Ugotavljanje genskih sprememb pri raku želodca* Identification of genes alterations in stomach cancer* Andreja Gojkovič**, Mojca Grošelj*** Ključne besede želodec novotvorbe - genetika adenokarclnom - genetika polimerazna verižna reakcija mikrosatelitska zaporedja Izvleček. Žlezni rak (adenokarcinom) želodca je pogosto maligno obolenje v Sloveniji. Po Laure-novi razvrstitvi ga delimo na intestinalno, dobro diferencirano, in difuzno, slabo diferencirano obliko. Poti nastanka obeh oblik naj bi se razlikovali po značilnem zaporedju genetskih sprememb. V naši raziskavi smo želeli na izbranem vzorcu intestinalne in difuzne oblike adenokar-cinomov želodca ugotoviti izgubo alela nekaterih zaviralnih genov (APC, p53, Rb, nm23 in DCC) in ugotoviti morebitno razliko med obema oblikama. Hkrati smo želeli uvesti novo, najsodobnejšo metodo preiskovanja izgube alelov. Proučevali smo vzorce tumorskega in zdravega tkiva želodca, odvzete sedemnajstim naključno izbranim bolnikom z rakom želodca, operiranim v letu 1997. Za pomnoževanje mikrosatelitnih zaporedij zaviralnih genov smo uporabili verižno reakcijo s polimerazo. Dobljene PCR-pridelke smo analizirali po načelu kapilarne elektrofo-reze s pomočjo avtomatskega genskega analizatorja. Za gen APC smo ugotovili izgubo heterozigotnosti v 17 %, za gen p53 v 50 % in za gen DCC v 100% primerov. Pri genih Rb in nm23 nismo ugotovili izgube heterozigotnosti. Ugotovili smo razliko v pojavljanju genskih sprememb pri intestinalni in difuzni obliki. Naša raziskava je dala osnove za nadaljnje iskanje najugodnejših pogojev za izvedbo obsežnejše multipleks verižne reakcije s polimerazo in za njeno uporabo pri preiskavi še neraziskanih genov. Key words stomach neoplasms - genetics adenocarcinoma - genetics polymerase chain reaction microsatellite repeats Abstract. Stomach cancer (gastric adeno-cacinoma) is a common malignant disease in Slovenia. The Lauren's classification distinguishes between a well differentiated intestinal type and a poorly differentiated diffuse type of the disease, which differ in their development and the characteristic sequence of genetic changes. The purpose of this first study done on a selected sample of Slovene patients was to investigate the allele loss of several tumor suppressor genes (APC, p53, Rb, nm23 and DCC) and thus distinguish between the intestinal and diffuse type of gastric adenocarcinoma in the Slovene population. Another aim of this work was to introduce the newest method for investigating the allele loss. Seventeen randomly selected frozen samples of adenocarcinomas and adjacent normal tissues were obtained from 17 patients treated by surgery in 1997. The polymerase chain reaction was used for multiplying microsatellite sequences of the tumor suppressor genes. The obtained PCR products were analysed with the capillary elec-trophoresis in the automatic gene analyser. Loss of heterozigosity was found in 17% of samples for APC, in 50% for p53, and in 100% for DCC. There was no loss of heterozigosity for Rb and nm23. Dfferences in genetic alterations between the intestinal and diffuse type of adenocarcino-ma in the Slovene population were identified. The results represent a good starting point for the multiplex polymerase chain reaction using a larger set of genetic markers, and for its application in the research of some other, not yet investigated tumor suppressor and mismatch repair genes. "Objavljeno je skrajšano delo, ki je bilo nagrajeno s Prešernovim priznanjem za študente v letu 1998. ""Andreja Gojkovič, štud. med., Inštitut za biokemijo, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana. ***Mojca Grošelj, štud. med., Inštitut za biokemijo, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana. Uvod Raz{irjenost raka želodca Rak želodca je v Sloveniji pogosto maligno obolenje. Po podatkih Registra raka za leto 1995 zavzema četrto mesto pri moških (8% vseh rakov oz. 310 novih primerov na leto) in peto mesto pri ženskah (6% vseh rakov oz. 222 novih primerov na leto) (1). Čeprav incidenca raka želodca v Sloveniji zadnja desetletja upada (upadanje incidence se zadnja leta umirja), je v primerjavi z razvitimi evropskimi državami še vedno visoka. V evropskih državah je delež raka želodca pri moških 3,5-18,4% vseh rakov ter pri ženskah 2,3-15,3 % vseh rakov (2). Rak želodca ostaja pogost v državah vzhodne Evrope, srednje Amerike in na Japonskem; najnižjo incidenco pa beležijo v Švici in Franciji ter na Danskem (3). Izvor raka želodca Prehrana ima pomembno vlogo pri nastanku raka želodca. Razvoj raka pospešujejo nitrati in nitriti v hrani in vodi, prevelika poraba soli, prekajeno meso ter vložena zelenjava. Sveža zelenjava in sadje, ki vsebuje veliko vitamina C, pa njegov razvoj zavirata (4). Večje tveganje za razvoj obolenja predstavljajo tudi nekateri genetski dejavniki (krvna skupina A, pojav bolezni pri bližnjih sorodnikih) (4, 5). Ugotovljeno je pogostejše pojavljanje raka želodca pri kroničnem atrofičnem gastritisu, perniciozni anemiji in želodčni polipozi (4, 6). V novejšem času povezujejo rak želodca z okužbo z bakterijo Helicobacter pylori (7). Razvrstitev raka želodca Žlezni rak (adenokarcinom) predstavlja 95% primerov raka želodca, ostali maligni tumorji so redki (4, 7). Ločimo zgodnji rak (bolezen je omejena na sluznico in podsluzni-co) in napredovali rak želodca (vrašča skozi podsluznico v mišično plast ali globlje) (8). Makroskopsko delimo rak želodca po Borrmannovi razvrstitvi v štiri tipe: tip 1 - polipoid-ni tumor, tip 2- razuljeseni neinfiltrativni tumor, tip 3- razuljeseni infiltrativni tumor, tip 4-difuzno infiltrativni tumor in neopredeljeni tumor (8). Patohistološko razvrščamo rak želodca po različnih razvrstitvah (8-10). V Evropi in tudi pri nas se je najbolj uveljavila Laurenova razvrstitev (1965), ki deli rak želodca glede na način rasti in invazivnost na intestinalno, difuzno in mešano obliko, kadar procesa ne moremo uvrstiti v nobeno od skupin (9, 11). Pri intestinalni, bolje diferencirani obliki, pride predhodno do metaplazije želodčne sluznice v črevesno sluznico. Difuzna, slabše diferencirana oblika, pa naj bi nastala neposredno iz celic želodčne sluznice (4). Mingova histološka razvrstitev deli rak želodca na ekspanzivno, infiltrativno ter mešano obliko (12). Razširjenost bolezni označujemo po TNM-razvrstitvi s stadijem (I—IV). T označuje globino vraščanja tumorja (T0-T4), N prizadetost bezgavk (N0-N2) in M oddaljene zasev-ke (M0-M2) (9). Splošno o kancerogenezi Kancerogeneza je večstopenjski proces, ki nastane zaradi sprememb celičnega genoma. Vodi v nebrzdano razmnoževanje celic (slika 1). Raziskave v molekulski genetiki so odkrile, da genske poškodbe prizadenejo dva razreda genov, ki so pomembni za kancero-genezo: protoonkogene in antionkogene oz. zaviralne (tumorsko supresorske) gene (13). PRIDOBLJENI DEJAVNIKI • kemični (anorganske in organske snovi) • fizikalni (neionizirajoče in iozinirajoče sevanje) • biološki (virusi) GENETSKI DEJAVNIKI c N • podedovane mutacije v. y IZRAZANJE SPREMENJENIH GENSKIH PRODUKTOV IN IZGUBA PRODUKTOV REGULATORNIH GENOV I RAK Razmnoževanje celic enega klona Progresija tumorja (nove mutacije) Heterogenost (nastanek več klonov celic) Slika 1. Mehanizem nastanka raka. Protoonkogeni so sestavni del celičnega genoma ter pospešujejo celično rast in diferenciacijo. Njihovi produkti so rastni dejavniki, receptorji za rastne dejavnike, beljakovine, ki prenašajo signale, in dejavniki prepisovanja DNA (14). Genska poškodba povzroči spremembo protoonkogena v onkogen, kar povzroči ali pretirano izražanje gena (preveč sicer normalne beljakovine v celici) ali pa biosintezo nenormalne, preveč aktivne beljakovine. To je eden od pogojev za maligno preobrazbo celice. Onkogeni se izražajo dominantno, zato je za spremembo protoonkogena v onkogen dovolj mutacija le enega alela (slika 2) (15). Zaviralni geni, nasprotno od onkogenov, zavirajo celično rast in diferenciacijo. Njihovi produkti delujejo na površini celice, uravnavajo prenos signalov rastnih dejavnikov in uravnavajo prepisovanje DNA (14). Zaviralni geni se izražajo recesivno, zato je za izgubo njihove aktivnosti potrebna mutacija obeh alelov (slika 2) (15). B par homolognih kromosomov ZDE materin HL mE Prva poškodba: točkovna mutacija V \ ul očetov Podedovana točkovna mutacija mn Poškodba dominantnega onkogena KL 301 hxe mu HL ji: c mn / Druga poškodba: velika delecija UL Druga poškodba: velika delecija KE I i RAK) I I Slika 2. Razlika v izražanju mutacij zaviralnih genov in protoonkogenov. Vsak gen je v človeškem genomu navzoč v dveh kopijah (na očetovem in materinem kromosomu homolognega kromosomskega para). A: za inaktivacijo zaviralnega gena sta potrebni dve genski poškodbi—podedovano ali pridobljeno mutacijo v zaviralnem genu razkrije šele mutacija, pridobljena na njegovem drugem alelu (recesivnost zaviralnih genov). B: za aktivacijo dominantnega onkogena je dovolj že