Fiziologija rastlin Priročnik z navodili za vaje Avtorici Jana Ambrožič-Dolinšek Terezija Ciringer Junij 2022 Naslov Fiziologija rastlin Title Plants Physiology Podnaslov Priročnik z navodili za vaje Subtitle Exercise Instructions Manual Avtorici Jana Ambrožič-Dolinšek Authors (Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko) Terezija Ciringer (Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko) Recenzija Andreja Urbanek Krajnc Review (Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede) Nataša Pipenbaher (Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko) Jezikovni pregled Language edeting Mojca Garantini Tehnični urednik Jan Perša Technical editor (Univerza v Mariboru, Univerzitetna založba) Oblikovanje ovitka Jan Perša Cover designer (Univerza v Mariboru, Univerzitetna založba) Grafične priloge Graphic material Avtorici Grafika na ovitku Cover graphics Foto: Ambrožič-Dolinšek in Ciringer, 2022 Založnik Univerza v Mariboru, Univerzitetna založba Published by Slomškov trg 15, 2000 Maribor, Slovenija https://press.um.si, zalozba@um.si Izdajatelj Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko Issued by Koroška cesta 160, 2000 Maribor, Slovenija https://www.fnm.um.si, fnm@um.si Izdaja Edition Prva izdaja Izdano Published at Maribor, junij 2022 Vrsta publikacije Publication type E-knjiga Dostopno na Available at https://press.um.si/index.php/ump/catalog/book/660 CIP - Kataložni zapis o publikaciji © Univerza v Mariboru, Univerzitetna založba Univerzitetna knjižnica Maribor / University of Maribor, University Press 581.1(075.8)(076.5)(0.034.2) Besedilo / Text © Ambrožič-Dolinšek, Ciringer, 2022 To delo je objavljeno pod licenco Creative Commons Priznanje avtorstva AMBROŽIČ-Dolinšek, Jana 4.0 Mednarodna. / This work is licensed under the Creative Commons At ribution Fiziologija rastlin [Elektronski vir] 4.0 International License. : priročnik z navodili za vaje / avtorici Jana Ambrožič-Dolinšek, Terezija Ciringer. Uporabnikom je dovoljeno tako nekomercialno kot tudi komercialno - 1. izd. - E-knjiga. - Maribor : Univerza reproduciranje, distribuiranje, dajanje v najem, javna priobčitev in v Mariboru, Univerzitetna založba, 2022 predelava avtorskega dela, pod pogojem, da navedejo avtorja izvirnega dela. Način dostopa (URL): https://press.um.si/index.php/ump/catalog/ Vsa gradiva tretjih oseb v tej knjigi so objavljena pod licenco Creative book/660 Commons, razen če to ni navedeno drugače. Če želite ponovno uporabiti ISBN 978-961-286-614-3 (PDF) gradivo tretjih oseb, ki ni zajeto v licenci Creative Commons, boste morali doi: 10.18690/um.fnm.3.2022 pridobiti dovoljenje neposredno od imetnika avtorskih pravic. COBISS.SI-ID 112629763 https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ISBN 978-961-286-614-3 (pdf) DOI https://doi.org/10.18690/um.fnm.3.2022 Cena prof. dr. Zdravko Kačič, Price Brezplačni izvod Odgovorna oseba založnika For publisher rektor Univerze v Mariboru Citiranje Ambrožič-Dolinšek, J., Ciringer, T. (2022). Fiziologija rastlin: priročnik z navodili za vaje. Maribor: Univerzitetna založba. Attribution doi: 10.18690/um.fnm.3.2022 FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer Kazalo Rastlinska barvila ........................................................................................................................... 1 1. vaja: Antocianini, betacianini ............................................................................................................................ 3 2. vaja: Fotosintetsko aktivna asimilacijska barvila ............................................................................................ 7 3. vaja: Ločitev zelenih in rumenih barvil iz kloroplastov .............................................................................. 15 4. vaja: Določitev barvil na osnovi topnosti ..................................................................................................... 19 Izmenjava plinov .......................................................................................................................... 21 5. vaja: Dihanje rastlin .......................................................................................................................................... 23 6. vaja: Fotosintetska aktivnost ........................................................................................................................... 27 Encimska aktivnost ......................................................................................................................29 7. vaja: Aktivnost katalaze ................................................................................................................................... 31 Sprejem, prevajanje in uravnavanje vode v rastlinah ...................................................................39 8. vaja: Specifična prevodnost lesa ..................................................................................................................... 41 9. vaja: Stopnja sukulentnosti .............................................................................................................................. 45 10. vaja: Merjenje sprejema vode v rastlino ...................................................................................................... 51 Disperzijski sistemi, koloidi, plazmoliza .....................................................................................57 11. vaja: Koloidni sistemi ..................................................................................................................................... 59 12. vaja: Plazmoliza ............................................................................................................................................... 65 13. vaja: Merjenje vodnega potenciala z mejno plazmolizo ............................................................................ 71 Mineralna prehrana rastlin ...........................................................................................................77 14. vaja: Spremljanje simptomov fizioloških motenj ob pomanjkanju določenih hranil ........................... 79 Reduktivni sladkorji .....................................................................................................................87 15. vaja: Kvalitativno določanje reduktivnih sladkorjev ................................................................................. 89 16. vaja: Kvantitativna ocena reduktivnih sladkorjev ...................................................................................... 95 Biotesti .................................................................................................................................... 103 17. vaja: Triticum test za določanje hormonov – citokininov ........................................................................ 105 18. vaja: Mungo test za določanje hormonov – avksinov ............................................................................... 111 Zaključek .................................................................................................................................... 115 Dodatek: Spektrofotometrija ............................................................................................................................ 117 Izbrane osnove kemijske stahiometrije ............................................................................................................ 119 Literatura ............................................................................................................................................................ 121 FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 1. vaja: Antocianini, betacianini UVOD Antocianini so vodotopni flavonoidi v glikozidni obliki (glikozidi z vezanimi sladkorji), ki se kopičijo v vakuolah. Aglikoni antocianinov brez vezanega sladkorja so antocianidini. Najdemo jih samo pri rastlinah v različnih tkivih, na primer v jesenskem listju, v cvetovih in plodovih, ki jih obarvajo rdeče, roza, vijolično ali modro. Najpogostejši antocianini so: − cianidin (antocianidin modre, vijolične, rdeče barve najdemo npr. v cvetu plavice ( Centaurea cyanus) , plodu šipka ( Rosa) , v plodu črnega ribeza ( Ribes nigrum), češnje ( Prunus avium); − delfinidin (antocianidin modre barve najdemo v cvetovih in plodovih nekaterih rastlin, npr. ostrožnika ( Delphinium), v plodovih borovnice ( Vaccinium myrtil us) − pelargonidin (antocianidin rdeče, vijolične barve najdemo v cvetovih in plodovih mnogih rastlin, npr. krvomočničevk (Geraniaceae) , v plodovih jagodnjaka ( Fragaria); − malvidin (modra barva, ki jo najdemo v cvetnih listih rastlin rodu Primula (Primula x polyantha), v modrih cvetovih modrega pimperela ( Anagal i s monel i), v rdečem vinu iz vinske trte ( Vitis vinifera); 4 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. − petunidin (temno rdeč ali vijoličast pigment, ki ga najdemo v številnih robidnicah ( Rubus), na primer v aroniji, v rdečem vinu, predvsem iz grozdja vinske trte ( Vitis rotundifolia). Antocianini sodelujejo v interakciji med rastlinami in živalmi. Antocianini, ki so prisotni v cvetovih določenih rastlinskih vrst privabljajo opraševalce, prav tako antocianini v plodovih privabijo živali, ki le-te pojedo, in tako sodelujejo pri razširjanju semen in plodov. V fotosintetskem tkivu (asimilacijskem parenhimu) listov antocianini ščitijo celice pred poškodbami, ki so posledica svetlobnega stresa v povezavi z drugimi stresnimi dejavniki, kot sta mraz in suša. Antocianini so antioksidanti, ki ščitijo rastlino pred vplivi UV svetlobe. Uporabljajo se kot prehranski dodatki, z oznako E 163, za obarvanje marmelad, sadnih pekarskih izdelkih, bonbonov in krem. Njihova barva je odvisna od strukture (vezave sladkorne molekule, števila hidroksilnih (-OH), in metoksilnih (-OCH3) skupin na B obroču antocianidina), prisotnosti nekaterih kovinskih ionov (Fe, Al, Cr) in pH vakuole. Betacianini (betaciani) so rdeča barvila, z dušikom (N) vezanim v heterocikličnem obroču. Nahajajo se v vakuoli kot vodotopni proteinski kompleksi. Najdemo jih v korenu rdeče pese ( Beta vulgaris) in drugih predstavnikih družine metlikavk (Chenopodiaceae) ter v cvetovih družin kaktusovk (Cactaceae), tolščakovk (Portulacaceae), v nekatrih vrstah amarantusa ( Amaranthus) in tudi v nekaterih glivah višjega reda. Uporabljajo se kot prehranski dodatki z oznako E 162, kot naravna barvila za hrano. CILJI − Seznanili se boste s fenolno reakcijo, značilno za antocianine in betacianine. − Sami boste pripravili pH indikator in z njim izmerili pH. NALOGA 1. S fenolno reakcijo (FeCl3) določite vrsto rdečega barvila v ekstraktu. 2. Iz ekstrakta antocianinov pripravite barvno skalo za pH indikator. 3. S pripravljenim pH indikatorjem izmerite pH vina, mleka, paradižnika, limone … 4. S spreminjanjem pH lahko spremenite tudi barvo z antocianinom obarvanega celičnega soka. MATERIAL: rdeče zelje ( Brasica oleracea var. capitata rubra), rdeča pesa ( Beta vulgaris var. conditiva), 2 čaši (500 ml), kuhalnik, stojalo za epruvete, 20 epruvet, FeCl3, alkoholni flomaster. 1. vaja: Antocianini, betacianini 5. IZVEDBA S kuhanjem koščkov rdeče pese in rdečega zelja (vsakega posebej) pripravite njuna vodna ekstrakta barvil. Tako z ekstraktom rdečega zelja, kakor tudi z ekstraktom pese napolnite po eno epruveto (1–2 cm visoko). 1. Vrsto rdečega barvila v epruveti z ekstraktom rdeče pese in v epruveti z ekstraktom rdečega zelja ugotovite s fenolno reakcijo tako, da po kapljicah dodajate FeCl3 in opazujete barvo. Pozitivna fenolna reakcija (temno vijolično-črno obarvanje) pomeni, da so barvila antocianini: negativna fenolna reakcija (rdečkasto rjavo obarvanje) pomeni, da so barvila betacianini (Preglednica 1). 2. Indikatorski pH standard (barvno skalo) iz antocianinov pripravite tako, da iz čaše z antocianini nalijte ekstrakt barvila v 8 epruvet (1 cm visoko). Postavite jih v stojalo in razporedite v eno vrsto. V prvo zunanjo epruveto (epruveta 1) na levi strani dodajte tolikšen volumen kisline (1 M HCl), da se barva ekstrakta spremeni v rdečo barvo. V prvo zunanjo epruveto (epruveta 8) na desni strani dodajte toliko baze (1 M NaOH), da se barva ekstrakta spremeni v rumeno barvo (Slika 1, Preglednica 2). Nato iz prve zunanje epruvete v naslednjo notranjo s kapalko dodajajte vsebino do nove spremembe barve (Slika 1, Preglednica 2). In tako naprej v vsako naslednjo epruveto (iz leve proti desni do sredine in od desne proti levi do sredine). Po ureditvi barvne lestvice to ovrednotite tudi s pH vrednostmi, da se barve ujemajo s spremembo pH (Slika 1, Preglednica 2). 