I-127 Strokovni prispevek/Professional article DOLOČITEV ŠTEVILA AKTIVIRANIH TROMBOCITOV S PROTITELESI ZA AKTIVIRANI FIBRINOGEN IN SELEKTIN-P PRI BOLNIKIH Z ESENCIALNO TROMBOCITEMIJO IN VPLIV ANTIAGREGACIJSKIH ZDRAVIL DEFINITION OF ACTIVATED THROMBOCYTE NUMBER WITH ANTIBODIES FOR ACTIVATED FIBRINOGEN AND P-SELECTIN IN PATIENTS WITH ESSENTIAL THROMBOCYTHEMIA AND ANTIAGGREGATION DRUG EFFECT Samo Zver, Darja Žontar Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana Prispelo 2004-02-13, sprejeto 2004-03-05; ZDRAV VESTN 2004; 73: Suppl. I: 127–34 Ključne besede: aktivirani trombociti; selektin-P; aktivni fibrinogen; klopidogrel; acetil-salicilna kislina Izvleček – Izhodišča. Esencialna trombocitemija (ET) je kro- nična mieloproliferativna bolezen, za katero je značilno po- večano število funkcijsko spremenjenih trombocitov v razpo- nu od 400 do 2000 × 109/L. Večji delež trombocitov kot pri zdravi populaciji je pri bolnikih z ET tudi aktiviran. Aktivira- ne trombocite označujeta selektin-P in aktivirani fibrinogen na njihovih membranah. Ker so za bolezen značilni pogostej- ši trombembolični zapleti in krvavitve, je ET potrebno zdravi- ti. Skupino bolnikov z ET, ki imajo število trombocitov nižje od 1000 × 109/L in niso utrpeli nobenega trombemboličnega zapleta, zdravimo samo z antiagregacijskim zdravilom, ace- tilsalicilno kislino 100 mg/dan per os. Redna uporaba clopi- dogrela pri bolnikih z ET ni poznana in je omejena le na posamezne opise primerov v literaturi. Bolniki in metode. V klinični raziskavi smo primerjali anti- agregacijski učinek acetilsalicilne kisline in clopidogrela ta- ko, da smo določali deleže izraženega selektina-P in aktivira- nega fibrinogena na membranah trombocitov. V raziskavo smo vključili 35 bolnikov z ET v starosti od 21 do 78 let, ki so imeli število trombocitov med 451 in 952 × 109/L in ki v poteku bolezni niso utrpeli trombemboličnega zapleta. Bolniki so v štirinajst dnevnih zaporednih obdobjih prejema- li acetilsalicilno kislino 100 mg/dan per os, clopidogrel 75 mg/dan per os in nato še obe zdravili hkrati v istem odmerku. Po vsakem končanem obdobju smo delež (odstotek) aktivira- nih trombocitov določili s pretočnim citometrom z mono- klonskimi protitelesi proti selektinu-P in aktiviranemu fibri- nogenu. Za izračun razlike med povprečjema dveh majhnih neodvisnih vzorcev smo uporabili t-porazdelitev, oziroma t- test. Rezultati. Ko so bolniki prenehali jemati acetilsalicilno kisli- no in začeli prejemati clopidogrel, so se deleži izraženega selektina-P na membrani trombocitov statistično značilno zmanjšali (t-vrednost 1,99; p < 0,05). Prav tako se je statistič- Key words: activated platelets; selectin-P; activated fibrino- gen; clopidogrel; acetyl-salicylic acid Abstract – Background. Essential thrombocythemia (ET) is a chronic myeloproliferative disease with a platelet count within the range of 400–2000 × 109/L. Higher percentage of platelets in the circulation of patients with ET express also activation markers on their membranes. Two of such markers are P-selectin and activated fibrinogen on platelet membranes. Because of frequent thrombembolic and also bleeding related complications, treatment of ET is mandatory. Patients whose platelet count is less than 1000 × 109/L and who did not suffer any thrombembolic complication during the course of the disease, are ussually treated with an anti- aggregation drug, acetylsalicylic acid 100 mg/daily orally. Clopidogrel is an adenosyn-di-phosphate (ADP) receptor antagonist in platelets. There is no routine clinical data about clopidogrel treatment in the patients with ET and only sporadic case reports can be find in the literature. Patients and methods. In our clinical study we compared antiaggregational effects of acetylsalicylic acid and clopido- grel, by measuring the P-selectin level and activated fibrino- gen expression on platelet membranes. There were 35 ET patients included, within the age range between 21 and 78 years and with platelet counts within 451–952 × 109/L. None of the patients did suffer any thrombembolic complication during the course of the disease. During the sequential 14 day periods, patients rece- ived acetylsalicylic acid 100 mg/daily orally, followed by clopidogrel 75 mg/daily orally and ultimativelly, together acetylsalicylic acid 100 mg/daily orally plus clopidogrel 75 mg/daily orally. After each fourteen days period the level of P-selectin and activated fibrinogen activated platelets were determined with monoclonal antibodies on flow cytometer. Statistical evaluation was calculated on the difference of average values between the two small, independent pair gro- ups with the t-test. ZDRAV VESTN 2004; 73: I-127–34 I-128 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I no značilno zmanjšal tudi delež selektina-P v obdobju, ko so bolniki prejemali hkrati acetilsalicilno kislino in clopidogrel glede na obdobje, ko so prejemali samo acetilsalicilno kislino (t-vrednost 2,11; p < 0,05). Nobene statistično značilne razli- ke v deležih selektina-P pa nismo ugotovili, ko smo primerjali obdobje, v katerem so bolniki prejemali samo clopidogrel z obdobjem, ko so prejemali hkrati acetilsalicilno kislino in clo- pidogrel (t-vrednost 0,19; p > 0,05). Deleži aktiviranega fibri- nogena na trombocitnih membranah so bili v vseh obdobjih jemanja zdravil med seboj primerljivi in brez statistično ugo- tovljenih značilnih razlik med seboj (za vsako parno razmer- je je bil p > 0,05). Zaključki. Clopidogrel statistično značilno zmanjša delež se- lektina-P na membranah trombocitov pri bolnikih z ET (p < 0,05). Acetilsalicilna kislina ne vpliva na zmanjšanje P-selek- tina na membrani trombocitov. Tudi kombinacija acetilsali- cilna kislina/clopidogrel nima večjega učinka na zmanjša- nje izraženega deleža selektina-P kot clopidogrel sam. Acetil- salicilna kislina in clopidogrel vsak posamezno kot tudi v kom- binaciji ne znižata deleža aktiviranega fibrinogena na mem- branah trombocitov. Zaključimo lahko, da je clopidogrel mor- da lahko ustrezna zamenjava za acetilsalicilno kislino pri bolnikih z ET, ki acetilsalicilne kisline zaradi različnih vzro- kov ne morejo prejemati. Results. When the patients stopped with acetylsalicylic acid and began with clopidogrel, the percentage of P-selectin exposure on platelet membranes was statistically significant lower (t-value 1.99; p < 0.05). We also noticed statistically significant lower P-selectin exposure in the period, during which patients