Oznaka poročila: ARRS-RPROJ-ZP-2011-1/82 zaključno poročilo o rezultatih raziskovalnega projekta A. PODATKI O RAZISKOVALNEM PROJEKTU 1. Osnovni podatki o raziskovalnem projektu Šifra projekta J3-0389 Naslov projekta BELJAKOVINE MODRASOVEGA STRUPA Z VPLIVOM NA HEMOSTAZO-RAZVOJ INOVATIVNIH BIOMEDICINSKIH ANTITROMBOTIKOV Vodja projekta 412 Igor Križaj Tip projekta J Temeljni projekt Obseg raziskovalnih ur 2.085 Cenovni razred D Trajanje projekta 02.2008 - 01.2011 Nosilna raziskovalna organizacija 106 Institut "Jožef Stefan" Raziskovalne organizacije -soizvajalke Družbenoekonomski cilj 13. Splošni napredek znanja - RiR financiran iz drugih virov (ne iz splošnih univerzitetnih fondov - SUF) . Družbeno-ekonomski cilj1 Šifra 07. Naziv Zdravje 2. Sofinancerji2 1. Naziv Naslov 2. Naziv Naslov 3. Naziv Naslov B. REZULTATI IN DOSEŽKI RAZISKOVALNEGA PROJEKTA Zaključno poročilo o rezultatih raziskovalnega projekta - 2011 / 1. rok 3. Poročilo o realizaciji programa raziskovalnega projekta3 Za preprečevanje in zdravljenje tromboembolijskih bolezni, kot so venska tromboza, akutni srčni infarkt, pljučna embolija, kap in periferna arterijska okluzija, se uporablja terapija s trombolitiki in antikoagulanti, katerih cilj je raztopiti krvni strdek in preprečiti njegovo ponovno nastajanje. Trenutno kar okrog 1% celotne zahodne populacije prejema določeno obliko antitrombotske terapije, v Sloveniji pa za vensko trombozo zboli okoli 3000 bolnikov letno. Pri trombolitskih terapijah se trenutno uporabljajo aktivatorji plazminogena (streptokinaza, tkivni aktivator plazminogena in urokinaza), ki katalizirajo pretvorbo plazminogena v plazmin, ki potem cepi fibrin in tako razgraja krvne strdke. Kljub njihovi nedvoumni koristi in uspešnosti pri reševanju življenj, pa ima njihova uporaba tudi številne slabe strani: 1) njihovo delovanje je posredno in zato počasno, 2) serpini v krvi učinkovito inhibirajo njihovo delovanje in s tem terapevtsko učinkovitost, 3) višje doze plazminogenskih aktivatorjev, ki so potrebne za izničenje učinka serpinov, ponavadi izzovejo sistemsko krvavitev in 4) aktivacija trombocitov, ki je posledica visoke koncentracije sproščenega plazmina, povzroča re-okluzijo. Strupene živali predstavljajo enega glavnih virov visoko selektivnih in učinkovitih bioaktivnih spojin, ki so že privedle do razvoja nekaterih inovativnih zdravil. Kačji strupi so posebej bogati z učinkovinami, ki vplivajo na proces strjevanja krvi. Lahko delujejo pro- ali antikoagulantno na trombocite in faktorje strjevanja krvi ter razgrajujejo fibrinske strdke. Celosten pregled komponent kačjih strupov, ki vplivajo na hemostazo smo predstavili v vabljenem preglednem članku v reviji Toxicon (Sajevic in sod., 2011). Ti proteini lahko ponudijo spojine vodnice za pripravo novih terapevtskih učinkovin za zdravljenje tromboembolijskih težav, nove pristope k zdravljenju bolezni in nova molekulska orodja za rutinsko laboratorijsko testiranje motenj hemostatskega sistema. Najnovejše smernice v antikoagulantni terapiji vključujejo uporabo neposrednih sintetskih inhibitorjev aktiviranega faktorja Xa (FXa). Antikoagulantne sekretorne fosfolipaze A2 (sPLA2) iz kačjih strupov lahko preprečijo koagulacijo krvi na več različnih načinov, med drugimi tudi z vezavo na FXa, kar posledično prepreči tvorbo protrombinaznega kompleksa in blokira kaskado koagulacije krvi. Kratki peptidi, ki bi posnemali strukturo " antikoagulantnega mesta" na površini teh molekul, bi bili dobra osnova za razvoj visoko specifičnih antikoagulantnih učinkovin. Med novimi substancami, ki veliko obetajo kot trombolitiki, so zlasti nekatere metaloproteinaze (MP) iz kačjih strupov. Pozitivne lastnosti teh encimov so, da za razliko od aktivatorjev plazminogena, neposredno delujejo na fibrinske strdke in jih zato hitro razgrajujejo, da ne aktivirajo endogenega fibrinolitskega sistema in da jih ne inhibirajo serpini. Poglavitna ovira za njihovo uporabo v terapevtske namene je njihova toksičnost. Praktično vse so namreč hemoragične. Kljub intenzivnemu iskanju primernih kandidatk med kačjimi MP za spojine vodnice pri razvoju novih trombolitikov, je do danes uspelo zadovoljiti vse kriterije kliničnih testiranj II. faze le alfimeprazi, rekombinantnemu derivatu fibrolaze iz strupa kače Agkistrodon c. contortrix. Iz modrasovega strupa smo izolirali fibrin(ogen)olitično MP, amoditazo, z lastnostmi, ki obetajo, da utegne postati naslednja spojina vodnica v razvoju nove vrste antitrombotikov. Ključnega pomena pri tem je, da amoditaza ne kaže toksičnih učinkov, hitro in učinkovito razgraja fibrinske strdke in vitro, ne aktivira ali razgrajuje plazminogena in protrombina, in nima učinka na kolagen- ali ADP-stimulirano agregacijo trombocitov in vitro. Strukturna analiza je poleg tega pokazala, da proteinaza sodi v drugo strukturno skupino MP kot fibrolaza. Njena molekula sestoji iz MP, dizintegrinske in s cisteinom-bogate domene, medtem ko fibrolazo tvori le MP domena. V primeru alfimepraze so raziskovalci težave z re-okluzijo, ki so se pokazale v kliničnih testih, poskušali omiliti s konjugacijo peptida z dizintegrinskim motivom in MP na kemijski način. V primeru amoditaze bi ta problem rešili tako, da bi pripravili fuzijski protein sestavljen iz njene MP in dizintegrinske domene. Poleg tega, da bi na ta način preprečili re-trombozo, predvidevamo, da bi se konstrukt tudi specifično lokaliziral na mestih okluzij, kar bo povečalo učinkovitost njegovega delovanja. Amoditaza tako predstavlja odlično alternativo alfimeprazi/fibrolazi pri razvoju novih vrst antitrombotikov. Cilj tega projekta je bil razvoj novih učinkovin z antikoagulantnim ali trombolitskim delovanjem na osnovi antikoagulantne sPLA2, amoditoksina (Atx), in fibrinolitične MP, amoditaze, obeh proteinov iz strupa najbolj strupene evropske kače modrasa (Vipera ammodytes ammodytes). Poleg tega je bil naš namen tudi sistematična analiza nabora proteinov iz tega strupa, ki interferirajo s procesom strjevanja krvi in predstavljajo potencialna nova zdravila ter molekulska orodja za karakterizacijo krvi in njeno testiranje. Izoobliki Atx, AtxA in AtxC, sta nevrotoksična proteina, preprečujeta pa tudi strjevanje krvi (antikoagulantni učinek) tako, da se vežeta na FXa. V prvotnem načrtu je bila kristalizacija kompleksa med Atx in FXa in določitev tridimenzionalne (3D) strukture kompleksa. V sodelovanju s francoskimi partnerji z Instituta Pasteur v Parizu smo s pomočjo kristalizacijskega robota preizkusili številne pogoje za pridobitev kristalov kompleksa vendar nismo bili uspešni. Zato smo se odločili, da poskusimo s kristalizacijo samega Atx, kar je pa tudi bil velik izziv, glede na to, da se je to poskušalo narediti že skoraj dvajset let. Nam je tokrat uspelo, kar je potem omogočilo določitev struktur obeh antikoagulantnih sPLA2 (Saul in sod., 2010). Poznavanje 3D strukture AtxA nam je bilo v veliko pomoč pri izdelovanju računalniškega modela 3D strukture kompleksa med AtxA in FXa, ki pa ob zaključku projekta še