3. Točko 2 ponovite tudi z betacianini. 4. S pomočjo pripravljenega pH indikatorja iz antocianinov izmerite (ocenite) pH različnim raztopinam (npr.: raztopine pralnega praška, kisa, limoninega soka, raztopine tekočega mila …) in vrednosti zabeležite (Preglednica 3). V pet epruvet ali manjših čašic nalijte (1–2 cm visoko) posamezne raztopine, katerim dodajte ekstrakt antocianinov. Ko se barva raztopin z antocianini ustali, jo primerjajte z barvo antocianinskega indikatorskega pH standarda in ocenite pH le-teh. 5. S pomočjo mikroskopa opazujte povrhnjico rdeče čebule. Pod krovno stekelce (ob strani) dodajte bazo (1 M NaOH) in opazujte spreminjanje barve celičnega soka ter razložite to spremembo! 6 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. REZULTATI IN OPAŽANJA Preglednica 1: Vrsta barvila, določena s fenolno reakcijo Ekstrakt Fenolna reakcija Vrsta barvila (+ pozitivna, - negativna) (antocianini, betacianini) rdeče zelje rdeča pesa Slika 1: Indikatorska barvna lestvica z določenimi pH vrednostmi 1 do 13. Preglednica 2: pH indikatorska skala iz antocianinov, betacianinov Epruveta 1 2 3 4 5 6 7 8 N l aO Dodaj HC nevtralno H Barva ekstrakta zelja modro vijolična pH 7 Barva ekstrakta pese pH Preglednica 3: Meritve pH pH zemlja milo pralni prašek kis limona FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 2. vaja: Fotosintetsko aktivna asimilacijska barvila UVOD Absorpcija svetlobe s pomočjo fotosintetskih barvil omogoča proces fotosinteze pri rastlinah, algah in modrozelenih cepljivkah. Fotosintetska barvila obsegajo tri skupine, ki se med seboj razlikujejo v kemijski zgradbi in v absorpciji svetlobe: klorofile, karotenoide in fikobiline. Ločimo glavna in pomožna fotosintetska barvila. Od vseh pigmentov, ki sodelujejo pri fotosintezi, ima klorofil temeljno vlogo. Zato so ostali fotosintetski pigmenti znani kot pomožni pigmenti. Vsako barvilo absorbira samo določeno valovno dolžino svetlobe. Glavno barvilo, ki je klorofil a (pri bakterijah bakterioklorofil), absorbira svetlobo modre in kratkovalovne rdeče svetlobe in jo pretvarja v energijo elektronov. Pomožna barvila so v pomoč pri absorpciji svetlobe, energijo resonančno prenašajo do glavnega barvila, ki edini lahko odda elektron. Ko foton svetlobe trči v molekulo fotosintetskega barvila, se svetloba določene valovne dolžine absorbira, nekaj svetlobe odbije, nekaj pa jo list prepušča. 8 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. VPRAŠANJA Razložite značilnosti plastidov: proplastidi, kloroplasti, kromoplasti, levkoplasti, amiloplasti, etioplasti! Opišite zgradbo in delovanje kloroplastov! 2. vaja: Fotosintetsko aktivna asimilacijska barvila 9. Katera so fotosintetsko aktivna barvila? Opišite fotosistem I in II! Kaj je fluorescenca? Ponovite znanje o svetlobnih in ogljikovih reakcijah fotosinteze! 10 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Kakšne so anatomske in fiziološke razlike med metabolizmom fotosinteze tipa C4, C3 in CAM? Kromatografija je laboratorijska metoda, s katero na podlagi razlike v hitrosti potovanja različnih snovi v vzorcu po stacionarni fazi le te v vzorcu ločujemo. Snovi, ki vzorec sestavljajo, potujejo po stacionarni fazi s pomočjo mobilne faze. Ločevanje omogočajo razlike v fizikalno-kemijskih lastnostih sestavin v vzorcu, kot so: velikost, oblika, naboj, hlapnost, topnost, adsorpcija . . Gre za separacijsko metodo, ki ločuje kemijsko podobne substance. Po zaključeni ločbi dobimo kromatogram. Za kvalitativno in kvantitativno ugotavljanje posameznih sestavin vzorca, je nujno potreben tudi ustrezen detekcijski sistem. Kromatografski sistem sestavlja več komponent: stacionarna faza, kromatografski nosilec, mobilna faza. Obstajajo številni tipi kromatografij, kot so: papirna, tankoplastna, kolonska, tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC), plinska kromatografija (GC) . . 2. vaja: Fotosintetsko aktivna asimilacijska barvila 11. Papirna kromatografija: Razdalja potovanja vzorca (barvil) vzdolž kromatografskega papirja je odvisna od dveh dejavnikov: a) od topnosti (polarnosti oziroma nepolarnosti) barvila v vsaki od kemikalij, ki sestavlja kromatografsko topilo (mobilna faza). Bolj topno, nepolarno barvilo bo potovalo dlje, kot manj topno. b) od adsorpcije barvila na kromatografski papir (stacionarna faza). Bolj adsorbirano barvilo bo potovalo počasneje. Potovanje sestavin (barvil) v vzorcu podajamo relativno na potovanje topila in je konstantno ter ga podamo, kot relativno frontalno mobilnost (Rf). Rf izračunamo z enačbo (1): 𝑹𝑹𝑹𝑹 = 𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒓𝒓𝒑𝒑𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒑𝒑𝒓𝒓𝒑𝒑𝒓𝒓𝒗𝒗𝒓𝒓 (1) 𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒓𝒓𝒑𝒑𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒑𝒕𝒕𝒓𝒓𝒓𝒓 CILJI − Spoznali boste različna barvila, vključena v absorpcijo svetlobe. − Seznanili se boste z ekstrakcijo barvil in njihovim ločevanjem. − Seznanili se boste s kromatografskim ločevanjem snovi. − Seznanili se boste z absorpcijskimi lastnostmi barvil. − Seznanili se boste s spektrofotometrijo. NALOGA 1. S papirno kromatografijo ločite barvila v kloroplastih. 2. Izračunajte relativno frontalno mobilnost (Rf) za posamezno barvilo (Preglednica 4). 3. Pred vir svetlobe (lučka) postavite epruveto z ekstraktom ne ločenih barvil in opazujte obarvanost presvetljene vsebine epruvete. 4. S spektrofotometrom izmerite (absorbanco) absorpcijo vsakega od ločenih barvil, kontrolne raztopine topila in ekstrakta barvil v območju z valovnimi dolžinami od 350 nm do 750 nm. 12 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. MATERIAL Trava ( Poa sp.) ali listi poljubne rastline, škarje, podlaga za rezanje, terilnica s pestilom, 100-ml čaša, manjša čaša, kromatografski papir, kromatografska komora s plutovinastim čepom za kromatografijo, kapilara, stojalo za epruvete, 7 epruvet, 7 zamaškov za epruvete, lučka, spektrofotometer. KEMIKALIJE Aceton, petroleter, aceton : petroleter (v/v = 1 : 6), kremenčasti pesek IZVEDBA 1. Izrežite kromatografski papir tako, da po merah ustreza višini in širini kromatografske komore. Papirnat trak naj bo nekoliko ožji kot premer komore (da ni v stiku s steno komore) in tako dolg, da se bo dotikal gladine razvijalne tekočine oziroma da bo potopljen vanjo približno 2 mm. 1,5 cm od spodnjega roba kromatografskega papirja zelo narahlo s svinčnikom zarišite startno črto za nanos vzorca. 2. Travo s škarjami narežite na majhne koščke, prilijte malo acetona in travo v terilnici z dodatkom konice spatule kremenčevega peska dobro strite nad ledeno kopeljo. Temno zeleno obarvan grobi acetonski ekstrakt barvil dekantirajte v čašo, ki jo postavite na ledeno kopel. S kapilaro (nastavkom za pipeto) ekstrakt barvila nanesite na zarisano startno črto (1,5 cm od spodnjega roba). Nanos večkrat ponovite (ob vsakem nanosu progo sproti posušimo) tako, da dobimo temnozeleno progo. Preostanek ekstrakta barvil shranite v eno od epruvet. 3. Kromatografski papir z nanešenim ekstraktom pritrdite na zamašek in namestite v sredino komore tako, da bo 2–3 mm potopljen v mobilno fazo ((aceton : petroleter (v/v = 1 : 6)). Kromatografski papir naj se ne dotika stene komore. Ko mobilna faza doseže končno linijo, kromatogram snemite iz komore, ga posušite na zraku in na njem izmerite (označite) fronto topila, fronto barvil. 4. Posamezne lise z barvilom iz kromatograma izrežite in vsako liso posebej dajte v epruveto ter prelijte z acetonom, da se barvilo lise v njem ekstrahira. 5. Ekstraktom posameznih barvnih lis ločenih barvil s spektrofotometrom izmerite (absorbanco) absorpcijo, pri valovni dolžini od 350 nm do 750 nm in absorcijske spektre grafično predstavite. 2. vaja: Fotosintetsko aktivna asimilacijska barvila 13. REZULTATI IN OPAŽANJA Preglednica 4: Ekstrakti posameznih front barvil iz kromatograma Vzorec Barva lise Rf Prisotno barvilo F E D C B A 14 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. ZAPISKI FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 3. vaja: Ločitev zelenih in rumenih barvil iz kloroplastov UVOD Glejte: predhodne vaje Rastlinska barvila CILJI − Seznanili se boste z metodo ekstrakcije. − Spoznali boste ločitev zelenih in rumenih asimilacijskih barvil na osnovi topnosti. NALOGA 1. Barvila, ekstrahirana v etanolu, ločite z dvema različnima topiloma (petroleter in etanol). MATERIAL Trava, 100-ml in 20-ml čaši, kuhalnik, terilnica s pestilom, epruveta. 16 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. KEMIKALIJE Etanol, petroleter, deionizirana voda. IZVEDBA Narezane liste trave segrejte do vretja v etanolu. Ekstrakt dekantirajte v čašo. V epruveto nalijte en del (1–2 cm) ekstrakta in dolijte enak del petroletra. Dodajte nekaj kapljic vode, stresite in pustite, da se zmes porazdeli med ekstrakcijskima topiloma. Postopek ponavljajte tako dolgo, dokler se barvila ostro ne ločijo. REZULTATI IN OPAŽANJA Fotografirajte ločena barvila! VPRAŠANJA Kaj dosežemo z dodajanjem vode? 2. vaja: Fotosintetsko aktivna asimilacijska barvila 17. Kako se obarva posamezna faza in katero barvilo se nahaja v njej? V katerem barvilu so topni klorofili, v katerem karotenoidi? 18 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. ZAPISKI FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 4. vaja: Določitev barvil na osnovi topnosti UVOD Glejte: predhodne vaje Rastlinska barvila. CILJI − Seznanili se boste s kemijskimi lastnostmi določenih barvil in z rabo ustreznih topil za ekstrakcijo le-teh. − Določili boste vrsto barvila v rdeči papriki ( Capsicum). − Določili boste vrsto barvila v hibiskusu ( Hibiscus). NALOGA 1. Barvila v rdeči papriki in hibiskusu ekstrahirajte z različnimi topili, z vodo in z jedilnim oljem. MATERIAL Rdeča paprika v prahu, sušen hibiskus (za čaj), dve 100-ml čaši (visoki), steklena palčka. 20 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. KEMIKALIJE Voda, belo jedilno olje IZVEDBA V dve enaki čaši (visoki) nalijte do višine 2 cm olje in nato enak volumen vode. V prvo čašo dajte majhno žličko rdeče paprike v prahu in v drugo majhno žličko hibiskusa. V obe čaši dajte stekleno palčko za mešanje. Opazujte in preverite, v katerem topilu se bodo ekstrahirala barvila iz paprike in v katerem iz hibiskusa. REZULTATI IN OPAŽANJA Razložite, za katero vrsto barvila gre pri rdeči papriki in za katero pri hibiskusu in na osnovi česa ste se odločili za vrsto barvila! FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 5. vaja: Dihanje rastlin UVOD Dihanje semen Pri mirujočih semenih so mitohondriji še nerazviti. Metabolizem in izmenjava plinov sta izredno nizka, saj je vsebnost vode nizka (<10 %). Med nabrekanjem (imbibicijo) semena se intenzivnost dihanja veča in je merljiva s preprostimi metodami. Poraba kisika strmo narašča; aktivirajo se encimi, ki so skladiščeni v semenu. Porabijo se primarne zaloge hranil (v večini nižji sladkorji) v embriu. V teh procesih se porablja tudi kisik, ki je skladiščen v različnih tkivih semena. Mitohondriji se razvijejo, poveča se njihovo število in naraste količina njihovih encimov. Pri nekaterih vrstah rastlin začne po nekaj urah poraba kisika stagnirati ali celo rahlo upade. To se običajno zgodi ob koncu imbibicije. Vzrok zanjo je verjetno slaba prepustnost semenske ovojnice (teste) za kisik, ki je v imbibiranem stanju še manjša. Kisik, ki prihaja skoznjo, prestrezajo tudi fenolne substance, ki so v njej po navadi prisotne v visokih koncentracijah. Metabolizem je v tem času delno anaeroben, kljub temu v semenu poteka intenzivna sinteza encimov. Ponoven porast porabe kisika opazimo, ko se pojavijo s prostim očesom vidni znaki kalitve – prodor koreničice (radikule). Embrio intenzivno izkorišča rezerve iz sekundarnega endosperma ali kotiledonov in redko iz hipokotila. Na svetlobi lahko pri kalici opazimo pozitivno fototropično reakcijo. Razvije se tudi fotosintezni aparat in kalica 24 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. preide na avtotrofni način življenja (Likar in Vogel-Mikuš, 2011). Več o dihanju rastlin boste izvedeli na predavanjih! Dihanje rastlin lahko spremljamo tako, da ugotavljamo, kaj pri tem nastaja in kaj se pri tem porablja. Pri dihanju dokazujemo ali merimo sproščeni CO2 oziroma porabljeni O2. Ta proces lahko spremljamo s pomočjo Vernierjevega merilnika za merjenje koncentracije plinastega CO2 in O2 CILJI − Dokazali boste, da pri dihanju nastaja CO2. − Dokazali boste, da se pri dihanju porablja O2. − Izmerili boste količino porabljenega O2 in nastalega CO2 pri suhih in imbibiranih semenih. − Spoznali boste vpliv različnih obravnav (različne koncentracije NaCl) na dihanje semen pri kalitvi (3–4 dni). NALOGA 1. Izmerite količino porabe O2 in nastanka CO2 pri suhih in inbibiranih semenih. 