received acetylsalicylic acid plus clopidogrel, versus the period, during which they received acetylsalicylic acid only (t-value 2.11; p < 0.05). But there was no statistically significant difference in P-selectin exposure within the periods, during which patients received clopidogrel versus acetylsalicylic acid plus clopidogrel (t-value 0.19; p > 0.05). Percentages of activated fibrinogen exposures on platelet membranes were in all clinical study periods comparable and no statistically significant differences between them were noticed (for each pair-relation p > 0.05). Conclusions. In patients with ET clopidogrel statistically significant (p < 0.05) lowers the percentage of P-selectin exposure on platelet membranes. Acetylsalicylic acid has no influence on P-selectin expression and also the combination of acetylsalicylic acid and clopidogrel, does not have higher P-selectin lowering efficacy, than clopidogrel itself. Acetyl- salicylic acid and clopidogrel alone, nor in combination don’t have any influence on the expression level of activated fibrinogen on platelet membranes. To conclude, that clopidogrel may be an alternative to acetylsalicylic acid in patients with ET, who can not tolerate acetysalicylic acid because of it’s side-effects. Uvod Esencialna trombocitemija (ET) sodi v skupino kroničnih mi- eloproliferativnih krvnih bolezni. Je klonska bolezen multipo- tentne matične krvotvorne celice, ki je usmerjena v megakari- ocitno-trombocitno celično vrsto. V krvni sliki je zato zvečano število trombocitov od 400 do 2000 × 109/L, v kostnem mozgu pa ugotovimo povečano število velikih, zrelih megakariocitov. Ker noben klinični in laboratorijski kazalec ni značilen za ET, potrdimo diagnozo tako, da izključimo ostale mieloprolifera- tivne in mielodisplastične bolezni, predvsem pa vsa stanja, ki bi bila lahko povezana z reaktivno oziroma sekundarno trom- bocitozo (1). Večje število trombocitov kot pri zdravih osebah je pri bolni- kih z ET tudi aktiviranih (2, 3). Delež aktiviranih trombocitov lahko ocenimo z določanjem števila trombocitov, ki imajo na svoji površini izražena specifična antigena. To sta aktivirani, konformacijski spremenjeni fibrinogen, ki je vezan na recep- tor GP II B /III A , in selektin-P (poznan tudi kot CD62 antigen). Pri ET so pogostejši trombembolični zapleti, ki lahko prizade- nejo arterijski in/ali venski žilni sistem in so glavni vzrok obo- levnosti in umrljivosti pri bolnikih (4, 5). Najpogosteje prihaja do cerebro-vaskularnih inzultov (CVI), prehodnih ishemij osrednjega živčevja (TIA), zapor manjših perifernih arterij, mi- okardnih infarktov in globokih venskih tromboz s posledični- mi pljučnimi trombembolizmi. Žilje je lahko prizadeto tudi na ravni arteriol in kapilar in se klinično izrazi kot ishemija prstov rok, nog oziroma akralnih delov telesa, kar imenujemo eritro- melalgija (6). Zato je ET potrebno zdraviti. S kliničnimi raziskavami je potrjeno, da število trombocitov 1000 × 109/L in več pomembno vpliva na pogostost trombem- boličnih zapletov in krvavitev pri novoodkritih kot tudi pri že zdravljenih bolnikih z ET (7). Veljavna doktrina zdravljenja bol- nikov z ET na Kliničnem oddelku za hematologijo Kliničnega centra v Ljubljani in tudi v Sloveniji je, kakor sledi. Novoodkriti bolniki s številom trombocitov v razponu med 400 in 1000 × 109/L, ki v anamnezi nimajo trombemboličnega zapleta, pre- jemajo samo antiagregacijsko zdravilo, acetilsalicilno kislino 100 mg/dan per os. Bolnike z ET, ki imajo ob ugotovitvi bole- zni število trombocitov večje od 1000 × 109/L, in tiste, ki so že utrpeli kakršen koli trombemboličen zaplet, zdravimo s cito- statiki (busulfan, hidroksiurea) ali interferonom alfa. V zadnjih letih se uveljavlja novo antiagregacijsko zdravilo clo- pidogrel. Clopidogrel je antagonist receptorjev za adenozin- di-fosfat (ADP) na membrani trombocitov (9–12). ADP je v skoraj molarnih koncentracijah v gostih zrncih trombocitov, iz katerih se sprosti predvsem takrat, ko so trombociti stimulira- ni s trombinom in kolagenom. Sam po sebi je ADP šibak agre- gacijski dejavnik, zato pa je nujen kofaktor za normalno trom- bocitno aktivacijo z agregacijskima agonistoma trombinom in kolagenom (13, 14). V manjši meri ADP poveča tudi agregacij- sko delovanje šibkejših agonistov, kot so serotonin, adrenalin in nekateri citokini (15–17). Na trombocitih so znani trije različni receptorji za ADP. To so receptorji P2Y 1 , P2Y 12 in P2X 1 . Clopidogrel deluje na receptor P2Y 12 . Zdravilni učinek nastopi po treh dneh jemanja zdravila in traja lahko najdlje še deset dni zatem, ko bolnik zdravila ne prejema več. Selektivno in nepovratno antagonizira z ADP inducirano inhibicijo PGE 1 -adenilil ciklaze (prostaglandin E 1 ade- nilil ciklaza), fosforilacijo tirozina na več proteinih in defosfori- lacijo nekaterih proteinov (18–20). Clopidogrel zato zavira agregacijo trombocitov z različnimi agregacijskimi dejavniki, predvsem z ADP, moti vezavo fibrinogena na receptor GPII B / III A , znižuje delež selektina-P na trombocitni membrani in zavi- ra povezavo med trombociti in levkociti v krvnem strdku (21, 22). Hkrati pa clopidogrel ne vpliva na spremembo oblike trombocitov in tok kalcija skozi trombocitno membrano, ki sta prav tako odvisna od ADP. Redno se clopidogrel že uporablja v kardiologiji pri bolnikih s sindromom angine pektoris (AP) (23). Po veljavni doktrini v Sloveniji bolniki z ishemično boleznijo srca, ki jih zdravimo s koronarografijo in vstavitvijo znotrajžilnih opornic v koronar- ne arterije, po posegu vsaj štiri tedne prejemajo clopidogrel 75 mg/dan skupaj z acetilsalicilno kislino 100 mg/dan per os (24, 25). Zdravljenje nato nadaljujejo samo z acetilsalicilno ki- slino. Clopidogrel lahko še naprej prejemajo tudi bolniki z is- I-129 hemično boleznijo srca, ki zaradi drugih vzrokov ne morejo prejemati acetilsalicilne kisline. Pri bolnikih z ET bi bil morda lahko clopidogrel alternativa antiagregacijskemu zdravljenju z acetilsalicilno kislino pri bol- nikih, ki imajo ob ugotovitvi bolezni število trombocitov manj- še od 1000 × 109/L in niso doživeli trombemboličnega zapleta. Posebno bi clopidogrel prišel v poštev kot zdravilo izbire pri bolnikih, ki imajo alergične reakcije na acetilsalicilno kislino, pri bolnikih z anamnezo ulkusne bolezni po jemanju nestero- idnih antirevmatikov ali pa pri tistih, ki imajo sočasno astmo, acetilsalicilna kislina pa lahko sproži astmatične napade in aler- gični rinitis/sinusitis. Učinkovitost zdravljenja ET