku z gojiščem (to je preprečevala uporaba plastične mrežice), lahko sklepamo, da je velika vsebnost vode posledica delovanja gliv. V teoriji se namreč ob razkroju enega grama celuloze sprosti 0,555 g vode (Griffin, 1977). Težko je reči, ali je manjša izguba mase posledica manjše vsebnosti vode ali pa je manjša vsebnost vode posledica manjše izgube mase (Zelinka in sod., 2020). V ta namen so raziskovalci predlagali izračun dodatne spremenljivke, t. i. razlike v vsebnosti vode. Slednja naj bi predstavljala dodatno vodo, ki jo proizvede sama gliva (Zelinka in sod., 2020). Naši rezultati so pokazali povezavo med uspešno glivno presnovo, kar se kaže z večjimi izgubami mase lesa in večjo končno vsebnostjo vode. Še posebno dobro je ta povezava opazna pri podatkih, ki se nanašajo na delovanje izolatov T. versicolor in G. trabeum. Negativne vrednosti razlik v vsebnosti vode pri vzorcih ostrolistnega javorja, ki smo jih izpostavili Eu. maura, ne znamo pojasniti. Pregled literature je sicer pokazal, da se to dogaja tudi v drugih raziskavah, vendar avtorji prav tako ne navajajo razlogov (Peterson in Cowling, 1973; Zelinka in sod., 2020). Neznačilne razlike v povprečni vsebnosti vode med kontrolnimi vzorci in vzorci, izpostavljenimi določenim glivnim izolatom, kažejo, da izolati niso proizvedli velikih količin vode, kar se sklada z njihovo manjšo sposobnostjo razkroja lesa. V nadaljevanju smo zbirali dodatne informacije o naselitvi in razkroju lesa s svetlobno (LM) in vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM). Testirane glive ( T. versicolor, dva izolata E. parasitica) so se razraščale v trahejah, ki so najširše celice v javorjevem lesu in so nekakšna glivna avtocesta (Humar in sod., 2008). Z mikroskopijo smo potrdili, da je izguba mase resnično posledica delovanja gliv. V naši raziskavi se je kot najuspešnejša gliva za naselitev in razkroj lesa gorskega javorja izkazala T. versicolor. LM in meritve debelin celičnih sten so v omenjenih primerih nakazale značilen razkroj celuloze in hemiceluloze vzorcev lesa in na tak način potrdile veliko občutljivost lesa gorskega javorja za omenjeno glivo, povzročiteljico bele trohnobe. Znatne poškodbe zaradi delovanja T. versicolor so bile v nadaljevanju opazne in potrjene tudi s pomočjo SEM. Za oba izolata E. parasitica, vključena v poskus, smo s SEM ugotovili manjšo učinkovitost preraščanja in razkroja lesa. Prečni in tangencialni prerezi vzorcev lesa, ki so bili v poskusu izpostavljeni izolatoma E. parasitica, so kazali značilno manjši vpliv omenjenih izolatov na razkroj lesa. To se sklada tudi z rezultati o manjših izgubah mas in debelejših celičnih stenah v primerjavi z delovanjem T. versicolor. Izolata E. parasitica sta bila sposobna naselitve javorjevega lesa, vendar sta bila manj uspešna pri razkroju oz. sta povzročila razkroj manjših razsežnosti. Meritve debelin celičnih sten vlaken in trahej v vzorcih, izpostavljenih izolatoma E. parasitica, se znotraj posamezne branike niso značilno razlikovale. V našem primeru smo ugotovili značilne razlike v povprečni izgubi mase med vzorci, izpostavljenimi 74 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 različnima izolatoma E. parasitica, medtem ko French (1969) ni zaznal omenjenih razlik. Na podlagi rezultatov obarvanja prerezov lesa s safranin (lignin obarva rdeče)/astra modrim (celulozo obarva modro) barvilom, ki je notranje dele sekundarnih celičnih sten obarval nekoliko modro, predvidevamo, da je E. parasitica sposobna razkroja lignina in jo lahko zato uvrstimo med glive, povzročiteljice bele trohnobe. Enako so delovanje E. parasitica v poznejših fazah razkroja označili tudi Pildain in sod. (2005), medtem ko naj bi v začetnih fazah razkroja vrsta povzročala mehko trohnobo (Worrall in sod., 1997; Pildain in sod., 2005). Pri navajanju tovrstnih zaključkov moramo biti sicer precej previdni, saj vemo, da E. parasitica ni ravno zelo agresivna pri razkroju lesa. Za točnejšo določitev tipa trohnobe bi bile nujne še dodatne analize encimske aktivnosti v različnih razmerah okolja, kar pa je presegalo okvir naše raziskave. Na splošno so zaprtotrosnice večinoma kategorizirane kot glive, ki povzročajo mehke trohnobe (Mäkelä in sod., 2015) in so kot takšne sposobne razkroja polisaharidov v začetnih fazah razkroja in lignina nekoliko pozneje (Brischke in Unger, 2017). Obilje hif na sredini vzorcev lesa, kjer smo odvzeli tudi prečne in tangencialne prereze za mikroskopijo, kaže na dobro preraščanje in uspešno prodiranje glivnega micelija v tkivu lesa. Velika količina hif kaže na velik uspeh naselitve in posledičen glivni razkroj lesa. V primeru enega izmed izolatov E. parasitica, kjer smo hife zaznali le bolj ali manj na robu vzorca, predvidevamo, da izolat ni preveč učinkovito napredoval v les zaradi manjše sposobnosti prodiranja in kratkega časa trajanja izpostavitve. Tudi French (1967) je poročal o prodiranju E. parasitica v vlakna in traheje, občasno celo v parenhim trakov. Ni pa opazil nekega očitnega obarvanja ali razbarvanja lesa, kar se sklada tudi z našimi ugotovitvami. Pri vzorcu, ki je bil izpostavljen izolatu E. parasitica ZLVG 34 (Zbirka živih kultur Laboratorija za varstvo gozdov na Gozdarskem inštitutu Slovenije), smo z LM opazili le manjše znake glivnega delovanja. SEM pa je odkril prisotnost glivnih hif v trahejah, kar potrjuje domnevo o večji občutljivosti slednjega tipa mikroskopije. Čeprav LM omogoča hiter pregled velikega števila celic in lažjo pripravo vzorcev, jih je za zanesljivo določitev prisotnosti gliv smiselno pregledati še s SEM (Wilcox, 1993). Še posebno primerno je oba tipa mikroskopije kombinirati, ko želimo preverjati razkroj v začetnih fazah ali kadar se ukvarjamo z manj agresivnimi glivami. Podatki o majhnih izgubah mase in pojavnosti hif E. parasitica v vzorcih lesa se skladajo z opaženim počasnim napredovanjem vrste in razkrojem lesa na terenu. Povprečna letna rast glive v dolžino namreč znaša 1–2 cm (Sinclair in sod., 1987). Napredovanje glive je hitrejše v vzdolžni kot pa prečni smeri (Ogris in sod., 2009). Okuženi starejši javorji lahko z glivo živijo in rastejo več desetletij (Ogris in sod., 2005). Zaradi napredujoče glivne aktivnosti, razkroja lesa in izgube mehanskih lastnosti se starejša okužena drevesa pogosto prelomijo na mestu rakov (French, 1967; Kliejunas in Kuntz, 1974). Izmerjene debeline celičnih sten so bile dobro povezane z izgubami mase vzorcev lesa. Uspešna naselitev in učinkovit razkroj lesnih tkiv sta se kazala v večjih izgubah lesne mase. 75 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Najočitneje je bilo to pri vzorcih, izpostavljenih glivi T. versicolor. Čeprav so izolati E. parasitica povzročili približno štirikrat manjše izgube mase lesa kot izolata T. versicolor, ne gre zanemariti njenega vpliva na razkroj javorjevega lesa. Ker E. parasitica navadno okuži najnižji del debla, ki je hkrati tudi najdebelejši in najvrednejši del drevesa, je vsaka še tako majhna škoda nezaželena. Že začetni razkroj lesa lahko namreč pomeni značilno zmanjšanje mehanskih lastnosti (Schmidt, 2006). Gostota lesa lahko glede na literaturo določa naravno odpornost lesa na delovanje gliv. Obstajajo raziskave, ki potrjujejo, da se manjše gostote lesa kažejo v večji občutljivosti za razkroj lesa z glivami (Humar in sod., 2008; Dadzie in Amoah, 2015). Podobno bi lahko sklepali tudi za rezultate v naši študiji. Predvidevamo, da je javorjev rani les bolj občutljiv za naselitev z glivami in za razkroj. Rani les je v primerjavi s prehodnim in poznim lesom kazal nekoliko tanjše celične stene trakov in trahej, kar se ujema z nekoliko manjšimi gostotami (Shigo in Marx, 1977). Na podlagi izračunanih vrednosti gostot lesa in vsebnosti vode sklepamo, da ima maklenov les nekoliko drugačne lastnosti kot preostali vrsti javorjev, ki smo ju uporabili v raziskavi (gorski in ostrolistni javor). Gostota lesa in vsebnost vode pri maklenu sta bili namreč značilno večji. Vendar pa povezava med vsebnostjo vode in gostoto lesa ni bila značilna. Večja gostota maklenovega lesa se v večini primerov ni odražala v manjši občutljivosti za razkroj in posledično manjših izgubah lesa. To kaže na kompleksnost procesa razkroja lesa, kjer pomembno vlogo igra tudi odnos med glivo in gostiteljskim drevesom. Obarvanje in razkroj lesa sta večinoma posledica delovanja bakterij ali gliv, ki vstopajo skozi odmrle veje v živo tkivo (Shigo, 1975). Značilnosti in potek razkroja lesa dobro opisuje model CODIT, ki sta ga razvila Shigo in Marx (1977) in smo ga predstavili v uvodnem poglavju. Green in sod. (1981) so na rdečem javorju proučevali kompartmentalizacijo obarvanja in razkroja lesa, ki je posledica vstopa mikroorganizmov skozi odmrle veje. Ločili so dva osnovna tipa odmrlih vej: 1) veje z jasno izraženo barierno cono zelene barve, ki ločuje obarvan in razkrojen les od beljave v deblu in 2) veje, ki nimajo barierne cone in se zato obarvan les širi v deblo. Ugotovili so, da odsotnost ali uničenje omenjene cone olajša širjenje mikroorganizmov, obarvanja in razkroja lesa v deblo. Oblikovanje barierne cone je izjemno pomembno tudi v primeru okužb z E. parasitica. Eutypella parasitica namreč po doslej znanih podatkih vstopa v gostitelja skozi odmrle veje ali poškodbe na deblu in tako sproži bolj ali manj uspešno kompartmentalizacijo. Če se barierna cona ne oblikuje, lahko gliva nemoteno napreduje v les debla in povzroča značilno obarvanje in razkroj lesa. 3.2 SKLEPI Z raziskavo najpogostejših gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja smo določili izjemno širok spekter gliv. Večinoma so bili saprofiti iz debla Ascomycota. Pestrost ugotovljenih taksonov je še toliko pomembnejša, če upoštevamo dejstvo, da so bile lokacije vzorčenj 76 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 