2. Izmerite količino porabe O2 in nastanka CO2 pri obravnavanih semen z 0-%, 1-%, 5-% in 10-% raztopino NaCl, za vsako obravnavo posebej. 3. Primerjajte meritve posameznih obravnav med seboj. MATERIAL Tri do štiri dni stara kaleča semena pšenice ( Triticum), ali semena drugih rastlin, ki smo jih za kalitev različno obravnavali; z 0-%, 1-%, 5-% in 10-% raztopino NaCl. Vernierjev merilnik za merjenje plinastega CO2 in O2, vmesnik, računalnik, programska oprema LabPro, tehtnica. KEMIKALIJE NaCl 5. vaja: Dihanje rastlin 25. IZVEDBA Koncentracijo plinastega kisika in ogljikovega dioksida boste izmerili s pomočjo Vernierjevega merilnika za merjenje koncentracije plinastega CO2 in O2, ki je povezan z Vernierjevim vmesnikom. Rezultate boste spremljali s pomočjo programske opreme LabPro (Slika 2). Slika 2: Shematski prikaz delovanja Vernierjevega merilnika Zelo pomembno: Merilnik se uporablja za merjenje plinastega O2 in ne O2 raztopljenega v tekočini, zato ga ne potapljajte v nikakršno tekočino. Medtem, ko merilnika ne uporabljamo, mora biti nameščen navpično. To je pomembno za vzdrževanje merilnika! 1. Meritve opravite najprej pri suhih semenih (kontrola 1) in nato pri imbibiranih semenih, tretiranih z 0-% (kontrola 2), 1-%, 5-% in 10-% raztopino NaCl. Sočasno merite koncentracijo plinastega kisika (O2) in ogljikovega dioksida (CO2). 2. Kaleča semena istega tretmaja predhodno stehtajte in z njimi napolnite epruveto (komoro) za O2 in za CO2 (rastlinski material se ne sme neposredno dotikati Vernierjevega merilnika!). 3. Vstavite Vernierjev merilnik za merjenje O2 in CO2 v komoro navpično navzdol. Komori nežno pričvrstite/vpnite s prižemo v stojalo. 4. Povežite merilnika z vmesnikom in vmesnik z računalnikom (merilnik O2 in merilnik CO2) in odprite program Logger pro, določite (nastavite) čas meritve in počakajte, da program samodejno prepozna merilnika in začne meritev. Med posameznimi meritvami komore temeljito prezračite (5–10 min). 26 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. REZULTATI IN OPAŽANJA Rezultate meritev kontrole in vseh tretmajev zberite na en graf in jih komentirajte ter razložite. VPRAŠANJA Zakaj imate pri tem eksperimentu dve kontroli (konrola1 in kontrola2)? Razložite vpliv NaCl na intenzivnost dihanja! FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 6. vaja: Fotosintetska aktivnost UVOD Fotosintetsko aktivnost lahko ugotavljamo z merjenjem proizvodnje O2 ali porabe CO2. CO2 se z difuzijo prenese v kloroplaste, kjer se v procesu asimilatorne redukcije v Calvinovem ciklu s pomočjo encima RUBISCO vgrajuje v triozo gliceraldehid in naprej v glukozo. Glede na razlike v fotosintezni karboksilaciji ločimo fotosintezni metabolizem C3, C4, in CAM rastlin. Pri C4 in CAM metabolizmu je prvi proizvod vezave CO2 oksalacetat, malat ali aspartat s po 4 atomi ogljika, ki predstavlja vmesno skladiščenje CO2 za ohranjanje visokega delnega tlaka CO2, ki se z dekarboksilacijo nadalje usmerja v Kalvinov cikel. Pri vseh treh metabolizmih poteka asimilatorna redukcija CO2 po Calvinovem ciklu (Likar in Vogel-Mikuš, 2011). CILJI − Spoznali boste fotosintetsko aktivnost meritev porabe CO2 pri svetlobah različnih valovnih dolžin (bela, rdeča, modra, zelena). NALOGA 1. Vodno lečo ( Lemna minor) izpostavite svetlobi različne kakovosti za določen čas (20 min ali več) in spremljajte porabo CO2 pri vsaki posamezni svetlobi. 28 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. MATERIAL Rastline vodne leče, komora za meritve izmenjave plinov, merilnik ogljikovega dioksida, vmesnik LoggerPro, računalnik s programom LoggerPro, izvor svetlobe (žarnica) različne kakovosti (bela, rdeča, zelena, modra). IZVEDBA V komoro nalijte 60 ml vode in dodajte 10 g vodne leče. Vstavite Vernierjev merilnik za CO2, ki ga ustrezno povežite z računalnikom. V programu nastavite čas meritve na 60 min, frekvenco zajemanja podatkov na dva podatka/minuto in zaženite zajemanje podatkov. REZULTATI in OPAŽANJA Rezultate o porabi CO2 pri različnih svetlobah (bela, rdeča, zelena, modra) grafično prikažite in jih komentirajte. VPRAŠANJA Kako si razlagate razlike v porabi CO2 pri različnih spektralnih lastnostih svetlobe? FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 7. vaja: Aktivnost katalaze UVOD Katalaza je široko razširjen encim, ki ga najdemo praktično v vseh aerobnih celicah v peroksisomih in glioksisomih (živali, rastline in mikroorganizmi). Je encim, ki spada v skupino encimov oksidoreduktaz. Katalizira razgradnjo vodikovega peroksida (H2O2), pri čemer se sprošča kisik (O2): katalaza 𝟐𝟐 𝑯𝑯𝟐𝟐𝑶𝑶𝟐𝟐 → 𝟐𝟐 𝑯𝑯𝟐𝟐𝑶𝑶 + 𝑶𝑶𝟐𝟐 (2) Je relativno stabilen encim, ki ga lahko preprosto merimo s količino sproščenega kisika iz substrata. Sestavljen je iz štirih podenot, ki tvorijo tetramer (1 podenota = 65 kD). Vsaka polipeptidna podenota ima v aktivnem mestu prostetično skupino, ki je hemin (porfirin s Fe+3). Ena molekula železa katalizira reakcijo dveh molekul vodikovega peroksida. Znotraj ene vrste lahko najdemo različne katalazne izocime. Katalaza ščiti celice pred toksičnimi učinki vodikovega peroksida tako, da ga razgradi v molekularni kisik in vodo. Vodikov peroksid nastaja kot stranski proizvod metabolizma. Nastaja v skoraj vsakem aerobnem procesu v celici še posebej v dveh procesih: ob fotorespiraciji (v peroksisomih) in ob kalitvi semen v β-oksidaciji maščobnih kislin (v glioksisomih). Za celice je toksičen, saj je zelo močan oksidant, ki bi sicer napadal druge organske molekule. 32 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. VPRAŠANJA Kaj so encimi? Katere skupine encimov še poznamo? Katere skupine oksidoreduktaz poznamo in kaj katalizirajo? 7. vaja: Aktivnost katalaze 33. Katere hidrolaze poznamo, kako delujejo in katere reakcije katalizirajo? Znanje o encimih lahko najdete na spletni strani www.plantphys.net v poglavju »Energy and Enzymes«! CILJI − Spoznali boste, kako dejavniki (pH, koncentracija encima, temperatura, koncentracija substrata - H2O2) uravnavajo encimsko aktivnost katalaze. NALOGA 1. Izmerite vpliv pufrskih raztopin s pH (4, 5, 6, 6,6, 7,2, 7,8, 8,4, 9, 10, 12) na aktivnost katalaze. 2. Narišite krivuljo hitrosti reakcije v odvisnosti od pH medija. 3. Izmerite vpliv koncentracije encima – katalaze (0,00, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 3,00, 4,00 ml encima v vzorcu, ki ga vedno dopolnimo s pufrom pH = 7,2 do 22 ml) na hitrost encimske reakcije. 4. Narišite krivuljo hitrosti reakcije v odvisnosti od koncentracije encima. 5. Izmerite vpliv koncentracije substrata - H2O2 (0,0, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 10,0 ml H2O2, ki ga, če je potrebno, dopolnimo s pufrom pH = 7,2 do 10 ml) na aktivnost katalaze. 6. Narišite krivuljo hitrosti reakcije v odvisnosti od koncentracije substrata. 7. Izmerite vpliv T (T vodne kopeli = 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 °C) na aktivnost katalaze. 8. Narišite krivuljo hitrosti reakcije v odvisnosti od T vodne kopeli. 34 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. MATERIAL Gomolj krompirja ali drug rastlinski material, 50-ml bireta, 60-ml lij ločilnik, 100-ml reakcijska steklenica z zamaškom, cevke za povezavo, terilnica s pestilom, 0,1- do 10-ml pipete, grelna plošča z mešalom. KEMIKALIJE 3-% H2O2, različni pufri, ki smo jih pripravili iz 0.1 M citronsko kislino (A), 0.2 M Na2HPO4 (B), 0.2 M NaH2PO4 (C), 0.2 M KCl (D) , 0.2 M H3BO3 (E), 0.2 M NaOH (F). IZVEDBA Encimski ekstrakt pridobite iz 3 g poljubnega rastlinskega materiala (npr. sveži listi špinače brez pecljev ali drobno nastrgan gomolj krompirja). Pripravite si 50 ml deionizirane vode. Del vode prilijte v terilnico, dodajte na drobno sesekljan (nastrgan) rastlinski material, ki ga dobro strete, da se encim sprosti iz tkiva. Dodajte preostanek (od 50 ml) deionizirane vode in počakajte, da se grob rastlinski material usede na dno. Ekstrakt (supernatant) brez sedimenta dekantirajte ob stekleni palčki v stekleničko in ga za čas trajanja eksperimenta hranite v njej. S pomočjo asistenta po shemi (Slika 3) sestavite aparaturo! Vodno kopel lahko nadomestite z grelno ploščo. V reakcijsko posodo dodajajte encimski ekstrakt (supernatant) z ustreznim pufrom in v lij ločilnik H2O2 – substrat (glejte točke izvedbe 1., 2., 3., 4. in 5). Reakcijsko posodo potopite v vodno kopel ali posredno na grelno ploščo z mešalnikom na 30 °C in jo s cevko povežite z narobe obrnjeno bireto, napolnjeno z vodo. Po 5 min termične akomodacije počasi spustite substrat (H2O2) iz lija ločinlika v reakcijsko posodo. Takoj nato zaprite pipo na lij ločilniku, da preprečite uhajanje nastalega kisika. Ko substrat zaradi fizikalnih pojavov izpodrine že nekaj zraka v bireti, hitro odčitajte nivo vode (označite) in začnite z meritvijo časa poteka reakcije. Vsebino v reakcijski posodi ves čas reakcije nežno mešajte. 7. vaja: Aktivnost katalaze 35. Po 10 minutah reakcije zapišite na podlagi izpodrinjene vode volumen sproščenega kisika, (ali čas, v katerem se je nabralo 50 ml kisika, če je ta čas krajši kot 5 min). Slika 3: Skica postavitve merilnika za merjenje aktivnosti katalaze Aktivnost katalaze preverjajte pri različnih dejavnikih: 1. Vpliv pH na hitrost reakcije: V reakcijsko posodo dajte 2 ml encimskega ekstrakta (supernantant) in 20 ml pufra z ustreznim pH (4, 5, 6, 6,6, 7,2, 7,8, 8,4, 9, 10, 12) in v lij ločilnik 10 ml H2O2. Pri vsakem pH naj teče reakcija 10 minut. Po desetih minutah zabeležite volumen nastalega kisika (Preglednica 6). 2. Vpliv koncentracije encima na hitrost reakcije: V reakcijsko posodo dajte zmes encimskega ekstrakta in pufra (0,00, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 3,00, 4,00 ml encima v vzorcu, ki ga vedno dopolnite s pufrom pH = 7,2 do 22 ml) in v lij ločilnik 10 ml H2O2. Pri vsaki navedeni koncentraciji encima naj teče reakcija 10 minut. Po desetih minutah zabeležite volumen nastalega kisika (Preglednica 7). 3. Vpliv koncentracije substrata na hitrost reakcije: V reakcijsko posodo dajte 2 ml encimskega ekstrakta (supernantant) in 20 ml pufra s pH = 7,2 in v lij ločilnik ustrezno redčen substrat (0,0, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 10,0 ml H2O2, ki ga za različne razredčitve dopolnite s pufrom pH = 7,2 do 10 ml). Pri vsaki navedeni koncentraciji substrata naj teče reakcija 10 minut. Po desetih minutah zabeležite volumen nastalega kisika (Preglednica 8). 4. Vpliv temperature na hitrost reakcije: V reakcijsko posodo dajte 2 ml encimskega ekstrakta (supernantant) in 20 ml pufra s pH = 7,2 in v lij ločilnik 10 ml H2O2. 36 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Spreminjajte temperaturo vodne kopeli ali grelne plošče (T = 10, 20, 30, 40, 50, 60 °C). Pri vsaki navedeni temperaturi naj teče reakcija 10 minut. Po desetih minutah zabeležite volumen nastalega kisika (Preglednica 9). Preglednica 5: Priprava pufrov (200 ml) pH ml osnovne raztopine za pripravo 4,0 61,4 A + 38,6 B 0,1 M citr. kislina (A) 5,0 48,6 A + 51,4 B 0,2 M Na2HPO4 (B) 6,0 35,8 A + 64,2 B 6,6 62,5 C + 37,5 B 0,2 M NaH2PO4 (C) 7,2 28,0 C + 72,0 B 7,8 8,5 C + 91,5 B 0,2 M KCl (D) 8,4 50,0 D + 50,0 E + 8,6 F 9,0 50,0 D + 50,0 E + 21,4 F 0,2 M H3BO3 (E) 10,0 50,0 D + 50,0 E + 39,1 F 12,0 50,0 D + 50,0 E + 61,0 F 0,2 M NaOH (F) Za vsak pufer dopolnite z deionizirano H2O do 200 ml! REZULTATI IN OPAŽANJA Preglednica 6: Vpliv pH na hitrost encimske reakcije pH pufrske raztopine Volumen O2 (ml min-1) 7. vaja: Aktivnost katalaze 37. Preglednica 7: Vpliv koncentracije encima na hitrost encimske reakcije Količina encima v vzorcu (ml) Volumen O2 (ml min-1) Preglednica 8: Vpliv koncentracije substrata na hitrost encimske reakcije V H2O2 v vzorcu (ml) Volumen O2 (ml min-1) 38 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Preglednica 9: Vpliv temperature na hitrost encimske reakcije T (°C) puferske raztopine z Volumen O encimom 2 (ml min-1) FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 8. vaja: Specifična prevodnost lesa UVOD Voda vstopa v rastlino skozi koreninske laske in nato z radialnim transportom po koreninski skorji po endodermu kot fiziološki zapori/pregradi za vodo v ksilem in po njem z aksialnim transportom po steblu v liste, kjer izhlapeva s površine celic mezofila in prehaja skozi listne reže in v malem deležu po kutikuli iz rastline. Hitrost prevajanja vode ni odvisna samo od transpiracije, ampak tudi od zgradbe in delovanja prevajalnih elementov – ksilema. Na vajah bomo raziskali prevodnost sekundarnega ksilema (lesa) pri golosemenkah in kritosemenkah. Med lesom različnih lesnih vrst so razlike tako v zgradbi kot v prevodnosti. Prevajanje praviloma poteka samo po zunanjih branikah in v nekaterih primerih (hrast, brest, pravi kostanj ...) samo po zadnji, najmlajši braniki. Sposobnost lesa, da prevaja vodo, izrazimo v obliki specifične prevodnosti. VPRAŠANJA Kako se po zgradbi razlikujeta les iglavcev in listavcev? 