ena poškodba (dominantnost onkogenov). Za maligno preobrazbo celice ni dovolj nastanek le enega onkogena, temveč je potrebna aktivacija več protoonkogenov in izguba aktivnosti več zaviralnih genov (13, 14). Kancerogeneza pri raku želodca Correa je postavil hipotezo, da nastane rak želodca preko več vmesnih stopenj (16). Prva sprememba normalne želodčne sluznice naj bi bila površinski gastritis, ki napreduje v kronični atrofični gastritis, intestinalno metaplazijo, displazijo in končno preide v intestinalno obliko raka želodca. Ves ta proces se odvija več let pod vplivom zunanjih in notranjih dejavnikov, ki povzročajo genetske spremembe (17). Pri razvoju raka želodca nastajajo številne genetske spremembe (18): • genetska nestabilnost, • ponovna aktivacija telomeraze v zgodnjih fazah, • inaktivacija nekaterih zaviralnih genov in genov za celične adhezine, • aktivacija nekaterih onkogenov in • povečano izražanje rastnih dejavnikov ali citokinov pri napredovanju bolezni. Genetska nestabilnost Z izrazom genetska nestabilnost označujemo somatske mutacije mikrosatelitnih zaporedij (mikrosatelitna nestabilnost), ki nastanejo zaradi napak pri podvajanju DNA (18). Mikrosatelite, poleg minisatelitov in satelitov, uvrščamo v visoko ponavljajočo se DNA, ki ima obliko kratkih nukleotidnih zaporedij in se v genomu ponavlja v številnih identičnih ali sorodnih kopijah. Mikrosateliti so po genomu naključno razporejeni in jih najdemo povprečno na vsakih 6 kilobaznih parov. Dolžina njihovega osnovnega motiva je od 2 do 6 baznih parov, število ponovitev pa je manjše od sto. Polimorfne mikrosatelite imenujemo male tandemske ponovitve ali STR (okr. angl. short tandem repeat) lokusi. Po-limorfizem temelji na različicah v številu ponovitev osnovnega motiva, posledica pa je visoka variabilnost v dolžinah posameznih alelov, zato govorimo o dolžinskem polimor-fizmu. Čim bolj je lokus polimorfen, večja je njegova informativnost (19). Ponovna aktivacija telomeraze Telomeraza je ribonukleoproteinski encim, ki sintetizira telomerno DNA v zarodnih tkivih in nesmrtnih tumorskih celicah, v normalnih somatskih celicah pa je neaktivna. Ugotovljeno je, da v celicah raka želodca prvotno pride do skrajšanja telomere, kar vodi v kromosomsko nestabilnost. Kasneje pride do ponovne aktivacije telomeraze, kar stabilizira telomere in prispeva k celični nesmrtnosti (18). Onkogeni V razvoj in napredovanje raka želodca je vpletenih mnogo onkogenov. Najpogosteje se pri raku želodca pojavlja gen c-met, ki zapisuje receptor za rastni dejavnik jetrnih celic oz. HGF (okr. angl. hepatocyte growth factor) in je pri ostalih tumorjih prebavil redek (20). Ostali vpleteni geni, ki se še pojavljajo, so K-sam (zapisuje receptor, ki pripada družini receptorjev za rastni dejavnik fibroblastov oz. FGF (okr. angl fibroblastgrowth factor), c-erbB2 (zapisuje površinski receptor za epidermalni rastni dejavnik oz. EGF (okr. angl. epidermal growth factor), K-ras (zapisuje GTP-vezočo beljakovino) (18, 21). Zaviralni (tumorsko supresorski) geni Alela zaviralnih genov lahko vsebujeta enako število baznih parov (homozigotnost) ali pa se njuna dolžina razlikuje (heterozigotnost). Dolžina posameznega alela je namreč odvisna od vsebnosti visoko ponavljajoče se DNA. Prva stopnja v izgubi aktivnosti zaviralnih genov je mutacija enega alela, ki je lahko dedna ali pa nastane spontano. Da se mutacija izrazi, je potrebna izguba drugega normalnega alela. Ta pojav imenujemo izguba heterozigotnosti (angl. loss of heterozigosity, LOH). Vzrok za izgubo drugega alela je lahko izguba kromosoma ali pa kromosomska delecija (13). V dosedanjih raziskavah so ugotovili povezanost z rakom želodca za naslednje zaviralne gene: • p53(gen, ki zapisuje 53 kilodaltonov veliko beljakovino, vključeno v uravnavanje celičnega cikla) (18, 22), • APC (okr. angl. adenomatous polyposis coli) (18, 23), • DCC (okr. angl. deleted in colorectal carcinomas) (18) in • nm23 (gen, ki zapisuje nukleotidno difosfatno kinazo) (18, 24). Pri intestinalni in difuzni obliki raka želodca pride najpogosteje do izgube alela ali mutacije gena p53 (22). Izguba heterozigotnosti ali mutacija genov APCter DCCje značilna za intestinalno, dobro diferencirano obliko raka želodca (17, 22). Pojav zasevkov pri bolnikh z rakom želodca povezujejo z zmanjšanim izražanjem gena nm23 (18, 24). Dosedanje raziskave kažejo, da naj bi se poti nastanka intestinalne in difuzne oblike raka želodca razlikovali (17, 21,25). Vsaka