ni bil popolnoma dokončan. Pri računanju modela kompleksa Atx-FXa smo si pomagali tudi s kemijskim označevanjem roba stične površine med Atx in FXa z uporabo fotoreaktivnega derivata AtxC, sulfo-SBED-AtxC. 3D Model nam bo zelo olajšal načrtovanje krajših peptidov z antikoagulantnim delovanjem v prihodnosti. Da bi s pomočjo proteinskega inženirstva pripravili rekombinantno amoditazo in skrajšane oblike te molekule ter jih temeljito karakterizirali, tako biokemijsko kot tudi fiziološko, potrebujemo njen cDNA zapis. Iz knjižnice cDNA, pripravljene na osnovi mRNA-prepisov, izoliranih iz strupne žleze modrasa, smo uspeli pomnožiti nukleotidne zapise za modrasove MP. Oligonukleotidne sonde smo pripravili na osnovi visoko ohranjenih delov nukleotidnih zapisov za kačje MP iz sorodnih vrst viperidnih kač, katerih izpeljana aminokislinska zaporedja so podobna tistim, ki so bila do sedaj izolirana iz modrasovega strupa. Pomnožene zapise smo vstavili v klonirni plazmidni vektor, ki smo ga namnožili v E. coli in nato določili njihova nukleotidna zaporedja. Dobili smo več različnih zaporedij, ki ustrezajo kačjim MP iz razredov P-I, P-II in P-III, med njimi tudi zaporedje za hemoragično MP VaH2. Zaporedja za amoditazo na žalost ni bilo med njimi. Za sintezo oligonukleotidnih sond, ki bi specifično prepoznale le amoditazo v knjižnici cDNA, smo potrebovali več podatkov o njeni primarni strukturi. V ta namen smo najprej izolirali večje količine čiste MP iz surovega strupa in jo encimsko (z endoproteinazami Lys-C, Arg-C in V8) ali kemijsko (s CNBr) razgradili. Fragmente smo nato ločevali s pomočjo RP-HPLC, jim določili N-terminalno aminokislinsko zaporedje z Edmanovo degradacijo in dobljena zaporedja primerjali z znanimi zaporedji MP iz kačjih strupov v bazi NCBI. Amoditazo smo vzporedno razgradili tudi s tripsinom, dobljene peptide pa analizirali s pomočjo masne spektrometrije. Do zaključka izvajanja projekta smo uspeli določiti približno 75% aminokislinskega zaporedja amoditaze. Pripravili smo nove oligonukleotidne sonde na osnovi zaporedja specifičnega za amoditazo, toda tudi tokrat v knjižnici nismo uspeli dobiti iskanega cDNA zapisa. Glede na to, da je amoditaza v strupu prisotna v relativno velikih količinah sklepamo, da se je njen zapis v knjižnici skozi leta poškodoval ali razgradil. Sklenili smo pripraviti svežo cDNA knjižnico strupne žleze modrasa za kar se potrebuje strupna žleza kače iz naravnega okolja. Od Ministrstva za okolje in prostor (MOP) smo pridobili dovoljenje za odlov modrasa tik pred iztekom projekta, zato te naloge nismo mogli v celoti izvršiti. Kloniranje in proizvodnja rekombinantne amoditaze in njenih delov je tako naloga, ki je nismo uspeli izvršiti v predvidenem obsegu. Vzporedno smo v strupu modrasa sistematično iskali nove komponente, ki vplivajo na hemostazo z namenom odkrivanja novih učinkovin za regulacijo procesa koagulacije krvi, uporabnih v kliniki, diagnostiki. Posamezne vrhove, ki smo jih dobili po gelski filtraciji celotnega strupa, smo testirali na fibrinogenolitično aktivnost, sposobnost aktivacije FX in proteina C. Prvi vrh vsebuje proteine z molekulsko maso 50 - 120 kDa. Tu prevladujejo hemostatsko aktivne MP. Z uporabo klasičnih in kromatografskih metod pod večjimi pritiski smo izolirali in biokemijsko karakterizirali šest MP. Tri so povzročile krvavitev, torej so hemoragične. Poleg že opisanih modrasovih hemoragičnih MP, VaH1 in VaH2, smo izolirali in označili nov hemoragin, VaH3. VaH3 razgrajuje fibrinogen z enako specifičnostjo kot amoditaza, vendar je za razliko od nje toksičen in zato ni primeren za razvoj antitrombotika. Ker je VaH3-podoben hemoragin, jararhagin iz strupa kače Bothrops jararaca, izražal citotoksičen učinek na celice melanoma v in vitro pogojih, smo preizkusili, če ima tudi VaH3 podobno aktivnost. V poskusih na rakavih celicah ustja materničnega vratu (HeLa) smo pokazali, da tudi VaH3 deluje citotoksično. V sodelovanju s partnersko skupino z Imunološkega zavoda, d.d. (Odjel za istraživanje i razvoj) v Zagrebu smo preučevali tudi imunogenost hemoragičnih MP iz strupa modrasa (Hallasy in sod., 2008]) in vlogo hemoragičnih komponent strupa modrasa za imunogenost strupa (Halassy in sod., 2010 in 2011). Fibrinogenolitično aktivnost so pokazali vrhovi, ki vsebujejo MP in serinske proteinaze (SP), to je prvi in drugi vrh. MP so razgrajevale predvsem Aa-verigo, SP pa Aa- in BG-verigo fibrinogena. SP, tako kot MP, delujejo neposredno na koagulacijske faktorje in jih ne inhibirajo proteinski inhibitorji serinskih proteinaz v plazmi (serpini). Zato so nekatere, kot so ancrod (Viprinex) in batroxobin (Defibrase, Pentapharm, Švica) že našle svoje mesto v kliničnih laboratorijih za določanje fibrinogena ter kot terapevtiki za zdravljenje ishemičnih cerebrovaskularnih bolezni. Iz prvega vrha smo izolirani in karakterizirali dve MP, VAFXA-I in VAFXA-II, ki sta aktivirali FX (Leonardi in sod., 2008). V molekuli FX cepita vez Arg194-Ile195, tako kot fiziološka aktivatorja, FVIIa in FIXa. Obe MP sta pokazali visoko stopnjo homologije z znanimi aktivatorji FX iz kačjih strupov, RVV-X iz Daboia russelli in VLFXA iz Vipera lebetina. Aktivatorja sta bila aktivna v celotni krvni plazmi, kar smo pokazali z vplivom na protrombinski čas. Danes se za zdravljenje hemofilij uporablja rekombinantni FVIIa. VAFXA-I in VAFXA-II, ki specifično aktivirata FX in nista odvisna od kofaktorjev v krvi bi lahko predstavljali odlično alternativo FVIIa. Poleg tega sta molekuli primerni tudi za diagnostična testiranja FX kot alternativa RVV-X. Ugotovili smo, da FX aktivirajo tudi nekatere SP iz strupa, ki pa jih še nismo uspeli izolirati v homogeni obliki. Protein C so aktivirale le proteinaze iz drugega vrha, ki vsebuje predvsem SP. Skladno s tem je to aktivnost zavrl tudi inhibitor serinskih proteinaz Pefabloc. Podobna SP iz strupa kače Agkistrodon contortrix, Protac (Pentapharm Ltd., Basel, Švica), se že uporablja v kliničnih laboratorijih za diagnosticiranje motenj antikoagulantnega sistema PC. Iz drugega vrha smo izolirali 32 kDa protein, katerega je N-končno aminokislinsko zaporedje je homologno botrocetinu iz strupa kače Bothrops neuwiedi, pa tudi drugim lektinom tipa C iz kačjih strupov, ki sprožajo od von Willebrandovega faktorja (VWF) odvisno aglutinacijo trombocitov. Botrocetin (Penthafarm, Švica) se uporablja za določanje von Willebrandovega faktorja v plazmi. V poskusih na agregometru bomo preverili, če tudi modrasov lektin izraža podobno aktivnost. V sodelavi s Kliniko za žilne bolezni Univerzitetnega kliničnega centra v Ljubljani (UKCL) smo testirali vpliv posameznih frakcij po gelski filtraciji na različne koagulacijske teste, t.i. protrombinski čas (PČ), aktivirani parcialni tromboplastinski čas (APTČ) in trombinski čas (TČ). Visokomolekularne frakcije, v katerih se nahajajo pretežno MP, so rahlo skrajšale vse tri koagulacijske čase. Visokomolekularne frakcije, v katerih se nahajajo večinoma SP, pa so rahlo podaljšale vse tri koagulacijske