42 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Kaj je venčasto porozni les in kaj raztreseno porozni les? Kaj je mirkoporen in kaj makroporen les? CILJI − Spremljali boste razlike v prevodnosti lesa različnih vrst dreves in grmov. 8. vaja: Specifična prevodnost lesa 43. NALOGA 1. Izmerite volumen obarvane tekočine, ki priteče skozi vejo v 30 minutah. 2. Izračunajte površino prereza vejice. 3. Izračunajte specifično prevodnost (sp) po enačbi (3): 𝒔𝒔𝒑𝒑 = 𝑽𝑽∙𝒓𝒓 (3) 𝒑𝒑 ∙𝑺𝑺 ∙𝒑𝒑 V = volumen pretočene tekočine (m3) l = dolžina vejice (m) t = dolžina poskusa (h) S = presek veje (m2) p = tlak (Pa)*. * Tlak vode nad cevko je enak 0,01MPa za vsak meter tekočine nad vejo. 1 at = 760 mmHg = 1,013 bar = 0,1013 MPa MATERIAL Veje različnih dreves debeline približno 1 cm, cev dolžine 1 m, gumijasta cev (zamašek), ki se prilega stekleni ali kovinski cevi in veji, žica, stojalo, prižema, menzura, čaša, lijak, žaga, milimetrski papir, ravnilo, škarje. KEMIKALIJE 0,05 % metilensko modrilo. IZVEDBA Odrežite približno 30 cm dolge veje in jih do poskusa shranite v vodi, da preprečite nastanek kavitacij. Iz sredine veje odžagajte 10 cm dolg kos brez stranskih vejic in ga z gumijasto cevjo (zamaškom) pritrdite na stekleno cev. To vpnite na stojalo tako, da je veja v vertikalnem (navpičnem) položaju (Slika 4). Cev napolnite 1 m visoko z raztopino metilenskega modrila in počakajte, da barvilo priteče skozi vejo v čašo. Nato z menzuro izmerite volumen tekočine, ki se pretoči skozi. Med poskusom ves čas dolivajte metilensko modrilo, da je višina tekočine v cevi vedno enaka. Meritev ponovite dvakrat in rezultate zabeležite (Preglednica 10). Po končani meritvi izmerite premer veje (lesa) in jo vzdolžno 44 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. razpolovite. Oglejte si obarvane in ne obarvane dele in iz obarvanja sklepajte, katere branike so prevajale vodo. Slika 4: Skica aparature za merjenje prevodnosti lesa REZULTATI IN OPAŽANJA Preglednica 10: Specifična prevodnost različnih vrst lesa Objekt V t S p sp FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 9. vaja: Stopnja sukulentnosti UVOD Stopnja sukulentnosti (SS) je kvocient, ki opisuje razmerje med volumnom in površino listov. Številne rastlinske vrste suhih rastišč imajo debele liste, z relativno nizkim razmerjem med površino in volumnom, debelo kutikulo in zelo nizko transpiracijo. Običajno imajo slabo razvit sloj stebričastega tkiva, zato večino listov ali stebel sestavljajo fotosintetsko aktivne celice gobastega tkiva, ki imajo velike vakuole in malo citoplazme. Sprejem CO2 in metabolizem fotosinteze pri sukulentih je CAM tip (kisli metabolizem sočnic). Več o metabolizmu ogljika pri rastlinah boste izvedeli na predavanjih. VPRAŠANJA Kako poteka sprejem in metabolizem CO2 pri C3, C4 in CAM rastlinah? 46 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Za katere rastlinske skupine je značilen posamezen cikel? Na kakšnih rastiščih jih najdemo? Skozi katere organe in tkiva poteka transpiracija? Kako rastline regulirajo transpiracijo? 9. vaja: Stopnja sukulentnosti 47. Kako so nekatere rastline zavarovane pred preveliko transpiracijo? Kako jih imenujemo? CILJI − Spoznali boste stopnjo sukulentnosti listov različnih rastlinskih vrst. NALOGA 1. Izračunajte stopnjo sukulentnosti (SS) za posamezne liste po formuli (4). 𝑺𝑺𝑺𝑺 = 𝒎𝒎 (4) 𝟐𝟐∙𝒑𝒑 m = vsebnost - masa vode (g) v listih p = površina lista (cm2). 2. Ugotovite ali starost listov vpliva na spremembo stopnje sukulentnosti. 48 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. MATERIAL Sveže odrezane vejice z listi različnih rastlin, petrijevke, aluminijasta folija, milimetrski papir, škarje, svinčnik, tehtnica, sušilnik. IZVEDBA Izberite pet različnih rastlin in jim odrežite po en list (Preglednica 11). Nato, izmet teh petih rastlin izberite eno, ki ji odrežite prvih pet listov od vršička navzdol (Preglednica 12). Vse odrezane liste stehtajte. Izmerite površino listov tako, da jih narišete na milimetrski papir. Liste položite na stehtan povoščen papir (peki papir) in jih sušite do konstantne teže pri 105 °C. Liste ponovno stehtajte in določite vsebnost vode vseh listov (Preglednica 11, Preglednica 12). REZULTATI IN OPAŽANJA Preglednica 11: Stopnja sukulentnosti različnih rastlinskih vrst Listi različnih površina sveža teža suha teža vsebnost vode stopnja rastlinskih vrst (cm2) (g) (g) (g) sukulentnosti 9. vaja: Stopnja sukulentnosti 49. Preglednica 12: Vpliv starosti listov na stopnjo sukulentnosti Listi ene površina sveža teža suha teža vsebnost vode stopnja rastlinske vrste (cm2) (g) (g) (g) sukulentnosti 1. list 2. list 3. list 4. list 5. list 50 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. ZAPISKI FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 10. vaja: Merjenje sprejema vode v rastlino UVOD Voda v rastlini je v stiku z vodo v tleh in v zraku. Za vodo v rastlini velja, da potuje z mesta višjega na mesto nižjega vodnega potenciala (iz smeri manj negativnega v smer bolj negativnega vodnega potenciala). Zato transport vode vedno poteka z mesta višjega vodnega potenciala v tleh, v smeri nižjega vodnega potenciala v atmosferi, torej v smeri gradienta vodnega potenciala. Ker je vodni potencial bolj ali manj suhega zraka nekaj deset do nekaj tisoč kPa nižji od tistega v rastlinah, voda v rastlini teži k temu, da zapusti rastlino. Voda vstopa v rastlino skozi koreninske laske in nato z radialnim transportom po koreninski skorji skozi endoderm kot fiziološko zaporo/prepreko v ksilem. Po njem potuje v steblo in liste, kjer izhlapeva s površine celic mezofila in nato difundira skozi listne reže in v manjšem deležu skozi kutikulo iz rastline. Transport vode po rastlini imenujemo transpiracijski tok, izgubo vode s površine rastlin pa transpiracija. Transpiracija poteka večinoma skozi liste, in sicer skozi listne reže, v manjšem deležu skozi kutikulo (kutikularna transpiracija) in lenticele lubja (peridermalna transpiracija). Več o vodnem potencialu , njegovih komponentah in transpiraciji boste izvedeli na predavanjih. 52 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. VPRAŠANJA Kateri zunanji (okolje) in notranji (zgradba, metabolizem) dejavniki vplivajo na transpiracijo? Aparatura, ki jo uporabljamo za merjenje sprejema vode v rastlinski poganjek ali v mlado rastlino, je potometer (Slika 5). Transpiracije ne merite neposredno ampak posredno, saj rastlina izgubi večino sprejete vode s transpiracijo. Transpiracija in sprejem vode sta torej tesno povezana. Transpiracijo merimo: Neposredno - z merjenjem volumna porabljene vode v graduirani cevki v enoti časa. Predvidevamo, da rastlina sprejme vodo skozi odrezan del ali skozi korenine, ki nadomestijo vodo, izgubljeno s transpiracijo. 10. vaja: Merjenje sprejema vode v rastlino 53. Posredno – z merjenjem zmanjševanja mase potometra v enoti časa. Čeprav na vsebnost vode vplivajo tudi številni metabolni procesi v rastlini (dihanje, fotosinteza), vplivajo na vsebnost vode in maso rastline, so njihovi učinki v primerjavi z transpiracijo zanemarljivi in jih ne upoštevamo. Pri sestavljanju potometra moramo paziti na dvoje: − steblo rastline moramo odrezati pod vodo, da v žile ne prodre zrak; − vsi sestavni deli morajo tesniti, tako da voda izhaja samo s transpiracijo skozi rastlino. CILJI − Ugotavljali boste vpliv vetra, vlažnosti in listne površine na sprejem vode in na transpiracijo. NALOGE 1. S pomočjo asistenta sestavite potometer (Slika 5). 2. Izmerite sprejem vode (cm3 h-1) v rastlino tako, da bomo odčitavali porabo vode v graduirani cevki (1-ml pipeti). 3. Narišite graf sprejema vode v različnih pogojih. 4. Izračunajte izgubo vode, preračunano na površino listov (cm3 h-1 m -2). MATERIAL Mladi olistani poganjki različnih rastlin, doma izdelan potometer, večja prozorna plastična vrečka, električni fen; štoparica, termometer, injekcijska brizga, milimetrski papir. KEMIKALIJE Vosek ali vazelin. 54 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. IZVEDBA 1. Sprejem vode Pripravite vse za sestavo potometra (Slika 5). Izberite rastlino, jo odrežite in odrezan konec takoj potopite v vodo. Tako se izognete vdoru mehurčkov zraka v ksilem. Pod vodo, nekaj cm nad prvim rezom takoj še enkrat gladko, poševno odrežite poganjek. Še v vodi ga vstavite v preluknjan zamašek potometra. Potometer napolnite z vodo in ga sestavite v kadici z vodo. Prav tako v vodi vanj namestite 1-ml pipeto z merilom in brizgalko. Sestavljen potometer vzemite iz vode, vpnite v stojalo in preverite vodni stolpec v kapilari (pipeti). Potometer je pripravljen za meritev, ko se vodni stolpec v kapilari začne premikati v smeri vodnega stolpca. Pred vsako meritvijo z brizgalko uravnajte menisk v kapilari, in nato v 30 minutah na 10 minut (ali čas prilagodimo dejanskim dogajanjem) odčitajte porabo vode. Rezultati naj bodo izračunani kot volumen na enoto časa (cm3 h-1) (Preglednica 14). Po vsaki spremembi poskusnih pogojev morate potometer adaptirati (preurediti)! Izvedite serijo štirih meritev in sproti beležite rezultate (Preglednica 13): a) Kontrolna meritev. b) Veter: simulirajte ga tako, da v rastlino zelo rahlo pihate s fenom (pri močnem vetru se reže zaprejo). c) Povečanje vlažnosti: povečate jo tako, da poganjek prekrijete s plastično vrečko. d) Zmanjšanje listne površine za 1/2: zmanjšajte jo tako, da odstranite polovico listov. 2. Transpiracija Listno površino izmerite tako, da po koncu meritev s poganjka odstranite vse liste in izračunate njihovo listno površino. To naredite tako, da liste prerišete na milimetrski papir in na njem preštejete kvadrate. Rezultate izrazite v porabi vode na enoto časa in na listno površino (cm3 h-1m-2) (Preglednica 15). 10. vaja: Merjenje sprejema vode v rastlino 55. Slika 5: Skica potometra REZULTATI IN OPAŽANJA Preglednica 13: Vpliv dejavnikov okolja na porabo vode Poraba vode (ml) čas (min) kontrola veter (fen) vlažnost (vrečka) 1/2 listne površine 56 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Preglednica 14: Sprejem vode pri različnih dejavnikih okolja Povprečna poraba vode (cm3 h-1) kontrola veter (fen) vlažnost (vrečka) 1/2 listne površine Preglednica 15: Transpiracija vode pri različnih dejavnikih okolja Povprečna izguba vode na listno površino (cm3 h-1 m-2) kontrola veter (fen) vlažnost (vrečka) 1/2 listne površine Narišite krivulji časovnega poteka porabe vode in transpiracije! FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 11. vaja: Koloidni sistemi UVOD V živih organizmih je ogromno spojin v koloidnem stanju. Njihovi pomembni lastnosti sta: da imajo električni naboj in da nabrekajo – na svojo površino vežejo ione ali molekule z drugačnim električnim nabojem (liofilni koloidi). Koloidno raztopino v notranjosti celice predstavlja citoplazma. Citoplazma je koloidna raztopina snovi v velikosti 1–1000 nm, ki napolnjuje notranjost celic in je razdeljena na dve komponenti: tekočo frakcijo, znano kot citosol ali citoplazemski matriks, in organele, ki so v njej pri evkariontskih celicah. Citosol je želatinasta koloidna raztopina celice (včasih brezbarvna, včasih sivkasta snov), citoplazme in je sestavljen iz ogromne količine topljenih snovi, kot so ioni, vmesni presnovki, ogljikovi hidrati, lipidi, beljakovine in ribonukleinske kisline (RNA). Lahko je v dveh medsebojno spremenjivih fazah kot gel ali kot sol. Med najpomembnejšimi elementi so: ogljik, vodik, dušik, kisik, fosfor in žveplo. Prav tako je citosol bogat z ioni, ki povzročajo zvišanje osmotskega tlaka celice in pomagajo vzdrževati optimalno kislo-bazično ravnovesje v celičnem okolju. 