oblika naj bi imela svoje značilno zaporedje genetskih spememb. Na začetku naj bi prišlo pri obeh do nastanka genetske nestabilnosti, nato pa naj bi se pri vsaki obliki vključili različni genski mehanizmi, kot je prikazano na sliki 3 (25). DIFUZNA OBLIKA INTESTINALNA OBLIKA Slika 3. Domnevni genetski poti nastanka dobro in slabo diferencirane oblike raka želodca. P53, APC, nm23 — zaviralni geni; c-met, K-ras, bcl-2, c-erbB2, K-sam — onkogeni; TGFfi — rastni dejavnik fibroblastov; CD44 — adhezijska molekula. Molekulska analiza onkogenov in zaviralnih genov lahko napove potek bolezni, kar je še posebej pomembno pri zgodnjih oblikah raka. Zato bi uvajanje dognanj molekulske genetike v klinično prakso olajšalo in izboljšalo prepoznavo raka, izboljšalo napoved poteka bolezni in pripomoglo k odkrivanju novih načinov zdravljenja (18). Namen naloge V svetu je do sedaj potekalo že mnogo raziskav o nastanku raka želodca, vendar vloga zaviralnih genov še ni v celoti raziskana. Kljub visoki pogostnosti raka želodca v Sloveniji raziskav na tem področju pri nas še ni bilo. Zato smo se odločili, da na izbranem vzorcu adenokarcinomov želodca ugotovimo, kateri geni kažejo večjo pogostnost sprememb pri sporadičnih primerih. Pri tem smo želeli ugotoviti morebitne razlike v genskih spremembah med dobro in slabo diferencirano obliko. Na izbranem vzorcu dobro diferenciranih adenokarcinomov (intestinalna oblika) in slabo diferenciranih adenokarcinomov (difuzna oblika) smo s pomočjo verižne reakcije s po-limerazo in avtomatskega genskega analizatorja v izbranih lokusih nekaterih zaviralnih genov (APC, p53, Rb, nm23, DCC) ugotavljali izgubo alela. Ob tem smo želeli uvesti najsodobnejšo metodo preiskovanja izgube genske heterozi-gotnosti, ki bi bila že sama po sebi informativna za onkologa, omogočila pa bi tudi nadaljnje, poglobljene raziskave zaviralnih in popravljalnih genov pri različnih vrstah raka. Metode dela Bolniki Tabela 1. Klinične značilnosti bolnikov in histopatološki rezultati vzorcev. M — moški spol, @ — ženski spol; L — mesto tumorja v želodcu, zg. tretj. — zgornja tretjina želodca, sr. tretj. — srednja tretjina želodca, sp. tretj. — spodnja tretjina želodca, cel. — celoten želodec; B - Borrmannova razvrstitev; Lauren - Laurenova razvrstitev, INT-intestinalna oblika, DIF-difuzna oblika, ME-mešana oblika; Ming-Mingova razvrstitev, EKSP-ekspanzivna oblika, INF - infiltrativna oblika, ME - mešana oblika; OS - stanje okolne sluznice, PG - površinski gastritis, KAG - kronični atrofični gastritis, IM - intestinalna metaplazija, NP - ni podatka. Primer št. Starost (leta) Spol L B Lauren Ming Stadij OS 1 62 M sr. tretj. 3 INT ME II KAG 2 70 Ž sr. tretj. 3 INT ME II PG 3 69 M sp. tretj. 1 ME EKSP II PG 4 74 Ž zg. tretj. 3 DIF INF III KAG, IM 5 70 M sr. tretj. 2 INT ME II KAG, IM 6 65 Ž cel. 3 DIF INF III KAG 7 69 M cel. 2 INT INF III KAG, IM 8 59 M sr. tretj. 2 INT ME IV KAG 9 64 M sr. tretj. 3 ME INF IV NP 10 32 M sr. tretj. 2 INT ME III PG 11 67 M zg. tretj. 1 INT ME II KAG, IM 12 62 M cel. 3 ME INF III KAG, IM 13 62 M sp. tretj. 3 INT EKSP II PG 14 68 M sr. tretj. 3 ME INF III KAG, IM 15 63 M sp. tretj. 1 INT ME I KAG, IM 16 64 M sp. tretj. 3 ME INF III KAG, IM 17 36 Ž cel. 4 DIF INF IV KAG V raziskavo je bilo vključenih 17 naključno izbranih bolnikov z rakom želodca, ki so bili operirani v letu 1997 v Sloveniji. Vsakemu bolniku je bil odvzet vzorec tumorskega tkiva iz središča tumorja (0,1-1,0 g) ter vzorec zdravega tkiva želodca (0,1-1,0 g). Vzorci tumorskih in zdravih tkiv so bili histološko pregledani in potrjeni na Oddelku za patologijo Onkološkega inštituta v Ljubljani. Zamrznjeni so bili v tekočem dušiku in shranjeni pri temperaturi -70°C. Raziskovalna naloga je bila izvedena v okviru projekta J1-8762-0381 (Molekularna genetika v biomedicinskih raziskavah, nosilec prof. dr. R. Komel), za katerega je bilo pridobljeno predhodno soglasje Republiške komisije za medicinsko etiko. Vsi vzorci so bili označeni s šifro, tako da je bila zagotovljena tajnost podatkov. Klinične značilnosti bolnikov ter histopatološke rezultate vzorcev prikazujemo v tabeli 1. Osamitev DNA Načelo DNA je zelo stabilna molekula, zato jo lahko osamimo iz različnih bioloških materialov: iz krvi, mišic, skeletnega materiala in drugih tkiv. Osamitev poteka iz svežih tkiv, lahko pa tudi iz primerno skladiščenih arhivskih tkiv. V našem primeru je potekala osamitev DNA iz sveže zamrznjenih tkiv, ki so bila shranjena pri