z acetilsalicilno kislino in/ali clopi- dogrelom lahko poskusimo objektivno oceniti tako, da do- ločimo delež aktiviranih trombocitov. Aktivirani trombociti ima- jo na svoji površini izražen selektin-P in receptorje GP II B /III A za aktivirano, konformacijsko spremenjeno obliko fibrinoge- na. Selektin-P je glikoprotein v membranah a granul tromboci- tov, ki se vključi v membrano trombocita, ko je ta aktiviran (26). Če je selektin-P na membrani trombocita, se v trombus vključijo levkociti. Verjetno je to ključni dogodek pri trombo- genezi, povezan tudi s kasnejšim vnetnim odgovorom v sa- mem trombusu (27). Clopidogrel zmanjša delež (odstotek) izraženosti selektina-P na trombocitni membrani (28, 29). Z monoklonskimi protitelesi proti P-selektinu lahko s pretoč- nim citometrom določimo delež aktiviranih trombocitov v ce- lotni trombocitni populaciji bolnika. GP II B /III A je pri človeku receptor za fibrinogen. Na en recep- tor se veže ena molekula fibrinogena. Mirujoči trombocit ima na svoji površini od 40.000 do 80.000 receptorjev GP II B /III A , ki pa fibrinogena ne vežejo. Ob aktiviranju trombocita se nji- hovo število poveča v razponu od 0 do 100%. Aktiviranje trom- bocita spremeni tudi konformacijo receptorjev GPII B /III A ta- ko, da se izpostavijo njihova vezavna mesta za fibrinogen. Ta- ko spremenjeni receptor ima zato veliko afiniteto za fibrino- gen. Vezava fibrinogena na konformacijsko spremenjen re- ceptor GPII B /III A pa spremeni tudi konformacijsko obliko fi- brinogena. Nastane aktivirani fibrinogen, ki ga lahko določa- mo z monoklonskimi protitelesi. V pregledu literature nismo zasledili poročil o zdravljenju bol- nikov z ET s clopidogrelom. Prav tako tudi ni objavljenih poro- čil o zdravljenju ET s kombinacijo acetilsalicilne kisline in clopi- dogrela in spremljanju učinka zdravljenja z določitvijo deleža aktiviranih trombocitov s protitelesi za P-selektin in aktivirani fibrinogen. Menimo, da bi lahko z določanjem deleža aktivira- nih trombocitov v klinični praksi dobili pomemben podatek o tem, kaj z antiagregacijskim zdravljenjem bolnikov z ET prav- zaprav dosežemo. Morda bi lahko delež aktiviranih tromboci- tov v prihodnje postal napovedni dejavnik tveganja nastanka trombemboličnega zapleta pri bolnikih z ET. Zasnova klinične raziskave in opis metod V obdobju 12 mesecev smo v raziskavo vključili 35 bolnikov, 9 moških in 26 žensk, ki v poteku bolezni niso doživeli trom- bemboličnega zapleta. Njihova povprečna starost je bila 58,6 leta v razponu od 21 let do 78 let. Pogoj za vključitev v raziska- vo je bilo število trombocitov med 400 in 1000 × 109/L. Tako je bilo povprečno število trombocitov pri bolnikih 763 × 109/L, v razponu od 451 do 952 × 109/L. Pri vključenih bolnikih smo posebej pozorno opravili anamnezo v smislu izključitve bole- zni srca in ožilja, predvsem sindroma angine pektoris. Ker so vključeni bolniki krajši čas prejemali dve antiagregacijski zdra- vili hkrati, nihče od bolnikov ni smel imeti anamnestičnih po- datkov o ulkusni bolezni želodca in dvanajstnika, oziroma nag- njenosti k podkožnim in sluzničnim krvavitvam. Diagnozo ET smo postavili na osnovi zvečanega števila trom- bocitov, ki je moralo biti več od 400 × 109/L in potrdili z izsled- kom punkcije oziroma biopsije kostnega mozga. V kostnem mozgu ni smelo biti morfoloških znakov mielodisplastičnih krv- nih bolezni in obsežnejše kolagenske fibroze. V krvni sliki je moral biti hematokrit manjši od 40% in povprečni volumen eritrocitov (PVE) normalen. Sočasno smo pri vseh bolnikih iz- ključili vzroke za sekundarno trombocitozo. Načrt klinične raziskave Bolnikom smo določili delež aktiviranih trombocitov v treh različnih kliničnih obdobjih. Določili smo jih s pretočnim cito- metrom in monoklonskimi protitelesi proti selektinu-P in akti- viranemu fibrinogenu. Prvič smo odvzeli kri za določitev akti- viranih trombocitov bolnikom, ki se že vodijo v hematološki ambulanti in so vsaj štirinajst dni pred odvzemom redno preje- mali acetilsalicilno kislino 100 mg/dan per os. Bolnikom acetil- salicilne kisline z namenom, da bi dobili izhodne vrednosti se- lektina-P in aktiviranega fibrinogena v obdobju, ko bolniki ne bi jemali zdravila, nismo ukinili. To bi za bolnike lahko pred- stavljalo preveliko tveganje za trombotične zaplete, kar ni skla- dno z medicinsko etiko. Hkrati smo vključili tudi novoodkrite bolnike z ET, ki so v tem obdobju prišli v hematološko ambu- lanto. Tej podskupini bolnikov smo odvzeli kri za določitev aktiviranih trombocitov, še preden so začeli jemati acetilsalicil- no kislino in nato še enkrat potem, ko so že 14 dni prejemali acetilsalicilno kislino 100 mg/dan. Drugič smo kri za določitev aktiviranih trombocitov odvzeli, ko so bolniki prenehali jemati acetilsalicilno kislino 100 mg/ dan in naslednjih 14 dni preje- mali samo clopidogrel 75 mg/dan per os. Tretjič smo kri za določitev aktiviranih trombocitov odvzeli, ko so bolniki na- slednjih 14 dni prejemali acetilsalicilno kislino 100 mg/dan per os skupaj s clopidogrelom 75 mg/dan per os. Po koncu raz- iskave so bolniki nadaljevali s trenutno uveljavljenim antiagre- gacijskim zdravljenjem z acetilsalicilno kislino 100 mg/dan. Ob menjavah zdravil (acetilsalicilna kislina/clopidogrel) nismo predvideli večdnevnega prostega intervala, v katerem naj bi se prejšnje zdravilo izplavilo iz telesa. To, upoštevaje življenj- sko dobo trombocitov, na katere zdravili učinkujeta, niti ni bilo potrebno. Raziskavo je odobrila komisija za medicinsko etiko dne 24. 9. 2002 (dopis št. 95/09/02). Določitev števila aktiviranih trombocitov s pretočnim citometrom Vsakemu bolniku smo na začetku klinične raziskave in ob kon- cu vsakega obdobja jemanja zdravil odvzeli kri za določitev aktiviranih trombocitov. Pri vsakem odvzemu smo odvzeli 5 ml venske krvi v epruveto s citratom kot antikoagulansom (0,105 M). Kot reagente smo uporabljali fiziološko raztopino z dodatkom pufra (PFR), 1-odstotni bovini serumski albumin (BSA), piščančja protitelesa proti selektinu-P (anti-human P- selectin-FITC WAK-FA-PSFITC-2, proizvajalec WAK Chemie, Bad Soden, Germany), piščančja protitelesa proti aktivirane- mu fibrinogenu (anti human fibrinogen WAK-FA-AFFITC-2, pro- izvajalec WAK Chemie, Bad Soden, Germany). Izotipski kon- troli za protitelesa proti selektinu-P sta bili piščančji IgY-FITC (WAK Chemie, Bad Soden,Germany) in za protitelesa proti aktiviranemu fibrinogenu piščančji IgG1-FITC (WAK Chemie, Bad Soden, Germany) (30). Vzorec krvi v epruveti s citratom