60 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Raznolikost ionov, ki jih najdemo v citosolu, je odvisna od tipa celice. Na primer, mišične in živčne celice imajo visoke koncentracije kalija in magnezija, kalcijevih ionov pa je še posebej veliko v krvnih celicah. V rastlinskih celicah so predvsem koloidi, v katerih je disperzijsko sredstvo voda (hidrofilni koloidi). Pri njihovem nabrekanju se dipoli vode vežejo na makromolekule, ki so največkrat proteini, lahko pa so tudi polisaharidi. Delovanje takih koloidnih sistemov ponazarja vaja, v kateri pripravimo disperzjiski sistem iz agarja (polisaharida z negativnim nabojem makromolekul) in iz vode oziroma različnih ionskih raztopin. Negativno nabit agar v vodi nabreka, ker se na njegovo površino vežejo molekule vode. VPRAŠANJA Kaj so disperzni sistemi? Kateri od njih so koloidni sistemi? 11. vaja: Koloidni sistemi 61. Kaj je disperzijska faza in disperzijsko sredstvo? Kako pripravimo spodaj omenjene koncentracije raztopin? Kako jih izračunamo? 62 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Katere podatke potrebujemo? Kaj je molarnost in molarna koncentracija? CILJI − Na modelu boste simulirali tista dogajanja v rastlinskih celicah, ki so posledica lastnosti hidrofilnih koloidov. NALOGA 1. Ugotovite vpliv dodanih ionov na nabrekanje agarja v odvisnosti od kombinacije dodanih ionov, njihovih el. nabojev, velikosti ionov in njihovega hidratacijskega ovoja. MATERIAL Šest epruvet enakega premera, 25-ml menzura, večja čaša, žlička, tehtnica, stojalo za epruvete. 11. vaja: Koloidni sistemi 63. KEMIKALIJE Agar, 1 M raztopine KI, KBr, KCl, NaCl, LiCl, deionizirano voda. IZVEDBA 1. V šest enakih epruvet pazljivo stresite po 0,5 g agarja (Slika 6). 2. V pet epruvet napolnite po 10 ml posameznih raztopin (KI, KBr, KCl, NaCl, LiCl), šesto pa z enako količino destilirane vode in na epruvete takoj označite vrsto raztopine. 3. Epruvete postavite v vročo vodno kopel. Po eni uri preverite in zabeležite nivo nabreklega agarja. REZULTATI IN OPAŽANJA Vrišite (fotografirajte) nivo nabreklega agarja v vsaki od epruvet in razložite rezultate (Slika 6). Slika 6: Vpliv ionov (KI, KBr, KCl, NaCl, LiCl) v koloidnem sistemu 64 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. ZAPISKI FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 12. vaja: Plazmoliza UVOD Plazmoliza je odstop celična membrane od celične stene kot posledica krčenja vakuole zaradi oddajanja vode v hipertoničnem okolju (okolju z večjo koncentracijo raztopljene snovi). Rastlinske celice so v običajnem stanju v turgorju. Zaradi turgorja se hranilne raztopine premikajo med celicami, rastline imajo tonus in ostanejo pokonci. V celici s pravo količino vode celična membrana stisne celično steno in je v popolnem stiku z njo. Ko je ta celica v hipertonični raztopini, voda začne prehajati iz celice, kar sprva ne vpliva na celično steno. Ker pa se voda iz celice, zaradi hipertoničnega okolja, še naprej izgublja, se pojavi prvi znak krčenja celične vsebine – začetna prva faza plazmolize, kjer se celična membrana na koncih odtrga od celične stene, a še ohranja stik v drugih regijah. V drugi fazi, ko celica v hipertoničnih pogojih še naprej izgublja vodo, se celična membrana popolnoma strga s celične stene, se skrči in doseže sferično obliko ter ostane v središču celice. 66 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Ko eksosmoza traja, krčenje celice in citoplazme doseže najnižjo mejo in nadaljnje krčenje prostornine ni mogoče. Glede na končno obliko citoplazme je končna plazmoliza razdeljena na dve vrsti: konkavna plazmoliza in konveksna plazmoliza. Med konkavno plazmolizo se protoplazma in celična membrana krčita in ločujeta od celične stene zaradi izgube vode. Ko se začne ločevati od celične stene, se protoplazma spremeni v protoplast. Ta postopek se lahko obrne, če celico postavimo v hipotonično raztopino, zaradi katere bo voda spet tekla v celico. Konveksna plazmoliza nastopi, ko celična membrana in protoplast izgubijo toliko vode, da se popolnoma ločijo od celične stene. Konveksne plazmolize ni mogoče popraviti in vodi do uničenja celic. Takšna rastlina ovene, umre zaradi pomanjkanja vode. V laboratoriju lahko plazmolizo ponazorimo tako, da damo živo celico v raztopino natrijevega klorida ali raztopino katere druge soli, kjer bo koncentracija vode v celici večja kot zunaj celice. Zato voda potuje iz celice skozi celično membrano do medija zunaj celice. Končno se protoplazma loči od celične stene in prevzame sferično obliko in povzroči plazmolizo. Ko plazmolizirano celico damo v hipotonično raztopino (raztopina, v kateri je koncentracija topljene snovi nižja od celičnega soka), voda potuje v celico zaradi večje koncentracije vode zunaj celice. Nato celica nabrekne in ponovno dobi svoj turgor. Ta proces obnovitve normalnega turgorja plazmolizirane celice je znan kot deplazmoliza. VPRAŠANJA Kaj je difuzija, osmoza, osmolarnost, toničnost, plazmoliza, vodni potencial celice? 12. vaja: Plazmoliza 67. Ponovite: celična stena, plazmalema, citoplazma, tonoplast, vakuola, protoplazma! 68 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. CILJI − Spoznali boste obnašanje celic v različnih raztopinah z različnim vodnim potencialom. − Spoznali boste plazmolizo: vrste plazmolize, mejno plazmolizo in deplazmolizo. NALOGA Opazujte in narišite posamezne stopnje plazmolize: 1. mejna plazmoliza, 2. konkavna plazmoliza (nizka viskoznost protoplazme) 12. vaja: Plazmoliza 69. 3. konveksna plazmoliza (visoka viskoznost protoplazme) 4. čepičasta plazmoliza (tonoplat in plazmalema nista enako propustni za ozmotik) MATERIAL Rdeča čebula ( Al ium cepa), mikroskop in pribor za mikroskopiranje, britvica ali skalpel, filtrirni papir. KEMIKALIJE 1 M raztopina KNO3, 0,7 M Ca(NO3)2 , 1 M raztopina saharoze, 1 M raztopina KSCN. 70 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. IZVEDBA 1. V zgornjo stran omesenele listne baze čebule z britvico zarežite približno 5 x 5 mm velik kvadrat. S pinceto previdno oluščite povrhnjico, jo položite na objektno steklo v kapljico izbrane hipertonične raztopine, pokrijte s krovnim steklom in takoj z mikroskopom opazujte spreminjanje protoplasta celice. Opazujte tako dolgo, da se plazmoliza ustali in neha napredovati. Posamezne stopnje plazmolize narišite. Delajte postopno, zato si vedno pripravite samo en preparat, ga opazujte, narišite in šele nato pripravite novega. Pripravili boste štiri preparate: a) Tkivo položite v kapljico hipertonične raztopine KNO3 in takoj opazujte spreminjanje protoplasta celice, posamezne stopnje plazmolize narišite. b) Tkivo položite v kapljico hipertonične raztopine Ca(NO3)2 in takoj opazujte spreminjanje protoplasta celice, posamezne stopnje plazmolize narišite. c) Tkivo položite v kapljico hipertonične raztopine saharoze in takoj opazujte spreminjanje protoplasta celice, posamezne stopnje plazmolize narišite. d) Tkivo položite v kapljico hipertonične raztopine KSCN in takoj opazujte spreminjanje protoplasta celice, posamezne stopnje plazmolize narišite. 2. Ob krovno stekelce, pod katerim je tkivo v eni od zgoraj omenjenih raztopin, dokapajte destilirano vodo in jo s pomočjo filtrirnega papirja povlecite na drugo stran. Opazujte spremembe protoplasta celice in razložite ter definirajte dogajanje. REZULTATI IN OPAŽANJA FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 13. vaja: Merjenje vodnega potenciala z mejno plazmolizo UVOD Večina teorije o plazmolizi, vodnem potencialu ste usvojili na predavanjih. Z odgovori na vprašanja ponovite in razložite teoretične osnove. VPRAŠANJA Kaj je vodni potencial celice? 72 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Kaj je osmotičnost? Kaj je toničnost? Kdaj je celica (ali tkivo) izo-, hipo- ali hipertonična(o) v primerjavi z raztopino, v kateri se nahaja? 13. vaja: Merjenje vodnega potenciala z mejno plazmolizo 73. Kdaj v celici nastopi mejna plazmoliza in kakšen je takrat njen vodni potencial in vodni potencial raztopine, ki jo obdaja? Kako pripravimo različne raztopine plazmolitikov? Katere podatke potrebujemo in kako bi to izračunali? 74 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Kaj je molarnost ali molarna koncentracija? Obstaja več metod, s katerimi ugotavljamo vodni potencial celic ali tkiv. Eden najpogostejših načinov je s pomočjo mejne plazmolize. Takrat velja, da je vodni potencial celice (ψc) enak vodnemu potencialu raztopine (ψr), v kateri se celica nahaja. V tej točki velja ψ celice = ψ raztopine. Raztopina, v kateri se je začela mejna plazmolizo, ima skoraj enak (nekoliko nižji) vodni potencial kot raztopina, ki se nahaja znotraj celice. CILJI − Izmerili boste vodni potencial celice z mejno plazmolizo. 13. vaja: Merjenje vodnega potenciala z mejno plazmolizo 75. NALOGA 1. Tkivo luskolista čebule oziroma celice tkiva boste polagali v serijo plazmolitikov z naraščajočo koncentracijo in ugotavljali, v kateri raztopini plazmolitika nastopi mejna plazmoliza! (Mejna plazmoliza nastopi med raztopino, ko protoplast celice začne odstopati od celične stene in med raztopino z nižjo koncentracijo). 2. Na podlagi podatka mejne plazmolize izračunajte vodni potencial raztopine. MATERIAL Rdeča čebula ( Al ium cepa), 12 objektnih in krovnih stekel, britvica ali skalpel, pinceta, krovna stekelca, mikroskop. KEMIKALIJE Raztopine plazmolitika KNO3 (ali saharoze): 0,00 M, 0,05 M, 0,10 M, 0,15 M, 0,20 M, 0,25 M, 0,30 M, 0,35 M, 0,40 M, 0,45 M, 0,50 M, 0,60 M. IZVEDBA 1. Na posamezno objektno stekelce kanite dve kapljici posamezne raztopine iz serije različnih koncentracij. 2. V vsako položite košček povrhnjice z luskolista čebule in ga prekrije s krovnim stekelcem. 3. S pomočjo mikroskopa opazujte, pri kateri koncentraciji je nastopila mejna plazmoliza. Če je plazmolitik KNO3, takoj opazujemo plazmolizo, če pa je plazmolitik saharoza, opazujemo plazmolizo šele po približno pol ure. (Zakaj?) Raztopina v celici je izotonična nekje med raztopino, pri kateri nastopi mejna plazmoliza, in med raztopino z nižjo koncentracijo. Vodni potencial raztopine izračunajte po enačbi (5): ψr = - c ⋅ i ⋅ R ⋅ T (5) ψr = vodni potencial raztopine (1 Pa = N m-2, N = Newton); c = molarna koncentracija raztopine (mol l-1); i = izoozmotska konstanta; za saharozo i = 1; za KNO3 i = 1.69; R = splošna plinska konstanta (8,3 J mol-1 K-1; J = N m); 76 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. T = temperatura v kelvinih (T = 0 °C = 273 °K) 1 bar = 0,987 atm = 105 Pa = 100 kPa 1000 kPa = 1 MPa. REZULTATI IN OPAŽANJA Vodni potencial (ψ) sestavljata potencial raztopine (ψr) in potencial tlaka (ψp). Zakaj v vaših meritvah niste upoštevali potenciala tlaka? FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 14. vaja: Spremljanje simptomov fizioloških motenj ob pomanjkanju določenih hranil UVOD Avtotrofni način prehranjevanja ne obsega samo sinteze ogljikovih hidratov iz CO2 in iz H+, katerega donor (darovalec) je voda, ampak vključuje tudi sintezo drugih organskih snovi, za katere so potrebni mineralni elementi, kot so N, S, P, K, Ca . . Nekateri od njih so rastlinam potrebni v velikih količinah (>0.1%), zato jih imenujemo makrohranila (N, O, H, C, P, S, K, Ca, Mg), drugi so potrebni v zelo majhnih količinah (<0.1 %), zato jih imenujejo mikrohranila (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, Co). Pomanjkanje posameznega elementa se kaže v simptomih, ki so bodisi zaostajanje v rasti, rumenenje (kloroza – propad klorofila), rjavenje (nekroza – propad mezofila) ali drugo. Simptomi pomanjkanja elementov, ki se dobro prevajajo po rastlini, se kažejo po celi rastlini (N, P) ali v starejših delih rastlin, kot so starejši listi (K, Mg). Simptomi tistih, ki se slabo prevajajo po rastlini, pa se kažejo predvsem v mladih delih rastlin, kot so poganjki in mladi listi (S, Ca, Fe, B, Mn). Več o mineralni prehrani boste izvedeli na predavanjih. 80 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. CILJI − S pomočjo tehnike vodne kulture – hidroponike (rastline rastejo v hranilnih raztopinah z znanimi količinami mineralnih elementov) boste spoznali rast in razvoj rastlin v popolni hranilni raztopini in v hranilnih raztopinah, ki smo ji odvzeli enega ali več elementov in ob tem spremljali (spoznali) simptome ob pmanjkanju določenih hranil NALOGA 1. Pripravite posamezne hranilne vodne raztopine. 