relativno blizu. Pri interpretaciji številčnosti izoliranih in prepoznanih gliv pa velja opozoriti, da je v vzorcih zagotovo še več vrst, ki jih zaradi počasne rasti ali neustreznih pogojev izolacije in inkubacije nismo zaznali. Za taksone, ki smo jih označili kot "sp." in določili le do nivoja rodu ali celo višje, bi bile potrebne dodatne morfološke in molekularne analize, ki bi razvozlale njihovo identiteto. Poleg številnih prepoznanih vrst smo zaznali tudi veliko pestrost vrst in majhno podobnost glivnih združb. Pestrost vrst smo določili kot funkcijo števila različnih vrst in številčnosti posamezne vrste (Magurran, 2004). Pri proučevanju glivnih združb pa smo se osredotočili le na prisotnost oz. odsotnost določene vrste (Jaccard, 1908). Razlike v pestrosti in podobnosti glivnih združb smo proučevali za različne lokacije, različna mesta izolacij in različne debelinske razrede vej. S pomočjo Kruskall-Wallisovega testa na podlagi vrednosti Shannonovega diverzitetnega indeksa nismo ugotovili razlik v pestrosti vrst med različnimi lokacijami vzorčenja, med različnimi mesti izolacij in med različnimi debelinskimi razredi vej. Na podlagi Jaccardovega indeksa podobnosti lahko potrdimo prvo hipotezo (H1) o značilnih razlikah v glivni združbi med različnimi lokacijami vzorčenja, med različnima mestoma izolacije in med različnimi debelinskimi razredi vej. Prav tako lahko potrdimo tudi drugo hipotezo (H2) o vrednostih Shannonovega diverzitetnega indeksa nad 3 med različnimi lokacijami vzorčenja, mestoma izolacije in različnimi debelinskimi razredi vej. Najpogosteje izolirane vrste gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja so bile Eu. maura, Eutypa sp., F. avenaceum, N. acerina in E. parasitica. Med najpogosteje izoliranimi vrstami je samo Eu. maura tako univerzalna, da se pojavlja tudi v drugih, tujih študijah vrst na vejah gorskega javorja. Med najpogosteje izoliranimi vrstami je bila tudi E. parasitica, povzročiteljica javorovega raka. Glede na tak rezultat sklepamo na večjo razširjenost glive, kot je bilo znano doslej. Eden izmed zanimivejših rezultatov je bila izolacija E. parasitica iz vseh vzorčnih lokacij, čeprav smo simptome okužb in razvite rake opazili le na treh lokacijah od petih. To dejstvo odpira številna dodatna vprašanja in sili k razmišljanju o razlogih. Na podlagi naših rezultatov in rezultatov iz prejšnjih raziskav predvidevamo, da so bile okužbe izredno mlade in se zato na javorjih še niso razvili značilni znaki raka. Lahko bi govorili celo o asimptomatskih okužbah, vendar pa moramo biti pri tem izjemno previdni, saj ne gre zamenjevati šibkega oz. počasnega patogena z endofitom. Z raziskavo nismo odkrili razlik v pestrosti vrst ali združbi gliv med vejami gorskega javorja, kjer se je pojavljala E. parasitica in kjer je nismo izolirali. Ugotavljamo, da torej nobena izmed najpogosteje izoliranih vrst ni strogo povezana s pojavom ali odsotnostjo E. parasitica. Dodatno smo ugotovili še pogostejše izolacije E. parasitica iz razbarvanega dela lesa v deblu kot pa v zunanjem delu odmrle veje. Ta podatek smo povezali z veliko konkurenco, ki vlada v zunanjem delu veje. Predvidevamo, da se E. parasitica morebitnemu neuspešnemu tekmovanju izogne s hitrim napredovanjem v deblo. 77 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Naša hipoteza (H3) o šibkejši konkurenčnosti E. parasitica v primerjavi z drugimi glivami v lesu odmrlih vej gorskih javorjev se je izkazala za delno pravilno. Eutypella parasitica ni v nobenem primeru prerasla micelija izzivalnega izolata. Ugotovili smo, da je v vseh dvojnih kulturah sicer nastal stik micelijev. Najpogosteje se je rast E. parasitica po stiku z drugim micelijem ustavila ali pa je izzivalni izolat delno prerasel micelij glive E. parasitica po začetnem stiku micelijev in ustavitvi rasti. Redkeje pa se je rast ustavila na razdalji brez stika micelija, kar bi bila lahko posledica sproščanja sekundarnih metabolitov z zaviralnim učinkom. Izzivalni izolati so glede na vrednosti antagonističnega indeksa (AI) šibki antagonisti. Najvišje vrednosti smo beležili pri Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp. in P. incarnata. Omenjeni izolati so značilno negativno vplivali na rast E. parasitica v dvojni kulturi in jih lahko označimo za najbolj tekmovalno uspešne izolate v naši raziskavi. Reizolacije E. parasitica iz dvojnih kultur z Eutypa sp., F. avenaceum in Neonectria sp. so bile neuspešne. Omenjeni izolati so najverjetneje v interakcijski coni premagali in nadomestili E. parasitica. Na drugi strani pa so bile reizolacije Diaporthe sp., N. acerina in Pe. irregularis manj uspešne. V takih primerih sklepamo na večji tekmovalni uspeh E. parasitica. Na podlagi vrednosti AI in uspešnosti reizolacij (s) lahko štejemo E. parasitica za šibkejšo tekmovalno vrsto, ki ne vloži veliko energije v neposredno tekmovanje z drugimi vrstami. S testom dvojnih kultur smo pridobili delni vpogled v kompleksnost interakcij med E. parasitica in najpogosteje izoliranimi vrstami gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja. Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp. in P. incarnata so se izkazale za najbolj obetavne vrste za uporabo v sklopu biološke kontrole E. parasitica. V prvem delu raziskave smo določili najpogostejše vrste gliv v odmrlih vejah gorskega javorja, ki je glede na dosedanje raziskave najpogostejše vstopno mesto za vstop E. parasitica v gostitelja. V nadaljevanju smo proučevali medsebojni vpliv in morebitni antagonizem najpogostejših vrst gliv v lesu odmrlih vej na glivo E. parasitica. Pridobili smo razširjeno znanje o izoliranih vrstah in njihovem vplivu na uspešnost naselitve in rast glive E. parasitica v dvojnih kulturah. Vendar pa moramo biti pri interpretaciji in posploševanju naših rezultatov izjemno previdni; gre namreč za preliminarne rezultate laboratorijskih testov, ki bi jih bilo nujno razširiti z več ponovitvami posameznih kombinacij, z več uporabljenimi izolati E. parasitica, z dodatnimi raziskavami sekundarnih metabolitov in njihovega morebitnega antagonističnega vpliva (Yuen in sod., 1999; Prior in sod., 2017). Za točnejše zaključke o uporabi določenih vrst za biološko kontrolo E. parasitica pa bi bilo nujno raziskati tudi značilnosti interakcij v naravnem okolju. Zagotovo pa so ugotovljeni rezultati dobra osnova za nadaljnje študije. Našo četrto hipotezo (H4) o počasnem razkroju lesa javorjev zaradi delovanja E. parasitica v primerjavi z drugimi trohnobnimi glivami, ki smo jih vključili v poskus, lahko potrdimo. 78 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Gliva E. parasitica je povzročila manjše izgube lesne mase gorskega javorja ( A. pseudoplatanus), ostrolistnega javorja ( A. platanoides) in maklena ( A. campestre) v primerjavi z obema referenčnima glivama razkrojevalkama, tj. Trametes versicolor in Gloeophyllum trabeum. Vrste, vključene v poskus, so kazale različne potenciale razkroja lesa. Kot najučinkovitejši sta se izkazali referenčni vrsti T. versicolor in G. trabeum, znani povzročiteljici bele oz. rjave trohnobe. Velike izgube mase lesa najpogosteje rastočih javorjev v Sloveniji kažejo na njihovo občutljivost za delovanje omenjenih vrst gliv. Preostale vrste ( Diaporthe sp., Eutypa sp., Eu. maura, E. parasitica, Fusarium sp., N. acerina, Ne. faginata in N. punicea) so bile manj učinkovite. Pri vizualnem pregledu vzorcev ni bilo opaziti znakov obarvanja lesa. S statistično obdelavo podatkov smo odkrili nekaj značilnih povezav med izračunanimi parametri. Večje izgube mase smo povezali z večjo vsebnostjo vode v vzorcih. Prav tako so se večje izgube mase kazale v tanjših celičnih stenah vlaken in trahej. Zaznali smo tudi povezavo med izgubami mase in gostotami lesa. Manjše gostote so pomenile večjo občutljivost za razkroj lesa in s tem večje izgube mase. Poleg izračunov izgub mase, vsebnosti vode in gostot smo s pomočjo svetlobne in vrstične elektronske mikroskopije opazovali tudi strukturne spremembe v vzorcih, izpostavljenih delovanju izbranih vrst gliv. Z mikroskopijo smo potrdili rast glivnih hif v trahejah in v določenih primerih tudi očiten razkroj celičnih sten. Počasen razkroj lesa zaradi delovanja E. parasitica lahko povežemo tudi s počasnim napredovanjem glive v lesu. Čeprav je E. parasitica povzročila značilno manjše izgube mase kot najuspešnejši vrsti ( T. versicolor in G. trabeum), vključeni v poskus, ne smemo zanemariti njenega vpliva na razkroj javorjevega lesa, še posebno na daljši rok. Ne smemo pozabiti tudi na povsem drugačne razmere, ki vladajo v naravi in jih v laboratorijskih pogojih nismo mogli poustvariti. Vsekakor pa je ta del raziskave zagotovil splošen pregled aktivnosti razkroja E. parasitica v lesu naših najpogostejših vrst javorjev. Na podlagi rezultatov obarvanja vzorcev sklepamo, da E. parasitica razkraja lignin in jo lahko kot tako uvrščamo med glive povzročiteljice bele trohnobe. Na podlagi pridobljenih rezultatov lahko oblikujemo naslednje zaključke: • V celoti potrdimo prvo hipotezo (H1) – Glivne združbe v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( A. pseudoplatanus) se značilno razlikujejo med različnimi lokacijami vzorčenja v osrednji Sloveniji (Rožnik, Smrekovec, Mokrc, Mala voda, Samotorica), med različnimi mesti izolacije (veja, deblo, kontrola) in med različnimi debelinskimi razredi vej (od 0,2 do 0,7 cm, od 0,8 do 1,2 cm, od 1,3 do 3,2 cm). • V celoti potrdimo drugo hipotezo (H2) – Vrednost Shannonovega diverzitetnega indeksa vrst gliv izoliranih iz lesa odmrlih vej gorskega javorja ( A. pseudoplatanus) med različnimi lokacijami vzorčenja v osrednji Sloveniji (Rožnik, Smrekovec, 79 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mokrc, Mala voda, Samotorica), med različnima mestoma izolacije (veja, deblo) in med različnimi debelinskimi razredi vej (od 0,2 do 0,7 cm, od 0,8 do 1,2 cm, od 1,3 do 3,2 cm) je višja od 3. • Deloma ovržemo tretjo hipotezo (H3) – Gliva E. parasitica je v čisti kulturi šibko konkurenčna desetim najpogosteje izoliranim vrstam gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( A. pseudoplatanus). Hipotezo ovržemo v dvojnih kulturah z Diaporthe sp., N. acerina in Pe. irregularis, potrdimo pa jo lahko v preostalih testiranih dvojnih kulturah z Eutypa sp., Eu. maura, E. parasitica, F. avenaceum, Neonectria sp., P. incarnata in Ph. pustulata. • V celoti potrdimo četrto hipotezo (H4) – Gliva E. parasitica povzroči manjše izgube lesne mase gorskega javorja ( A. pseudoplatanus), ostrolistnega javorja ( A. platanoides) in maklena ( A. campestre) v primerjavi z glivama razkrojevalkama Trametes versicolor in Gloeophyllum trabeum. Eutypella parasitica je relativno slabo raziskana vrsta. Z našimi poskusi smo podrobneje raziskali izbrana področja njene biologije in na tak način prispevali k razširitvi znanja o njenem delovanju. Ugotovili smo zanimive in uporabne zaključke, vendar pa je še veliko prostora za nadaljevanje raziskav na tem področju. V nadaljevanju izpostavljamo nekaj najpomembnejših predlogov: • določitev manj pogostih vrst v odmrlih vejah gorskega javorja; • več vzorčnih lokacij, ki bi omogočale zanesljivejše primerjave združb, predvsem med lokacijami z E. parasitica in brez nje; • uporaba več izolatov E. parasitica in več ponovitev posameznih kombinacij v dvojnih kulturah za preskus antagonizma oz. tekmovalnosti; • uporaba dodatnih izzivalnih vrst, ki so v literaturi navedene kot antagonisti rodu Eutypella spp. v dvojnih kulturah; • raziskava sekundarnih metabolitov in njihovega vpliva na antagonistično dejavnost; • raziskava interakcij in vivo; • raziskava vpliva gliv iz rodu Neonectria spp. na E. parasitica; • raziskava napredovanja E. parasitica v lesu in tvorba bariernih con; • natančnejša določitev tipa trohnobe, ki ga povzroča E. parasitica; • dodatne raziskave glede obarvanja in razkroja lesa v naravi; • raziskati, ali je E. parasitica endofit. 80 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 4 POVZETEK (SUMMARY) 4.1 POVZETEK Javorov rak, ki ga povzroča gliva Eutypella parasitica, so odkrili in opisali leta 1937 na meji med Kanado in Združenimi državami Amerike (Davidson in Lorenz, 1938). V Evropi je bil javorov rak prvič zabeležen v Sloveniji leta 2005 (Jurc in sod., 2006). Eutypella parasitica je po definiciji invazivna tujerodna vrsta, ki se je pri nas ustalila, povzroča gospodarsko škodo in se uspešno razmnožuje. Gliva najpogosteje okuži gostitelja skozi odmrlo vejo ali poškodbo na deblu (French, 1967). Do naših raziskav je veljalo, da ima vrsta izjemno velik infekcijski potencial, vendar so opazne okužbe relativno maloštevilne. Kot glavni namen pričujoče disertacije smo si zadali podrobneje raziskati izbrana področja biologije vrste E. parasitica, ki povzroča javorov rak, njenega vpliva na izgubo mase lesa treh vrst javorjev in odnosov z drugimi najpogostejšimi vrstami gliv, ki se pojavljajo v odmrlih vejah gorskega javorja. Opredelili smo tri raziskovalne cilje. Cilj 1 (C1): Določiti najpogostejše vrste gliv v odmrlih vejah gorskega javorja na petih lokacijah v okolici Ljubljane. Cilj 2 (C2): Izmeriti vpliv desetih najpogostejših vrst gliv v odmrlih vejah gorskega javorja na rast glive E. parasitica v čisti kulturi in ugotoviti njihov morebitni antagonizem. Cilj 3 (C3): Ugotoviti izgubo lesne mase treh vrst javorjev ( Acer pseudoplatanus, A. platanoides, A. campestre) zaradi glive E. parasitica po metodi mini-blok, ki temelji na standardu SIST EN 113:2002, in primerjati rezultate z izolati gliv Trametes versicolor, Gloeophyllum trabeum in s petimi najpogostejšimi glivami, ki povzročajo trohnobo v javorjevih odmrlih vejah. Na petih vzorčnih lokacijah v okolici Ljubljane smo od novembra 2017 do marca 2018 vzorčili odmrle veje gorskega javorja. Na vsaki lokaciji smo odvzeli po 40 vzorcev (skupaj 200 vej), ki smo jih v laboratoriju površinsko sterilizirali in koščke z različnih mest odmrle veje in debla (nMAX = 20) nacepili na 2 % gojišče MEA (gojišče z ekstraktom ječmenovega slada; angl. malt extract agar). S periodičnim pregledovanjem in precepljanjem smo glive izolirali v čiste kulture. Na podlagi makromorfoloških značilnosti smo kulture razvrstili v morfotipe. Najpogostejše morfotipe (število kultur > 5) smo določili do nivoja vrste ali rodu z analizo nukleotidnih zaporedij izbranih molekularnih markerjev (del odsekov ITS rDNA, EF-1α). Na podlagi podatkov smo izračunali relativne frekvence prepoznanih taksonov, indeks gostote, Shannonov diverzitetni indeks, Jaccardov indeks podobnosti ipd. V nadaljevanju smo preverjali razlike v pestrosti vrst in podobnosti glivnih združb med različnimi lokacijami vzorčenja, različnimi mesti izolacij in različnimi debelinskimi razredi 81 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 vej. Kulture smo deponirali v ZLVG, pridobljena nukleotidna zaporedja pa v podatkovno zbirko GenBank. V nadaljevanju smo glivo E. parasitica izpostavili desetim najpogosteje izoliranim vrstam gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja v dvojnih kulturah na 3,9 % gojišču PDA (krompirjev agar z glukozo; angl. potato dextrose agar). Pripravili smo tudi samoinhibicijske (isti izolat E. parasitica) in kontrolne ( E. parasitica in sterilen agar) dvojne kulture. Vsako kombinacijo smo ponovili trikrat. Rast smo spremljali v petrijevkah, določili tip interakcije in izračunali antagonistični indeks (AI). Po desetih dneh od stika micelijev oz. deset dni po koncu rasti na navidezni vodoravni liniji med nacepljenima koščkoma smo izvedli reizolacije (pet koščkov iz interakcijske cone in dva kontrolna koščka). Razvite kulture smo morfološko pregledali in z molekularnimi metodami potrdili prisotnost oz. odsotnost E. parasitica v reizoliranih kulturah ter izračunali uspešnost reizolacij (s) iz interakcijske cone. Na podlagi prilagojenega standarda EN 113 smo vzorce lesa (30 × 10 × 5 mm) A. pseudoplatanus, A. platanoides in A. campestre za primerjavo izpostavili štirim izolatom E. parasitica in devetim drugim glivnim vrstam. Vzorce lesa smo stehtali v absolutno suhem stanju pred izpostavitvijo (m0), v vlažnem končnem stanju (m1) in v absolutno suhem stanju po izpostavitvi (m2). Na podlagi meritev smo izračunali povprečne izgube mas in vsebnost vode v vzorcih. Strukturne spremembe v lesu smo si ogledali s pomočjo svetlobne (LM) in vrstične elektronske mikroskopije (SEM). Na prečnih prerezih izpostavljenih vzorcev lesa smo s pomočjo LM izmerili in izračunali povprečne debeline celičnih sten vlaken in trahej. Izmed 91 najpogosteje izoliranih morfotipov v lesu odmrlih vej gorskih javorjev smo določili 58 različnih taksonov gliv. Najpogosteje izolirane vrste so bile Eutypa maura, Eutypa sp. 2, Fusarium avenaceum, Neocucurbitaria acerina in E. parasitica. Razlike v pestrosti vrst med različnimi lokacijami vzorčenja, med različnimi mesti izolacije in med različnimi debelinskimi razredi vej so bile neznačilne. Ravno obratno pa smo ugotovili značilne razlike v glivnih združbah med različnimi lokacijami vzorčenja, med različnimi mesti izolacij in med različnimi debelinskimi razredi vej. Eutypella parasitica smo izolirali tudi na lokacijah, kjer predhodna inventura javorjev ni pokazala prisotnosti javorovega raka. Ugotovili smo pogostejše izolacije E. parasitica iz obarvanega lesa v deblu kot iz zunanjega dela odmrle veje, kar lahko kaže na njeno manjšo konkurenčnost in umik pred drugimi, bolj tekmovalnimi vrstami. Primerjava pestrosti glivnih vrst med odmrlimi vejami z E. parasitica in brez nje pa ni pokazala značilnih razlik. Zato domnevamo, da nobena izmed vrst ni strogo povezana s pojavljanjem E. parasitica. V dvojnih kulturah je v skoraj vseh primerih nastal stik micelijev med E. parasitica in izzivalnim izolatom. Najpogosteje se je rast E. parasitica po stiku z drugim micelijem ustavila ali pa jo je izzivalni izolat delno prerasel. Največje vrednosti AI in s tem značilno negativen vpliv na rast E. parasitica v dvojnih kulturah smo zabeležili pri Eutypa sp., Eu. 82 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 maura, Neonectria sp. in Peniophora incarnata. Hkrati so imele omenjene vrste veliko uspešnost reizolacij iz interakcijske cone in jih lahko označimo kot potencialno uporabne v sklopu biološke kontrole E. parasitica. Na drugi strani so bile reizolacije Diaporthe sp., N. acerina in Petrakia irregularis manj uspešne, domnevno zaradi večjega tekmovalnega uspeha E. parasitica. S testom dvojnih kultur in preverjanjem uspešnosti reizolacij smo pridobili delni vpogled v kompleksnost interakcij med E. parasitica in najpogosteje izoliranimi vrstami gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja. Pri interpretaciji in posploševanju rezultatov moramo biti izjemno previdni. Preliminarne rezultate laboratorijskih testov bi bilo treba razširiti in tako pridobiti verodostojnejše informacije o medsebojnemu učinkovanju vrst, morebitnem antagonizmu in prenosu ugotovitev v prakso. Po 15-tedenski inkubaciji vzorcev lesa v petrijevkah z glivami sta izguba mase lesa in mikroskopska analiza pokazali dobro razraščanje gliv in različne potenciale razkroja lesa. Pri razkroju lesa in posledični izgubi mase sta bili najuspešnejši referenčni vrsti gliv Trametes versicolor in Gloeophyllum trabeum, ki sta znani razkrojevalki in povzročiteljici bele oz. rjave trohnobe po vsem svetu. V povprečju so glive povzročile najmanjšo izgubo mase pri vzorcih A. pseudoplatanus in največjo pri vzorcih A. campestre, kar lahko delno povežemo z razlikami v gostoti lesa. Eutypella parasitica je povzročila največje izgube lesne mase