čase. Nizkomolekularne frakcije, v katerih se nahajajo predvsem sPLA2, so močno podaljšale PČ in APTČ, na TČ pa niso imele opaznega vpliva. Ostale nizkomolekularne frakcije so imele podoben, le mnogo manj izrazit vpliv. Vse frakcije strupa smo v sodelavi s Pediatrično kliniko UKCL testirali tudi na vpliv na agregacijo trombocitov, inducirano s tremi agonisti, ki delujejo na različne trombocitne receptorje, kolagenom, ADP in ristocetinom. Visokomolekularne frakcije, v katerih se nahajajo MP in SP močno zmanjšajo agregacijo trombocitov, izzvano z vsemi tremi agonisti. Nizkomolekurane frakcije, vsebujoče pretežno sPLA2, so skoraj v celoti inhibirale agregacijo trombocitov, inducirano s kolagenom in ADP, na agregacijo izzvano z ristocetinom, pa so imele manj izrazit inhibitoren učinek. Ostale nizkomolekularne frakcije so imele enak, le manj izrazit vpliv. Razvili smo postopek za analizo modrasovega strupa z dvodimenzionalno elektroforezo (2DE). Pri optimalnih pogojih analize smo v celotnem strupu detektirali 208 proteinskih lis v območju molekulskih mas 10 - 120 kDa. Lise smo izrezali iz gela in pričeli s sistematičnim postopkom njihove strukturne identifikacije. V prvem koraku smo izbrali 16 lis, različnih po molekulski masi. Proteine smo v gelu razgradili s tripsinom, dobljene peptide ekstrahirali in analizirali z masno spektrometrijo. Strukturna identifikacija je razkrila dve še neznani MP iz razredov P-II in P-III, L- aminokislinsko oksidazo, s cisteini bogate sekretorne proteine (CRISP), netoksično sPLA2 -amoditin 12, lektinom tipa-C podobne proteine in disintegrine. Poleg 2DE celotnega strupa smo naredili tudi 2DE analizo posameznih frakcij, kar nam olajšuje določanje navideznih molekulskih mas in izoelektričnih točk proteinov v posameznih frakcijah. Ti podatki bodo vodilo pri izbiri ustreznih kromatografskih postopkov za nadaljnje ločevanje proteinov. Naredili smo tudi 1D SDS-PAGE celotnega strupa in posameznih frakcij pod redukcijskimi in neredukcijskimi pogoji in s tem ugotovili navidezno molekulsko maso posameznih proteinov v frakcijah in povezanost podenot z disulfidnimi vezmi. Pričeli smo s čiščenjem nizkomolekularnih frakcij z visokotlačno tekočinsko kromatografijo na obrnjenih fazah (RP-HPLC). Posamezne vrhove smo že strukturno analizirali z Edmanovo metodo. Tako smo identificirali dve sPLA2 in dizintegrin. Čeprav je bil financiran le z 0.4 FTE, so rezultati projekta bogati. To se najlepše odraža v kar šestih dosedanjih objavah, vseh v uglednih mednarodnih znanstvenih revijah. Nekaj rezultatov še pripravljamo za objavo. Naše izsledke smo poleg tega predstavljali tudi na mednarodnih znanstvenih konferencah v obliki predavanj ali postrov in bili z njimi vedno deležni precejšnjega zanimanja. Kot je razvidno iz poročila, rezultati pravkar zaključenega projekta odpirajo številne obetavne smeri raziskav, zato se nadejamo podpori našemu predlogu nadaljevalnega projekta na razpisu, ki je trenutno v teku. Že objavljeni rezultati projekta: 1. HALASSY, Beata, HABJANEC, Lidija, BRGLES, Marija, LANG BALIJA, Maja, LEONARDI, Adrijana, KOVAČIČ, Lidija, PRIJATELJ, Petra, TOMAŠIČ, Jelka, KRIŽAJ, Igor. The role of antibodies specific for toxic sPLA2s and haemorrhagins in neutralizing potential of antisera raised against Vipera ammodytes ammodytes venom. Comp. biochem. physiol., Toxicol. pharmacol., 2008, vol. 148, no. 2, str. 178-183. [COBISS.SI-ID 21825831] 2. LEONARDI, Adrijana, FOX, Jay W., TRAMPUŠ-BAKIJA, Alenka, KRIŽAJ, Igor. Two coagulation factor X activators from Vipera a. ammodytes venom with potential to treat patients with dysfunctional factors IXa or VIIa. Toxicon (Oxford). [Print ed.], 2008, vol 52, no. 5, str. 628-637. [COBISS.SI-ID 21894439] 3. SAUL, Friderick A., PRIJATELJ, Petra, NORMAND, Brigitte V. de, VILLETTE, Benoit, RAYNAL, Bertrand, PUNGERČAR, Jože, KRIŽAJ, Igor, FAURE, Grazyna. Comparative structural studies of two natural isoforms of Ammodytoxin, phospholipases A2 from Vipera ammodytes ammodytes which differ in neurotoxicity and anticoagulant activity. J Struct Biol, 2010, vol. 169, no. 3, str. 360-369. [COBISS.SI-ID 23047975] 4. HALASSY, Beata, HABJANEC, Lidija, LANG BALIJA, Maja, KURTOVIČ, Tihana, BRGLES, Marija, KRIŽAJ, Igor. Ammodytoxin content of Vipera ammodytes ammodytes venom as a prognostic factor for venom immunogenicity. Comp. biochem. physiol., Toxicol. pharmacol., 2010, vol. 151, no. 4, str. 455-460. [COBISS.SI-ID 23479847] 5. HALASSY, Beata, BRGLES, Marija, HABJANEC, Lidija, LANG BALIJA, Maja, KURTOVIČ, Tihana, MARCHETTI DESCHMANN, Martina, KRIŽAJ, Igor, ALLMAIER, Gunter. Intraspecies variability in Vipera ammodytes ammodytes venom related to its toxicity and immunogenic potential. Comp. biochem. physiol., Toxicol. pharmacol., 2011, vol. 153, no. 2, str. 223-230. [COBISS.SI-ID 24083495] 6. SAJEVIC, Tamara, LEONARDI, Adrijana, KRIŽAJ, Igor. Haemostatically active proteins in snake venoms. Toxicon (Oxford). [Print ed.], 2011, vol. 57, no. 5, str. 627-645. [COBISS.SI-ID 24433959] 4. Ocena stopnje realizacije zastavljenih raziskovalnih ciljev4 Poglavitni programski cilji so bili v doseženi, v večih delih pa bistveno preseženi. Kljub intenzivnemu iskanju pogojev nam ni uspelo kristalizirati kompleksa Atx-FXa za difrakcijsko analizo, smo pa zato uspeli, po dvajsetih letih prizadevanj, kristalizirati AtxA in AtxC ter določiti njuni tridimenzionalni (3D) strukturi. Ob že poznani 3D strukturi FXa smo zato lahko s podatki pridobljenimi s kemijskim označevanjem interakcijskih površin v obeh proteinih in molekularnega modeliranja izdelali relevanten model kompleksa Atx-FXa, ki nam bo lahko dobro služil pri načrtovanju kratkih peptidov z antitrombotskimi lastnostmi. Prav tako nismo uspeli izolirati cDNA zapisa za amoditazo iz cDNA knjižnice modrasove strupne žleze. Vzrok bi bil lahko degradacija tega zapisa v knjižnici, ki smo jo uporabljali, zato smo se odločili, da jo pripravimo na novo. Zaradi dolgotrajnega postopka pridobivanja dovoljenja za odlov modrasa iz naravnega okolja z strani MOP, ki smo ga prejeli šele tik pred zaključkom projekta, ni bilo mogoče pripraviti nove cDNA knjižnice njegove strupne žleze, poiskati v njej cDNA za amoditazo, jo klonirati in pridobiti rekombinanten encim ter nekaj njegovih delov v E. coli. 5. Utemeljitev morebitnih sprememb programa raziskovalnega projekta oziroma sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine5 Omembe vrednih sprememb programa raziskovalnega projekta ni bilo. 6. Najpomembnejši znanstveni rezultati projektne skupine6 Znanstveni rezultat 1. Naslov SLO Vloga protiteles, specifičnih za toksične sPLA2 in hemoragine, v nevtralizacijskem potencialu antiseruma proti strupu kače Vipera a. ammodytes. ANG The role of antibodies specific for toxic sPLA2s and haemorrhagins in neutralizing potential of antisera raised against Vipera a. ammodytes venom Opis SLO Z uporabo ELISA testov smo ugotovili visoko korelacijo med stopnjo zaščite antiserumov proti celotnemu strupu v miškah in količini