2. Hranilnim raztopinam izmerite pH in v njih namestite rastline, katerim pred tem izmerite dolžino cele rastline, poganjka in glavne korenine, določite število listov. 3. V času trajanja poskusa (poskus traja dva meseca) vsak teden nadomeščajte izhlapelo vodo oziroma ustrezno hranilno raztopino. 4. Vsakih štirinajst dni opazujte in opišite simptome pomanjkanja, izmerite dolžino cele rastline, poganjka in glavne korenine, določite število listov. 5. Na koncu poskusa izmerite pH hranilne raztopine. MATERIAL Mlade rastline paradižnika, enolitrske kozarce, ovite z aluminijasto folijo, nalepke, svinčnik ali alkoholni flomaster, indikator pH, pokrovi z dvema manjšima in eno večjo odprtino. KEMIKALIJE 1 M Ca(NO3)2, 1 M KNO3, 1 M MgSO4, 1 M KH2PO4, raztopina Na-FeEDTA*1, 1 M NaNO3, 1 M MgCl2, 1 M Na2SO4, 1 M NaH2PO4, 1 M CaCl2 1 M KCl, raztopina mikroelementov*2 Priprava raztopin: *1 raztopina Na-FeEDTA; 5,57 g FeSO4 × 7H2O v 200 ml deionizirane vode. Nato raztopi 7,45 g Na2EDTA v 200 ml deionizirne vode. Obe raztopini segrevaj in med segrevanjem mešaj, nato ohladi in dopolni do 1000 ml. *2 raztopina mikroelementov; 2,86 g H3BO4, 1,81 g MnCl2 × 4H2O, 0,11 g ZnCl2, 0,05 g CuCl2 × 2H2O in 0,025 g Na2MoO4 × 2H2O dopolnimo z deionizirano vodo do 1000 ml. 14 vaja: Spremljanje simptomov fizioloških motenj ob pomanjkanju določenih hranil 81. IZVEDBA 1. Vsak kozarec napolnite najprej z deionizirano vodo do polovice predvidenega volumna, nato po spodnji preglednici (Preglednica 16) odpipetirajte posamezne ionske raztopine in jih dopolnite z deionizirano vodo do umeritvene oznake. Vsaki raztopini izmerite pH. 2. Kozarec ovijete v aluminijasto folijo in ga opremite z nalepko, na kateri je zapisan manjkajoči element ali kontrolna polna raztopina (komplet) ali deionizirana voda. 3. Rastlinam, ki ste jih izbrali za poskus, iz korenin očistite (sperite s tekočo vodo) zemljo in jim izmerite vse potrebne parametre (Preglednica 17). 4. Vsako od njih vstavite v največjo odprtino pokrova tako, da je na mestu stika s pokrovom ovita (stabilizirana) z vato. Vata naj ostane ves čas trajanja poskusov suha. 5. Z zamaškom zaprite kozarec in ga prenesite poskusni prostor v učilnici. Nivo hranilne raztopine vzdržujte tako, da po potrebi dolijete ustrezno hranilno raztopino. Vsak drugi teden izvedite meritve (Preglednica 17) in opazovanja ter vse zabeležite (Preglednica 17). Pazite, da ob tem ne poškodujete rastlin. Preglednica 16: Sestava hranilnih raztopin ml Hranilna raztopina Deion. (1M) Komplet - Ca - S - Mg - K - N - P - Fe - Mikroelementi H2O Ca(NO3)2 10 - 10 10 10 - 10 10 10 - KNO3 10 10 10 10 - - 10 10 10 - MgSO4, 4 4 - - 4 4 4 4 4 - KH2PO4 2 2 2 2 - 2 - 2 2 - NaFeEDTA 2 2 2 2 2 2 2 - 2 - Mikroelementi 2 2 2 2 2 2 2 2 - - NaNO3 - 20 - - 10 - - - - - MgCl2 - - 4 - - - - - - - Na2SO4 - - - 4 - - - - - - NaH2PO4 - - - - 2 - - - - - CaCl2 - - - - - 10 - - - - KCl - - - - - 10 2 - - - 82 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. REZULTATI IN OPAŽANJA Preglednica 17: Hranilna raztopina:_____________________________ in opaženi simptomi a njk ne anil Opaženi simptomi atum hr topine* (cm) D ina poga ina korenin (cm) pH raz olž olž D D *Izmerimo na začetku poskusa in na koncu poskusa. 14 vaja: Spremljanje simptomov fizioloških motenj ob pomanjkanju določenih hranil 83. VPRAŠANJA Kakšen je pomen pH v hranilni raztopini? Ali se pH hranilnih raztopin spreminja tekom trajanja poskusa? Zakaj? Zakaj se simptomi pomanjkanja nekaterih elementov pokažejo sprva v starih listih, medtem ko se pri drugih to zgodi najprej v mladih listih? 84 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Zakaj se nekateri simptomi pokažejo prej kot drugi? S pomočjo literature dopolni Preglednico 18! 14 vaja: Spremljanje simptomov fizioloških motenj ob pomanjkanju določenih hranil 85. Preglednica 18: Simptomi pomanjkanja MAKROELEMENTI Elem. Oblika sprejema Kje ga najdemo? Simptomi pomanjkanja? N NO3- proteini, NK, encimi, NH4+ klorofil, nukleotidi, proteini, NK, P PO43+ GTP, ATP, H2PO4- FAD, NADP, lipidi povezan je s funkcijami membran, kofaktor v K K+ fotosintezi in respiraciji, v citoplazmi v ionski obliki, vezan tudi na beljakovine sinteza proteinov (cistein, S SO cistin, metionin), 42- koencim A, - SH skupina v encimih v osrednji lameli celične stene Ca Ca (protopektinsko omrežje), 2+ vezan je v organelih, v citoplazmi ga je malo sprejemnik elektronov v klorofilu – fotosinteza, strukturni gradnik osrednje Mg Mg2+ lamele, ionska vez med molekulami pektina, povezovanje ribosomskih podenot sodeluje v biosintezi klorofila (na koncu ga zamenja Mg) Fe Fe3+ fotosinteza (feredoksin), dihalna veriga (citokrom oksidaza), 86 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. MIKROELEMENTI Elem. Oblika sprejema Kje ga najdemo? Simptomi pomanjkanja? Mn kofaktor v encimih (fosfataze, avksin oksidaza) Cu kofaktor v encimih (citokrom oksidaza), dihalna veriga (PQ) anaerobna respiracija Zn (alkoholno vrenje), biosinteza triptofana Mo kofaktor v encimih (nitrat reduktaza) B normalna celična delitev meristemov, biosinteza NK Co kofaktor vitamin B12 FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 15. vaja: Kvalitativno določanje reduktivnih sladkorjev UVOD Reduktivni sladkorji so aldoze in ketoze s prosto reaktivno -OH skupino, ki ni blokirana z glikozidno vezjo. Reduktivni sladkorji so vsi monosaharidi, kot sta glukoza in fruktoza, in nekateri disaharidi, kot so na primer maltoza, laktoza in celobioza. Saharoza ni reduktivni sladkor. VPRAŠANJA Kje v metabolizmu rastlinskih celic nastajajo reduktivni sladkorji? 90 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Kje in v kakšni obliki se transportirajo sladkorji po rastlini od mesta nastajanja na mesto porabe in kako poteka transport? V kakšni obliki jih rastlina skladišči? V kaetrih celičnih organelih in rastlinskih organih rastline skladiščijo rezervne sladkorje? 15. vaja: Kvalitativno določanje reduktivnih sladkorjev 91. V katerem delu leta je največ sladkorjev v založni obliki? Kako prehajajo sladkorji skozi celulozno celično steno in plazmalemo? 92 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. CILJI − Ugotavljali boste prisotnost reduktivnih sladkorjev v listih. − Seznanili se boste Fehlingovim testom za reduktivne sladkorje. NALOGA 1. Ugotovite prisotnost reduktivnih sladkorjev v ekstraktu listov trave in ekstraktu luskolistov čebule in ju med seboj primerjajte (fotografirajte). MATERIAL Rastlinski material (zelena trava, čebula idr.),voda, terilnica s pestilom, filtrirni papir, lijak, manjša čaša, višja epruveta, gorilnik, oprijemalka. KEMIKALIJE Fehlingov reagent I. (3,5 g CuSO4 × 5H2O + 100 ml destilirane H2O) in Fehlingov reagent II. (18 g C4H4O6NaK + 6 g NaOH + 100 ml destilirane H2O). IZVEDBA Travo in luskoliste čebule,vsakega posebej stremo v terilnici. Dodamo nekaj ml vode in ekstrakt prefiltriramo. Fehlingov test: V epruveto nalijemo približno 2 ml ekstrakta (2 prsta) in dodamo najprej 1ml Fehlingovega reagenta I. (1/2 prsta), nato pa enako količino Fehlingovega reagenta II. in segrevamo nad plamenom do nastanka oborine. 15. vaja: Kvalitativno določanje reduktivnih sladkorjev 93. Barva končne oborine (precipitata) se namreč spreminja od zelene, rumene, oranžne do rdeče-rjave, odvisno od količine reduktivnih sladkorjev. (Začetna rumena barva precipitata daje z modro barvo bakrovega sulfata zeleno . .). Fehlingov reagent vsebuje bakrov sulfat (CuSO4). Reduktivni sladkorji reducirajo topni in modro obarvani bakrov sulfat (modro galico), ki vsebuje bakrove (II) ione (Cu2+) v netopen rdečerjav bakrov oksid (Cu2O), ki vsebuje baker (I) v drugačni ionski obliki (Cu+).Raztopina lahko med segrevanjem burno reagira, zato je potrebna previdnost – epruveto obrnite stran od sebe ali drugih. Test je semikvantitativen, kar pomeni, da je možna groba ocena količine reduktivnih sladkorjev. REZULTATI IN OPAŽANJA 94 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. ZAPISKI FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 16. vaja: Kvantitativna ocena reduktivnih sladkorjev UVOD Alternativa Nelson-Somogyijevi metodi za kvantitativno oceno reduktivnih sladkorjev je metoda z reagentom DNS (dinitrosalicilne kisline). Je preprosta, občutljiva in sprejemljiva ter primerna za obdelavo večjega števila vzorcev v danem času (Sadasivam & Manickam, 2007, str. 6). CILJI − Določili boste količino reduktivnih sladkorjev, prisotnih v vašem izbranem vzorcu, s pomočjo umeritvene krivulje in z uporabo standardnega grafa. MATERIAL Spektrofotometer (SpectroVis Plus), program LoggerPro3, računalnik, kivete, vata, puhalka z destilirano vodo, 1000-ml čaša za odpadno tekočino, epruvete, stojalo za epruvete, pipete, tipsi, erlenmajerice s pokrovčki, čaše, lij, filtrirni papir, terilnica s pestilom, nož, podlaga za rezanje, vodna kopel (100-ml čaša, napolnjena z vodo do oznake 500 ml), kuhalnik, analitska tehtnica, steklene palčke, dozirne žličke, papirnate brisače, alkoholni flomaster; rastlinski material (npr. kalčki semen, plodovi dreves, gomolji …). 96 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. KEMIKALIJE Destilirana voda (H2O), glukoza v prahu (C6H12O6), fruktoza v prahu (C6H12O6), 3,5-dinitrosalicilna kislina (C7H4N2O7), natrijev hidroksid (NaOH), kristalni fenol (C6H5OH), natrijev sulfit (Na2O3S), kalij-natrijev tartrat (C4H4KNaO6 ∙ 4H2O). Priprava DNS reagenta (reagenta iz 3,5-dinitrosalicilne kisline) V prvo 50-ml čašo natehtamo 1 g 3,5-dinitrosalicilne kisline, v drugo 200 mg kristalnega fenola in v tretjo 50 mg natrijevega sulfita. Z alkoholnim flomastrom na čaše napišemo njihovo vsebino. V 100-ml čašo natehtamo 1 g natrijevega hidroksida in dopolnimo z destilirano vodo do oznake 100 ml. Dobro premešamo. Tako dobimo 1 % raztopino NaOH. Nekaj te raztopine vlijemo v čaše, v katere smo prej natehtali kemikalije in dobro premešamo. Raztopine iz vseh treh čaš vlijemo v 100-ml bučko. Vse tri čaše operemo z 1 % raztopino NaOH in vse skupaj prelijemo v 100-ml bučko. Preostanek 1 % raztopine NaOH prelijemo v 100-ml bučko. Bučko označimo z nalepko, na katero napišemo DNS reagent in datum. Raztopino hranimo pri temperaturi 4 °C. V primeru daljšega hranjenja raztopine lahko natrijev sulfit dodamo, ko bomo raztopino uporabili, saj natrijev sulfit poslabša kakovost reagenta ob dolgem hranjenju (Preglednica 18). 40-% raztopino Rochellejeve soli (kalij-natrijevega tartrata) pripravimo tako, da v 50-ml čašo natehtamo 20 g kalij-natrijevega tartrata, dopolnimo z destilirano vodo do oznake 50 ml in dobro premešamo. Raztopino hranimo v 5-ml bučki, ki jo označimo z nalepko, na katero napišemo 40-% Rochellejeva sol in datum (Preglednica 19). Preglednica 19: Priprava DNS reagenta Kemikalije Količina 1-% raztopina NaOH natrijev hidroksid 1 g destilirana voda do oznake 100 ml dinitrosalicilna kislina 1 g kristalni fenol 200 mg natrijev sulfit 50 mg 40-% raztopina kalij-natrijev tartrat 20 g Rochel ejeve soli destilirana voda do oznake 50 ml 16. vaja: Kvantitativna ocena reduktivnih sladkorjev 97. NALOGA 1. Pripravite standardne raztopine za glukozo in nato različne koncentracije le-te. 2. Na podlagi izmerjenih absorbanc posameznih koncentracij glukoze narišite umeritveno krivuljo za glukozo. 3. Na podlagi izmerjenih absorbanc ekstraktov izbranih vzorcev iz umeritvene krivulje določite količino glukoze. 4. Pripravite standardne raztopine za fruktozo in nato različne koncentracije le-te. 5. Na podlagi izmerjenih absorbanc posameznih koncentracij fruktoze narišite umeritveno krivuljo za fruktozo. 6. Na podlagi izmerjenih absorbanc ekstraktov izbranih vzorcev iz umeritvene krivulje določite količino fruktoze. IZVEDBA Priprava umeritvene krivulje Osnovna standardna raztopina glukoze (1 mg ml-1) V 100-ml merilno bučko natehtajte 100 mg glukoze in z destilirano vodo dopolnite do oznake 100 ml ter dobro premešajte. Osnovna standardna raztopina fruktoze (1 mg ml-1) V 100-ml merilno bučko natehtajte 100 mg fruktoze in z destilirano vodo dopolnite do oznake 100 ml ter dobro premešajte. Priprava standardnih raztopin glukoze Pripravite 8 erlenmajeric z volumnom 50 ml in jih označite s črkami od Ag do Hg. V vsako erlenmajerico odpipetirajte ustrezen volumen osnovne standardne raztopine glukoze, in sicer 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0, 12,0 14,0 in 16,0 ml. Vse erlenmajerice dopolnite z destilirano vodo do oznake 50 ml in dobro pretresite (Preglednica 20). Tako boste dobili standardne raztopine glukoze z masnimi koncentracijami 0,04 mg/ml, 0,08 mg/ml, 0,12 mg ml-1, 0,16 mg ml-1, 0,20 mg ml-1, 0,24 mg ml-1, 0,28 mg ml-1 in 0,32 mg ml-1 (Preglednica 20). 