V kirur{ki patologiji je razumljivo, da lahko postavimo
pravilno diagnozo pri bolniku le tedaj, ~e dobimo v
preiskavo njegov vzorec. Ena najpomembnej{ih zahtev pri
tem delu je torej pravilna identifikacija tkivnih vzorcev in
njihova pravilna oznaka. ^eprav so sistemi ozna~evanja na
strani kirurga, transporta in ozna~evanje na strani patologa
vsak posebej preizku{en in ves ~as nadzorovan, se lahko
zgodi, da vzorec med potjo od bolnika do mikroskopa
napa~no ozna~imo ali pa oznako izgubimo.
Ker gre v kirur{ki patologiji za diagnosti~ne procese, in ne
za enostavno tehnologijo, ni mogo~e pri~akovati, tako kot
{e vedno misli lai~na publika pa tudi nekateri zdravniki,
»ni~elnega« standarda, standarda, kjer pri dobrem delu ni
napak. Kak{na je verjetnost napak, lahko sklepamo tudi iz
obsega dela, saj izdelamo na Oddelku za patologijo
Onkolo{kega in{tituta letno za diagnozo 5800 kirur{kih
biopsij, kar je ve~ kot 95.000 histolo{kih preparatov vseh
vrst. Na vsakem preparatu je povpre~no sedem
identifikacijskih {tevilk.
Kljub nadzoru dela se lahko zgodi, da biopsijske vzorce
razli~nih bolnikov po pomoti zamenjamo. Na Oddelku za
patologijo smo imeli v obdobju med 1992 in 2001 15 takih
primerov. V devetih primerih smo odkrili zamenjavo pri
biopsijah kostnega mozga in {estkrat pri drugih vzorcih. V
dodatnih 11 primerih smo iz tehni~nih razlogov izgubili
oznake na kasetah s tkivom. Vsakega od teh problemov smo
uspeli re{iti. Kadar pa zamenjamo majhne vzorce
istovrstnega materiala (od{~ipi pri endoskopskih preiskavah,
biopsije kostnih mozgov, bezgavke), se lahko zgodi, da bo
ponovna identifikacija vzorca, ~eprav na zamenjavo
upravi~eno sumimo, kljub ob{irni in natan~ni analizi
dogodkov od operacije do laboratorijskih obdelav,
nemogo~a. Ker so lahko posledice zamenjave usodne, si
`elimo v takih primerih zanesljivej{ih na~inov dolo~anja,
kateremu od bolnikov pripada biopsijski vzorec. 
Od za~etka devetdesetih let lahko v takih primerih `e
uporabljamo molekularno-biolo{ke metode.
Metoda genetskega profiliranja, pri kateri dolo~amo alelne
vzorce ali genetske profile, je najbolj zanesljiva metoda
identifikacije biolo{kega materiala in preverjanja bli`njih
sorodstvenih povezav. Prvi~ v zgodovini identifikacijskih
metod nam namre~ omogo~a pozitivno identifikacijo, in ne
le izklju~itve.
Prva genetska identifikacijska metoda, ki jo je leta 1985 v
Veliki Britaniji razvil Alec Jeffreys, je temeljila na preiskavi
minisatelitnih polimorfizmov. V za~etku devetdesetih let so
razvili metodo genetskega profiliranja, pri kateri tipiziramo
mikrosatelite ali kratke tandemske ponovitve. Ozna~imo jih
s kratico STR (angl. Short Tandem Repeat), pomno`ujemo
pa jih v veri`ni reakciji s polimerazo – PCR (angl.
Polymerase Chain Reaction). Zaradi bistveno hitrej{ih analiz
in mo`nosti re{evanja primerov, za katere je zna~ilna
izredno majhna koli~ina DNK (identifikacija biolo{kih
sledov, kot so slina s cigaretnega ogorka, slina s po{tne
znamke, prhljaj, nohti in lasje s koreninico), se je ta metoda
mo~no raz{irila in jo danes uporablja ve~ina forenzi~nih
genetskih laboratorijev. 