smo takoj po odvzemu pet- najst minut centrifugirali pri 194 G (1000 obratih/minuto). S trombociti bogato plazmo smo odpipetirali in nato redčili vzo- rec s fiziološko raztopino do števila trombocitov približno 400 × 109/L. V označene epruvete smo odpipetirali 40 µl tako pri- pravljene s trombociti bogate plazme in dodali 10 µl protiteles oziroma izotipskih kontrol. Po petnajstminutni inkubaciji v te- mi in pri sobni temperaturi smo v vsako epruveto posebej ZVER S, ŽONTAR D. DOLOČITEV ŠTEVILA AKTIVIRANIH TROMBOCITOV S PROTITELESI ZA AKTIVIRANI FIBRINOGEN IN SELEKTIN-P I-130 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I pipetirali 2 ml ohlajenega pufra PFR z BSA in odčitali fluore- scenco na pretočnem citometru Coulter Epics XL-MCL. Rezul- tat smo zapisali v odstotkih. Statistična obdelava podatkov Cilj statistične obdelave zbranih podatkov je bil ovrednotiti raz- like v delovanju treh načinov antiagregacijskega zdravljenja na znižanje deleža aktiviranih trombocitov z določitvijo deleža selektina-P in aktiviranega fibrinogena na membrani trombo- citov. Statistična analiza je bila ločena za delež izraženega se- lektina-P in za delež izraženega aktiviranega fibrinogena. Stati- stične spremenljivke so bili deleži selektina-P (1) in aktivirane- ga fibrinogena (2) na trombocitnih membranah pri zdravlje- nju z A (acetilsalicilna kislina), P (clopidogrel) in kombinacijo AP (acetilsalicilna kislina in clopidogrel hkrati) pri vsakem od bolnikov v skupini. V celotni skupini bolnikov z ET smo obliko- vali tudi podskupino novoodkritih bolnikov z ET, ki smo jim določili tudi deleže aktiviranih trombocitov, še preden so začeli prejemati acetilsalicilno kislino (0). Uporabili smo preskus domneve o razliki med povprečjema dveh majhnih neodvisnih vzorcev. Preizkus je temeljil na ana- lizi parnih podatkov s t-testom. Primerjani parni vzorci so: (a) delovanje zdravila P na znižanje deleža selektina-P in aktivira- nega fibrinogena v primerjavi z delovanjem zdravila A (kon- trolni vzorec); (b) delovanje kombinacije zdravil AP na zniža- nje deleža selektina-P in aktiviranega fibrinogena v primerjavi z delovanjem zdravila A (kontrolni vzorec); (c) delovanje zdra- vila P na znižanje deleža selektina-P in aktiviranega fibrinoge- na v primerjavi z delovanjem kombinacije zdravil AP. Pri podskupini novoodkritih bolnikov z ET smo izhodiščno vre- dnost selektina-P in aktiviranega fibrinogena na trombocitnih membranah, ko bolniki še niso prejemali nobenega zdravila s t-testom dodatno primerjali z vrednostjo selektina-P in aktivi- ranega fibrinogena potem, ko so bolniki začeli prejemati zdra- vilo A, P ali hkrati AP. Parne kombinacije A, P in AP smo pri tej podskupini bolnikov primerjali še ločeno med seboj. Rezultati Skupino 35 bolnikov z ET, ki smo jih vklju- čili v klinično raziskavo kot osrednjo sku- pino za statistično obdelavo podatkov, smo razdelili še na dve podskupini bolni- kov. V prvo podskupino 17 bolnikov smo uvrstili novoodkrite bolnike z ET, ki ob pri- hodu v hematološko ambulanto niso je- mali antiagregacijskih zdravil oziroma acetilsalicilne kisline. Za statistično obde- lavo so bili zanimivi zato, ker smo jim lah- ko določili izhodiščne vrednosti selekti- na-P in aktiviranega fibrinogena. V drugo podskupino 18 bolnikov smo uvrstili bol- nike, ki so se že pred vključitvijo v klinič- no raziskavo vodili v hematološki ambu- lanti in redno prejemali acetilsalicilno ki- slino 100 mg/dan. Za celotno skupino 35 bolnikov in za vsako od podskupin smo izračunali arit- metično sredino, mediano, modus, stan- dardno deviacijo, minimalno in maksi- malno vrednost posamezne meritve ter vrednosti za prvi, drugi in tretji kvartil. Za vsak primerjani par smo izračunali t- vrednost in jo nato prevedli v vrednost p pri 5-odstotni stopnji statističnega tve- ganja. Za skupino 35 bolnikov v obdobju je- manja acetilsalicilne kisline (A1) je bila Razpr. 1. Statistična obdelava vseh 35 bolnikov z ET. Table 1. Statistical data from all 35 patients with ET. A1 P1 AP1 A2 P2 AP2 Število bolnikov No. of patients 35 35 35 35 35 35 Aritmetična sredina Arithmetical mean 4,2960 2,6826 2,6200 39,5771 37,1657 39,0600 value Mediana Median 2,8500 2,3800 2,5800 37,2000 33,5000 38,4000 Modus Modus 3,39 2,32 1,20 17,00 34,10 38,40 Stand. deviacija SD 4,6054 1,3665 0,9772 11,2454 13,0548 10,6337 Minimum Min. 1,01 0,49 0,96 17,00 20,60 24,00 Maksimum Max. 23,50 7,09 4,65 66,60 80,20 81,90 Vsota Total 150,36 93,89 91,70 1385,20 1300,80 1367,10 Prvi kvartil 1st quartile 25 2,4600 1,9600 2,0400 33,0000 29,8000 31,6000 Drugi kvartil 2nd quartile 50 2,8500 2,3800 2,5800 37,2000 33,5000 38,4000 Tretji kvartil 3rd quartile 75 4,0000 3,3400 3,2300 48,6000 39,4000 44,1000 A – acestilsalicilna kislina, P – clopidogrel, 1 – selektin-P, 2 – aktiviran fibrinogen A – acetylsalicylic acid, P – clopidogrel, 1 – P-selectin, 2 – activated fibrinogen Razpr. 2. Statistična obdelava podskupine 17 novoodkritih bolnikov z ET, ki ob vključitvi v klinično raziskavo niso prejemali acetilsalicilne kisline. Table 2. Statistical data from 17 newly diagnosed ET patients, without acetyl- salicylic therapy. 01 A1 P1 AP1 02 A2 P2 AP2 Število bolnikov No. of patient 17 17 17 17 17 17 17 17 Aritmetična sredina Arithmetical mean value 4,4700 4,8618 2,7053 2,7171 41,5824 39,6235 39,7059 39,8647 Mediana Median 3,5000 2,9300 2,3200 2,6100 39,7000 39,0000 34,1000 38,4000 Modus Modus 1,54 3,39 2,32 0,96 23,40 17,00 27,00 39,80 Stand. deviacija SD 3,6565 6,0432 0,8608 1,0007 14,9869 12,1896 13,9682 12,6233 Minimum Min. 1,54 1,01 1,59 0,96 23,40 17,00 27,00 28,40 Maksimum Max. 17,30 23,50 5,18 4,65 76,20 58,00 80,20 81,90 Vsota Total 75,99 82,65 45,99 46,19 706,90 673,60 675,00 677,70 Prvi kvartil 1st quartile 25 2,4800 2,3300 2,1600 2,1200 30,2500 29,7500 30,2500 31,8000 Drugi kvartil 2nd quartile 50 3,5000 2,9300 2,3200 2,6100 39,7000 39,0000 34,1000 38,4000 Tretji kvartil 3rd quartile 75 4,8900 4,0350 3,2300 3,4050 46,2000 48,9000 43,2000 42,5000 0 – brez zdravila, A – acetilsalicilna kislina, P – clopidogrel, 1 – selektin-P, 2 – aktiviran fibrinogen 0 – without therapy, A – acetylsalicylic acid, P – clopidogrel, 1 – P-selectin, 2 – activated fibrinogen aritmetična sredina za delež selektina-P 4,29% in tako precej večja kot izračunana mediana vrednost 2,85% oziroma modus 3,39% (Razpr. 