temperaturi -70°C. Postopek Tkivo, zamrznjeno pri -70°C, smo stehtali, dali v terilnico, napolnjeno s tekočim dušikom, in ga s pestilom strli v prah. Po potrebi smo dolivali tekoči dušik. Strto tkivo smo dali v epruvetko Eppendorf, prilili približno 0,6 ml pufra K in s plastičnim batkom homo-genizirali. Nato smo dolili pufer K do vrha epruvetke (1,2 ml/100 mg tkiva). Epruvetke smo v stresalnem inkubatorju stresali 15 ur pri 50°C. Vsebino epruvetk smo nato razdelili na dva dela. Vsakemu delu smo dodali približno 0,6 ml zmesi fenola, kloroforma in izoamilalkohola ter močno pretresli. Vsebino epruvetk smo centrifugirali 15 minut pri 13.200 obratih na minuto. S pipeto smo previdno odstranili zgornjo, vodno fazo z DNA, in jo prenesli v svežo epruvetko. Nato smo zgoraj opisane postopke fenolne ekstrakcije še enkrat ponovili. Dobljenemu volumnu vzorca smo dodali enak volumen zmesi kloroforma in izoamilalkohola ter močno pretresli. Vsebino epruvetk smo centrifugirali 10 minut pri 13.200 obratih na minuto. S pipeto smo zopet odstranili zgornjo vodno fazo z DNA in jo prenesli v svežo epruvetko. Enemu volumnu vzorca smo dodali pol volumna amonijevega acetata ter dva in pol volumna 100 % etanola. Vsebino epruvetk smo rahlo pretresli, da se je DNA izoblikovala v meduzico, in jo shranili 24 ur pri -20°C. Naslednji dan smo vzorce centrifugirali 20 minut pri 13.500 obratih na minuto pri 4°C. Odlili smo tekočino in na dnu epruvetk je ostala oborina, ki smo ji dodali 1 ml ledenega 75% etanola. Epruvetko smo pretresli, da je oborina splavala. Vzorce smo ponovno centrifugirali 15 minut pri 13.500 obratih na minuto pri 4°C. Previdno smo odlili tekočino in s pipeto posrkali preostanke tekočine. Sprano oborino smo osušili v vakuumu. Preostanku (oborjeni in sprani DNA) smo dodali 30 |il dvakrat destilirane vode in ga raztapljali 24 ur pri 4°C. Naslednji dan smo tako pripravljene vzorce raztopin DNA zamrznili pri -20°C. Koncentracijo DNA v vzorcih smo izmerili spektrofotometrično z merjenjem absorbno-sti svetlobe valovne dolžine 260 nm (A260). Za določitev koncentracije DNA smo uporabili podatek, da je pri koncentraciji DNA 1 ^g/ml absorbnost svetlobe valovne dolžine 260 nm enaka 1 enoti (A260 = 1 enota) (26). Za določitev čistosti vzorca smo izmerili še absorbnost pri 280 nm in določili razmerje A260/A280, ki mora biti med 1,5 in 2,0, sicer navzočnost prevelikih količin primesi (predvsem beljakovin) moti nadaljnje analize. Elektroforeza na agaroznem gelu Z elektroforezo na agaroznem gelu smo preverili vsebnost genomske DNA v vzorcih po končani osamitvi DNA (0,5% agarozni gel) in ugotavljali navzočnost PCR-pridelkov po verižnem pomnoževanju DNA (2% agarozni gel). Načelo Pri elektroforezi potujejo odseki DNA, ki so zaradi fosfodiesterskih vezi negativno nabiti, z električnim tokom po določenem mediju (nosilcu) od katode proti anodi. Različno veliki odseki potujejo z različno hitrostjo in se tako med seboj ločujejo po dolžini. Hitrost potovanja skozi medij je odvisna od koncentracije snovi, iz katere je medij sestavljen, velikosti in oblike odsekov DNA ter električne poljske jakosti. Po določenem času bodo krajši odseki prepotovali daljšo pot, daljši odseki pa krajšo. S spreminjanjem koncentracije medija lahko med seboj ločimo odseke DNA različnih redov velikosti. Agarozna elektroforeza omogoča ločitev odsekov DNA dolžine od 300 do 10.000 baznih parov (27). Raztopini agaroznega gela dodamo etidijev bromid (EtBr). EtBr se vrine v strukturo dvoj-novijačne molekule DNA in povzroči, da DNA fluorescira ob osvetlitvi z ultravijolično svetlobo (UV) valovne dolžine 203 nm. Postopek Pripravili smo 2% ali 0,5% agarozno raztopino in jo segrevali, dokler ni postala prosojna. Raztopini za 2% agarozni gel smo dodali 6 |il EtBr, raztopini za 0,5% agarozni gel pa 4|il EtBr. Pripravljeno raztopino smo vlili v plitvo posodo z že nameščenimi glavnič-ki. Po 20 minutah, ko se je gel strdil, smo odstranili glavničke in posodo namestili v elek-troforezno kadičko. Elektroforezno kadičko smo napolnili z 1 xTAE-pufrom. Za elektroforezo genomske DNA smo zmešali 2 |il elektroforetskega barvila BFB (bro-mofenol modro), 8 |il 1 xTAE-pufra in 2 |il vzorca genomske DNA. Za elektroforezo PCR-pri-delkov smo zmešali 2 |il elektroforetskega barvila BFB in 10 |il PCR-pridelkov. Pripravljene vzorce smo vnesli v žepke. Elektroforeza genomske DNA je tekla 20 minut pri napetosti 120 voltov, elektroforeza PCR-pridelkov pa 60 minut pri napetosti 