Tudi metoda, ki smo jo uvedli v genetskem laboratoriju
In{tituta za sodno medicino Medicinske fakultete v
Ljubljani, temelji na preiskavi mikrosatelitnih dol`inskih
polimorfizmov molekule DNK. Pri preiskavi 14 lokusov STR
dobimo za vsakega posameznika edinstven vzorec alelov, ki
je osebno specifi~en in ga imenujemo genetski profil. Pri
identifikacijskih testih dosegamo verjetnost ujemanja
naklju~no izbrane osebe z genetskim profilom analiziranega
biolo{kega vzorca 1 v 1015. V primerjavi z velikostjo
celotne ~love{ke populacije (6x109) ka`e ta verjetnost
edinstvenost genetskih profilov. 
Za dolo~anje spola pomno`ujemo v forenzi~nih vzorcih s
PCR odsek amelogeninskega gena.
MIKROSATELITI ALI LOKUSI STR
Mikrosateliti ali lokusi STR so podro~ja ~love{kega genoma,
v katerih se ljudje med seboj najbolj razlikujemo. Lokusi
STR pripadajo nekodogeni DNK in ne kodirajo proteinov.
Raztreseni so po vsem genomu. So nevtralni, ker ne nosijo
nobene informacije o posamezniku, omogo~ajo pa
ugotavljanje identitete. Variabilnost lokusov STR je znotraj
populacije tako visoka, da lahko z uporabo ve~jega {tevila
lokusov med seboj razlikujemo katerikoli osebi, razen
enojaj~nih dvoj~kov. Lokusi STR imajo obliko kratkih,
tandemsko ponovljenih nukleotidnih zaporedij, t.i.
osnovnih motivov, ki se ponavljajo v {tevilnih identi~nih ali
sorodnih kopijah. Polimorfizem lokusov STR torej temelji na
variacijah v {tevilu ponovitev osnovnega motiva. Posledica
je visoka variabilnost v dol`inah posameznih alelov, kar
opi{emo kot dol`inski polimorfizem. Dol`ina osnovnega
motiva vseh 14 lokusov STR, ki jih na In{titutu za sodno
medicino uporabljamo pri rutinskih preiskavah, so {tirje
bazni pari, zato govorimo o tetranukleotidnih lokusih,
njihova dol`ina pa ne presega 400 baznih parov. 
Na sliki 1 je shematsko prikazan dol`inski polimorfizem
lokusa TH01. Osnovni motivi so obarvani rumeno, njihovo
nukleotidno zaporedje je AATG, mejna podro~ja lokusa pa
so obarvana modro. Obe prikazani osebi imata zaradi
razli~nega {tevila ponovitev osnovnega motiva na lokusu
ONKOLOGIJA / problemi in perspektive
Irena Zupaniè Pajniè, Jože Balažic, Radovan Komel, Rastko Golouh
Identifikacija tkivnih vzorcev z molekularno-biološkimi metodami
17
razli~no dolge alele. Oseba 1 ima na enem kromosomu
osem ponovitev osnovnega motiva in na homolognem
kromosomu pet ponovitev, oseba 2 pa ima {est in devet
ponovitev osnovnega motiva. Ker ozna~imo alele s {tevilom
ponovitev osnovnega motiva, pravimo, da ima oseba 1 na
lokusu TH01 alel 8 in alel 5, oseba 2 pa alel 6 in alel 9. 
Rodovni{ke analize so pokazale, da se lokusi STR
razporejajo neodvisno s star{ev na potomce, ka`ejo
kodominantno naravo alelov in se dedujejo strogo po
Mendlovih zakonih dedovanja, po katerih otrok vedno
podeduje en alel od matere in enega od o~eta. Na sliki 2 je
Sodnomedicinske genetske preiskave
sestavlja ve~ korakov:
• izolacija genomske DNK iz razli~nega
biolo{kega materiala,
• pomno`evanje lokusov STR in odseka
amelogeninskega gena v PCR,
• lo~evanje amplifikacijskih produktov s
kapilarno elektroforezo in dolo~anje
genotipov analiziranih vzorcev ter
• ocenjevanje mo~i genetskega dokaza.