1). To je posledica visokega deleža selektina-P v tem obdobju pri 4 bolnikih. Največja vrednost je bila celo 23,50%. Ko so bolniki prenehali jemati acetilsalicilno kislino (A1) in začeli jemati clopidogrel (P1), so se deleži izraženega I-131 selektina-P zmanjšali: aritmetična sredina 2,68%, mediana 2,38% in modus 2,32% To se je prevedlo tudi v statistično značil- no zmanjšanje deleža selektina-P na trombocitni membrani, t- vrednost 1,99 (p < 0,05) (Razpr. 4). Ko so bolniki prejemali acetilsalicilno kislino in clopidogrel hkrati (A1P1), so bile vre- dnosti selektina-P za aritmetično sredino 2,62%, mediano 2,58% in modus 1,20% in tako podobne tistim, ko so bolniki prejemali samo clopidogrel (P1) (t-vrednost 0,19; p > 0,05). Če med seboj primerjamo deleže selektina-P v obdobjih, ko so bolniki prejemali acetilsalicilno kislino (A1) in hkrati acetilsali- cilno kislino in clopidogrel (A1P1), ugotovimo, da je delež se- lektina-P statistično značilno manjši v obdobju A1P1, t-vrednost 2,11 (p < 0,05). Deleži aktiviranega fibrinogena na trombocitnih membranah so bili v obdobjih, ko so bolniki prejemali acetilsalicilno kislino (A2), clopidogrel (P2) in acetilsalicilno kislino in clopidogrel (A2P2) med seboj primerljivi (Razpr. 1). t-vrednosti v obdob- jih A2-P2, A2-A2P2 in P2-A2P2 so bile 0,002, 0,018 in 0,056 (Razpr. 4) in za vsako parno razmerje je bil p > 0,05.  Pri podskupini 17 bolnikov z novoodkrito ET, ki sprva niso prejemali antiagregacijskega zdravljenja, so izhodiščni deleži selektina-P (01) 4,47% in aktiviranega fibrinogena (02) 41,5824% večji v primerjavi s podskupino 18, že zdravljenih bolnikov, ki so v izhodišču klinične raziskave že prejemali ace- tilsalicilno kislino 100 mg/dan (A1 3,7617% in A2 39,5333%) (Razpr. 2, 3). Razliki v parnih razmerjih 01-A1 in 02-A2 niso statistično značilne (p > 0,05). Deleža izraženega selektina-P sta potem, ko je bil v zdravljenje vključen clopidogrel v obeh skupinah 17 oziroma 18 bolnikov primerljiva (P1(17) 2,7053% : P1(18) 2,6611% in A1P1(17) 2,7053 : A1P1(18) 2,5283%) in se statistično značilno pomembno ne razlikujeta (p > 0,05) (Razpr. 2, 3). V skupini 17 novoodkritih bolnikov z ET beležimo statistično značilne razlike v znižanju deleža selektina-P na membrani trombocitov v izhodiščnem obdobju, ko bolniki niso prejemali antiagregacijskih zdravil (01), v primerjavi z obdobjem, ko so bolniki prejemali clopidogrel (P1) ali pa kombinacijo zdravil acetilsalicilna kislina in clopidogrel (A1P1). Za primerjani par- ni vzorec 01-P1 je t-vrednost 2,01 (p < 0,05) in za parni vzorec 01-A1P1 t-vrednost 1,98 (p < 0,05). Če v skupini 17 bolnikov primerjamo parne vzorce deležev selektina-P med pari acetil- salicilna kislina (A1) – clopidogrel (P1) je t-vrednost 1,46 (p > 0,05) in v paru acetilsalicilna kislina (A1) – acetilsalicilna kislina in clopidogrel (A1P1) t-vrednost 1,44 (p > 0,05). Med primer- janima paroma A1-P1 in A1-A1P1 v tej podskupini ni statistično pomembne razlike (Razpr. 4). V podskupini A1 sta dve merit- vi selektina-P 17,5% in 23,5% močno izstopali v primerjavi z ostalimi deleži selektina-P. V podskupini 17 novoodkritih bolnikov nismo odkrili nobene statistično značilne razlike v deležih izraženega aktiviranega fibrinogena na membranah trombocitov med obdobjema, ko so bili bolniki brez antiagregacijskih zdravil ali pa so prejemali acetilsalicilno kislino, clopidogrel oziroma hkrati acetilsalicilno kislino in clopidogrel (Razpr. 3 in 4). V vseh mogočih parnih kombinacijah je bila t-vrednost največ 0,03 in zato p > 0,05.  Stranskih učinkov zdravljenja, kot so ulkusna bolezen želodca in dvanajsternika, alergične reakcije, slabosti, diareje, spremem- be razpoloženja in kožnih izpuščajev nismo beležili. Bolniki niso navajali nobenih dodatnih težav v obdobju zadnjih štiri- najst dni, ko so prejemali hkrati acetilsalicilno kislino in clopi- dogrel. V celotnem obdobju klinične raziskave nismo zabele- žili nobene spontane krvavitve v kožo ali sluznice notranjih organov. Nihče od bolnikov ni utrpel trombemboličnega za- pleta med zdravljenjem. Razpravljanje ET je klonska kronična mieloproliferativna bolezen. Incidenca bolezni v Sloveniji je 1,4 na 100.000 prebivalcev in narašča, odkar so v uporabi avtomatizirani analizatorji krvne slike (31, 8). Bolezen označuje razraščanje megakariocitov v kostnem mozgu in zvečano število trombocitov v periferni krvi (32). Ker zaenkrat ni ugotovljen noben za ET značilen klinični ali laboratorijski parameter, je diagnostika še vedno zasnovana na podlagi izključitve preostalih mieloproliferativ- nih in/ali mielodisplastičnih sindromov in predvsem reaktivne trombocitoze. Razpr. 3. Statistična obdelava podskupine 18 bolnikov z ET, ki so že predhodno jemali acetilsalicilno kislino. Table 3. Statistical data from 18 ET patients, allready treated with acetylsalicylic acid. A1 P1 A1P1 A2 P2 A2P2 Število bolnikov No. of patient 18 18 18 18 18 18 Aritmetična sredina Arithmetical mean 3,7617 2,6611 2,5283 39,5333 34,7667 38,3000 value Mediana Median 2,8200 2,4900 2,4250 36,4000 31,5500 38,4000 Modus Modus 1,47 0,49 1,20 26,50 20,60 38,40 Stand. deviacija SD 2,7247 1,7425 0,9742 10,6334 12,0282 8,6556 Minimum Min. 1,47 0,49 1,00 26,50 20,60 24,00 Maksimum Max. 13,40 7,09 4,61 66,60 73,20 54,70 Vsota Total 67,71 47,90 45,51 711,60 625,80 689,40 Prvi kvartil 1st quartile 25 2,4600 1,3150 1,9000 33,3000 27,9250 29,8750 Drugi kvartil 2nd quartile 50 2,8200 2,4900 2,4250 36,4000 31,5500 38,4000 Tretji kvartil 3rd quartile 75 4,0325 3,5000 3,1925 45,8000 36,7000 45,5000 A – acetilsalicilna kislina, P – clopidogrel, 1 – selektin-P, 2 – aktiviran fibrinogen A – acetylsalicylic acid, P – clopidogrel, 1 – P-selectin, 2 – activated fibrinogen Razpr. 