70 voltov. Genomsko DNA in PCR-pridelke smo pogledali in fotografirali pod ultravijolično svetlobo valovne dolžine 203 nm na UV-transiluminatorju. Verižna reakcija s polimerazo V naši raziskavi smo z verižno reakcijo s polimerazo oz. PCR (okr. angl. polymerase chain reaction) pomnoževali mikrosatelitna zaporedja, ki označujejo izbrane gene (APC, p53, DCC, Rb in nm23) po postopkih, ki so opisani v literaturi (28). Najprej smo na naključno izbranih vzorcih (šest parov vzorcev) izvedli PCR enega, izbranega mikrosate-litnega zaporedja (monoPCR). S tem smo določili najugodnejše pogoje za sestavo in izvedbo multipleks PCR. Načelo Verižna reakcija s polimerazo je metoda, ki nam omogoča pomnožitev specifičnih področij genoma. Po končani reakciji dobimo milijon ali več kopij pomnoženega odseka DNA (29, 30). PCR temelji na značilnostih podvajanja molekule DNA. DNA-polimeraza uporablja kot vzorec za sintezo komplementarnih verig enoverižni DNA, ki ju dobimo s segrevanjem dvo-verižne DNA na temperaturo 95°C. To fazo imenujemo razdvajanje (angl. denaturation). Za začetek sinteze komplementarnih verig potrebuje polimeraza majhen odsek dvove-rižne DNA. Ta odsek nam priskrbita začetna oligonukleotida (angl. primers), dolga približno 20 baznih parov, ki se specifično vežeta na komplementarni zaporedji enoverižnih DNA in določita mesto začetka sinteze komplementarnih verig (faza prileganja). Za prile-ganje začetnih oligonukleotidov (angl. primer annealing) je potrebna temperatura med 45 in 75°C, odvisno od njihovega nukleotidnega zaporedja in od pomnoževane DNA. Na ta način usmerimo DNA-polimerazo v sintezo točno določenega, za nas zanimivega področja DNA. V reakcijsko zmes dodamo dva različna začetna oligonukleotida, od katerih je prvi komplementaren odseku ene in drugi odseku druge verige. Izbrana začetna oligonukleotida pokrivata oz. omejujeta področje DNA, ki ga želimo pomnožiti. Sledi faza podaljševanja (angl. extension), v kateri se novo nastajajoči verigi podaljšujeta v smeri od 5'-konca proti 3'-koncu. Na vsaki novo sintetizirani verigi nastane vezav-no mesto za vezavo novega začetnega oligonukleotida. Faza podaljševanja poteka najpogosteje pri 72°C (30), ki je najugodnejša temperatura za delovanje temperaturno obstojne DNA-polimeraze. Ker je PCR sestavljen iz 25- do 40-kratnega ponavljanja določenega temperaturnega cikla, je končni rezultat dogajanja eksponentno kopičenje značilnih tarčnih odsekov DNA. Zaradi ponavljanja razdvajanja pri 95°C uporabljamo termostabilni encim, aq DNA-polimera-zo, ki so jo pridobili iz termofilnih bakterij iz islandskih vrelcev vroče vode. Po zadnjem ciklu se celotna encimska reakcija največkrat ustavi z ohladitvijo reakcijske zmesi na 4°C (30). Multipleks PCR je metoda, pri kateri hkrati pomnožujemo več odsekov DNA. To dosežemo z dodatkom več različnih parov začetnih oligonukleotidov v isto epruvetko (28). Tako dobljene PCR-pridelke lahko kasneje razlikujemo po dolžini. Postopek Pripravili smo 25 |il reakcijske zmesi za PCR, ki je vsebovala: • 16,25 |il dvakrat destilirane vode; • 1 |il vzorca DNA (25-50 ng); • 2,5 |il 2 mM dNTP; • 2,5 |il reakcijskega pufra PCR; • 1,5 |il 25 mM MgCl2; • 0,5|il začetnega oligonukleotida a (25pmol); • 0,5 |il začetnega oligonukleotida b (25pmol); • 0,25 |il Taq DNA-polimeraze (0,25 enote). Za multipleks PCR smo pripravili 25 |il reakcijske zmesi, ki je vsebovala: • 8,5 |il dvakrat destilirane vode; • 5 |il 2 mM dNTP; • 2,5 |il reakcijskega pufra PCR; • 1,5 |il 25 mM MgCl2; • 0,5 |il začetnega oligonukleotida a in b vsakega od izbranih mikrosatelitov, ki označujejo gene APC, p53 Rb in nm23 (25 pmol); • 0,5 |il Taq DNA-polimeraze (0,5 enote). V vsako epruvetko smo dodali kapljico parafinskega olja, ki je preprečilo izhlapevanje reakcijske zmesi med reakcijo. Za negativno kontrolo smo reakcijski zmesi namesto DNA dodali dvakrat destilirano vodo. Z epruvetko smo ravnali enako kot z vsemi ostalimi in jo zaprli šele, ko so bile vse ostale epruvetke že zaprte. Epruvetke smo vložili v napravo za PCR (Techne PHC-2) in pognali ustrezni program: • 1 cikel: 5 minut pri 95°C in 1 minuto pri 55°C; • 22 ciklov: 30 sekund pri 94°C, 1 minuto pri 55°C in 30 sekund pri 72°C; • 1 cikel: 10 minut pri 72°C ter • ohladitev na 4°C. Začetne oligonukleotide so nam izdelali in barvno označili s fluorokromi pri družbi Per-kin Elmer. Barvno so nam označili le en začetni oligonukleotid vsakega para. Tako je bila označena le ena veriga DNA, kar nam