GENETSKO PROFILIRANJE PRI IDENTIFIKACIJI TKIVNIH
VZORCEV
Kadar nas zanima, ali pripadajo tkiva v parafinskem bloku
ali v histolo{kem preparatu isti osebi, moramo izolirati
genomsko DNK iz vseh vpra{ljivih vzorcev in jim dolo~iti
genetske profile. Da bo odgovor pritrdilen, se morajo
genetski profili, dobljeni iz vseh tkiv, popolnoma ujemati na
vseh 14 analiziranih lokusih STR. ^e opazimo neujemanje
na enem samem lokusu, vzorca ne pripadata isti osebi. Pri
tem moramo biti pozorni na to, da v identifikacijske teste
vklju~imo le tkiva, ki niso genetsko spremenjena. Veliko
pogostnost somatskih mutacij so namre~
opazili prav v ~love{kih tumorjih.
Somatske mutacije povzro~ajo razlike v
genotipih razli~nih tkiv istega osebka, kar
privede do zapletov pri identifikacijah,
saj te temeljijo na predpostavki, da imajo
vsa tkiva posameznika enak genotip. To
pomeni, da tumorjev ne smemo
genotipizirati, saj so mikrosatelitna
zaporedja v njih pogosto mutirana. 
^e pa nas zanima, ali pripada
neidentificiran tkivni vzorec dolo~enemu
pacientu, vzamemo pacientu malo krvi iz
prsta in bris bukalne sluznice ter ju
genotipiziramo. Dobljen genetski profil
nato primerjamo z genetskim profilom
tkiva v parafinskem bloku, katerega izvor
ni popolnoma jasen. Tkivni vzorec lahko
pozitivno identificiramo le ob popolnem
ujemanju dobljenega genetskega profila z
genetskim profilom pacienta. Ponovno
naj opozorimo, da za identifikacije z
genetskim profiliranjem tumorji niso
primerni; potrebno je analizirati
neprizadeta tkiva.
Na sliki 3 je prikazan hipoteti~en primer identifikacije
tkivnih vzorcev. Referen~ni vzorec predstavlja genetski
profil znanega pacienta, eviden~ni vzorec 1 in 2 pa
genetska profila dveh tkivnih vzorcev, katerih identiteto
preverjamo. Zaradi jasnej{e predstave so na
elektroferogramih prikazani le genetski profili treh lokusov
STR, preiskavo pa seveda opravimo na vseh 14 lokusih STR.
Ujemanje genetskih profilov opazimo med referen~nim
vzorcem (pacient) in eviden~nim vzorcem 1 (tkivni vzorec
1). Oba vzorca imata na lokusu D3S1358 genotip 15/18, na
ONKOLOGIJA / problemi in perspektive
18
Slika 1. Shematski prikaz dol`inskega polimorfizma lokusa HUMTH01.
Slika 2. Dedovanje lokusov STR.
prikazano dedovanje lokusov STR pri treh generacijah. V
vsaki generaciji poskrbi spolno razmno`evanje za razli~ne
kombinacije alelov. Na na~inu dedovanja lokusov STR
temeljijo preverjanja spornih o~etovstev in vse preiskave,
pri katerih ugotavljamo bli`nje sorodstvene povezave med
posamezniki. Identifikacijski testi, pri katerih ne spremljamo
na~ina dedovanja, ampak nas zanima, ali se genetski profili
analiziranih vzorcev med seboj popolnoma ujemajo, pa
temeljijo na predpostavki, da imajo vsa tkiva posameznika
enak genotip.
lokusu vWA 16/17 in na lokusu FGA 24/25. Tkivni vzorec 1
torej pripada znanemu pacientu, pri ~emer mora biti
ujemanje potrjeno na vseh 14 lokusih STR. Eviden~ni
vzorec 2 (tkivni vzorec 2) se na dveh prikazanih lokusih ne
ujema z referen~nim vzorcem istega pacienta. Genotip
referen~nega vzorca na lokusu D3S1358 je 15/18,
eviden~nega vzorca 2 pa 16/16, na lokusu FGA je genotip
referen~nega vzorca 24/25, eviden~nega vzorca 2 pa 20/24.