anti-Atxs protiteles, ki jih vsebujejo. Ker je hemoragični učinek strupa pri človeku prevladujoč toksični učinek pri zastrupitvi z modrasovim strupom, je izostanek podobne korelacije z vsebnostjo anti-H IgG protiteles razkril, da mišji model verjetno ni optimalen za ovrednotenje nevtralizacijskega potenciala antiserumov za humano terapijo. Ugotovili smo tudi, da Atx in strukturno soroden vendar netoksičen AtnI2 iz strupa modrasa nista navzkrižno imuno-reaktivna. ANG Using ELISA assays we established a high correlation between the protective efficacy of the whole venom antisera in mice and their anti-Atxs antibody content. As the haemorrhage is the prevailing toxic effect of the venom in human, the lack of correlation also with anti-H IgG content exposed that the mouse model might not be optimal to evaluate the neutralizing potential of the venom-specific antisera for human therapy. We further revealed that Atxs and structurally very similar but non-toxic AtnI2 from the venom are not immuno cross-reactive. Objavljeno v HALASSY, Beata, HABJANEC, Lidija, BRGLES, Marija, LANG BALIJA, Maja, LEONARDI, Adrijana, KOVAČIČ, Lidija, PRIJATELJ, Petra, TOMAŠIČ, Jelka, KRIŽAJ, Igor. The role of antibodies specific for toxic sPLA2s and haemorrhagins in neutralizing potential of antisera raised against Vipera ammodytes ammodytes venom. Comp. biochem. physiol., Toxicol. pharmacol., 2008, vol. 148, no. 2, str. 178-183. Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek COBISS.SI-ID 21825831 2. Naslov SLO Dva aktivatorja koagulacijskega faktorja X iz strupa Vipera a. ammodytes s potencialom za zdravljenje pacientov z okvarjenimi faktorji IXa ali VIIa. ANG Two coagulation factor X activators from Vipera a. ammodytes venom with potential to treat patients with dysfunctional factors IXa or VIIa. Opis SLO V tem članku poročamo o izolaciji in karakterizaciji dveh aktivatorjev koagulacijskega faktorja X (FX), 58 kDa VAFXA-I in 70 kDa VAFXA-II iz strupa kače Vipera a. ammodytes. VAFXAzi aktivirata FX v odvisnosti od Ca2+ in z enako specifičnostjo kot fiziološki aktivatorji. Aktivatorja ne aktivirata protrombina ali plazminogena, inhibirata pa s kolagenom inducirano agregacijo trombocitov in vitro. Aktivirata FX v FXa brez toksičnih učinkov. Obetavna je uporaba teh dveh aktivatorjev FX pri pacientih z nefunkcionalnimi FIXa ali FVIIa z namenom vzpostavitve normalnega procesa koagulacije krvi. ANG Here we report on purification and characterization of two activators of coagulation factor X (FX), 58 kDa VAFXA-I and 70 kDa VAFXA-II from Vipera a. ammodytes venom. The VAFXAs activate FX in a Ca2+-dependent manner with the same specificity as physiological activators. The activators did not activate prothrombin or plasminogen but inhibit collagen-induced platelet aggregation in vitro. They activate coagulation FX to FXa without toxic effects. Their application in treating patients with dysfunctional factors IXa or VIIa to restore the normal blood coagulation process is thus promising. Objavljeno v LEONARDI, Adrijana, FOX, Jay W., TRAMPUS-BAKIJA, Alenka, KRIŽAJ, Igor. Two coagulation factor X activators from Vipera a. ammodytes venom with potential to treat patients with dysfunctional factors IXa or VIIa. Toxicon (Oxford). TPrint ed.l, 2008, vol 52, no. 5, str. 628-637. Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek COBISS.SI-ID 21894439 3. Naslov SLO Primerjava tridimenzionalnih struktur AtxA in AtxC iz strupa Vipera a. ammodytes, ki se razlikujeta po nevrotoksičnosti in antikoagulantni aktivnosti. ANG Comparison of three-dimensional structures of AtxA and AtxC from Vipera a. ammodytes venom which differ in neurotoxicity and anticoagulant activity. Opis SLO Ammodytoxin A (AtxA) in njegova naravna izooblika AtxC is strupa Vipera a. ammodytes izražata nevrotoksične in anti-koagulacijske učinke. Izotoksina, ki se med seboj ločita le v dveh amino kislinskih ostankih, pa se občutno razlikujeta v stopnji nevrotoksičnosti, jakosti anti-koagulativnega učinka in se vežeta na proteinske interaktorje, npr. nevronske receptorje in koagulacijski faktor Xa (FXa), s precej različnimi afinitetami. V tem delu smo določili kristalni strukturi AtxA in AtxC in z njuno primerjavo pojasnili omenjene farmakološke razlike med molekulama. ANG Ammodytoxin A (AtxA) and its natural isoform AtxC from the venom of Vipera a. ammodytes exhibit strong neurotoxic and anticoagulant effects. The two isoforms, which differ in sequence by only two amino acid residues, display significant differences in toxicity and anticoagulant properties and act on protein targets including neurotoxic proteic receptors and coagulation factor Xa with significantly different strengths of binding. In this work we determined the three-dimensional structure of both molecules and by their comparison explained the pharmacological differences between both Atxs. Objavljeno v SAUL, Friderick A., PRIJATELJ, Petra^ NORMAND, Brigitte V. de, VILLETTE, Benoit, RAYNAL, Bertrand, PUNGERČAR, Jože, KRIŽAJ, Igor, FAURE, Grazyna. Comparative structural studies of two natural isoforms of Ammodytoxin, phospholipases A2 from Vipera ammodytes ammodytes which differ in neurotoxicity and anticoagulant activity. J Struct Biol, 2010, vol. 169, no. 3, str. 360-369. Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek COBISS.SI-ID 23047975 4. Naslov SLO Znotrajvrstna variabilnost strupa kače Vipera a. ammodytes v korelaciji s toksičnostjo in imunogenskim potencialom strupa. ANG Intraspecies variability in Vipera a. ammodytes venom related to its toxicity and immunogenic potential. Opis SLO V temu delu smo pokazali znotrajvrstno variabilnost med 8 strupi kače vrste Vipera a. ammodytes. Prvič smo lahko določili tiste biokemijske razlike v strupih, ki so povezane z in lahko dajo informacijo o toksičnosti in imunogenosti posameznega strupa. Pokazali smo, da lahko z metodami za kvantifikacijo vsebnosti amoditoksina (najbolj toksične komponente strupa Vipera a. ammodytes odkrite do sedaj) jasno razločimo med visoko in nizko imunogenim strupom. ANG In this work we demonstrated intraspecific variability between 8 Vipera a. ammodytes venom production batches. For the first time we were able to select those biochemical differences that are related to and give information on the venom's toxicity and immunogenicity. We have shown that methods quantifying ammodytoxin (the most toxic compound identified so far in the Vipera a. ammodytes venom) content of the venom clearly distinguish 1 between high and low immunogenic venoms. Objavljeno v HALASSY, Beata, BRGLES, Marija, HABJANEC, Lidija, LANG BALIJA, Maja, KURTOVIČ, Tihana, MARCHEIII DESCHMANN, Martina, KRIŽAJ, Igor, ALLMAIER, Gunter. Intraspecies variability in Vipera ammodytes ammodytes venom related to its toxicity and immunogenic potential. Comp. biochem. physiol., Toxicol. pharmacol., 2011, vol. 153, no. 2, str. 223-230. Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek COBISS.SI-ID 24083495 5. Naslov SLO Hemostatko aktivni proteini v kačjih strupih. ANG Haemostatically active proteins in snake venoms. Opis SLO V tem vabljenem preglednem članku smo opisali najbolj pomembne proteine v kačjih strupih, ki prizadenejo hemostatski sistem. Za nekatere med njimi je že bile pokazana medicinska uporabnost. Opisali smo tiste komponente strupov, ki so že dobile status zdravil za lajšanje hemostatskih bolezni ali pa za uporabo v diagnostiki teh bolezni. Za večino proteinov iz kačjih strupov, ki delujejo na hemostazo, pa klinične aplikacije v tem trenutku še niso znane. Članek zaključujemo s opisom najbolj obetavnih potencialnih aplikacij. ANG In this invited review we descride the most relevant haemostatically active proteins from snake venoms. Medical applications have already been found for some of these snake venom proteins. We describe those that have already been approved as drugs to treat haemostatic disorders or are being used to diagnose such health problems. No clinical applications, however, currently exist for the majority of snake venom proteins acting on haemostasis. We conclude with the most promising potential uses in this respect. Objavljeno v SAJEVIC, Tamara, LEONARDI, Adrijana, KRIŽAJ, Igor. Haemostatically active proteins in snake venoms. Toxicon (Oxford). [Print ed.], 2011, vol. 57, no. 5, str. 627-645. Tipologija 1.02 Pregledni znanstveni članek COBISS.SI-ID 24433959 7. Najpomembnejši družbeno-ekonomsko relevantni rezultati projektne skupine6 Družbeno-ekonomsko relevantni rezultat 1. Naslov SLO Beljakovine modrasovega strupa z vplivom na hemostazo - razvoj inovativnih biomedicinskih antitrombotikov (projekt MR). ANG Proteins of the long-nosed viper venom acting on haemostasis -development of innovative biomedical antitrombotics (YR project). Opis SLO Namen predlaganega projekta je razvoj novih substanc za preprečevanje strjevanja krvi - antitrombotikov. Naloga mladega raziskovalca je razvoj amoditaze iz strupa modrasa (Vipera ammodytes ammodytes) v smeri predkliničnih in kliničnih raziskav. Poleg tega tudi sistematično analizira repertoar proteinov iz strupa modrasa in išče tiste komponente, ki vplivajo na proces strjevanja krvi, z namenom odkrivanja novih molekulskih orodij za karakterizacijo in testiranje krvi. ANG The proposed project is aimed at developing new drug candidates to prevent thrombosis. The task of the young researcher is developing ammodytase from the venom of the long-nosed viper (Vipera ammodytes ammodytes) towards pre-clinical and clinical studies. In addition, she is systematically analyzing repertoire of proteins from Vipera a. ammodytes venom for those components that interfere with haemostasis to discover new molecular tools to be used in blood testing and characterization. Šifra D.09 Mentorstvo doktorandom Objavljeno v Še ni objave. Tipologija 2.08 Doktorska disertacija COBISS.SI-ID 0000000 2. Naslov SLO Biokemijske in strukturne raziskave viperidnih fosfolipaz A2 v kompleksih z njihovimi vezavnimi proteini. ANG Biochemical and structural characterization of phospholipases A2 from viperids in complexes with their binding proteins. Opis SLO Amoditoksini (Atx) in bazična podenota krotoksina (CB), sPLA2 iz strupov kač, sta antikoagulantni, obenem pa tudi nevrotoksični molekuli. Antikoagulativni učinek je posledica vezave sPLA2 na koagulacijski faktor Xa (FXa), nevrotoksičnost je lahko pogojena z vezavo na CaM. Namen projekta je določitev 3D strukture kompleksov med Atx (in CB) ter FXa ali CaM kot osnove za načrtovanje sintetskih peptidov ali peptidomimetikov z antikoagulantnim in anti-nevrotoksičnim učinkom za uporabo v klinične namene. Partnerska institucija: Institut Pasteur, Pariz, Francija. ANG Ammodytoxis (Atx) and basic subunit of crotoxin (CB), sPLA2s from snake venoms, are anticoagulant as well as neurotoxic. Anticoagulant effect results from binding of these sPLA2s to blood coagulation factor X (FXa), neurotoxicity may be related to binding to CaM. The aim of this project is to determine the 3D structure of complexes between Atx (and CB) and FXa or CaM as a starting point for designing of the synthetic peptides or peptidomimetics with anticoagulant and antineurotoxic effect to be used in clinics. Partner institution: Institut Pasteur, Pariz, Francija. Šifra D.01 Vodenje/koordiniranje (mednarodnih in domačih) projektov Objavljeno v Projekt Proteus (BI-FR/08-09-PROTEUS-007): http://www.arrs.gov.si/sl/medn/dvostr/drzave/Francija/rezultati/07/inc/rezult -proteus-08-09.pdf Tipologija 3.25 Druga izvedena dela COBISS.SI-ID 0000000 3. Naslov SLO Izolacija komponent strupa modrasa (Vipera ammodytes ammodytes) in analiza njihove imunogenosti. ANG Isolation of long-nosed viper (Vipera ammodytes ammodytes) venom components and analysis of their immunogenicity. Opis SLO Glavni cilj projekta je razviti novo metodologijo priprave polispecifičnega protisturpa proti glavnim toksičnim komponentam modrasovega strupa, z visokim in čim širšim nevtralizacijskim potencialom, ki bo učinkovit in varen pri imunoterapiji pacientov. Nov postopek pridobivanja protistrupa naj bi zagotavljal konstantno kvaliteten produkt, zahteval le majhne količine strupa in imel kvečjemu minimalne posledic za živali, udeležene v postopku. Izpopolnili bomo metodo za in vitro določanje kvalitete proizvedenih protistrupov, brez uporabe živali. Partner: Imunološki zavod, Zagreb, Hrvaška. ANG In this project we will develop a new methodology to produce polyspecific antivenom towards the main toxic components of the long-nosed viper venom, of high and broad neutralising activity, to be used in efficient and safe treatment of envenomed patients and immunochemistry. The new procedure should not be variable in terms of quality of the product, should require low amount of venom and should have low if any side effects on antivenom-producing animals. We will tend to further improve the in vitro antivenom-quality-testing procedure. Partner: Institute of Immunology, Zagreb, Coatia. Šifra D.01 Vodenje/koordiniranje (mednarodnih in domačih) projektov Objavljeno v Program znanstvenega in tehnološkega sodelovanja med vlado RS in vlado hrvaške republike (BI-HR/10-11-025): http://www.arrs.gov.si/sl/medn/dvostr/drzave/Hrvaska/rezultati/10/inc/sprejeti -slo-hrv-2010-11.pdf Tipologija 3.25 Druga izvedena dela COBISS.SI-ID 0000000 4. Naslov SLO Soustanovitelj in partnerj Centra odličnosti za integrirane pristope v kemiji in biologiji proteinov (CIPKeBiP). ANG Co-founder and partner of the Centre of Excellence for Integrated Approaches in Chemistry and Biology of Proteins (CIPKeBiP). CIPKeBiP povezuje znanje, izkušnje in tehnologije vrhunskih slovenskih Opis SLO raziskovalnih skupin, ki se ukvarjajo z raziskovanjem proteinov ter njihovih lastnosti in funkcij. Center vključuje deset organizacij iz centralne in severovzhodne Slovenije, med njimi pet podjetij. Partnerji se osredotočamo na specifične biološke probleme visoke znanstvene in biomedicinske relevance (infekcijske bolezni, signalne poti) in