pri vzorcih gorskega javorja (povprečje 6,6 %). Povprečna izguba lesne mase treh vrst javorjev zaradi delovanja izolatov E. parasitica je znašala 5,5 %, iz česar sklepamo, da je gliva počasna razgrajevalka lesa. Pri vseh izolatih smo odkrili statistično značilno pozitivno korelacijo med izgubo mase in vsebnostjo vode ter značilno negativno korelacijo med izmerjeno debelino celičnih sten in izgubo mase vzorcev. Statistična analiza je pokazala značilne razlike v izgubi mase in vsebnosti vode med različnimi izolati E. parasitica. Na podlagi obarvanja tkiv s safranin/astra modrim barvilom domnevamo, da je E. parasitica sposobna razkroja lignina in bi jo zato lahko uvrstili med povzročiteljice bele trohnobe lesa. Za dokončno potrditev te trditve bi bile nujne še dodatne raziskave. Glede na postavljene cilje raziskave smo ugotovili zaključke, ki jih navajamo v nadaljevanju. Uspešno smo dosegli vse tri postavljene cilje. V sklopu prvega (C1) smo uspešno določili najpogosteje izolirane vrste gliv, ki se pojavljajo v lesu odmrlih vej gorskega javorja na petih lokacijah v okolici Ljubljane. V nadaljevanju smo ugotavljali medsebojni vpliv in morebitni antagonizem najpogostejših vrst gliv v lesu odmrlih vej gorskega javorja na glivo E. parasitica. Potrdili smo našo domnevo o šibkejši konkurenčnosti E. parasitica v dvojnih kulturah z Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp. in P. incarnata, medtem ko je imela v dvojnih kulturah z Diaporthe sp., N. acerina in Pe. irregularis večji tekmovalni uspeh. Cilj (C2) je bil torej uspešno dosežen, domneva pa delno potrjena. V tretjem delu poskusa smo preverjali vpliv E. parasitica na razkroj lesa naših treh najpogostejših vrst javorjev. Ugotovili smo, da E. parasitica povzroča manjšo izgubo mase in s tem razkroj lesa javorjev kot uporabljeni referenčni vrsti ( T. versicolor in G. trabeum). Tako smo uspešno dosegli še 83 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 tretji raziskovalni cilj (C3) in potrdili našo domnevo o počasnejšem razkroju lesa zaradi delovanja E. parasitica v primerjavi z drugimi trohnobnimi glivami. Z našo raziskavo smo pridobili razširjeno znanje o vrstah, ki se pojavljajo v odmrlih vejah gorskega javorja, ki je hkrati tudi najpogostejše vstopno mesto za E. parasitica. Zaradi vpliva drugih vrst na uspešnost naselitve in razrasti glive E. parasitica v odmirajočih javorjevih vejah smo predlagali potencialno uporabne vrste za biološko kontrolo javorovega raka. Ugotavljali smo tudi vpliv E. parasitica na razkroj lesa, ki je sicer počasna, vendar je ne smemo zanemariti. Gliva namreč v večini primerov poškoduje spodnji in tako tudi najdebelejši, najvrednejši sortiment, zato naši rezultati pripomorejo k boljšemu razumevanju vpliva glive na ekonomsko in tehnično razvrednotenje okuženih javorjev. V doktorski disertaciji smo podrobneje obravnavali določena področja delovanja glive E. parasitica, ki povzroča javorov rak. Doslej je bilo relativno malo raziskav, ki bi obravnavale omenjeno vrsto. Z našimi rezultati smo prispevali k razširitvi vedenja o njeni biologiji. Zavedamo se, da so rezultati in zaključki le del, na določenih mestih še vedno slabo raziskanega mozaika. V prihodnje so torej še priložnosti za raziskovanje in razvijanje novih ugotovitev in znanj s tega področja. 4.2 SUMMARY Eutypella canker of maple, which is caused by Eutypella parasitica, was discovered and described in 1937 on the border between Canada and the United States (Davidson and Lorenz, 1938). In Europe, Eutypella canker of maple was first recorded in Slovenia in 2005 (Jurc et al., 2006). Eutypella parasitica is an invasive alien species that has become established in our country, causes economic damage, and reproduces successfully. The fungus most frequently infects the host through a branch stub or bark wound (French, 1967). The species has an extremely high infectious potential, but visible infections are still relatively rare. The main purpose of this dissertation was to investigate in detail the selected areas of biology of E. parasitica, the causative agent of Eutypella canker of maple, its impact on the mass loss of three maple species, and its relationships with other frequent fungal species that occur in the wood of the dead branches of sycamore maple. We defined three research objectives: Objective 1 (O1): To determine the most frequent species of fungi in the dead branches of sycamore maple at five locations in the vicinity of Ljubljana. Objective 2 (O2): To measure the influence of the ten most frequent species of fungi isolated from the dead branches of sycamore maple on the growth of the fungus E. parasitica in pure culture and to determine their possible antagonism. 84 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Objective 3 (O3): To measure the mass loss of three species of maple ( Acer pseudoplatanus, A. platanoides, A. campestre) due to the fungus E. parasitica using the miniblock method based on the SIST EN 113: 2002 standard and to compare the results with isolates of Trametes versicolor, Gloeophyllum trabeum, and the five most frequent fungi causing rot in dead maple branches. Between November 2017 and March 2018, we sampled the dead branches of sycamore maple at five sampling sites in the vicinity of Ljubljana. Forty samples (200 branches in total) were collected at each site. Samples were surface sterilized in the laboratory, and subsamples from different isolation sources in each sample (nMAX = 20) were plated on 2 % MEA (malt extract agar). The fungi were isolated into pure cultures by periodic inspection and sub culturing. Based on macromorphological characteristics, cultures were grouped into morphotypes. The most frequent morphotypes (number of cultures > 5) were determined up to the species or genus level by nucleotide sequence analysis of selected molecular markers (part of ITS rDNA sections, EF-1α). Based on the data, we calculated the relative frequencies of identified taxa, density index, Shannon diversity index, and Jaccard similarity index. Furthermore, we examined the differences in species diversity and fungal communities between different sampling sites, different isolation sources, and different branch thickness classes. Cultures were deposited in the culture collection of the Laboratory of Forest Protection at the Slovenian Forestry Institute (ZLVG), and the obtained sequences in the GenBank database. The fungus E. parasitica was then exposed to the ten most frequently isolated species of fungi in the wood of the dead branches of sycamore maple in dual cultures on 3.9 % PDA (potato dextrose agar). Self-inhibitory (same isolate of E. parasitica) and control ( E. parasitica and sterile agar) dual cultures were also prepared. Each combination was repeated three times. We monitored growth in Petri dishes, determined the type of interaction, and calculated the antagonism index (AI). Ten days after mycelium contact or ten days after the end of growth on the apparent horizontal line between the inoculated plugs, re-isolations were performed (five plugs from the interaction zone and two control plugs). Re-isolated cultures were morphologically examined, the presence or absence of E. parasitica was confirmed with molecular methods, and the success of re-isolations (s) from the interaction zone was calculated. Based on the modified standard EN 113, wood samples (30 × 10 × 5 mm) of A. pseudoplatanus, A. platanoides, and A. campestre were exposed to four isolates of E. parasitica and nine other fungal species for comparison. Wood samples were weighed to obtain initial dry mass (m0) before exposure, the mass of a wet sample (m1), and final dry mass (m2) after exposure. Based on the measurements, we calculated the average mass loss and moisture content of the samples. Structural changes in the wood were observed using light (LM) and scanning electron microscopy (SEM). On the cross-sections of exposed wood 85 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 samples, the average cell wall thicknesses of fibers and vessels were measured and calculated using LM. Of the 91 most frequently isolated morphotypes in the wood of the dead branches of sycamore maple, 58 different fungal taxa were identified. The most frequently isolated species were Eutypa maura, Eutypa sp. 2, Fusarium avenaceum, Neocucurbitaria acerina, and E. parasitica. Differences in species diversity between sampling sites, between isolation sources, and between branch thickness classes were not significant. Conversely, we found significant differences in fungal communities between sampling sites, between isolation sources, and between branch thickness classes. Eutypella parasitica was also isolated from sites where a previous maple inventory did not show the presence of Eutypella canker of maple. We found more frequent isolations of E. parasitica from the discoloured wood of trunks than from the outer parts of dead branches, which may indicate its weaker competitiveness and withdrawal from other, more competitive species. However, a comparison of the fungal species diversity between dead branches with and without E. parasitica showed no significant differences, leading to the assumption that none of the species is strictly associated with the occurrence of E. parasitica. In almost all dual cultures, the challenge isolate made mycelium contact with E. parasitica. The growth of E. parasitica most frequently stopped after contact with another mycelium or was partially overgrown by the challenge isolate. The highest values of AI and thus a significantly negative effect on the growth of E. parasitica in dual cultures were recorded in Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp., and Peniophora incarnata. At the same time, those