98 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Preglednica 20: Priprava standardnih raztopin glukoze Erlenmajerica Ag Bg Cg Dg Eg Fg Gg Hg Volumen osnovne standardne raztopine glukoze (ml) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 Volumen destilirane vode (ml) 48,0 46,0 44,0 42,0 40,0 38,0 36,0 34,0 Masna koncentracija glukozeγg (mg ml-1) 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32 Priprava standardnih raztopin fruktoze Pripravite 8 erlenmajeric z volumnom 50 ml in jih označite s črkami od Af do Hf. V vsako erlenmajerico odpipetirajte ustrezen volumen raztopine fruktoze, in sicer 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0, 12,0 14,0 in 16,0 ml (Preglednica 21). Vse erlenmajerice dopolnite z destilirano vodo do oznake 50 ml in dobro pretresite. Tako boste dobili standardne raztopine fruktoze z masnimi koncentracijami 0,04 mg ml-1, 0,08 mg ml-1, 0,12 mg ml-1, 0,16 mg ml-1, 0,20 mg ml-1, 0,24 mg ml-1, 0,28 mg ml-1 in 0,32 mg ml-1 (Preglednica 21). Preglednica 21: Priprava standardnih raztopin fruktoze Erlenmajerica Af Bf Cf Df Ef Ff Gf Hf Volumen osnovne standardne raztopine fruktoze (ml) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 Volumen destilirane vode (ml) 48,0 46,0 44,0 42,0 40,0 38,0 36,0 34,0 Masna koncentracija fruktoze γf (mg ml-1) 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32 Priprava raztopin glukoze za merjenje s spektrofotometrom V slepo epruveto nalijte 3 ml destilirane vode in 3 ml DNS reagenta. V ostale epruvete, označene s številkami od 1 g do 8 g, dodajte 3 ml ustrezne standardne raztopine glukoze in 3 ml DNS reagenta. Vse epruvete dajte za 5 min v vrelo vodno kopel, nato pa jih ohladite, da so še vedno tople, ter dodajte v vsako po 1 ml Rochellejeve soli. Epruvete dobro pretresite. V vse epruvete dodajte še 3 ml destilirane vode, jih pretresite in ohladite na sobno temperaturo (Preglednica 22). Preglednica 22: Priprava raztopin glukoze za meritev absorbance Epruveta Slepa g 1g 2g 3g 4g 5g 6g 7g 8g Standardna raztopina glukoze (merilna bučka) / A B C D E F G H Standardna raztopina glukoze (ml) 0,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 DNS reagent (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Destilirana voda (ml) 6,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Raztopina Rochellejeve soli (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 16. vaja: Kvantitativna ocena reduktivnih sladkorjev 99. Priprava raztopin fruktoze za merjenje s spektrofotometrom V slepo epruveto nalijte 3 ml destilirane vode in 3 ml DNS reagenta. V ostale epruvete (označite s številkami od 1f do 8f) dodajte 3 ml ustrezne standardne raztopine fruktoze in 3 ml DNS reagenta. Vse epruvete dajte za 5 min v vrelo vodno kopel, nato pa jih ohladite, da so še vedno tople, ter dodajte v vsako po 1 ml Rochellejeve soli. Epruvete dobro pretresite. V vse epruvete dodajte tudi 3 ml destilirane vode, jih pretresite in ohladite na sobno temperaturo (Preglednica 23). Preglednica 23: Priprava raztopin fruktoze za merjenje absorbance Epruveta Slepa f 1f 2f 3f 4f 5f 6f 7f 8f Standardna raztopina fruktoze (merilna bučka) / A B C D E F G H Standardna raztopina fruktoze (ml) 0,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 DNS reagent (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Destilirana voda (ml) 6,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Raztopina Rochellejeve soli (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Merjenje absorbance (A) raztopinam glukoze in fruktoze S spektrofotometrom izmerite absorbanco raztopine v vsaki epruveti posebej pri valovni dolžini 512 nm (A 512). Nato pripravite umeritveno krivuljo – glukozno specifično absorbanco v odvisnosti od koncentracije glukoze in fruktozno specifično absorbanco v odvisnosti od koncentracije fruktoze. Na podlagi rezultatov narišite umeritveno krivuljo (Preglednica 24 in Preglednica 25). Priprava ekstrakta (vzorcev) iz preiskovanega rastlinskega materiala Natehtajte 0,5 g rastlinskega materiala (trave, čebule …) in jo ob dodajanju destilirane vode strite v terilnici. Ekstrakt prefiltrirajte v čašo in filtrat dopolnite z destilirano vodo do oznake 50 ml. Merjenje absorbance rastlinskih vzorcev V epruveto odpipetirajte 3 ml ekstrakta rastlinskega materiala (vzorca) in dodajte 3 ml DNS reagenta. Epruveto 5 min segrevajte v vreli vodni kopeli in jo nato ohladite pod tekočo vodo tako, da je še vedno topla. Dodajte1 ml Rochellejeve soli in dobro pretresite. Dodajte tudi 3 ml destilirane vode in epruveto pretresite. Epruveto ohladite na sobno temperaturo in izmerite absorbanco pri valovni dolžini 512 nm (A 512) in zabeležite (Preglednica 26 in Preglednica 27). 100 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. REZULTATI IN OPAŽANJA Preglednica 24: Absorbance (optične gostote) za različne masne koncentracije glukoze Masna koncentracija Absorbanca (A) Glukozno glukoze Povprečna specifična γg (mg ml 1. meritev 2. meritev 3. meritev absorbanca A -1) (Ā) (Ā–A slepa) Preglednica 25: Absorbance (optične gostote) za različne masne koncentracije fruktoze Masna koncentracija Absorbanca (A) Fruktozno glukoze Povprečna specifična γf (mg ml 1. meritev 2. meritev 3. meritev absorbanca A -1) (Ā) (Ā–A slepa) 16. vaja: Kvantitativna ocena reduktivnih sladkorjev 101. Preglednica 26: Absorbance (optične gostote) posameznih vzorcev za določitev glukoze Absorbanca (A) Glukozno Vzorec Povprečna specifična 1. meritev 2. meritev 3. meritev absorbanca A (Ā) (Ā–A slepa) Preglednica 27: Absorbance (optične gostote) posameznih vzorcev za določitev fruktoze Absorbanca (A) Fruktozno Vzorec Povprečna specifična 1. meritev 2. meritev 3. meritev absorbanca A (Ā) (Ā–A slepa) Račun: Izračunajte količino reduktivnih sladkorjev, prisotnih v vzorcu, z uporabo standardnega grafa. 102 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 17. vaja: Triticum test za določanje hormonov – citokininov UVOD Bioteste lahko uporabimo za določanje rastlinskih hormonov ali njim podobnih substanc. Rastlinski hormoni so naravni rastlinski rastni regulatorji (RRR). Tako naravni RRR kot tudi sintetični RRR, v majhnih količinah kvalitativno ali kvantitativno vplivajo na rast. Rastlinski hormoni so skupina organskih snovi in so najpomembnejši notranji regulatorji rasti in razvoja. Gre za organske molekule, ki so v rastlinah v zelo majhnih koncentracijah in ne služijo kot hranila. Sintetizirajo se v določenih delih rastline, se po njej premeščajo in v tarčnih celicah, tkivih, sprožijo odzive celic (Vodnik, 2012). Za kvantitativno merjenje vsebnosti rastlinskih hormonov uporabljajo dve prevladujoči metodi: Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC – angl. high performance liquid chromatography) in plinska kromatografija (GC – angl. gas cromatography), ki ji v nadaljevanju sledi tudi masna spektrometrija (MS – angl. mass spectrometry ). Obe metodi sta natančni, a zapleteni in dragi. 106 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Obstajajo tudi klasični načini določanja rastlinskih hormonov in njim podobnih substanc, in sicer z biotesti, ki vključujejo uporabo rastlinskega materiala za določanje rastlinskim hormonom podobnih substanc (Vodnik, 2012). Biotest (biološki test) je sistem testiranja, pri katerem zaznamo specifičen odziv, ki se pridobi s pomočjo testiranja na živih organizmi ali njihovih delih. Z biotesti določamo prisotnost ali koncentracijo določene kemične substance (Yopp, 1990). Biotesti temeljijo na uporabi bioloških odzivov kot sistema za odkrivanje biološko aktivnih snovi (npr. rastlinskih hormonov). V najenostavnejši obliki jih uporabljamo za analizo prisotnosti (in koncentracije) določene snovi v primerjavi z znano količino iste snovi. Eden od standardiziranih biotestov za določanje vsebnosti citokininov je pšenični ( Triticum) biotest. Z njim lahko ugotavljamo vsebnost citokinina 6-benzilaminopurinu (BAP) podobnih substanc. Citokinini ob ostalih dejavnikih (svetloba, hranila, razvojni stadij) regulirajo tudi razvoj kloroplastov. Če etiolirane rastline pred izpostavitvijo svetlobi tretiramo s citokinini, se kloroplasti, klorofili in fotosintetski proteini v takšni rastlini razvijejo prej, kot brez dodatka citokininov (Vodnik, 2012). Pšenični biotest temelji na citokininskem zaviranju razpada kloroplastov. Iz ekstraktov klorofila – segmentov prvih listov pšenice, ki so izpostavljeni različnim koncentracijam hormona BAP ali ekstraktom iz preiskovanih rastlin (vzorcev) s pomočjo spektrofotometra izmerimo absorbanco. CILJI − Določiti količino citokininov v izbrani preiskovani rastlini s pomočjo Triticum biotesta. NALOGA 1. Pripravite kalice pšenice. Semena kalite na svetlobi 7–10 dni, da kalice dosežejo velikost 10–13 cm. 2. Pripravite znane koncentracije citokininskih raztopin za umeritveno krivuljo. 3. Določite vsebnost citokinunu BAP podobnega hormona v izbrani preiskovani rastlini. 17 vaja: Triticum test za določanje hormonov – citokininov 107. MATERIAL Skalpel, ravnilo, epruvete, stojalo za epruvete in gumice. KEMIKALIJE Citokinin BAP (6-benzilaminopurina), seme pšenice za pripravo kalic, rastlinski material za preiskavo. IZVEDBA Priprava kalic Testni material – kalice pripravite iz semena pšenice. Semena pšenice 5 minut namakajte v 2-% natrijevem hipokloritu. Nato jih 2 uri spirajte pod tekočo vodo. Seme pšenice nato dajte v kadico, ki jo prej jo očistite in razkužite z natrijevim hipokloritom ali etanolom in vanjo pripravite z vodo omočen perlit. Razkužite si roke in sprana semena posadite 1 cm globoko v vlažen perlit (ali položite semena na predvideno podlago perlita in jih prekrijete z vlažnim perlitom do višine enega cm). Semena naj kalijo 1 teden na svetlobi. Priprava vodnega ekstrakta preiskovanega rastlinskega materiala Ekstrakt preiskovane rastline pripravite tako, da stehtan rastlinski material posušite v liofilizatorju (-50 °C) in ga nato s pomočjo pestila v terilnici zdrobite v prah. Znano količino zdrobljenega materiala ekstrahirate v znanem volumnu vode (50 ali 100 ml) z dodatkom nekaj kapljic alkohola za boljšo topljivost – ekstrakcijo. Priprava biotesta Po enem tednu liste kalic pšenice odrežite 35 mm pod apikalnim meristemom v 10 mm dolge segmente (Slika 7). Biotest vzorca (preiskovane rastline) delajte sočasno s testom za umeritveno krivuljo! Pripravite po štiri vzporedne teste (4 epruvete) za vsako znano koncentracijo BAP (0, 0,3, 0,5, 1, 3, 10) mg l-1 in prav tako tri vzporedne teste za vsak ekstrakt naše preiskovane rastline. 108 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. V epruveto nalijte 5 ml določene koncentracije in prav tako 5 ml ekstrakta naše preiskovane rastline in v vsako epruveto dajte po deset 10-mm segmentov. Epruvete pokrijte, da preprečite izhlapevanje, in jih za 4 dni postavite na popolnoma temno mesto. Slika 7: Priprava segmentov iz kalic pšenice za obravnave v biotestu Priprava ekstraktov za meritev absorbance Po štirih dnevih iz epruvet s segmenti listov pšenice, odpipetirate (odlijete) hormonske raztopine in ekstraktov preiskovane rastline. V vsako epruveto, na pšenične listne segmente nalijte 8 ml 80 % etanola in pokrijte, da preprečite izhlapevanje. Nato epruvete segrevajte v vodni kopeli na temperaturi 80–90 °C. Po segrevanju dolijte etanol do oznake 10 ml in epruvete ohladite na sobno temperaturo. Začnite z meritvijo absorbance pri 645 nm. Rezultate meritev znanih koncentracij BAP in vzorcev zapišite v preglednico (Preglednica 28 in Preglednico 29) in izračunajte povprečje. Na podlagi izmerjenih absorbanc znanih koncentracij BAP narišite umeritveno krivuljo in iz nje odčitajte (izračunajte) koncentracijo hormona v vzorcu (Preglednica 28 in Preglednico 29). 17 vaja: Triticum test za določanje hormonov – citokininov 109. REZULTATI IN OPAŽANJA Preglednica 28: Izmerjene absorbance (optične gostote) znanih koncentracij BAP Koncentracija hormona Povprečna BAP (mg l absorbanca -1) Absorbanca (A) (Ā) 1. meritev 2. meritev 3. meritev Preglednica 29: Izmerjene absorbance (optične gostote) vzorcev Povprečna Vzorec Absorbanca (A) absorbanca (Ā) 1. meritev 2. meritev 3. meritev 110 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. ZAPISKI FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer 18. vaja: Mungo test za določanje hormonov – avksinov UVOD Test mungo (Mungo) temelji na koreninjenju kalic mungo fižola (( Vigna radiata). Gre za relativno enostaven biotest (Hess,1961), ki ne zahteva drage opreme in je dokaj neobčutljiv na prisotnost inhibitorjev. (glejte tudi uvod 17. vaje). CILJI − Določiti količino avksinov v izbrani preiskovani rastlini s pomočjo Mungo (Vigna) biotesta. NALOGA 1) Pripravite kalice fižola mungo. Semena kalite na svetlobi 7–10 dni, da kalice dosežejo velikost 10–13 cm. 2) Pripravite znane koncentracije avksinskih raztopin za umeritveno krivuljo. 