4. Analiza parnih vzorcev s t-testom. Table 4. T-test matched-pair analysis. F t p A1-P1 11,36 1,99 p < 0,05 A1-A1P1 22,21 2,11 p < 0,05 P1-A1P1 1,96 0,19 p > 0,05 A2-P2 1,35 0,002 p > 0,05 A2-A2P2 1,12 0,018 p > 0,05 P2-A2P2 1,51 0,056 p > 0,05 01-A1 2,73 0,05 p > 0,05 01-P1 20,54 2,01 p < 0,05 01-A1P1 13,35 1,98 p < 0,05 A1-P1 56,11 1,46 p > 0,05 A1-A1P1 36,47 1,44 p > 0,05 P1-A1P1 1,54 0,04 p > 0,05 02-A2 1,51 0,03 p > 0,05 02-P2 1,15 0,03 p > 0,05 02-A2P2 1,41 0,03 p > 0,05 A2-P2 1,31 0,001 p > 0,05 A2-A2P2 1,07 0,005 p > 0,05 P2-A2P2 1,22 0,003 p > 0,05 0 – brez zdravila, A – acetilsalicilna kislina, P – clopidogrel, 1 – selektin-P, 2 – akt. fibrinogen, pokončen tekst v tabeli: skupina vseh 35 v klinično raziskavo vklju- čenih bolnikov, poševen tekst v tabeli: podskupina 17 novoodkritih bolnikov z ET 0 – without therapy, A – acetylsalicylic acid, P – clopidogrel, 1 – P-selectin, 2 – act. fibrinogen, straight text: all 35 patients who entered clinical study, italic text: subgroup of 17 newly diagnosed patients ZVER S, ŽONTAR D. DOLOČITEV ŠTEVILA AKTIVIRANIH TROMBOCITOV S PROTITELESI ZA AKTIVIRANI FIBRINOGEN IN SELEKTIN-P I-132 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I Pred tridesetimi leti je kot eno od diagnostičnih meril za bole- zen veljalo število trombocitov, ki je moralo biti večje od 1000 × 109/L (33, 34). Z leti se je zahtevana vrednost števila trombo- citov zmanjševala in danes za diagnozo ET zadošča, da je ob izključitvi reaktivne trombocitoze število trombocitov večje od 400 × 109/L (35). Vse to ima svoj pomen pri pristopu k zdravljenju bolezni. Za bolezen je značilna nagnjenost h krva- vitvam, še pogosteje pa k trombemboličnim zapletom, ki so glavni vzrok obolevnosti in umrljivosti (36, 37). Zdravljenje ET ni povsem enotno. Jasno pa je, da je potrebno zmanjšati število trombocitov v področje normalnih vrednosti pri tistih bolnikih, ki so utrpeli kakršen koli trombembolični zaplet (38). Število trombocitov lahko učinkovito zmanjšamo z interferonom alfa, anagrelidom, hidroksiureo in busulfanom (39–41). Stroka je enotna tudi v priporočilu glede zdravljenja bolnikov z ET, ki imajo klinične težave v smislu eritromelalgije. To so boleči in pekoči občutki akralnih delov telesa, navadno v konicah prstov rok in nog. Tem bolnikom pomaga zdravljenje z acetilsalicilno kislino 100 mg/dan (42). O tem, kako zdraviti bolnike z ET, ki v poteku bolezni niso utrpeli trombemboličnega zapleta, še ni enotnosti. Zaenkrat je tudi nerazrešeno vprašanje, kako veliko mora biti število trombocitov, da se odločimo za začetek zdravljenja z zdravili, ki zmanjšujejo število trombocitov. Po veljavni strokovni dok- tirni v Sloveniji bolnike z ET, ki v poteku bolezni niso utrpeli trombemboličnega zapleta in ki imajo število trombocitov, manj- še od 1000 × 109/L, zdravimo z acetilsalicilno kislino 100 mg/ dan (8). Če je število trombocitov večje od 1000 × 109/L ali pa je bolnik utrpel trombembolični zaplet, se odločimo zmanjšati število trombocitov z interferonom alfa, anagrelidom, hidro- ksiureo ali busulfanom, po upoštevanju bolnikove starosti in stranskih učinkov zdravljenja (43). Namen antiagregacijskega zdravljenja pri bolnikih z ET je zmanjšati funkcijsko sposobnost trombocitov. Predvsem želi- mo zmanjšati delež aktiviranih trombocitov, ki je pri bolnikih z ET zvečan (44, 2, 3). Pri tem moramo vedeti, da je tako zdrav- ljeni bolnik izpostavljen spontanim krvavitvam. Antiagregacij- sko zdravilo izbire pri bolnikih z ET je acetilsalicilna kislina (45, 46). Ker kot antiagregacijsko zdravilo po trenutnih strokovnih priporočilih nima ustrezne zamenjave, je antiagregacijsko zdravljenje ET neizvedljivo pri bolnikih s sočasno ulkusno bo- leznijo prebavil, alergičnimi reakcijami in bolnikih z astmo, pri katerih nesteroidni antirevmatiki lahko sprožijo astmatični na- pad. Poročila o zdravljenju bolnikov z ET z novejšimi antiagregacij- skimi zdravili so zelo redka (47). Clopidogrel je antagonist receptorjev za ADP na membrani trombocitov. V zadnjih letih je clopidogrel postal pomembno zdravilo v kardiologiji, kjer se rutinsko uporablja pri bolnikih z vstavljeno koronarno opor- nico in pri bolnikih s koronarno boleznijo, ki acetilsalicilne ki- sline ne prenašajo (48, 49). Klinična učinkovitost je verjetno v veliki meri posledica njegovega delovanja na selektin-P. Z izra- ženim selektinom-P se v tromb vključujejo levkociti, kar po- vzroči vnetni odziv v trombu (50). V zadnjih letih raziskujejo tudi pomen selektina-P pri vnetnem odgovoru v aterosklero- tični lehi pri generalizirani aterosklerozi (51). V klinično raziskavo smo vključili 35 bolnikov z ET. Ker so bolniki prejemali antiagregacijsko zdravilo clopidogrel s še ne- znanim kliničnim učinkom pri ET, smo vključili samo bolnike, ki niso doživeli trombemboličnega zapleta in ki so imeli število trombocitov manjše od 1000 × 109/L. Ti med bolniki z ET pred- stavljajo najmanj ogroženo podskupino bolnikov. Skupina bol- nikov je tudi homogena, saj morda različna zdravila, ki zmanj- šujejo število trombocitov, vplivajo na rezultate. V zaporednih štirinajstdnevnih intervalih so bolniki brez vmesne prekinitve (izpiralnega časa za zdravilo) prejemali acetilsalicilno kislino, zatem clopidogrel in nato še hkrati acetilsalicilno kislino in clo- pidogrel. Za samo štirinajstdnevne intervale smo se odločili zaradi neznanega antiagregacijskega učinka clopidogrela pri bolnikih z ET. Izpiralni čas za zdravilo ni bil potreben, ker se celotna trombocitna populacija, na katero zdravili učinkujeta, obnovi v največ desetih dnevih. Tudi z etičnega stališča je izpi- ralni čas za zdravilo neprimeren, ker veljavna strokovna pri- poročila v Sloveniji priporočajo antiagregacijsko zdravljenje (8, 32). Ko so bili v raziskavo vključeni bolniki, ki so se že vodili v hema- tološki ambulanti in prejemali acetilsalicilno kislino 100 mg/ dan, jim zdravila z namenom, da bi lahko odvzeli izhodne vre- dnosti deležev selektina-P in aktiviranega fibrinogena nismo ukinili. Znotraj skupine 35 bolnikov smo izoblikovali podsku- pino 17 novoodkritih bolnikov z ET, ki ob prihodu v našo am- bulanto niso prejemali antiagregacijskega zdravila. Tem bolni- kom smo določili izhodne vrednosti deležev selektina-P in ak- tiviranega fibrinogena v obdobju brez antiagregacijskega zdrav- ljenja. V celotni skupini 35 bolnikov smo ugotovili statistično značilno zmanjšanje deleža selektina-P na membrani trombocitov v obdobju, ko so bolniki jemali clopidogrel (P1; A1P1) v prime- rjavi z začetnim obdobjem, ko so jemali samo acetilsalicilno kislino (A1) (Razpr. 1, 4). V obeh parnih primerjavah acetilsa- licilna kislina – clopidogrel (A1-P1) in acetilsalicilna kislina – acetilsalicilna kislina in clopidogrel hkrati (A1-A1P1) je bil p < 0,05. Zaključimo lahko, da clopidogrel pomembno in značilno zmanjša delež selektina-P na trombocitni membrani pri bolni- kih z ET. Acetilsalicilna kislina sama ali v kombinaciji s clopido- grelom na izraženost selektina-P nima vpliva. Podobne rezul- tate dobimo, če analiziramo samo podskupino 17 novo- odkritih bolnikov z ET. Statistično značilno zmanjšanje deleža selektina-P na trombocitni membrani (p < 0,05) dobimo s parno primerjavo obdobja, ko bolniki niso prejemali antiagre- gacijskega zdravila (01) z obdobjema, ko so prejemali clopidogrel (P1), ali pa hkrati acetilsalicilno kislino in clopido- grel (A1P1) (Razpr. 