species had a high success of re-isolations from the interaction zone and can be characterized as potentially useful in the biological control of E. parasitica. On the other hand, the isolates of Diaporthe sp., N. acerina, and Petrakia irregularis were less successful, presumably due to the greater competitive success of E. parasitica. The dual culture test and verification of the success of re-isolations, gave us a partial insight into the complexity of the interactions between E. parasitica and the most frequently isolated fungal species in the wood of the dead branches of sycamore maple. We must be extremely careful when interpreting and generalizing the results. Preliminary results of laboratory tests should be expanded to provide more credible information on species interactions, possible antagonism, and translation of our findings into practice. After 15 weeks of incubation of wood samples in Petri dishes with fungi, mass loss and microscopic analysis showed good fungal growth and different wood degradation potentials. Trametes versicolor and Gloeophyllum trabeum, well known as white and brown rot fungi worldwide, were the most successful in the decomposition of wood and the consequent loss of mass. On average, the tested fungi caused the lowest mass loss in A. pseudoplatanus samples and the highest loss in A. campestre samples, which can be partly attributed to differences in wood density. Eutypella parasitica caused the greatest mass loss in sycamore 86 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 maple samples (average 6,6 %). The average mass loss of the three maple species due to E. parasitica isolates was 5.5 %, based on which we conclude that the fungus is a slow degrader of wood. In all isolates, we found a statistically significant positive correlation between mass loss and moisture content and a characteristic negative correlation between the measured cell wall thickness and the mass loss of the samples. Statistical analysis showed significant differences in mass loss and moisture content between different E. parasitica isolates. Based on the staining of tissues with safranin/astra blue water solution, we assumed that E. parasitica was able to degrade lignin and could be considered as a white rot fungus. Further research is needed to definitively confirm this claim. According to the set goals of the research, we can draw the following conclusions: We successfully achieved all three goals. As part of the first (O1), we successfully identified the most frequently isolated species of fungi in the wood of the dead branches of sycamore maple at five sites in the vicinity of Ljubljana. Further on, we determined the interaction and possible antagonism between the most frequent fungal species in the wood of dead branches of sycamore maple and the fungus E. parasitica. We confirmed our assumption of the poor competitiveness of E. parasitica in dual cultures with Eutypa sp., Eu. maura, Neonectria sp., and P. incarnata. However, in dual cultures with Diaporthe sp., N. acerina, and Pe. irregularis, E. parasitica showed greater competitive success. Objective (O2) was therefore successfully achieved, and the assumption was partially confirmed. In the third part of the experiment, we examined the influence of E. parasitica on wood degradation in our three most common maple species. E. parasitica was found to cause lower mass loss and thus less efficient maple wood degradation than the reference species ( T. versicolor and G. trabeum). Thus, we successfully achieved the third research goal (O3) and confirmed our assumption of the slower degradation of wood due to E. parasitica compared to the other three rot fungi. Through our research, we gained extensive knowledge on the species that occur in the dead branches of sycamore maple, which is also the most likely entry point for E. parasitica. Due to the influence of other species on the efficiency of colonization and growth of E. parasitica in dead maple branches, we proposed potentially useful species for the biological control of Eutypella canker of maple. We also addressed the effect of E. parasitica on wood degradation, which is slow but not negligible. In most cases, the fungus damages the lower and thus the thickest, most valuable part of the tree. Our results therefore shed light on the impact of the fungus on the economic and technical devaluation of infected maples. In the doctoral dissertation, we discussed in more detail certain areas of activity of the fungus E. parasitica, the causative agent of Eutypella canker of maple. To date, relatively little research has been done to address this species. With our results, we have contributed to broadening the knowledge on its biology. Our results and conclusions are only part of a mosaic that is still poorly researched in certain areas and there remain opportunities to research and develop new findings and knowledge in this field. 87 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 5 VIRI Asthana A., Shearer C. A. 1990. Activity of Pseudohalonectria and Ophioceras. Mycologia, 82, 5, doi: 10.1080/00275514.1990.12025928: 554-561. Badalyan S. M., Innocenti G., Garibyan N. G. 2002. Antagonistic activity of xylotrophic mushrooms against pathogenic fungi of cereals in dual culture. Phytopathologia Mediterranea, 41, doi: 10.14601/Phytopathol_Mediterr-1668: 200-225. Badalyan S. M., Innocenti G., Garibyan N. G. 2004. Interactions between xylotrophic mushrooms and mycoparasitic fungi in dual-culture experiments. Phytopathologia Mediterranea, 43, doi: 10.14601/Phytopathol_Mediterr-1733: 44-48. Balasundaram S. V., Engh I. B., Skrede I., Kauserud H. 2015. How many DNA markers are needed to reveal cryptic fungal species? Fungal Biology, 119, 10, doi: 10.1016/j.funbio.2015.07.006: 940-945. Bavcon J., Božič G., Kutnar L., Košiček B. 2011. Tehnične smernice za ohranjanje in rabo genskih virov: Maklen, trokrpi javor in tatarski javor ( Acer campestre, Acer monspessulanum, Acer tataricum): Slovenija. Gozdarski vestnik, 69, 9: 417-424. Bayman P. 2007. Fungal endophytes. V: The mycota: environmental and microbial relationship. Kubicek C. P., Druzhinina I. S. (ur.). Berlin, Heidelberg, Springer-Verlag: 213-229 Boddy L. 2000. Interspecific combative interactions between wood-decaying basidiomycetes. FEMS Microbiology Ecology, 31, doi: 10.1111/j.1574-6941.2000.tb00683.x: 185-194. Boddy L., Bardsley D. W., Gibbon O. M. 1987. Fungal communities in attached ash branches. The New Phytologist 107, doi: 10.1016/S0007-1536(88)80033-0: 143-154. Bregant C. 2018. Eutypella parasitica: primo rinvenimento e monitoraggio in Fruili Venezia Giulia: lauree magistrali. Legnaro, Università degli Studi di Padova, Dipartimento Territoria e Sistemi Agro-Forestali, Corso di Laurea Magistrale in Scienze Forestali e Ambientali: 90 str. https://thesis.unipd.it/bitstream/20.500.12608/26450/1/Bregant%2c_Carlo.pdf (20. jan. 2022) Brischke C., Unger W. 2017. Potential hazards and degrading agents. V: Performance of bio-based building materials. Jones D., Brischke C. (ur.). Amsterdam, Elsevier: 188-203 Brus R. 2008. Dendrologija za gozdarje. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za gozdarstvo in obnovljive gozdne vire: 408 str. Butin H., Kowalski T. 1986. Die natürliche Astreinigung und ihre biologischen Voraussetzungen III. Die Pilzflora von Ahorn, Erle, Birke, Hainbuche und Esche. Forest Pathology, 16, 3, doi: 10.1111/J.1439-0329.1986.TB01053.X: 129-138. Caudullo G., de Rigo D. 2016. Acer platanoides in Europe: distribution, habitat, usage and threats. V: European atlas of forest tree species. San-Miguel-Ayanz J., de Rigo D., Caudullo G., Houston Durrant T., Mauri A. (ur.). Luxembourg, Publications Office of the European Union: 54-55. Cazorla F. M., Mercado-Blanco J. 2016. Biological control of tree and woody plant diseases: an impossible task? BioControl, 61, doi: 10.1007/s10526-016-9737-0: 233-242. Cech T. L. 2007. Erstnachweis von Eutypella parasitica in Österreich. Forstschutz Aktuell, 40: 10-13. https://bfw.ac.at/400/pdf/fsaktuell_40_4.pdf (26. nov. 2018) 88 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Cech T. L., Schwanda K., Klosterhuber M., Straßer L., Kirisits T. 2016. Eutypella canker of maple: first report from Germany and situation in Austria. Forest Pathology, 46, doi: 10.1111/efp.12268: 336-340. CEN. 2002. EN 113 - Wood preservatives - Test method for determining the protective effectiveness against wood destroying basidiomycetes - Determination of the toxic values. Brussels, European Committee for Standardization: 34 str. Chlebicki A. 1988. Some ascomycetous fungi or their anamorphs occurring on trees in Poland. Acta Mycologica, 24, doi: 10.5586/am.1988.006: 77-92. Černý K., Hrabětová M., Svobodová I., Mrázková M., Kowalski T. 2017. Eutypella parasitica naturalised in Bohemian and Polish Silesia. Forest Pathology, 47, e12347, doi: 10.1111/efp.12347. Čufar K. 2006. Anatomija lesa: univerzitetni učbenik. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za lesarstvo: 185 str. Dadzie P. K., Amoah M. 2015. Density, some anatomical properties and natural durability of stem and branch wood of two tropical hardwood species for ground applications. European Journal of Wood and Wood Products, 73, doi: 10.1007/s00107-015-0925-x: 759-773. Dangl J. L., Jones J. D. G. 2001. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature, 411, 14, doi: 10.1038/35081161: 826-833. Danti R., Sieber T. N., Sanguineti G. 2002. Endophytic mycobiota in bark of European beech ( Fagus sylvatica) in the Apennines. Mycological Research, 106, 11, doi: 10.1017/S0953756202006779: 1343-1348. Davidson R. W., Lorenz R. C. 1938. Species of Eutypella and Schizoxylon associated with cankers of maple. Phytopathology, 28: 733-745. Dubach V., Queloz V., Beenken L. 2022. First record of Eutypella parasitica on Acer in Switzerland. New Disease Report, 45, e12074, doi: 10.1002/ndr2.12074: 1-2. EPPO. 2008. Mini data sheet on Eutypella parasitica. Paris, European and Mediterranean Plant Protection Organization: 2 str. https://gd.eppo.int/taxon/ETPLPA/documents (26. nov. 2018) Evans J. A., Eyre C. A., Rogers H. J., Boddy L., Muller C. T. 2008. Changes in volatile production during interspecific interactions between four wood rotting fungi growing in artificial media. Fungal ecology, 1, doi: 10.1016/j.funeco.2008.06.001: 57-68. Falconer R. E., Brown J. L., White N. A., Crawford J. W. 2008. Modelling interactions in fungi. Journal of the Royal Society Interface, 5, doi: 10.1098/rsif.2007.1210: 603-615. Fisher P. J., Petrini O. 1990. A comparative study of fungal endophytes in xylem and bark of Alnus species in England and Switzerland. Mycological Research, 94, 3, doi: 10.1016/S0953-7562(09)80356-0: 313-319. French W. J. 1967. Eutypella canker on species of Acer in New York state: PhD Thesis. Syracuse, New York, State University College of Forestry at Syracuse University: 160 str. https://www.proquest.com/231be6c9-746d-48c8-a463-e90a55defb53 (2. okt. 2017) French W. J. 1969. Eutypella canker on Acer in New York. Syracuse, New York, State University College of Forestry at Syracuse University: 56 str. Gennaro M., Gonthier P., Nicolotti G. 2003. Fungal endophytic communities in healthy and declining Quercus robur L. and Q. cerris L. trees in northern Italy. Phytopathology, 151, doi: 10.1046/j.1439-0434.2003.00763.x: 529-534. 89 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Glawe D. A. 1983. Observations on the anamorph of Eutypella parasitica. Mycologia, 75, 4, doi: 10.1080/00275514.1983.12023745: 742-743. Glawe D. A. 1984. Bloxamia truncata in artificial culture. Mycologia, 76, 4: 741-745. https://www.jstor.org/stable/3793232 (7. avg. 2019) Goodell B., Winandy J. E., Morrell J. J. 2020. Fungal degradation of wood: emerging data, new Insights and changing Perceptions. Coatings, 10, 1210, doi: 10.3390/coatings10121210: 1-19. Green D. J., Shortle W. C., Shigo A. L. 1981. Compartmentalization of discolored and decayed wood in red maple branch stubs. Forest Science, 27, 3, doi: 10.1093/forestscience/27.3.519: 519-522. Griffin D. M. 1977. Water potential and wood-decay fungi. Annual Review of Phytopathology, 15, doi: 10.1146/annurev.py.15.090177.001535: 319-329. Gross H. L. 1984a. Defect associated with Eutypella canker on maple. Forestry Chronicle, 60, 1: 15-17. Gross H. L. 1984b. Impact of Eutypella canker on the maple resource of the Owen Sound and Wingham forest district. Forestry Chronicle, 60, 1: 18-21. Hanácková Z., Havrdová L., Černý L., Zahradník D., Koukol O. 2017. Fungal endophytes in ash shoots - diversity and inhibition of Hymenoscyphus fraxineus. Baltic Forestry, 23, 1: 89-106. https://www.balticforestry.mi.lt/bf/PDF_Articles/2017-23%5B1%5D/Baltic%20 Forestry%202017.1_089-106.pdf (17. okt. 2017) Hardoim P. R., van Overbeek L. S., Berg G., Pirttilä A. M., Compant S., Campisano A., Döring M., Sessitsch A. 2015. The hidden world within plants: ecological and evolutionary considerations for defining functioning of microbial endophytes. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 79, 3, doi: 10.1128/MMBR.00050-14: 293-320. Hawksworth D. L. 1991. The fungal dimension of biodiversity: magnitude, significance, and conservation. Mycological Research, 95, 6, doi: 10.1016/S0953-7562(09)80810-1: 641-655. Hawksworth D. L., Lücking R. 2017. Fungal diversity revisited: 2.2 to 3.8 million species. Microbiology Spectrum, 5, 4, doi: 10.1128/microbiolspec.FUNK-0052-2016: 1-17. He D. C., He M. H., Amalin D. M., Liu W., Alvindia D. G., Zhan J. 2021. Biological control of plant diseases: an evolutionary and eco-economic consideration. Pathogens, 10, 1311, doi: 10.3390/pathogens10101311. Hein S. 2009. Distribution of valuable broadleaved forests in Europe, Appendix B. V: Valuable broadleaved forests in Europe. Spiecker H., Hein S., Makkonen-Spiecker K., Thies M. (ur.). Leiden, Boston, Brill: 251-256 Herrera C. S. 2014. Systematics of the genus Cosmospora (Nectriaceae, Hypocreales), and cospeciation of Cosmospora species: PhD Thesis. College Park, Maryland, Faculty of the Graduate School of the University of Maryland: 215 str. http://hdl.handle.net/1903/15367 (7. avg. 2019) Herrera C. S., Rossman A. Y., Samuels G. J., Chaverri P. 2013. Pseudocosmospora, a new genus to accommodate Cosmospora vilior and related species. Mycologia, 105, 5, doi: 10.3852/12-395: 1287-1305. Holmer L., Renvall P., Stenlid J. 1997. Selective replacement between species of wood-rotting basidiomycetes, a laboratory study. Mycological Research, 101, 6, doi: 10.1017/s0953756296003243: 714-720. 90 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Hulme P. E., Nentwig W., Pyšek P., Montserrat V. 2009. Handbook of alien species in Europe/DAISIE. Dordrecht, Springer: 399 str. Humar M. 2008. Tramovka: najbolj kozmopolitanska lesna gliva. Les/Wood, 60, 4: 159. http://eprints.gozdis.si/id/eprint/1583 (7. apr. 2022) Humar M., Fabčič B., Zupančič M., Pohleven F., Oven P. 2008. Influence of xylem growth ring width and wood density on durability of oak heartwood. International Biodeterioration & Biodegradation, 62, doi: 10.1016/j.ibiod.2008.03.010: 368-371. Humar M., Lesar B., Thaler N., Kržišnik D., Kregar N., Drnovšek S. 2018. Quality of copper impregnated wood in Slovenian hardware stores. Drvna industrija, 69, 2, doi: 10.5552/drind.2018.1732: 121-126. Index Fungorum. 2009. P. M. Kirk. http://www.indexfungorum.org/ (2. sept. 2019) Jaccard P. 1908. Nouvelles recerches sur la distribution florale. Bulletin de la Société Vaudoise des Sciences Naturelles, 44, doi: 10.5169/seals-268384: 223-270. Jenko J. 2010. Uporaba antagonističnih gliv za zatiranje rastlinskih bolezni: diplomski projekt. (Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo). Ljubljana, samozal.: 23 str. Johnova M. 2009. Diversity and ecology of selected lignicolous Ascomycetes in the Bohemian Switzerland National Park (Czech Republic). Czech Mycology, 61, 1, doi: 10.33585/cmy.61106: 81-97. Johnson D. W., Kuntz J. E. 1976. Sporulation from Eutypella cankered maples reduced by felling infected trees. Plant Disease Reporter, 60, 5: 448-451. Johnson D. W., Kuntz J. E. 1979. Eutypella canker of maple: ascospore discharge and dissemination. Phytopathology, 69, doi: 10.1094/Phyto-69-130: 130-135. Jurc D., Ogris N., Piškur B., Csóka G. 2016. First report of Eutypella canker of maple ( Eutypella parasitica) in Hungary. Plant Disease, 100, doi: 10.1094/PDIS-11-15-1283-PDN: 1241. Jurc D., Ogris N., Slippers B., Stenlid J. 2006. First report of Eutypella canker of Acer pseudoplatanus in Europe. Plant Pathology, 55, 4, doi: 10.1111/j.1365-3059.2006.01426.x: 577. Jurc D., Piškur B., Ogris N., Brglez A., Linaldeddu B. T., Bregant C., Montecchio L. 2019. First report of Eutypella canker caused by Eutypella parasitica on Acer campestre in Italy. Pant Disease, 104, 4, doi: 10.1094/PDIS-08-19-1631-PDN: 1257. Katalog sortimentov. 2017. 11. licitacija vrednejših sortimentov lesa. Slovenj Gradec, Društvo lastnikov gozdov Mislinjske doline in Zveza lastnikov gozdov Slovenije: 78 str. Katalog sortimentov. 2018. 12. licitacija vrednejših sortimentov lesa. Slovenj Gradec, Društvo lastnikov gozdov Mislinjske doline in Zveza lastnikov gozdov Slovenije: 141 str. Katalog sortimentov. 2019. 13. licitacija vrednejših sortimentov lesa. Slovenj Gradec, Društvo lastnikov gozdov Mislinjske doline in Zveza lastnikov gozdov Slovenije: 169 str. Katalog sortimentov. 2020. 14. licitacija vrednejših sortimentov lesa. Slovenj Gradec, Društvo lastnikov gozdov Mislinjske doline in Zveza lastnikov gozdov Slovenije: 301 str. Kielmann B. C., Adamopoulos S., Militz H., Mai C. 2014. Decay resistance of ash, beech and maple wood modified with N-methylol melamine and a metal complex dye. 91 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 International Biodeterioration & Biodegradation, 89, doi: 10.1016/j.ibiod.2014.01.011: 110-114. Kliejunas J. T., Kuntz J. E. 1972. Development of stromata and the imperfect state of Eutypella parasitica in maple. Canadian Journal of Botany, 50, doi: 10.1139/b72-176: 1453-1456. Kliejunas J. T., Kuntz J. E. 1974. Eutypella canker, characteristics and control. The Forestry Chronicle, 50, 3, doi: 10.5558/tfc50106-3: 106-108. Koukol O., Mrnka L., Kulhankova A., Vosatka M. 2006. Competition of Scleroconidioma sphagnicola with fungi decomposing spruce litter needles. Canadian Journal of Botany, 84, doi: 10.1139/B06-021: 469-476. Kowalski T., Kehr R. D. 1992. Endophytic fungal colonization of branch bases in several forest tree species. Sydowia, 44, 2: 137-168. https://www.zobodat.at/pdf/Sydowia_44_0137-0168.pdf (13. okt. 2017) Kowalski T., Kraj W., Bednarz B. 2016. Fungi on stems and twigs in initial and advanced stages of dieback of European ash ( Fraxinus excelsior) in Poland. European Journal of Forest Research, 135, doi: 10.1007/s10342-016-0955-x: 565-579. Kusari P., Kusari S., Spiteller M., Kayser O. 2013. Endophytic fungi harbored in Cannabis sativa L.: diversity and potential as biocontrol agents against host plant-specific phytopathogens. Fungal Diversity, 60, doi: 10.1007/s13225-012-0216-3: 137-151. Lachance D. 1971. Discharge and germination of Eutypella parasitica ascospores. Canadian Journal of Botany, 49, doi: 10.1139/b71-160: 1111-1118. Lachance D., Kuntz J. E. 1970. Ascocarp development of Eutypella parasitica. Canadian Journal of Botany, 48, doi: 10.1139/b70-288: 1977-1979. Lešnik L., Mešl M. 2021. Kap vinske trte. Maribor, Kmetijsko gozdarska zbornica Slovenije, Zavod Maribor: 2 str. https://www.kmetijski-zavod.si/Portals/0/Novosti_Nasveti/kap%20vinske%20trte.pdf? ver=2021-03-23-071749-083 (16. feb. 2022) Luchi N., Capretti P., Feducci M., Vannini A., Ceccarelli B., Vettraino A. M. 2015. Latent infection of Biscogniauxia nummularia in Fagus sylvatica: a possible bioindicator of beech health conditions. iForest, 9, doi: 10.3832/ifor1436-008: 49-54. MacLeod A., Pautasso M., Jeger M., Haines-Young R. 2010. Evolution of the international regulation of plant pests and challenges for future plant health. Food Security, 2, doi: 10.1007/s12571-010-0054-7: 49-70. Maček J. 2008. Gozdna fitopatologija. Ljubljana, Zavod za gozdove Slovenije, Zveza gozdarskih društev, Gozdarska založba: 448 str. Magurran A. E. 2004. Measuring biological diversity. Malde, Oxford, Carlton, Blackwell Publishing company: 256 str. Mäkelä M. R., Marinović M., Nousiainen P. A., Liawanag A. J. M., Benoit I., Sipilä J., Hatakka A. I., de Vries R., Hilden S. K. 2015. Aromatic metabolism of filamentous fungi in relation to the presence of aromatic compounds in plant biomass. Advances in Applied Microbiology, 91, doi: 10.1016/bs.aambs.2014.12.001: 63-137. Marinč A. 2022. "Filogeografska analiza evropskih in severnoameriških populacij fitopatogene glive Eutypella parasitica". Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biotehnologijo (neobjavljeno). Martinez I., Pickens J. B., Richter D. L., Orr. B. D. 2003. Eutypella canker clustering and volume loss in the western upper peninsula of Michigan. Northern Journal of Applied Forestry, 20, 4, doi: 10.1093/njaf/20.4.186: 186-187. 92 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Meyer L., Brischke C., Treu A., Larsson-Brelid P. 2016. Critical moisture conditions for fungal decay of modified wood by basidiomycetes as detected by pile tests. Holzforschung, 70, 4, doi: 10.1515/hf-2015-0046: 331-339. MKGP. 2020. Seznam registriranih fitofarmacevtskih sredstev: AQ-10. https://spletni2.furs.gov.si/FFS/REGSR/ (24. mar. 2022) Nagy L., Ducci F. 2004. EUFORGEN Technical guidelines for genetic conservation and use for field maple ( Acer campestre). Rome, International Plant Genetic Resources Institute: 6 str. Ogris N., Brglez A., Piškur B. 2021. Drought stress can induce the pathogenicity of Cryptostroma corticale, the causal agent of sooty bark disease of sycamore maple. Forests, 12, 377, doi: 10.3390/f12030377: 12. Ogris N., Diminić D., Piškur B., Kraigher H. 2008. First report of Eutypella parasitica causing cankers on field maple ( Acer campestre) in Croatia. Plant Pathology, 57, 10.1111/j.1365-3059.2008.01869.x: 785. Ogris N., Hauptman T., Pavlin M., Šneberger B., Brglez A., Anonimen, Bogovič M., Grmovšek T., Zidar S., Laznik L., Bartol B., Klaužer S., Dolšak K., Kostanjevec M., Kovačič M., Jazbec J., Jurc D., Kavčič A., Cajnko D., Držaj A., Petretič M., Marinšek A., Iveta N., Prosenc P., Papler Lampe V., Zavratnik Z. 2022. Najdbe invazivnih tujerodnih vrst v Sloveniji: Eutypella parasitica. V: Invazivke - Osrednji elektronski informacijski sistem za invazivne tujerodne vrste v Sloveniji, www.invazivke.si. Ogris N. (ur.). Ljubljana, Gozdarski inštitut Slovenije (25. mar. 2022). Ogris N., Jurc D., Jurc M. 2005. Javorov rak ( Eutypella parasitica: Ascomycota: Fungi) na gorskem javorju in maklenu: značilnosti in razlike. Gozdarski vestnik, 63, 10: 411-418. Ogris N., Jurc D., Jurc M. 2006. Spread risk of Eutypella canker of maple in Europe. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 36, doi: 10.1111/j.1365-2338.2006.01047.x: 475-485. Ogris N., Jurc D., Jurc M. 2007. Ocena tveganja za širjenje javorovega raka ( Eutypella parasitica) v Sloveniji zaradi podnebnih sprememb. V: Podnebne spremembe - vpliv na gozd in gozdarstvo. Jurc M. (ur.). Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za gozdarstvo in obnovljive gozdne vire: 335-358 Ogris N., Piškur B., Jurc D. 2009. Some morphological aspects of Eutypella canker of maple ( Eutypella parasitica). V: Proceedings of the conference of IUFRO working party 7.02.02, Eğirdir, 11. - 16. maj 2009. Doğmuş Lehtijärvi T. H. (ur.). Isparta, SDU Faculty of Forestry Journal: 150-161 Pal K. K., McSpadden Gardener B. 2006. Biological control of plant pathogens. The Plant Health Instructor, 10, doi: 10.1094/PHI-A-2006-1117-02: 1-25. Parfitt D., Hunt J., Dockrell D., Rogers H. J., Boddy L. 2010. Do all trees carry the seeds of their own destruction? PCR reveals numerous wood decay fungi latently present in sapwood of a wide range of angiosperm trees. Fungal Ecology, 3, doi: 10.1016/j.funeco.2010.02.001: 338-346. Pautasso M., Schlegel M., Holdenrieder O. 2015. Forest health in a changing world. Microbial Ecology, 69, doi: 10.1007/s00248-014-0545-8: 826-842. Peters J. C., Lees A. K., Cullen D. W., Sullivan L., Stroud G. P., Cunnington A. C. 2008. Characterization of Fusarium spp. responsible for causing dry rot of potato in Great Britain. Plant Pathology, 57, doi: 10.1111/j.1365-3059.2007.01777.x: 262-271. Peterson C. A., Cowling E. B. 1973. Influence of various initial moisture contents on decay of Sitka spruce and sweetgum sapwood by Polyporus versicolor in the soil-block test. Phytopathology, 63, doi: 10.1094/Phyto-63-235: 235-237. 93 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pildain M. B., Novas M. V., Carmarán C. C. 2005. Evaluation of anamorphic state, wood decay and production of lignin-modifying enzymes for diatrypaceous fungi from Argentina. Journal of Agricultural Technology, 1, 1: 81-96. https://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.469.5109&rep=rep1&type= pdf (5. nov. 2018) Piškur B., Ogris N., Jurc D. 2007. Species-specific primers for Eutypella parasitica, the causal agent of Eutypella canker of maple. Plant Disease, 91, doi: 10.1094/PDIS-91-12-1579: 1579-1584. Porter C. L., Carter J. C. 1938. Competition among fungi. Botanical Review, 4, 4, doi: 10.1007/BF02870112: 165-182. Pravilnik o varstvu gozdov. 2009. Ur. l. RS št. 114/09 in 31/16. Prior R., Feife A., Begerow D. 2017. Antagonistic activity of the phyllosphere fungal community. Sydowia, 69, doi: 10.12905/0380.sydowia69-2017-0183: 183-198. Purvis A., Hector A. 2000. Getting the measure of biodiversity. Nature, 405, 6783, doi: 10.1038/35012221: 212-219. Qi F. H., Jing T. Z., Wang Z. X., Zhan Y. G. 2009. Fungal endophytes from Acer ginnala Maxim: isolation, identification and their yield of gallic acid. Letters in Applied Microbiology, 49, 1, doi: 10.1111/j.1472-765X.2009.02626.x: 98-104. Rappaz F. 1987. Taxonomie et nomenclature des diatrypacées à aseas octospores. Mycologia Helvetica, 2, 3: 285-648. https://doc.rero.ch/record/29136/files/rap_tnd.pdf (12. avg. 2019) Rayner A. D. M., Griffith G. S., Wildman H. G. 1994. Induction of metabolic and morphogenetic changes during mycelial interactions among species of higher fungi. Elicitors in Plant and Microbial Metabolism, 22, doi: 10.1042/bst0220389 389-394. Reinprecht L., Vidholdová Z., Gašpar F. 2016. Decay inhibition of maple wood with nano-zinc oxide used in combination with essential oils. Acta Facultatis Xylologiae Zvolen, 58, 1, doi: 10.17423/afx.2016.58.1.06: 51-58. Rezgui A., Vallance J., Ben Ghnaya-Chakroun A., Bruez E., Dridi M., Djidjou Demasse R., Rey P., Sadfi-Zouaoui N. 2018. Study of Lasidiodiplodia pseudotheobromae, Neofusicoccum parvum and Schizophyllum commune, three pathogenic fungi associated with the Grapevine Trunk Diseases in the North of Tunisia. European Journal of Plant Pathology, 152, doi: 10.1007/s10658-018-1458-z: 127-142. Riley R., Salamov A. A., Brown D. W., Nagy L. G., Floudas D., Held B. W., Levasseur A., Lombard V., Morin E., Otillar R., Lindquist E. A., Sun H., LaButti K. M., Schmutz J., Jabbour D., Luo H., Baker S. E., Pisabarro A. G., Walton J. D., Blanchette R. A., Henrissat B., Martin F., Cullen D., Hibbett D. S., Grigoriev I. V. 2014. Extensive sampling of basidiomycete genomes demonstrates inadequacy of the white-rot/brown-rot paradigm for wood decay fungi. The Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111, 27, doi: 10.1073/pnas.1400592111: 9923-9928. Robinson S. C., Laks P. E., Richter D. L., Pickens J. B. 2007. Evaluating loss of machinability in spalted sugar maple. Forest Products Journal, 57, 4: 33-37. https://www.proquest.com/b1b5f708-2528-4a48-820a-04a25708be55 (18. apr. 2018) Rolshausen P. E., Greve L. C., Labavitch J. M., Mahoneq N. E., Molyneux R. J., Gubler W. D. 2008. Pathogenesis of Eutypa lata in grapevine: Identification of virulence factors and biochemical characterization of cordon dieback. Phytopathology, 98, doi: 10.1094/PHYTO-98-2-0222: 222-229. 