je olajšalo zaznavo. Oligonukleotidi so bili barvno označeni po postopkih, ki so opisani v literaturi (31, 28). Tabela 2. Nukleotidna zaporedja, dolžine pridelkov in barvne oznake začetnih oligonukleotidov. TET - zeleno fluorescentno barvilo; 6-FAM - modro fluorescentno barvilo; HEX - rumeno fluorescentno barvilo; APC, p53, DCC, Rb in nm23 — zaviralni geni; ZO - začetni oligonukleotidi. Izbrani Nukleotidno zaporedje Barvna Dolžina pridelka ZO oznaka (bazni pari) APC-1a 5' -GTAAGCAGGACAAGATGACAG-3' TET 156-182 APC-1b 5' -GCTATTCTCTCAGGATCTTG-3' neobarvan P53-2a 5' -AACAGCTCCTTTAATGGCAG-3' 6-FAM 140-175 P53-2b 5' -GAATCCGGGAGGAGGTTG-3' neobarvan DCC-2a 5' -GATGACAIIIICCCTCTAG-3' HEX 150-210 DCC-2b 5' -GTGGTTATTGCCTTGAAAAG-3' neobarvan Rb-1a 5' -CTCCTCCCTACTTACTTGT-3' TET 266-306 Rb-1b 5' -AATTAACAAGGTGTGGTGGTACACG-3' neobarvan Nm23-1a 5' -TTGACCGGGGTAGAGAACTC-3' TET 94-104 Nm23-1b 5' -TCTCAGTACTTCCCGTGACC-3' neobarvan Analiza PCR-pridelka s kapilarno elektroforezo Načelo PCR-pridelke smo ločevali po načelu kapilarne elektroforeze z napravo, ki jo imenujemo avtomatski genski analizator (angl. Genetic Analyser). Vzorce nanašamo zaporedno in avtomatsko. Odseki DNA potujejo po tekočem mediju (polimeru) do optičnega okenca. To je mesto na kapilari, ki prepušča vzpodbujevalno svetlobo. Zaznava temelji na začetnih oligonukleotidih, ki so označeni s fluorescentnimi barvili (fluorokromi, npr. HEX, 6-FAM, TAMRA in TET). Med elektroforezo potujejo označeni odseki DNA po kapilari preko optičnega okenca, kjer laserski žarek spodbudi fluorokrome in ti pričnejo fluorescirati - oddajati vzbujeno svetlobo. Fluorokromi imajo vrhove oddane svetlobe pri različnih valovnih dolžinah. Fluorescentni signal zaznavamo v barvi, ki jo dobimo s pomočjo ustreznega filtra. Sočasno lahko zaznavamo štiri različne tipe fluorescentnih barvil, kar nam omogoča sočasno zaznavanje različno fluorescentno označenih PCR-pridelkov. Hkrati lahko analiziramo največ tri, z različnimi fluorokromi označene PCR-pridelke, s četrtim fluorokromom pa označimo notranji velikostni standard, ki predstavlja osnovo za avtomatsko določanje dolžin odsekov DNA oz. alelov (27). V primeru, da se PCR-pridelki, označeni z enako barvo, dovolj razlikujejo po dolžini, pa lahko zaznavamo tudi večje število PCR-pridelkov. Tako lahko odseke DNA ločujemo na osnovi barv in dolžin. Slika, ki jo dobimo po končani ločitvi PCR-pridelkov, se imenuje elektroferogram. Postopek priprave vzorcev V Eppendorf epruvetko smo dali po 12 |il formamida, 0,5 |il notranjega velikostnega standarda in 1 |il PCR-pridelka. Epruvetke smo zaprli in oddali v ločevanje s kapilarno elektroforezo, kar so izvedli na avtomatskem genskem analizatorju (Perkin Elmer) na Inštitutu za sodno medicino Medicinske fakultete v Ljubljani. Računanje alelnega razmerja Računanje alelnega razmerja smo povzeli po delu Cawkwellove in sodelavcev (28). Alel-no razmerje smo računali na podlagi elektroferograma, v katerem je količina pomnoženega odseka DNA (alela) prikazana kot površina vrha. V primeru heterozigotnosti alelov smo dobili dva vrha. Izračunali smo razmerje površin obeh vrhov za tumorsko tkivo (T1, T2) in ga primerjali z razmerjem površin obeh vrhov pri zdravem tkivu (N1, N2). T1T2 N1:N2 T1 vedno predstavlja površino nižjega vrha, N1 pa ustrezno površino vrha pri enaki dolžini v parnem vzorcu zdravega tkiva. T2 vedno predstavlja površino višjega vrha, N2 pa ustrezno površino vrha pri enaki dolžini v parnem vzorcu zdravega tkiva. V primeru, ko alel-no razmerje presega rezultat 1,00, uporabimo naslednjo pretvorbo: 1 katere rezultat je med 0,00 in 1,00. T:T2 N1:N2 \ i c- / Končni rezultat, ki je manjši ali enak 0,50, se smatra kot dokaz za izgubo alela. Tako dopuščamo možnost, da vsebuje tumorsko tkivo 50% normalnih celic. V primeru homozigotnosti alelov alelnega razmerja ne moremo izračunati in tak rezultat smatramo za neinformativen. Tudi če se v elektroferogramu tumorskega tkiva prikažejo novi vrhovi, ki niso vidni v elektroferogramu zdravega tkiva, je rezultat neinformativen. Vzrok temu je mikrosatelitna nestabilnost opazovanega gena. Ra~unanje pogostnosti izgube heterozigotnosti Računanje pogostnosti izgube heterozigotnosti smo povzeli po delu Cawkwellove in sodelavcev (28). Za računanje smo uporabili enačbo: LOH -7-šX 100% L-OH+N) LOH - število primerov z izgubo heterozigotnosti N - število heterozigotnih primerov, ko ni prišlo do izgube heterozigotnosti Rezultati DNA smo osamili iz