2, 4). Nekoliko presenetljivo pa v skupini 17 novoodkritih bolnikov z ET ne dobimo statistično značilne razlike s primerjavo parnih vzorcev med obdobjem, ko so bolniki prejemali acetilsalicilno kislino (A1), in obdobjem, ko so prejemali clopidogrel (P1) oziroma hkrati acetilsalicilno kislino in clopidogrel (A1P1) (Razpr. 2, 4). t-vrednost za ob- dobje A1-P1 je bila 1,46 (p > 0,05) in za obdobje A1-A1P1 1,44 (p > 0,05). To lahko razložimo z dvema izstopajočima, zelo visokima vrednostima deležev selektina-P na trombocitni membrani pri tej podskupini bolnikov v obdobju, ko so pre- jemali samo acetilsalicilno kislino (A1). Pri enem od bolnikov je bil delež selektina-P 17,5% in pri drugem celo 23,5%. Upoštevajoč nizke vrednosti izračunanih aritmetične sredine, mediane in modusa v tem obdobju ter predvsem majhnost vzorca (samo 17 enot), sta ta dva visoka deleža selektina-P verjetno preveč vplivala na celoten vzorec. V skupini 35 bolnikov z ET nismo v deležih aktiviranega fibri- nogena na membranah trombocitov v nobenem obdobju je- manja antiagregacijskih zdravil s primerjavami parnih vzorcev ugotavljali statistično značilnih razlik med njimi (Razpr. 4). De- leži aktiviranega fibrinogena so bili vseskozi medsebojno pri- merljivi. Enake rezultate smo dobili tudi, če smo analizirali sa- mo podskupino 17 novoodkritih bolnikov z ET. Zaključimo lahko, da acetilsalicilna kislina, clopidogrel in tudi kombinacija obeh zdravil nimajo nobenega vpliva na delež izraženega akti- viranega fibrinogena. Slednje je skladno tudi s podatki iz litera- ture (52). Pri nobenem od bolnikov nismo beležili resnejših neželenih učinkov zdravljenja. Pravzaprav smo jih pričakovali predvsem takrat, ko so bolniki hkrati prejemali acetilsalicilno kislino in clopidogrel. Pričakovali bi lahko spontane krvavitve, predvsem krvavitve v želodec in dvanajstnik. Kombinacija obeh zdravil se je izkazala za varno. Opozoriti je potrebno, da so bili v raz- iskavo vključeni izbrani bolniki brez ulkusne bolezni prebavil v anamnezi. Pri nobenem od bolnikov ni prišlo v nobenem ob- dobju jemanja zdravil do trombemboličnega zapleta. Slednje I-133 smo zaradi nepoznavanja kliničnega učinka clopidogrela pri ET pričakovali kvečjemu v obdobju, ko so bolniki prejemali clopidogrel. Kakšno je klinično uporabno sporočilo opravljene klinične raz- iskave? Mnenja smo, da je morda clopidogrel z zmanjšanjem deleža selektina-P na membranah trombocitov možna zame- njava za acetilsalicilno kislino pri bolnikih, ki acetilsalicilne kisli- ne ne prenašajo oziroma jo ne morejo jemati. To so bolniki z anamnezo in klinično sliko ulkusne bolezni želodca ali dva- najstnika, bolniki, ki navajajo alergične reakcije na acetilsalicil- no kislino, in bolniki z ET in astmo hkrati, pri katerih jemanje acetilsalicilne kisline lahko sproži astmatični napad. Zavedati pa se moramo, da clopidogrel kot antiagregacijsko zdravilo prve izbire pri bolnikih z ET še vedno ne predstavlja enakovre- dnega nadomestila za acetilsalicilno kislino. Klinična raziskava, ki bi pri bolnikih z ET primerjala klinično učinkovitost acetilsa- licilne kisline in clopidogrela, namreč še ni bila narejena. Tudi s stališča farmakoekonomike je acetilsalicilna kislina nekajkrat cenejše antiagregacijsko zdravilo kot clopidogrel. Za klinične raziskave v prihodnje pa je zanimivo še eno vpra- šanje. Ali je mogoče znotraj skupine bolnikov z ET podskupi- na, ki bi lahko imela dodatno korist od hkratnega jemanja ace- tilsalicilne kisline in clopidogrela? Trije bolniki so imeli delež selektina-P visoko nad 10% in sicer 14%, 18% in celo 24%. Morda bi hkratno jemanje acetilsalicilne kisline in clopidogre- la lahko koristilo podskupini bolnikov z ET, ki bi imeli na pri- mer v treh časovno ločenih zaporednih določitvah selektina-P, njegov delež večji od 10%. Morda bi bilo smiselneje dodati clopidogrel, ne upoštevajoč izhodni delež selektina-P, tistim bolnikom z ET, ki imajo sočasno prisotnih tudi več dejavnikov tveganja za nastanek bolezni srca in ožilja, kot so povečana serumska vrednost lipidov, povišan krvni sladkor, debelost, kajenje, pozitivna družinska anamneza in povišan krvni tlak. Literatura 1. Kutti J, Wadenvik H. Diagnostic and differential criteria of essential throm- bocythemia and reactive thrombocytosis. Leuk Lymph 1996; 22: Suppl. 1: 41–6. 2. Frojmovic MM. Flow cytometric analysis of plateled activation and fibrino- gen binding. Platelets 1996; 7: 9–21. 3. Griesshammer M, Beneke H, Nussbaumer B. Increased plateled surface ex- pression of P-selectin and thrombospodin as markers of plateled activation in essential thrombocythaemia. Thromb Res 1999; 96: 191–6. 4. Cortelazzo S, Viero P, Finazzi G et al. Incidence and risk factors for thrombo- tic complications in a historical cohort of 100 patients with essential throm- bocythemia. J Clin Oncol 1990; 8: 555–62. 5. Colombi M, Radaelli F, Zocchi L et al. Thrombotic and hemorrhagic compli- cations in essential thrombocythemia. Cancer 1991; 67: 2926–30. 6. Van Genderen PJJ, Michielis JJ. Erythromelalgia: a patognomonic micro- vascular thrombotic complication in essential thrombocythemia and poly- cythemia vera. Semin Thromb Haemost 1997; 23: 357–64. 7. Tefferi A. Risk based management in essential thrombocythemia. Hemato- logy; ASH education program book 1999: 172–7. 8. Podbregar M, Černelč P. Zapleti in zdravljenje bolnikov z ET. Zdrav Vestn 1999; 68: 353–6. 9. Savi P, Herbert JM, Pharmacology of ticlopidin and clopidogrel. Haematolo- gica 2000; 85: 66–72. 10. Defreyn G, Gachet C, Savi P et al. Ticlopidin and clopidogrel selectively neutralize ADP inhibition of PGE1-activated plateled adenylate cyclase in rats and rabbits. Thromb Haemost 1991; 65: 186–90. 11. Storey RF, Judge HM, Wilcox RG. Inhibition of ADP-induced P-selectin ex- pression and plateled leukocyte conjugate formation by clopidogrel and the P2Y 12 receptor antagonist AR-C69931MX but not aspirin. Thromb Ha- emost 2002; 88: 488–94. 12. Kanapuli SP. Functional characterization of plateled ADP receptors. Platelets 1998; 9: 343–51. 13. Reimers H. Adenine nucleotides in blood platelets. In: Longenecker G ed. The platelets: physiology and pharmacology. Orlando: Academic Press, 1985: 85–98. 14. Weiss HJ. Inherited abnormalities of plateled granules and signal transduc- tion. In: Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, Salzman EW eds. Hemostasis and thrombosis. Basic principles and clinical practice. 3rd ed. Philadelphia: Lip- pincott, 1994: 673–84. 15. Macffarlane DE. Agonists and receptors: adenosine diphosphate. In: Holm- sen H ed. Plateled responses and metabolism. Boca Raton CRC Press, 1987: 19–36. 