Tkivni vzorec 2 zaradi neujemanja torej ne pripada temu
pacientu. 
PRIMERI FORENZI^NIH GENETSKIH IDENTIFIKACIJ 
Trenutno potekajo v ZDA izredno obse`ne genetske
identifikacijske preiskave, kjer posku{ajo s pomo~jo zobnih
{~etk in glavnikov pogre{anih oseb identificirati `rtve
nedavnega teroristi~nega napada na Svetovni trgovinski
center in na Pentagon. 
Ena najbolj odmevnih in uspe{nih forenzi~nih genetskih
raziskav je identifikacija ruske vladarske dru`ine Romanov.
Za pozitivno identifikacijo je bilo potrebno analizirati tako
jedrno kot mitohondrijsko DNK (mtDNK). S pomo~jo jedrne
DNK so lahko preverili maternalno in paternalno
povezanost dru`inskih ~lanov, niso pa mogli odgovoriti na
vpra{anje, ali gre res za posmrtne ostanke dru`ine
Romanov. Jedrna DNK namre~ omogo~a le preverjanje
bli`njih sorodstvenih odnosov. Preverjanje sorodnosti med
daljnimi sorodniki, ki so med seboj lo~eni z nekaj
generacijami, pa zaradi rekombinacije ni mo`no. Edini
na~in preverjanja daljnih sorodstvenih povezav je analiza
mitohondrijske DNK, saj se ta deduje izklju~no po materi in
se ne rekombinira. Pri dru`ini Romanov so preverili
identi~nost skeletnih ostankov tako, da so primerjali
nukleotidna zaporedja mitohondrijskih DNK z nekaj
generacij oddaljenimi, {e `ive~imi potomci po materini
liniji. Referen~na oseba za identifikacijo carice Aleksandre
in njenih otrok je bil Princ Filip, vojvoda
Edinbur{ki, prane~ak carice Aleksandre
in mo` angle{ke kraljice Elizabete II.
Njegova mtDNK je bila identi~na cari~ini
in mtDNK njenih otrok. Še `ive~i
referen~ni osebi za identifikacijo carja
Nikolaja sta bila vnuk in vnukinja Luise
Hesse Cassel in posmrtni ostanki
carjevega brata Georgija Romanova, ki je
umrl za tuberkulozo leta 1899 in so ga za
potrebe te analize ekshumirali v katedrali
Svetega Petra in Pavla v Sankt
Peterburgu. Tudi tu so potrdili identi~nost
mitohondrijskih sekvenc. 