3) Določite vsebnost avksinu IBA podobnega hormona v izbrani opazovani rastlini. 112 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. MATERIAL Rastno komoro ali rastlinjak, vir svetlobe, plastične pladnje, steklene viale (25 mm x 90 mm). KEMIKALIJE sterilni perlit ali vermikulit, raztopino natrijevega hipoklorita (NaOCl, 0,33 %), auxin IBA (indol-butanojska kislina), seme fižola mungo, rastlinski material za raziskavo. IZVEDBA Priprava kalic Seme fižola mungo ( Vigna radiata) namočite za 4 minute v 0,33 % raztopino natrijevega hipoklorita in jih po sterilizaciji čez noč spirajte pod majhnim curkom tekoče vode. Tako pripravljena imbibirana semena posadite v navlažen perlit (vermit) v plastične kadičke. Pladnje prenesite na svetlobo v rastno komoro, ali na svetlo in toplo mesto, dokler niso velike 10–13 cm. Kalice so pripravljene za poskuse po 7 do 10 dneh. Ko so kalice primerno velike, jih nežno izpulite iz zemlje in vsaki posebej s čistim skalpelom ali britvico odrežete steblo s koreninami, na razdalji približno 3 cm pod kotiledonoma (Slika 8). Slika 8: Priprava kalice fižola za obravnave v biotestu 18. vaja: Mungo test za določanje hormonov – avksinov 113. Priprava vodnega ekstrakt preiskovanega rastlinskega materiala Ekstrakt preizkovane rastline pripravite tako, da stehtan rastlinski material posušite v liofilizatorju (-50 °C) in ga nato s pomočjo pestila v terilnici zdrobite v prah. Znano količino zdrobljenega materiala ekstrahirate v znanem volumnu vode (50 ali 100 ml) z dodatkom nekaj kapljic alkohola za boljšo topljivost – ekstrakcijo. Priprava biotesta Pripravite ustrezen volumen različnih koncentracij rastnega regulatorja IBA. Pripravite naslednje koncentracije IBA: (0, 0,3, 0,5, 1, 3, 10) mg l-1. Štiri nizke epruvete (višine 5-10 cm) napolnite s po 10 ml posamezne koncentracije IBA. Na posamezne epruvete zapišite točen datum začetka biotesta, in koncentracijo hormona oziroma vrsto preiskovanega rastlinskega ekstrakta (vzorca). Vsako epruveto napolnite s štirimi kalicami fižola. Fižolove kalice pustite v posameznih raztopinah različnih koncentracij IBA približno 24 ur. Po 24 urah zamenjate raztopine IBA z 10 ml destilirane vode. Biotest traja 7 dni. V tem času v epruvete dodajate manjkajočo vodo. Po 7 dneh se biotest zaključi. Kalice vzamete iz eksperimentalnih raztopin in preštejete nastale korenine, ki so večje kot 1 mm. Rezultate zberite v Excelovi preglednici. Število korenin je neposredno sorazmerno s koncentracijo auksina znotraj območja testa. Pri vsaki koncentraciji izračunajte povprečno število korenin, standardno deviacijo (SD) in standardno napako (SE). Iz dobljenih povprečnih vrednosti števila korenin za vse znane koncentracijo IBA pripravite umeritveno krivuljo (graf), na osnovi katere boste določili vsebnost IBA oziroma ostalih avksinov v vaših preiskovanih rastlinah (vzorcih). Biotest vzorca delajte sočasno s testom za umeritveno krivuljo! Biotest vzorcev pripravite po enakem postopku kot umeritveno krivuljo. Razlika je samo v tem, da namesto znane koncentracije vodne raztopine avksina v epruveto s fižolovimi rastlinami dodate znano količino vodnega ekstrakta vašega rastlinskega vzorca, za katerega nas zanima vsebnost rastlinskih hormonov – avksinov. Po sedmih dneh kalice vzamete iz eksperimentalnih raztopin in preštejete nastale korenine, ki so večje kot 1 mm. Izračunajte povprečno število korenin, SD in SE. Iz prej pripravljene umeritvene krivulje odčitajte (določite) količino avksinov v vaših vzorcih. 114 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. REZULTATI IN OPAŽANJA FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer Dodatek: Spektrofotometrija Absorpcijska spektrofotometrija je metoda za merjenje količine svetlobe, ki jo absorbira vzorec pri določeni valovni dolžini. Metoda omogoča tudi določanje koncentracije snovi v vzorcu, ki se nahaja v kiveti z določeno dolžino (l), in sicer s primerjanjem z določenim standardom. Najuporabnejša meritev svetlobe je absorbanca (A –. optičan gostota), imenovana tudi optična gostota. Definirana je kot A = log I0 / I , pri čemer je I0 intenziteta vpadne svetlobe, ki pade na vzorec, in I intenziteta prepuščene svetlobe. Absorpcijo svetlobe prikažemo grafično tako, da na valovno dolžino (λ) nanašamo na absciso – neodvisna spremenljivka; - absorbanco (A) pa na ordinato – odvisna spremenljivka. Graf, ki ga dobimo, imenujemo absorpcijski spekter in pokaže tiste valovne dolžine, ki jih vzorec (pri nas barvila) najbolj absorbirajo. Absorbanco (optično gostoto) merimo s spektrofotometrom in metodo imenujemo absorpcijska spektrofotometirja. Delovanje spektrofotometra prikazuje Slika 9. Napravo sestavlja vir svetlobe, monokromator z mehanizmom (to je lahko prizma), s katerim izbiramo valovno dolžino, nosilec za vzorec v stekleni kiveti, fotodetektor in snemalnik ali računalnik. Valovno dolžino svetlobe spreminjamo z rotiranjem prizme v monokromatorju. Svetloba prehaja skozi monokromator, ki razcepi polikromatsko svetlobo na več valovnih dolžin, od katerih samo ena monokromatska svetloba prehaja skozi vzorec v kiveti na fotodetektor. 118 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Slika 9: Shematska zgradba spektrofotometra Optična gostota (A – absorbanca) vzorca je povezana s koncentracijo po Beerovem zakonu: A = ε ∙ c ∙ l (6) Pri tem je c – koncentracija, običajno merjena v molih na liter, l – dolžina svetlobne poti (kivete), običajno 1 cm, in ε – konstanta, imenovana molarni ekstincijski koeficient z enoto liter na mol na centimeter (l mol-1 cm-1). Običajni ε za klorofil je 100.000 l mol-1 cm-1. FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer Izbrane osnove kemijske stahiometrije Odstotna koncentracija Ločimo masne in volumske odstotke. Če v besedilu ni navedeno, za katere gre, pomeni, da so mišljeni masni odstotki. Koncentracija masnih odstotkov je izražena v gramih topljenca na 100 g raztopine. Koncentracija volumskih odstotkov je izražena v volumskih delih snovi v 100 volumskih delih raztopine. Molarna koncentracija Koncentracija je izražena s številom gram molekul (molov) raztopljene snovi v 1000 ml (1 liter) raztopine (mol l-1). Molekulsko maso v gramih (g) izračunamo iz relativnih molekulski mas, Mr, posameznih elementov. Najdemo jih v priročnikih, napisane pa so tudi na embalaži vseh izvirno zapakiranih kemikalij. V uporabi so tudi drugi simboli za izražanje molarnosti (mol l-1 = M) in milimolarnosti (mmol l-1 = mM) in mikromolarnosti (μmol l-1 = μM). Masna koncentracija Koncentracija je izražena z maso raztopljene snovi v določenem volumnu raztopine, kot na primer v miligramih na liter (mg l-1). 120 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. Pretvorbe enot 1 mm3 = 1 µl = 1000 nl = 1 x 10-6 pl 1 cm3 = 1 ml = 10-3 µl = 1000 µl 1 µm3 = 10-9 mm3 = 10-9µl = 10-6 nl = 10-3 pl FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE J. Ambrožič-Dolinšek, T. Ciringer Literatura Bidwell R. G. S., 1974. Plant physiology. Macmillan publishing, New York. Gabrovšek K., Gogala N. 1991. Navodila za vaje iz fiziologije rastlin, Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Ljubljana. Gros N., Harrison T., Štrumbelj Drusany I., Kapun Dolinar A. 2010. Science In School. Prevzeto 30. marec 2011 iz Spektrometrija v šoli: eksperimenti z izkustvenim pristopom: http://www.scienceinschool.org/2010/issue14/spectrometer/slovene Greulach V. A., 1973. Plant physiology. Macmillan publishing, New York. Hess C. E., 1961. The mung bean bioassay for detection of root promoting substances. – Plant Physiolology 36(I): Suppl. 21. Kühnle J.A., Fuller G., Corse J. and Mackey B.E. 1977. Antisenescent activity of natural cytokinins. Physiol. Plant., 41: 14–21. Krajnčič B. 1993. Fiziologija in biokemija rastlinskih hormonov. Fakulteta za kmetijstvo, Maribor. Kutschera U. 1998. Grundpraktikum zur Pflantzenphysiologie. Quelle & Meyer Verlag Wiesbaden. Likar M., Regvar M. 2003. Praktikum fiziologije rastlin. Scripta, Študentska založba, Ljubljana. Likar M., Vogel-Mikuš K. 2011. Navodila za laboratorijske vaje pri predmetu Fiziologija rastlin za študente biologije. pč. https://issuu.com/plantbiol/docs/collectanea, sep 2017. Mohr H., Schopfer P.1995. Plant physiology. Springer-Verlag. Sadasivam S., Manickam A. 2007. Biochemical Methods. Prevzeto 30. marec 2011 iz New Age International: http://www.newagepublishers.com/samplechapter/000091.pdf Salisbury F.B., Ross C.W. 1991. Plant Physiology. Wadsworth Publishing Company Belmont, California. Sitte P., Weiler E.W., Kadereit J.W., Bresinsky A., Körner C. 2002. Lehrbuch der Boranik für Hochsculen. Begründet von Strasburger E., Noll F., Schenck H., Schimper. Spectrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin. Stušek P., Podobnik A., Gogala N. 1997. Celica. DZS Ljubljana. Šarič M. R., Fiziologija biljaka. 1974. Naučna knjiga, Beograd. Taiz L., Zeiger E., Moller IM., Murphy A. 2018. Plant Physiology and Development. Sinauer Associatites, Oxford University Press, New York, UnitedStates of America. Yopp J.H. 1990. Bioassays for plant hormones and other natural y occuring plant growth regulators. In: Mandava, N.B. (ed.): CRC Handbook of Natural Pesticides: Methods. Vol. 1. Theory, Practice, and Detection. CRC Press (Boca Raton, Ann Arbor, Boston), 329–477. Vinković Vrček., Loretić. 2010. Aditivi u hrani. Vodič kroz E-brojeve. Zagreb. Školska knjiga. Vodnik, D. 2012. Osnove fiziologije rastlin. Ljubljana: Oddelek za agronomijo, Biotehniška fakulteta 122 FIZIOLOGIJA RASTLIN: PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE. FIZIOLOGIJA RASTLIN PRIROČNIK Z NAVODILI ZA VAJE JANA AMBROŽIČ-DOLINŠEK, TEREZIJA CIRINGER Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Maribor, Slovenija jana.ambrozic@um.si, terezija.ciringer@um.si Povzetek Priročnik je namenjen študentom na študijskih programih s področja biologije, ekologije z naravovarstvom in bodočim učiteljem biologije, ki bi se radi spoznali z eksperimentalnim delom s področja fiziologiji rastlin. Sestavlja ga osem vsebinskih sklopov, ki obravnavajo rastlinske pigmente, dihanje rastlin in fotosintezo, encimsko aktivnost rastlin, uravnavanje vodnih razmer v rastlinah, plazmolizo, mineralno prehrano rastlin s prepoznavanjem simptomov pomanjkanja posameznih hranil, metode določanja vsebnosti sladkorjev in bioteste za rastlinske hormone. Vsaka od vaj se začne z Ključne besede: eksperimentalne vaje, vsebinskim uvodom ter nadaljuje s cilji, nalogami, materiali in priročnik, potekom izvedbe vaje. Vaje so podprte s slikami posameznih fiziologija rastlin, poskusov, preglednicami, kemijskimi formulami za preračune biologija rastlin, laboratorijske posameznih fizioloških parametrov in navodili za delo s kemikalijami aparature in postopki, in opremo. laboratorijske rastline DOI https://doi.org/10.18690/um.fnm.3.2022 ISBN 978-961-286-589-4 Document Outline Rastlinska barvila 1. vaja: Antocianini, betacianini 2. vaja: Fotosintetsko aktivna asimilacijska barvila 3. vaja: Ločitev zelenih in rumenih barvil iz kloroplastov 4. vaja: Določitev barvil na osnovi topnosti Izmenjava plinov 5. vaja: Dihanje rastlin 6. vaja: Fotosintetska aktivnost Encimska aktivnost 7. vaja: Aktivnost katalaze Sprejem, prevajanje in uravnavanje vode v rastlinah 8. vaja: Specifična prevodnost lesa 9. vaja: Stopnja sukulentnosti 10. vaja: Merjenje sprejema vode v rastlino Disperzijski sistemi, koloidi, plazmoliza 11. vaja: Koloidni sistemi 12. vaja: Plazmoliza 13. vaja: Merjenje vodnega potenciala z mejno plazmolizo Mineralna prehrana rastlin 14. vaja: Spremljanje simptomov fizioloških motenj ob pomanjkanju določenih hranil Reduktivni sladkorji 15. vaja: Kvalitativno določanje reduktivnih sladkorjev 16. vaja: Kvantitativna ocena reduktivnih sladkorjev Biotesti 17. vaja: Triticum test za določanje hormonov – citokininov 18. vaja: Mungo test za določanje hormonov – avksinov Zaključek Dodatek: Spektrofotometrija Izbrane osnove kemijske stahiometrije Literatura