16. Lanza F, Beretz A, Stierle A et al. Epinephrine potentiates human plateled activation but is not an aggregating agent. Am J Physiol 1988; 255: H1276– H1288. 17. Clementson KJ, Clementson JM, Proudfoot AE et al. Functional expression of CCR1, CCR3, CCR4 and CXCR4 chemokine receptors on human platelets. Blood 2000; 96: 4046–54. 18. Savi P, Artcanuthurry V, Bornia J et al. Effect of clopidogrel treatment on ADP- induced phosphorylation in rats platelets. Br J Haematol 1997; 97: 185–91. 19. Geiger J, Brich J, Honig-Liedl P et al. Specific impairment of human plateled P2Y(AC) ADP receptor mediated signalling by the antiplateled drug clopido- grel. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999; 19: 2007–11. 20. Mills DC, Puri R, Hu CJ et al. Clopidogrel inhibits the binding of ADP analogues to the receptor mediating inhibition of plateled adenylate cyclase. Arterios- cler Thromb 1992; 12: 430–6. 21. Furie B, Furie BC, Flaumenhaft R. A journey with plateled P-selectin: the molecular basis of granule secretion, signalling and cell adhesion. Thromb Haemost 2001; 86: 214–21. 22. Ruf A, Patscheke H. Flow cytometric detection of activated platelets: compa- rison of determining shape change, fibrinogen binding and P-selectin ex- pression. Semin Thromb Haemost 1995; 21: 146–51. 23. The clopidogrel in unstable angina to prevent recurrent events trial investi- gators. Effects of clopidogrel in addition to aspirin in patients with acute coronary syndromes without ST-segment elevation. N Engl J Med 2001; 345: 494–502. 24. Harding SA, Boon NA, Flapan AD. Antiplateled treatment in unstable angina: aspirin, clopidogrel, glycoprotein IIb/IIIa antagonist or all three? Heart 2002; 88: 11–4. 25. Bertrand ME, Rupprecht HJ, Urban P et al. Double blind study of the safety of clopidogrel with and without a loading dose in combination with aspirin compared with ticlopidine in combination with aspirin after coronary stenting (CLASSICS). Circulation 2000; 102: 624–9. 26. McGregor JL. Adhesion molecules and platelets. Educational sessions of the second EHA 1996; 134–8. 27. Azar RR, Waters DD. The inflamatory etiology of unstable angina pectoris. Am Heart J 1996; 132: 1106–16. 28. Klinkhardt U, Bauersachs R, Adams J et al. Clopidogrel but not aspirin redu- ces P-selectin expression a formation of plateled-leukocyte aggregates in patients with atherosclerotic vascular disease. Clin Pharm Ther 2003; 73: 232–41. 29. Jaremo P, Lindahl TL, Fransson SG et al. Individual variations of plateled inhibition after loading doses of clopidogrel. J Intern Med 2002; 252: 233–8. 30. Žontar D, Černelč P. Uporaba pretočne citometrije v klinični hematologiji. Zdrav Vestn 1993; 62: 393–5. 31. Mesa RA, Silverstein MN, Jacobsen SJ et al. Population based incidence and survival figures in essential thrombocythemia and agnogenic myeloid meta- plasia: an Olmsted County study; 1976–1995. Am J Hematol 1996; 61: 10–5. 32. Modic M. Kronične mieloproliferativne bolezni. In: Kocijančič A, Mrevlje F eds. Interna medicina. Ljubljana: EWO, 1998: 1088–94. 33. Laszlo J. Myeloproliferative disorders (MPD): myelofibrosis, myelosclerosis, extramedullary hematopoesis, undifferentiated MPD and hemorrhagic throm- bocythemia. Semin Hematol 1975; 12: 409–32. 34. Berlin NI. Diagnosis and classification of the polycythemias. Semin Hematol 1975; 12: 339–51. 35. Michelis JJ, Juvonen E. Proposal for revised diagnostic criteria of essential thrombocythemia and polycythemia vera by the Thrombocythemia Vera Study Group. Semin Thromb Hemost 1997; 23: 339–47. 36. Schafer AI. Bleeding and thrombosis in myeloproliferative disorders. Blood 1984; 64: 1–10. 37. Schafer AI. Essential thrombocythemia. In: Beutler E, Lichtman MA Coller BS, Kipps TJ eds. Williams Hematology. New York: McGraw Hill 2001: 1541–49. 38. Cortelazzo S, Finazzi G, Ruggeri M et al. Hydroxyurea in the treatment of patients with essential thrombocythemia at high risk thrombosis: a prospec- tive randomised trial. N Eng J Med 1995; 332: 1132–6. 39. Lofvenberg E, Wahlin A. Management of polycythemia vera, essential throm- bocythemia and myelofibrosis with hydroxyurea. Eur J Haematol 1988; 41: 375–81. 40. Solberg LA, Tefferi A, Oles A et al. The effects of anagrelide on human megakaryopoesis. Br J Haematol 1997; 99: 174–9. 41. Elliot MA, Tefferi A. Interpheron alpha therapy in polycythemia vera and essential thrombocythemia. Semin Thromb Hemost 1997; 23: 463–71. 42. Van Genderen PJJ, Michelis JJ Van Stirk R et al. Plateled consumption in thrombocythemia complicated by erythromelalgia: reversal by aspirin. Thromb Hemost 1995; 73: 210–5. 43. Michelis JJ. Normal life expectancy and thrombosis free survival in aspirin treated essential thrombocythemia. Clin Appl Thromb/Hemost 1999; 23: 335–8. 44. Villmow T, Kemkes-Matthes B, Matzdorff AC. Markers of plateled activation and plateled-leukocyte interaction in patients with myeloproliferative syndromes. Thromb Res 2002; 108: 139–45. 45. Gruppo Italiano Studio Polycythemia Vera: Low dose aspirin in polycythe- mia vera: a pilot study. Br J Haematol 1997; 97: 453–7. 46. Willoughby S, Pearson TC. The use of aspirin in polycythaemia vera and primary thrombocythaemia. Blood Rev 1998; 12: 12–22. 47. Klinzing P, Markert UR, Liesaus K et al. Case report: successful pregnancy and delivery after myocardial infarction and essential thrombocythemia treated with clopidogrel. Clin Exp Obstet Gynecol 2001; 28: 215–6. ZVER S, ŽONTAR D. DOLOČITEV ŠTEVILA AKTIVIRANIH TROMBOCITOV S PROTITELESI ZA AKTIVIRANI FIBRINOGEN IN SELEKTIN-P I-134 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I 48. Caprie Steering Committee. A randomiced, blinded trial of clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events (CAPRIE). Lancet 1996; 348: 1329–39. 49. Gurbel PA, Cummings CC, Bell CR et al. Onset and extent of plateled inhibition by clopidogrel loading in patients undergoing elective coronary stenting: The Plavix Ň reduction of new thrombus occurrence (PRONTO) trial. Am Heart J 2003; 145: 239–47. 50. McEver RP. Adhesive interactions of leukocytes, platelets and the vessel wall during hemostasis and inflammation. Thromb Haemost 2001; 86: 746–56. 51. Burger PC, Wagner DD. Plateled P-selectin facilitates atherosclerotic lesion developement. Blood 2003; 101: 2661–7. 52. Vestweber D, Blanks JE. Mechanisms that regulate the functions of the selec- tins and their ligands. Physiol Rev 1999; 79: 181–213.