Z analizo jedrne in mitohondrijske DNK
so dokazali, da posmrtni ostanki v
domnevnem grobi{~u carske dru`ine v
resnici pripadajo dru`ini Romanovih. V
grobi{~u so na{li posmrtne ostanke carja
Nikolaja II., carice Aleksandre, treh
njunih otrok, treh slu`abnikov in
dru`inskega zdravnika. Car in carica sta
imela {tiri h~erke in sina. Vsi trije najdeni 
otro{ki skeleti so `enskega spola. V grobi{~u sta torej
manjkali trupli carjevi~a Alekseja in ene od h~era, kar
predvidevajo tudi zgodovinski viri. Pred ~asom je Delo
objavilo novico, da so na{li tudi posmrtne ostanke
domnevnega sina in manjkajo~e h~erke, tako da v kratkem
pri~akujemo v strokovni literaturi ~lanek o genetski
identifikaciji do sedaj manjkajo~ih ~lanov dru`ine
Romanov, kar bi dokon~no ovrglo kakr{nekoli dvome o
tem, da je najmlaj{a h~i Anastazija pre`ivela grozoviti
poboj, o ~emer je bilo veliko polemi~nih razprav. V ZDA je
Ana Anderson vse do svoje smrti leta 1984 trdila, da je
Anastazija Romanov. Po uspe{ni identifikaciji posmrtnih
ostankov Romanovih leta 1992 so z genetsko analizo
biolo{kega materiala Ane Anderson (biopsijski vzorec
~revesnega tkiva, ki so ga Andersonovi odvzeli leta 1979 in
je bil shranjen v eni od bolni{nic v Virginiji) ovrgli
kakr{nokoli sorodstveno povezavo Andersonove z
Romanovimi. 
Literatura:
1. Jeffreys AJ. DNA typing: approaches and applications. J Forensic
Sci Soc 1993; 33: 204-211.
2. Fowler JCS, Burgoyne LA, Scott AC, Harding HWJ. Repetitive
deoxyribonucleic acid (DNA) and human genome variation - a
concise review relevant to forensic biology. J Forensic Sci, 1988;
33: 1111-1126.
3. Hochmeister MN, Budowle B, Jung J, Borer UV, Comey CT,
Dirnhofer R. PCR-based typing of DNA extracted from cigarette
butts. Int J Legal Med 1991; 104: 229-233.
4. Fridez F, Coquoz R. PCR DNA typing of stamps: evaluation of
the DNA extraction. Forensic Sci Int, 1996; 78: 103-110.
5. Herber B, Herold K. DNA typing of human dandruff. J Forensic
Sci 1998; 43: 648-656.
6. Tahir MA, Watson N. Typing of DNA HLA-DQα alleles extracted
from human nail material using poymerase chain reaction. J
Forensic Sci 1995; 40: 634-636.
ONKOLOGIJA / problemi in perspektive
19
Slika 3. Primer identifikacije tkivnih vzorcev.
7. Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R. Chelex 100 as a medium for
simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic
material. BioTechniques 1991; 10: 506-513.
8. Benecke M. DNA typing in forensic medicine and in criminal
investigations: a current survey. Naturwissenschaften 1997; 84:
181-188.
9. Zupani~ I, Bala`ic J, Komel R. Analysis of nine short tandem
repeat (STR) loci in the Slovenian population. Int J Legal Med
1998; 111: 248-250.
10. Zupani~ Pajni~ I, Šterlinko H, Bala`ic J, Komel R. Parentage
testing with 14 STR loci and population data for 5 STRs in the
Slovenian population. Int J Legal Med 2001; 114: 178-180.
11. Trent RJ. Forensic medicine. In: Trent RJ. Molecular Medicine -
an introductory text for students. London: Churchill and
Livingstone, 1993: 177-192.
12. Inman K, Rudin N. An introduction to forensic DNA analysis.
New York: CRC Press Inc, 1997: 256.
13. Zupani~ I. Genetski detektivi: prepoznavanje oseb in
preverjanje sorodstvenih povezav s pomo~jo preiskave DNA.
Proteus 1998; 60: 400-405.
14. Pena SDJ, Chakraborty R, Epplen JT, Jeffreys AJ. DNA
fingerprinting: state of the science. Basel, Boston, Berlin:
Birkhauser Verlag, 1993: 466.
15. Committee on DNA Forensic Science, Commission on DNA
Forensic Science, National Research Council. The evaluation of
forensic DNA evidence. Washington: National Academy Press,
1996: 254.
16. Gill P, Ivanov PL, Kimpton C, Piercy R, Benson N, Tully G, Evett
I, Hagelberg E, Sullivan K. Identification of the remains of the
Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics 1994; 6:
130-135.
■
ONKOLOGIJA / problemi in perspektive
20