pomembne za okolje (adaptacija ekstremofilnih organizmov). Izsledke in znanja iz raziskav bomo uporabili pri razvoju procesov in znanja pri skupnih projektih z industrijskimi partnerji. ANG CIPKeBiP is connecting the top available expertise, knowhow, and technology of Slovenian research laboratories in protein science, thus emphasizing biomedical relevance of the applied project (priority health and life sciences). The Centre includes ten partner institutions from central and northeastern region of Slovenia, among them five industrial entities. We are focused on specific biological issues of high scientific relevance and of high biomedical (infectious diseases, signaling pathways) and environmental (adaption mechanisms of extremofiles) importance. Šifra D.02 Ustanovitev raziskovalnega centra, laboratorija, študija, društva Objavljeno v http://www.cipkebip.org/ Tipologija 3.25 Druga izvedena dela COBISS.SI-ID 0000000 5. Naslov SLO Sekretar Evropske sekcije Mednarodne toksinološke zveze in član Sveta Svetovne toksinološke zveze (2005-2008 in 2009-2012). ANG Secretary of the European section of The International Society on Toxinology (IST) and the World IST board member (2004-2008 and 2009-2012). Opis SLO Mednarodna toksinološka zveza je bila ustanovljena leta 1962. Poslanstvo združenja je napredek znanja o lastnostih toksinov in antitoksinov in povezovanje raziskovalcev z različnih področij znanosti, ki jih povezuje skupni interes - odkrivanje načinov delovanja, uporaba in zaščita pred naravnimi toksini. Vodilne funkcije v organih evropskih in svetovnih strokovnih združenj dodatno krepijo našo nacionalno identiteto in prepoznavnost v svetu. ANG The International Society on Toxinology was founded in 1962. The purpose of the Society is to advance knowledge on the properties of toxins and antitoxins and to bring together scholars interested in these substances through a common Society. The leading functions in the committees of European and international professional societies helps in the international recognition of Slovenian science and in strengthening of our national identity. Šifra D.03 Članstvo v tujih/mednarodnih odborih/komitejih Objavljeno v http://www.toxinology.net/ist_website/IST_Officebearers.htm Tipologija 3.25 Druga izvedena dela COBISS.SI-ID 0000000 8. Drugi pomembni rezultati projetne skupine8 Šifra: C.04 Uredništvo mednarodne revije Naslov: Članstvo v uredniškem odboru revije Toxicon. Objava: Toxicon. Križaj, Igor (član uredniškega odbora 2006-). [Print ed.]. Oxford: Pergamon press, 1962-. ISSN 0041-0101. [COBISS.SI-ID 1835012] (http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home/259/description#description) Opis: Dr. Igor Križaj je bil povabljen v uredniški odbor mednarodne znanstvene revije Toxicon (ISSN: 0041-0101). trenutni faktor vpliva revije (2008) je 2.460. Je vodilna revija na področju toksinologije v svetu, med vodilnimi revijami na področju toksikologije (26/75) in v zgornji polovici revij na področju farmakologije in farmacije (94/216). Code: C.04 Editorial of an international journal Title: Membership in the Editorial Board of Toxicon. Publication: Toxicon. Križaj, Igor (member of editorial board 2006-). [Print ed.]. Oxford: Pergamon press, 1962-. ISSN 0041-0101. [COBISS.SI-ID 1835012] (http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home/259/description#description) Description: In 2006, Dr. Igor Križaj became a member of the Editorial Board of Toxicon (ISSN: 0041-0101) which current impact factor (2008) is 2.460. Toxicon is the leading toxinology journal, it is among the leading journals in the field of toxicology (26/75) and in the upper half of the journals in the field of pharmacology and pharmacy (94/216). 9. Pomen raziskovalnih rezultatov projektne skupine9 9.1. Pomen za razvoj znanosti10 SLO_ Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije (WHO) so vzrok za smrt globalno v kar 29% primerih kardiovaskularne bolezni. Ta žalostna statistika kvalificira kardiovaskularne patologije kot ene najbolj perečih za človeško vrsto. Bolezni ožilja so tudi eden glavnih zdravstvenih problemov prebivalcev Evropske unije. Po podatkih iz leta 2007 te vrste bolezni vsako leto prizadenejo več kot milijon prebivalcev EU. Po napovedih WHO bosta dva glavna vzroka smrti v svetu v letu 2030 ishemična srčna bolezen in kap (World Health Statistics 2008, WHO Statistical Information System - WHOSIS). Iz naštetih razlogov je eden od strateških prioritet Programa za kardiovaskularne bolezni v okviru WHO (http://www.who.int/cardiovascular_diseases/priorities/en/) razvoj poceni inovacij in sistema za zdravljenje kardiovaskularnih bolezni, ki bi bile dostopne tudi najrevnejšim, za zmanjšanje smrtnosti kot posledice te vrste bolezni. Antikoagulanti so osnova za preventivo in zdravljenje tromboembolitskih bolezni, ki so eden najresnejših zdravstvenih problemov današnjega časa v razvitih delih sveta, saj trenutno kar okrog 1% celotne zahodne populacije prejema določeno obliko antitrombotske terapije. V teh delih sveta se človeška populacija pospešeno stara, zato je pričakovati, da se bo problem v prihodnosti še stopnjeval. Glede na to je intenzivno iskanje novih terapevtskih pristopov in substanc v boju zoper trombo-embolitske bolezni zelo relevantno v naporih za izboljšanje človeškega zdravja. ANG_ According to World Health Organization (WHO), 29% of global deaths are caused by cardiovascular diseases, qualifying these kind of pathologies as one of the most critical for the mankind. Venous thromboembolic disease is also a major problem in the European Union, where it affects according to the 2007 data more than one million people every year. Moreover, WHO predicts that two leading causes of death in the world in 2030 will be ischemic heart disease and stroke (World Health Statistics 2008, WHO Statistical Information System -WHOSIS). Therefore, one of the strategic priorities of the WHO Cardiovascular Disease Programme (http://www.who.int/cardiovascular_diseases/priorities/en/) is to develop cost effective and equitable health care innovations for management of cardiovascular diseases to reduce morbidity and mortality caused by cardiovascular diseases. Anticoagulants are pivotal for the prevention and treatment of thromboembolic disorders which are one of the most severe medical problems nowadays in developed world indicated by the fact that nearly 1% of the western population receives anticoagulant treatment. It is expected that the problem will expand in the following years, as the population in these parts of the world is rapidly aging. For these reasons, intensive search for novel therapeutic approaches and substances in this medical area is highly relevant. 