sveže zamrznjenih vzorcev tumorskega in zdravega tkiva. Vsebnost DNA v vzorcu smo preverili z elektroforezo na 0,5% agaroznem gelu DS 1 2 3 4 5 Slika 4. Elektroforeza nekaj vzorcev osamljene DNA. DS—dolžinski standard; od 1 do 5 — vzorci osamljene DNA. Osamljeni DNA smo izmerili koncentracijo in čistost z merjenjem absorbnosti ultravijolične svetlobe pri 260 in 280 nm. Koncentracije DNA so znašale od 0,1 do 10,0 ^g/^l, čistost pa je ustrezala zahtevanemu razmerju (A260/A280 je med 1,5 in 2,0). Izvedli smo multipleks PCR izbranih mikrosatelitnih zaporedij, ki označujejo gene APC, p53, Rb in nm23, za gen DCC pa smo izvedli monoPCR. PCR-pridelke smo ločevali 1800. 1600. 1400. 1200. 1000. 800. 600. 400. 200. Dye/Sample Peak Minutes Size Peak Height Peak Area Data Point Il 22 B, 1 14.70 148.21 869 7507 4007 Il 22B,2 14.86 153.82 867 7523 4051 ® 22G,5 13.04 97.03 2 9 1 2617 3555 Il 22G, 7 13.18 101.36 272 2382 3594 BI 22G, 1 2 14.97 157.61 1864 1 5945 4081 Il 22G, 1 7 18.82 284.58 313 5235 5132 El 22G.20 19.06 292.78 289 4497 5196 B 1800. 1600. 1400. 1200. 1000. 800. 600. 400. 200, Dye/Sample Peak Minutes Size Peak Height Peak Area Data Point II 22B, 1 14.70 148.21 869 7507 4007 Il 22B,2 14.86 153.82 867 7523 4051 ® 22G,5 13.04 97.03 2 9 1 2617 3555 II 22G,7 13.18 101.36 272 2382 3594 BI 22G, 1 2 14.97 157.61 1864 1 5945 4081 Il 22G, 1 7 18.82 284.58 313 5235 5132 El 22G.20 19.06 292.78 289 4497 5196 Slika 5. Elektroferogramprikazuje multipleks PCR (za mikrosatelitna zaporedja genov APC, p53, Rb in nm23) primera, označenega sštevilko 10. Elektroferograma zdravega tkiva (A) in tumorskega tkiva (B) sta si podobna —ni prišlo do genskih sprememb. Dokazana je homozigotnost APC (prisoten samo en vrh), vsi ostali (nm23, p53, Rb) pa so heterozigotni (prisotna dva vrhova). Na abscisi je prikazana dolžina pomnoženega odseka v baznih parih, na ordinati pa višina vrha. Dolžine mikrosatelitnih zaporedij alelov: nm23 (97bp, 101 bp), APC (157bp), Rb (285 bp, 293 bp), p53 (148bp, 154 bp). Tabela pod elektroferogramomprikazuje dolžino odseka (angl. size) v baznih parih, višino vrha (angl. peak height) in površino vrha (angl. peak area). 70 80 90 100 1 10 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 22 B: VZOREC 21 / 6-FAM (P2) mm 22 R: VZOREC 21 / GS 350 TAMRA S.S. 22 G: VZOREC 21 / TET (APC1,NM,Rb) 70 80 90 100 1 10 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 _ 22 B: VZOREC 21 / 6-FAM (P2) mm 22 R: VZOREC 21 / GS 350 TAMRA S.S. UH 22 G: VZOREC 21 /TET (APC1,NM,Rb) z avtomatskim genskim analizatorjem, ki nam je izrisal ustrezne elektroferograme. Z avtomatskim analizatorjem smo preiskali 17 parov vzorcev, od katerih jih je bilo 12 primernih za nadaljnjo analizo, preostalih 5 (označenih s številkami 13-17) pa smo izločili. Nekaj primerov elektroferogramov za posamezne pare vzorcev je prikazanih na slikah od 5 do 8. 1800. 1600. 1400. 1200. 1000. 800. 600. 400. 200. Dye/Sample Peak Minutes Size Peak Height Peak Area Data Point B SB,2 14.59 153.78 1343 11358 3979 B 8B,3 14.75 159.14 1329 11130 4022 B 8G,5 12.80 96.88 455 4503 3490 B 8G,6 12.87 99.07 352 3261 3509 B 8G, 1 4 15.35 178.56 1265 10220 4184 B 8G.19 15.66 188.78 992 8000 4270 B 8G, 2 4 18.47 284.50 446 8078 5037 B 8G.2 6 18.70 292.62 402 6380 5099 B 45Q_ 400_ 350_ 300_ 250. 200_ 150_ 100_ 50_ Dye/Sample Peak Minutes Size Peak Height Peak Area Data Point B 9B, 2 14.58 153.78 413 3482 3975 B 9B, 3 14.74 159.14 90 720 4018 0 9G, 9 12.79 96.78 3 0 6 2615 3486 B 9G, 1 0 12.86 99.08 1 77 1465 3506 B 9G, 1 5 15.33 178.49 263 2233 4179 B 9G.17 15.65 188.86 7 7 622 4266 B 9G, 1 8 18.45 284.27 73 JL255_j 5032 B 9G,2 0 18.69 292.50 97 1569 5095 Slika 6. Elektroferogramprikazuje multipleks PCR (za mikrosatelitna zaporedja genov APC, p53, Rb in nm23) primera, označenega s številko 5. Elektroferograma zdravega tkiva (A) in tumorskega tkiva (B) sta različna. Vsi aleli so heterozigotni, za p53 in APC pa smo z izračunom alelnega razmerja dokazali izgubo heterozi-gotnosti. Na abscisi je prikazana dolžina pomnoženega odseka v baznih parih, na ordinati pa višina vrha. Dolžine mikrosatelitnih zaporedij alelov: nm23 (97bp, 99bp), APC (178bp, 189bp), Rb (284bp, 293bp), p53 (154bp, 159bp). Tabela pod elektroferogramom prikazuje dolžino odseka (angl. size) v baznih parih, višino vrha (angl. peak height) in površino vrha (angl. peak area). 70 80 90 100 1 10 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 _A il A A, J J US 8 B : VZOREC 7 / 6-FAM