94 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Rot M., Žežlina I., Kos K., Celar F. A., Matošević D., Melika G. 2017. Biotično varstvo kostanjeve šiškarice ( Dryocosmus kuriphilus Yasumatsu) s parazitoidom Torymus sinensis v Sloveniji in sosednjih državah. V: Zbornik predavanj in referatov 13. Slovenskega posvetovanja o varstvu rastlin z mednarodno udeležbo. Rimske Toplice, 7. - 8. mar. 2017. Trdan S. (ur.). Ljubljana, Društvo za varstvo rastlin Slovenije: 316-324 Rusanen M., Myking T. 2003. EUFORGEN Technical guidelines for genetic conservation and use for sycamore ( Acer pseudoplatanus). Rome, International Plant Genetic Resources Institute: 6 str. Schmidt O. 2006. Wood and tree fungi: biology, damage, protection, and use. Berlin, Heidelberg, Springer-Verlag: 336 str. Schmit J. P. 1999. Resource consumption and competition by unit restricted fungal decomposers of patchy substrates. OIKOS, 87, 3, doi: 10.2307/3546815: 509-519. Schoch W., Heller Kellenberger I., Schweingruber F., Kienast F. 2004. Wood anatomy of central European Species. www.woodanatomy.ch (4. feb. 2022) Schumann K., Leuchner C., Schuldt B. 2019. Xylem hydraulic safety and efficiency in relation to leaf and wood traits in three temperate Acer species differing in habitat preferences. Trees, 33, doi: 10.1007/s00468-019-01874-x: 1475-1490. Schwarze F. W. M. R. 2007. Wood decay under the microscope. Fungal Biology Reviews, 21, doi: 10.1016/j.fbr.2007.09.001: 133-170. Schwarze F. W. M. R., Engels J., Mattheck C. 2000. Fungal strategies of wood decay in trees. Berlin, Heidelberg, Springer Verlag: 185 str. Seebens H., Essl F., Dawson W., Fuentes N., Moser D., Pergl J., Pyšek P., van Kleunen M., Weber E., Winter M., Blasius B. 2015. Global trade will accelerate plant invasions in emerging economies under climate change. Global Change Biology, 21, doi: 10.1111/gcb.13021: 4128-4140. Sendak P. E., Bove J. R., Bergdahl D. R., Tobi D. R., Huyler N. K. 1997. Effects of Eutypella canker and sugar maple borer on merchantable volume loss in sugar maple. Northern Journal of Applied Forestry, 14, 1, doi: 10.1093/njaf/14.1.26: 26-31. Shearer C. A., Zare-Maivan H. 1988. In vitro hyphal interactions among wood- and leaf-inhabiting Ascomycetes and Fungi Imperfecti from freshwater habitats. Mycologia, 80, doi: 10.1080/00275514.1988.12025494: 31-37. Shigo A. L. 1975. Biology of decay and wood quality. V: Biological transformation of wood by microorganisms. Liese W. (ur.). Berlin, Heidelberg, Springer-Verlag: 15 str. Shigo A. L., Marx H. G. 1977. Compartmentalization of decay in trees. (Agriculture Information Bulletin No. 405). Washington, U.S. Department of Agriculture, Forest Service: 73 str. Sieber T. 1988. Endophytische Pilze in Nadeln von gesunden und geschadigten Fichten ( Picea abies L. Karsten). European Journal of Forest Pathology, 18, doi: 10.1111/j.1439-0329.1988.tb00220.x: 321-342. Sieber T. N. 2007. Endophytic fungi in forest trees: are they mutualists? Fungal Biology Reviews, 21, doi: 10.1016/j.fbr.2007.05.004: 75-89. Sieber T. N., Kowalski T., Holdenrieder O. 1995. Fungal assemblages in stem and twig lesions of Quercus robur in Switzerland. Mycological Research, 99, 5, doi: 10.1016/S0953-7562(09)80709-0: 534-538. Sinclair W. A., Lyon H. H., Johnson W. T. 1987. Eutypella canker of maple. V: Diseases of trees and shrubs. Ithaca/London, Cornell University Press: 220-221 95 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Sørensen J. L., Phipps R. K., Nielsen K. F., Schroers H. J., Frank J., Thrane U. 2009. Analysis of Fusarium avenaceum metabolites produced during wet apple core rot. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, doi: 10.1021/jf802926u: 1632-1639. Spiecker H., Hein S., Makkonen-Spiecker K., Thies M. 2009. Valuable broadleaved forests in Europe. Leiden, Boston, Brill: 256 str. Sun X., Ding Q., Hyde K. D., Guo L. D. 2012. Community structure and preference of endophytic fungi of three woody plants in a mixed forest. Fungal Ecology, 5, doi: 10.1016/j.funeco.2012.04.001: 624-632. Sun X., Guo L. D., Hyde K. D. 2011. Community composition of endophytic fungi in Acer truncatum and their role in decomposition. Fungal Diversity, 47, doi: 10.1007/s13225-010-0086-5: 85-95. Tedersoo L., Bahram M., Põlme S., Kõljalg U., Yorou N. S., Wijesundera R., Villarreal Ruiz L., Vasco-Palacios A. M., Quang Thu P., Suija A., Smith M. E., Sharp C., Saluveer E., Saitta A., Rosas M., Riit T., Ratkowsky D., Pritsch K., Põldmaa K., Piepenbring M., Phosri C., Peterson M., Parts K., Pärtel K., Otsing E., Nouhra E., Njouonkou A. L., Nilsson R. H., Morgado L. N., Mayor J., May T. W., Majuakim L., Lodge D. J., Lee S. S., Larsson K. H., Kohout P., Hosaka K., Hiiesalu I., Henkel T. W., Harend H., Guo L., Greslebin A., Grelet G., Geml J., Gates G., Dunstan W., Dunk C., Drenkhan R., Dearnaley J., De Kesel A., Dang T., Chen X., Buegger F., Brearley F. Q., Bonito G., Anslan S., Abell S., Abarenkov K. 2014. Global diversity and geography of soil fungi. Science, 346, 6213, 1256688, doi: 10.1126/science: 11 str. Terho M., Hallaksela A. M. 2008. Decay characteristics of hazardous Tilia, Betula, and Acer trees felled by municipal urban tree managers in the Helsinki City Area. An International Journal of Forest Research, 81, 2, doi: 10.1093/forestry/cpn002: 151-159. Travadon R., Baumgartner K., Rolshausen P. E., Gubler W. D., Sosnowski M. R., Lecomte P., Halleen F., Peros J. P. 2012. Genetic structure of the fungal grapevine pathogen Eutypa lata from four continents. Plant Pathology, 61, doi: 10.1111/j.1365-3059.2011.02496.x: 85-95. Trouillas F. P., Gubler W. D. 2010. Host range, biological variation, and phylogenetic diversity of Eutypa lata in California. Phytopathology, 100, doi: 10.1094/PHYTO-02-10-0040: 1048-1056. Unterseher M., Otto P., Morawetz W. 2005. Species richness and substrate specificity of lignicolous fungi in the canopy of a temperate, mixed deciduous forest. Mycological Progress, 4, 2, doi: 10.1007/s11557-006-0115-7: 117-132. Unterseher M., Tal O. 2006. Influence of small scale conditions on the diversity of wood decay fungi in a temperate, mixed deciduous forest canopy. Mycological Research, 110, doi: 10.1016/j.mycres.2005.08.002: 169-178. Wanasinghe D. N., Phookamsak R., Jeewon R., Wen J. L., Hyde K. D., Jones E. B. G., Camporesi E., Promputtha I. 2017. A family level rDNA based phylogeny of Cucurbitariaceae and Fenestellaceae with descriptions of new Fenestella species and Neocucurbitaria gen. nov. Mycosphere, 8, 4, doi: 10.5943/mycosphere/8/4/2: 397-414. Wardle D. A., Parkinson D., Waller J. E. 1993. Interspecific competitive interactions between pairs of fungal species in natural substrates. Oecologia, 94, 3, doi: 10.1007/BF00341313: 165-172. Wenneker M., van Raak M. M. J. P., van Brouwershaven I. R., Martin W., Kox L. F. F. 2011. Eutypa lata, the causal agent of dieback in red currant ( Ribes rubrum) and 96 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 gooseberry ( R. uva-crispa) in the Netherlands. European Journal of Plant Pathology, 131, doi: 10.1007/s10658-011-9821-3: 441-449. White N. A., Boddy L. 1992. Extracellular enzyme localization during interspecific fungal interactions. FEMS Microbiology Letters, 98, doi: 10.1111/j.1574- 6968.1992.tb05493.x: 75-80. Wilcox W. W. 1993. Comparison of scanning electron microscopy and light microscopy for the diagnosis of early stages of brown rot wood decay. IAWA Journal, 14, 3, doi: 10.1163/22941932-90001320: 219-226. Worrall J. J., Anagnost S. E., Zabel R. A. 1997. Comparison of wood decay among diverse lignicolous fungi. Mycologia, 89, 2, doi: 10.1080/00275514.1997.12026772: 199-219. Wu B., Hussain M., Zhang W., Stadler M., Liu X., Xiang M. 2019. Current insights into fungal species diversity and perspective on naming the environmental DNA sequences of fungi. Mycology, 10, 3, doi: 10.1080/21501203.2019.1614106: 127-140. Yang D. Q. 2005. Isolation of wood-inhabiting fungi from Canadian hardwood logs. Canadian Journal of Microbiology, 51, doi: 10.1139/w04-104: 1-6. Yuen T. K., Hyde K. D., Hodgkiss I. J. 1999. Interspecific interactions among tropical and subtropical freshwater fungi. Microbial Ecology, 37, doi: 10.1007/s002489900151: 257-262. Zabel R. A., Morell J. J. 2020. Factors affecting the growth and survival of fungi in wood (fungal ecology). V: Wood microbiology (second edition). Zabel R. A., Morell J. J. (ur.). Cambridge, Academic Press: 30 str. Zakon o zdravstvenem varstvu rastlin. 2007. Ur. l. RS, št. 62/07, 36/10, 40/14 - ZIN-B in 21/18 - ZNOrg. Zelinka S. L., Kirker G. T., Bishell A. B., Glass S. V. 2020. Effects of wood moisture content and the level of acetylation on brown rot decay. Forests, 11, 299, doi: 10.3390/f11030299. ZGS. 2022. Gozdni fondi, stanje 2021. Zavod za gozdove Slovenije. (31. mar. 2022) 97 Brglez A. Antagonizem med glivo … v lesu odmrlih vej gorskega javorja ( Acer pseudoplatanus) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ZAHVALA Zahvaljujem se Javni agenciji za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (program Mladi raziskovalec, programska skupina: Gozdna biologija, ekologija in tehnologija (P4-0107), ki poteka na Gozdarskem inštitutu Slovenije), ki je financirala raziskavo. Posebno zahvalo namenjam mentorju, dr. Nikici Ogrisu, ki me je z entuziazmom popeljal v svet raziskovanja. Hvala za vso pomoč, hitro odzivnost, odgovore na moja vprašanja ter usmerjanje pri zasnovi poskusov in izdelavi doktorske disertacije. Z izredno potrpežljivostjo in umirjenim pristopom brez nepotrebne živčnosti ter pritiskov je ustvaril prijetno vzdušje za delo in razvoj. Zahvala velja tudi vodjema Oddelka za varstvo gozdov Gozdarskega inštituta Slovenije, prof. dr. Dušanu Jurcu in dr. Barbari Piškur, za vse spodbudne besede, ideje, predloge, možnost dodatnega usposabljanja v tujini in vključevanja v redno delo oddelka. Špeli Jagodic in Zini Devetak se zahvaljujem za potrpežljivost in uporabne nasvete pri uvajanju v molekularne analize v laboratoriju. Hvala tudi preostalim sodelavcem za druženja in pogovore ob malici. Vsak od vas je prispeval svoj nenadomestljiv del k prijetnemu bivanju na inštitutu. Izr. prof. dr. Benedettu Teodoru Linaldeddu z Oddelka za krajino, okolje, kmetijstvo in gozdarstvo Univerze v Padovi hvala za možnost sodelovanja in pridobivanje novih znanj ter izkušenj v njihovem laboratoriju. Za lekturo slovenskega dela besedila se zahvaljujem Marjetki Šivic, za lekturo izvlečka in povzetka v angleščini pa Philipu Janu Naglu. Najlepša hvala tudi članom komisije za oceno in zagovor za temeljit pregled disertacije in dragocene pripombe ter predloge. Nazadnje bi se želela zahvaliti še celotni družini, ki me je spremljala v teh letih: mami Tatjani, očetu Jožetu, teti Zdenki, Domnu in malemu Aljažu. Hvala za vso podporo, potrpežljivost, spodbudne besede, občasna kosila in varstvo. Brez vas preprosto ne bi bilo enako. Super ste!