9.2. Pomen za razvoj Slovenije11 SLO Projekt se je posvečal analizi strupne mašinerije modrasa, ki vpliva na hemostatski sistem pri človeku z namenom njenega razumevanja in izrabe za odkrivanje novih načinov za diagnosticiranje in terapijo hemostatskih motenj pri človeku. Številni rezultati projekta bodo že kratkoročno pozitivno vplivali na izboljšanje človeškega zdravja. Farmakološko zanimivi rezultati bodo omogočili nadaljnjo krepitev sodelave predvsem z domačo farmacevtsko industrijo. Izvedeni projekt je imel tudi številne posredne pozitivne učinke na našo družbo. Ti so še zlasti vidni na področju izobraževanja. Raziskave so v prvi vrsti prispevale k znanstveni in strokovni rasti raziskovalcev in univerzitetnih učiteljev - nekateri člani projektne skupine sodelujejo v dodiplomskih in podiplomskih izobraževalnih programih na različnih visokošolskih ustanovah. V okviru projektnih raziskav so se izobraževali študentje, mlada raziskovalka v okviru doktorskega študija, z izdelavo svojih diplomskih del pa so bili vklučeni tudi dodiplomski študentje. Svoje znanje in izkušnje iz laboratorijev smo tako neposredno prenašali na do- in podiplomske študente. Del rezultatov naših raziskav je že bil objavljen v kar šestih člankih v kvalitetnih mednarodnih znanstvenih revijah, nekaj publikcij pa še pripravljamo. Skupaj s predstavljanjem projektnih dosežkov s predavanji in postri na mednarodnih znanstvenih srečanjih smo dvigali prepoznavnost in znanstveni ugled Slovenije v svetu. Posebnega pomena za slovenski raziskovalni prostor in preko njega za celotno družbo je uvajanje in posredovanje najnovejših raziskovalnih tehnologij, ki jih uporabljamo pri svojem raziskovalnem delu. V okviru tega projekta je ena takih modernih tehnologij, ki smo jo uvajali in uporabljali, tehnologija proteomike. ANG_ The project was focused on analysis of the nose-horned venom machinery that affects the human haemostatic system in order to understand and exploit these findings for discovery of novel diagnostic and therapeutic procedures to cure human haemostatic dysfunctions. Numerous results that we obtained will have high and immediate impact on improvement of human health. Pharmacologically interesting results will enable further strengthening of our collaboration with especially domestic pharmaceutical industry. The concluded research project resulted in also several indirect positive impacts on our society. These are especially reflected in the education area. The research activities, first of all, aided to the scientific and professional growth of researchers and university teachers involved - some members of the project team are involved in teaching activities at undergraduate and postgraduate levels at different faculties. In the scope of the performed project students had been educated, a young researcher on her PhD study, as well as several undergraduate students working on their diplomas. Our knowledge and experiences had been thus directly transferred from the labs to the students. A part of the obtained results had been already published in six papers in high quality scientific journals, some are still under preparation. Together with dissemination of our achievements through lectures and postes on international scientific conferences, we extended the recognition and scientific reputation of Slovenia in the World. Of the special importance for the Slovenian research sphere and through it for the whole society is also introducing and transferring of the latest research technologies that we are use in our experimental work. In the scope of this project one of such state-of-the-art technology that was introduced and used was the proteomics. 10. Samo za aplikativne projekte! Označite, katerega od navedenih ciljev ste si zastavili pri aplikativnem projektu, katere konkretne rezultate ste dosegli in v kakšni meri so doseženi rezultati uporabljeni Cilj F.01 Pridobitev novih praktičnih znanj, informacij in veščin Zastavljen cilj .> DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.03 Večja usposobljenost raziskovalno-razvojnega osebja Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.04 Dvig tehnološke ravni Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.05 Sposobnost za začetek novega tehnološkega razvoja Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.06 Razvoj novega izdelka Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.07 Izboljšanje obstoječega izdelka Zastavljen cilj .) DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.08 Razvoj in izdelava prototipa Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.09 Razvoj novega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.10 Izboljšanje obstoječega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.11 Razvoj nove storitve Zastavljen cilj ') DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.12 Izboljšanje obstoječe storitve Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.13 Razvoj novih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.14 Izboljšanje obstoječih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.15 Razvoj novega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.16 Izboljšanje obstoječega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.17 Prenos obstoječih tehnologij, znanj, metod in postopkov v prakso Zastavljen cilj .> DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference) Zastavljen cilj D DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.19 Znanje, ki vodi k ustanovitvi novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.20 Ustanovitev novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.21 Razvoj novih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.22 Izboljšanje obstoječih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.23 Razvoj novih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj .> DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.24 Izboljšanje obstoječih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.25 Razvoj novih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.26 Izboljšanje obstoječih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.27 Prispevek k ohranjanju/varovanje naravne in kulturne dediščine Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.28 Priprava/organizacija razstave Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.29 Prispevek k razvoju nacionalne kulturne identitete Zastavljen cilj D DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.30 Strokovna ocena stanja Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.31 Razvoj standardov Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.32 Mednarodni patent Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.33 Patent v Sloveniji Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.34 Svetovalna dejavnost Zastavljen cilj .> DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.35 Drugo Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d Komentar 11. Samo za aplikativne projekte! Označite potencialne vplive oziroma učinke vaših rezultatov na navedena področja Vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.01 Razvoj visoko-šolskega izobraževanja G.01.01. Razvoj dodiplomskega izobraževanja O O O o G.01.02. Razvoj podiplomskega izobraževanja o o o o G.01.03. Drugo: o o o o G.02 Gospodarski razvoj G.02.01 Razširitev ponudbe novih izdelkov/storitev na trgu O O O O G.02.02. Širitev obstoječih trgov o o o o G.02.03. Znižanje stroškov proizvodnje o o o o G.02.04. Zmanjšanje porabe materialov in energije O O O O G.02.05. Razširitev področja dejavnosti o o o o G.02.06. Večja konkurenčna sposobnost o o o o G.02.07. Večji delež izvoza o o o o G.02.08. Povečanje dobička o o o o G.02.09. Nova delovna mesta o o o o G.02.10. Dvig izobrazbene strukture zaposlenih O O O O G.02.11. Nov investicijski zagon o o o o G.02.12. Drugo: o o o o G.03 Tehnološki razvoj G.03.01. Tehnološka razširitev/posodobitev dejavnosti O O O O G.03.02. Tehnološko prestrukturiranje dejavnosti O o o o G.03.03. Uvajanje novih tehnologij o o o o G.03.04. Drugo: o o o o G.04 Družbeni razvoj G.04.01 Dvig kvalitete življenja o o o o G.04.02. Izboljšanje vodenja in upravljanja o o o o G.04.03. Izboljšanje delovanja administracije in javne uprave o o o o G.04.04. Razvoj socialnih dejavnosti o o o o G.04.05. Razvoj civilne družbe o o o o G.04.06. Drugo: o o o o G.05. Ohranjanje in razvoj nacionalne naravne in kulturne dediščine in identitete O O O O G.06. Varovanje okolja in trajnostni razvoj O O O O G.07 Razvoj družbene infrastrukture G.07.01. Informacijsko-komunikacijska infrastruktura O O O O G.07.02. Prometna infrastruktura o o o o G.07.03. Energetska infrastruktura o o o o G.07.04. Drugo: o o o o G.08. Varovanje zdravja in razvoj zdravstvenega varstva o o o o G.09. Drugo: o o o o Komentar 12. Pomen raziskovanja za sofinancerje, navedene v 2. točki12 1. Sofinancer Vrednost sofinanciranja za celotno obdobje trajanja projekta je znašala: EUR Odstotek od utemeljenih stroškov projekta: % Najpomembnejši rezultati raziskovanja za sofinancerja Šifra 1. 2. 3. 4. 5. Komentar Ocena 2. Sofinancer Vrednost sofinanciranja za celotno obdobje trajanja projekta je znašala: EUR Odstotek od utemeljenih stroškov projekta: % Najpomembnejši rezultati raziskovanja za sofinancerja Šifra 1. 2. 3. 4. 5. Komentar Ocena 3. Sofinancer Vrednost sofinanciranja za celotno obdobje trajanja projekta je znašala: EUR Odstotek od utemeljenih stroškov projekta: % Najpomembnejši rezultati raziskovanja za sofinancerja Šifra 1. 2. 3. 4. 5. Komentar Ocena C. IZJAVE Podpisani izjavljam/o, da: • so vsi podatki, ki jih navajamo v poročilu, resnični in točni • se strinjamo z obdelavo podatkov v skladu z zakonodajo o varstvu osebnih podatkov za potrebe ocenjevanja, za objavo 6., 7. in 8. točke na spletni strani http://sicris.izum.si/ ter obdelavo teh podatkov za evidence ARRS • so vsi podatki v obrazcu v elektronski obliki identični podatkom v obrazcu v pisni obliki • so z vsebino zaključnega poročila seznanjeni in se strinjajo vsi soizvajalci projekta Podpisi: Igor Križaj in podpis vodje raziskovalnega projekta zastopnik oz. pooblaščena oseba RO Kraj in datum: Ljubljana 14.4.2011 Oznaka poročila: ARRS-RPROJ-ZP-2011-1/82 1 Zaradi spremembe klasifikacije družbeno ekonomskih ciljev je potrebno v poročilu opredeliti družbeno ekonomski cilj po novi klasifikaciji. Nazaj 2 Samo za aplikativne projekte. Nazaj 3 Napišite kratko vsebinsko poročilo, kjer boste predstavili raziskovalno hipotezo in opis raziskovanja. Navedite ključne ugotovitve, znanstvena spoznanja ter rezultate in učinke raziskovalnega projekta. Največ 18.000 znakov vključno s presledki (približno tri strani, velikosti pisave 11). Nazaj 4 Realizacija raziskovalne hipoteze. Največ 3.000 znakov vključno s presledki (približno pol strani, velikosti pisave 11). Nazaj 5 V primeru bistvenih odstopanj in sprememb od predvidenega programa raziskovalnega projekta, kot je bil zapisan v predlogu raziskovalnega projekta oziroma v primeru sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine v zadnjem letu izvajanja projekta (obrazložitev). V primeru, da sprememb ni bilo, to navedite. Največ 6.000 znakov vključno s presledki (približno ena stran, velikosti pisave 11). Nazaj 6 Navedite največ pet najpomembnejših znanstvenih rezultatov projektne skupine, ki so nastali v času trajanja projekta v okviru raziskovalnega projekta, ki je predmet poročanja. Za vsak rezultat navedite naslov v slovenskem in angleškem jeziku (največ 150 znakov vključno s presledki), rezultat opišite (največ 600 znakov vključno s presledki) v slovenskem in angleškem jeziku, navedite, kje je objavljen (največ 500 znakov vključno s presledki), izberite ustrezno šifro tipa objave po Tipologiji dokumentov/del za vodenje bibliografij v sistemu COBISS ter napišite ustrezno COBISS.SI-ID številko bibliografske enote. Navedeni rezultati bodo objavljeni na spletni strani http://sicris.izum.si/. PRIMER (v slovenskem jeziku): Naslov: Regulacija delovanja beta-2 integrinskih receptorjev s katepsinom X; Opis: Cisteinske proteaze imajo pomembno vlogo pri nastanku in napredovanju raka. Zadnje študije kažejo njihovo povezanost s procesi celičnega signaliziranja in imunskega odziva. V tem znanstvenem članku smo prvi dokazali... (največ 600 znakov vključno s presledki) Objavljeno v: OBERMAJER, N., PREMZL, A., ZAVAŠNIK-BERGANT, T., TURK, B., KOS, J.. Carboxypeptidase cathepsin X mediates 62 - integrin dependent adhesion of differentiated U-937 cells. Exp. Cell Res., 2006, 312, 2515-2527, JCR IF (2005): 4.148 Tipopologija: 1.01 - Izvirni znanstveni članek COBISS.SI-ID: 1920113 Nazaj 7 Navedite največ pet najpomembnejših družbeno-ekonomsko relevantnih rezultatov projektne skupine, ki so nastali v času trajanja projekta v okviru raziskovalnega projekta, ki je predmet poročanja. Za vsak rezultat navedite naslov (največ 150 znakov vključno s presledki), rezultat opišite (največ 600 znakov vključno s presledki), izberite ustrezen rezultat, ki je v Šifrantu raziskovalnih rezultatov in učinkov (Glej: http://www.arrs.gov.si/sl/gradivo/sifranti/sif-razisk-rezult.asp), navedite, kje je rezultat objavljen (največ 500 znakov vključno s presledki), izberite ustrezno šifro tipa objave po Tipologiji dokumentov/del za vodenje bibliografij v sistemu COBISS ter napišite ustrezno COBISS.SI-ID številko bibliografske enote. Navedeni rezultati bodo objavljeni na spletni strani http://sicris.izum.si/. Nazaj 8 Navedite rezultate raziskovalnega projekta v primeru, da katerega od rezultatov ni mogoče navesti v točkah 6 in 7 (npr. ker se ga v sistemu COBISS ne vodi). Največ 2.000 znakov vključno s presledki. Nazaj 9 Pomen raziskovalnih rezultatov za razvoj znanosti in za razvoj Slovenije bo objavljen na spletni strani: http://sicris.izum.si/ za posamezen projekt, ki je predmet poročanja. Nazaj 10 Največ 4.000 znakov vključno s presledki Nazaj 11 Največ 4.000 znakov vključno s presledki Nazaj 12 Rubrike izpolnite/prepišite skladno z obrazcem "Izjava sofinancerja" (http://www.arrs.gov.si/sl/progproj/rproj/gradivo/), ki ga mora izpolniti sofinancer. Podpisan obrazec "Izjava sofinancerja" pridobi in hrani nosilna raziskovalna organizacija - izvajalka projekta. Nazaj Obrazec: ARRS-RPROJ-ZP/2011-1 v1.01 32-EE-AA-F5-AB-21-E0-AC-C0-99-88-94-1E-CE-08-E6-D4-6C-72-4C